ES2227593T3 - Replicacion del virus del herpes simple especifico de tejidos o de la celula. - Google Patents

Replicacion del virus del herpes simple especifico de tejidos o de la celula.

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ES2227593T3 ES96919053T ES96919053T ES2227593T3 ES 2227593 T3 ES2227593 T3 ES 2227593T3 ES 96919053 T ES96919053 T ES 96919053T ES 96919053 T ES96919053 T ES 96919053T ES 2227593 T3 ES2227593 T3 ES 2227593T3
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Abstract

METODO PARA DESTRUIR CELULAS TUMORALES IN VITRO QUE CONSISTE EN GENERAR VECTORES COMPETENTES PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLE DIRIGIDOS A CELULAS TUMORALES. EL VECTOR COMPETENTE PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLE TIENE UN GEN ESENCIAL DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLE QUE ES ACTIVADO POR UN PROMOTOR ESPECIFICO DE TUMOR O CELULA DESTRUYE CELULAS TUMORALES Y NO ES NEUROVIRULENTO. ADEMAS, SE PRESENTA UN METODO PARA PRODUCIR UN MODELO ANIMAL, MEDIANTE LA ABLACION DE UN TIPO CELULAR ESPECIFICO IN VIVO, QUE CONSISTE EN GENERAR VECTORES COMPETENTES PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLE DIRIGIDOS CONTRA EL ANIMAL. ESTE TIPO DE VECTOR, CON UN GEN ESENCIAL DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLE QUE ES ACTIVADO POR UN PROMOTOR ESPECIFICO DE TUMOR O CELULA, DESTRUYE ESPECIFICAMENTE EL TIPO CELULAR DIANA. ESTE METODO DE TERAPIA GENICA MEDIADA POR VIRUS EMPLEA LA REPLICACION VIRICA ESPECIFICA DE CELULA, EN EL QUE LA REPLICACION VIRICA Y LA CITOTOXICIDAD ASOCIADA ESTAN LIMITADAS A UNTIPO CELULAR ESPECIFICO MEDIANTE LA EXPRESION REGULADA DE UN PRODUCTO GENICO VIRICO ESENCIAL INMEDIATO - PRECOZ (IP).

Description

Replicación del virus del herpes simple específico de tejidos o de la célula.
La presente invención se refiere a la utilización de virus alterados del herpes simple que son capaces de destruir las células tumorales. Más particularmente, la presente invención se refiere al virus-1 del herpes simple (VHS-1) competente para la replicación que contiene secuencias reguladoras de la transcripción específicas para las células que están ligadas operativamente a un gen esencial del virus del herpes simple. Además, el VHS-1 específico para las células se puede hacer no-virulento e incapaz de replicarse en las células que no se están dividiendo. Además, se puede construir también un VHS-1 específico de las células o del tejido para replicar y destruir un tipo de célula específico, lo que se denomina ablación específica de la célula, con el fin de producir un modelo animal para una enfermedad específica. La ablación específica de la célula por el VHS-1 específico de las células o del tejido se puede utilizar también para tratar trastornos con etiologías basadas en células hiperactivas o células que se expresan de manera ectópica.
En el pasado, se ha ensayado la capacidad de los virus para tratar varios tipos de tumores en animales o seres humanos. Los mecanismos terapéuticos propuestos de la terapia del cáncer vírico en la técnica anterior incluyen: (i) la producción de nuevos antígenos en la superficie de la célula tumoral para provocar el rechazo inmunológico, fenómeno denominado "xenogenización", y (ii) la destrucción directa de la célula por el virus, denominada oncolisis. Austin et al., Adv. Cancer Res. 30: 301 (1979); Kobayashi et al., Adv. Cancer Res. 30: 279 (1979); Moore Progr. Exp. Tumor Res.1: 411 (1960); Rusell, Sem. Cancer Biol. 5: 437-443 (1994). Los tratamientos de los tumores tanto en animales como en el hombre se han basado en el virus natural, en el virus atenuado por pasos o en las preparaciones de células infectadas. Kobayashi et al., Adv. Cancer Res. 30: 279 (1979); Cassel et al., Cancer 52: 856 (1983); Moore Progr. Exp. Tumor Res.1: 411 (1960).
Se han utilizado varios modelos animales y tumores animales para estudiar la oncolisis con virus naturales. Moore, Ann. Rev. Microbiol. 8: 393 (1954); Moore Progr. Exp. Tumor Res.1: 411 (1960). Se ha demostrado que al menos nueves virus son capaces de producir algún grado de remisión tumoral en varios tumores en ratones, ratas, conejos y cobayas. El principal inconveniente observado en estos estudios preliminares en animales, sin embargo, fue la infección generalizada por el virus.
Para impedir la infección generalizada, la ingeniería genética de los virus para su utilización como agentes antineoplásicos se ha enfocado a la generación de virus alterados que no son capaces de replicación en las células que no están dividiéndose. Los virus capaces de replicación en las células en división destruyen con preferencia rápidamente las células tumorales en división porque estos virus son incapaces de replicarse en las células que no están en división o en las normales.
La utilización de los retrovirus de replicación defectuosa para tratar los tumores requiere células productoras que se ha demostrado que están limitadas porque cada partícula de retrovirus de replicación defectuosa solamente se puede introducir en una célula individual y no puede infectar a continuación otras de manera productiva. Debido a que estos retrovirus de replicación defectuosa no se pueden propagar a otras células tumorales, serían incapaces de penetrar in vivo completamente en un tumor estratificado, profundo. Markert et al., Neurosurg. 77: 590 (1992).
Los ensayos clínicos que emplean tratamiento terapéutico del cáncer con vector retrovírico han sido aprobados en los Estados Unidos. Culver, Clin. Chem 40: 510 (1994). Las células que contienen vector retrovírico se han implantado en tumores cerebrales que se desarrollan en pacientes humanos. Oldfield et al., Hum. Gene Ther. 4: 39 (1993). Estos vectores retrovíricos llevaban el gen de timidina cinasa del VHS-1 (VHS-tk) en las células circundantes del tumor cerebral, que comunican la sensibilidad de las células tumorales al fármaco antivírico ganciclovir. Algunas de las limitaciones de la terapia del cáncer basada en retrovíricos actuales, descritos por Oldfield son: (1) el título bajo de virus producido, (2) la propagación del virus está limitada a la zona que rodea el implante de la célula productora, (3) la posible respuesta inmunitaria a la línea celular productora, (4) la posible mutagénesis de la inserción y la transformación de células retrovíricas infectadas, (5) únicamente es posible un solo régimen de tratamiento de profármaco, ganciclovir, debido a que el producto "suicida" destruye retrovíricamente las células infectadas y las células productoras y (6) el efecto circundante está limitado a las células en contacto directo con las células retrovíricamente transformadas. Bi, W.L. et al., Human Gene Therapy 4: 725 (1993).
Un enfoque para los genes de la toxina que se expresan selectivamente en las células cancerosas se denomina "quimioterapia molecular" la cual emplea las secuencias reguladoras de la transcripción (TRS) de un gen expresado en el tumor para dirigir la expresión de las secuencias que codifican la toxina. Garver et al. (1994) Gene Therapy 1: 46-50; Miller y Vile, FASEB J. 9:190-199 (1995). Se han utilizado secuencias reguladoras específicas del tejido para conducir la expresión de "genes suicidas" después de (a) la transferencia génica mediada por retrovíricos, (b) inyección directa de ADN o (c) transducción mediada por adenovirus-polilisina. Huber, B.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Harris, J.D. et al. (1994). Gene Ther. 1 :170-175; Vile, R. et al. (1994) Gene Ther. 1:307-316; Smith, M.J. et al. (1994) Human Gene Ther. 5:29-35; Kuriyama, S. et al. (1991) Cell Struct. Funct. 16:503-510; Vile, R.G. et al. (1993) Cancer Res. 53:3860-3864; Garver, R.I.J. et al. (1994) Gene Ther. 1:46-50.
La genoterapia mediada por retrovíricos se denomina "terapia con enzima/profármaco dirigida por el virus"
(VDEPT). Huber, B.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Gutiérrez, A. A. et al. (1992) The Lancet 339:715-721. La VDEPT está basada en un vector de replicación defectuosa que se expresa específicamente en las células tumorales pero no en las células normales. Un ejemplo in vitro de VDEPT discrimina entre las células hepáticas normales y de hepatoma por expresión diferencial de un vector retrovírico de replicación defectuosa que contiene los activadores tanto para albúmina como para \alpha-fetoproteína unida a un gen tk del VHS. Huber, et al., supra. En el sistema de VDEPT, las élulas hepáticas normales pudieron expresar timidina cinasa cuando el gen tk del VHS se acopló al activador de albúmina pero no cuando se acopló al activador de \alpha-fetoproteína. En cambio, las células de hepatoma pudieron expresar la timidina cinasa cuando el gen tk del VHS se acopló al activador de \alpha-fetoproteína pero no bajo el promotor de albúmina. La timidina cinasa transforma los análogos de nucleósido o profármacos en potentes agentes citotóxicos en las células en división. La expresión de la timidina cinasa se ha conseguido en varios tipos de células diferentes, incluyendo de linfoma, carcinoma hepatocelular, glioma, fibrosarcoma, adenocarcinoma y melanoma. Huber, B.E. et al. (1991), supra; Mullen, C.A. et al. (1992), PNAS 89:33-37; Culver, K.W., et al. (1992) Science 256:1550-1552; Ram, Z., et al. (1993) Cancer Res. 53 : 83-88; Moolten, F.L. et al. (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82 : 297-300 y Vile, R.G. y Hart, I.R. (1993) Cancer Res. 53 : 3860-3864.
Las estrategias de la genoterapia para el cáncer han empleado además numerosos procedimientos de administración diferentes para transferir los "genes suicidas" o los genes inmunomoduladores a las células neoplásicas. El objetivo principal de estas estrategias es dirigir la expresión del gen transferido al tipo de célula apropiado con el fin de que las células normales no sean afectadas de forma desfavorable. Por ejemplo, se ha utilizado la TRS de una proteína que es específica para la proteína A tensioactiva humana, del epitelio respiratorio diferenciado, para dirigir un gen productor de toxinas en una línea celular de cáncer de pulmón con células no pequeñas. Smith, M.J. et al. (1994) Human Gene Therapy 5:29-35. Asimismo, se ha utilizado la TRS de la proteína específica del carcinoma, inhibidor de la leucoproteasa secretora (SLPI), para dirigir la expresión de la timidina cinasa desde un plásmido en carcinomas que se expresan en SLPI. Garver, et al., supra.
Al principio de los años 90, la utilización de vectores víricos del VHS-1 modificados genéticamente competentes para la replicación se exploró en primer lugar en el contexto de la terapia antitumoral. Martuza et al., Science 252: 854 (1991). Un virus competente para la replicación presenta la ventaja de poder introducirse en una célula tumoral, hacer varias copias, lisar la célula y propagarse a otras células tumorales. Un mutante de timidina cinasa defectuoso (TK^{-}), dlsptk, fue capaz de destruir células del glioma maligno humano en un modelo de tumor cerebral animal. Martuza, supra (1991). Desgraciadamente, los mutantes dlsptk se atenuaron solamente de forma moderada la neurovirulencia y producen encefalitis a las dosis necesarias para destruir las células tumorales de forma adecuada. Markert et al., Neurosurgery 32: 597 (1993). La neurovirulencia residual, demostrada por una letalidad del 50% de los vectores víricos del virus del herpes simple con replicación defectuosa en 10^{6} unidades formadoras de placa (pfu) limita la utilización de dichos vectores para la terapia tumoral. Además, los mutantes TK^{-}del VHS-1 conocidos son insensibles a acyclovir y ganciclovir, los más frecuentemente utilizados y a los agentes anti-herpéticos eficaces.
Por consiguiente, continúa siendo de la mayor importancia desarrollar un vector vírico seguro y eficaz para destruir las células tumorales. Aún cuando se han hecho varios intentos para modificar genéticamente un vector vírico capaz de destruir in vivo las células tumorales humanas, la tecnología convencional no proporcionó un vector vírico con neurovirulencia atenuada, a la dosis requerida para destruir las células tumorales, que presentaban una hipersensibilidad a los agentes antivíricos y una incapacidad para volver al virus natural.
Los procedimientos de terapia génica y de quimioterapia molecular de la técnica anterior dependen de un polinucleótido exógeno o de la proteína traducida a partir de dicho nucleótido exógeno, para realizar la terapia. Actualmente, no se ha demostrado ningún vector vírico específico del tejido o del tumor utilizando un virus competente para la replicación. Además, se ha demostrado que ningún vector del VHS específico del tejido o del tumor depende del propio vector vírico para realizar la destrucción terapéutica del tejido diana.
En dos artículos estudiados, S.J. Russell expone algunas de las dificultades encontradas para utilizar un vector vírico de replicación dirigido a las células tumorales. Russell, Sem. Cancer Biol. 5:437-443 (1994); Eur. J. Cancer 30A: 1165-1171 (1994). Las estrategias para aumentar la exactitud de los vectores de replicación se ha enfocado a los vector retrovíricos. El estudio de Russell describe la manipulación de virus de genoma pequeño como agentes oncolíticos. El principal inconveniente de dichos virus de genoma pequeño es su falta de seguridad, debido a que se propagan a los tejidos normales.
Además, la expresión específica para la célula de tk no se mantuvo, en un vector retrovírico, cuando se generaron animales transgénicos. Esto sugiere que la genoterapia mediada por retrovíricos específicos de células puede que no funcione como tal debido a que una vez se transforman in situ las células, la expresión correcta puede desviarse. Richards y Huber, Human Gene Therapy 4: 143 (1993).
La tecnología convencional ha descuidado el VHS como vector potencial para la oncolisis dirigida debido a que el genoma grande del VHS es difícil de regular. Además, los genes del VHS no parece que se regulen como si fuese un gen celular. Los genes del VHS-1 en el medio de los genomas celulares están comprendidos en dos categorías de regulación; están regulados como genes precoces intermedios (conocidos como \alpha genes) o como genes precoces (conocidos como \beta genes). Los genes del VHS-1 en el medio celular no están regulados como los genes últimos (conocidos como \gamma genes). Por lo tanto, la regulación génica vírica en el medio de los cromosomas huéspedes no corresponde a la de los genes víricos en el genoma vírico. Esto sugiere que los activadores celulares colocados en el genoma vírico deberían ser regulados también de forma diferente que en su genoma celular endógeno. McKnight et al., en CANCER CELLS 4; DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163-173. Otra técnica anterior demostró que los activadores exógenos eran regulados como activadores víricos cuando se colocaban en el contexto del genoma del VHS. Esto sugirió que VHS no podía ser dirigido de manera específica a la célula o al tejido. Panning, B. y Smiley, J.R. J. Virol. 63: 1929 (1989); Roemer, et al., J. Virol. 65: 6900 (1991). Más pruebas de las dificultades para dirigir el VHS de modo específico a las células proceden del trabajo de Anderson et al., que demuestra que el activador de enolasa específica de las neuronas (NSE) es un activador ineficaz en VHS para administrar genes a las neuronas del CNS. Anderson et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13: 503 (1993); Anderson et al., Human Gene Therapy 3: 487 (1992).
Otras pruebas de que los genes exógenos no eran regulados de modo específico por las células en el contexto del VHS proceden de experimentos que demuestran que los productos del VHS pueden regular activadores celulares. Smiley, et al., Virology 113: 345 (1981). Por ejemplo, cuando el gen de \beta-globina de conejo se introduce en fibroblastos como parte de un genoma del VHS infeccioso, el gen es activado por el VHS adyacente a los polipéptidos iniciales. En vista de las limitaciones de la técnica anterior, existe una necesidad sentida hace tiempo de terapias basadas en virus que puedan destruir células cancerosas, pero que dejen intactas la mayor parte de las células normales.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención consiste, por lo tanto, en proporcionar un virus del herpes simple (VHS) competente para la replicación que sea capaz de destruir in vivo un tipo de células diana específicas o de células tumorales empleando VHS que contenga un activador específico del tejido de las células que esté ligado operativamente a un gen esencial del virus del herpes simple.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector del virus del herpes simple, en el que el genoma del vector vírico contiene un activador específico del tejido o de la célula que está ligado operativamente a un gen esencial del virus del herpes simple.
En la realización de cualquiera de los objetivos de la presente invención, el gen esencial del virus del herpes simple puede ser un gen inicial adyacente del virus del herpes simple. El gen inicial adyacente del VHS preferido que se ha de utilizar en el vector de la invención es el gen esencial del virus del herpes simple es el gen ICP-4.
Las células tumorales descritas en la presente memoria pueden ser de un tipo del sistema nervioso seleccionado de entre el grupo constituido por astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosarcoma y meduloblastoma. Otros tipos de células tumorales que pueden ser destruidas, siguiendo la presente invención, incluyen las seleccionadas de entre el grupo constituido por células de melanoma, células de cáncer pancreático, células de carcinoma de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de cáncer gástrico, fibrosarcoma, carcinoma de células escamosas, células neurrectodérmicas, células tumorales de tiroides, células tumorales de pituitaria, células de linfoma, células de hepatoma y células de mesotelioma de carcinoma epidermoide.
Para satisfacer este y otros objetivos, se ha proporcionado, según un aspecto de la presente invención, un virus del herpes simple competente para la replicación que es incapaz de expresar uno o ambos de (i) un producto del gen \gamma34.5 funcional y (ii) una ribonucleótido reductasa. En una forma de realización preferida, el vector contiene alteraciones en ambos genes.
