ES2229780T3 - Procesos de muestreo para identificacion de agentes antibacterianos. - Google Patents
Procesos de muestreo para identificacion de agentes antibacterianos.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de una sub-población fenotípicamente antibioresistente de bacterias en fase estacionaria que comprende una de las siguientes etapas: (1) cultivo de bacterias hasta la fase estacionaria, y (2) tratamiento de dicho cultivo en fase estacionaria con uno o varios agentes antibacterianos a una concentración y durante un periodo lo suficientemente largo como para matar las bacterias del cultivo, y de este modo seleccionar una sub- población fenotípicamente antibioresistente
Description
Procesos de muestreo para identificación de
agentes antibacterianos.
La presente invención se refiere al aislamiento
de una sub-población de bacterias en fase
estacionaria que muestran resistencia a los agentes convencionales
antibacterianos, al uso de tales sub-poblaciones
resistentes en procesos de muestreo para identificación de agentes
antibacterianos nuevos y mejorados, a agentes novedosos con ello
identificados y a aplicaciones terapéuticas de tales
antibacterianos.
La tuberculosis aún es una enfermedad seria en
todo el mundo, y se estima que las muertes causadas de la
tuberculosis hacen el 7% de la cantidad total de muertes de
enfermedades infecciosas. Tal como se discute en la patente USA Nº
5,700,925, la amplia mayoría de individuos que se infectan con el
Mycrobacterium tuberculosis no desarrollan una tuberculosis
sintomática pero muestran una reacción positiva a la prueba de
tuberculosis en la piel. En tales portadores infectados, algunas
bacterias persisten en un estado durmiente o latente, en el cual
éstas son sustancialmente resistentes a drogas antimicrobianas. A lo
largo de un período de vida hasta un 10% de estos individuos
infectados pero asintomáticos podrían continuar desarrollando
tuberculosis. Frecuentemente muchos años tras un infección primaria,
en el momento en el que el bacilo durmiente se activa y comienza a
crecer. Esto puede resultar en una tuberculosis pulmonar y otras
formas variadas de esta enfermedad. Los factores que predisponen a
esta activación del organismo durmiente y a la manifestación del
estado de enfermedad incluyen pobreza, pobres condiciones de vida,
malnutrición, deficiencia inmunitaria o supresión inmunitaria.
Por lo general en el tratamiento de tuberculosis,
la terapia antimicrobiana que usa agentes antibacterianos tales como
rifampicina, isoniazida y/o pirazinamida es relativamente exitosa
contra las bacterias que crecen activamente. Semejante terapia es
infectiva, no obstante, contra bacterias que permanecen durmientes o
las cuales habiendo sufrido una fase de crecimiento, recomienzan una
frase durmiente. Esto causa problemas particulares en el tratamiento
clínico de enfermos y portadores de tuberculosis debido a que la
resistencia del organismo durmiente necesita unos cuidados
quimio-terapéuticos a largo plazo. Semejante
tratamiento a largo plazo, típicamente de seis meses de duración, no
es satisfactorio ya que es caro y puede resultar en una pobre
adhesión del paciente al tratamiento y puede animar el desarrollo y
la aparición de cadenas de bacterias resistentes a los antibióticos
durante y después de los M. tuberculosis enfocados en la
terapia.
Se cree que la mayoría de las bacterias patógenas
por ejemplo el Staphylococcus aureus, el Haemophilus
influenzae, Estreptococcus pyogenes, Estreptococcus gordonii y
E. coli poseen una similar sub-población
sustancialmente resistente al agente antibacteriano que puede actuar
como foco de nueva infección durante o después de la quimioterapia.
Estas bacterias resistentes son habitualmente sensibles a las drogas
en la reincidencia indicando que su resistencia de quimioterapia es
fenotípica mas que genética.
Con el fin de investigar si el metabolismo de tal
bacteria persistente está inactivado sin división celular alguna
(por ejemplo tipo esporas) o es activa (es decir de tal modo que las
células contienen marcadores del metabolismo tales como mRNA), se ha
estudiado la M. tuberculosis en un modelo de fase
estacionaria in vitro obtenido por un cultivo de largo plazo
de los microorganismos en un gradiente microaerofílico en el cual
eran viables los organismos de fase estacionaria. Se encontró que
semejantes bacterias de fase estacionaria eran resistentes a la
rifacimpina en un nivel de concentración mínima normal inhibitoria
(MIC) de 0.1 \mug/ml (tal como recomendado con la bacteria a una
concentración de 106-107 cfu/ml). También se examinó
la viabilidad de M. tuberculosis in vivo antes y
después del tratamiento con agentes antituberculosis. También había
presentes bacterias persistentes no cultivables, tras el tratamiento
con antibacterianos cuya durmencia se invirtió al ser sometidos los
animales portadores a una terapia de esteroides.
El presente invento se basa en el descubrimiento
inesperado y sorprendente de que mientras que el tratamiento de
semejante bacteria en fase estacionaria con agentes antibacterianos
como la rifampicina a concentraciones que excedían con mucho el
mínimo de concentración inhibitoria reduce la numeración sobre placa
a unidades que forman colonia cero (CFU), queda una pequeña
cantidad de organismos persistentes que pueden detectarse mediante
por ejemplo un conteo de dilución del caldo de cultivo.
