ES2228022T3

ES2228022T3 - Metodo para realizar el recuento de celulas de sangre.

Info

Publication number: ES2228022T3
Application number: ES99911178T
Authority: ES
Inventors: Stephen Clark Wardlaw; Robert Aaron Levine
Original assignee: Wardlaw Partners LP
Current assignee: Wardlaw Partners LP
Priority date: 1998-03-07
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2019-03-05
Also published as: EP1070252B1; CN1292872A; AU2988299A; DE69921463D1; US5948686A; TW490561B; EP1070252A1; CA2321691A1; AU747548B2; NO20004451D0; EP1070252A4; CN1141578C; JP2003526082A; WO1999045386A1; JP4086468B2; WO1999045386A9; WO1999045386A8; NO20004451L; CA2321691C; DE69921463T2

Abstract

Un método para evaluar constituyentes de glóbulos blancos y/o constituyentes de plaquetas en una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida, comprendiendo dicho método los pasos de: a) proporcionar una cámara [10] de muestra que se forma entre una primera pared [16] y una segunda pared [18] transparente dichas paredes que están separadas por un primer grosor entre planos [20] en una primera región de dicha cámara. b) crear una mezcla de un colorante y la muestra de sangre, en la que dicho colorante diferencia uno o más de dichos constituyentes en la muestra de sangre, siendo dicha mezcla creada fuera o dentro de dicha cámara, y estando dicha mezcla en contacto con las mencionadas primera y segunda pared de dicha cámara en dicha primera región de dicha cámara cuando la mezcla está dentro de dicha cámara; c) mantener en reposo dicha mezcla en dicha cámara durante un periodo de tiempo predeterminado suficiente para formar uno o más rulos [30], los cuales rulos son contiguos a lagunas [32] que también se forman en dicha mezcla en reposo, y en la que dichos constituyentes residen en dichas lagunas; d) examinar uno o más campos de visión que están situados en dicha primera región de dicha cámara; y e) evaluar dichos constituyentes de glóbulos blancos y/o dichos constituyentes de plaquetas en dichas lagunas en dichos campos de visión.

Description

Método para realizar el recuento de células de sangre.

Antecedentes del invento 1. Campo técnico

El presente invento se refiere a métodos y aparatos para analizar muestras de sangre completa o entera, y a métodos y aparatos para evaluar los constituyentes en una muestra de sangre completa como glóbulos blancos, plaquetas, etc.

2. Información de los antecedentes

Los recientes avances en hematología analítica han aumentado la cantidad y calidad de información disponible a partir de una muestra de sangre de un paciente. Como resultado, también se ha aumentado el interés de la comunidad médica en usar una muestra de sangre de un paciente como herramienta de diagnosis. Los métodos para analizar muestras de sangre, sin embargo, no han evolucionado en todos los casos al mismo ritmo que la información disponible. Históricamente, las muestras de sangre se han evaluado untando una pequeña cantidad de sangre no diluida en un portaobjetos, secando, fijando y tintándola, y examinando la mancha bajo el microscopio. Se pueden obtener resultados razonables a partir de un frotis como este, pero la precisión y fiabilidad de los datos dependen en gran medida de la experiencia y técnica del técnico. Además, los frotis de sangre son intensivos en trabajo y prohibitivos en coste, y por tanto no se eligen generalmente para aplicaciones comerciales.

Otro método conocido para evaluar una muestra de sangre completa implica diluir un volumen de sangre completa, situarlo en una cámara, y evaluar manualmente las células constituyentes en la muestra diluida. La dilución es necesaria porque el número y concentración de los glóbulos rojos (GR's) en la sangre completa superan en gran numero a otras células constituyentes. En una muestra de sangre completa de un individuo típico, por ejemplo, hay alrededor de 4,5 x 10^{6} GR's/microlitro (\mul) de muestra de sangre, pero sólo alrededor de 0,25 x 10^{6}de plaquetas y 0,007 x 10^{6} glóbulos blancos (GB's) por \mul de muestra de sangre. Para determinar un cómputo de GB, la muestra de sangre completa se debe diluir en un rango de alrededor de una parte de sangre por veinte partes de diluyente (1:20) hasta una dilución de aproximadamente 1:256, dependiendo de la técnica exacta empleada, y es también generalmente necesario desintegrar selectivamente los GR's con uno o más reactivos. La desintegración de GR's los quita efectivamente de la vista de forma que se pueden ver los GB's. Para determinar un cómputo de plaquetas, la muestra de sangre se debe diluir en un rango de alrededor de 1:100 hasta aproximadamente 1:50.000. Los cómputos de plaquetas no requieren, sin embargo, una desintegración de GR's en la muestra. Un inconveniente de este método de evaluar una muestra de sangre completa es que el proceso de dilución es largo y caro. Además, añadir diluyentes a la muestra de sangre completa aumenta la probabilidad de error en los datos de la muestra.