Dicho vector de la presente invención se puede hacer además (1) sensible a agentes antivíricos y (2) capaz de expresar neurovirulencia generalizada disminuida. Por ejemplo, el virus del herpes simple del vector puede ser VHS-1 o VHS-2.
La presente invención proporciona una composición para su utilización para la ablación de células normales específicas en un paciente, que comprende una composición farmacéutica, ésta se compone de (A) un vector del virus del herpes simple que contiene un activador específico del tejido o de la célula que está ligado operativamente a un gen esencial del virus del herpes simple; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el vector, de modo que las células normales específicas son alteradas in situ por el vector, por lo cual las células se destruyen. Dicha composición puede ser utilizada para la ablación de células de pituitaria normales cuando el activador específico de la célula utilizado en el vector VHS es el activador de la hormona del crecimiento. Además, la composición se puede utilizar para destruir células adrenocorticales normales cuando el activador específico de la célula es Proopiomelanocortina.
La presente invención proporciona además una composición para su utilización en la protección de un paciente contra la infección del virus del herpes simple, que comprende una composición farmacéutica que se compone de (A) un vector del virus del herpes simple en el que el genoma del virus está alterado en (i) el gen \gamma34.5, y (ii) el gen de ribonucleótido reductasa; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el vector.
En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica de la invención es adecuada para la administración conjunta neurocirugía, quimioterapia o radioterapia.
Un vector vírico mutante de la presente invención puede ser sensible a temperaturas mayores de la temperatura basal del huésped, lo que proporciona una característica de seguridad adicional poniendo en peligro además la replicación vírica en presencia de encefalitis y de fiebre.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican formas de realización preferidas de la invención, se dan solamente a título de ilustración, ya que a partir de esta descripción detallada para los expertos en la técnica serán evidentes varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y del alcance de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se puede entender completamente con referencia a los siguientes dibujos, en los que:
La Figura 1 es un diagrama que ilustra la disposición esquemática del gen de G92A. La figura utiliza las siguientes abreviaturas: E=EcoRI, B=Bam HI, S=SspI, e/p=secuencia de potenciador/activador.
La Figura 2 es un histograma que ilustra la infectividad vírica de los vectores G92A_{1} y G92A_{2} del VHS de la presente invención comparada con la de los vectores KOS y d120 del VHS en diferentes tipos de células humanas. Las células E5 contienen el gen ICP4 integrado de forma estable y son capaces de soportar el crecimiento del virus de ICP4^{-}. Hep3B y HuH7 son células que expresan albúmina. Det551, SW480 y MCF7 no son capaces de expresar albúmina. Se prepararon células en placas de 6 pocillos y se infectaron las monocapas de las células con los virus indicados (KOS, G92A_{1}, G92A_{2} y d120). Se incubaron las células infectadas hasta que se formaron las placas y a continuación se fijaron y tiñeron con giemsa o por histoquímica de X-gal. Se contaron las placas y se determinaron las Pfu/ml del número medio de placas. Los valores representados para cada tipo de célula infectada son los promedios de un número de experimentos diferentes, de 2 a 14.
La Figura 3 es un gráfico que ilustra una curva de crecimiento de una sola etapa en la que los cultivos celulares se infectaron con KOS o G92A en un MOI de 1,5 y las veces de post-infección indicadas, el virus se recogió de las células y se tituló en células E5.
La Figura 4 es una ilustración esquemática de la construcción de un virus mutante del herpes simple que contiene una deleción de 1 kB en ambas copias del gen \gamma34.5 y una inserción en el gen ICP6.
La Figura 5 presenta la disposición de la secuencia de un virus mutante del herpes simple, G207-1, comparado con su fondo natural paterno (cepa F). Las abreviaturas son B, BamHI; Be, BstEII; G, Bg1III; N, NcoI; S, ScaI; St, StuI; y X, XhoI.
La Figura 6 es un gráfico que ilustra la capacidad de G207-1 y G207-2 para destruir todas las células U-87MG de glioma humano en el cultivo, incluyendo a baja multiplicidad de infección (M0I=0,01).
La Figura 7 es un gráfico que ilustra la sensibilidad a ganciclovir (GCV) de R3616, G207-1 y G207-2 que pone de manifiesto que G207-1 y G207-2 son diez veces más sensibles a ganciclovir que R3616. R3616 (cepa F) tiene la misma sensibilidad a ganciclovir que la cepa KOS (tipo natural).
La Figura 8 es un gráfico que ilustra la capacidad de G207-1 y G207-2 para inhibir el crecimiento de las células tumorales del cerebro humano (U-87MG) en el modelo del tumor del cerebro humano subcutáneo en ratones lampiños.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
La presente invención explota la capacidad de un VHS-1 competente para la replicación para introducirse en una célula tumoral específica o en un tipo celular in situ, hacer copias múltiples, lisar la célula diana específica y propagarse en otras células del mismo tipo con efectos relativamente menores en las células normales circundantes. El virus del herpes simple de la presente invención presenta cada una de las siguientes características: (1) eficacia para destruir una célula tumoral o un tipo de célula normal y (2) especificidad para destruir un tipo específico de célula tumoral o un tipo determinado de célula normal. Además, el virus del herpes simple de la presente invención puede incluir cualquiera de las siguientes características: (a) atenuación marcada de la neurovirulencia generalizada para proteger el cerebro normal, (b) deleciones múltiples de modo que una sola mutación no pueda producir la vuelta al fenotipo vírico natural y (c) hipersensibilidad a ganciclovir de modo que se pueda evitar la propagación no deseada del virus.
El procedimiento de la técnica anterior emplea genoterapia, que es la transferencia de material genético en las células específicas de un paciente. Las genoterapia ex vivo es la genoterapia que implica la eliminación de las células diana adecuadas del cuerpo, la transducción de las células in vitro y la reintroducción posterior de las células modificadas en el paciente.
La presente invención proporciona un VHS recombinado a un tipo de célula diana específica o tejido. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los demás procedimientos de genoterapia que dependen del polinucleótido exógeno o de la proteína traducida de dicho polinucleótido exógeno, para realizar la terapia, la presente invención depende del propio VHS para realizar la destrucción terapéutica del tejido diana.
La presente invención proporciona un enfoque alternativo que utiliza las capacidades citotóxicas inherentes del VHS competente para la replicación para destruir células tumorales in vivo y en el proceso replicarse y propagarse en todo el tumor. Nuestros estudios iniciales con tumores cerebrales malignos se utilizaron mutantes del VHS que no eran capaces de replicarse en las células que no se están dividiendo y/o no eran neurovirulentos. Martuza, R.L. et al. (1991) Science 252: 854-856; Mineta, T. et al. (1994) Cancer Res. 54: 3963-3966.
Debido a la neuropatogenicidad inherente del VHS, se han aislado mutantes no neuropáticos, que son capaces de desarrollarse normalmente en otros tipos de células. Fawl, R.L. et al. (1994). Sem. Virol. 5:261-271. Las diferencias entre los tumores que crecen rápidamente y el tejido cerebral normal circundante son tales que el virus parece que permanece localizado en el tumor y no produce efectos adversos en el animal tratado. Martuza, R.L. et al. (1991) Science, supra.
En lugar de la expresión diana de un producto génico único, la presente invención se dirige a un gen IE vírico esencial que se necesita para la transcripción de los genes víricos precoces y posteriors y por lo tanto al ciclo completo de desarrollo de la destrucción del virus. Los genes precoces adyacentes son reguladores de la transcripción y de la traducción. Ejemplos de un gen del VHS inicial adyacente esencial incluyen ICP4 e ICP27. (ICP27 es también conocido como IE63, Vmw63, IE2, UL54 y \alpha27). Pero solamente ICP4 es esencial para atacar a los genes víricos iniciales. El potencial citotóxico del vector es amplificado por la síntesis de nuevas partículas víricas infecciosas que se propagarán a las células adyacentes en todo el tumor.
La producción de vectores víricos específicos de la célula es aplicable a muchos otros sistemas aparte de los tumores, tales como la ablación de tipos de células específicas en animales para producir modelos animales o para estudiar la importancia de un determinado tipo de célula durante el desarrollo por ablación de determinadas células en diferentes etapas del desarrollo. Así pues, el procedimiento de la presente invención también es aplicable a la ablación específica por células de células normales para crear modelos animales experimentales para el estudio de la función celular y de estados patológicos. Se pueden utilizar activadores específicos de la célula o del tejido en las construcciones del VHS de la presente invención para proporcionar un modelo animal para una determinada enfermedad con una etiología basada en la disfunción de dichas células o tejidos específicos. Por ejemplo, las células de los islotes beta del páncreas pueden ser extirpadas utilizando un vector del VHS de la invención en el que un gen esencial del VHS es regulado por el activador de insulina para producir un modelo animal de diabetes mellitus dependiente de insulina.
Los estados patológicos que han sido creados utilizando ratones transgénicos inconscientes podrían ser también creados en animales individuales utilizando el mismo gen utilizado para las toxinas diana en ratones transgénicos inconscientes. Por ejemplo, se han creado ratones transgénicos que contienen lacZ bajo el control de varios activadores específicos de células nerviosas. Nirenberg, S. y Cepko, C.J. Neurosci. 13: 3238 (1993). En estos ratones transgénicos, la expresión de lacZ se podría detectar con colorante fotoactivable y a continuación se fotoextirparían las células marcadas con colorante.
La presente invención evita la necesidad de producir animales transgénicos inconscientes exponiendo al animal a un VHS específico de la célula con el fin de extirpar in vivo células específicas. Se puede utilizar cualquiera de las TRS específicas de la célula o del tejido relacionadas en la Tabla 1 en el vector del VHS reivindicado. A continuación se proporcionan ejemplos de vectores del VHS específicos de la célula o del tejido: (a) el fragmento BglII_{th} (-2400) a AluI_{th} (+27) del activador de la tirosina hidroxilasa de rata (Kim, L.S., et al. (1993). J. Biol. Chem. 268: 15689-15695) se puede utilizar para producir un vector del VHS catecolaminérgico específico de neuronas; (b) el fragmento BglII_{MBP} (-1297) a HindIII (+60) de pBP-H (Miura, M., et al. (1989) Gene 75: 31-38) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico de oligodendrocitos; (c) el fragmento BglII_{NF-L} (-2003) a SmaI_{NF-L} (+75) del gen del neurofilamento ligero de rata (Reeben, M., et al. (1995) J. Neurosci. Res. 40:177-188) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico de neuronas; (d) el fragmento SalI_{TPH} (-2117) a AvaI_{TPH} (+29) del gen de triptófano hidroxilasa humano (Boularand, S., et al. (1995) J. Biol. Chem 270:3757-3764) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico de serotonina/glándula pineal; (e) el fragmento XbaI_{Pcp-2}(-3,5) a PvuI_{Pcp-2} (ATG) del gen de la proteína-2 de la célula Purkinje de ratón (Pcp-2) (Vandaele, S., et al. (1991) Genes & Dev. 5:1136-1148) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico de las células Purkinje/del cerebelo; (f) el fragmento SstI_{mPl} (-4800) a NcoI_{mPl} (+95) del gen de protamina 1 de ratón (Peschon, J.J., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5316) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico de espermátidas; y (g) el activador de proopiomelanocortina (Tremblay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8890 (1988)) se puede utilizar para producir un VHS específico de células adrenocorticales. La siguiente relación proporciona ejemplos de vectores del VHS específicos del tumor: (a) el fragmento SstI_{EGFr} (-1109) a SstI_{EGFr} (+1) del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (Ishii, S. et al., PNAS 82: 4920 (1985)) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico del tumor para dirigir al carcinoma escamoso, al glioma o a los tumores de mama; (b) el fragmento XmnI_{DF3} (-1656) a XmnI_{DF3} (+31) del gen de glucoproteína de tipo mucina humano (DF3, MUC1) (Abe, M y Kufe, D. PNAS 90:282 (1993)) se puede utilizar para producir un vector del VHS específico del carcinoma de mama.
Además, se pueden utilizar los presentes vectores del VHS específicos del tumor para producir modelos animales para estudiar el papel fisiológico de los genes específicos del tumor. Cualquiera de las TRS específicas del tumor o de los activadores relacionadas en la Tabla 2 se puede utilizar en el vector del VHS reivindicado.
Todavía otra utilización para los presentes vectores del VHS específicos de la célula del tejido es para la preparación de medicamentos para el tratamiento de varios estados patológicos. Cualquiera de las TRS específicas de la célula o del tejido relacionadas en la Tabla 1 se puede utilizar en el vector del VHS reivindicado para extirpar las células implicadas en un determinado estado patológico. Un enfoque terapéutico potencial consistiría en extirpar neuronas específicas implicadas en el dolor crónico. En el tratamiento del dolor neuropático, el VHS incluye un gen esencial del VHS bajo el control de las TRS de la sustancia P. Dicho VHS está dirigido a las células de los ganglios de la espina dorsal que expresan la sustancia P. El vector del VHS se modificaría genéticamente para infectar células que no están dividiéndose y sería sensible a un agente antivírico.
Otros enfoques terapéuticos incluyen: (1) ablación de queratinocitos/células epiteliales responsables de verrugas; (2) ablación de células en órganos hiperactivos (p. ej., tiroides); (3) ablación de células grasas en pacientes obesos (4) ablación de tumores benignos (p. ej., tumores benignos del tiroides, hipertrofia prostática benigna, esclerosis tuberosa); (5) ablación de las células adenohipofisarias que producen la hormona del crecimiento para tratar la acromegalia; (6) ablación de mamotropos para interrumpir la producción de prolactina; (7) ablación de células productoras de ACTH para tratar la enfermedad de Cushing; (8) ablación de células de cromafina productoras de epinefrina de la médula adrenal para tratar el feocromocitoma; y (9) ablación de las células de los islotes beta productoras de insulina para tratar el insulinoma.
Por ejemplo, la esclerosis tuberosa es un trastorno hereditario (1:10.000 nacimientos) que se caracteriza por tumores benignos (hamartomas) que invaden varios órganos. La esclerosis tuberosa se puede tratar utilizando un vector del VHS de la invención dirigido al tumor utilizando la secuencia reguladora de la transcripción \alpha\beta-cristalina. Iwaki y Tateishi, Am. J. Pathol. 139: 1303 (1991).
Otro ejemplo utiliza la TRS de adipositos (Graves, R.A. et al., J. Cell Biochem. 49: 219 (1992)) para dirigir el vector del VHS de la invención para replicarse de forma específica en adipocitos y lisarlos. Para el tratamiento de células no cancerosas que no se dividen, el vector podría no ser atenuado para el crecimiento en las células que no están en división. Además, la construcción sería sensible a un agente antivírico, (p. ej. tk^{+}).
Los virus de la presente invención se modifican genéticamente para contener alteraciones en la expresión de al menos un gen esencial del virus del herpes simple. Un "gen esencial del virus del herpes simple" es un gen del VHS que codifica una proteína que es esencial para la replicación vírica. Véase Ward y Roizman, Trends in Genetics 10: 267 (1994). Ejemplos de genes del VHS que son esenciales para la replicación vírica incluyen los genes ICP4 e ICP27 precoces adyacentes, los genes necesarios para la replicación del ADN (VL9, VL5, VL24, ADN pol e ICP8) y algunos genes estructurales del VHS. Id. Sin embargo, los genes precoces adyacentes del VHS son los genes del VHS preferidos para ser colocados bajo el control del activador específico de células o tejidos en el VHS de la invención. Los genes ICP4 e ICP27 son los genes del VHS precoces adyacentes preferidos porque son genes reguladores de la transcripción. Por ejemplo, ICP4 debe ser atacado antes que otros genes esenciales para la replicación en el VHS. Por consiguiente, aunque los genes del VHS necesarios para la replicación del ADN (p. ej. VL9, VL5, VL42, ADN pol e ICP8) son esenciales para la replicación vírica, su colocación bajo el control de un activador específico de células o tejidos puede no demostrar que sea específico para determinados activadores o para un determinado tipo de células.
Los virus de la presente invención se modifican genéticamente también para contener otras alteraciones en la expresión de uno o más genes específicos del VHS-1. Los genes específicos del VHS-1 que se pueden alterar además son: (1) el gen \gamma34.5 y (2) el gen de ribonucleótido reductasa. Las alteraciones a este respecto incluyen cualquiera que destruya la expresión del producto tanto del gen \gamma34.5 como del gen de ribonucleótido reductasa. La presencia de dichas mutaciones múltiples reduce además la posibilidad de volver a la fotogenicidad natural.
Obtención de la especificidad para el tejido, célula o tumor
Debido a que el virus del herpes simple presenta una gama de huésped muy amplia y parece capaz de infectar la mayoría de los tipos de células, los mutantes del virus del herpes simple de la presente invención pueden ser dirigidos a los tipos de tumor específicos utilizando activadores tumorales específicos para la célula. La expresión "activador tumoral específico de la célula" o "secuencia reguladora de la transcripción específica de la célula tumoral" o "activador específico del tumor" o "secuencia reguladora de la transcripción específica del tumor" indica una secuencia reguladora de la transcripción, el activador y/o potenciador que está inducido selectivamente o en un nivel más alto en la célula diana del tumor que en una célula normal. Los activadores específicos del tumor incluyen activadores que están inducidos selectivamente o a un nivel superior en un determinado tipo de célula o en una célula tumoral. En la Tabla 2 se relacionan las TRS específicas de la célula tumoral. La expresión "activador específico del tejido" o "activador específico de la célula" o "secuencia reguladora de la transcripción específica del tejido" indica una secuencia reguladora de la transcripción que está inducida selectivamente o a un nivel superior en el tipo de célula o tejido diana.
