ES2227701T3 - Amidasa. - Google Patents

Abstract

UNA ENZIMA TERMOESTABLE PURIFICADA DERIVADA DE LA ARCHEOBACTERIA THERMOCOCCUS GU5L5. LA ENZIMA TIENE UN PESO MOLECULAR DE 68,5 KILODALTONS APROXIMADAMENTE Y LA ACTIVIDAD DE LA CELULASA. LA ENZIMA SE PUEDE PRODUCIR A PARTIR DE CELULAS HUESPEDES NATIVAS O RECOMBINANTES Y SE PUEDE UTILIZAR PARA ELIMINAR LOS AMINOACIDOS DE ARGININA, FENILALANINA O METIONINA DEL EXTREMO N - TERMINAL DE PEPTIDOS DURANTE UNA SINTESIS PEPTIDICA O PEPTIDOMIMETICA. LA ENZIMA ES SELECTIVA AL ENANTIOMERO L O "NATURAL" DE LOS DERIVADOS DE AMINOACIDOS Y POR TANTO ES UTIL EN LA PRODUCCION DE COMPUESTOS CON UNA ACTIVIDAD OPTICA. ESTAS REACCIONES SE PUEDEN LLEVAR A CABO EN PRESENCIA DE LA FUNCIONALIDAD ESTER MAS REACTIVA QUIMICAMENTE, UN PASO QUE ES MUY DIFICIL DE CONSEGUIR A TRAVES DE PROCEDIMIENTOS NO ENZIMATICOS.

Description

Amidasa.

Esta invención se refiere a polinucleótidos identificados recientemente, polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como la producción y aislamiento de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, el polipéptido de la presente invención se ha identificado como una amidasa y, en particular, una enzima que tiene actividad en la eliminación de la arginina, fenilalanina o metionina del extremo
N-terminal de los péptidos en la síntesis peptídica o de peptidomiméticos.

Las bacterias termófilas han recibido una atención considerable como fuentes de enzimas sumamente activas y termoestables (Bronneomeier, K. y Staudenbauer, W. L., D. R. Woods (Ed.), The Clostridia and Biotechnology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA (1993). Recientemente, se han aislado y caracterizado las eubacterias organotróficas más extremadamente termófilas conocidas actualmente. Estas bacterias, que pertenecen al género Thermotoga, son microorganismos fermentativos que metabolizan una variedad de hidratos de carbono (Huber, R. y Stetter, K. O., en Ballows, et al., (Ed.), The Procaryotes, 2ª Ed., Springer-Verlaz, Nueva York, págs. 3809-3819 (1992)).

Debido que hasta la fecha, la mayoría de microorganismos identificados del dominio Arquea son termófilos e hipertermófilos, las arqueobacterias también se consideran una fuente fértil de enzimas termófilas.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una enzima nueva, así como fragmentos, análogos y derivados activos de la misma.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislados que codifican para una enzima de la presente invención, incluyendo ARNm, ADN, ADNc, ADN genómicos así como análogos y fragmentos activos de tales enzimas.

Según todavía un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir tal polipéptido mediante técnicas recombinantes que comprende cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima de la presente invención, en condiciones que promueven la expresión de dicha enzima y la posterior recuperación de dicha enzima.

Según todavía un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tal enzima, o los polinucleótidos que codifican para tal enzima. La enzima es útil para la eliminación de aminoácidos arginina, fenilalanina o metionina del extremo N-terminal de los péptidos en la síntesis peptídica o de peptidomiméticos. La enzima es selectiva para el enantiómero L o "natural" de los derivados de aminoácido y, por tanto, es útil para la producción de compuestos ópticamente activos. Estas reacciones pueden realizarse en presencia de la funcionalidad éster, químicamente más reactiva, una etapa que es muy difícil de conseguir con métodos no enzimáticos. La enzima también puede tolerar altas temperaturas (al menos de 70ºC) y elevadas concentraciones de disolventes orgánicos (> 40% de DMSO), que producen ambas una alteración de la estructura secundaria de los péptidos; esto permite la escisión de los enlaces que, si no, serían resistentes.

Según todavía un aspecto adicional de la presente invención, se prevén sondas de ácidos nucleicos que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridarse específicamente a una secuencia de ácido nucleico de la presente invención.

Según todavía un aspecto adicional de la presente invención, se prevé un procedimiento para utilizar tales enzimas, o los polipéptidos que codifican para tales enzimas, para fines in vitro relacionados con la investigación científica, por ejemplo, en la generación de sondas para identificar secuencias similares que podrían codificar para enzimas similares de otros microorganismos.

Éstos y otros aspectos de la presente invención deben ser evidentes para los expertos en la técnica de la materia a partir de las enseñanzas del presente documento.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos son ilustrativos de las realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención englobado por las reivindicaciones.

La figura 1 es una ilustración del ADN de longitud completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida de la enzima de la presente invención. La secuenciación se realizó utilizando un secuenciador de ADN automático 378 (Applied Biosystems, Inc.).

La figura 2 muestra la fluorescencia frente a la concentración de DMSO. Las casillas rellenas y abiertas representan los ensayos individuales del ejemplo 3.

La figura 3 muestra las tasas relativas lineales iniciales (aumento de la fluorescencia por minuto, es decir, la "actividad") frente a la concentración de DMF para el CBZ-L-arg-AMC más reactivo, del ejemplo 3.

