ES2229250T3 - Procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de pa-adh en una levadura para la produccion por via biiotecnologica de proteinas heterologas en altos rendimientos. - Google Patents

Procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de pa-adh en una levadura para la produccion por via biiotecnologica de proteinas heterologas en altos rendimientos.

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Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA LA UTILIZACION DEL SISTEMA PROMOTOR ADH-II DE LA LEVADURA PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS HETEROLOGAS CON ELEVADO RENDIMIENTO, P. E. PARA LA OBTENCION DE HIRUDINAS, MINIPROINSULINAS, LEPTINAS O SUS DERIVADOS.

Description

Procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de p\alpha-ADH II en una levadura para la producción por vía biotecnológica de proteínas heterólogas en altos rendimientos.
El invento se refiere a un nuevo procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de p\alpha-ADH II en levadura para la producción por vía biotecnológica de hirudina, de derivados de hirudina o de proteínas de fusión, que contienen hirudina o un derivado de hirudina.
En el caso del polipéptido hirudina, aislado originalmente a partir de la sanguijuela Hirudo medicinalis, se trata de un agente inhibidor de trombina muy específico,. con un amplio potencial terapéutico (F. Markwardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (1985) 1007-1013). Las cantidades necesarias se pueden preparar, sin embargo, solamente por la vía de tecnología genética a través de microorganismos transformados. En tal caso, se ha mostrado que la levadura Saccharomyces cerevisiae es apropiada como organismo anfitrión (hospedante), para producir una hirudina correctamente plegada y plenamente activa (documentos de solicitudes de patentes europeas EP A1 168.342 y EP A1 200.655).
Por el nombre de hirudina han de entenderse agentes inhibidores de trombina a modo de péptidos con una actividad específica de por lo menos 10.000 U-AT/mg (unidades de anti-trombina / mg), que se derivan de las conocidas isohirudinas de la especie Hirudo medicinalis, y presentan unas características estructurales esenciales de éstas, en particular la unión característica de los tres puentes de disulfuro (J. Dodt y colaboradores, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985) 379-385), (compárense p.ej. los documentos EP A1 158.564, EP A1 168.342, el de patente alemana DE 34.45.517, y los EP A2 193.175, EP A1 200.655, EP A1 158.986, EP A1 209.061, DE 33.42.199 y EP A1 171.024).
En particular, se entiende por este nombre una hirudina, tal como se describe en los documentos EP A1 171.024, EP A1 158.986 y EP A1 209.061.
El gen para la isoenzima II deshidrogenasa de alcohol (ADH II) es regulado estrictamente en células de una levadura. El producto génico de ADH II no se descubre 1 cuando al medio de fermentación se le han añadido fuentes de carbono fermentables, tales como p.ej. glucosa.
Las condiciones de inducción para el promotor de ADH II se pueden conseguir también en procesos discontinuos (batch = por cargas) aerobios sencillos en matraces sometidos a sacudimiento o en fermentadores, que se ponen en marcha p.ej. con una concentración de glucosa de 4%. En primer lugar, en el caso de un crecimiento sobre glucosa, debido al denominado efecto de Crabtree, con ayuda de la enzima ADH I, se forma etanol, que a su vez después de un consumo total de la glucosa sirve como fuente de C adicional. Después de una descomposición de la glucosa, se induce la enzima ADH II que descompone al etanol, y comienza la expresión de hirudina.
Tales fermentaciones discontinuas no aportan por regla general el alto rendimiento de espacio / tiempo que se pretende para aplicaciones industriales. Se desea la separación de la fermentación en una fase de crecimiento y una fase de producción, tal como se consigue p.ej. en fermentaciones clásicas de antibióticos mediante un modo de funcionamiento de alimentación discontinua (fed-batch = alimentación por cargas) limitada en el que, después de haberse establecido una determinada densidad celular, se alimenta posteriormente, limitando el crecimiento, una fuente de C, con el fin de formar con alto rendimiento el producto (p.ej. el metabolito secundario penicilina) en condiciones fisiológicas óptimas (Hersbach y colaboradores: The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation, in: Biotechnology of Industrial Antibiotics [Las penicilinas: propiedades, biosíntesis y fermentación en: Biotecnología de Antibióticos Industriales], páginas 45-140, coordinador de edición E.J. Vandamme, Marcel Dekker, Nueva York, 1984).
A causa de la regulación del sistema promotor de ADH II, éste se aprovecha para la preparación por vía biotecnológica de proteínas recombinantes en la levadura de panadero Saccharomyces cerevisiae (Price y colaboradores: Methods in Enzimology [Métodos en enzimología], volumen 185, 308-318, 1990). La fermentación se basa en este caso, debido al crecimiento de las células en levadura, en la eliminación natural de glucosa como fuente de C. En el caso de una ausencia de glucosa, se conecta e inicia la formación de producto y se prosigue hasta el final de la fermentación. No obstante, el rendimiento de producto parece quedar por detrás de lo esperado.