Estas resistentes sub-poblaciones
son fenotípicamente resistentes a la rifampicina, ya que estas se
vuelven sensibles a la rifampicina a unos niveles MIC normales una
vez reanudado el crecimiento.
Unos estudios análogos usando modelos de sistemas
E. coli en fase estacionaria y los tratamientos de estos con
canamicina y ampicilina arrojan respectivamente unos resultados
similares.
En un primer aspecto, el presente invento con
ello proporciona un método para preparar una
sub-población fenotípicamente resistente de
bacterias en fase estacionaria que comprende por lo menos los
últimos pasos de:
- (1)
- criar un cultivo de bacterias hacia una fase estacionaria, y
- (2)
- tratar dicho cultivo en fase estacionaria con uno o varios agentes antibacterianos en una concentración y por un tiempo suficiente como para matar las bacterias que se crían, seleccionando con ello una sub-población fenotípicamente resistente al antibiótico.
Tal como aquí se le hace referencia, el término
"fenotípicamente resistente al antibiótico" se refiere a una
parte de la bacteria en fase estacionaria que permanece
metabólicamente activa (es decir, como examinado por una actividad
de trascripción) tras el tratamiento de la fase estacionaria con un
antibiótico en particular (uno mas que un antibiótico) administrado
en una dosificación alta, a saber por lo menos 10 veces mayor que
MIC. Esta sub-población no obstante es susceptible
de ser tratada con el antibiótico cuando no se encuentra en la fase
estacionaria. Se notará que una sub-población de
bacterias resistentes a un antibiótico en particular puede
distinguirse de una sub-población resistente a un
antibiótico diferente.
Tal como aquí es referido, el concepto
"matar" se refiere a una pérdida de viabilidad tal como se
determina por una falta total de actividad metabólica. Para lograr
este efecto, se administra un antibiótico a la fase estacionaria por
un tiempo aproximado y en una concentración apropiada.
Convenientemente, el antibiótico se aplica en una concentración que
va desde 10 a 104 x MIC, o bien a una concentración de 25 a 150
\muMg/ml (o bien 50 a 100 \muMg/ml) con las bacterias a una
concentración de 5 a 109 bacterias/ml) (o bien 106 a 107
bacterias/ml). Convenientemente las bacterias son tratadas con un
agente antibacteriano por de 1 a 10 días, o bien 3-5
días.
La naturaleza del agente antibacteriano empleado
puede depender de la bacteria en particular que se está
investigando. El uso de agentes antibacterianos empleados puede
depender de las bacterias en particular que se están investigando.
Se ha encontrado conveniente el uso de agentes antibacterianos tales
como la rifamcipina que enfocan un polimerizado RNA, por ejemplo a
concentraciones de 102, 103 y 104 veces el nivel normal MIC. En una
modalidad representativa de este aspecto del invento, el tratamiento
de la fase estacionaria M. tuberculosis a un nivel de 106
bacterias/ml para un día con 100 \mug/ml de rifampicina (MIC x
103) dio como resultado una subpoblación fenotípicamente resistente
de 102 bacterias/ml. Alternativamente la M. tuberculosis
puede tratarse con pirazinamina. En otras modalidades M.
tuberculosis puede tratarse con pirazinamida. En otras
modalidades, el tratamiento de una fase estacionaria de E.
coli o S. aureus (= 109 bacterias/ml) con 50 \mug/ml de
kanamicina o 100 \mug/ml ampicilina para 3 días da como resultado
una subpoblación fenotípicamente resistente de = 105
bacterias/ml.
La sub-población fenotípicamente
resistente al antibiótico puede verse como representativa de las
bacterias persistentes que permanecen metabólicamente activas en
vivo y las que pueden dar como resultado una activación o
rebrote de la enfermedad. Son especialmente interesantes por ello en
particular las sub-poblaciones resistentes a
antibióticos a partir de bacterias que muestran una inactividad
en vivo, es decir bacterias de los géneros Staphylococcus,
Escherichia, Hemophilous, y Micobacterium. Se prefieren
particularmente las sub-poblaciones de las bacterias
Staphilococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
Streptococcus pyrogenes, Streptococcus gordonii y Mycobacterium
tuberculosis.
En características especialmente preferidas las
bacterias son Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli
y
Staphilococcus aureus tratadas respectivamente con rifampicina, canamicina y ampicilina.
Staphilococcus aureus tratadas respectivamente con rifampicina, canamicina y ampicilina.
Tales sub-poblaciones
fenotípicamente resistentes de bacterias en fase estacionaria que
pueden obtenerse tratando las bacterias en fase estacionaria con
altas dosis de un agente antibiótico, constituyen una característica
más de la presente invención.
Sobre la base de que las
sub-poblaciones fenotípicamente resistentes de la
invención mimetizan el comportamiento de bacterias durmientes en
vivo, estas constituyen unas herramientas muy valiosas en
procedimientos de investigación diseñados para identificar nuevos
agentes antibacterianos potencialmente valiosos. Se apreciará que
los agentes antibacterianos que tienen actividad contra tales
sub-poblaciones fenotípicamente resistentes pueden
tener un gran potencial terapéutico en el tratamiento de
enfermedades tales como la tuberculosis en la cual las bacterias
durmientes proporcionan un foco de infección.
