ES2227802T3 - Metodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celularprogramada. - Google Patents

Metodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celularprogramada.

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Abstract

Un método para identificar inhibidores de la muerte celular programada en un sistema libre de células, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar un sistema libre de células que comprende eIF-2 fosforilado y proteína fosfatasa 1 (PP1); (b) introducir en el sistema libre de células de la etapa (a) un inhibidor candidato de la muerte celular programada, y dejar incubar a la mezcla resultante; y (c) medir el nivel de fosforilación de eIF-2 resultante de la etapa (b); en el que un inhibidor de la muerte celular programada disminuye o evita el aumento del nivel de fosforilación de eIF-2 que acompaña a la muerte celular programada, cuando se compara con un control.

Description

Métodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celular programada.
Antecedentes de la invención
La muerte celular programada, o apoptosis, es un mecanismo celular activo y tiene varias implicaciones importantes. Primeramente, está claro que tal proceso activo puede proporcionar un medio adicional para regular el número de células así como las actividades biológicas de las células. En segundo lugar, las mutaciones o sucesos celulares que potencian la apoptosis pueden dar como resultado una muerte celular prematura. En tercer lugar, al menos se puede suprimir potencialmente una forma de muerte celular que depende de un mecanismo celular activo específico. Finalmente, es de esperar que la inhibición de la muerte celular programada conduzca a una supervivencia aberrante de las células, y se podría esperar que contribuya a la oncogénesis, mientras que, por el contrario, se piensa que a través de la apoptosis o muerte celular programada se podría inducir el suicidio de las células tumorales.
En general, la muerte celular programada implica cambios morfológicos distintos que incluyen la condensación nuclear y la degradación del ADN a fragmentos oligonucleosómicos. En ciertas circunstancias es evidente que la apoptosis está disparada o está precedida por cambios en la síntesis de las proteínas. Por ejemplo, la síntesis de proteínas celulares se puede reducir significativamente. La degradación del ADN descrita anteriormente puede ser un proceso lento, ocurriendo días después del cese de las actividades biosintéticas de las células. Parece que la apoptosis proporciona un proceso muy limpio para la destrucción celular, por cuanto las células son eliminadas mediante reconocimiento específico y fagocitosis antes de romperse. De este manera, las células se pueden eliminar de un tejido sin provocar daño a las células vecinas. De este modo, se puede observar que la muerte celular programada es importante para un número de procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo morfológico, la selección clonal en el sistema inmunitario, y la maduración normal y muerte celular en otros sistemas de tejidos y órganos.
También se ha demostrado que las células pueden sufrir apoptosis o muerte celular programada en respuesta a estímulos medioambientales. Los ejemplos incluyen la aparición de un estímulo, tal como las hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, o la desaparición de un estímulo, tal como la retirada de interleuquina-2 de linfocitos maduros, o la eliminación de factores estimulantes de colonias de precursores hematopoyéticos (para un repaso de la bibliografía, véase Williams, Cell, 65:1097-1098 [11991]). Además, se ha demostrado recientemente que la respuesta a la eliminación del factor de crecimiento neuronal de cultivos neuronales conocidos que imitan la eliminación diana, o axiotomía, u otros métodos de eliminación de factores tróficos, es un accionamiento de un programa de suicidio o de la muerte celular programada [véase Johnson et al., Neurobiol of Aging, 10:549-552 (1989)]. Se propone una "cascada de muerte" o "programa de muerte" que imagina que la pérdida de factores tróficos inicia la transcripción de nuevo ARNm y la traducción subsiguiente de ese ARNm en proteínas asociadas con la muerte que actúan en secuencia para producir, en último lugar, "proteínas asesinas". Tal mecanismo intracelular parece que se ajusta bastante bien con las características de la apoptosis discutidas anteriormente, por ejemplo, muerte de células específicas sin la liberación de materiales dañinos y sin el desbaratamiento de la integridad de los tejidos. Además, se indica que los inhibidores de la síntesis macromolecular evitaron la muerte de neuronas en ausencia del factor de crecimiento neuronal.
Se han realizado estudios para explorar la posibilidad de que las células tumorales se puedan eliminar mediante apoptosis accionada artificialmente. El anticuerpo monoclonal anti-APO-1 induce apoptosis en varias estirpes de células B y T humanas transformadas. El anticuerpo se une a una proteína de superficie de 52 kd, y podría actuar imitando una señal positiva inductora de la muerte o bloqueando la actividad de un factor requerido para la supervivencia. Los anticuerpos anti-FAS tienen efectos similares. La reciente clonación y secuenciación del gen del antígeno FAS ha demostrado que es un receptor transmembránico de 63 kilodaltons (Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)).
Sin embargo, es probable que ni APO-1 ni FAS funcionen exclusivamente como un accionador para la muerte celular. Ambos son receptores de superficie celulares que pueden activar respuestas celulares bastante diferentes en otras circunstancias. Además, estos antígenos no están restringidos a células tumorales, y su efecto sobre células normales es ciertamente una consideración importante, como es la posible aparición de variantes que ya no desempeñen los antígenos.
También se ha demostrado que la muerte celular inducida por un intervalo de fármacos citotóxicos, incluyendo varios usados en la terapia contra el cáncer, parece ser también una forma de apoptosis [Barry et al, Biochem. Biopharmacol., 40:2353-2362 (1990)]. Esto también es cierto, en muchos casos, para la muerte celular después de la irradiación con rayos \gamma o rayos X [Williams, Cell, 65:1097-1098 1991)]. De hecho, el fallo de la apoptosis o muerte celular programada en células tumorales podría ser de importancia fundamental en la contribución no sólo a la evasión de los controles fisiológicos sobre los números de células sino también a la resistencia tanto a defensas naturales como a la terapia clínica.
La expresión del gen bcl-2 ha demostrado que inhibe la muerte por apoptosis. El gen bcl-2 se aisló del punto de ruptura de la translocación entre los cromosomas 14 y 18 encontrados en una proporción elevada de los linfomas humanos más habituales, siendo estos los linfomas de células B foliculares. La translocación junta el gen bcl-2 y el locus que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina, dando como resultado un aumento aberrante de la expresión de bcl-2 en células B. Subsiguientemente, Henderson et al., [Cell, 65:1107-1115 (1991)] demostraron que la expresión de la proteína 1 membránica latente en células infectadas por el virus de Epstein-Barr protegió de la muerte celular programada a las células B infectadas al inducir la expresión del gen bcl-2. Sentman et al., [Cell, 67:879-888 (1991)] demostraron que la expresión del gen bcl-2 puede inhibir múltiples formas de apoptosis, pero no la selección negativa en timocitos. Strasser et al. [Cell, 67:889-899 (1991)] demostraron que la expresión del transgén bcl-2 inhibe la muerte de células T, y puede perturbar la capacidad de autocensura tímica. Clem et al. [Science, 245:1388-1390 (1991)] identificaron un producto génico de baculovirus específico como el responsable del bloqueo de la apoptosis en células de insectos. Gagliardini et al [Science, 263:826-828 (1994)] demostraron la capacidad del producto génico crmA para evitar la apoptosis en gangliocitos de la raíz posterior de la médula espinal de los pollos a los que se les había privado del factor de crecimiento neuronal. De forma más general, Barinaga, [Science, 263:754-756 (1994)] también discute el papel de bcl-2, Bax (largo), bclX (corto) e ICE en la apoptosis.
Se ha asociado un número de enfermedades con la apoptosis de células neuronales. Por ejemplo, se ha asociado a la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig) con la muerte celular apoptótica. Alexianu et al., J. Neurochem. 63:2365-2368 (1994). La atrofia muscular espinal está asociada con la eliminación parcial de una proteína inhibidora de la apoptosis, lo que da como resultado la muerte celular apoptótica. Roy et al., Cell 80:167-178 (1995). También se ha asociado a la enfermedad de Huntington con la muerte celular apoptótica. Portera-Cailliau et al., J. Neurosci 15:3775-3787 (1995). La muerte celular apoptótica también ha sido fuertemente implicada en la enfermedad de Alzheimer, Gschwind et al., J. Neurochem 65:292-300 (1995); y LaFerla et al., Nat. Genet. 9:21-30 (1995).