T\phittrup y colaboradores (Biotechnol. Bioeng., 35, 339-348, 1990) describen una realización modificada de la fermentación para la producción intracelular de una proteína de fusión con insulina humana, que implica una alimentación de glucosa con una subsiguiente alimentación de etanol para realizar la óptima inducción del sistema. Se consiguió por ellos, en comparación con un proceso discontinuo, casi una duplicación del rendimiento del producto referido al volumen, mediante una alimentación continua de glucosa con caudal constante durante todo el período de tiempo de fermentación. Finalmente, una duplicación adicional se consiguió mediante el recurso de que a partir de un determinado momento, la alimentación de glucosa se reemplazó por una alimentación de igual tipo de etanol. A partir de este resultado, se sacó la conclusión de que, incluso en el caso de un defecto de glucosa en el caldo de cultivo, o bien de muy bajas concentraciones de glucosa. de < 20 mg/l, el promotor híbrido todavía es reprimido parcialmente por glucosa o por un metabolito de la glicolisis. Tan sólo mediante una adición de etanol se consigue entonces una inducción completa.
Si el sistema de expresión, descrito en el artículo de Price y colaboradores, se aprovecha para la preparación del producto génico hirudina, mencionado en el documento de patente europea 0.324.712 B1 (véase el Ejemplo 1), los autores del invento hemos comprobado con sorpresa que el rendimiento específico de producto, referido a la biomasa, disminuye de un modo continuo o discontinuo, mediante la adición de etanol, puesto que se puede observar un crecimiento celular aumentado con un título de producto de igual magnitud.
La adición directa de etanol ha sido investigada a la escala de laboratorio. El aumento adicional de concentración de una tanda discontinua con etanol, durante el crecimiento sobre etanol, ha aumentado ciertamente la cantidad de biomasa pero, en comparación con la tanda sin aumento de concentración, no ha conducido a una concentración aumentada de producto.
Las tandas de laboratorio, que se habían llevado a cabo exclusivamente con etanol como fuente de C, no aportaron, dentro del marco de la exactitud de medición, tampoco ningún rendimiento específico más alto (referido a la densidad óptica o bien a la biomasa) que una tanda comparativa con glucosa (véase también el Ejemplo 2). A partir de esto se puede sacar la conclusión de que el etanol a solas no es ningún inductor de la ADH II.
Asimismo, el intento de producir un crecimiento desreprimido mediante una alimentación de glucosa regulada, apoyada en un modelo, (regulación posterior, es decir aumento, del régimen de alimentación de un modo correspondiente a la densidad celular creciente) y evitar una formación de etanol como consecuencia del efecto de Crabtree, para a continuación, en la 2ª etapa, mediante una adición pulsante de glucosa con subsiguiente formación de etanol como consecuencia del efecto de Crabtree, inducir más intensamente la expresión, no aportó ningún rendimiento aumentado de producto.
Sorprendentemente, se encontró por fin un modo de fermentación sencillo, autorregulable, y sobre todo realizable a gran escala técnica, para el aprovechamiento del sistema promotor de ADH II en una levadura con el fin de efectuar la producción por vía biotecnológica de proteínas heterólogas en altos rendimientos. Este procedimiento comprende la adición dosificada continua de glucosa como fuente de carbono a una tanda de fermentación (cultivo principal), en la que inicialmente no estaba presente nada de glucosa. En el transcurso de la cultivación, se recorrieron diferentes fases, de tal manera que se llegase a una óptima inducción o bien formación de producto. Una inducción de este tipo de la expresión génica heteróloga en una levadura, mediando utilización del sistema promotor de ADH II, es muy sorprendente a la luz del estado de la técnica, p.ej. de la cita bibliográfica de Price y colaboradores ya mencionada, puesto que, de acuerdo con Price y colaboradores, tan sólo después de un fuerte agotamiento de la glucosa se desreprime el promotor de ADH II.
Nosotros pudimos conseguir en nuestro sistema óptimos rendimientos de producto con una alta productividad específica, cuando directamente después de la inoculación del cultivo principal se alimenta de manera continua con caudal constante una pequeña cantidad de glucosa. El aumento de volumen del cultivo, condicionado por la alimentación, puede conducir en este caso a una disminución de hasta 25% del caudal real de alimentación de glucosa al final del período de tiempo de cultivación. En primer término, la glucosa está presente en exceso para la baja población celular, es decir que en el caso de un crecimiento reprimido se forma etanol como consecuencia del efecto de Crabtree. A partir de un determinado momento, la densidad celular es tan alta que ya no resulta suficiente la glucosa como única fuente de carbono, y aparece un crecimiento mixto sobre glucosa y etanol. Tan sólo cuando entonces se ha consumido asimismo el etanol formado de manera primaria, y mediante la glucosa se limita un crecimiento adicional (desreprimido), se conecta el promotor de ADH II y comienza la formación del producto. En comparación con el proceso discontinuo, de esta manera se puede por ejemplo triplicar el rendimiento de producto.