Un método moderno para evaluar una muestra de sangre es la citometría de flujo de impedancia u óptico. La citometría de flujo implica circular una muestra de sangre diluida a través de uno o más orificios de pequeño diámetro, cada uno adyacente a un sensor de tipo impedancia o a un sensor de tipo óptico que evalúa las células constituyentes cuando pasan a través del conjunto simple de orificios. Aquí de nuevo, se debe diluir la muestra de sangre para mitigar el excesivo número de los GR's con relación al de los GB's y las plaquetas. Aunque más práctico y consistentes que los métodos descritos anteriormente, la citometría de flujo también tiene numerosos inconvenientes. Algunos de esos inconvenientes nacen de las tuberías requeridas para transportar la muestra, y los controles de fluido necesarios para controlar la tasa de flujo de fluido a través de los sensores. El control preciso del flujo de muestra es esencial para el funcionamiento del citómetro de flujo. Las tuberías en los citómetros de flujo pueden tener fugas y frecuentemente las tienen, comprometiendo potencialmente la precisión y seguridad del equipo. Los controles de flujo de fluido y el equipo de dilución, por otra parte, requieren recalibraciones periódicas. La necesidad de recalibración ilustra el potencial de resultados imprecisos y los indeseables costes de operación que existen con muchos de los analizadores hematológicos disponibles actualmente que usan citómetros de flujo. Otro inconveniente es el volumen de reactivos requeridos. Debido a los grandes ratios de dilución empleados, son necesarios los correspondientes grandes volúmenes de reactivos líquidos. El gran volumen de reactivo aumenta el coste de la prueba y crea un problema de eliminación de residuos.

Otra aproximación al análisis celular en el escaneo capilar volumétrico como se esboza en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.547.849 y 5.585.246 por ejemplo, donde una muestra relativamente no diluida de sangre completa se sitúa en un capilar de volumen y grosor conocidos y se examina mientras la sangre está en un estado de reposo. Esta técnica trata con la presencia de GR's limitando las longitudes de onda de escaneo a aquellas con las que los GR's aparecen relativamente transparentes, y requiere que se trate la muestra para que los GR's no se agreguen durante el proceso de medida. De esta forma, esta técnica se limita al uso de fluorescencia de mayor longitud de onda, y no hay provisión para el examen de GR's y plaquetas o el examen de cualquier morfología
celular.

Lo que se necesita es un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida que: 1) es capaz de proporcionar resultados precisos; 2) no requiere la eliminación de GR's antes del análisis; 3) permite el uso de un amplio rango de fuentes de excitación de luz para el examen de la muestra; 4) no usa grandes volúmenes de reactivos; 5) no requiere flujo de fluido de muestra durante el análisis; 6) es capaz de analizar todas o casi todas las células y partículas en la muestra; y 7) es efectivo en coste.

Descripción del invento

Es, por tanto, un objetivo del presente invento proporcionar un método para evaluar de forma precisa los constituyentes de una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre completa que no requiere diluciones sustanciales.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre completa que no requiere el uso de grandes volúmenes de reactivos líquidos.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre completa que no requiere flujo fluido de muestra durante la evaluación.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre completa que no requiere la eliminación de la mayoría de los GR's antes del análisis.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra que permite la evaluación de todos o casi todos los constituyentes de la muestra.

Es otro objetivo proporcionar un método y un aparato para evaluar una muestra de sangre que es simple de usar.

Este invento se refiere a un método y un aparato para usar en el examen y obtención de información a partir de una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida en reposo que está contenida en una cámara. La expresión "sustancialmente no diluida" como se usa en conexión con este invento describe una muestra de sangre que está diluida no más de alrededor de 1:1, y preferiblemente mucho menos. Generalmente, los únicos reactivos que se usarán en ejecutar el método de este invento son colorantes, tintes y anticoagulantes, y estos reactivos no se añaden con el propósito de diluir la muestra sino que se añaden más bien para producir una reacción, un efecto, o similares que facilitan la realización de la prueba.