De este modo, está claro que la capacidad para controlar la apoptosis o muerte celular programada, tal como induciéndola para que ocurra en células (por ejemplo, en células tumorales), o para evitar la apoptosis o muerte celular programada (por ejemplo, en estados patológicos neurodegenerativos tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, atrofia muscular espinal, y otros trastornos neurodegenerativos), permitirá la intervención terapéutica en enfermedades para las cuales hay actualmente pocas modalidades terapéuticas, si es que hay alguna. A fin de lograr tal control terapéutico, se deben proporcionar métodos de detección para identificar sustancias que induzcan o inhiban la muerte celular programada.
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar métodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celular programada en sistemas libres de células. Más particularmente, la invención se dirige a métodos para identificar inhibidores o inductores de la muerte celular programada, o apoptosis, que ejerzan sus efectos interactuando con elementos de la maquinaria sintética de proteínas de una célula cuando se ensayen en un sistema libre de células.
La invención explota la observación de que las células, cuya síntesis de proteínas se detiene como resultado de ciertas agresiones que provocan la muerte celular programada, o apoptosis, muestran un aumento en la capacidad para fosforilar o para evitar la desfosforilación de eIF-2\alpha. La invención también explota la observación de que las proteínas que han demostrado que evitan la muerte celular programada, tales como \gamma_{1}34.5 y GADD34, reducen el nivel de fosforilación de eIF-2\alpha.
Según la invención, un inhibidor de la muerte celular programada se identifica por su capacidad para disminuir el nivel de fosforilación de eIF-2\alpha fosforilado, o para evitar la fosforilación de eIF-2\alpha en un sistema libre de células que comprende PP1\alpha y eIF-2\alpha.
Los inductores de la muerte celular programada se identifican en un sistema libre de células de la invención por su capacidad para evitar la desfosforilación de eIF-2\alpha, para inducir la fosforilación de eIF-2\alpha y/o para interactuar con (por ejemplo, activar) PKR.
Otros objetos y ventajas de la invención pueden ser manifiestos para los expertos en la técnica a partir de un repaso de la siguiente descripción detallada, tomada conjuntamente con las figuras y las reivindicaciones anejas.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B ilustran la actividad de eIF-2\alpha quinasa en extractos de células infectadas y extractos de células falsamente infectadas.
Las Figuras 2A y 2B ilustran la asociación de fosfatasa 1\alpha con \gamma_{1}34.5 y MyD116.
Las Figuras 3A y 3B muestran imágenes autorradiográficas de proteínas marcadas con ^{35}S-metionina, separadas mediante electroforesis, a partir de lisados celulares infectados con los virus indicados en presencia o ausencia de ácido ocadaico.
La Figura 4 representa imágenes autorradiográficas de eIF-2, separado mediante electroforesis, después de la reacción con variantes de células falsamente infectadas, y de células infectadas con HSV-1(F), R3616, y R8300.
Las Figuras 5A a 5D ilustran la actividad de fosfatasa en fracciones de S10 de células HeLa falsamente infectadas, y de tales células infectadas con 20 pFU de HSV-1(F), R3616 o R3800 por célula. La Figura 5A muestra la radioactividad residual en eIF-2\alpha después de la reacción con cantidades variables de fracciones de S10 procedentes de células infectadas o falsamente infectadas. La Figura 5B muestra el efecto del inhibidor 2 sobre la velocidad de desfosforilación de eIF-2\alpha 1\alpha^{32}P mediante la actividad de fosfatasa en las fracciones de S10. La Figura 5C muestra la actividad de fosfatasa de ^{21}P-fosforilasa. La Figura 5D muestra el efecto del inhibidor 2 sobre la velocidad relativa de la actividad de fosfatasa de ^{32}P-fosforilasa.
Descripción detallada
Los virus del herpes simple tienen características particulares que les hacen útiles para el estudio de la muerte celular programada (véase el documento WO 93/19591 publicado el 14 de Octubre de 1993 y las referencias citadas más abajo). El virus del herpes simple 1 (HSV-1) codifica un gen, \gamma_{1}34.5, cuya función es impedir una respuesta de hospedante que termina toda la síntesis de proteínas subsiguiente al comienzo de la síntesis del ADN vírico [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)]. El gen \gamma_{1}34.5 se localiza en las secuencias que flanquean a la secuencia única larga de ADN del HSV-1 y, por lo tanto, está presente en dos copias por genoma [Chou et al., J. Virol. 57:629-637 (1986)]. La proteína de 263 aminoácidos codificada por el \gamma_{1}34.5 de HSV-1(F) consta de tres dominios, un dominio aminoterminal de 160 aminoácidos, diez repeticiones de tres aminoácidos (AlaThePro), y un dominio carboxiterminal de 73 aminoácidos [Chou et al., J. Virol. 64:1014-1020 (1990)]. Un intervalo de 64 aminoácidos en el término carboxílico del \gamma_{1}34.5 es homólogo a un intervalo correspondiente de aminoácidos del término carboxílico de una proteína de múrido conocida como MyD116 y una proteína de hámster chino conocida como GADD34 [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); McGeoch et al., Nature (Londres) 353:609 (1991)]. La MyD116 es un miembro de un conjunto de proteínas inducido en células de leucemia mielógena, por diferenciación terminal mediante interleuquina 6 [Lord et al., Nucleic Acids Res. 18:2823 (1990)]. La GADD34, relacionada muy íntimamente con MyD116, es también una de un subconjunto de proteínas inducidas tras el daño de ADN o la detención del crecimiento celular [Fornace et al., Mol. Cell. Biol. 9:4196-4203 (1989); Fornace et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:139-153 (1992); Zhan et al., Mol. Cell. Biol. 14:2361-2371 (1994)].
La infección de células humanas con el virus del herpes simple, en el que ambas copias de \gamma_{1}34.5 están inactivadas o eliminadas, pero particularmente de la estirpe celular SK-N-SH de neuroblastoma humano o fibroblastos de prepucio humano primarios, da como resultado el cese casi completo de la síntesis de proteínas celulares del hospedante y el ciclo replicativo del virus [Chou et al., J. Virol. 66:8304-8311 (1994)]. Esta parada prematura total de la síntesis de proteínas no se observa en estas células cuando se tratan con inhibidores de la síntesis de ADN vírico o en células Vero [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)].
La capacidad para evitar la parada prematura total de la síntesis de proteínas se localiza en el dominio del término carboxílico de la proteína \gamma_{1}34.5 que es homóloga a la proteína MyD116 [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5247-5251 (1994)]. Efectivamente, el término carboxílico de MyD116 sustituye con éxito al dominio correspondiente de \gamma_{1}34.5. Los virus que carecen de la proteína \gamma_{1}34.5, o son capaces de expresar el término carboxílico de la proteína, son totalmente avirulentos en un modelo de encefalitis murina de infecciones de HSV-1 [Chou et al., Science 250:1262-1266 (1990); Whitley et al., J. Clin. Invest. 91: 2837-2843 (1993); McKie et al., J. Gen. Virol. 75:733-741 (1994)].
Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995) extendió estas observaciones y demostró que, en células infectadas mutantes o de tipo salvaje, se activaba la proteína quinasa dependiente de ARN bicatenario (PKR). Sin embargo, sólo se fosforilaba la subunidad \gamma de eIF-2\alpha en células infectadas con los mutantes de \gamma_{1}34.5 que carecían del dominio de \gamma_{1}34.5 que codifica el término carboxílico de la proteína.