Los vectores de la invención se pueden también diseñar para replicarse de forma selectiva en una célula tumoral de origen de tejido no nervioso y destruirla. El vector del virus del herpes simple de la invención se modifica genéticamente para colocar al menos una proteína vírica necesaria para la replicación vírica bajo control de un activador específico de la célula o específico del tumor. El activador específico del tumor se produce de forma selectiva o a niveles mayores en las células tumorales que en las células normales.
Dichos mutantes del VHS-1 específicos del tumor utilizan activadores procedentes de genes que se expresan en alto grado en el tumor diana, tal como el activador del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr) o el activador del gen del factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGFb) o el NESTIN u otros activadores relacionados con el tumor o los elementos potenciadores para conducir la expresión de un gen del virus del herpes simple esencial (p. ej., ICP4), en circunstancias en las que no se expresaría el gen esencial natural del virus del herpes símple. Se puede conseguir hacer no funcional el gen esencial del virus del herpes simple por inactivación genética o sustitución de la secuencia reguladora de la transcripción por una secuencia reguladora de la transcripción específica del tumor.
La presente invención describe además un mutante del virus del herpes simple condicional al intervalo del huésped en el que un producto del gen vírico esencial está bajo control de un activador específico del tumor en lugar de su propio activador vírico. En las células que lo permiten, que contienen las proteínas reguladoras adecuadas para este activador específico, se expresa el producto génico vírico esencial y el virus es capaz de replicar y propagarse a las células adyacentes hasta que se infecta una célula no permisiva. Estos estudios son aplicables al virus del herpes simple competente para la replicación de la presente invención. Estas construcciones, sin embargo, son únicamente competentes en la replicación en los tipos de células correctos (es decir, células tumorales o tipos de células diana) y son de replicación defectuosa en otras células (es decir, en el tejido circundante).
Muchos tipos de células tumorales expresan marcadores fenotípicos que se desvían en las células normales, diferenciadas terminalmente. Se puede aprovechar este modelo de expresión alterada para construir virus específicos de célula tumoral. Ejemplos de dichos genes regulados de forma diferencial en los tumores neuronales incluyen: (i) nestina, proteína intermedia del filamento expresada normalmente en las células madre neuroepiteliales, aún no en las células maduras del SNC, que se expresan por todas partes en los tumores del cerebro humano, de forma más destacada en los gliomas, (ii) factor de crecimiento del fibroblasto básico (FGFb), factor de diferenciación y mitógeno para el neuroectodermo, que se expresa en gran medida en los gliomas y meningogiomas humanos pero no en los tumores cerebrales metastásicos o en el tejido del cerebro normal y (iii) receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr), proteína cinasa específica de la tirosina unida a la membrana que con frecuencia está muy sobreexpresada, alterada y el gen amplificado en los gliomas humanos en alto grado pero en raras ocasiones en el cerebro normal. Un ejemplo de un gen regulado de forma diferencial que se expresa en carcinomas de pulmón, de mama, bucofaríngeo, del endometrio de la vejiga, de ovario y colorrectal es el inhibidor secretor de leucoproteasa (SLPI). La Tabla 1 proporciona una relación de ejemplos de activadores específicos del tejido que se pueden utilizar en el vector de la presente invención, mientras que la Tabla 2 proporciona una relación de ejemplos de activadores específicos del tumor.
TABLA 1 Activadores específicos del tejido
1
2 
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Abreviaturas: br, cerebro; B, linfocitos; mu, músculo esquelético; he, músculo cardíaco; te, testículos; beta, células beta; th, timo; lu, pulmón; Pa, páncreas exocrino; ys, saco vitelino; li, hígado; ery, células eritroides; pit, pituitaria y cristalino, cristalino del ojo.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Secuencias reguladoras de la transcripción específicas del tumor
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Un gen del VHS específico esencial que se coloca bajo el control de la secuencia reguladora de la transcripción específica del tejido es el gen ICP4, que es también conocido como Vmw175 o gen IE-3 o IE175 o \alpha4. ICP4 codifica una proteína de 175 kD que es el principal trans-activador de la transcripción del VHS y esencial para el desarrollo lítico del virus. ICP4 que carece de mutantes no puede sintetizar polipéptidos víricos precoces o posteriors. Preston, C.M. (1979) J. Virol. 29:275-284. DeLuca, N.A. et al. (1985) supra.
Un posible eje central del VHS que se utiliza para el vector recombinado de la presente invención es G92A, que procede del d120, mutante del gen ICP4 por deleción derivada de KOS del VHS-1. d120 puede crecer solamente en las líneas celulares, tales como E5, que complementan a ICP4. DeLuca, N.A. et al. (1985) J. Virol. 56:558-570.
Para controlar los inhibidores, se preparan soluciones madre víricas en la célula diana a partir del aislamiento inicial del recombinado. No suele existir ninguna posibilidad de inversión de la deleción de ICP4, cuando el vector se desarrolla en células diana. Las inversiones tienen lugar, sin embargo, con baja frecuencia en las células E5 porque las células E5 contienen un gen ICP4 integrado. Esta estrategia es utilizada por varias células diana, una vez se ha determinado que el activador está dirigiendo la expresión de ICP4 de un modo específico para las células y que se ha aislado el recombinado. Esto podría realizarse aislando recombinados en las células E5 en primer lugar y a continuación comprobando su especificidad.
No es necesario que todos los vectores sean no-neurovirulentos porque para el direccionamiento a algunos tipos de tumor, es improbable que el virus se introduzca en el SNC. Sin embargo, los vectores de la presente invención pueden incluir además las características de seguridad expuestas en el documento U.S. nº de serie 08/264.581. La incapacidad del VHS recombinado para volver al tipo natural es una característica importante de la presente invención. Se pueden eliminar otros genes que afectan la virulencia del virus o la capacidad para evadir la respuesta inmunitaria del huésped. Para la ablación celular, el vector se construye de modo que sea capaz de replicarse en las células que no se están dividiendo.
Los efectos de cada construcción en la que una secuencia reguladora de la transcripción específica del tumor o del tejido controla un gen esencial del VHS se evalúan en las células diana específicas del mamífero así como en las células de referencia que son incapaces de efectuar la particular TRS.
La construcción de vectores del VHS-1 está descrita, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.288.641; Roizman y Jenkins, J. Science 229:1208 (1985); Johnson et al., J. Virol. 66:2952 (1992); Gage et al., J. Virol. 66: 5509 (1992); Spaete y Frenkel, Cell 30; 295 (1982); Goldstein y Weller, J. Virol. 62: 196 (1988), Coen, capítulo 7, Virology, Raven Press, 1990; Breakefield y DeLuca, The New Biologist, 3:203 (1991); Leib y Olivo, BioEssays 15:547 (1993); Glorioso et al., Seminars in Virology 3:265 (1992); Chou y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266 (1992); Breakfield et al., Molec. Neurobiol. 1:339 (1987); Shih et al., en: VACCINES 85, Cold Spring Harbor Press (1985) 177-180; Palella et al., Molec. Cell. Biol. 8: 457 (1988); Matz et al., J. Gen. Virol. 64: 2261 (1983); Mocarski et al., Cell 22: 243 (1980); y Coe et al., Science 234: 53 (1986).
Se conocen en la técnica otros procedimientos para la manipulación genética de las secuencias de ADN. En general, estos incluyen a Ausubel et al., capítulo 16 en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley e hijos, Inc.); Paoletti et al., patente U.S. nº 4.603.112 (julio de 1986). Asimismo se examinan consideraciones virológicas en Coen D.M., "Molecular Genetics of Animals Viruses" en VIROLOGY 123-150 (2ª edición) (Raven Press, 1990).
El plásmido recombinado Ptk\DeltaL-ALI4, utilizado para generar G92A, se construyó de la forma siguiente. El fragmento de BgIII-KpnI de 0,5 kb de la zona de codificación tk del VHS en pHSV106 (que contiene el fragmento Q de BamHI del VHS, GIBCO/BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) se sustituyó por un policonectador BglII-BamHI de pSL301 (Invitrogen) para generar ptk\Delta. El fragmento Hind III-Sal I de 4,3 kb de pHCL (véase Kaplitt, M.G. et al. (1991) Molecular and Cellular Neurosciences 2:320-330), que contiene el gen lacZ de Escherichia coli y la señal de poliadenilación SV40 (poly A), se truncó con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y se subclonó en el punto BglII truncado (+53 de tk) de ptk\Delta para crear ptk\DeltaL. En la expresión de lacZ de ptk\DeltaL se desprende el activador tk del VHS, activador inicial del VHS. El fragmento SalI-Mse I de 4,1 kb de pGH108 (véase Roberts, M.S. et al. (1988). J. Virol. 62:4307-4320) que contiene la secuencia de codificación de ICP4, desde +178 (123 bp corriente arriba de la ATG) y el punto de poliadenilación, fue completado por el fragmento de Klenow y se subclonó en el punto BamHI truncado de p2335A-1. (Véase, Huber, B.E. et al. (1991) supra.), 22 bases corriente abajo del punto de la tapa de albúmina (véase Pinkert, C.A. et al. (1987)) para crear pALI4. El fragmento de 6,4 kb de pALI4 (fragmento de BstXI truncado y de EcoRV) que contiene el potenciador/activador de albúmina y las secuencias de codificación de ICP4, se subclonaron en ptk\DeltaL en el punto XbaI (truncado) en el policonectador justo después del punto de poliadenilación SV40 para crear ptk\DeltaL-ALI4.
Análisis de hibridación por transferencia Southern de la estructura de ADN de G92A
(A) Se confirmó la presencia de las secuencias de poliadenilación de lacZ y SV40 por hibridación de los ADN víricos digeridos con BamHI y SspI con pHCL marcado (que contiene el punto de poliadenilación de lacZ y SV40). G92A contiene los fragmentos de 3,5 y 2,2 kb esperados, no presentes en d120. (B) Se confirmó la presencia de la secuencia del potenciador/activador de albúmina por hibridación de los ADN víricos digeridos con EcoRI con p2335A-1 marcado. (C) Se confirmó la presencia de los fragmentos correctos de ICP4 por hibridación de los ADN víricos digeridos con EcoRI con pXhoI-C marcado (que contiene el fragmento XhoI-C de 9,5 kb. Véase O'Hare, P. et al. (1985). J. Virol. 53:751-760), incluyendo el gen ICP4; los fragmentos de ICP4 natural se observan con ADN de KOS del VHS natural. La deleción de 4,1 kb de ICP4 en d120 y G92A está contenida dentro del fragmento de 1,2 kb, en lugar de en el fragmento de 5,3 kb presente en KOS. Además, el fragmento de ICP4 derivado del plásmido (ptk\DeltaL-ALI4) de 4,7 kb se observó únicamente en G92A. (D) Se confirmó el potenciador/activador de albúmina, lacZ y la inserción del gen ICP4 en la secuencia de codificación de tk por hibridación de los ADN víricos digeridos con BamHI y SspI con pHSV106 marcado (incluyendo el gen tk). Los dos fragmentos (4,5 y 2,4 kb) procedentes del plásmido ptk\Delta-ALI4 estaban presentes en G92A, mientras que el fragmento Q BamHi natural (3,4 kb) estaba presente en d120.
Expresión de la proteína IC4 en células infectadas por virus
Células E5 (complemento de ICP4) (véase DeLuca, N.A. et al. (1987) supra) HepG2, Hep3B (productoras de albúmina) y MCF7 (no productoras de albúmina) cultivadas en portaobjetos de la cámara Lab-Tek (NUNC, Inc., Naperville, IL) se infectaron con virus, 20 a 100 pfu/pocillo de G92A_{1}, G92A_{2}, d120 o hrR3 (VHS mutante por deleción de ICP6). Goldstein, D.J. et al. (1988) J. Virol. 62:196-205. Se fijaron las células 48 horas después de la infección y se hicieron reaccionar con anticuerpo monoclonal anti-ICP4 (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD 21046, USA) seguido de IgG anti-ratón de cabra conjugada con rodamina ImmunoPure® (Pierce, Rockford, IL 61105). Las cifras del grupo positivo de ICP4 son las siguientes: (infección por hrR3 de MCF7, E5, Hep3B y HepG2) = (6, 15, 20, 9)] e, (infección por d120 de MCF7, E5, Hep3B y HepG2) = (0, 88, 0, 0), (infección por G92A_{1} de MCF7, E5, Hep3B y HepG2) = (0,128, 28, 36) e (infección por G92A_{2} de MCF7, E5, Hep3B y HepG2) = (0,132, 42, 70). Se observaron unas pocas células inmunopositivas individuales después de la infección de las células MCF7 con d120 y G92A. Aunque el gen lacZ se utiliza como indicador en estas construcciones, se pueden utilizar otros indicadores (p. ej., la fosfatasa alcalina de la placenta humana u otros genes del VHS o neoR).
Expresión de \beta-galactosidasa en placas con G92A
Se infectaron células con las construcciones de la invención. Cuando las placas eran visibles al microscopio, se fijaron las células con formaldehído/glutaraldehído y se tiñeron con X-gal (0,5 mg/ml de X-gal, ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, MgCl_{2} 2 mM en solución salina tamponada con fosfato). Las células que expresan \beta-galactosidasa aparecen con coloración oscura.
Destrucción mediada por el vector del virus del herpes simple de las células de hepatoma
Un ejemplo de la presente invención abarca un virus mutante de herpes simple específico del hepatoma en el que un producto del gen vírico esencial está bajo control de la secuencia reguladora de la transcripción de la albúmina en lugar de su propio activador vírico. De forma más específica se puede utilizar la secuencia del potenciador/activador de albúmina de ratón como zona reguladora específica de tipo celular. Pinkert, C.A. et al. (1987) Genes Dev. 1:268-276; Herbst, R.S. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1553-1557. Una zona de 8,5 a 10,4 kb corriente arriba del activador de albúmina funciona como potenciador, que en combinación con el activador de albúmina (300 bp), conduce la expresión de alto nivel en el hígado adulto de ratones transgénicos y en las células de hepatoma humano después de la infección con adenovirus recombinado o retrovirus recombinados. Herbst, R.S. et al. (1990). Mol. Cell. Biol. 10:3896-3905; Huber, B.E. et al. (1991) supra; Kuriyama, S. et al. (1991) supra; Pinkert, C.A. et al. (1987) supra. La albúmina se expresa únicamente en el hígado y es regulada en el nivel de iniciación de la transcripción. Tilghman, S.M. et al. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5254-5257.
Para construir un VHS mutante en el que ICP4 está regulado por una secuencia reguladora de la transcripción específica para el hígado, se generó un plásmido, ptk\Delta-ALI4, conteniendo dos genes mixtos (Figura 1). La secuencia de codificación lacZ de E. coli y el punto de poliadenilación SV40 se insertaron en el gen tk del VHS justo corriente abajo del activador tk de modo que la expresión de \beta-galactosidasa fue regulada por el activador tk del VHS. Se clonaron las secuencias del potenciador/activador de albúmina de ratón corriente arriba de la secuencia de codificación de ICP4 (en +178, la transcripción de ICP4 comienza en +301) y el punto de adición de poliA. Pinkert, C.A. et al. (1987) supra.
Los activadores específicos del tejido se pueden insertar en el gen ICP4 del VHS en cualquier punto entre el punto SalI (+178) y el punto de iniciación de la traducción (ATG en 0). Es probable que los puntos corriente arriba de +178, hasta el punto de iniciación de la transcripción en +301 sean también funcionales en un modo específico de la célula, del tejido o del tumor. Utilizando procedimientos de biología molecular habituales, sería posible insertar un policonectador en el punto SalI para simplificar una inserción de otros activadores (proporcionando una gama de posibles puntos de restricción). La secuencia de ICP4 con su activador es el número de registro X06461 del banco de genes o el locus id HEHSV1G3 de EMBL.
Se linealizó ptk\Delta-ALI4 (en el único punto de Sal I en el eje central del plásmido) y se co-transfectó con ADN de d120 en células E5 (células de Vero transformadas de forma estable con el gen ICP4 (desde -330 hasta aproximadamente 400 bp corriente abajo del extremo 3' de ARNm)). DeLuca, N.A. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:4491-4511. Se purificaron las placas de los vectores víricos recombinados tres veces en las células E5. Las placas recombinadas se tiñeron de azul en presencia de X-gal (debido al gen lacZ) y se cultivaron en presencia de gancyclovir (1 mg/ml, porque eran tk^{-}).
Se prepararon a continuación soluciones madre de virus en células HepG2 para minimizar la posibilidad de contaminar las soluciones madre con transformantes de ICP4^{+} generados por combinación con el gen ICP4 presente en las células E5. Se prepararon dos soluciones madre recombinadas aisladas independientemente, G92A_{1} y G92A_{2}. La estructura del ADN de estos recombinados se confirmó por digestión con endonucleasa de restricción y análisis de transferencia Southern, utilizando sondas para genes ICP4, lacZ, potenciador/activador de albúmina y tk del VHS. El recombinado conserva las deleciones en ICP4 de d120 y contiene además la inserción ICP4 en el gen tk del VHS.