Descripción detallada de la invención

El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y remolque) además de las secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

Una secuencia codificante está "unida operativamente a" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcriba las dos secuencias codificantes en un único ARNm, que después se traduce en un único polipéptido que tiene los aminoácidos procedentes de ambas secuencias codificantes. Las secuencias codificantes no tienen que estar contiguas entre sí siempre que las secuencias expresadas sean procesadas finalmente para producir la proteína deseada.

Las enzimas "recombinantes" se refiere a enzimas producidas mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producidas a partir de células transformadas mediante una construcción de ADN exógeno que codifica para la enzima deseada. Las enzimas "sintéticas" son las preparadas mediante síntesis química.

La presente invención proporciona enzimas amidasas sustancialmente puras. La expresión "sustancialmente pura" se utiliza en el presente documento para describir una molécula, tal como un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de amidasa, o un fragmento del mismo) que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los que está asociada de manera natural. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como un polipéptido, puede ser al menos el 60%, en peso seco, de la molécula de interés. La pureza de los polipéptidos puede determinarse utilizando métodos habituales, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE), cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)), y análisis de la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal.

Un "secuencia codificante" de ADN para o una "secuencia de nucleótidos que codifica para" una enzima particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en una enzima cuando se sitúa bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que puede unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo ("downstream") (en dirección 3'). El promotor es parte de la secuencia de ADN. Esta región de la secuencia tiene un codón de iniciación en su extremo 3'. La secuencia promotora sí que incluye el número mínimo de bases en las que están los elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables superiores al fondo. Sin embargo, tras unirse la ARN polimerasa a la secuencia e iniciarse la transcripción en el codón de iniciación (extremo 3' con un promotor), la transcripción avanza corriente abajo en la dirección 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (definido convenientemente mediante el mapeo con la nucleasa S1) además de dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

La presente invención prevé una enzima termoestable purificada que cataliza la eliminación de aminoácidos arginina, fenilalanina o metionina del extremo N terminal de los péptidos en la síntesis peptídica o de peptidomiméticos. La enzima purificada es una amidasa derivada de un microorganismo referido en el presente documento como "Thermococcus GU5L5" que es un microorganismo termófilo del dominio Arquea que tiene una temperatura óptima muy elevada. El microorganismo es estrictamente anaerobio y crece entre 55 y 90ºC (de forma óptima a 85ºC). GU5L5 se descubrió en una zona hidrotermal marina poco profunda en Vulcano, Italia. El microorganismo tiene células cocoides que se producen en singletes o como parejas. GU5L5 crece de forma óptima a 85ºC y un pH de 6,0 en un medio marino con peptona como sustrato y nitrógeno en fases gaseosa.

El polinucleótido de esta invención se recuperó originalmente de una librería genómica derivada de Thermococcus GU5L5, tal como se describió anteriormente. Contiene un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 622 residuos de aminoácido.

En una realización preferida, la enzima amidasa de la presente invención tiene un peso molecular de aproximadamente 68,5 kilodalton, tal como se infiere de la secuencia de nucleótidos del gen.

Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos) que codifican para la enzima madura que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2).

Esta invención, además de la molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una enzima amidasa descrita en la figura 1 (SEQ ID Nº: 1), también prevé proporciona secuencias sustancialmente similares. Las secuencias de ácido nucleico aisladas son sustancialmente similares si: (i) pueden hibridarse en condiciones rigurosas, descritas más adelante en el presente documento, a la SEQ ID Nº: 1; o (ii) codifican para secuencias de ADN que son degeneradas de la SEQ ID Nº: 1. Las secuencias de ADN degeneradas codifican para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID

\hbox{Nº: 2,}

pero tienen variaciones en las secuencias codificantes de nucleótidos. Tal como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente similares" se refiere a las secuencias que tienen una identidad similar a las secuencias de la presente invención. Las secuencias de nucleótidos que son sustancialmente similares pueden identificarse mediante hibridación o mediante comparación de la secuencia. Las secuencias de enzima que son sustancialmente similares puede identificarse mediante uno o más de lo siguiente: digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación.

Un medio para aislar una moléculas de ácidos nucleicos que codifica para una enzima amidasa es sondear una librería génica con una sonda natural o diseñada de manera artificial, utilizando procedimientos conocidos (véase, por ejemplo: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (EDS.) Green Publishing Company Assoc. Y Jonh Wiley Interscience, Nueva York, 1898, 1992). Un experto en la técnica aprecia que la SEQ ID Nº: 1, o fragmentos de la misma (que comprendan al menos 15 nucleótidos contiguos), es una sonda particularmente útil. Otras sondas particularmente útiles para estos fines son fragmentos que se pueden hibridar a secuencias de la SEQ ID Nº: 1 (es decir, que comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos).

Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan a secuencias de ácidos nucleicos específicas descritas en el presente documento, la hibridación puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso condiciones rigurosas. Como ejemplo de la hibridación de oligonucleótidos, se hibrida previamente, en primer lugar, una membrana polimérica que contiene ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45ºC en una disolución que consiste en NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0, Na_{2}EDTA 5,0 mM, SDS al 0,5%, disolución de Denhardt 10X y ácido polirriboadenílico (ácido poliadenosin-monofosfato) 0,5 mg/ml. Entonces, se añade a la disolución aproximadamente 2 x 10^{7} cpm (actividad específica de 4 - 9 x 10^{8} cpm/ug) de la sonda de oligonucleótidos marcados en el extremo con ^{32}P. Tras 12 - 16 horas de incubación, se lava la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente en medio SET 1X (NaCl 150 mM, clorhidrato de Tris 20 mM, pH 7,8, Na_{2}EDTA 1 mM) que contenía SDS al 0,5%, seguido por un lavado de 30 minutos con medio SET 1X nuevo a Tm de -10ºC para la sonda de oligonucleótidos. Después, se expuso la membrana a una película de autorradiografía para detectar las señales de hibridación.