La parada prematura de la síntesis de proteínas asociada con la muerte celular programada da lugar a varias cuestiones interesantes, es decir, que acciona a la respuesta del hospedante, cuál es el mecanismo por el cual se apaga la síntesis de proteínas, y cuál es el mecanismo mediante el cual \gamma_{1}34.5 evita la respuesta del hospedante.
Los datos presentados más abajo muestran que (i) el término carboxílico de MyD116 interactúa con la fosfatasa 1\alpha proteínica en levadura, y tanto MyD116 como \gamma_{1}34.5 interactúan con la fosfatasa 1\alpha proteínica in vitro; (ii) la síntesis de proteínas en células infectadas está fuertemente inhibida por el ácido ocadaico, un inhibidor de fosfatasa 1; y (iii) la subunidad \alpha en eIF-2 purificado fosforilado in vitro es desfosforilada específicamente por fracciones de S10 de células infectadas de tipo salvaje, a una velocidad de 3000 veces la de las células simuladamente infectadas, mientras que la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa de células infectadas con \gamma_{1}34.5^{-} vírico es menor que la de células simuladamente infectadas. Las actividades de eIF-2\alpha-P-fosfatasa son sensibles al inhibidor 2 de la fosfatasa proteínica. Al contrario de la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa, los extractos de células simuladamente infectadas muestran una actividad de fosfatasa dos veces superior sobre [^{32}P]-fosforilasa que los extractos de células infectadas. Estos resultados indican que, en células infectadas, \gamma_{1}34.5 interacciona con y redirige a la fosfatasa para desfosforilar eIF-2\alpha para permitir la síntesis continua de proteínas a pesar de la presencia de PKR activada. La proteína GADD34 puede tener una función similar en células eucariotas. El mecanismo para el mantenimiento de la síntesis de proteínas ante la acumulación de ARN bicatenario es diferente del descrito para los virus examinados hasta la fecha.
Situando las observaciones anteriores en un contexto más amplio, en células infectadas con HSV-1 la acumulación de transcritos simétricos después del comienzo de la síntesis de ADN da como resultado la activación de PKR. Una proteína vírica, \gamma_{1}34.5, se une a PP1\alpha, presumiblemente a través de su término carboxílico, y redirige la actividad de la enzima para desfosforilar eIF-2\alpha por sí misma o en combinación con otras proteínas. Como consecuencia, aunque la PKR está activada, la síntesis de proteínas sigue sin disminuir. Los siguientes datos apoyan esta situación.
En células infectadas tanto con mutantes de tipo salvaje como \gamma_{1}34.5^{-}, la PKR se fosforila, pero sólo en las células infectadas con mutantes que carecen de todo o del dominio 3' del gen \gamma_{1}34.5 es donde la síntesis de proteínas se detiene y se fosforila el eIF-2\alpha. La secuencia de \gamma_{1}34.5 requerida para bloquear la atención de la síntesis de proteínas se localiza en el dominio 3' del gen, y se puede sustituir sin pérdida de función por el dominio correspondiente de MyD116, el gen GADD34 murino.
Las actividades de eIF-2\alpha-P-fosfatasa dadas a conocer aquí pueden dar cuenta de las diferencias en la síntesis de eIF-2\alpha-P y de proteínas en estado estacionario previamente señalada en células infectadas con \gamma_{1}34.5^{-} vírico [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995)]. Debido a que la PKR no está activada en células infectadas de forma simulada, la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa moderada observada debería ser suficiente para evitar el grado de fosforilación de eIF-2\alpha requerido para inhibir la síntesis de proteínas. La infección con HSV-1 de tipo salvaje da como resultado la activación de PKR [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995)], pero su efecto está probablemente más que contrarrestado por el aumento de \sim 3000 veces en eIF-2\alpha-P-fosfatasa. Este notable aumento en la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa es debido a la expresión del producto génico \gamma_{1}34.5, debido a que la infección por el mutante \gamma_{1}34.5^{-} está asociada con una disminución en la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa, que, con la activación de PKR, da como resultado la fosforilación de eIF-2\alpha y la inhibición de la síntesis de proteínas [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995)].
En el sistema de dos híbridos de levadura, el término carboxílico de MyD116 interactuó con la PP1\alpha humana. La interacción de PP1\alpha y MyD116, o con la proteína \gamma_{1}34.5, también fue demostrable en experimentos usados para determinar la interacción física entre dos o más proteínas (conocidos en inglés como experimentos "pulldown") in vitro. La hipótesis de que la actividad de eIF-2\alpha-fosfatasa medida en fracciones citoplásmicas de células infectadas o simuladamente infectadas deriva de PP1 está reforzada por la observación de que era sensible al inhibidor 2. No obstante, dos líneas de evidencia sugieren que esta actividad puede representar una forma modificada de PP1\alpha redirigida a eIF-2\alpha. Específicamente, la actividad de eIF-2\alpha-P-fosfatasa fue menos sensible al inhibidor 2 que la de las células infectadas de forma simulada, y adicionalmente la actividad de fosfatasa fosforilasa, una función conocida de PP1, fue más potente en células no infectadas que en células infectadas.
Este trabajo arroja luz sobre la función putativa de GADD34. Como se ha señalado anteriormente, el término carboxílico del gen GADD34 murino (MyD116) es homólogo y puede sustituir al dominio correspondiente de \gamma_{1}34.5 [He et al., J. Virol., 70:84-90 (1996)]. También se ha demostrado que PP1\alpha interactúa tanto con proteínas quiméricas de \gamma_{1}34.5 como MyD116 in vitro (véase más abajo). Estos resultados arguyen que al menos una de las funciones del gen GADD34 es similar a la del gen \gamma_{1}34.5, y que el gen \gamma_{1}34.5 puede ser útil sustituyendo su homólogo celular mamífero para sostener la síntesis de proteínas ante el esfuerzo que suprimiría de forma natural la síntesis de proteínas mediante fosforilación de eIF-2\alpha.
Finalmente, la mayoría de los virus estudiados hasta la fecha bloquean la fosforilación de eIF-2\alpha codificando proteínas que se unen al ARN bicatenario, por ejemplo, E2L de vacuna [Davies et al., J. Virol. 67:1688-1692 (1993); Carroll et al., J. Biol. Chem. 268:12837-12842 (1993); y Yuwen et al., Virology l95:732-744 (1993)], proteína \alpha3 de Reo y rotavirus [Langland et al., J. Virol. 68:3821-3829 (1994); Beattie et al., J. Virol. 69:499-505 (1995); Imani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7887-7891 (1988); y Lloyd et al., J. Virol. 66:6878-6884 (1992)], y proteína NS1 de influenza [Lu et al., Virology 214:222-228 (1995)], o proteínas o ARN que inactivan PKR al unirse a la misma, por ejemplo, K3L del virus de la vacuna, EBERS1 y 2 del virus de Epstein-Barr [Sharp et al., Nucleic Acids Res. 21:4483-4490 (1993)], ARN de VA1 adenovírico [Sharp et al., Nucleic Acids Res. 21:4483-4490 (1993); y Ghade et al., J. Virol. 68:4137-4151 (1994)], proteína p58 celular inducida por el virus de la influenza [Lee et al., Mol. Cell. Biol. 14:2331-2342 (1994)] o degrada PKR (polovirus) [Black et al., J. Virol. 67:71-800 (1993)]. La secuencia TAR de HIV-1 parece que se une a una proteína de unión de TAR celular y a PKR [McMillan et al., Virology 213:413-424 (1995); Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4713-4717 (1994); y Consentino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9445-9449 (1995)]. Las excepciones pueden ser el virus delta de la hepatitis, que no activa PKR incluso aunque in vitro consta principalmente de ARN bicatenario [McNair et al., J. Gen. Virol. 75:1371-1378 (1994)], y el virus 40 de simio cuyo gran antígeno T actúa en una etapa de postactivación de PKR [Swaminahan et al., J. Virol. 219:321-323 (1996)]. Estos datos sugieren que HSV-1 y HSV-2 usan un mecanismo muy diferente para evitar la parada de la síntesis de proteínas al seleccionar como diana a eIF-2\alpha fosforilado en lugar de PKR o de ARN bicatenario.