Para determinar la especificidad del tejido de los VHS recombinados aislados purificados, se determinó su capacidad en soluciones madre víricas para replicarse en varias líneas celulares humanas. La Hep 3B humana (con virus de hepatitis B integrado (VHB)) y la HepG2 de VHB^{-} y las células de hepatoma HuH7 expresan albúmina. Nakabayashi, H. et al. (1982) Cancer Res. 42:3858-3863; Aden, D.P. et al. (1979) Nature 282:615-616; Huber, B.E. et al. (1991) supra. Las células de hepatoma poseen normalmente solo el 5 al 10% del nivel de expresión de albúmina en comparación con los hepatocitos adultos. Clayton, D.F. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:2633-2641. Las células de adenocarcinoma de pecho MCF-7 humanas, las células de adenocarcinoma de colon SW480 y las células de fibroblasto diploide Detroit 551no expresan albúmina detectable. Huber, B.E. et al. (1991). supra.
Se determinó la capacidad del virus recombinado, G92A, para la síntesis de la proteína de ICP4 en varios tipos de células por el ensayo de inmunofluorescencia. Se infectaron las células con 20 a 100 pfu de virus y a continuación se fijaron 48 horas después. Se utilizó anticuerpo monoclonal anti-ICP4 para detectar las células que expresan a ICP4. La expresión de ICP4 en las células E5 se puede detectar solamente después de la infección con VHS. Se observan grupos de células ICP4^{+} después de la infección con G92A_{1} y G92A_{2} solamente en las células que expresan albúmina (HepG2, Hep3B y HuH7) en tanto que la infección con hrR3 (delección mutante en ICP6) conduce a los grupos de células ICP4^{+} en todos los tipos de célula ensayados. La infección de células que no son de hepatoma con el virus recombinado produjo inmunorreactividad no detectable en ICP4 sobre la observada en las células de referencia. Cuando los plásmidos se transfectaron en las células el número de células que expresan fue similar en las células Vero y HepG2. Cuando se determinó la expresión transitoria de los plásmidos que contienen las construcciones activador de albúmina -ICP4 en diferentes tipos de células, no se observó especificidad. La inmunopositividad para ICP4 identifica el producto génico del gen que (a) está siendo regulado por el activador específico del tejido o de la célula y (b) es esencial para la replicación del virus. Si la construcción del VHS es incapaz de expresar ICP4 en el tipo de célula dirigida en concreto, no sólo las células infectadas serían inmunonegativas para ICP4, sino tampoco existiría formación de placa.
Se utiliza lacZ como indicador en los presentes vectores cuando está regulado por un activador inicial del VHS (p. ej. el activador tk), que requeriría la expresión de genes adyacentes-precoces (p. ej., ICP4) antes de la expresión. Podrían utilizarse otros indicadores conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de los indicadores potenciales incluyen el gen de la fosfatasa alcalina de la placenta humana o cualquier otro gen inicial o posterior del VHS para el que existan anticuerpos específicos.
Se determinó la eficacia de plaqueado del virus recombinado en varias líneas celulares. La cepa KOS natural paterna forma placas de manera eficaz en todas las células ensayadas, mientras que d120 solo forma placas de manera eficaz en las células E5 (Tabla 5). Unas pocas placas se forman en alguno de los tipos de otras células a aproximadamente una frecuencia 10^{-5} en las células E5, debido probablemente a los inhibidores en la solución madre del virus. DeLuca, N.A. et al. (1985). J. Virol. 56:558-570. G92A formó placas con gran eficacia en las células de hepatoma que expresan albúmina y con eficacia muy disminuida en las células que no la expresan (Tabla 5). Además, no se observaron placas verdaderas en las células que no expresan sino más bien en grupos de células que presentan CPE o que se tiñen con X-gal. La intensidad de la coloración con X-gal fue muy reducida en comparación con la observada en las células que expresan albúmina. Al normalizar la eficacia de plaqueado en diferentes tipos de células a las de KOS de tipo natural, se obtiene un índice de susceptibilidad que oscila entre 0,0018 para G92A_{1} en SW48 y 1,1 en células HepG2 o una diferencia mayor de 600 veces en la susceptibilidad.
Los vectores víricos recombinados, que contienen únicamente el transgen ICP4 del potenciador/activador de albúmina, todavía sin gen indicador lacZ, se aislaron también por cultivo en presencia de gancyclovir. Estos recombinados fueron capaces también de formar placas en las células de hepatoma y expresaron la proteína de ICP4 detectada por inmunofluorescencia.
La presente invención proporciona un procedimiento para construir un virus cuyo ciclo de desarrollo lítico depende del elemento regulador específico de la célula. Esto se demuestra en un experimento de desarrollo de una sola etapa, mostrado en la Figura 3, en la que el desarrollo lítico de G92A se observó en las células que expresan albúmina pero no en las células de referencia. La infección por G92A de las células MCF7 produjo menos de 1pfu/célula, mientras que el virus de KOS natural infectó las mismas células MCF7, cada célula produce del orden de 10^{3} pfu. Cuando G92A infecta las células Hep3B, se produce un rendimiento de aproximadamente 80 pfus/células, lo que indica que tiene lugar el desarrollo lítico en la línea celular de hepatoma y no en las células MCF7 de referencia. El virus natural no presentó ninguna diferencia entre el desarrollo lítico en los dos tipos de células. De este modo se puede construir VHS para que sea específico para la célula o el tumor.
La presente invención demuestra que la zona potenciador/activador de albúmina funciona de forma específica para la célula cuando está presente en el contexto del genoma del VHS. Algunos elementos activadores insertados en el genoma del VHS están afectados por las propiedades reguladoras de las secuencias del VHS circundantes. Roemer, K. et al. (1991). J. Virol. 65:6900-6912; Panning, B. et al. (1989). J. Virol. 63 :1929-1937. La actividad específica de la célula de la construcción potenciador/activador de albúmina en el genoma del VHS indica que los vectores del VHS defectuosos para la replicación y que contienen un transgén regulado por el potenciador/activador de albúmina podrían ser útiles para la genoterapia dirigida en el hígado donde se requiere la expresión génica específica de la célula sin destrucción celular.
Además, los vectores del VHS recombinado específicos para el tumor o el tejido de la presente invención quizás incluyan además otras secuencias de codificación, tales como para los productos moduladores inmunitarios, que se pueden colocar bajo control de activadores víricos precoces y posteriors. Los procedimientos para producir VHS que tienen un producto génico extraño bajo el control del activador vírico inicial y posterior se ilustró anteriormente con lacZ. Cuando dichas construcciones infectan la diana apropiada, el gen extraño se expresa únicamente en aquellas células en las que el virus se está replicando. VHS es un vector especialmente útil para este fin debido a su gran tamaño (con muchos genes no esenciales) y su capacidad para infectar la mayoría de los tipos de células. Roizman, B. et al. (1990). Fundamental Virology. págs. 849-896.
Ensayo de formación de placas
Se prepararon células en placas de 12 pocillos y se aplicó la solución madre de virus (indicada) en un volumen de 0,5 ml (excepto para Hep3B, HepG2 y MCF7 infectadas por KOS que se prepararon en placas de 6 pocillos y se infectaron con 0,7 ml). Se prepararon pocillos duplicados para cada dilución de virus y se realizaron dos diluciones para cada tipo de célula infectado. Se incubaron las células infectadas a 34,5ºC durante los periodos siguientes; Hep3B durante 2 días, HepG2 durante 6 días y HuH7, Det551, SW480, MCF7 y E5 durante 3 días. Se calcularon las unidades formadoras de placa (pfu) a partir del número medio de placas formadas. Se detectaron placas recombinadas después de la tinción con X-gal. No se observaron placas verdaderas en las líneas celulares de albúmina (MCF7, SW480 y Detroit 551) sino algunos grupos de pocas células presentando CPE o coloración positiva con X-gal. ND: no realizado. S.I.: índice de susceptibilidad = (relación a E5)/(relación a E5 para KOS).
TABLA 3 Título en diferentes tipos de células
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Otros vectores del VHS específicos para el tejido, la célula o el tumor
Otro ejemplo de un vector del VHS recombinado de la presente invención puede dirigirse a las células de melanoma. El activador de tirosinasa puede suprimirse del plásmido pTyr-\betagal1 (conseguido en R. Vile, St. Thomas Hospital) utilizando EcoR1 y XhoI (EcoR1, -2540 a XhoI, -46). El fragmento que contiene el activador de tirosinasa se insertó a continuación corriente arriba de ICP4 en SalI (como para G92A) por ligadura del extremo truncado y a continuación se insertó el fragmento tyr-ICP4 en el gen tk del VHS (pHSV106 en los puntos BglII/Acc651) para formar el plásmido pT14tk\Delta-1. Se recombinó éste a continuación en el d120 del VHS por recombinación homóloga en el locus tk y se aisló rHT14 del virus recombinado en las células E5, resistente a GCV o mediante la formación de placas en las células RPMI7941 (células de melanoma maligno humano, ATCC HTB 66) o células SK-MEL-3 (células de melanoma maligno humano, ATCC HTB 69).
Evaluación in vivo de la destrucción de células diana específica en el tumor, el tejido o las células, mediada por VHS
Los efectos de la infección por el VHS recombinado en los tumores humanos in vivo se pueden evaluar en ratones atímicos al permitir el desarrollo de tumores humanos. El efecto en los tumores animales se puede evaluar utilizando células tumorales en animales clónicos. Por ejemplo, se pueden implantar células de hepatoma humano como xenoinjertos subcutáneos para probar la eficacia del vector G92A del VHS que contiene el activador/potenciador de albúmina. Después de un periodo de tiempo, aproximadamente de dos a seis semanas, cuando los tumores se desarrollan en los animales, los animales se dividen en dos grupos. Un grupo recibe inyección intraneoplásica de 50 \mul de sucedáneo de extracto (referencia) y un segundo grupo recibe una inyección idéntica pero que contiene el vector del VHS. Los tumores se miden dos veces a la semana con calibres Vernier. Se realizan comparaciones de la proporción del crecimiento para determinar si el grupo tratado con el vector tiene proporciones de crecimiento significativamente reducidas. Se sacrifican los animales por la patología cuando la masa tumoral llega a ser una carga para el animal.
La presencia del vector del VHS (G92A) en la masa tumoral se determina utilizando histoquímica de X-gal, midiendo la expresión del gen lacZ insertado o con anticuerpos contra antígenos víricos. De igual manera se pueden examinar otros órganos. En particular, se examina el hígado para determinar si el virus se ha extendido a los tipos de células sensibles (hepatocitos). Se sacrifican los animales pero no se fijan de modo que se pueda examinar la presencia del VHS en estos tejidos. Se homogeneiza el tejido aislado y se coloca en células E5 para cuantificar el número de unidades formadoras de placa en la muestra. A continuación se examinará el desarrollo de las células con hepatoma en las muestras que contienen VHS y la presencia de lacZ para indicar si el virus aislado es el vector inyectado. Se puede aislar también ADN de dichas muestras y determinar por PCR la presencia del ADN del vector, utilizando cebadores para el gen lacZ o para la unión entre tk del VHS y la inserción del activador de albúmina.
Para determinar la seguridad de los vectores del VHS de la presente invención y su posible propagación in vivo, se puede inyectar el vector recombinado (G92A) a los animales (p. ej. ratones atímicos, ratones Balb/c y ratas Sprague-Dawley) que no tienen tumores. Se administra el virus por inyección intravenosa, inyección subcutánea o inyección intraperitoneal. Se sacrifican los animales en varias veces después de la administración del virus (los días 3, 7, 11 y 14; las semanas 3, 4 y 5) y se examinan sus tejidos como se expuso anteriormente.
Vectores de virus del herpes simple con alteraciones individuales en la ribonucleótido reductasa o en el gen \gamma34.5
El trabajo inicial en la utilización de vectores del virus del herpes simple atenuados para su utilización en la terapia anti-tumoral empleó VHS-1 mutado en un gen que permite al vector replicarse en las células en división, pero no en las células que no se dividen. Dos de dichos vectores del virus del herpes simple mutantes en un gen individual son (1) hrR3, carente de ribonucleótido reductasa, que contiene una inserción del gen lacZ de Escherichia coli en el gen ICP6 que codifica la subunidad grande de RR, [Mineta, T. et al., Gene Therapy 1:S78 (1994) y Mineta et al., J. Neurosug. 80:381 (1994)]; y (2) R3616, que contiene mutaciones en ambas copias del gen \gamma34.5. Markert et al., Neurosurgery 32: 597 (1993).
Se han sido construidos mutantes de ribonucleótido reductasa por numerosos procedimientos. El mutante hrR3 contiene una inserción del gen lacZ de Escherichia coli en el gen ICP6, que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa. Otros mutantes del virus del herpes simple con ribonucleótido reductasa son adecuados para construir el vector vírico mutante de la invención. Goldstein y Weller, supra; Goldstein y Weller, supra; Preston et al., Virol. 167: 458 (1988).
La ribonucleótido reductasa (RR) es una enzima clave en la síntesis de novo de los precursores de ADN, que cataliza la reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos. VHS-1 codifica su propia RR (genes UL39 y UL40), que está compuesta de dos subunidades no idénticas. Duita, J. Gen. Virol. 64: 513 (1983). La subunidad grande (peso molecular 140 k), denominada ICP6, está estrechamente asociada con la subunidad pequeña (peso molecular 38 k). La RR del virus del herpes simple se necesita para el desarrollo vírico eficaz en las células que no se están dividiendo pero no en muchas células en división. Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196 (1988); Goldstein y Weller, J. Virol. 166: 41 (1988); Jacobson et al., Virol. 173: 276 (1989). Ambas subunidades de RR están presentes en VHS-2. Obsérvese que el ICP6 del VHS-1 es el mismo que el ICP10 del VHS-2. Nikas et al., Proteins 1:376 (1986); McLaughlan y Clements EMBO J. 2: 1953 (1983); Swain y Halloway J. Virol. 57: 802 (1986)] y las mutaciones en la subunidad pequeña de RR también conducen a la pérdida de actividad de RR y a neuropatogenicidad [Cameron et al., J. Gen. Virol. 69: 2607 (1988)]. La presencia del gen lacZ en hrR3 permite la identificación de células tumorales infectadas por virus utilizando la histoquímica de la \beta-galactosidasa.
El efecto citopático in vitro de hrR3 (0,1 pfu/célula) en la línea celular U-87MG del glioblastoma humano fue significativo; solamente el 0,2% de las células U-87MG estaban vivas 67 horas después de la infección. Para los estudios in vivo, diez animales que albergan tumores con U-87MG se dividieron al azar y se trataron por vía intraneoplásica con 5 \times 10^{5} unidades formadoras de placa de hrR3 o con medio solo. El grupo de tratamiento vírico presentó inhibición significativa de crecimiento del tumor (p<0,01, prueba del orden de Wilcoxon por un lado).
Una diferencia importante entre la ribonucleótido reductasa defectuosa (RR^{-}) y otros mutantes del virus del herpes simple es la hipersensibilidad de hrR3 a acyclovir y ganciclovir. Debido a que los mutantes TK^{-} del VHS-1 conocidos en la técnica son resistentes a estos agentes anti-víricos, dichos mutantes podrían ser difíciles de eliminar en caso de infección generalizada o de encefalitis. Por lo tanto, en caso de encefalitis vírica, hrR3 es sensible a la terapia antivírica.
Además, los mutantes RR- del virus del herpes simple están seriamente comprometidos en su capacidad para producir infecciones y sintetizar ADN vírico a 39,5ºC in vitro. Goldstein y Weller, Virology 166: 41 (1988). Por lo tanto, estos mutantes están atenuados para neurovirulencia y es menos probable que se propaguen en el caso de una fiebre en el huésped infectado. Dichas características son esenciales para un vector terapéutico que debe ser de neurovirulencia atenuada y adecuadas para la terapia antivírica en caso de encefalitis vírica.
En los mutantes del virus del herpes simple que carece solamente del gen \gamma34.5, tal como R3616, están atenuados para neurovirulencia, lo que reduce la posible alteración en las células normales del cerebro. Goodman et al., J. Virol. 63: 1153 (1989); Chou et al., Science 250: 1262 (1990). La neurovirulencia disminuida de R3616 está supuestamente relacionada con la interrupción de la síntesis de la proteína neuronal, que está adelantada en la infección por virus de herpes simple natural. Chou y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3266 (1992). El producto del gen \gamma34.5 se puede detectar por transferencia Western o análisis ELISA de las proteínas celulares infectadas con anticuerpos o por la pérdida de replicación en las células primarias confluentes. Véase Bolovan et al., J. Virol. 68: 48 (1994). El gen \gamma34.5 está también presente en VHS-2. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72:3057 (1991). Se ha obtenido la secuencia del gen \gamma34.5 en cuatro cepas del VHS-1, a saber F, 17, MGH-10 y CVG-2. Chou y Roizman, J. Virol. 64: 1014 (1990). Los vectores del VHS-1 mutante del gen \gamma34.5 conservan un nivel de sensibilidad natural a acyclovir. Markert et al., supra (1993).
Varios investigadores han construido mutantes de \gamma34.5 utilizando diferentes técnicas y en diferentes cepas tales como la 1771 mutante (McKie et al., J. Gen. Virol. 75:733 (1994)] y 17termA [Bolovan et al., J. Virol. 68:48 (1994)] en la cepa 17 del VHS-1.