Con todo ello, en otro aspecto, el presente
invento proporciona un procedimiento para determinar la actividad
antibacteriana del compuesto de prueba o agente o para identificar o
aislar un compuesto o agente que tiene una actividad antibacteriana
contra bacterias en fase estacionaria que comprende los pasos
de:
- (1)
- criar un cultivo bacteriano en fase estacionaria
- (2)
- tratar dicha fase estacionaria con uno o mas agentes antibacterianos a una concentración y por un tiempo suficiente como para matar bacterias que se crían seleccionando con ello una sub-población fenotípicamente resistente.
- (3)
- Incubar una muestra de dicha sub-población fenotípicamente resistente con uno o más compuestos de prueba o agentes, y
- (4)
- determinar cualquier efecto antibacteriano contra dicha sub-población fenotípicamente resistente y opcionalmente aislar el compuesto o agente que exhibe actividad antibacteriana.
Semejante proceso facilita el rápido análisis de
grandes cantidades de compuestos con rapidez y eficacia. Los
componentes a ser investigados pueden ser cualquier compuesto
químico y pueden ser también conocidos o estos mismos pueden ser
nuevos. Compuestos candidatos especialmente adecuados son productos
con una química combinatoria, biblioteca de fagos, productos
naturales, sus homólogos, análogos, derivativos y precursores de
agentes antimicrobianos conocidos y otros productos farmacéuticos.
Tales homólogos, análogos, derivativos y precursores son entidades
que están relacionadas a o se derivan de antimicrobianos que
aparecen en la naturaleza u otros productos farmacéuticos, a saber
donde este es una proteína o péptido por sustitución, adición y/o
eliminación singular o múltiple del aminoácido o alteración del
nivel de glicosilación, o si el antimicrobiano es un compuesto
químico por derivación química, es decir esterificación, adición de
varios sustituyentes, metilación, etc. Preferentemente las
modificaciones arriba descritas no afectarán la función principal de
la molécula, es decir, estas retendrán la actividad antimicrobiana
aunque pueda ser modificada la extensión de esta actividad.
Para llevar a acabo la prueba, se añaden
convenientemente 1-1000 \mul, o bien
50-300 \mul de la bacteria resistente al
antibiótico preparada (la cual es lavada antes del uso) que contiene
103 a 106 bacterias/ml a la muestra que se tiene que analizar, o
bien 0,1 a 100 \mug, preferentemente 1-20 \mug.
Estos son incubados conjuntamente a una temperatura adecuada para la
actividad metabólica, preferentemente 37ºC. Los efectos
antibacterianos después son determinados en uno o varios momentos
que varían desde un día a cuatro semanas, preferentemente una vez a
la semana a lo largo de cuatro semanas.
El término "determinar" tal como se usa aquí
en referencia a los efectos antibacterianos incluye tanto la
cuantificación en el sentido de obtener un valor absoluto de la
extensión de la actividad antibacteriana, como también obtener una
determinación semi-cuantitativa u otra indicación
tales como un índice o ratio de la magnitud de actividad
antibacteriana en la muestra. La determinación incluye la
identificación de ambos, tanto los efectos positivos como la
actividad bacteriana. Se prefiere no obstante la identificación y el
aislamiento opcional de agentes de compuestos que exhiben unos
efectos antibacterianos. Tales efectos antibacterianos pueden ser
bactericidas o bacteriostáticos por naturaleza, aunque se prefiere
lo anterior.
Se puede uno cerciorar de la existencia de
actividad antibacteriana comparando el nivel de bacterias
metabólicamente vivas en la muestra de control de muestras. La
determinación puede lograrse con cualquier técnica apropiada que
identifica una actividad metabólica. Así por ejemplo, la actividad
transcripicional o translacional puede determinarse respecto a uno o
más genes, por ejemplo monitorizando los niveles de transcripción de
genes, o más generalmente, por ejemplo monitorizando la
incorporación de bases particulares de aminoácidos.
Alternativamente se pueden usar otras técnicas, por ejemplo se puede
fijar la capacidad de formar colonias, es decir, se puede determinar
una enumeración cfu tras la resucitación en cultivo líquido aunque
puede fallar incluso el conteo directo sobre medios sólidos sin un
medio de cultivo intermedio líquido para determinar la cfu. Los
compuestos de interés pueden ser opcionalmente analizados en
diferentes concentraciones por ejemplo para establecer el nivel de
MIC.
Componentes o agentes que tienen una actividad
antibacteriana se consideran aquellos que con la concentración usada
afectan adversamente la actividad metabólica de la
sub-población fenotípicamente
anti-resistente, preferentemente reduciendo la
actividad metabólica a menos del 50%, especialmente preferentemente
a menos del 25%, es decir menos del 10% comparado con muestras de
control no tratadas.
Componentes candidatos identificados de esta
manera, por ejemplo exhibiendo una concentración inhibitoria mínima
de 10 \mug/ml o menos, preferentemente 1 \mug/ml o menos,
especialmente preferentemente 0,1 \mug/ml (como determinado con
bacterias a una concentración de 106 a 107 cfu/ml) con respecto a la
sub-población resistente pueden después someterse a
mas tipos de análisis, eficacia y tests de toxicidad, etc.
El método de selección del invento puede llevarse
a cabo usando un paquete de determinación de actividad de un
compuesto de prueba o para identificación de un agente
antibacteriano que comprenda lo siguiente:
- i)
- una sub-población fenotípicamente resistente al antibiótico de bacterias en fase estacionaria tal como se define en lo siguiente.