La elucidación de estos mecanismos proporciona la capacidad para desarrollar nuevos métodos libres de células que son útiles para la detección sistemática tanto de inductores como de inhibidores de la muerte celular programada, de forma que los inhibidores o inductores de la muerte celular programada puede proporcionar agentes terapéuticos útiles para la prevención de enfermedades asociadas con la inducción de la muerte celular programada, así como compuestos terapéuticos para enfermedades tales como cualquiera de una amplia variedad de enfermedades tumorígenas en las que sería deseable inducir la muerte celular programada. Tales sistemas también son útiles para identificar sustancias antivíricas que influyen con la muerte celular programada sobre células infectadas mediante mecanismos explicados aquí en este documento y ejemplificados más abajo. Los siguientes ejemplos ejemplifican la práctica de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención como se recita en las reivindicaciones.
El Ejemplo 1 describe las células y virus usados en los estudios.
El Ejemplo 2 demuestra que la fosforilación de eIF-2\alpha está asociada con una quinasa presente en una fracción enriquecida en ribosomas de células infectadas con R3616 (\gamma_{1}34.5^{-}) y cuya síntesis de proteínas se detuvo. Estos datos también muestran que la inmunoprecipitación de PKR a partir de la misma fracción tras la reacción con [\gamma^{32}P]-ATP produjo varios polipéptidos fosforilados.
El Ejemplo 3 describe la clonación y expresión de proteína fosfatasa 1\alpha humana.
El Ejemplo 4 describe la medida de la actividad de eIF-2\alpha-fosfatasa.
El Ejemplo 5 describe la determinación de la actividad de fosforilasa y de fosfatasa.
El Ejemplo 6 describe la interacción de GADD3y (MyD116) con PP1\alpha en un sistema de dos híbridos de levadura, y la identificación de PP1\alpha.
El Ejemplo 7 describe la unión de MyD116 y \gamma_{1}34.5 a PP1\alpha in vitro.
El Ejemplo 8 describe el papel de la actividad de fosfatasa en la síntesis de proteínas en células infectadas.
El Ejemplo 9 describe la actividad de eIF-2\alpha-fosfatasa en células infectadas con virus recombinante R8300 o de tipo salvaje.
El Ejemplo 10 describe la sensibilidad de la actividad de eIF-2\alpha-fosfatasa por el inhibidor 2 de PP\alpha.
El Ejemplo 11 demuestra que la actividad de fosfatasa activada es específica para eIF-2\alpha.
El Ejemplo 12 describe métodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celular programada en sistemas libres de células.
Ejemplo 1 Células y virus
Las células HeLa, Vero, y las células de neuroblastoma humano (SK-N-SH) de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 se propagaron en medio Eagle modificado de Dulbecco, suplementado con 5% (células Vero y HeLa) y 10% (células SK-N-SH) de suero fetal bovino, respectivamente. La HSV-1(F) es la cepa prototipo de HSV-1 usada en estos estudios (Ejercito et al., J. Gen. Virol. 2:357-364 (1968)). El R3616 recombinante de HSV-1 se ha descrito previamente [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5247-5251 (1994); y Chou et al.; Science 250:1262-1266 (1990)]. El virus R3616 carece de 1 Kb de los dominios codificantes de ambas copias de los genes de \gamma_{1}34.5. En el virus recombinante R8300 la secuencia que codifica el dominio terminal carboxílico del gen de \gamma_{1}34.5 se sustituyó con el dominio correspondiente del gen MyD116 como se describe en He et al., J. Virol. 70:84-90 (1996).
Ejemplo 2 La actividad de eif-2\alpha quinasa está asociada con la fracción ribosómica en células infectadas con el virus de \gamma_{1}34.5^{-}
A la vista de los resultados descritos en Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995), se realizó una serie de estudios para determinar si la parada prematura de la síntesis de proteínas en células de neuroblastoma humano infectadas con R3616 es debida a la modificación (fosforilación) de una subunidad \alpha del factor de iniciación de la traducción eIF-2 vía la actividad de eIF-2\alpha quinasa. Los experimentos utilizaron células HeLa por cuanto parece que eIF-2 es más estable en lisados de esta estirpe celular. Las células HeLa, al igual que la mayoría de las estirpes celulares humanas estudiadas hasta la fecha, también se ven afectadas por la parada prematura de la síntesis de proteínas en células infectadas con los virus de \gamma_{1}34.5^{-}.
Cultivos en paralelo de células HeLa se infectaron de forma simulada o se infectaron con los virus HSV-1(F) o R3616 como se describe en Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995). Siete horas después de la infección, las células se cosecharon, y se prepararon fracciones de S10, que incluyen todos los materiales citoplásmicos (excluyendo las mitocondrias), según los procedimientos descritos por Pollard y Clemens (Pollard et al., In Methods in Molecular Biology: New Nucleic Acid Techniques (Walker, J.M., ed.), Capítulo 5, p. 47-60, Humana Press, Clifton, N.J. (1988)). Las fracciones de S100 (postrribosómicas) fueron fluidos sobrenadantes preparados a partir de fracciones de S100 después de centrifugar a 29.000 rpm durante tres horas a 4ºC en un rotor Beckman SW41. Esta fracciones contenía la mayor parte de las proteínas solubles, pero estaba libre de ribosomas. Se purificó eIF-2 de conejo a partir de un lisado de reticulocitos de conejo, según el método descrito por Grass et al., J. Biol. Chem., 255:6270-6275 (1980), y se usó para detectar la actividad de eIF-2\alpha quinasa presente en esos extractos. Se hicieron reaccionar 0,2 \mug de eIF-2 con las fracciones de S10 o S100 en presencia de [\gamma^{32}P]-ATP (100 \muCi por muestra, actividad específica 6000 Ci/mmoles, NEN, Boston, MA) a 30ºC durante 20 minutos. Las mezclas de reacción se solubilizaron entonces, se separaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12% desnaturalizante, reticulado con N',N'-dialiltartardiamida, se transfirieron en láminas de nitrocelulosa, y se dispusieron para la autorradiografía como se ha descrito previamente (Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)). La Figura 1 muestra los resultados del análisis. Las líneas con eIF-2 exógeno añadido se indicaron en el extremo izquierdo. La posición de eIF-2\alpha se muestra en la derecha.
Como se muestra en la Figura 1, Panel A, la subunidad de eIF-2\alpha estaba intensamente fosforilada en los extractos de S10 de células infectadas con R3616, estaba mínimamente fosforilada en células de tipo salvaje o infectadas de forma simulada, y no estaba fosforilada en absoluto en ausencia de extractos celulares. Estos resultados indican que la fracción de S10 de las células infectadas con el virus de \gamma_{1}34.5^{-} contenía una actividad de eIF-2\alpha quinasa que estaba muy reducida o era nula en extractos similares de células infectadas de forma simulada o en células infectadas con el tipo salvaje. Esta actividad no existía en ninguna de las fracciones de S100 ensayadas, sugiriendo que la actividad de quinasa está asociada con los ribosomas. En ausencia de eIF-2 exógena, se observó en todos los extractos una fosforilación mínima de eIF-2 endógeno debido a procesos de fosforilación y desfosforilación en estado estacionario en la célula.
La Figura 1, Panel B, muestra una fotografía de una lámina de nitrocelulosa que contiene proteínas separadas teñidas con anticuerpo monoclonal específico para eIF-2\alpha (Scorsone et al., J. Biol. Chem. 262:14538-14543 (1987)). Después de reaccionar con el anticuerpo secundario apropiado, la mancha se desarrolló con reactivos coloreados proporcionados por Promega (Madison, Wisconsin) para identificar el polipéptido de eIF-2\alpha. Las flechas indican las manchas usadas para orientar y alinear el polipéptido de eIF-2\alpha fosforilado en el panel A con el polipéptido de eIF-2\alpha teñido con el anticuerpo en el Panel B. Los datos en el panel B de la Figura 1 muestran que el nivel de eIF-2\alpha fue similar en todas las muestras al que se había añadido.