Construcción de vectores del virus del herpes simple
VHS-1 es un virus neurótropo humano que es capaz de infectar prácticamente todas las células de los vertebrados. Las infecciones naturales siguen un ciclo lítico, replicador o crean latencia, normalmente en los ganglios periféricos, donde el ADN se mantiene indefinidamente en estado episómico.
Los vectores del virus del herpes simple recombinados competentes para la replicación de la presente invención contienen alteraciones en la expresión de al menos un gen del virus de herpes simple esencial. Los virus de la presente invención se modifican genéticamente para contener otras alteraciones en la expresión de uno o más genes específicos del VHS-1. Los genes específicos del VHS-1 que se pueden alterar además son: (1) el gen \gamma34.5 y (2) el gen de la ribonucleótido reductasa. Las alteraciones en los genes específicos del VHS hacen al producto de ambos genes no funcional o reducen su expresión de modo que el vector del virus del herpes simple mutante tiene las propiedades de la presente invención. Los modos de conseguir dichas alteraciones incluyen (a) cualquier procedimiento que destruya la expresión del producto de ambos genes o (b) cualquier procedimiento que haga que se exprese el producto del gen \gamma34.5 y la ribonucleótido reductasa no funcional.
Se conocen numerosos procedimientos conocidos para destruir la expresión de un gen, incluyendo las alteraciones de estos genes o sus secuencias activadoras en el genoma del VHS-1 por inserciones, delecciones y/o cambios de base. Roizman y Jenkins, Science 229: 1208 (1985). El vector del virus del herpes simple mutado de la presente invención es un virus de herpes simple competente para la replicación cuyo genoma está alterado en la expresión de al menos un gen esencial del virus del herpes simple. Más particularmente, el vector del virus del herpes simple mutado de la presente invención es un virus de herpes simple competente para la replicación cuyo genoma está alterado en la expresión de al menos un gen del virus del herpes simple esencial de modo que el gen esencial del VHS está regulado por una secuencia reguladora de la transcripción específica del tejido o de la célula. El vector del virus del herpes simple recombinado de la presente invención puede además ser modificado genéticamente para que contenga alteraciones adicionales en la expresión del gen \gamma34.5 o del gen ribonucleótido reductasa o de ambos de estos genes.
Las alteraciones en un gen esencial del VHS incluyen las modificaciones en las secuencias reguladoras de la transcripción de estos genes. McKnight et al. en CANCER CELLS 4; DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163-173; Post, L.E. et al., Cell 24: 555 (1981). Las alteraciones en el gen \gamma34.5 y en el gen de la ribonucleótido reductasa incluyen modificaciones en las secuencias estructurales o reguladoras de estos genes. Las alteraciones genéticas se pueden determinar por procedimientos normalizados tales como la hibridación por transferencia Southern del ADN vírico digerido por endonucleasa de restricción, el secuenciado de las zonas mutadas del ADN vírico, la presencia del gen indicador (para inserciones), el nuevo punto de endonucleasa de restricción, el análisis enzimático para la actividad de la ribonucleótido reductasa [Huszar y Bacchetti, J. Virol. 37: 580 (1981)], la transferencia Western o el análisis ELISA de las proteínas de las células infectadas con anticuerpos contra RR o \gamma34.5, y/o la falta de réplica en las células primarias confluentes para \gamma34.5. Véase Bolovan et al., J. Virol. 68: 48 (1994)] o las células de ratón para RR- [Jacobson et al., Virology 173: 276 (1989)].
Las manipulaciones genéticas siguientes del virus del herpes simple proporcionan ejemplos para ilustrar la producción de vectores mutantes de virus del herpes simple. La modificación genética de los vectores del virus del herpes simple de los genes bien caracterizados de la presente invención, ICP4 adyacente-inicial esencial (IE), el \gamma34.5 y los genes de ribonucleótido reductasa en un virus bien caracterizado biológicamente.
Un vector del virus del herpes simple que ha sido mutado en su \gamma34.5 y los genes de la ribonucleótido reductasa se pueden aislar después de la mutagénesis o construir por recombinación entre el genoma vírico y las secuencias modificadas genéticamente. El alto grado de recombinación en el virus del herpes simple y el hecho de que el ADN vírico transfectado es infeccioso hace que la manipulación genética sea muy sencilla. Estos virus competentes para la replicación, alterados genéticamente se pueden utilizar en los ensayos de seguridad y eficacia que serán descritos más adelante.
El VHS-1 contiene un genoma de ADN lineal, de doble cadena de 153 kilobases de longitud, que ha sido secuenciado completamente por McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531 (1988). McGeoch et al., Nucleic Acids Res 14: 1727 (1986); McGeoch et al., J. Mol. Biol. 181 : 1 (1985); Perry y McGeoch, J. Gen. Virol. 69 : 2831 (1988). La replicación del ADN y el acoplamiento del virión tiene lugar en el núcleo de las células infectadas. Después de la infección, el ADN vírico concatenado se escinde en moléculas largas del genoma que se rellenan en los viriones. En el SNC, el virus del herpes simple se propaga a través de las neuronas seguido del transporte intraaxonal al núcleo, retrógrado o anterógrado, donde tiene lugar la replicación.
Las construcciones de ADN que emplean VHS-2 basadas en las ilustradas en la presente memoria utilizando el genoma del VHS-1 están comprendidas en la presente invención. VHS-2 contiene ambas subunidades de RR; ICP6 del VHS-1 es análogo a ICP10 del VHS-2. Nikas et al., Proteins 1: 376 (1986); McLaughlan y Clements, EMBO J. 2: 1953 (1983); Swain y Halloway, J. Virol. 57: 802 (1986). \gamma34.5 está también presente en VHS-2. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72: 3057 (1991).
Alteración de la expresión genética por modificación de \gamma34.5 o de las secuencias reguladoras de la ribonucleótido reductasa
Otra manera de obtener que un virus de herpes simple sea incapaz de expresar el producto del gen \gamma34.5 funcional y la ribonucleótido reductasa es alterar su expresión. La expresión de estos dos genes se puede interrumpir alterando las secuencias reguladoras de los genes \gamma34.5 y de la ribonucleótido reductasa.
Las zonas reguladoras para \gamma34.5 y/o ribonucleótido reductasa se pueden alterar por técnicas normalizadas para destruir la expresión del gen \gamma34.5 y de la ribonucleótido reductasa. Por ejemplo, sus secuencias reguladoras podrían ser alteradas en el genoma vírico utilizando las técnicas descritas anteriormente para la alteración de las secuencias de codificación.
Se han cartografiado las zonas activadoras de \gamma34.5 y de ICP6 de la ribonucleótido reductasa. Se ha cartografiado el activador para \gamma34.5 en una zona en la secuencia "a". La secuencia "a" contiene también secuencias para la escisión de la unidad de longitud de ADN de los concatámeros del VHS-1, la envoltura del ADN del VHS-1 en las cápsides y la inversión de los componentes L y S. Chou y Roizman, J. Virol. 57: 629 (1986). La zona activadora de ICP6 ha sido cartografiada para las secuencias corriente arriba de 5' del gen estructural ICP6. Golstein y Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Sze y Herman, Virus Res. 26: 141 (1992). El punto de inicio de la transcripción para la subunidad pequeña de RR, a saber UL40, está comprendido dentro de la zona de codificación de ICP6. McLauchlan y Clements, J. Gen. Virol. 64: 997 (1983); McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69 : 1531 (1988).
El efecto de estas alteraciones sobre la capacidad reguladora de \gamma34.5 y de los genes RR se puede detectar insertando un gen indicador corriente abajo del activador, tal como el descrito para la fusión ICP6/lacZ. Goldstein y Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Sze y Herman, Virus Res. 26: 141 (1992). Debido a que los genes del virus del herpes simple se regulan de forma diferente cuando están presentes en el genoma celular, los efectos de cada alteración en el gen esencial del VHS, que incluye ICP4, ICP27, \gamma34.5 o el componente regulador de la ribonucleótido reductasa se podrían evaluar en varias células diana de mamífero. McKnight et al., en CANCER CELLS 4; DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163-173.
Comunicación de hipersensibilidad a agentes antivíricos
Una precaución de seguridad en la utilización terapéutica del virus del herpes simple frente a los gliomas implica proporcionar un medio para interrumpir cualquier infección potencial de otras células en división. Los estudios clínicos indican que incluso los virus VHS-1 naturales en general no se propagan más allá del punto de la infección inicial o producen una enfermedad generalizada grave en individuos inmunocompetentes. Sacks et al., Ann. Int'I Med. 111: 893 (1989).
Obsérvese que los virus TK^{-} algunas veces se han relacionado con la enfermedad evolutiva en determinados pacientes inmunocomprometidos y que el dlsptk mutante del VHS-1 es resistente a acyclovir. Erlich et al., New Engl. J. Med. 320: 293 (1989); Coen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4736 (1989). Cualquier vector vírico competente para la replicación mutante que sea más sensible al agente antivírico que su precursor natural se estima hipersensible al agente antivírico, proporcionando potencialmente un medio para abortar una propagación no deseada del virus mutante.
Al construir mutantes del virus del herpes simple para su utilización in vivo, se determina la sensibilidad de los mutantes a las farmacoterapias anti-herpéticas actuales con el fin de controlar las infecciones virulentas no previstas. Actualmente están disponibles numerosos fármacos para tratar las infecciones por herpes en el hombre, siendo los más eficaces los análogos de nucleósidos que bloquean la replicación del ADN en el virus del herpes simple. Se conocen tres genes del virus del herpes simple que están implicados en la sensibilidad a los análogos de nucleósidos: ADN polimerasa del virus del herpes simple (UL30, pol), timidina cinasa del virus del herpes simple (UL23, tk) y UL97 de CMV que comparte homología con las proteína cinasas y las fosfotransferasas bacterianas. Furman et al., J. Virol. 32: 77 (1979); Littler et al., Nature 358 : 160 (1992); Sullivan et al., Nature 358 : 162 (1992).
Existen numerosos mutantes de ADN polimerasa del virus del herpes simple que presentan hipersensibilidad a ganciclovir, incluyendo PAA^{r}5 y AraA^{r}9. Coen et al., J. Virol. 53: 477 (1985). Desgraciadamente, las inyecciones intracraneales de AraA^{r}9 conducen a la muerte prematura y no tienen ningún efecto sobre el desarrollo del tumor subcutáneo. Markert et al., supra. Otro virus mutante de herpes simple, el virus dlsptk no es ya sensible al fármaco, al menos a los fármacos análogos de nucleósidos y por lo tanto es incontrolable potencialmente in vivo.
Atenuación de la neurovirulencia
La neurovirulencia generalizada atenuada o disminuida significa que la encefalitis con riesgo para la vida no continua después de la infección con el vector del virus doble mutante del herpes simple de la presente invención. Debido a que la encefalitis provocada por el virus del herpes simple en el hombre es muy difícil de tratar y puede ser fatal, aún con medidas farmacológicas adecuadas, la disminución de la neurovirulencia generalizada es una característica importante de la presente invención. La hipersensibilidad al GCV necesita no estar presente con las construcciones del VHS de la invención que son tk^{-} porque son resistentes al GCV. Sin embargo, un experto en la técnica a la vista de la presente memoria podría colocar fácilmente la inserción, que comprende el activador específico del tejido o de la célula ligado a un gen del VHS esencial, en otra posición en el genoma del VHS distinta de la del gen tk. Dicho vector sería hipersensible a un GCV, tal como G207.
Para los estudios de ablación celular, en los que se desea la replicación del VHS recombinante en las células que no están dividiéndose, es probable que tk^{-} o rr^{-} no actuase debido a que están atenuados para el desarrollo en las células que no están dividiéndose. Para dicha ablación en el SNC, la neurovirulencia atenuada puede también ser un problema porque el vector puede no replicarse en las células diana.
Volviendo a la deseada atenuación de la neurovirulencia, el riesgo de que un vector VHS específico de neuronas para la ablación específica de las células pueda propagarse a las células cerebrales normales o a otras células no deseadas en el cerebro puede disminuirse construyendo el VHS con un segundo gen esencial eliminado, tal como una delección en un gen inicial o en un gen posterior. Como alternativa, el gen neurovirulento (podría ser eliminado o colocado bajo control de un segundo activador específico de las células. Por ejemplo se podría colocar tk, rr o \gamma34.5 bajo el control del activador específico para las neuronas (p. ej. sinapsina [Phiel, G. et al., PNAS USA 88:3431 (1991)], del neurofilamento ligero) e ICP4 se colocaría bajo el control de un segundo activador específico en el subconjunto de neuronas al que se dirige (p. ej. tirosina hidroxilasa (TH) para células catecolaminérgicas, dopamina-\betahidroxilasa (DBH) para neuronas noradrenérgicas y adrenérgicas y la proteína 2 de la célula de Purkinje (PCP-2) para las células de Purkinje). Por consiguiente, el vector de la invención habría atenuado la neurovirulencia cuando está presente en otras células distintas a las que expresan el segundo activador específico de las células.
Diferentes cepas de virus de herpes simple varían en neurovirulencia y las cepas más atenuadas se pueden emplear para la construcción del mutante doble para disminuir además la neurovirulencia. Otras cepas del VHS-1 disponibles en ATCC incluyen HF (ATCC VR-260), MacIntyre (ATCC VR-539), MP (ATCC VR-735) y las cepas G del VHS-2 (ATCC VR-734) y MS (ATCC VR-540).
Por otra parte, cualquier mutación del gen del virus del herpes simple que conduce a la disminución de la replicación vírica in vivo y/o en poblaciones de células específicas se puede utilizar en el vector del virus del herpes simple mutado de la invención. Otros genes con neurovirulencia incluyen: (i) dUTPase [Pyles et al., J. Virol. 66:6706, (1992)], (ii) UL53 [Moyal et al., Virus Res. 26:99 (1992)], (iii) \alpha22 [Sears et al., J. Virol. 55 : 338 (1985)] e (iv) US3 [Meignier et al., Virology 162 :251 (1988)].
Desde una perspectiva clínica, la encefalitis por el virus del herpes simple es la infección viral más frecuentemente descrita del sistema nervioso central (SNC) en los Estados Unidos, con una frecuencia estimada de 2,3 casos para una población de un millón. La encefalitis por el virus del herpes simple se localiza normalmente en el lóbulo temporal y en el sistema límbico y el examen histológico de los casos de autopsia demuestra el antígeno vírico en estos puntos. Numerosos fármacos están disponibles para controlar la infección, incluyendo acyclovir 9-92-hidroxietoxi-metil)guanina, Zovirax®, arabinósido de adenina (Vidarabina®), foscarnet (ácido fosfonofórmico, PFA) y ganciclovir 9(1,3-deshidroxi-2-propixi)metilguanina, DHPG, 2'NDG, Cytovene®. Véase Whitley et al., en López et al., (eds.) IMMUNOBIOLOGY AND PROPHYLAXIS OF HUMAN HERPESVIRUS INFECTIONS, página 243 (1990, Plenum Press, N.Y.); Whitley et al., N. Engl. J. Med. 297: 289 (1977); Oberg, Pharmacol. Ther. 19: 387 (1983); DeArmond, Transplant. Proc. 23: 171 (1991).
Vectores del virus del herpes simple eficaces para la xenogenización
La presente invención emplea el vector del virus del herpes simple competente para la replicación con neurovirulencia disminuida como modulador o inductor de la célula tumoral de una respuesta inmunitaria contra las células tumorales. El vector del virus del herpes simple mutante de la invención se puede alterar además para expresar citocinas en la célula diana tumoral para producir una respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Por ejemplo, un vector del virus mutante del herpes simple puede provocar la destrucción de células tumorales mediada por virus que a continuación es amplificada por una respuesta inmunitaria potenciada por citocina, una citocina que ha sido expresada por el propio vector. La expresión de citocinas o de otros productos génicos, a partir del vector del virus mutante del herpes simple tendría lugar durante las horas de infección de modo que se sintetizarían suficientes productos génicos antes de la destrucción de las células. La destrucción de las células puede incluso aumentar la eficacia de la respuesta inmunitaria antitumoral. Barba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4348 (1994).
Destrucción de las células tumorales del tejido nervioso mediada por el vector del virus del herpes simple
Ejemplos experimentales para el tratamiento según la presente invención incluyen, pero no están limitados a (i) el tratamiento de seres humanos o de otros animales que padecen tumores y neoplasmas, (ii) tumores del sistema nervioso y (iii) tumor cerebral maligno.
Preferentemente el tratamiento se iniciará mediante inoculación intraneoplásica directa. Para los tumores en el cerebro se utilizarán MRI, CT u otra técnica estereotáctica guiada por detección por imagen para dirigir la inoculación vírica o se inoculará el virus en el momento de la craneotomía.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administrarán de modo ventajoso en forma de composiciones inyectables. Una composición típica para tal fin comprendería un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición podría contener albúmina de suero humano en tampón de fosfato conteniendo NaCl. Otros portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares. Véase REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (15ª ed.) 1405-1412 y 1461-1487, Mack Publishing Co. (1975), y THE NATIONAL FORMULARY XIV (14ª ed.), American Pharmaceutical Association (1975). Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, el aceite vegetal y los ésteres orgánicos inyectables, tal como eloleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen el agua, las soluciones acuosas, las soluciones salinas, los vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluido y de nutrientes. El pH y la concentración exacta de varios componentes de la composición farmacéutica se ajustan según las técnicas de rutina en la materia. Goodman y Gilman, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7ª ed.).