Preferentemente el kit también contiene tampones
y soluciones apropiadas (particularmente para mantener las
bacterias, por ejemplo incluyendo agentes antibacterianos
apropiados) para determinar los efectos antibacterianos del
compuesto de prueba o agente determinando la actividad metabólica de
las bacterias. Adicionalmente, el paquete puede también incluir los
medios de estandarización de la prueba o par propósitos
comparativos.
Los compuestos o agentes antibacterianos
identificados o aislados mediante el procedimiento arriba mencionado
son producidos en una mayor escala para otra prueba o uso.
Dependiendo de la naturaleza de los compuestos de prueba esto se
puede lograr usando procedimientos sintéticos o naturales, o una
combinación de ambos. Por ejemplo, donde el compuesto de pruebas es
un péptido, esto puede producirse sintéticamente por síntesis de
péptidos o puede también producirse por expresión de una molécula de
DNA apropiada. Así, en un aspecto preferente, el presente invento
proporciona un procedimiento para preparar un agente que tiene
actividad antibacteriana contra bacterias de fase estacionaria en
donde es amplificado dicho agente identificado según el
procedimiento aquí descrito.
Los compuestos químicos recientes que muestran
efectos bacteriostáticos o bactericidas en una
sub-población resistente a un agente antibacteriano,
por ejemplo una sub-población resistente a la
rifampicina de M. tuberculosis, una
sub-población resistente a la canamicina de E.
coli o una sub-población resistente a la
ampicilina de S. aureus, puede ser identificada y/o preparada
por lo métodos de la invención.
Se cree que la resistencia de bacterias
persistentes a agentes antibacterianos puede deberse a un
decrecimiento de la permeabilidad en la pared celular y/o el uso de
factores sigma alternativos (tales como sigB). Nuevos agentes
antibacterianos que tienen efecto de incremento de permeabilidad de
pared celular o que inhiben el uso de factores sigma alternativos
son por eso especialmente preferentes.
Los agentes antibacterianos preferentes
identificados según la invención tienen una utilidad particular en
el tratamiento de enfermedades o desórdenes en los cuales las
bacterias durmientes proporcionan un foco desde el cuál se puede
iniciar o reiniciar la enfermedad sintomática. En particular pueden
enfocarse enfermedades que resultan de bacterias patogénicas del
género Staphylococcus, Escherichia, Haemophilus y
Mycobacterium. Los agentes antibacterianos que poseen una
actividad contra las bacterias persistentes pueden utilizarse
durante etapas sintomáticas o asintomáticas de la enfermedad o
condición, cuando aquellos bacilos persistentes están en estado
durmiente o no durmiente, y opcionalmente pueden utilizarse
conjuntamente con agentes dirigidos a bacterias no durmientes.
"Bacterias no durmientes" tal como aquí se usa incluye
bacterias que al mismo tiempo están en un estado no latente, es
decir, están creciendo activamente, pero pueden o no otras veces
mostrar un estado durmiente.
Se pudo hacer una formulación o composición que
comprende un antimicrobiano novedoso identificado y o preparado por
los métodos del invento, es decir un agente antibacteriano o
compuesto químico tal como descrito aquí y un diluyente a excipiente
farmaceuticamente aceptable.
Las mezclas farmacéuticas pueden formularse de la
manera convencional usando ingredientes que pueden obtenerse
preparados. Así pueden incorporarse los ingredientes activos,
opcionalmente conjuntamente con otras sustancias activas, con una o
más carreras convencionales, diluyentes y/o excipientes para
producir preparados galénicos como tabletas, píldoras, polvos,
almidones, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, jarabes,
aerosoles (en estado sólido o líquido), ungüentos, cápsulas de
gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones estériles
inyectables, polvos empaquetados estérilmente, y similares.
Ejemplos de portadores apropiados, excipientes, y
diluyentes son lactosa, dextrosa, sucrosa, sorbitol, manitol,
almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, aglinados, tragacanto,
gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina,
polivinilpirrodina, sirope de agua, agua/etanol, agua/glicol,
agua/polietileno, glicol/propileno, celulosa de metilo,
metilohidroxibenzoato, hidroxibenzoato, talco, estearato de
magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como la grasa
dura o una mezcla apropiada de ésta.
En el manejo clínico de la tuberculosis y otras
enfermedades en donde el establecimiento y la existencia de
bacterias durmientes es problemático, puede ser ventajoso
administrar una combinación de agentes antibacterianos que son
respectivamente dirigidos hacia las distintas fases de crecimiento
de estos organismos. Por ello por ejemplo una forma apropiada de
tratamiento quimioterapéutico de la tuberculosis y enfermedades
similares sería la administración a un paciente de uno o más agentes
antibacterianos dirigidos contra la fase de crecimiento o de
ramificación de los microorganismos y uno o más agentes
antibacterianos dirigidos contra la población durmiente o en fase
estacionaria.
Pueden prepararse formulaciones para comprender
por lo menos un agente antibacteriano que tiene una actividad contra
bacterias crecientes activamente y por lo menos un agente
antibacteriano o compuesto químico (tal como aquí se describe) que
tiene una actividad contra la sub-población
fenotípicamente resistente de la fase estacionaria de dichas
bacterias. Tales formulaciones pueden presentarse como una
preparación combinada para uso simultáneo, por separado o secuencial
en el tratamiento de infecciones bacterianas como la
tuberculosis.