Esta actividad no estaba presente en células infectadas de forma simulada o infectadas con tipo salvaje. El eIF-2 se une a Met-tRNA^{f} y GTP en un complejo ternario que entonces se asocia con subunidades ribosómicas en un complejo de preiniciación (Merrick, W.C., Microbiological Reviews 56:291-315 (1992); Hershey, J.W.B., Annu. Rev. Biochem. 60:717-755 (1991)). Después de la iniciación, el eIF-2 se recicla del complejo de 80S con la ayuda de eIF-2B, otro factor de traducción. Uno de los sucesos que regula la traducción es la fosforilación de la subunidad \alpha del complejo de eIF-2. La fosforilación de eIF-2\alpha se correlaciona con la parada de la síntesis de proteínas en células hematopoyéticas hemorreguladas, en respuesta a la inhibición del crecimiento, a esfuerzos celulares causados por infecciones víricas, a choque térmico, a metales pesados, a pérdida de suero, a aminoácidos, o a azúcar (Hershey, J.W.B., Annu. Rev. Biochem. 60:717-755 (1991); Sarre, T., BioSystems 22:311-325 (1989)). Estos efectos se han relacionado con la fosforilación de ser_{51} de eIF-2\alpha mediante PKR, una quinasa de M_{r} de 68.000 también conocida como dsl, una eIF-2\alpha quinasa activada por ARN bicatenario que se autofosforila a sí misma, o mediante HRI, una eIF-2\alpha quinasa hemorregulada (Merrick, W.C., Microbiological Reviews 56:291-315 (1992); Hershey, J.W.B., Annu. Rev. Biochem. 60:717-755 (1991)). El papel principal de la fosforilación de ser_{51} en la regulación de la síntesis de proteínas está apoyado por la observación de que la sustitución de ser_{51} por Ala evita la fosforilación y mantiene la síntesis de proteínas (Pathak et al., Mol Cell Biol. 8:993-995 (1988)).
Ejemplo 3 Clonación y expresión de proteína fosfatasa \alpha humana (pp1\alpha)
El plásmido pRB4891, que contiene un ADNc de 1,37 Kb que codifica la proteína fosfatasa 1\alpha humana (PP1\alpha), se aisló de una genoteca de ADNc de cerebro humano comercialmente disponible (Stratagene). Para construir pRB4890 se amplificó un fragmento de ADN de BamHI-EcoRI que codifica los codones 524 a 657 de MyD116 mediante PCR a partir de una copia de ADNc del gen descrito por He et al., J. Virol. 70:84-90 (1996), con los cebadores TGACTGGATGCAGAGGCGGCTCAGATTGTTC (SEQ ID NO. 1) y AGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAG (SEQ ID NO. 2), y se insertó en los sitios BamHI-EcoRI de pGBT9 (Clontech) para que sirva como un "cebo" en el sistema de dos híbridos. Las condiciones de la PCR fueron 94ºC durante 2 minutos, 60ºC durante 3 minutos y 72ºC durante 3 minutos, para 25 ciclos. El pRB4892, que contiene el gen quimérico GST-PP1\alpha, se construyó ligando un fragmento de PCR de 0,9 Kb, que contiene toda la secuencia de codificación de PP1\alpha, excepto el primer codón de metionina, en los sitios EcoRI-SalI de pGEX4T-1 (Pharmacia). Los cebadores oligonucleotídicos fueron GCACTGAATTCTCCGACAGCGAGAAGCTCAAC (SEQ ID NO. 3) y GCACTGTCGACATCTGGGGCACAGGGTGGTGT (SEQ ID NO. 4). Para construir pRB4893, que tiene un dominio quimérico carboxi terminal con glutationa S transferasa (GST) de \gamma_{1}34.5 [GST-\gamma_{1}34.5(C)], el fragmento EcoRI-SalI que codifica los codones 146 a 263 de \gamma_{1}34.5 de pRB71, y se clonó en los sitios EcoRI-SalI de pGEX4T-1. La construcción de pRB4873, que contiene un fragmento AccI-EcoRI que codifica los codones 174 3' terminales de MyD116, fusionado en la ventana a GST [GST-MyD116(C)] se dio a conocer por He et al., J. Virol. 70:84-90 (1996). La expresión de las proteínas de fusión GST-MyD116(C), GST-\gamma_{1}34.5(C) y GST-PP1, se indujo por adición de isopropil-\beta-D-tiogalactósido al medio con células BL21 de Escherichia coli transformadas con el plásmido pRB4873, pRB4892 o pRB4893, seguido de la purificación por afinidad de las proteínas de fusión a partir de lisados bacterianos sobre perlas de agarosa conjugadas con glutationa.
Ejemplo 4 Determinación de la actividad de eIF-2\alpha fosfatasa
El factor de iniciación de la traducción eIF-2 se purificó de ribosomas de reticulocitos de conejo según un método de Gross et al., J. Biol. Chem. 255:6270-6275 (1980). En la etapa 4 se purificó parcialmente un represor traduccional controlado por hemo (HCR) procedente de lisados de reticulocitos de conejo, según el método descrito por Gross et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 50:832-838 (1983). El eIF-2 (20 pmoles o 2,7 \mug) se hizo reaccionar con el HCR de la etapa 4 en 0,02 M de Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM de KCl, 2,0 mM de MgCl_{2}, y 0,17 mM de [\gamma^{32}P]-ATP (2-10 Ci o 74-370 GBq/mmoles) en un volumen final de 12 \mul durante 25 minutos a 34ºC para producir eIF-2\alpha y eIF-2\beta fosforilados (1,0 y 0,7 moles/mol de eIF-2, respectivamente). Las células HeLa se cosecharon 15 horas después de la infección simulada o de la infección con 20 PFU de HSV-1(F), R3616 o R8300 por célula. Se prepararon fracciones de S10 a partir de lisados de células infectadas de forma simulada o de células infectadas como se describe por Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10516-10520 (1995) y se diluyeron hasta un volumen final de 18 \mul con 0,02 M de Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM de KCl, 2 mM MgCl_{2}, y 0,1 mM de EDTA. Seguidamente se añadió ATP hasta una concentración final de 0,8 mM. Después de 30 segundos a 34ºC, cada muestra recibió 1,2 \mul (2 pmoles) de eIF-2(\alpha^{32}P), y se volvió a incubar a 34ºC. La velocidad de desfosforilación de eIF-2(\alpha^{32}P) se determinó mediante un método según Gross et al., Biochim. Biophys. ACTA 740:255-263 (1983) colocando alícuotas de 6,0 \mul en una disolución que contiene SDS a los tiempos indicados en las figuras, seguido de la electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 7%, como se describe, durante 21 horas a 44 V (3 V/cm), tiñendo con azul de Coomasie, o con plata, secando, y realizando la autorradiografía. El ^{32}P que queda en el eIF-2(\alpha^{32}P) se cuantificó separando esta banda y comparando su radiación de Cerenkov con la de alícuotas equivalentes de eIF-2(\alpha^{32}P) que no se incubaron posteriormente y que se sometieron a electroforesis en paralelo.