De acuerdo con el presente invento, se proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1. Como se usa en esta memoria, el término colorante se define como cualquier reactivo que produce una señal sensible por emisión fluorescente, o por absorción de luz a una longitud de onda específica, que puede ser cuantificada por el aparato.

Una ventaja del presente invento es que se proporciona un método para evaluar los constituyentes de una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida que proporciona información precisa. Específicamente, el presente método obvia la necesidad de control de flujo de fluido y dilución de muestra, y por tanto su probabilidad de error asociada.

Otra ventaja del presente método es que se pueden evaluar los constituyentes en una muestra de sangre completa anticoagulada sin diluir sustancialmente la muestra. El presente método requiere añadir una cantidad relativamente pequeña de colorante sensible a la muestra de sangre completa, permitiendo de este modo que la muestra permanezca sustancialmente no diluida. Consecuentemente se evitan el gasto y los problemas asociados con la dilución. Por ejemplo, bajo el presente método se puede obtener información útil con una muestra de 100 \mul de sangre mezclada con aproximadamente 10 \mul de colorante diluido en solución salina, o menos de 1 \mul de reactivo seco.

Otra ventaja es que el presente método del invento no requiere grandes cantidades de reactivo cuando se evalúan los constituyentes de una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida. Una persona experta en la técnica reconocerá que disminuir la cantidad de reactivo ayuda a disminuir el coste de material inicial del análisis y el coste de manipular el reactivo usado después del análisis.

Otra ventaja del presente método es que no se requiere flujo de fluido de muestra. El presente método permite que la muestra de sangre se evalúe en un estado de reposo (o "sustancialmente sin movimiento"). El único movimiento en la muestra de sangre será el movimiento browniano de los constituyentes formados en la muestra, cuyo movimiento no inutiliza el uso del dispositivo de este invento. Como resultado, se evitan las fugas de tuberías y cualquier problema medioambiental y/o de seguridad asociado con tales fugas. Además, evaluar la muestra en un estado de reposo obvia también la necesidad de controles de flujo de fluido y por tanto el coste de obtener y mantener dichos controles. Una persona experta en la técnica reconocerá que los costes de mantenimiento asociados con muchos citómetros de flujo son considerables, y que evitar esos costes es una clara ventaja.

Estos y otros objetivos, características y ventajas del presente invento se volverán aparentes a la luz de la descripción detallada del mejor modo de realización de esto, como se ilustra en los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es una vista en perspectiva esquemática de una cámara de muestra.

Fig. 2 es una vista en sección transversal esquemática de una cámara de muestra que incluye una segunda pared plana inclinada. Se forma un gradiente de grosor entre planos entre la primera y la segunda pared.

Fig. 3 es una vista en sección transversal esquemática de una cámara de muestra que incluye una segunda pared plana posicionada sobre una primera pared que tiene una pluralidad de escalones. La pluralidad de escalones proporciona una variedad de regiones de cámara en diferentes en diferentes grosores entre planos.

Fig. 4 es una vista en sección transversal esquemática de una cámara de muestra que tiene una segunda pared plana posicionada sobre una primera pared que tiene una superficie que se extiende en ángulo con la segunda pared. Se forma un gradiente de grosor entre planos entre la primera y la segunda pared.

Fig. 5 es una vista esquemática de una cámara de muestra que ilustra la apariencia visual opaca de una muestra de sangre completa anticoagulada, sustancialmente no diluida antes de haberse formado rulos y lagunas.

Fig. 6 es una vista esquemática de una cámara de muestra que ilustra la apariencia de rulos y lagunas en una muestra de sangre completa anticoagulada, sustancialmente no diluida, formada después de un periodo en reposo en la cámara.

Mejor modo de llevar a cabo el invento

El método para evaluar glóbulos blancos (GB's), plaquetas y otros constituyentes de la sangre completa en una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida de acuerdo con la reivindicación 1 proporciona muchas ventajas sobre métodos y aparatos de evaluación disponibles actualmente. El presente invento incluye los pasos de: a) proporcionar una cámara 10 de muestra; b) mezclar un colorante sensible con la muestra de sangre completa; c) insertar la muestra mezclada en la cámara 10 de muestra; d) mantener en reposo la muestra mezclada en la cámara 10 hasta que se formen rulos 30 y lagunas 32 (ver Fig. 6) en la muestra; y e) evaluar uno o más constituyentes objetivo en las lagunas 32.