Tales formulaciones pueden administrarse durante
las etapas sintomáticas o asintomáticas de la enfermedad, es decir
el agente antibacteriano contra la sub-población
resistente no necesariamente necesita ser usado cuando estas
bacterias están en fase durmiente, pero pueden usarse cuando estas
están creciendo activamente.
Los agentes antibacterianos que poseen una
actividad contra bacterias de crecimiento activo muestran efectos
antibacterianos tales como los anteriormente descritos contra
bacterias durante la fase de recuento.
Compuestos o agentes, identificados como
efectivos contra sub-poblaciones fenotípicamente
resistentes de bacterias en fase estacionaria, o bien por el
proceso de selección arriba descrito, o composiciones que contengan
estos puede usarse en el tratamiento de infección bacteriana.
Convenientemente, las infecciones bacterianas que pueden ser
tratadas apropiadamente son aquellas en las cuales las bacterias
persistentes permanecerían tras una infección incluso si el
macroorganismo infectado es asintomático, por ejemplo, antes de la
reanudación de la enfermedad o tras el tratamiento con
antibacterianos conocidos, Estas bacterias pueden estar en la fase
durmiente y con ello en un aspecto preferido la infección bacteriana
a tratarse incluye (o podría incluir potencialmente) bacterias
durmientes, en tanto la infección sea tipificada o caracterizada por
una sub-población de bacterias persistentes que
permanecen en pacientes asintomáticos en ausencia de bacterias de
crecimiento activo, es decir que pueden entrar en una fase durmiente
tras la infección.
Compuestos o agentes identificados como efectivos
contra las sub-poblaciones fenotípicamente
resistentes de bacterias en fase estacionaria, por ejemplo mediante
el proceso de muestreo arriba mencionado, o composiciones que las
contengan pueden usarse en la preparación de un medicamento para el
tratamiento de infecciones bacterianas.
Desde un punto de vista alternativo, el presente
invento proporciona un procedimiento para la preparación de un
medicamento para tratamiento de una infección bacteriana, en donde
el medicamento es administrado al paciente que está necesitado de
semejante terapia y comprende una cantidad efectiva de un agente
antibacteriano o compuesto dirigido hacia la fase de crecimiento de
dicho organismo.
Preferentemente, el animal a ser tratado es un
mamífero, especialmente preferentemente un ser humano.
Tal como se menciona arriba, puede llevarse a
cabo la administración cuando el individuo enfermo es sintomático o
asintomático. Aunque los agentes antibacterianos según el invento
pueden identificarse como efectivos contra bacterias persistentes
durmientes, es decir en fase estacionaria de crecimiento, los
agentes del invento pueden ser administrados cuando estas bacterias
están activamente creciendo.
La administración de la composición puede
llevarse a cabo por una cualquiera de las vías convencionales, por
ejemplo, por vía oral, por vía rectal, o por vía parenteral como por
ejemplo por vía de inyección intramuscular, subcutánea,
intraperitonal o intravenosa.
El ingrediente activo de tales composiciones
puede comprender desde alrededor de 0,01% a alrededor de un 99% en
peso de la formulación, preferentemente desde alrededor de 0,1 a
50%, por ejemplo un 10%, La dosificación precisa del ingrediente
activo a ser administrado y la duración del tratamiento dependerá
por supuesto de una cantidad de factores que incluyen por ejemplo la
edad y el peso del paciente, la condición específica que requiere
tratamiento y su severidad, y la vía de la administración.
En cada aspecto del invento, las bacterias de
fase estacionaria que son el objetivo de los agentes estacionarios
pueden incluir bacterias patogénicas tales como la Staphylococcus
aureus, Haemophylus influnzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
gordonii, Escherischia coli y preferentemente en particular,
Mycobacterium tuberculosis.
Los siguientes ejemplos no limitativos sirven
para ilustrar la invención. En los dibujos anexos
Fig.1 muestra curvas de crecimiento para la E.
coli y S. aureus por un período de 10 días;
Fig. 2 muestra la viabilidad de curvas de
crecimiento para la E. coli tras el tratamiento de 50
\mug/ml canamicina durante la fase estacionaria y fase de
selectividad de crecimiento;
Fig. 3 muestra la viabilidad del S. aureus
tras el tratamiento con 100 \mug/ml ampicilina durante la fase
estacionaria y fase de selectividad de crecimiento.
Se crió M. tuberculosis H37Rv en un caldo
de cultivo Middlebrook 7H9 que contenía 0,05% de Tween® 80 con 10%
de ADC de suplemento, sin agitación u otro tipo de disturbio por
espacio de hasta 100 dias, de acuerdo con el procedimiento de Wyne
(1976) Amer Rev. Resp. Dis 114:807-811. Allá donde
los organismos en fase estacionaria eran viables estos eran
resistentes a los niveles MIC de 0,1 \mug/ml de rifampicina.
Fueron pasados por el batidor unas sesenta
muestras de 10 ml de los cultivos fueron batidas con cuentas de
vidrio por espacio de 3-5 minutos, seguido de un
baño de ultrasonidos en un baño de agua por menos de cinco minutos.
Todos los cultivos fueron metidos en unas botellas estériles de 500
ml con un tapón de rosca.