Ejemplo 5 Determinación de actividad de fosforilasa y de fosfatasa
La fosforilasa b (32 \mug, Sigma) se fosforiló por incubación con 3,3 \mug de fosforilasa quinasa (Sigma, St. Louis, MO) en 0,01 M de Tris-HCl, pH 7,5, 2,0 mM de MgCl_{2}, y 0,13 mM de [\gamma^{32}P]-ATP (3 Ci o 111 GBq/mmol) en un volumen final de 15 \mul a 34ºC durante 10 minutos. La desfosforilación se determinó añadiendo 4,4 \mug de [^{32}P] fosforilasa a muestras constituidas e incubadas como se describe en el Ejemplo 4 en un volumen final de 27 \mul. A 1,5, tres, seis y diez minutos, se retiraron alícuotas de 6,0 \mul y se procesaron como se describe anteriormente para determinar la actividad de fosfatasa.
Ejemplo 6 El término carboxílico de la proteína GADD34 murina (MyD116) interactúa con PP1\alpha en el sistema de dos híbridos de levadura
La cepa Y190 (16) de levadura, transformada con el plásmido pRB4890, y que se hizo crecer en un medio selectivo de Trp, se volvió a transformar con una genoteca de ADNc de cerebro humano (CLONTECH), y se sometió a selección en medio Trp^{-}/Leu^{-}/His^{-} en presencia de 25 mM de 3-aminotriazol (Sigma). Las colonias que tuvieron un crecimiento de moderado a rápido después de colocar en placas durante cinco días se volvieron a pasar rápidamente en medio Trp^{-}/Leu^{-}/His^{-}. Los plásmidos derivados de la librería se recuperaron mediante transformación de HB101 de E. coli con preparaciones de ADN de levadura total, seguido de selección en medio Leu^{-}/ampicilina^{+} como se ha descrito previamente en Durfee et al., Gene Devel. 7:555-569 (1993). El ensayo de filtro para \beta-galactosidasa se realizó según recomienda Clontech.
Como se discute brevemente antes, el sistema de dos híbridos es particularmente útil para clonar genes que codifican proteínas que interactúan con una proteína de interés. Véase Fields et al., Nature 340:245-246 (1989) y Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582. El término carboxílico de MyD116 se seleccionó como un cebo para el sistema de dos híbridos debido a que (i) él mismo y \gamma_{1}34.5 comparten homología de secuencia de aminoácidos [véase Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5247-5251 (1994) y McGeoch et al., Nature (Londres) 353:609 (1991)], (ii) el término carboxílico de MyD116 puede sustituir funcionalmente al de la proteína \gamma_{1}34.5, y (iii) el uso de codones de MyD116, un gen de mamífero, es más próximo al de la levadura que el de HSV-1. De las 10^{6} colonias de levadura escrutadas, sólo una colonia fue positiva para la expresión de \beta-galactosidasa. El ADNc recuperado de esta colonia se volvió a transformar en la cepa Y 190 de levadura con diversos plásmidos de control que codifican proteínas de fusión. Estos estudios indicaron que sólo el término carboxílico de MyD116 interactuó con la proteína codificada por el ADNc aislado. El análisis de secuencia de ADN reveló que el ADNc aislado codificó la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1\alpha (PP1\alpha). Véase Song et al., Gene 129:291-295 (1993).
Ejemplo 7 Tanto la proteína MyD116 como \gamma_{1}34.5 se unen a PP1\alpha in vitro
Para verificar y ampliar las observaciones de que MyD116 y PP1\alpha interactúan en levadura, se expresó en E. coli un gen quimérico de GST-PP1\alpha construido como se describe en el Ejemplo 3. Se cosecharon cultivos duplicados de células HeLa en tampón de lisis que contiene 10 mM de Hepes, pH 7,6, 250 mM de NaCl, 10 mM de MgCl_{2}, 1% de Tritón X-100, 0,5 mM de PMSF y 2 mM de benzamidina 18 horas después de la infección simulada o de la infección con 10 PFU de HSV-1(F) o R8300 por célula. Después de 30 minutos en hielo húmedo, y con centrifugación a baja velocidad para eliminar los núcleos, los fluidos sobrenadantes se preaclararon con perlas de GST y después se hicieron reaccionar con perlas unidas a GST-fosfatasa 1 a 4ºC toda la noche. Después de un intenso aclarado, las proteínas unidas a las perlas se solubilizaron hirviendo en tampón de disgregación que contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 5% de \beta-mercaptoetanol, 2% de SDS, y 2,75% de sacarosa, se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% desnaturalizantes, se transfirieron a una lámina de nitrocelulosa, y la mancha se sondó con antisuero de \gamma_{1}34.5 dirigido al Ala Thr Pro presente tanto en \gamma_{1}34.5 como en la proteína quimérica de \gamma_{1}34.5-MyD116 expresada por R8300. La posición de la proteína de \gamma_{1}34.5 y de la proteína quimérica \gamma_{1}34.5-MyD116 se muestra en la Figura 2A. Como se observa en la Figura 2A, la proteína de GST-PP1\alpha se unió tanto a \gamma_{1}34.5 procedente de lisados de células infectadas con HSV-1(F) como a la proteína quimérica de \gamma_{1}34.5-MyD116, que migra más lentamente, procedente de células infectadas con R8300. La GST sola no reaccionó con ninguna proteína en los lisados celulares apropiados.
En un segundo experimento, la PP1\alpha purificada se mezcló con perlas que tienen GST o proteínas quiméricas que constan de GST fusionada a los aminoácidos 146 a 263 de \gamma_{1}34.5 o a los aminoácidos 485 a 657 de MyD116 según lo siguiente.
Una alícuota de la proteína de fusión de GST-PP1\alpha unida a perlas se hizo reaccionar con 25 unidades de trombina (Sigma, St. Louis, MO) en tampón salino PBS a temperatura ambiente. Después de ocho horas, la mezcla se hizo girar en una centrifugadora de mesa, y el fluido sobrenadante, que contiene PP1\alpha, se dializó entonces frente a tampón de lisis, se hizo reaccionar con GST, GST-MyD116(C) o GST-\gamma_{1}34.5(C) unidos a perlas, y se procesó como se describe en el Panel A. La PP1 se detectó con anticuerpo antifosfatasa 1\alpha (Upstate Biotechnology Incorporated).
Las proteínas unidas a GST o a las proteínas quiméricas se solubilizaron, se sometieron a electroforesis en un gel desnaturalizante, y se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-PP1\alpha. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, ambas proteínas quiméricas, pero no la GST, produjeron una proteína con un M_{r} aparente de 38.000 (marcadores de peso molecular no mostrados) y que reaccionó con el anticuerpo PP1\alpha.
Ejemplo 8 La actividad de fosfatasa es esencial para la síntesis de proteínas en células infectadas
Los ensayos se realizaron para determinar si la actividad de fosfatasa es esencial para la síntesis sostenida de proteínas en células infectadas. Se infectaron proteínas marcadas con [^{35}S]metionina, procedentes de lisados celulares, con los virus indicados, en presencia o en ausencia de ácido ocadaico (OA). Las células SK-N-SH se infectaron de forma simulada, o se infectaron con 20 PFU de HSV-1(F), R3616, o R8300 por célula. Dos horas después de la exposición a los virus, las células se cubrieron con medio 199V [Ackermann et al., J. Virol. 58:843-850 (1986)] suplementado con o sin ácido ocadaico (25 ng/ml). Catorce horas después de la infección, las células se cubrieron durante una hora con un ml de medio 199V que carece de metionina pero que está suplementado con 50 \muCi de [^{35}S]metionina (actividad específica > 1000 Ci/mmol; Amersham) durante una hora, después se cosechó, se solubilizó en tampón de disgregación, se sometió a electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% desnaturalizantes, se transfirió a una lámina de nitrocelulosa y se sometió a autorradiografía como se describe en otra parte [Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3266-3270 (1992)]. Los resultados (Figura 3A) muestran que el ácido ocadaico inhibió totalmente la síntesis de proteínas en células infectadas con HSV-1(F) de tipo salvaje, con el virus R3616 de \gamma_{1}34.5^{-}, o con R8300 recombinante que expresa la proteína quimérica \gamma_{1}34.5-MyD116. Por el contrario, el ácido ocadaico no tuvo ningún efecto aparente sobre la síntesis de proteínas en células infectadas de forma simulada.