Con referencia a las Figs. 1-4, la cámara 10 de muestra incluye una primera pared 16 y una segunda pared 18 transparente. Las paredes 16, 18 están separadas una de la otra por un grosor 20 entre planos de magnitud determinable. Como se usa en la presente memoria, el término "grosor entre planos" se refiere a una línea de visión que corresponde a la distancia más corta entre la superficie 22 interior de la primera pared 16 y la superficie 24 interior de la segunda pared 18. En una primera realización (Fig. 2), las paredes 16, 18 son sustancialmente planas y paralelas una a la otra. En una segunda realización (Figs. 2 y 4), las paredes 16, 18 convergen entre ellas, formando de ese modo un gradiente de grosor 20 entre planos. Las paredes 16, 18 de la segunda realización pueden intersecar entre ellas (en cuyo caso el grosor 20 entre planos se va a cero) o las paredes 16, 18 pueden permanecer separadas por una mínima cantidad. En una tercera realización (Fig. 3), una o ambas paredes 16, 18 incluyen uno o más escalones 26. Cada escalón 26 crea una región independiente que tiene diferente grosor 20 entre planos. En todas las realizaciones, se pueden usar espaciadores 28 donde sea apropiado para crear/mantener el grosor 20 entre planos entre las dos paredes 16, 18, y las paredes 16, 18 (o regiones de escalón 26) pueden ser sustancialmente planas o arqueadas.

El grosor 20 entre planos entre las paredes 16, 18 se puede determinar matemática y/u opticamente, o comparativamente usando una referencia conocida. Si, por ejemplo, se conoce la pendiente de las paredes 16, 18 y las paredes 16, 18 están en contacto (o separadas por una cantidad conocida; p.ej., un espaciador 28), entonces se puede calcular matemáticamente el grosor 20 entre planos en cualquier punto elegido, dada la distancia desde el punto de contacto (o desde el espaciador 28). El grosor 20 entre planos se puede determinar también usando técnicas ópticas que incluyen, pero no se limitan a ellas, interferometría, microscopía isofocal o similares. Se puede encontrar una descripción más completa de los métodos que determinan el grosor 20 entre planos en la solicitud de Patente de Estados Unidos nº 09/248.135 (expediente de agente nº UFB-013). Independientemente de qué método se use, el grosor 20 entre planos de la cámara se puede fijar y anotar durante el proceso de fabricación de la cámara 10, o se puede determinar el grosor 20 entre planos en un momento posterior antes de insertar la muestra, o después de que se inserte la muestra (p.ej. en el usuario final). En general, el tamaño del constituyente objetivo y del hematocrito de la muestra dicta el grosor 20 entre planos más conveniente. La relación entre los constituyentes y el grosor 20 entre planos se discutirá en detalle más adelante.

La muestra de sangre completa se mezcla con una cantidad de al menos un colorante sensible suficiente para permitir la visualización de las células o partículas. El colorante sensible puede ser cualquier material que: 1) distingue el constituyente objetivo en la muestra de sangre completa; y 2) no diluye sustancialmente la muestra de sangre completa cuando se mezcla. Un ejemplo de colorante sensible es un tinte supravital revelador fluorescente como naranja de acridina, naranja-21 básica, o un colorante similar que se puede ver usando un microscopio fluorescente. En algunas ocasiones, se puede usar un solo colorante para identificar varios constituyentes. En otras ocasiones, se puede usar una variedad de colorantes para distinguir una variedad de constituyentes. Otras evaluaciones de constituyentes, como aquellas descritas en la solicitud de Patente de Estados Unidos nº 09/249.721 (expediente de agente nº UFB-016), se pueden ejecutar simultáneamente mediante la adición de otro colorante sensible. La adición del colorante sensible se puede ejecutar añadiendo una pequeña cantidad de colorante en forma líquida a la muestra de sangre completa, creando así una mínima dilución de la muestra, o se puede añadir el colorante en forma seca tal como una pequeña tableta. Un medio alternativo de mezclar colorante sensible con la muestra de sangre completa es secar el colorante en un área de la cámara 10 de muestra. Cuando la muestra de sangre completa se inserta en la cámara 10, el colorante se difunde en la muestra.