Antes de la adición de rifampicina unas muestras
del cultivo fueron extraídas para comprobar la pureza, la
viabilidad, y la actividad metabólica tal como sigue
| 1. | 2 x 100 \mul para conteos de CFU |
| 2. | 2 x 5 ml para conteos de caldo de cultivo |
| 3. | 2 x 10 ml para conteos de [3H]uridina |
| 4. | 2 x 5 ml para conteos de [35S] metionina |
| 5. | 10 ml para extracción de RNA para conteos de RT-PCR |
| 6. | 10 ml para control libre de drogas |
| 7. | 20 \mul de sangre para controlar la esterilidad |
Se añadieron 50 ml de 1.000 \mug/ml de
rifampicina a 500 ml del cultivo de arriba para obtener una
concentración final de rifampicina de 100 \mug/ml, y se incubó el
cultivo a 37ºC por espacio de cinco días. Las células luego fueron
recolectadas en unos tubos de ensayo estériles mediante
centrifugación a 5.000 g por espacio de 15 minutos, y luego se
lavaron dos veces en solución tampón salina de fosfato estéril que
contenía 0,005% de antibióticos Selectitab® y Tween® 80 (que
comprende una combinación de agentes antibacterianos que matan a la
mayoría de las bacterias excepto M. tuberculosis, evitando
con ello que la M. tuberculosis fuese excesivamente germinada
por bacterias de crecimiento más rápido). Las células luego fueron
resuspendidas en 500 ml de medio fresco 7H9.
La esterilidad del cultivo se chequeó antes de
otros experimentos, se añadieron 2 x 100 \mul de muestras del
cultivo de placas de agar de sangre en duplicado que fueron
incubados a 37ºC por la noche. Se mantuvo la suspensión de células a
4ºC por la noche. Los cultivos contaminados deberían siempre
descartase.
Se encontró que este tratamiento con altos
niveles de rifampicina redujo los conteos de placas a unidades de
formación de colonia cero pero resultó en una pequeña cantidad de
organismos persistentes que eran perceptibles mediante conteo de
dilución de caldo de cultivo. La tabla 1 muestra un ejemplo típico
de tal selección en donde quedaron 10^{2} de 10^{6} bacterias/ml
tras el tratamiento por un días con rifampicina. De esto parece
deducirse que M. tuberculosis tiene por lo menos dos
poblaciones de organismos en fase estacionaria: la primera es
eliminada por una elevada dosis de rifampicina y la segunda
"persiste" y es fenotípicamente resistente. Tras la reanudación
de la crianza, la sub-población en fase estacionaria
resistente a la rifampicina se hace sensible a la rifampicina a un
nivel normal MIC de 0,1 \mug/ml.
Se crió M. tuberculosis en un medio de 7H9
que contenía 0,05% de Tween® suplido con 10% de ADS (Laboratorios
Difco) sin agitar por espacio de 100 días. Se le añadió rifampicina
a los cultivos a una concentración final de 100 \mug/ml por
espacio de cinco días. Se fue estimando la viabilidad a intervalos
de un día. Se lavaron por encima las células y se añadieron 100
\mul de muestras de diluciones de 10 ramificaciones de los
cultivos a las placas por triplicado de medio Middlebrook 7H11
suplido con OADC (Difco Laboratories). Se contaron unidades
formadoras de colonias (CFU) tras la incubación de la placa por
espacio de tres semanas a 37ºC. Se llevaron a cabo conteos del caldo
de cultivo en diluciones de 10 ramificaciones añadiendo 1 ml de la
muestra a 9 ml del medio 7h9. Se estimó la viabilidad examinando el
crecimiento en los cultivos diluidos tras la incubación por espacio
de 6 semanas a 37ºC por la noche.
Para la incorporación de uridina radiactiva se
lavó dos veces la cantidad de 10 ml del cultivo para cada punto en
el tiempo al objeto de retirar la rifampicina restante, y luego se
suspendió de nuevo en 10 ml de medio 7H9 seguido de incubación con
10 \muCi/ml de [^{3}H]-uridina por espacio de 20
horas. Por 5'' el cultivo no se lavó tras la incubación con
rifampicina y 10 \muCi/ml de [^{3}H]-uridina se
añadieron al cultivo que además fue incubado en la presencia de
rifampicina por espacio de 20 horas. Se extrajo el RNA mediante
métodos conocidos en la profesión. La incorporación de
[^{3}H]-uridina fue determinada como conteos por
minuto de RNA precipitado en ácido tricloroacético .
Los resultados se confirmaron en tres
experimentos independientes
El estado metabólico de los bacilos antes y
después del tratamiento con rifampicina también fue determinado
examinando el total del RNA extraído. Se realizó un
RT-PCR en los siguientes genes: rpoB que codifica el
objetivo rifampicina (sub-unidad B de polimerasa);
proteína 16kDa (homóloga \alpha-cristalina); 16S
rRNA y dos homólogos Sigma70, sigA y sigB.
Los resultados se muestran en la Tabla 1
Se analizaron unas muestras de la
sub-población de células resistentes a la
rifampicina y después la población de células fue caracterizada. La
población se mostró ser metabólicamente activa por virtud de una
actividad trascripcional y translacional detectada en la población.
Todos los genes que se examinaron mostraron que se transcribían en
la fase estacionaria. Tras cinco días de tratamiento con rifampicina
que redujo la cfu a cero, el rRNA 16S no disminuyó y aún se podían
detectar transcripciones para rpoB, 16K y SigB, todas a niveles
reducidos, mientras que no se podía ver la transcripción para
SigA.