Las condiciones rigurosas significan que la hibridación sólo se producirá si existe al menos un identidad del 90%, preferiblemente al menos una identidad del 95% y más preferiblemente al menos una identidad del 97% entre las secuencias. Véase, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory) que se incorpora al presente documento como referencia, en su totalidad.

"Identidad" tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende un porcentaje de las mismas bases que un polinucleótido de referencia (SEQ ID Nº: 1). Por ejemplo, un polinucleótido que es al menos idéntico en un 90% a un polinucleótido de referencia, tiene bases de polinucleótidos que son idénticas en el 90% de las bases que componen el polinucleótido de referencia y pueden tener bases diferentes en el 10% de las bases que comprende esa secuencia de polinucleótido.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que se diferencian del polinucleótido de referencia de tal manera que los cambios son cambios silenciosos, por ejemplo, los cambios no alteran la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido. La presente invención también se refiere a cambios nucleotídicos que dan como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamiento de aminoácidos en la enzima codificada por el polinucleótido de referencia (SEQ ID Nº: 1). En un aspecto preferido de la invención, estas enzimas retienen la misma acción biológica que la enzima codificada por el polinucleótido de referencia.

También se aprecia que tales sondas pueden y se marcan preferiblemente con un reactivo detectable analíticamente para facilitar la identificación de la sonda. Reactivos útiles incluyen, pero no se limitan a ellos, los que tienen radiactividad, tintes fluorescentes o enzimas que pueden catalizar la formación de un producto detectable. Por tanto, las sondas son útiles para aislar copias complementarias de ADN procedente de otras fuentes animales o para seleccionar tales fuentes según secuencias relacionadas.

La secuencia codificante para la enzima amidasa de la presente invención se identificó mediante la preparación de una librería de ADN genómico de Thermococcus GU5L5 y mediante la búsqueda ("screening") en la librería de los clones que tienen actividad amidasa. Tales métodos para construir una librería genómica de genes son bien conocidos en la técnica. Un medio, por ejemplo, comprende cortar ADN aislado de GU5L5 mediante una alteración física. Se comprueba una pequeña cantidad del ADN cortado sobre un gel de agarosa para verificar que la mayoría del ADN está en el intervalo deseado de tamaño (aproximadamente de 3 - 6 kb). Se producen después extremos romos en el ADN utilizando nucleasa de judía mungo, incubada a 37ºC y extraída con fenol / cloroformo. Después, se metila el ADN utilizando metilasa ECO RI. Los ligadores Eco R1 se ligan entonces a los extremos romos mediante el uso de ADN ligasa de T4 e incubación a 4ºC. La reacción de ligado se termina después y el ADN se corta de nuevo con la enzima de restricción Eco R1. depuse, el ADN se fracciona por tamaños con un gradiente de sacarosa tras procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1982, que se incorpora al presente documento como referencia, en su totalidad.

Después, se realiza un ensayo en placa para obtener una concentración aproximada del ADN. Entonces, se realizan reacciones de ligado y se empaqueta 1 \mul de la reacción de ligado para construir una librería. Por ejemplo, el empaquetamiento puede producirse mediante el uso de brazos de fago \lambdagt11 purificado cortados con EcoRI y el corte del ADN con EcoRI tras unir ligadores EcoRI. El ADN y los brazos de \lambdagt11 se ligan con ADN ligasa. El ADN ligado se empaqueta después en partículas infecciosas de fago. Los fagos empaquetados se utilizan para infectar cultivos de E. coli y las células infectadas se diseminaron sobre placas de agar para producir placas que portan miles de placas de fago individuales. Entonces, se amplificó esta librería.

Pueden utilizarse fragmentos de los genes de la presente invención como una sonda de hibridación para un ADNc o una librería genómica para aislar el ADN de longitud completa y para aislar otros ADN que tienen una elevada similitud de secuencia con el gen o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen al menos 10, preferiblemente al menos 15, e incluso más preferiblemente al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, al menos 50 o más bases. La sonda también puede utilizarse para identificar un clon de ADN correspondiente a un transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo, incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones.

Las secuencias de ácidos nucleicos aisladas y otras enzimas pueden medirse entonces para determinar la retención de la actividad biológica característica de la enzima de la presente invención, por ejemplo, en un ensayo para detectar la actividad enzimática de amidasa. Tales enzimas incluyen formas truncadas de amidasa y variantes tales como variantes de deleción e inserción.

El polinucleótido de la presente invención puede estar en la forma de ADN, ADN que incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica para la enzima madura puede ser idéntica a la secuencia codificante mostrada en la figura 1 (SEQ ID Nº: 1) y/o a la del clon depositado o puede ser una secuencia codificante diferente, secuencia codificante que, como resultado de la redundancia o la degeneración del código genético, codifica para la misma enzima madura que el ADN de la figura 1 (SEQ ID Nº: 1).

El polinucleótido que codifica para la enzima madura de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2) puede incluir, pero no se limita a ello: sólo la secuencia codificante para la enzima madura; la secuencia codificante para la enzima madura y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o una secuencia de proproteína; la secuencia codificante para la enzima madura (y opcionalmente una secuencia codificante adicional) y una secuencia no codificante, tal como intrones y secuencias no codificantes 5' y/o 3' de la secuencia codificante para la enzima madura.