Se inserta en la cámara 10 una cantidad de muestra de sangre completa mezclada suficientemente grande para contactar con ambas paredes 16, 18 de la cámara. Se puede insertar la muestra en la cámara 10 por una variedad de medios que incluyen el uso de una vejiga, acción capilar, etc. Por razones medioambientales y de seguridad se prefieren los métodos y aparatos que minimizan el potencial de la mezcla para derramarse.

Con referencia a las Figs. 5 y 6, después de la admisión en la cámara 10, la muestra se mantiene en reposo durante un breve periodo de tiempo para permitir la formación de rulos 30 y lagunas 32 (ver Fig. 6). Como se expuso anteriormente, el único movimiento en la muestra de sangre será el movimiento browniano de los constituyentes formados de la muestra, cuyo movimiento no inutiliza el uso del dispositivo de este invento. Los rulos 30 son racimos de glóbulos rojos (GR's) que forman espontáneamente sangre completa anticoagulada, sustancialmente sin movimiento. Las lagunas son las áreas abiertas dejadas entre los rulos 30. La formación de rulos 30 y lagunas 32 ocurre de forma natural en sangre completa anticoagulada debido a que las fuerzas de atracción que agregan los GR's fuerzan a los otros constituyentes, como GB's 34 y plaquetas 36 (ver Fig. 6), hacia las lagunas 32 donde se pueden evaluar. Mantener una muestra de sangre completa sustancialmente sin movimiento durante aproximadamente 15-30 segundos es adecuado normalmente para permitir la formación de rulos 30 y lagunas 32, pero el tiempo puede variar de muestra a muestra. La formación de rulos 30 se puede facilitar con conocidos agentes de agregación, en cuyo caso los grupos de GR's se denominarían agregaciones. Ejemplos de tales agentes agregantes son dextrano, polibreno y mezclas de ambos, anticuerpos contra antígenos comunes de glóbulos rojos, y lectinas vegetales y similares.

El grosor 20 entre planos de la muestra de sangre completa que se evalúa es crítico para evaluar los constituyentes de la muestra. Por ejemplo, si se examina al microscopio una capa gruesa de 100 \mu (1 \mu =
1 x 10^{-6} metros) de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida, la muestra aparecerá opaca (como se ilustra en Fig. 5) porque la luz no puede penetrar adecuadamente la capa, independientemente de si se permite a los GR's formar rulos 30. Si, sin embargo, se reduce el grosor de la capa de muestra a aproximadamente menos de 70 \mu, y preferiblemente se reduce a entre 4 \mu y 50 \mu, atravesará una cantidad de luz suficiente de forma que las lagunas 32 aparecen como claros lagos en los que se pueden distinguir y evaluar los GB's 34 y las plaquetas 36. El grosor de capa de muestra óptimo para permitir la evaluación de constituyentes en las lagunas 32 dependerá del hematocrito original de la muestra. El hematocrito, que se refiere al número de GR's como un porcentaje del volumen total de sangre, es inversamente proporcional al grosor de capa de muestra óptimo; es decir, un hematocrito superior al normal se asocia generalmente con una capa de muestra óptima más fina que la normal. En todos los casos, sin embargo, la capa de muestra debe ser suficientemente gruesa para proporcionar un número razonable de partículas o células. Nótese que no todos los constituyentes simples de interés se pueden forzar hacia las lagunas 32. Esto no inutiliza el invento si un número estadística o clínicamente insignificante de constituyentes son oscurecidos por las agregaciones de GR's. Es también posible para uno o más constituyentes de interés permanecer sobre una agregación de GR's, pero como estos constituyentes serán visibles (en el caso de un microscopio vertical), serán plenamente evaluables por fluorescencia.

El constituyente objetivo se puede evaluar usando una variedad de técnicas. Si, por ejemplo, el constituyente objetivo se colorea con un colorante fluorescente, las lagunas 32 se pueden examinar con un microscopio de fluorescencia disponible comercialmente. El microscopio de fluorescencia iluminará el colorante fluorescente que interactúa con el constituyente objetivo, distinguiéndolo así en la muestra. La imagen producida con el microscopio de fluorescencia se puede grabar en un disector de imagen (e.g., una cámara CCD) y esa imagen se puede evaluar manualmente, o la imagen puede ser digitalizada y almacenada en un fichero electrónico. El fichero electrónico se puede interpretar usando un software de análisis que tiene la capacidad, por ejemplo, de identificar constituyentes particulares, enumerar las apariciones de un constituyente particular, y evaluar características del constituyente. Un ejemplo de software de análisis comercialmente disponible es el vendido por la Signal Analitics Corporation of Viena, VA, EE.UU., u otros sistemas de procesamiento de imagen similares. Se proporciona una descripción más completa de tal sistema de evaluación de imagen en la solicitud en tramitación de patente de Estados Unidos nº 09/255.673 de la solicitante (expediente de agente nº UFB-017).