Normalmente, el vector del virus del herpes simple se prepararía en forma de inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para la solución, o suspensión en el líquido antes de la inyección. La preparación también puede estar emulsionada. El ingrediente inmunógeno activo se mezcla con frecuencia con un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vector puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsionantes, agentes de tamponación del pH, adyuvantes o inmunopotenciadores que aumentan la eficacia de la vacuna del vector.
Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen las formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen excipientes típicos como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación lenta o polvos y contienen del 10% al 95% de ingrediente activo, preferentemente del 25% al 70%.
La expresión "dosis unitaria" se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas para su utilización en el hombre, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado juntamente con el diluyente requerido, es decir, el portador o vehículo y un determinado régimen de tratamiento. La cantidad que se ha de administrar, tanto según el número de tratamientos como de la cantidad, depende del paciente que se ha de tratar, de la capacidad del sistema inmunitario del paciente para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas que se debe administrar dependen del juicio del médico y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuadas son del orden de uno a varios cientos de microgramos de ingrediente activo por individuo. Los regímenes adecuados para la administrar inicial y las dosis de refuerzo también variarán pero están tipificadas por una administración inicial seguida de una o dos intervalos de semana por una o más inyecciones posteriores u otra administración.
Estudios animales de transfección in vivo
Las dosis de las composiciones farmacéuticas administradas según la presente invención se pueden determinar fácilmente. En general, las preparaciones de la presente invención se deberían dispensar en una forma de dosificación unitaria que comprende entre 10^{7} y 10^{10} pfu/ml del vector VHS en un portador farmacéuticamente aceptable por dosificación unitaria, (con preferencia aproximadamente 10^{5} a 5 \times 10^{9} pfu/ml) del virus de herpes simple competente para la replicación que comprende un activador específico del tejido que está operativamente ligado a un gen del virus esencial del herpes simple. Las pfu deseadas están contenidas en un volumen total de entre 0,3 y 2,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y administrada por varias técnicas.
El vector VHS puede introducirse en animales por inyección intratumoral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratraqueal, intravesicular, intraintestinal, intra-rectal, intraoral, intraocular o intraarterial. Para la introducción en la vejiga, el vector se puede instilar dentro de la vejiga por infusión intravesicular. Para la introducción en el recto, el vector se puede instilar utilizando un enema local. Para la introducción en el pulmón, el vector se puede introducir instilando por un tubo, infusión, inhalación en la tráquea o inyección en la tráquea.
Ejemplo 1 Construcción de mutantes dobles del VHS muy atenuados Virus y líneas celulares
La cepa natural del VHS-1 (KOS o cepa F) y los mutantes del VHS (R3616, hrR3) fueron proporcionados gentilmente por D.M. Coen, B. Roizman, J. Chou y S.K. Weller. La cepa F del VHS-1 está disponible como ATCC VR-733; las células Vero están disponibles como ATCC CRL 1587. R3616, que procede de la cepa F del VHS-1, contiene una deleción del par de 1 kilobase en ambas copias del gen \gamma34.5. R3616 se construyó tal como se describe en Chou et al., Science 250: 1262 (1990).
Se generaron soluciones madre de virus en cultivos de células de riñón de mono verde africano (Vero) tal como se describe. Se prepararon soluciones madre de virus tal como describe Coen et al., J. Virol. 53:477 (1985).
Se obtuvieron células U-87MG, T98G, U-138MG y A172 de glioblastoma humano del American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero de ternero fetal inactivado al 10% (IFCS) y antibióticos.
Se aísla ADN vírico de las células infectadas, que se lisan suavemente con NP40, se tratan con RNasa, a continuación con SDS y proteinasa K y finalmente se extraen con fenol, cloroformo/alcohol isoamílico y éter. El ADN vírico es adecuado para la transfección después de precipitación con etanol y resuspensión en agua. Para la generación de virus recombinados, la pieza de ADN que se ha de recombinar en el genoma vírico se escinde de un plásmido. El ADN lineal se co-transfecta con ADN vírico en células capaces de soportar la propagación de la descendencia recombinante del virus. Cuando se observan efectos citopáticos extensos, se recoge la progenie del virus. Los virus recombinantes se colocan a continuación en placas en células tolerantes en condiciones seleccionables o detectables. Por ejemplo, las placas recombinadas con LacZ+ se tiñen añadiendo X-gal y se seleccionan las placas azules (LacZ+). Además se realiza la purificación de la placa (tres veces) antes de preparar una solución madre.
Construcción del virus del herpes simple incapaz de expresar tanto el producto del gen \gamma34.5 como la ribonucleótido reductasa
Se construyen cepas mutadas del virus del herpes simple tanto en los genes de \gamma34.5 como de ribonucleótido reductasa utilizando procedimientos habituales para la generación de recombinantes víricos según describen Goldstein y Weller. Ambos genes no son esenciales para el crecimiento vírico en el cultivo y por lo tanto ninguno de los mutantes son viables en el cultivo. Dichos mutantes dobles incluyen la inserción del gen LacZ de E. coli en ambos genes, de modo que esta replicación en el punto se puede detectar fácilmente.
Un ejemplo de vector del virus del herpes simple mutante de la presente invención se puede construir por recombinación homóloga utilizando ADN aislado del virus R3616 y un fragmento HindIII-XbaI de 5,3 kB de pKX2-\betaG3. Un ejemplo de dicho mutante en la presente invención se denomina "G207". La Figura 4 ilustra la construcción de G207. Se purificaron cinco cepas y se denominaron G207-1, -2, -3, -4 y -5.
El mutante R3616 del VHS-1, procedente de la cepa F natural del VHS-1, contiene una deleción de 1 kB en ambas copias del gen \gamma34.5. Para construir una inserción de lacZ de ICP6 en el ADN vírico R3616, se transfectó conjuntamente el fragmento HindIII-XbaI de 5,3 kb de pKX2-\betaG3, que contiene la inserción lacZ en el fragmento XhoI de 2,3 kB del gen ICP6, con ADN vírico infeccioso R3616 en células de piel de conejo (RS) y se introdujo en el ADN vírico por recombinación homóloga. El plásmido pKX2-\betaG3 que contiene una inserción en el gen lacZ en el fragmento XhoI de 2,3 Kb del gen ICP6 (KOS), fue proporcionado gentilmente por el Dr. S.K. Weller (Univ. de Connecticut). Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196 (1988). Se construyó el plásmido pKpX2' por digestión parcial de pKX2-\betaG3 con BamHI, eliminación del gen lacZ y religadura. El plásmido pRB4081 que contiene el fragmento NcoI-SphI del gen \gamma34.5, fue proporcionado gentilmente por B. Roizman. Chou et al., Science 25: 1262 (1990). Todos los plásmidos recombinados se propagaron por procedimientos habituales. Todos los plásmidos y virus se pueden construir con materiales disponibles a la vista de la presente solicitud.
Se transfectan conjuntamente 200 a 1.000 unidades infecciosas de ADN vírico R3616 (aproximadamente 1 \mug) con un exceso 10 veces molar de la inserción de pKX2-\betaG3 de 5,3 kB, que se escinde cortando con XbaI y HindIII, a las células RS. Cuando se observaron efectos citopáticos muy extendidos, se recogió la descendencia y se determinaron los títulos en las células Vero.
El día 2 ó 3 después de la infección, se tiñeron las placas con solución de X-gal. Se identificaron los virus recombinados por tinción de las placas positiva con X-gal. Las placas víricas recombinadas (\gamma34.5-/ICP6- y LacZ^{+}) se tiñeron de azul en presencia de X-gal. El virus recombinado de las placas azules se purifica y se analiza el ADN cartografiando la endonucleasa de restricción para confirmar la estructura del ADN de los virus mutantes. Se purificaron las placas azules tres veces por paso en células Vero en un procedimiento de dilución limitada antes de preparar las soluciones madre.
Se analizó la morfología en placa de G207-1 y G207-2 así como el efecto de varias concentraciones de medio que contiene IFCS sobre la morfología de la placa. Se cultivaron monocapas de células Vero infectadas a 37ºC en el medio conteniendo 0,5%, 1%, 2,5% y 5% de IFCS; se fijaron a las 36 y 48 h después de la infección; y se tiñeron con X-gal, para detectar la actividad de \beta-gal y a continuación se contratiñeron con rojo neutro.
Los mutantes de G207-1 produjeron placas no sincitiales, mientras que los mutantes de G207-2 produjeron placas sincitiales, caracterizadas por la fusión extensa célula-célula.
La Tabla 4 documenta el aumento de diámetros en la placa en condiciones de aumento del crecimiento celular para G207-1 y G207-2. Se midieron los diámetros de las placas utilizando un micrómetro bajo un microscopio de contraste de fase inversa con un aumento 40\times. Cada valor representa el diámetro medio de 15 placas.
TABLA 4
5
En la Figura 5 se ilustra la disposición de la secuencia y del gen de los virus G207 comparados con su fondo natural de la cepa F. Las casillas de la línea superior de la Figura 5 representan la secuencia repetida invertida que flanquea los componentes largos (U_{L}) y cortos (U_{S}) del genoma del virus del herpes simple, que está representado por líneas finas. Los dominios expandidos de la única zona larga presentan la posición del gen ICP6. La línea gruesa presenta las secuencias transcritas del gen ICP6. El G207 mutante contiene el gen estructural de lacZ insertado en el punto BamHI en el gen ICP6. Los dominios expandidos de las zonas repetidas presentan la posición del gen \gamma34.5. El mutante G207 contiene una deleción de 1 kB en ambas copias del gen \gamma34.5.
Análisis del ADN vírico mutante
Para confirmar la estructura alterada de forma correcta de los vectores del virus del herpes simple, se realizó el análisis de transferencia Southern en los mutantes de la invención. Se prepararon los ADN víricos a partir de viriones parcialmente purificados. Todos los ADN víricos (KOS, hrR3, cepa F, R3616 y G207) se digirieron con endonucleasa de restricción, se separaron por electroforesis en gel de agarosa en un tampón Tris-borato-EDTA y se transfirieron por el método de Southern. Los ADN recombinados utilizados como sondas para la hibridación fueron marcados con el kit de marcado ECL (Amersham) tal como sugiere el suministrador. Para confirmar que los mutantes víricos contienen el gen lacZ en la posición apropiada, se digirió todo el ADN con Xho I y se sometió a hibridación por transferencia Southern por duplicado. Se hibridaron los filtros con pkpX2' marcado, que contiene secuencias naturales del gen ICP6. KOS natural del VHS-1 contiene un fragmento Xho I de 2,3 kB, mientras que, hrR3 (derivado de KOS y la inserción lacZ mutante en el gen ICP6) contiene el fragmento de 5,3 kB esperado si se insertó el gen lacZ. La cepa F del VHS contiene un fragmento Xho I de aproximadamente 6,0 kB debido a un polimorfismo entre las cepas naturales del virus del herpes simple. G207 contiene un fragmento de 9,0 kB, esperado si se insertó el gen lacZ en el fragmento de 6,0 kB de la cepa F. Cuando se hibridó el filtro con una sonda del gen lacZ sola, únicamente se detectó el fragmento de hrR3 de 5,3 kB y el fragmento de G207 de 9,0 kB. Estos resultados demuestran que el fragmento del gen lacZ está insertado en el punto apropiado en el genoma.
Para confirmar que G207 contiene deleciones en el gen \gamma34.5 se digirieron los ADN víricos de la cepa F, R3616 y G207 con Bam HI y se sometieron a hibridación por transferencia Southern. Se utilizó como sonda el plásmido pRB4081, que contiene las secuencias naturales del gen \gamma34.5. Se cartografía el gen \gamma34.5 en los fragmentos SP y S de Bam HI. La cepa F contiene las versiones naturales de SP y S de Bam HI de estos fragmentos, mientras que R3616 y G207 contienen las versiones eliminadas de estos fragmentos. Estos resultados demuestran que ambos genes \gamma34.5 están eliminados en el ADN vírico R3616 y G207.
Mutantes del virus del herpes simple dirigidos a tipos de células específicos
Se utilizan plásmidos que contienen el fragmento activador EGFR de 2,2 kB de pERCAT2, véase Jonson et al., J. Biol. Chem. 263: 5693 (1988), y un fragmento activador BFGF de 2,1 kB del pF2.ICAT, véase Shibata et al., Growth Factor 4: 277 (1991) para caracterizar la expresión transitoria de una proteína marcadora (\beta-galactosidasa). La especificidad de estas construcciones se confirma en las células U-87MG de glioblastoma humano para BFGF [Takahashi et al., FEBS Letters 288:65 (1991)] y en células A431 de carcinoma epidermoide humano para EGFR. Liberman et al., Nature 313:144 (1985). Las células A431 están disponibles como ATCC: CRL 1555; las células U-87MG MG están disponibles como ATCC: HTB 14.
Por ejemplo, el activador específico de las células tumorales se clona en un plásmido ICP 4 corriente arriba de la zona de codificación de ICP4. Ejemplos de plásmidos de ICP4 incluyen pGH108 o pXhoI-C. Roberts et al., J. Virol. 62: 4307 (1988). Este plásmido se recombina a continuación en el virus ICP4^{-} del herpes simple. El virus ICP^{-} del herpes simple se puede construir por deleciones o inserciones en la zona de codificación de ICP4. DeLuca et al., J. Virol. 56: 558 (1985); DeLuca y Schaffer, Nucleic Acids Res. 15: 4491 (1987); Paterson y Everett, J. Gen. Virol. 71: 1775 (1990). El vector de la invención también puede hacerse ICP4^{-} por una deleción o inserción en la zona de codificación de ICP4. Dichos vectores de ICP4^{-} se aíslan en las células que expresan a ICP4. DeLuca et al., supra; DeLuca y Schaffer, supra; Paterson y Everett, supra. Por otra parte, la zona reguladora de ICP4 del virus del herpes simple se sustituye con el activador específico del tumor de modo que ICP4 es producido solamente en las células capaces de expresar el activador sustituido. Se analiza la capacidad del mutante del virus del herpes simple que contiene su gen ICP4 bajo el control de un activador específico del tumor para infectar y destruir las células tumorales específicas.
Ejemplo 2 Estudios de seguridad y eficacia
La eficacia in vitro de los mutantes como agentes anti-glioma se puede determinar utilizando ensayos de citotoxicidad del glioma en cultivos de la línea celular de glioma humano a largo plazo, U-87MG, así como glioblastomas humanos del primer pasos. Para evaluar la inhibición del tumor in vivo, se tratan por separado xenotransplantes de U-87MG subcutáneos en ratones lampiños con inoculaciones de cada mutante o vehículo vírico y se analizan los índices de crecimiento tumoral. Para investigar los efectos potenciales del tratamiento del virus mutante del herpes simple sobre la supervivencia, ratones lampiños con xenotransplantes de U-87MG intracraneales se tratan con inoculaciones de virus o de vehículo y se compara la supervivencia del conjunto.
Para evaluar el grado de erradicación del tumor, así como la neurovirulencia potencialmente conservada de los virus cuando se utilizan a las dosis necesarias para conseguir una supervivencia prolongada, se seccionan los cerebros de los supervivientes a largo plazo con xenotransplantes intracraneales, se tiñen y se examinan al microscopio. Para la inhibición eficaz del tumor in vivo y la prolongación de la supervivencia, es esencial la selección cuidadosa del mutante empleando los ensayos descritos en la presente memoria. Los procedimientos siguientes proporcionan orientaciones claras a los expertos en la técnica para identificar vectores víricos mutantes que son eficaces in vivo para inhibir el crecimiento tumoral y prolongar la supervivencia. Para demostrar la seguridad relativa de estos virus como potenciales agentes anti-glioma, se investiga su susceptibilidad al agente antiherpético habitual ganciclovir. Por último, para demostrar la seguridad de la inoculación intracerebral del vector vírico mutante, los animales reciben un inóculo intracerebral del virus mutante y se evalúa posteriormente la encefalitis.
Destrucción citopática in vitro
Se determina en primer lugar la capacidad de los vectores del virus del herpes simple de la invención para destruir células tumorales en el cultivo celular. Todo el trabajo vírico se realiza en cámaras aprobadas y diseñadas para el vector vírico. Los virus se desarrollan inicialmente en células Vero, como las descritas en Martuza et al., Science 252:854 (1991). Para maximizar el título del mutante vírico, se centrifugó la suspensión vírica inicial a 34.500 g durante 2 h a 4ºC, y el sedimento se puso en suspensión posteriormente en el medio y se valoró otra vez. Los virus se aplican a multiplicidades de infección (MOI) variables, entre 10^{1} y 10^{-4}. Se calcularon los valores de MOI del número de células. Se aplicó el número apropiado de pfu víricas y se distribuyó uniformemente. Coen et al., J. Virol. 53: 477 (1985). Se compararon todos los cultivos celulares infectados por virus con cultivos de referencia (DMEM+ solo, sin virus). Se conservaron las células y se observaron al microscopio. Las células que se habían vuelto redondas, perdiendo su morfología normal y las que subieron en la placa se consideraron muertas. Las monocapas se consideraron completamente destruidas cuando el 99% o más de las células presentaban dichos efectos citopáticos.
El mutante o su precursor natural se aplicaron a una línea de glioma humano (U-87MG) y a células de riñón de mono verde africano (Vero) a multiplicidades de infección (MOI) de 10^{-4} a 10^{1} en DME+ (medio Eagle modificado por Dulbecco con suero de ternero fetal inactivado térmicamente del 1 al 5% ((IFCS) y antibióticos). Se obtuvo la línea de glioma U-87MG humano maligno de la American Tissue Cell Collection, Rockville, MD. Además, se obtuvieron dos gliomas malignos humanos primarios como muestras quirúrgicas de tumor. Maturza et al., supra (1991). Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10% y antibióticos (DMEM+).