Para probar una hipótesis trivial de que el ácido ocadaico bloqueó en cierta manera la síntesis de las proteínas de \gamma_{1}34.5 o de \gamma_{1}34.5-MyD116 en células infectadas, se solubilizaron los lisados de células infectadas con los virus de tipo salvaje y recombinante, se sometieron a electroforesis en geles desnaturalizantes, se transfirieron eléctricamente a una lámina de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpo para la proteína de \gamma_{1}34.5. Como se muestra en la Figura 3B, los lisados de células infectadas con HSV-1(F) o con R8300 expresaron la proteína de \gamma_{1}34.5 o de \gamma_{1}34.5-MyD116, respectivamente. El anticuerpo no reaccionó con los lisados de células infectadas de forma simulada, o de células infectadas con el virus de \gamma_{1}34.5^{-}.
Ejemplo 9 La actividad de eIF-2(\alpha^{32}p)-fosfatasa es muy abundante en células infectadas con virus de tipo salvaje o recombinante R8300, y disminuyó significativamente en células infectadas con el virus de \gamma_{1}34.5^{-}
Los experimentos se realizaron para averiguar si la parada de la síntesis de proteínas en células infectadas con R3616 vírico de \gamma_{1}34.5^{-} estaba determinada por el nivel de la actividad de eIF-2\alpha fosfatasa. Se prepararon fracciones de S10 a partir de lisados de células HeLa tanto infectadas como infectadas de forma simulada, y se ensayaron para determinar su capacidad para desfosforilar eIF-2(\alpha^{32}P). El eIF-2(\alpha^{32}P) sin reaccionar (Figura 4, líneas 1, 14, 18) mostró tres bandas marcadas que representan eIF-2\alpha, eIF-2\beta (flechas), y una pequeña cantidad de una proteína de M_{r} de 39.000 (flecha) que es un contaminante diferente de eIF-2\alpha [véase Gross et al., J. Biol. Chem. 255:6270-6275 (1980)]. La reacción de este eIF-2 con la fracción de S10 procedente de células infectadas de forma simulada mostró una velocidad moderada de pérdida de radioactividad de eIF-2(\alpha^{32}P) (Figura 4 y Figuras 5A, 5D). Esta actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa se redujo aproximadamente unas tres veces en células infectadas con el virus de \gamma_{1}34.5^{-}. Muy al contrario, la fracción de S10 de células infectadas con el virus de tipo salvaje o con el virus mutante R8300 mostró un nivel de actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa tan marcado que virtualmente toda la radioactividad de eIF-2(\alpha^{32}P) añadida fue eliminada en los primeros 20 segundos de reacción (Figura 4, líneas 2 y 11). Para verificar que esta actividad de fosfatasa no continuó después de que la mezcla de reacción se mezcló con la disolución desnaturalizante de SDS, se ensayó y se encontró que eIF-2(\alpha^{32}P) es completamente estable tras la adición de una mezcla de SDS y una fracción de S10 procedente de células infectadas tanto con el virus de tipo salvaje como con el virus recombinante R8300.
Para cuantificar el aumento en la actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa asociada con la infección mediante virus de tipo salvaje o virus recombinante R8300 de células HeLa, las fracciones S10 procedentes de esas células se diluyeron progresivamente hasta que se pudo medir de forma exacta la velocidad de desfosforilación de eIF-2(\alpha^{32}P). Sólo cuando la fracción de S10 de las células infectadas con el tipo salvaje se diluyó 600 veces, entonces es cuando se pudo medir de forma exacta la actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa, y fue incluso cinco veces mayor que la de las células infectadas de forma simulada (Figura 4 y Figuras 5A-5D). Estos hallazgos indican que la actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa de las células infectadas con el tipo salvaje aumentó aproximadamente 3000 veces. Análisis similares indicaron que, en células infectadas con el virus recombinante R8300, esta actividad aumentó aproximadamente 50 veces (Figuras 4 y 5A-5D). La eliminación de la radioactividad en estas muestras representó una desfosforilación y no la proteolisis, ya que no estaba asociada con pérdida de proteína de eIF-2\alpha según se mide por tinción. Además, el notable aumento en la actividad de eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa, observado en las fracciones de S10 de células infectadas con virus de tipo salvaje, puede ser específico para eIF-2\alpha, ya que ni la fosfoproteína de M_{r} de 39.000 ni eIF-2(\beta^{32}P) se vieron afectadas significativamente en las mismas condiciones (Figura 4). Finalmente, los resultados mostrados en las Figuras 4 y 5A-5D fueron reproducibles y se obtuvieron en dos determinaciones con cada una de las tres fracciones de S10 procedentes de células de HeLa infectadas de forma simulada o infectadas.
Ejemplo 10 La actividad de eIF-2(\alphap) fosfatasa es sensible al inhibidor 2 de PP1\alpha
Para determinar si eIF-2(\alpha^{32}P) se desfosforiló por PP1\alpha, se midió la velocidad de desfosforilación de eIF-2(\alpha^{32}P) como una función de la concentración de Inhibidor 2, un inhibidor conocido de PP1. Como se muestra en la Figura 5, panel B, la eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa, en la fracción de S10 procedente de células infectadas con virus de tipo salvaje o con virus R8300, fue similarmente sensible al Inhibidor 2, con una reducción del 50% en la velocidad de desfosforilación obtenida a aproximadamente 90 y 120 \mug de Inhibidor 2/ml, respectivamente. Esto sugiere que la eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa activada deriva de PP1. Sin embargo, la concentración de Inhibidor 2 requerida para la inhibición de la eIF-2(\alphaP) activada parece ser mucho mayor que la requerida para inhibir eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa en células infectadas de forma simulada, y también mucho mayor que la requerida para inhibir PP1\alpha en extractos celulares. Véase See Cohen, Methods in Enzymology 201:389-398 (1991). Esto podría ser debido a la posible asociación de \gamma_{1}34.5 con PP1\alpha de células HeLa, dando como resultado que la actividad de fosfatasa está dirigida específicamente a eIF-2(\alphaP), como sugieren los resultados mostrados en la Figura 4.
Ejemplo 11 La actividad de fosfatasa activada es específica para eIF-2\alpha
A título de confirmación de que la eIF-2(\alpha^{32}P) fosfatasa está específicamente activada en células infectadas, se examinó la desfosforilación de [^{32}P]-fosforilasa, un sustrato conocido de serina/treonina fosfatasas, mediante lisados de células HeLa infectadas de forma simulada o infectadas con virus de tipo salvaje. Los resultados (Figura 5C) mostraron que la actividad de fosfatasa de ^{32}P-fosforilasa de células infectadas con HSV-1(F) es solamente la mitad de la de las células infectadas de forma simulada. La actividad responsable de la desfosforilación de ^{32}P-fosforilasa, en células infectadas con virus de tipo salvaje, es sensible al Inhibidor 2 (Figura 5D). La observación de que la actividad de fosfatasa de la fosforilasa, en células infectadas con virus de tipo salvaje, se reduce significativamente con relación a la de células infectadas de forma simulada sugiere que el mecanismo de activación de eIF-2(\alphaP) fosfatasa puede implicar la asociación del producto génico de \gamma_{1}34.5 con una porción de la PP1\alpha celular, convirtiendo esta fracción a una actividad de fosfatasa que es específica para eIF-2(\alphaP).
Ejemplo 12 Sistemas libres de células para identificación de inductores e inhibidores de la muerte celular programada
Las observaciones descritas anteriormente de que la muerte celular programada está asociada con la fosforilación de eIF-2\alpha y la parada de la síntesis de proteínas, y de que las proteínas tales como \gamma_{1}34.5 y GADD(MyD116) evitan la parada de la síntesis de proteínas al redirigir la PP1\alpha para desfosforilar eIF-2\alpha y permitir la síntesis continua de proteínas a pesar de la presencia de PKR activada, se explotaron para preparar sistemas libres de células para identificar inductores o inhibidores candidatos de la muerte celular programada.
Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los sistemas libres de células para identificar inhibidores de la muerte celular programada según la invención comprenden eIF-2\alpha fosforilado y PP1\alpha. El eIF-2\alpha se puede fosforilar con ^{32}P. El sistema puede comprender además un sobrenadante postrribosómico de células, tales como células HeLa, células SK-N-SH, u otras células eucariotas, y/o un tampón adecuado. Entonces se introduce en el sistema un inhibidor candidato de la muerte celular programada, y se determina su efecto sobre el nivel de la fosforilación de eIF-2\alpha como se ha descrito anteriormente. Los inhibidores de la muerte celular programada se identifican por su capacidad para disminuir el nivel de fosforilación de eIF-2\alpha, por ejemplo, redirigiendo PP1\alpha para desfosforilar eIF-2\alpha. De forma similar, los inhibidores de la muerte celular programada se pueden identificar por su capacidad para evitar la fosforilación de eIF-2\alpha. La capacidad de un inhibidor candidato de la muerte celular programada también se puede identificar por su capacidad para interactuar con PKR en un sistema libre de células.
Los sistemas libres de células según la invención también son útiles para identificar inductores de la muerte celular programada. De este modo, tales sistemas comprenden eIF-2\alpha, PP1\alpha y un dador de fosfato adecuado, tal como ATP o un análogo de ATP. El ATP puede ser \gamma^{32}ATP. El sistema libre de células puede comprender adicionalmente un sobrenadante postrribosómico derivado de células eucariotas. El sistema libre de células puede comprender además PKR. Tales inductores se identifican por su capacidad para fosforilar o para mantener el nivel de eIF-2\alpha fosforilado, por ejemplo, dirigiendo PP1\alpha o PKR para fosforilar eIF-2\alpha en presencia de un dador de fosfato adecuado, tal como ATP o un análogo de ATP (que puede ser ATP marcado con \gamma^{32}P), cuando se introduce en un sistema libre de células.
El nivel de fosforilación de eIF-2\alpha, y las actividades de fosfatasa y de fosforilasa asociadas con la fosforilación y desfosforilación de eIF-2\alpha, se miden y se describen, por ejemplo, en los Ejemplos 4, 5 y 9 anteriores. La velocidad de la reacción de fosfatasa y/o de fosforilasa también se puede medir y los datos se pueden analizar usando, por ejemplo, un análisis de Michaelis-Menten a fin de caracterizar de forma más completa y cuantificar las reacciones de desfosforilación y de fosforilación respectivas.
Según la invención, se introducen concentraciones variables de inhibidor o inductor en los sistemas libres de células de la invención a fin de determinar las concentraciones óptimas a las que las sustancias ejercen sus efectos. En la práctica de la presente invención se prefieren PP1\alpha y eIF-2\alpha humanos. También está dentro del alcance de la invención el uso de PP1\alpha y eIF-2\alpha producidos recombinantemente. También están dentro del alcance de la invención los análogos u homólogos de eIF-2\alpha y/o PP1\alpha derivados de otras células eucariotas o procariotas, así como también lo están eIF-2\alpha y PP1\alpha preparados mediante métodos recombinantes.
El eIF-2\alpha fosforilado (marcado), producido en el sistema libre de células de la invención, se puede separar de los otros componentes del sistema mediante electroforesis o mediante métodos cromatográficos. A título de ejemplo, el eIF-2\alpha marcado se puede separar en geles de poliacrilamida desnaturalizantes después de lo cual los componentes separados se pueden transferir, por ejemplo, a una membrana de nailon o de nitrocelulosa tras la exposición a una película de rayos X. Entonces se determinan los niveles relativos de fosforilación después de desarrollar la película expuesta de rayos X y de cuantificar la densidad de las bandas que corresponden a eIF-2\alpha, por ejemplo, mediante densiometría. También se puede usar la autorradiografía para localizar las bandas en la membrana, correspondientes a eIF-2\alpha marcado, después de lo cual se pueden separar mediante escisión de la membrana y se pueden contar mediante recuento por centelleo de líquidos u otros métodos de recuento. eIF-2\alpha y PP1\alpha pueden ser de origen mamífero.
Lo anterior se presentó a título de ejemplo no limitante, y no se debe considerar que limita la presente invención como se expone en las reivindicaciones anejas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: ARCH DEVELOPMENT CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS PARA IDENTIFICAR INDUCTORES E INHIBIDORES DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 233 South Wacker Drive/6300 Sears Tower
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 60606-6402
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/795.470
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 4 de Febrero de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Zeller, James P.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 28.491
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 27373/33742 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (312)474-6300
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (312)474-0448
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGACTGGATG CAGAGGCGGC TCAGATTGTT C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGCGCAAT TAACCCTCAC TAAAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc. = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACTGAATT CTCCGACAGC GAGAAGCTCA AC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc. = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACTGTCGA CATCTGGGGC ACAGGGTGGT GT 
\hfill
32

Claims (10)

1. Un método para identificar inhibidores de la muerte celular programada en un sistema libre de células, comprendiendo el método las etapas de:
(a)
preparar un sistema libre de células que comprende eIF-2\alpha fosforilado y proteína fosfatasa 1\alpha (PP1\alpha);
(b)
introducir en el sistema libre de células de la etapa (a) un inhibidor candidato de la muerte celular programada, y dejar incubar a la mezcla resultante; y
(c)
medir el nivel de fosforilación de eIF-2\alpha resultante de la etapa (b);
en el que un inhibidor de la muerte celular programada disminuye o evita el aumento del nivel de fosforilación de eIF-2\alpha que acompaña a la muerte celular programada, cuando se compara con un control.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el sistema libre de células comprende un sobrenadante postrribosómico derivado de células de mamífero.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el sobrenadante postrribosómico deriva de células de mamífero infectadas con un virus del herpes simple que carece de los genes de \gamma_{1}34.5 expresables.
4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el eIF-2\alpha fosforilado es eIF-2\alpha marcado con [^{32}P].
5. El método de la reivindicación 1, en el que el eIF-2\alpha fosforilado se prepara mediante reacción en una mezcla que comprende eIF-2\alpha, un represor traduccional hemocontrolado, y ATP o un análogo del mismo.
6. Un método para identificar inductores de la muerte celular programada en un sistema libre de células, comprendiendo el método las etapas de:
(a)
preparar un sistema libre de células que comprende eIF-2\alpha, proteína fosfatasa 1\alpha (PP1\alpha), y ATP o un análogo del mismo;
(b)
introducir en el sistema libre de células de la etapa (a) un inductor candidato de la muerte celular programada, y dejar incubar a la mezcla resultante; y
(c)
medir el nivel de fosforilación de eIF-2\alpha resultante de la etapa (b);
en el que un inductor de la muerte celular programada aumenta o evita la disminución del nivel de fosforilación de eIF-2\alpha que acompaña a la muerte celular programada, cuando se compara con un control.
7. El método de la reivindicación 1, 6 ó 5, en el que el sistema libre de células de la etapa (a), como se define en la reivindicación 1 ó 6, o la mezcla de la reivindicación 5, comprende además un tampón.
8. El método de la reivindicación 6, en el que el ATP es ATP marcado con \gamma^{32}P.
9. El método de la reivindicación 6, en el que el sistema libre de células comprende además un sobrenadante postrribosómico derivado de células de mamífero.
10. El método de la reivindicación 6 a 9, en el que el sistema libre de células comprende además proteína quinasa dependiente de ARN bicatenario (PKR).
ES98903847T 1997-01-31 1998-01-30 Metodos para identificar inductores e inhibidores de la muerte celularprogramada. Expired - Lifetime ES2227802T3 (es)

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