Los siguientes ejemplos ilustrarán cómo se puede evaluar constituyentes individuales de una muestra de sangre completa usando el presente método y aparato del invento:

Ejemplo I

Con referencia a las Figs. 5 y 6, se pueden evaluar GB's 34 en una muestra de sangre completa anticoagulada mezclada con una pequeña cantidad de un colorante sensible en una cámara 10 que tiene un grosor 20 entre planos (ver Figs. 2-4), en la totalidad de la cámara 10 o en una parte de la cámara 10, aproximadamente igual a 20 \mu. EDTA es un ejemplo de un agente anticoagulante que se puede usar y un tinte supravital revelador fluorescente como naranja de acridina, naranja-21 básica, o similares son ejemplos de colorantes sensibles que se pueden usar. Se elige un grosor 20 entre planos de la cámara de aproximadamente 20 \mu por un par de razones. Primero, el volumen de evaluación contiene un número útil de GB's 34 para examen, y segundo, un grosor 20 entre planos de 20 \mu proporciona normalmente una cámara óptima para la formación de rulos 30. El volumen de muestra que se evalúa se define normalmente por el área en sección transversal del campo evaluativo 38 y el grosor 20 entre planos de la muestra. Como se expuso anteriormente, el grosor 20 exacto entre planos de un campo 38 en la cámara 10 se puede optimizar usando varias técnicas, que incluyen procesos iterativos donde la población de un constituyente objetivo en un campo 38 particular se evalúa estadísticamente y otros campos 38 se evalúan si es necesario aumentar o disminuir la población.

La Fig. 5 describe un campo 38 de la muestra inmediatamente después de la inserción en la cámara 10 al tiempo que la muestra aparece opaca cuando se examina bien con luz transmitida, o más preferiblemente con fluorescencia epi-iluminada. La apariencia opaca está causada por los GR's 35, que forman una masa cubriente antes de la formación de los rulos 30. A pesar de la apariencia opaca del campo de muestra 38, el colorante permite que se distingan levemente algunos GB's. La Fig. 6 muestra la misma cámara 10 después de permanecer sustancialmente sin movimiento durante aproximadamente treinta (30) segundos. Los GR's 35 se han arracimado espontáneamente en rulos 30, dejando lagunas 32 entre los rulos 30. Es en estas lagunas 32 donde se pueden distinguir y evaluar los otros constituyentes de la muestra de sangre completa (e.g. GB's 34 y plaquetas 36). Si se desea un cómputo de GB 34, se puede evaluar un campo 38 que tiene un área de sección transversal de un milímetro cuadrado en la región de la cámara 10 que tiene un grosor 20 entre planos de 20 \mu (que contiene 0,02 \mul de volumen de muestra de sangre completa). Se elige una muestra de 0,02 \mul para mantener un número razonable de GB's 34; una muestra normal de sangre completa contiene aproximadamente 7.000 GB's por \mul de muestra y una muestra de sangre completa normal de 0,02 \mul contiene aproximadamente 140 GB's. Se contaría un número de estos campos 38 hasta que se cuenten suficientes células para conseguir un número que tenga suficiente precisión estadística, que en la práctica es aproximadamente 1.000 células. Si se busca información adicional sobre GB 34, los GB's 34 (linfocitos, granulocitos, monocitos, etc.) se pueden evaluar posteriormente en el volumen de la cámara. Por ejemplo, si fuera deseable clasificar los tipos de GB's en la muestra de sangre completa y/o su frecuencia, se podrían evaluar los GB's usando un disector de imagen con/sin software de análisis. Se podría determinar un cómputo diferencial a partir de los datos recogidos. Se da una descripción más completa de este método en la solicitud en tramitación de patente de Estados Unidos nº H 09/252.153 (expediente de agente nº UFB-011).