Por tanto, la expresión "polinucleótido que codifica para una enzima (proteína)" engloba un polinucleótido que incluye sólo la secuencia codificante para la enzima así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en el presente documento que codifican para fragmentos, análogos y derivados de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2). La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica que se produce de manera natural del polinucleótido o una variante que no se produce de manera natural del polinucleótido.

Por tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican para la misma enzima madura mostrada en la figura 1 (SEQ ID Nº: 2) además de variantes de tales polinucleótidos, variantes que codifican para un fragmento, derivado o análogo de la enzima de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2). Tales variantes nucleotídicas incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.

Tal como se indicó anteriormente en el presente documento, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que es una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia codificante mostrada en la

\hbox{figura 1}

(SEQ ID Nº: 1). Tal como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótido que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función de la enzima para la que codifica.

La presente invención incluye también polinucleótidos, en los que la secuencia codificante para la enzima madura puede fundirse en el mismo marco de lectura a una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y la secreción de una enzima desde una célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder que funciona para controlar el transporte de una enzima desde la célula. La enzima que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura de la enzima. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proproteína que es la proteína madura más residuos de aminoácido 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la prosecuencia, queda una proteína madura activa.

Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar para una enzima madura o para una enzima que tiene una prosecuencia o para una enzima que tienen tanto una prosecuencia y una presecuencia (secuencia líder).

La presente invención se refiere también a polinucleótidos que se hibridan a las secuencias descritas anteriormente en el presente documento si existe identidad de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 90%, y más preferiblemente de al menos el 95% entre las secuencias. La presente invención se refiere particularmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos descritos anteriormente en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación sólo se producirá si existe una identidad de al menos el 95% y preferiblemente de al menos el 97% entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos descritos anteriormente en el presente documento en una realización preferida codifican para enzimas que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica de la enzima madura para la que codifica el ADN de la figura 1 (SEQ ID Nº: 1).

Alternativamente, el polinucleótido puede tener al menos 15 bases, preferiblemente al menos 30 bases y más preferiblemente al menos 50 bases que hibridan a un polinucleótido de la presente invención y que tiene una identidad con el mismo, tal como se describió anteriormente en el presente documento, y que puede retener o no la actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden emplearse como sondas para el polinucleótido de la SEQ ID Nº: 1, por ejemplo, para la recuperación del polinucleótido o como un cebador para PCR.

Por tanto, la presente invención se refiere a polinucleótidos que tienen una identidad de al menos el 70%, preferiblemente una identidad de al menos el 90% y más preferiblemente una identidad de al menos el 95% con un polinucleótido que codifica para la enzima de la SEQ ID Nº: 2, así como fragmentos del mismo, fragmentos que tienen al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50 bases, y a enzimas codificadas por tales polinucleótidos.

La presente invención se refiere además a una enzima que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la

\hbox{figura 1}

(SEQ ID Nº: 2), así como fragmentos, análogos y derivados de tal enzima.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando se refieren a la enzima de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2), hacen referencia a una enzima que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tales enzimas. Por tanto, un análogo incluye una proproteína que puede activarse mediante la escisión de la parte de proproteína para producir una enzima madura activa.

La enzima de la presente invención puede ser una enzima recombinante, una enzima natural o una enzima sintética, preferiblemente una enzima recombinante.

El fragmento, derivado o análogo de la enzima de la figura 1 (SEQ ID Nº: 2) puede ser (i) uno en el que se sustituyan uno o más de los residuos de aminoácido por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente, un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácido incluya un grupo sustituyente, o (iii) uno en que la enzima madura se fusione con otro compuesto, tal como un compuesto que incremente la vida media de la enzima (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan a la enzima madura, tales como una secuencia líder o de secreción o una secuencia que se emplea para la purificación de la enzima madura o una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos de la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.

Las enzimas y los polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada y preferiblemente se purifican hasta su homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o enzima que se produce de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o enzima, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o enzimas podrían ser parte de una composición, y estar todavía aislados porque tal vector o composición no es parte de su entorno natural.

Las enzimas de la presente invención incluyen la enzima de la SEQ ID Nº: 2 (en particular, la enzima madura) además de enzimas que tienen una similitud de al menos el 70% (preferiblemente, una identidad de al menos el 70%) con la enzima de la SEQ ID Nº: 2 y más preferiblemente una similitud de al menos el 90% (más preferiblemente, una identidad de al menos el 90%) con la enzima de la SEQ ID Nº: 2 y todavía más preferiblemente una similitud de al menos el 95% (todavía más preferiblemente una identidad de al menos el 95%) con la enzima de la SEQ ID Nº: 2 y también incluyen partes de tales enzimas, conteniendo generalmente tal parte de la enzima al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Tal como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos enzimas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácido conservado de una enzima con la secuencia de una segunda enzima. La similitud puede determinarse mediante procedimientos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool, herramienta de búsqueda por alineación local básica, en el Centro Nacional de Información Biológica).

Una variante, es decir un enzima "fragmento", "análogo" o "derivado" y una enzima de referencia pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación.

Entre las variantes preferidas se encuentran aquellas que varían de una referencia por las sustituciones de aminoácidos conservados. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Observados normalmente como sustituciones conservadoras se encuentran los reemplazamientos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los residuos hidroxilados Ser y Thr, el cambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amidados Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y los reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.