Se infectaron monocapas subconfluentes de U-87MG y células Vero con los vectores víricos mutantes de la invención a varias MOI. Las células infectadas se cultivan en medio que contenía IFCS del 1 al 5% a 34,5ºC. Se identificaron las células viables por el procedimiento de exclusión con azul de Trypan. El mutante que expresa efectos citopáticos a las 24 horas que es proporcional a la MOI y que expresa >99% de efecto citopático después de 10 días en U-87MG se estima que posee la capacidad para destruir células de glioma in vitro. El inóculo más bajo del virus mutante que puede mantener una infección que se propaga para destruir la monocapa completa de las células U-87MG proporcionará una de las dosis a las que se evalúa el mutante in vivo. El vector vírico mutante se ensaya también frente a una línea de glioma (T98G) humana diferente a varias MOI y se evalúa su capacidad para producir la destrucción de la monocapa en 10 días.
Se crearon cultivos de glioma a corto plazo transplantando tres gliomas humanos malignos (un astrocitoma anaplásico y dos glioblastomas) obtenidos en intervención quirúrgica en DME+ y se estudiaron en el segundo paso. Se determinó los efectos citopáticos de los mutantes a varias MOI. El virus mutante del herpes simple y la dosis que es citopática en los tres gliomas malignos primarios se estima que es capaz de destruir una amplia variedad de células tumorales del cerebro humano in vitro.
Se determina la capacidad para destruir 3 meningiomas malignos humanos, 1 meningioma atípico, 5 neurofibrosarcomas y 2 meduloblastomas de mutantes víricos además de cultivos de glioma en cultivo celular y en los modelos in vivo. Los mutantes víricos se determinan a las MOI que oscilan entre 10^{1} y 10^{-4}. La inhibición tumoral significativa por el virus mutante pone de manifiesto una amplia gama de tumores del sistema nervioso para los que el virus mutante es eficaz para destruir las células tumorales del cerebro humano.
La Figura 6 documenta la eficacia citopática in vitro de las células G207-1 y G207-2 en U-87MG. Se infectaron monocapas subconfluentes de células U-87MG con G207-1 o G207-2 (MOI = 0,01 ó 1), mientras que se simuló la infección de las referencias y se cultivaron en medio conteniendo IFCS al 10% a 34,5ºC. Se identificaron las células viables por el procedimiento de exclusión con azul de Trypan. Se evaluó el número de células supervivientes en comparación con el número de células en los cultivos de referencia con infección simulada (100%). Cada punto de los datos representa el promedio de triplicados. Las barras verticales indican la desviación estándar de los triplicados. Cada uno de los mutantes víricos destruyó todas las células tumorales 6 días después de la infección. El efecto citopático apareció el día 1 después de la infección para la MOI de 1,0, con >99% de citotoxicidad probada el día 3 para MOI de 1,0 y el día 6 para MOI de 0,01. La eficacia citopática de estos mutantes se puede determinar también en las líneas celulares T98G, U-138MG y A172 del glioma humano.
El vector del virus del herpes simple de la presente invención se puede utilizar para mediar en la destrucción de otros tumores humanos. Ejemplos de otros tumores humanos que pueden ser adecuados para la presente invención incluyen melanoma, carcinoma de próstata, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de colon, linfoma, hepatoma, y mesotelioma. Se pueden cultivar células tumorales humanas en tumores primarios como describen Fogh y Trempe, HUMAN TUMOR CELLS IN VITRO, Plenum Press, N.Y. (1975) pág. 115; Wilson, capítulo 8, ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH. IRL Press (1986). La línea celular de melanoma humano, SK-MEL-31 (ATCC: HTB 73): las líneas celulares de carcinoma de próstata humano, Du145 (ATCC: HTB 81) y PC3 (ATCC: CRL 1435); las células de carcinoma epidermoide humano, A431 (ATCC: CRL 1555); y las células de carcinoma pulmonar humano, Calu-1 (ATCC: HTB54) son sensibles a la infección por mutantes atenuados del VHS-1.
Sensibilidad del agente anti-vírico
Para superar la insensibilidad de alguno de los mutantes del virus del herpes simple de la técnica anterior a los agentes antivíricos, se inserta en el virus otro fármaco diana (por ejemplo, un gen suicida). Por ejemplo, se inserta el gen CMV UL97 (gan^{S}; pGMT7-UL97) en mutantes TK^{-} del VHS-1 y se determina su capacidad para completar la incapacidad de TK^{-} del VHS-1 para replicarse en células carentes de suero y comunicar sensibilidad a ganciclovir en este recombinado. Después de determinar la sensibilidad a ganciclovir del vector vial que contiene el gen suicida, se efectúa una comparación del ED_{50} (in vitro) y del tiempo de supervivencia medio de los vectores víricos sin suicida y de los que contienen suicida (p. ej. los mutantes TK^{-} del VHS-1/UL97 y dlsptk) en presencia de ganciclovir.
Ensayo de sensibilidad a ganciclovir
Se infectan monocapas confluentes de células Vero en placas de 12 pocillos con 100 pfu de R3616 o G207, en las que la MOI se mantiene por debajo de 0,0005. Después de eliminar el inóculo del virus, se añade a cultivos por triplicado DMEM más 1% de suero de ternero fetal inactivado e inmunoglobulina humana diluida 1000 veces (Armour Pharmaceutical Company; Kankakee, IL) que contiene varias concentraciones de ganciclovir y se incuban las células a 37ºC. Se observan las placas por coloración Giemsa y se hace el recuento el día 3 después de la infección. En la Figura 7 se ilustra la sensibilidad de R3616, G207-1 y G207-2 a ganciclovir (GCV), lo que pone de manifiesto que G207-1 y G207-2 son diez veces más sensibles a ganciclovir que R3616. La sensibilidad a ganciclovir de R3616 es similar a la del tipo natural. Cada punto de datos representa la media de los triplicados. El número de placa en ausencia de ganciclovir representa el 100% de las placas. La línea de puntos indica la ED_{50}.
Sensibilidad del vector vírico mutante a la temperatura
Para proporcionar una característica de seguridad adicional que solucione además la replicación vírica en presencia de encefalitis y fiebre, se determina la sensibilidad de los vectores víricos mutantes a temperaturas mayores que la temperatura basal del huésped. La Tabla 5 demuestra la disminución de la eficacia de la formación de placas de G207-1 y G207-2 a temperaturas elevadas. Se determinaron las eficacias de las placas valorando soluciones madre de virus en monocapas de células Vero. Se cultivan monocapas de células Vero infectadas en medio de IFCS al 1% a 37ºC o a 39,5ºC y se fijan a las 48 h después de la infección. Se hace el recuento de las placas seguido de coloración con Giemsa. Los títulos se expresan en pfu/ml. El mutante hrR3 presentaba sensibilidad a la temperatura en comparación con la cepa KOS precursora como se indicó anteriormente. Goldstein y Weller, Virology 166: 41 (1988). La cepa F natural del VHS-1, que es la cepa precursora de R3616, G207-1 y G207-2, también es sensible a la temperatura. Los mutantes R3616, G207-1 y G207-2 se mantienen sensibles a la temperatura como sus cepas precursoras.
TABLA 5
6
Ejemplo 3 Modelos extracraneales in vivo Transplante y terapia de xenotransplante de glioma subcutáneo
Se evaluaron los efectos de la infección del virus del herpes simple mutante en tumores cerebrales humanos in vivo en ratones atímicos para permitir el desarrollo de los tumores humanos. Se realizó el implante del xenotransplante subcutáneo tal como se describió anteriormente. Martuza et al., Science 252: 854 (1991) y Markert et al., Neurosurg. 32:597 (1993). Para comprobar el efecto de los mutantes del virus del herpes simple sobre el glioma humano in vivo, se implantaron por vía subcutánea piezas de glioma picadas de 1 mm^{3} (obtenidas a partir de ratones lampiños inyectados previamente por vía subcutánea con células U-87MG cultivadas) en ratones lampiños. Se anestesiaron los ratones lampiños con 0,25 ml de una solución consistente en 84% de solución salina bacterioestática, 10% de pentobarbitol sódico (1 mg/ml) y 6% de alcohol etílico. Los animales que mueren en 48 horas de cualquier procedimiento se consideran muertes perioperativas y se excluyen del análisis. Las muertes en los experimentos con tumor subcutáneo se excluyen del análisis (ninguna diferencia significativa en las muertes tuvo lugar entre los grupos tratados con virus y sus correspondientes referencias).
Entre las semanas 4 y 5, los animales que desarrollan tumores (=8 mm de diámetro) se dividen en dos grupos de 7 a 10 animales por grupo. Las referencias recibieron inyecciones intraneoplásicas de 50 ó 60 \mul de DMEM+; los animales tratados recibieron inyecciones intraneoplásicas similares de virus en suspensión en DMEM+. Las dosis administradas para cada virus oscilan entre 10^{6} y 10^{8} unidades formadoras de placa. Se toman precauciones para distribuir el virus en todo el tumor. Para los experimentos con dos dosis, se administran inyecciones posteriores de DMEM+ o de virus el día 14. Se realizan experimentos similares para cada uno de los virus mutantes a varias dosis.
Se midieron los tumores cada semana o dos veces a la semana con calibradores Vernier. Se registró el crecimiento de los xenotransplantes subcutáneos como la proporción de crecimiento del tumor por la fórmula ([1 \times w \times h]/2)/
([1 \times w \times h]_{\text{día 0}}/2) como se describe en Martuza et al., supra (1991). Se realizaron comparaciones de la proporción de crecimiento 28 días después del tratamiento inicial. Se evaluaron las diferencias potenciales en las proporciones de crecimiento utilizando la prueba del orden por un lado de Wilcoxon.
Terapia del xenotransplante de glioma subcutáneo utilizando G207
Los ratones que albergan tumores subcutáneos (de aproximadamente 6 mm de diámetro) se dividieron al azar (n=6 por grupo) y se trataron por vía intraneoplásica con 5 \times 10^{7} pfu de virus G207 en suspensión en 0,05 ml de tampón del virus o con tampón solo. Se midió el diámetro del tumor mediante mediciones externas con el calibre. Para los estudios patológicos, se trataron los ratones que tienen tumor (>10 mm de diámetro) con 1 \times 10^{7} pfu de G207 y se sacrificaron los días 8 y 15 trás de la inyección. Se extrajeron los tumores, se colocaron en fijador durante 1 h y se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato fría. Se colocaron los tumores a continuación durante la noche en solución de X-gal.
La Figura 8 es un gráfico que presenta la proporción de crecimiento de los tumores subcutáneos de U-87MG en ratones Balb/c (nu/nu) tratados con 5 \times 10^{7} pfu de G207-1 (círculo negro) o G207-2 (cuadrado negro) el día 0, o con medio de referencia solo (círculo blanco). Se midieron los tumores dos veces a la semana con calibres y se calculó la proporción de crecimiento dividiendo el volumen del tumor por el volumen del tumor el día de la inoculación inicial. Las barras representan la media \pm SE para cada grupo. La velocidad media del crecimiento del tumor se inhibió de forma significativa en los tumores tratados con G207 en comparación con los tumores de referencia tratados con medio solo.
Modelo de cápsula subrenal
Los efectos de G207 sobre las células U-87MG desarrollados en la cápsula subrenal del ratón lampiño también deberían determinarse porque la cápsula subrenal es una zona utilizada para controlar el crecimiento de otros tumores del sistema nervioso. Lee et al., Neurosurg. 26: 598 (1990); Medhkour et al., J. Neurosurg. 71: 545 (1989). Se deberían implantar células U-87MG (1,5 \times 10^{6}) en la cápsula subrenal del ratón lampiño. Diez días después, se miden los tumores y se inoculan varias pfu de G207 en 1 \mul de DME+ o 1 \mul de DME+ solo. Se volvieron a examinar todos los ratones a los 14 días y a los 26 días después de la inoculación para medir el tamaño del tumor. Los tumores tratados con virus que son más pequeños que los tumores de referencia demuestran que el virus mutante es capaz de destruir las células tumorales in vivo.
Ejemplo 4 Destrucción del tumor intracraneal in vivo
Para evaluar la eficacia in vivo del vector del virus del herpes simple competente para la replicación en el tratamiento de los gliomas intracerebrales, se debería inocular a los ratones lampiños por vía estereotáctica en el lóbulo frontal derecho 1,6 \times 10^{5} células U-87MG. En un estudio piloto, un inóculo celular similar produjo 100% de mortalidad en 1,5 meses.
Diez días después de la implantación del tumor, se dividirían los animales al azar en grupos de tratamiento para recibir las siguientes terapias a las mismas coordenadas estereotácticas utilizadas para los implantes del tumor: (1) el grupo de control recibiría inoculaciones intracraneales de 6 \mul de DME+ como anteriormente, (2) el segundo grupo recibiría inoculaciones intracraneales de 10^{3} pfu (baja dosis) del vector vírico mutante competente para la replicación, (3) el tercer grupo recibiría inoculaciones intracraneales de 10^{5} pfu (dosis media) del virus del ensayo y (4) el cuarto grupo recibiría inoculaciones intracraneales de 10^{7} pfu (dosis alta del virus de la prueba), cada una en suspensión en 6 \mul de DME+. Las inoculaciones serían en 2 \mul de DME+ a las coordenadas estereotácticas utilizadas al principio para inyectar las células U-87MG. A las 7 semanas, todos los animales de referencia habrían muerto, ya que han estado en las pasadas evaluaciones. Un vector vírico mutante de la presente invención es el que destruye los tumores de cerebro intracerebrales conservando un número significativo de ratones vivos a las siete semanas después del tratamiento. La representatividad se determina representando los valores experimentales frente a los de referencia en un ensayo exacto de Fischer de una cola.
Neuropatología in vivo
Los animales que se mantienen sanos y neurógicamente normales a las 19 semanas se sacrifican. Se fijará el cerebro entero, se seccionará en serie a intervalos de 7 \mum, se tiñe con hematoxilina y eosina y se examina al microscopio para la prueba de encefalitis y/o tumor. La ausencia de pruebas de encefalitis pondría de manifiesto que el vector vírico posee la característica de neurovirulencia generalizada disminuida o atenuada. La ausencia de pruebas del tumor pondría de manifiesto que el vector vírico es eficaz para destruir las células tumorales del cerebro humano in vivo.
El tratamiento in vivo sería más eficaz para los mutantes del virus del herpes simple que presentan disminución de la neurovirulencia manteniendo todavía efectos citopáticos en las células de glioma porque dichos efectos permitirían el tratamiento del tumor a dosis víricas mayores.
Estudios de mutantes del virus del herpes simple en modelos animales inmunitarios competentes
Para probar la eficacia de los mutantes del virus del herpes simple en la destrucción de las células tumorales humanas en presencia de un sistema inmunitario competente, se utilizaría el modelo de ependimoblastoma GL261 de ratón en su huésped clónico, el ratón C57BL/6. La línea celular GL261 se implantaría por vía subcutánea o intracraneal en ratones C57BL/6. Los animales que albergan tumores de GL261 subcutáneos se dividirían al azar y se tratarían por vía neoplásica como se describió anteriormente en el modelo de ratón lampiño. El grupo tratado con virus que presenta una inhibición del crecimiento significativo, evaluada por la prueba de la suma del orden de Wilcoxon se ensayaría a continuación en los estudios intracraneales. Para los estudios intracraneales, se inyectaría a los ratones con 10^{4} GL261 células en el lóbulo frontal derecho. Después de 7 días, se inocularía a los animales por vía intraneoplásica con virus mutante o con medio solo. Todos los ratones tratados con medio morirían probablemente, como en los estudios anteriores. Los mutantes víricos que fuesen capaces de prolongar la supervivencia de los ratones en 40 días o más después de la implantación de la célula tumoral serían considerados eficaces para la destrucción de las células del tumor cerebral humano in vivo.
Neuropatología y destrucción del tumor en animales inmunizados con virus del herpes simple
Como el virus del herpes simple es endémico en la sociedad, una terapia eficaz sería adaptar a los pacientes que han sido expuestos al VHS-1. Por consiguiente, es importante determinar si los vectores mutantes del virus del herpes simple de la presente invención pueden destruir las células tumorales in situ en los animales que han sido inmunizados previamente contra el virus del herpes simple. El efecto de la inmunización contra el virus del herpes simple sobre la capacidad del vector vírico mutante para destruir las células tumorales in vivo se determinaría en el modelo intracraneal GL261 en ratones C57BL/6.
Se inmunizarían ratones C57BL/6 contra la cepa KOS del virus del herpes simple; se inmunizaría otro grupo de ratones con la cepa natural de la que deriva el vector; se simularía la inmunización de otro grupo con solución salina. Los ratones que demuestran títulos de suero de anticuerpo altos por ensayo de reducción de placa 2 semanas después de la inoculación se utilizarían como animales inmunizados contra el virus del herpes simple. Cuatro semanas después de la inmunización, se inyectarían células tumorales por vía intracerebral como se describió anteriormente. Una semana después, se inocularía el tumor en las mismas coordenadas estereotácticas en el vector utilizando medio solo en el grupo de referencia negativo. Se evaluaría el efecto de la pre-inmunización sobre el crecimiento de las células tumorales, después de la muerte del animal y la capacidad del virus del herpes simple para destruir las células tumorales según se describió para el modelo intracerebral.