Es objeto del invento, por consiguiente, un procedimiento para la fermentación por vía biotecnológica de proteínas heterólogas en una levadura, en el que un cultivo principal se inocula con un cultivo preliminar de una cepa de levadura, que puede expresar la proteína heteróloga, inmediatamente después de la inoculación se aporta en régimen continuo con caudal constante una pequeña cantidad de glucosa, p.ej. de 0,7-1,4, de modo preferido de 0,9-1,3, y de modo muy especialmente preferido 1,1 g de glucosa / l de volumen de cultivo / h, mientras que la fermentación total asegura unas condiciones aerobias de cultivo, no dejándose disminuir la presión parcial de oxígeno por debajo de un 20% de la saturación, terminándose la fermentación después de 2 días, y finalmente aislándose la proteína heteróloga a partir de la tanda de fermentación.
Un objeto adicional del invento es un procedimiento de acuerdo con el descrito en el párrafo precedente, en el que los medios de los cultivos preliminar y principal son equivalentes, excepto por una adición de 1% de glucosa en el medio de cultivo preliminar, que preferiblemente se ha consumido prácticamente de modo total al inocular el cultivo principal, y contienen uno o varios constituyentes complejos, tales como p.ej. un líquido de maceración de maíz (cornsteep), harina de soja o un extracto de levadura. La expresión "consumido de modo prácticamente total" significa en este caso una concentración de glucosa < 100 mg/l.
Las cepas de levaduras, utilizadas en los procedimientos mencionados, pueden ser Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente Y79 (véase el documento EP 0.324.712), o también cepas de Kluyveromyces lactis.
La proteína heteróloga, que se puede preparar de acuerdo con el procedimiento, puede ser una hirudina, un derivado de hirudina, o bien una hirudina o un derivado de hirudina que contiene una proteína de fusión. El término "derivados" significa en este caso, entre otros, fragmentos funcionales, es decir biológicamente activos, de las proteínas de partida, o mutantes con nuevas propiedades biológicas, particularmente ventajosas.
Ejemplo 1 Preparación del vector de expresión para la producción por vía recombinante de hirudina en una levadura
El vector p\alpha ADH II (véase la Figura 2A del artículo de Price y colaboradores) contiene, de modo vecino al sitio de corte con la enzima de restricción Spe 1 en dirección al extremo 3' del ADNc (ADN cromosomal), un sitio de reconocimiento para la enzima Nco 1, que es singular para el plásmido.
Si, entonces, el ADN del vector descrito se hace reaccionar con Kpn 1 y Nco 1, entonces se obtienen dos fragmentos de ADN, que son separados uno de otro por electroforesis en gel. El mayor de los dos fragmentos se aísla y se hace reaccionar, en una reacción con la ligasa de T4, con un fragmento de hirudina de Kpn 1 / Nco 1, que se obtiene a partir del plásmido p\alphaf Hirl7 (documento EP 0.324.712 B1) por digestión parcial con la enzima Kpn 1 y digestión total con la enzima Nco 1.
Células de E. coli K12 competentes, obtenibles comercialmente, de la cepa HB101 se transforman con la mezcla de ligación, y la tanda de transformación se siembra sobre placas de Na-agar, que contienen 25 mg/1 de ampicilina. Las placas se incuban a 37ºC durante una noche y a la mañana siguiente se entresacan colonias individuales desde las placas y se utilizan para la cultivación de sistemas de cultivo durante una noche. A partir de las células de los cultivos se aísla en cada caso un ADN de plásmido, y se comprueba mediante un análisis por restricción. Un ADN de plásmido correcto, que contiene el gen de hirudina incorporado tal como se desea, es utilizado para la transformación de la cepa Y79 de Saccharomyces cerevisiae, tal como se ha descrito en el documento EP 0.324.712 B1.
De esta manera, se obtiene el sistema de expresión, que se ha usado para el descrito desarrollo del procedimiento.
Ejemplo 2 Comparación de tandas de laboratorio para la preparación de hirudina por vía recombinante en una levadura en el caso de la utilización de diferentes fuentes de carbono
En un fermentador de laboratorio, en unas condiciones por lo demás iguales, se investigan diferentes fuentes de carbono (fuentes de C). El medio de las etapas preliminar y principal se compone de la siguiente manera:
1% de un extracto de levadura
2% de peptona
fuente de C (en cada caso la misma cantidad referida al contenido de C)
80 mg/l de adenina
80 mg/l de uracilo
pH = 5,0
El cultivo principal se inocula con 2% de un inóculo y se incuba durante 48 horas.