Las más preferidas son variantes que retienen la misma función y actividad biológica que el polipéptido de referencia del que varía.

Pueden emplearse fragmentos o partes de las enzimas de la presente invención para producir la correspondiente enzima de longitud completa mediante síntesis peptídica; por tanto, los fragmentos como productos intermedios pueden emplearse para producir las enzimas de longitud completa. Pueden utilizarse fragmentos o partes de los polinucleótidos de la presente invención para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen los polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que se modifican mediante ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de enzimas mediante técnicas recombinantes.

Las células huésped se modifican mediante ingeniería genética (se transducen o transforman o transfectan) con los vectores que contienen los polinucleótidos de esta invención. Tales vectores pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped modificadas mediante ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según corresponda para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y será evidente para el experto habitual en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir enzimas mediante técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión, para expresar una enzima. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que pueda replicarse y sea viable en el huésped.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un(os) sitio(s) de una endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a una(s) secuencia(s) de control de la expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse: el promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos para controlar la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico, para la selección de células huésped transformadas, tal como la resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como la resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada tal como se describió anteriormente en el presente documento, así como el promotor o la secuencia de control apropiados, pueden empleare para transformar un huésped apropiado para que permita al huésped expresar la proteína.

Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como
E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como levaduras; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO (de ovario de hámster chino), COS (células de riñón de mono transformadas con SV40) o de melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.

Más particularmente, la presente invención incluye también construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias tal como se describió ampliamente con anterioridad. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta invención, la construcción comprende además secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la secuencia. Se conocen un gran número de vectores y promotores adecuados por los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente. Los siguientes vectores se facilitan a modo de ejemplo; bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eucarióticos: pXT1, pSG5 (Stratagene) pSVK3, pBVP, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que se puedan replicar y sean viables en el huésped.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado que utilice vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos particulares nombrados incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{L}, P_{R} lambda, y trp. Los promotores eucarióticos incluyen CMV de expresión temprana ("immediate early"), timidina quinasa de VHS (virus del herpes simplex), SV40 de expresión temprana ("early") y tardía ("late"), LTR (repeticiones terminales largas) de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuados está bastante dentro del nivel del experto habitual en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a células huésped que contienen las construcciones mencionadas anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede realizarse mediante la transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Las construcciones en las células huésped pueden utilizarse de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, las enzimas de la invención pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres de células también pueden emplearse para producir tales proteínas utilizando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión adecuados para su uso con huéspedes procarióticos y eucarióticos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), cuya descripción se incorpora como referencia al presente documento.

La transcripción del ADN que codifica para las enzimas de la presente invención por eucariotas superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en forma cis, normalmente de aproximadamente desde 10 hasta 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación de 100 a 270 pb, un potenciador del promotor de expresión temprana de citomegalovirus, el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia líder que pueda dirigir la secreción de la enzima traducida. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una enzima de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que le confiere las características deseadas, por ejemplo, la estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Vectores de expresión útiles para su uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con las señales deseadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos de selección y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proporcionar amplificación dentro del huésped. Huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como elección.

Como ejemplo representativo pero no limitante, vectores de expresión útiles para su uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de clonación, bien conocido, pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "esqueleto" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Tras la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, se induce el promotor seleccionado mediante medios adecuados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un periodo adicional.

Normalmente, las células se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se retiene para una purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método convencional, incluyendo ciclos de congelación - descongelación, sonicación, disrupción mecánica o uso de agentes de lisado celular, tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden emplearse varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descrito por Gluzman, Cell, 23:175 (1981) y otras líneas celulares que puedan expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador, y también cualquier sitio de unión a ribosomas, sitio de poliadenilación, sitios donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias 5' flanqueantes no transcritas que sean necesarios/as. Las secuencias de ADN derivadas de los sitios de empalme SV40 y de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

La enzima puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía en fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la cromatografía en hidroxiapatita y la cromatografía en lectina. Pueden utilizarse etapas para un nuevo plegamiento de la proteína, cuando sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación.

Las enzimas de la presente invención pueden ser un producto purificado de manera natural, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producidas mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos en cultivo). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, las enzimas de la presente invención pueden estar glicosiladas o pueden no estar glicosiladas. Las enzimas de la invención pueden también incluir o no un residuo de aminoácido inicial de metionina.

Las enzimas, sus fragmentos o sus derivados, o análogos de la misma, o células que las expresan, pueden utilizarse como un inmunogen para producir anticuerpos de las mismas. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos híbridos, monocatenarios y humanizados, además de fragmentos Fab, o el producto de una librería de expresión Fab. Pueden utilizarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados contra las enzimas correspondientes a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse por inyección directa de las enzimas en un animal o administrando las enzimas a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a las propias enzimas. De esta manera, incluso una secuencia que codifica sólo para un fragmento de las enzimas puede utilizarse para generar anticuerpos que se unen a las enzimas nativas en su totalidad. Tales anticuerpos pueden utilizarse entonces para aislar la enzima de las células que expresan esa enzima.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas(Kozbor
et al., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica del hibridoma de VEB (virus Epstein-Barr) para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de los EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios frente a los productos de enzima inmunogénicos de esta invención. También, pueden utilizarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados frente a productos de enzima inmunogénicos de esta invención.