Además, serían sacrificados varios animales de cada grupo para un estudio neuropatológico durante cada una de las fases agudas (2 días), fase subaguda (1 semana) y fase crónica (1 mes y 3 meses). Se evaluarían las siguientes patologías histológicas: tamaño del tumor, infiltración celular inmunitaria, edema cerebral, necrosis, alteración de las neuronas, glia, mielinación, hemorragia, proliferación o destrucción de los vasos sanguíneos, astrositos reactivos, neuronas normales y glia, isquemia, gliosis y propagación del virus (PCR para ADN vírico o \beta-galactosidasa). Estos estudios determinarían si la pre-inmunización contra el virus del herpes simple presenta algún efecto sobre la capacidad del vector vírico mutante para destruir las células tumorales o producir neuropatogénesis.
Identificación de la posición del virus
El virus del herpes simple que contiene el gen LacZ de E. coli y que expresa a \beta-galactosidasa después de la infección vírica es un marcador útil para determinar histológicamente la dinámica y la propagación del virus diana. Debido a que el mutante hrR3 contiene el gen LacZ de E. coli insertado en el gen ICP6 de modo que el virus expresa a \beta-galactosidasa durante la replicación vírica, se pueden teñir las células infectadas con X-gal. Goldstein y Weller, supra (1988).
Este marcador permite después de la propagación del virus in vivo examinar las muestras de cerebro de ratones en varios puntos de tiempo después de la infección con hrR3 por coloración con X-gal. Kaplitt et al., Mol. & Cell. Neurosci. 2: 320 (1991). La presencia de células infectadas por virus en secciones de cerebro fijadas se determina por PCR y se compara con la proporción de células teñidas con X-gal. El tumor es visible después de la tinción por contraste con H y E o por inmunohistoquímica con células tumorales o marcadores específicos de la especie. De esta manera, los vectores víricos competentes para la replicación serían traceados y se evaluaría su capacidad para propagarse a los depósitos de la célula tumoral a una distancia de la masa tumoral principal. Los estudios histológicos determinarían la distancia máxima a la que el virus se puede propagar para alcanzar un depósito tumoral
distante.
Otra técnica sensible para identificar la presencia de virus del herpes simple o de un vector de virus de herpes simple defectuoso en las secciones cerebrales emplearía PCR. Con el fin de localizar ADN vírico, se aislaría ADN para PCR de las células después de la fijación y de la histoquímica de modo que incluso las células positivas individuales generarían una señal específica de PCR. Utilizando cebadores de oligonucleótido específicos, se generarían productos exclusivos de PCR a partir del ADN del vector vírico presente en estas células. Se retirarían los cubreobjetos de los portaobjetos y se diseccionarían pequeñas piezas de tejido. Se incubaría el tejido con proteinasa K, Tween-20, oligonucleótidos y tampón de PCR a 65ºC durante 90 min y a continuación se aumenta a 95ºC para inactivar la proteinasa K. Se diluirían las muestras tratadas con NTPd, tampón de PCR y Taq ADN polimerasa y se ciclarían por temperatura. Los productos de PCR serían analizados por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se podrían utilizar las técnicas de PCR in situ disponibles para localizar ADN vírico durante los estudios neuropatológicos. Embretson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 357 (1993).
Seguridad de los mutantes del virus del herpes simple competentes para la replicación en ratones y primates no humanos
Para demostrar que el vector del virus del herpes simple no produce neurovirulencia a la dosis requerida para destruir las células tumorales, los animales recibieron inoculaciones de dosis destructoras del tumor del vector del virus del herpes simple mutante para determinar si el vector produciría encefalitis in vivo del virus del herpes simple. Se inocularon alícuotas (10 \mul) de G-207-1, G-207-2 y de la cepa F en el hemisferio cerebral derecho de ratones de tres semanas de vida; se puntuaron las muertes hasta 21 días después de la infección. La Tabla 6 demuestra que la inoculación intracerebral de ratones Balb/c con el virus natural precursor (cepa F) a 10^{3} p.f.u. produjo la muerte de la mitad de los animales por encefalitis. Chou et al., Science 250: 1262 (1990). El LD_{50} conocido para la cepa 17 es también de 10^{3} p.f.u. McKie et al., J. Gen. Virol. 75: 733 (1994). En cambio, no se observó mortalidad o enfermedad después de la inoculación intracerebral de los títulos mayores de G207-1 o G207-2 que se podría producir (10^{7} p.f.u. en 10 \mul). Esta dosis de 10^{7} p.f.u. demostró destruir las células tumorales in vivo del modelo de crecimiento tumoral U-87MG subcutáneo, tal como se presenta en la Figura 8.
TABLA 6
7
Se utiliza Aotus trivigatus, especie de primate sumamente sensible a la encefalitis por el virus del herpes simple, para probar la seguridad de los vectores del virus mutante del herpes simple de la invención. Katzin et al., Proc. Soc. Exp Biol. Med. 125: 391 (1967); Melendez et al., Lab. Anim. Care 19:38 (1969).
La exploración para la detección de la imagen por resonancia magnética (MRI) u otros análisis de detección por imagen se utilizarían para evaluar la encefalitis. Los monos recibirían una MRI en el cerebro y sin gadolinio antes del comienzo de la prueba.
La prueba inicial se realizaría a la dosis mayor que se pueda generar para cada mutante que se ha determinado que es segura en ratones (LD_{10} o menor). Por ejemplo, se administraría 10^{7} pfu en el interior del cerebro para el mutante con deleción G207 que se ha de ensayar. La dosis que es bien tolerada por una especie conocida que es muy sensible al virus del herpes simple, proporciona la prueba más forzada de que este tratamiento sería razonablemente seguro en el hombre. Si no se observa prueba clínica o de MRI de encefalitis en 1 mes, se probaría otro animal a esta misma dosis o a una logarítmica mayor. Se observarían los signos de enfermedad neurológica y generalizada en el animal a diario.
Este procedimiento puede determinar la dosis máxima que puede administrarse de forma segura por vía intracraneal sin producir la muerte, signos neurológicos persistentes o enfermedad progresiva. Después de 12 meses, se sacrificarían los animales y se examina en los cerebros la pérdida o alteración de neuronas, reacción del glia, mielinación, hemorragia, proliferación o destrucción de vasos sanguíneos, ADn vírico (por PCR) o \beta-galactosidasa producida por virus en los vasos sanguíneos, isquemia, necrosis, gliosis y reacción inflamatoria. Estos estudios elucidarían las lesiones neuropatológicas (si existen) que deben esperarse que ocurran en el cerebro del primate normal como resultado de la infección con este vector.
El género Aotus se cree desde hace tiempo que es un género monotípico con Aotus trivigatus como único representante. Los estudios han demostrado, sin embargo, que Aotus es un género multiespecífico con especies y subespecies que oscilan en el número de cromosomas desde 2n=46 a 2n=56 (Aotus nancymai, mono mochuelo con cariotipo 1, 2n=54). Cuando se describió en los años 60 la sensibilidad de los monos mochuelo al virus del herpes simple, no se pudo distinguir Aotus trivigatus de Aotus nancymai. Málaga et al., Lab. Anim. Sci. 41: 143-45 (1991). En la clasificación taxonómica actual, sin embargo, Aotus nancymai se creía antes que representaba a Aotus trivigatus. Hershkovitz, Amer. J. Primatol. 4:209 (1983).
Se probaría la capacidad de los vectores víricos competentes para la replicación de la presente invención para producir encefalitis del virus del herpes simple en primates que son sensibles a la encefalitis producida por el virus del herpes simple, a saber, Aotus nancymai y/o Aotus trivigatus. Un Aotus nancymai está viviendo todavía tres semanas después de ser inoculado con 10^{7} pfu del mutante G207.
Ejemplo 5 Tratamiento de tumores cerebrales humanos con vectores víricos competentes para la replicación
Pacientes con glioblastoma recurrente que era resistente a la cirugía habitual, a la radioterapia y a la quimioterapia, se tratarían con terapia del virus del herpes simple. Se exploraría al paciente utilizando MRI o CT u otra técnica y el tumor y se registraría el cerebro normal en el espacio estereotáctico. El virus sería administrado utilizando técnicas neuroquirúrgicas guiadas estereotácticamente. Una exploración por tomografía computerizada (CT) o una exploración por resonancia magnética nuclear (MRI) informatiza el marco estereotáctico que se utilizaría para inocular exactamente el virus en un tumor en una o más posiciones. El virus se inocularía a una dosis de 10^{1} a 10^{7} p.f.u. por inoculación utilizando una cánula <2 mm. El número de puntos inoculados dependería del tamaño del tumor. Se seguiría a los pacientes con exploraciones MRI periódicas y con examen neurológico, recuento sanguíneo y pruebas de la función hepática.
En una estrategia alternativa, los pacientes serán operados para eliminar la mayor parte del tumor recurrente y se inoculará el virus en el lecho tumoral extirpado de una manera similar a la anterior.
Ejemplo 6 Vacunas de vector del virus del herpes simple competente para la replicación
El vector del virus del herpes simple de la invención se puede utilizar como vacuna para proteger un animal contra la infección por el virus del herpes simple. En el presente contexto, "proteger" un paciente contra el virus del herpes simple incluye (1) una vacuna profiláctica, es decir, una vacuna utilizada para prevenir una futura infección por virus del herpes simple, y (2) una vacuna terapéutica para tratar una infección vírica por herpes simple existente.
Se prepararía la muestra de virus del herpes simple utilizando metodología normalizada. Células Vero infectadas por virus del herpes simple se congelarían a -70ºC hasta que se hayan de utilizar. Se descongelaría el material y el residuo celular se sedimentaría por centrifugación. Se descartaría el fluido sobrenadante y el sedimento se volvería a poner en suspensión hasta su volumen original. Este material se aproximaría mucho al utilizado en la preparación de la vacuna. Esta suspensión se trataría con ultrasonidos dos veces durante 20 segundos.
Los títulos de la placa del virus del herpes simple se determinarían por procedimientos normalizados. Por ejemplo, se valoraría el virus por triplicado en monocapas de células Vero en placas de 6 pocillos. Después de la adsorción de las muestras durante 2 horas, las células se cubrirían con medio conteniendo agarosa al 0,6% y se incubarían a 37ºC en un medio rico en CO_{2} durante 48 h. Se añadiría una segunda capa, la misma que anteriormente excepto por la adición de rojo neutro, y se incubarían las células otras 24 horas.
Los grupos de virus del herpes simple se valorarían antes de la filtración. Se filtrarían a continuación los grupos a través de un filtro Nalgene de 0,45 \mum, se tomarían muestras, se volverían a filtrar a través de un segundo filtro y a continuación se volverían a tomar muestras.
Ejemplo 7 Ensayo de patogenicidad con la vacuna de virus del herpes simple en un modelo murino y en un modelo de mono
La letalidad de la vacuna del virus del herpes simple se compararía con la letalidad de otras vacunas de virus del herpes simple en ratones mamadores de <24 h de vida, cepa CD-1, (Charles River, Raliegh, Carolina del norte). Meignier et al., J. Infect. Diseases 158: 602 (1988); Burke, Curr. Topics in Microbiology and Immunology 179: 137 (1992). La valoración comparativa de la vacuna del vector del virus del herpes simple se realizaría en una sola prueba utilizando el conjunto final de la vacuna del virus del herpes simple.
Se prepararían diluciones logarítmicas de la vacuna. Se utilizarían dos camadas de 5 ratones cada una para cada dilución. Se inocularía a los ratones por vía intracerebral con 0,03 ml de diluciones apropiadas y se observaría durante 21 días. Se calcularía la letalidad del ratón como la dosis en pfu que mata el 50% de los ratones (p. ej., pfu/0,03 ml de vacuna dividido por LD_{50} de vacuna).
Además, en el estudio se administraría vector del virus del herpes simple a 4 monos. Otros seis monos recibirían el vector un año después de la inmunización con el vector del virus del herpes simple de la invención. Si la administración intradérmica y subcutánea de la vacuna experimental es bien tolerada, la vacuna del vector del virus del herpes simple se estima que es segura para su utilización como agente inmunoprotector contra el virus del herpes simple.
Además, se ensayaría en todos los monos los títulos de anticuerpo del suero específicos para el virus del herpes simple. La seroconversión del mono se mediría por ELISA, después de la inmunización primaria. Si todos los monos se convierten serológicamente, la vacuna del vector del virus del herpes simple se estima que es eficaz como agente inmunoprotector contra el virus del herpes simple.
Ejemplo 8 Estudios clínicos en el hombre con la vacuna del vector del virus del herpes simple
Para su utilización como vacuna, el vector del virus del herpes simple mutado de la invención se inocularía por vía subcutánea. A continuación, se determinarían los títulos del anticuerpo específico del virus del herpes simple y los niveles de respuesta mediados por la célula específica del virus del herpes simple. Meignier et al., J. Infect. Diseases 162: 313 (1990); Burke, Curr. Topics in Microbiology and Immunology 179: 137 (1992). La fase preliminar del estudio implicaría una inoculación de cuatro individuos con infecciones por VHS-1 documentadas (Grupo 1), conseguidas por inoculación de cuatro individuos sin tratamiento previo con VHS-1 (Grupo 2) 21 días después de haber inoculado al primer grupo. La exposición previa aL VHS-1 se documentaría por registros médicos o la epidemia de VHS-1 inequívoca, evaluada por ensayo de inmunofluorescencia del VHS-1 disponible en los laboratorios clínicos. Esto iría seguido por una prueba al azar en 24 voluntarios sin tratamiento previo con virus del herpes simple (Grupo 3). La globulina inmunitaria anti VHS-1 y los agentes anti-herpéticos están disponibles en el sitio para el tratamiento de reacciones desfavorables graves.
Los pacientes del Grupo 1, 2, 3 y 4 serían admitidos en el hospital tres días antes de la inoculación y permanecerían como pacientes hospitalizados hasta cuatro días después de la inoculación. Se descartarían a continuación los pacientes y se evaluarían en base de paciente ambulatorio con exámenes clínicos para las reacciones o complicaciones potenciales hasta el día 21. Los pacientes que desarrollan fiebre, exantema, letargo, lesiones necróticas de la piel o signos neurológicos son seguidos con exámenes clínicos posteriores a diario y admitidos en el hospital si se considera necesario.
Los voluntarios del Grupo 5, todos sin tratamiento previo con VHS-1, se inscribirían dependiendo de la disponibilidad como pacientes ambulatorios. Los voluntarios del Grupo 5 serían asignados al azar a uno de los dos subgrupos: uno recibiría una sola inyección y el otro recibiría un refuerzo.
Los estudios de participación en el protocolo incluirían exámenes periódicos de lo siguiente: CBC con diferencial y plaquetas, análisis de orina, análisis químicos del suero, viremia del suero, anticuerpo del virus del herpes simple del suero y respuestas inmunitarias contra el antígeno del virus del herpes simple. Las restantes muestras de suero se mantendrían congeladas entre -80º y 120ºC y disponibles para otros estudios y/o repeticiones de estudios seleccionados según se necesite. Se haría un muestreo de fluido en las lesiones vesiculares o que supuren en el punto de la inoculación o en puntos distantes y se colocarían en un medio de transporte para aislamiento vírico para intentar la recuperación del virus. Las determinaciones del anticuerpo del suero incluirían la reactividad en ELISA con células infectadas con el vector del virus del herpes simple, el antígeno del VHS-1 y la neutralización con reducción de la placa del vector vírico del VHS-1.
Las pruebas clínicas del vector del virus del herpes simple demostrarían que la vacuna es segura y eficaz en el hombre. Los receptores de la vacuna sería de esperar que produjean una respuesta humoral significativa medida por ELISA. Una respuesta positiva estaría caracterizada por la producción tanto de anticuerpos neutralizantes como no neutralizantes, siendo esta última medida por la reducción de la placa y ensayos de neutralización. Además, los ensayos de blastogénesis de linfocitos positivos sería de esperar que demuestren que los linfocitos procedentes de receptores de la vacuna proliferen y produzcan citocinas durante la exposición al antígeno del virus del herpes simple in vitro.
Debe entenderse que la descripción, los ejemplos específicos y los datos, indican unas formas de realización preferidas y se proporcionan a título de ilustración y ejemplo, no pretendiendo limitar la presente invención. A partir de la exposición y descripción contenida en la presente memoria, resultará evidentes para los expertos en la materia que pueden realizarse varios cambios y modificaciones en la presente invención.

Claims (7)

1. Virus del herpes simple competente para la replicación que comprende un activador específico para el tejido o específico para las células que está operativamente ligado a un gen esencial del virus del herpes simple.
2. Vector del virus del herpes simple, en el que el genoma de dicho vector vírico contiene un activador específico del tejido o específico de las células que está operativamente ligado a un gen esencial del virus del herpes simple.
3. Vector o virus según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho virus del herpes simple es VHS-1.
4. Vector o virus según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho virus del herpes simple es VHS-2.
5. Vector o virus según la reivindicación 1 a 4, en el que dicho gen esencial del virus del herpes simple es un gen del VHS adyacente inicial.
6. Virus o vector según la reivindicación 5, en el que dicho gen del VHS adyacente inicial es el gen ICP4.
7. Composición farmacéutica que comprende
(A1) el virus del herpes simple según las reivindicaciones 1 ó 3 a 6, o
(A2) el vector del virus del herpes simple según las reivindicaciones 2 a 6; y
(B) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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