En lo que se refiere al etanol y a la glucosa como fuentes de C, se consiguieron los siguientes resultados:
Fuente de C Concentración de hirudina [%] Densidad óptica A_{578nm} [%]
Glucosa al 2% 100 100
Etanol al 1,54% 83 71
Ejemplo 3 Comparación de la preparación de hirudina por vía recombinante en una levadura por fermentación con o sin alimentación de glucosa a) Fermentación con alimentación de glucosa (proceso de alimentación discontinua = fed-batch)
En un fermentador con un volumen total de 3.600 l se esterilizan, durante 20 minutos a 121ºC, 1.600 l de un medio de cultivo, que consta de uno o varios constituyentes complejos, tales como p.ej. un líquido de maceración de maíz, harina de soja, un extracto de levadura, etc., sin adición de glucosa o de otras fuentes de C, tales como sacarosa.
Después de haber enfriado, el medio se inocula con aproximadamente 200 l de un cultivo preliminar que ha crecido durante aproximadamente 12 horas (densidad óptica A_{540nm} = 3,5 \pm 0,5) que contiene todavía solamente muy pequeñas 5 cantidades restantes de glucosa. El medio del cultivo preliminar es equivalente al del cultivo principal, con la excepción de que se añade 1% de glucosa.
Directamente después de una inoculación de la etapa principal, se añaden dosificadamente 2 kg de glucosa por hora en forma de una solución acuosa al 20% con caudal constante hasta el final de la fermentación, a través de un dispositivo destinado a la esterilización continua.
Durante la fermentación deben de estar aseguradas unas condiciones aerobias; ha de respetarse una presión parcial de oxígeno de pO_{2} \geq 20%.
La fermentación está terminada después de 48 \pm 2 horas y se termina mediante la adición de 0,225 \pm 0,025% de cloruro de benzalconio, p.ej. de 0,45 \pm 0,05% de ®Dodigen 226 (una solución al 50% de una mezcla de cloruros de alquil-) dimetil-bencil-amonio en agua).
A continuación, comienza el tratamiento para el aislamiento de hirudina a partir del caldo de cultivo.
El volumen final (medio + material condensado + cultivo preliminar + solución de glucosa añadida dosificadamente - pérdida de agua como consecuencia de la gasificación) es de 2.300 \pm 50 l.
b) Proceso discontinuo
El proceso discontinuo es equivalente al proceso de alimentación discontinua que se ha descrito en el apartado a), con las siguientes excepciones:
-
El medio contiene antes de la inoculación, junto a los constituyentes complejos, también 4% de glucosa.
-
No se efectúa ninguna adición dosificada adicional de glucosa.
-
El volumen final es solamente de 1.800 \pm 50 l.
c) Comparación de los resultados
Procedimiento Concentración de hirudina [%] Cantidad de hirudina [%]
Proceso discontinuo 100 100
Proceso de alimentación discontinua 228 291

Claims (8)

1. Procedimiento para la fermentación por vía biotecnológica de hirudina, de derivados de hirudina o de proteínas de fusión que contienen hirudina o un derivado de hirudina, en una levadura, mediando aprovechamiento de un sistema promotor de p\alpha-ADH II, caracterizado porque
a)
un cultivo principal se inocula con un cultivo preliminar de una cepa de levadura, que puede expresar la hirudina, el derivado de hirudina o una proteína de fusión que contiene hirudina o un derivado de hirudina;
b)
inmediatamente después de la inoculación, se aportan de modo continuo con un caudal constante 0,7-1,4 g de glucosa / l de volumen de cultivo / h;
c)
se aseguran unas condiciones aerobias de cultivo;
d)
se termina la fermentación después de aproximadamente 2 días, y finalmente
e)
se aísla desde la tanda de fermentación la hirudina, el derivado de hirudina o una proteína de fusión que contiene hirudina o un derivado de hirudina.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucosa se aporta en régimen continuo inmediatamente después de la inoculación con un caudal constante de 0,9-1,3, o con 1,1 g de glucosa / l de volumen de cultivo / h.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los medios de los cultivos preliminar y principal son equivalentes, excepto por una adición de 1% de glucosa en el estadio del cultivo preliminar.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 3, caracterizado porque la adición de 1% de glucosa en el medio del cultivo preliminar se ha consumido prácticamente de modo total en el momento de la inoculación.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las condiciones aerobias de cultivo se aseguran mediante una presión parcial de oxígeno de por lo menos 20% de la saturación.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los medios mencionados contienen uno o varios constituyentes complejos, tales como p.ej. un líquido de maceración de maíz, harina de soja o un extracto de levadura.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la mencionada cepa de levadura es una cepa de Saccharomyces cerivisiae, preferiblemente la Y79.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la mencionada cepa de levadura es una cepa de Kluyveromyces lactis.
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