Unos conteos de dilución de caldo de cultivo de
cultivos tratados con rifampicina (días 1-5) dieron
valores de 10^{2} bacterias/ml (Tabla 1) indicando la presencia de
bacterias capaces de crecer. No obstante, a pesar de la caída de
cuatro registros en los conteos de dilución de caldo de cultivo tras
el tratamiento con rifampicina, la señal RT-PCR para
16S, sigB, 16K y rpoB se situaba varias
ramificaciones de registro por encima de la que cabria esperarse
para tales bajas cantidades de bacterias supervivientes en positivo
en el caldo de cultivo. Para cuantificar la cantidad de 16S RNA
presente, se midió el nivel de rRNA mediante una transferencia
Northern antes y después del tratamiento con rifampicina (no se
muestran los datos). Un análisis densitométrico reveló que alrededor
de la mitad de la intensidad de señal permanecía tras 7 días de
tratamiento con el antibiótico tanto en organismos en fase de
registro como en organismos en fase estacionaria. Esto sugiere que
rRNA es muy estable en cultivos tratados con rifampicina. En
contraste a esto, los mRNAS fueron mucho menos estables que rRNA.
Las vidas medias de mRNA para 16K y sigB se midieron
tanto en cultivos en fase de registro como en fase estacionaria a
largo plazo y mostraron ser de entre 2 a 3 minutos. Por ello, es
improbable que los resultados RT-PCR sean tomados en
cuenta por un mRNA estable a largo plazo y sugieren una
transcripción activa. Esto fue probado tratando primero los
organismos con rifampicina, y después incubando esta bacteria
simultáneamente con rifampicina y [^{3}H]-uridina.
En presencia de rifampicina las bacterias incorporaron
[^{3}H]-uridina indicadora de una transcripción
activa en las bacterias persistentes incluso en la presencia de una
elevada concentración de rifampicina, y muestra que las bacterias
están metabolizando
activamente.
activamente.
Las células mostraron ser muy responsivas a los
cambios en su entorno. Cuando se retiró la rifampicina y se cambió
por solamente el medio de crianza, el nivel de trascripción de tres
genes (trascripciones 16K, sigA y rpoB)
analizado aumentó en de 5 a 10 ramificaciones tras 12 horas. También
se incrementó la incorporación de uridina radiactiva en alrededor de
5 ramificaciones tras la retirada de rifampicina y la incubación con
solamente el medio (Tabla 1 - compara conteos de 5* a 5 días). Esto
sugería que el nivel de trascripción se incrementaba rápidamente en
esas circunstancias. Los datos no excluyen la posibilidad de que los
organismos se repliquen en la presencia de un medio fresco, aunque
esto solamente se tendría en cuenta para una aumento de dos
ramificaciones en la trascripción en 12 horas, ya que el tiempo de
generación de la M. tuberculosis está en alrededor de 20
horas. Los datos apoyan la hipótesis de que en este modelo in
vitro de bacterias en fase estacionaria resistentes a drogas
existe una mayor población de bacterias que está trascribiendo
activamente RNA y son reactivas al entorno, aunque permanecen
negativas al cultivo de placas.
Para distinguir entre una resistencia fenotípica
y genotípica, las bacterias fueron lavadas por encima tras el
tratamiento con rifampicina y fueron cultivadas en un medio liquido
7H9 por unas seis semanas. En cuatro experimentos por separado la
M. tuberculosis fue criada invariablemente. Estas bacterias
eran sensibles a 0.1 \mug/ml de rifampicina y fueron negativas a
mutaciones resistentes a rifampicina en rpoB como se detectó por
RT-PCR y hibridación con sondas oligonucleótidas
(Immunogenetics N.V., Holanda; no se muestran aquí datos)
Esto indica que la resistencia es fenotípica en
este modelo
No es probable que el mecanismo de resistencia
inducida dependa de la mutación de niveles reducidos de expresión de
rpoB mRNA (por ejemplo en un nivel reducido de la droga objeto)
debido a que la trascripción continúa incluso con la presencia de
rifampicina (Tabla 1)
La sub-población antibacteriana
resistente fue examinada in vivo de acuerdo con el modelo de
estado latente Cornell en el cual la tuberculosis crónica murina es
inducida por quimioterapia. Se crió M. tuberculosis en unos
ratones BALB/c que pesaban de 18 a 20 gramos que fueron infectados
por via intravenosa con 2 x 105 cfu de una variedad virulenta H37Rv
que afecta a los ratones de M. tuberculosis. Se retiraron los
bazos y los pulmones rápidamente tras el sacrificio y la autopsia
estéril al cabo de hasta 2 semanas y 0 semanas; algunas piezas de
los órganos fueron inmediatamente congeladas en N_{2} líquido.
Se realizaron unos conteos de M.
tuberculosis viable a Cfu moliendo el bazo y los pulmones en
unos amoladores de politetrafluoroetileno/vidrio y realizando
conteos de la dilución en serie de las placas del homogeneizados
sobre placas de un medio selectivo 7H11 (Difco, Detroit).
Se le dio tratamiento por espacio de 14 semanas
con 100 mg de pirazinamida/kg y 25 mg de isoniacida/kg de peso
corporal en la dieta en píldoras cuando se alcanzó el estado
estéril. Una muestra de ratones también fue sacrificada al cabo de 7
semanas. Otra muestra mas se sacrificó al tiempo de 14, y la
totalidad de los homogeneizados de órgano fueron cultivados en un
medio líquido selectivo Kirchner (Lab M, Amersham). Los medios de
cultivo fueron hechos selectivos para M. tuberculosis con la
adición de 200 U polimixina B/ml, 100 \mug carbenicilina/ml 20
\mug trimetoprim/ml y 10 \mug amfotericina/ml. Durante otras 8
semanas mas se les administró a la muestra restante de ratones una
terapia de esteroides.