Los anticuerpos generados contra la enzima de la presente invención pueden utilizarse en la búsqueda de enzimas similares procedentes de otros microorganismos y muestras. Tales técnicas de búsqueda son conocidas en la técnica, por ejemplo, uno de tales ensayos de búsqueda se describe en "Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in Enzimology, Vol. 160, págs. 87-116, que se incorpora como referencia al presente documento, en su totalidad. Los anticuerpos también pueden utilizarse como una sonda para hacer búsquedas en librerías de genes generadas a partir de éste u otros organismos para identificar ésta ó actividades de reacción cruzada.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a moléculas intactas de inmunoglobulina, así como a fragmentos de moléculas de inmunoglobulina, tales como fragmentos Fab, Fab', (Fab')_{2}, Fv y SCA, que pueden unirse a un epítopo de un polipéptido de amidasa. Estos fragmentos de anticuerpo, que retienen cierta capacidad para unirse selectivamente al antígeno (por ejemplo, un antígeno de amidasa) del anticuerpo del que proceden, pueden prepararse utilizando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, anteriormente), y se describen adicionalmente, tal como sigue.

(1) Un fragmento Fab consiste en un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, y puede producirse mediante digestión de una molécula completa de anticuerpo con la enzima papaína, para dar un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada.

(2) Un fragmento Fab' de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando una molécula completa de anticuerpo con pepsina, seguido por reducción, para dar una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo tratada de esta manera.

(3) Un fragmento (Fab')_{2} de un anticuerpo puede obtenerse tratando una molécula completa de anticuerpo con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento (Fab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab', unidos entre sí mediante dos enlaces disulfuro.

(4) Un fragmento Fv se define como un fragmento modificado mediante ingeniería genética que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresado como dos cadenas.

(5) Un anticuerpo monocatenario ("SCA") es una molécula monocatenaria modificada mediante ingeniería genética que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada, unidas mediante un ligador de polipéptido flexible, adecuado.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, tal como un polipéptido de amidasa, al que se une el paratopo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de amidasa. Los determinantes antigénicos normalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie activa químicamente, tales como cadenas laterales de aminoácidos o azucares y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades son en peso, a menos que se especifique lo contrario.

Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen frecuentemente.

Los "plásmidos" se designan mediante una p minúscula precedido y/o seguido por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en el presente documento están disponibles comercialmente, disponibles públicamente sin restricciones o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles según los procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el experto habitual.

La "digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que sólo actúa en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en el presente documento están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se utilizaron tal como conocerá un experto habitual. Para fines analíticos, normalmente se utiliza 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de disolución tampón. Para el fin de aislar fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, normalmente se digieren de 5 a 50 \mug de ADN con de 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Las cantidades de sustrato y tampón adecuadas para enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Generalmente, se utilizan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Tras la digestión, se somete la reacción a electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza utilizando un gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos pueden o no tener un fosfato en 5'. Los que no, no se ligarán a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una Kinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado.

"Ligado" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre los dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Maniatis et al., Id., pág. 146). A menos que se proporcione de otra manera, el ligado puede realizarse utilizando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a ligar.

A menos que se establezca lo contrario, la transformación se realizó tal como se describe en el método de Sambrook, Fritsch y Maniatus, 1989.

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de amidasa

Se hizo una búsqueda de la actividad amidasa en una librería genómica de Thermococcus GU5L5 tal como se describe en el ejemplo 2 y se identificó y aisló un clon positivo. El ADN de este clon se utilizó como molde en una reacción de PCR de 100 \mul utilizando las siguientes secuencias de cebador:

Cebador 5': CCGAGAATTC ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGACCGGC ATCGAATGGA 3' (SEQ ID

\hbox{Nº: 3).}

Cebador 3': 5' AATAAGGATC CACACTGGCA CAGTGTCAAG ACA 3' (SEQ ID Nº: 4).

La proteína se expresó en E. coli. El gen se amplificó utilizando PCR con los cebadores indicados anteriormente.

Posteriormente a la amplificación, el producto de PCR se clonó en los sitios EcoRI y BamHI de pQET1 y se transformó por electroporación en M15(pREP4) de E. coli. Los transformantes resultantes se hicieron crecer en cultivos de 3 ml, y se indujo una parte de este cultivo. Se ensayaron una parte de los cultivos inducidos y no inducidos utilizando Z-L-Phe-AMC (véase más adelante).

Las secuencias cebadoras expuestas anteriormente también se emplearon para aislar el gen objetivo del material depositado mediante las técnicas de hibridación descritas anteriormente.

Ejemplo 2 Descubrimiento de una amidasa de Thermococcus GU5L5 Producción de un banco de genes de expresión

Se obtuvieron colonias que contenían plásmidos pBluescript con insertos aleatorios del microorganismo Thermococcus GU5L5 según el método de hay y Short. (Hay, B. y Short, J., Strategies, 1992, 5, 16.) Las colonias resultantes se recogieron con palillos estériles y se utilizaron para inocular individualmente cada uno de los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos. Los pocillos contenían 250 \mul de medio LB (Luria-Bertani) con ampicilina 100 \mug/ml, meticilina 80 \mug/ml y glicerol al 10% v/v (LB Amp/Met, glicerol). Las células se hicieron crecer durante la noche a 37ºC sin agitación. Esto constituyo la generación del "SourceGeneBank" (banco de genes fuente); cada pocillo del SourceGeneBank contenía así un cultivo madre de células de E. coli, cada uno de los cuales contenía un plásmido pBluescript con un único inserto de ADN.