Si las regiones de las lagunas 32 de la muestra aparecen parcialmente opacas a un grosor entre planos de la cámara de 20 \mu, quizá como resultado de un hematocrito superior al normal, puede ser deseable evaluar un campo 38 de muestra en la cámara 10 de muestra que tiene un grosor 20 entre planos menor que 20 \mu. Por otra parte, si el hematocrito de la muestra es inferior al normal, puede ser conveniente usar un campo 38 de muestra que tiene un grosor 20 entre planos mayor que 20 \mu porque la población de cada constituyente es potencialmente mayor. El grosor 20 entre planos de la muestra se puede cambiar también como un método para aumentar o disminuir las poblaciones de constituyentes.

Ejemplo II

Se pueden evaluar plaquetas 36 en una muestra de sangre completa anticoagulada usando la técnica descrita en el Ejemplo I. Debido a que las plaquetas están presentes en mucha mayor cantidad que los GB's 34, se usa una región de la cámara que tiene un grosor 20 entre planos de aproximadamente 5 \mu en magnitud. Cada campo 38 que tiene un área en sección transversal de un milímetro cuadrado en la región de la cámara que tiene un grosor entre planos de 5 \mu representa un volumen de muestra de 0,005 \mul y en un individuo normal contendrá por tanto alrededor de 1250 plaquetas 36. Se pueden evaluar las plaquetas 36 usando los mismos tintes supravitales reveladores fluorescentes y técnicas usadas para los GB's 34. Se pueden evaluar las plaquetas 36 en la misma cámara 10 que la usada para evaluar los GB's, si la cámara tiene regiones de grosor entre planos de magnitud variable como las descritas anteriormente con paredes oblicuas,
escalonadas y/o arqueadas.

Aunque se ha mostrado y descrito este invento con respecto a sus realizaciones detalladas, será entendido por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios en su forma y detalle. Por ejemplo, la cámara de muestra esta descrita como que tiene una primera pared y una segunda pared transparente. Si se usa transmitancia en lugar de fluorescencia como mecanismo para sensibilizar la muestra, entonces ambas la primera y la segunda pared serían transparentes.

Claims

1. Un método para evaluar constituyentes de glóbulos blancos y/o constituyentes de plaquetas en una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente no diluida, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) proporcionar una cámara (10) de muestra que se forma entre una primera pared (16) y una segunda pared (18) transparente dichas paredes que están separadas por un primer grosor entre planos (20) en una primera región de dicha cámara.

b) crear una mezcla de un colorante y la muestra de sangre, en la que dicho colorante diferencia uno o más de dichos constituyentes en la muestra de sangre, siendo dicha mezcla creada fuera o dentro de dicha cámara, y estando dicha mezcla en contacto con las mencionadas primera y segunda pared de dicha cámara en dicha primera región de dicha cámara cuando la mezcla está dentro de dicha cámara;

c) mantener en reposo dicha mezcla en dicha cámara durante un periodo de tiempo predeterminado suficiente para formar uno o más rulos (30), los cuales rulos son contiguos a lagunas (32) que también se forman en dicha mezcla en reposo, y en la que dichos constituyentes residen en dichas lagunas;

d) examinar uno o más campos de visión que están situados en dicha primera región de dicha cámara; y

e) evaluar dichos constituyentes de glóbulos blancos y/o dichos constituyentes de plaquetas en dichas lagunas en dichos campos de visión.

2. El método de la Reivindicación 1, que comprende además el paso de situar selectivamente uno o más campos en una segunda región de dicha cámara, teniendo dicha segunda región un segundo grosor entre planos que es mayor que dicho primer grosor entre planos en dicha primera región de dicha cámara.

3. El método de la Reivindicación 1, que comprende además el paso de situar selectivamente uno o más campos en una segunda región de dicha cámara, teniendo dicha segunda región un segundo grosor entre planos que es menor que dicho primer grosor entre planos en dicha primera región de dicha cámara.

4. El método de la Reivindicación 1, en el que dicho primer grosor entre planos no es mayor de 70 \mu.

5. El método de la Reivindicación 1, en el que dicho primer grosor entre planos no es menor de 4 \mu.

6. El método de la Reivindicación 1, en el que dicho primer grosor entre planos no es mayor de 50 \mu.

7. El método de la Reivindicación 1, en el que se crea dicha mezcla fuera de dicha cámara.

8. El método de la Reivindicación 1, en el que se crea dicha mezcla dentro de dicha cámara.