Búsqueda de la actividad amidasa

Se utilizaron las placas del SourceGeneBank para multiplicar los inoculados de una placa individual (la "placa condensada") que contenía en cada pocillo 200 \mul de medio LB Amp/Met, glicerol. Esta etapa se realizó utilizando la Herramienta de Replicación de Alta Densidad (HDRT) de Beckman Biomek con un 1% de blanqueador, agua, isopropanol, ciclo de esterilización con aire seco entre cada inoculación. Cada pocillo de la placa condensada contenía, por tanto, de 10 a 12 clones diferentes de pBluescript de cada una de las placas de la librería fuente. La placa condensada se hizo crecer durante 16 h a 37ºC y luego se utilizó para inocular dos placas hijas de microtitulación, blancas, de 96 pocillos y de Polyfiltronics que contenían en cada pocillo 250 \mul de medio LB Amp/Met, (sin glicerol). La placa condensada original se puso en almacenamiento a -80ºC. Las dos placas hijas condensadas se incubaron a 37ºC durante 18 h.

Se preparó la "disolución madre de sustrato 600 \muM" tal como sigue: se disolvieron 25 mg de N-morfourea-L-fenilalanil-7-amido-4-trifluorometilcumarina (Mu-Phe-AFC, Enzyme Systems Products, Dublín, CA) en el volumen apropiado de DMSO para dar una disolución 25,2 mM. Se añadieron doscientos cincuenta microlitros de disolución DMSO a aproximadamente 9 ml de tampón Hepes 50 mM, pH 7,5 que contenía 0,6 mg/ml de dodecilmaltósido. El volumen se enrasó hasta 10,5 ml con el tampón Hepes anterior para dar una disolución turbia.

Mu-Phe-AFC

Se añadieron cincuenta \mul de la "disolución madre 600 \muM" a cada uno de los pocillos de una placa condensada blanca utilizando el Biomek para dar una concentración final de sustrato de aproximadamente 100 \muM. Se registraron los valores de fluorescencia (excitación = 400 nm, emisión = 505 nm) con un fluorímetro de lectura de placas inmediatamente después de la adición del sustrato. La placa se incubó a 70ºC durante 60 minutos y se registraron de nuevo los valores de fluorescencia. Se restaron los valores de fluorescencia inicial y final para determinar si estaba presente un clon activo mediante un aumento de la fluorescencia en la mayoría de los otros pocillos.

Aislamiento del clon activo

Con el fin de aislar el clon individual que porta la actividad, se descongelaron las placas del Source GeneBank y se utilizaron los pocillos individuales para inocular por separado una nueva placa que contenía medio LB Amp/Met. Como se ha citado anteriormente, la placa se incubó a 37ºC para hacer crecer las células, y se añadieron 50 \mul de la disolución madre de sustrato 600 \muM utilizando el Biomek. Una vez que se identificó el pocillo activo de la placa fuente, se utilizaron las células de la placa fuente para inocular cultivos de 3 ml de medio LB/AMP/Met, que se hicieron crecer durante la noche. El ADN del plásmido se aisló de los cultivos y se utilizó para la secuenciación y construcción de subclones de expresión.

Ejemplo 3 Caracterización de amidasa de Thermococcus GU5L5 Especificidad de sustrato

Utilizando los siguientes sustratos (véase más adelante para las definiciones de las abreviaturas): CBZ-L-ala-AMC, CBZ-L-arg-AMC, CBZ-L-met-AMC, CBZ-L-phe-AMC y heptanoato de 7-metil-umbeliferilo a 100 \muM durante
1 hora a 70ºC en los ensayos tal como se describe en la sección de descubrimiento del clon, la actividad relativa de la amidasa fue de 3.3:1: < 0,1: < 0,1 para los compuestos CBZ-L-arg-AMC: CBZ-L-phe-AMC : CBZ-L-met-

\hbox{AMC :}

CBZ-L-ala-AMC : heptanoato de 7-metil-umbeliferilo. Las longitudes de onda de excitación y emisión para las 7-amido-4-metilcumarinas fueron de 380 y 460 nm, respectivamente, y de 326 y 450 para la metilumbeliferona.

Las abreviaturas significan los siguientes compuestos:

CBZ-L-ala-AMC = N\alpha-carbonilbenciloxi-L-alanina-7-amido-4-metilcumarina

CBZ-L-arg-AMC = N\alpha-carbonilbenciloxi-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina

CBZ-D-arg-AMC = N\alpha-carbonilbenciloxi-D-arginina-7-amido-4-metilcumarina

CBZ-L-met-AMC = N\alpha-carbonilbenciloxi-L-metionina-7-amido-4-metilcumarina

CBZ-L-phe-AMC = N\alpha-carbonilbenciloxi-L-fenilalanina-7-amido-4- metilcumarina

Sensibilidad al disolvente orgánico

Se probó la actividad de la amidasa en concentraciones crecientes de dimetilsulfóxido (DMSO) tal como sigue: a cada pocillo de una placa de microtitulación se añadieron 10 \mul de CBZ-L-phe-AMC 3 mM en DMSO, 25 \mul de lisado celular que contenía la actividad amidasa, y 250 \mul de una mezcla variable de DMSO : tampón Hepes 50 mM, pH 7,5. Las reacciones se calentaron durante 1 hora a 70ºC y se midió la fluorescencia. La figura 2 muestra la fluorescencia frente a la concentración de DMSO. Las casillas rellenas y abiertas representan los ensayos individuales.

Se probó la actividad y enantioselectividad de la amidasa en concentraciones crecientes de dimetilformamida (DMF) tal como sigue: a cada pocillo de una placa de microtitulación se añadieron 30 \mul de CBZ-L-arg-AMC o CBZ-D-arg-AMC 1 mM en DMF, 30 \mul de lisado celular que contenía la actividad amidasa y 240 \mul de una mezcla variable de DMF : tampón Hepes 50 mM, pH 7,5. Las reacciones se incubaron a TA durante 1 hora a 70ºC y se midió la fluorescencia a intervalos de 1 minuto. La figura 3 muestra las tasas relativas lineales iniciales (aumento de la fluorescencia por minuto, es decir, la "actividad") frente a la concentración de DMF para el CBZ-L-arg-AMC más reactivo.

La tasa lineal inicial ("actividad") de los sustratos de CBZ-arg-AMC L y D se muestra en las tablas 1 y 2, a continuación:

\hskip3cm

TABLA 1

\hskip7,2cm

TABLA 2

1

Los datos anteriores indican que la enzima muestra una excelente selectividad para el enantiómero L, o "natural" del sustrato de aminoácido derivatizado.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la presente invención puede practicarse de otras formas distintas a la descrita en particular.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Recombinant Biocatalysis, Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Amidasas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: FISH & RICHARDSON

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(B)

CALLE: 4225 EXECUTIVE SQUARE, STE. 1400

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(C)

CIUDAD: LA JOLLA

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 92037

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(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: DISQUETE DE 3,5 PULGADAS

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(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: WORD PERFECT 6.0

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: No asignado

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: Adjunta

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/664.646

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 de junio de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO / AGENTE:

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(A)

NOMBRE: LISA A. HAILE, Ph.D.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38.347

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 09010/005WO1

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(ix)

INFORMACIÓN DE COMUNICACIÓN A DISTANCIA:

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(A)

TELÉFONO: 619-678-5070

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 619-678-5099

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 1869 NUCLEÓTIDOS

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(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

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(C)

NATURALEZA DE LAS CADENAS: ÚNICA

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 622 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NATURALEZA DE LAS CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 NUCLEÓTIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NATURALEZA DE LAS CADENAS: ÚNICA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGAATTC ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGACCGGC ATCGAATGGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 NUCLEÓTIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NATURALEZA DE LAS CADENAS: ÚNICA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATAAGGATC CACACTGGCA CAGTGTCAAG ACA

\hfill

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Claims (16)

1. Un Polinucleótido aislado o polinucleótido recombinante seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 2;

(b)

el polinucleótido de (a) que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID Nº: 1 desde el nucleótido 1 hasta el 1869;

(c)

un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1;

(d)

un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 70% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ IN NO: 1;

(e)

el polinucleótido de (a) a (d), en el que T también puede ser U;

(f)

un polinucleótido que es complementario en su secuencia al polinucleótido de (a) a (e);

(g)

un fragmento del polinucleótido de (b) a (f) que tiene al menos 15 bases de longitud y que hibrida al polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones (a)a(f) en condiciones de hibridación de NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Na_{2}EDTA 5,0 mM, pH 7,0, SDS al 0,5%, disolución de Denhardt 10X y ácido polirriboadenílico 0,5 mg/ml a 45ºC; y

(h)

un polinucleótido que comprende una secuencia que hibrida a la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID Nº: 1 en condiciones de hibridación de NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Na_{2}EDTA 5,0 mM, pH 7,0, SDS al 0,5%, disolución de Denhardt 10X y ácido polirriboadenílico 0,5 mg/ml a 45ºC.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 90% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID Nº: 1.

3. El polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 95% con la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID Nº: 1.

4. El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polinucleótido se aísla de un procariota.

5. Un vector que incluye un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector según la reivindicación 5, que es un vector de expresión.

7. El vector según la reivindicación 5 ó 6, en donde el vector es un plásmido o procede de un virus.

8. Una célula huésped transformada con el vector según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. La célula huésped según la reivindicación 8, en la que la célula es procariótica.

10. La Célula huésped según la reivindicación 8, en la que la célula se selecciona de un grupo que consiste en células animales, células de mamíferos, células vegetales, células de insectos, células fúngicas, células de levaduras y células bacterianas.

11. Un procedimiento para producir una célula recombinante que comprende transformar o transfectar la célula con el vector según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, de tal manera que la célula exprese un polipéptido codificado por el polinucleótido aislado o recombinante de la reivindicación 1 contenido en el vector.

12. Un Polipéptido aislado o recombinante seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 2;

(b)

un polipéptido codificado por el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;

(c)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 2; y

(d)

un polipéptido que comprende al menos una secuencia de 30 residuos de aminoácido consecutivos de un polipéptido de (a) a (c).

13. Un método para producir un polipéptido que comprende hacer crecer la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en condiciones que permitan la expresión de un polinucleótido que codifica para el polipéptido según la reivindicación 12 y aislar dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido es una enzima con actividad amidasa.

14. Anticuerpos que se unen al polipéptido según la reivindicación 12.

15. Los Anticuerpos según la reivindicación 14, en donde los anticuerpos son policlonales o monoclonales.

16. Un procedimiento para la eliminación de arginina, fenilalanina o metionina del extremo N-terminal de péptidos en la síntesis peptídica o peptidomimética, que comprende: administrar una cantidad eficaz del polipéptido de la reivindicación 13 para la eliminación de arginina, fenilalanina o metionina del extremo N-terminal de péptidos en la síntesis peptídica o peptidomimética.