Se retiró de los pulmones RT-PCR
de RNA antes de que el tratamiento revelase transcripciones para
rpoN, sigA, 16K y 16S rRNA. Significativamente, el mRNA para sigB y
16K fue detectado en los pulmones desde el día 91 (13 semanas)
post-tratamiento, y el nivel de16S rRNA no se redujo
comparado con el nivel pre-quimioterapia. Es
sorprendente encontrar vestigio alguno de mRNA tras 13 semanas de
quimioterapia ya que la mRNA se agota en el plazo de unas horas. No
obstante, ya que no hemos sido capaces de medir la media vida de
mRNA in vivo o la absorción de [3H]-uridina a
RNA, no hemos podido discriminar entre mRNAs estables e inestables.
No obstante, los datos sugieren, que unas cantidades sustanciales de
bacilos persistentes están presentes en los pulmones hacia el día 91
que pueden ser metabólicamente activos ya que contienen mRNA, pero
no son cultivables. Todos los pulmones usados para
RT-PCR fueron cultivo-negativos.
Como en el modelo in vitro las
trascripciones sigA no eran perceptibles en los ratones persistentes
y eso puede ser debido a la reducida abundancia de este mRNA que
conduce a niveles por debajo de límites perceptibles, o puede ser
debido a iniciadores insensibles. Los datos actuales no hacen una
discriminación entre estas posibilidades. Las trascripciones sigF
(no se muestran aquí datos) fueron detectadas en ratones Cornell,
pero las bandas eran muy débiles. Todos los controles fueron
llevados a cabo para asegurar productos RT-PCR
derivados de mMRNA y no del DNA genómico contaminante.
Dos semanas tras la infección, en la semana de
tiempo 0, una muestra de cuatro ratones dió 2-5 x
10^{7} cfu/pulmones o bazos. Otros cuatro ratones fueron
sacrificados a las 7 y 14 semanas. De estos 8 ratones, dos dieron
un cultivo positivo de órgano, uno del bazo solamente y otro del
pulmón. No obstante, los ratones en este estado "estéril"
contienen grandes cantidades de DNA M. tuberculosis que se
estima equivalente a 10^{5} bacterias por órgano. Tras el
tratamiento de los ratones con esteroides, los pulmones y los bazos
dieron cultivos positivo que indicaban la reactivación desde una
estado latente, no cultivable, y resistente a los fármacos.
Sin desear atenerse demasiado a la teoría se cree
que el mecanismo de resistencia de las bacterias persistentes a los
agentes antibacterianos puede deberse a una reducción de la
permeabilidad del tabique celular (EDTA permeabiliza las paredes de
las células del persistente e incrementa la eficacia de rifampicina,
datos no mostrados) y el uso de factores sigma alternativos (tales
como sigB) que confieren una insensibilidad a la inhibición de
trascripción por medio de rifampicina.
Se usan unos tubos transparentes de ensayo
estériles de cierre de plástico por encaje y etiquetados de 0,7 ml
conteniendo 1-20 \mug del compuesto a analizar. El
compuesto se disuelve en agua estéril destilada o cualquier otro
diluyente apropiado. Se añade 0,25 ml del cultivo tratado por
rifampicina a cada tubo en el alojamiento de clase I en un
laboratorio de seguridad de categoría III con cuidado de evitar
cualquier contaminación. Los tubos se incuban a 37º. Los efectos del
fármaco se examinan mediante conteos CFU añadiendo 2 x 50 \mul de
cada muestra a placas de gel 7H11 en duplicado incluyendo controles
libres de fármaco a intervalos de 1 semana. Puede necesitarse una
serie de diluciones de 10 ramificaciones de las muestras, lo que se
hace en un caldo de cultivo 7H9 con 0,05%, Tween80 pero sin ADC,
después se aplican en placa sobre geles de 7H11 y el efecto de
concentración de los compuestos candidatos.
Se crían Eschereschia coli K12 y
Staphylococcus aureus en 10 ml de caldo nutriente Nº 2
(Oxoide) bajo agitación continua a 120 rpm por espacio de 10 días.
Se estima la viabilidad de las bacterias mediante conteos de
unidades de formación de colonias a intervalos de 2 horas para las
primeras 24 horas y de 12-24 horas después. De unas
diluciones en serie de 10 ramificaciones de los cultivos
experimentales, se añaden muestras de 100 \mul a placas por
triplicado de placas de agar nutriente (Oxoid). Se cuentan las
unidades que forman colonia (CFU) tras la incubación de las placas a
37ºC por 24 horas.
Se añaden ampicilina y canamicina a cultivos de
fase estacionaria de 5 dias de E. coli y S. aureus
respectivamente a una concentración final de 100 \mug/ml
respectivamente por espacio de 3 días. Tras 3 días de tratamiento
antibiótico, las células se lavan tres veces con agua destilada,
luego se re-suspenden en 10 ml de caldo de cultivo
fresco. Se estima la viabilidad mediante conteos de CFU y conteos de
dilución de caldo de cultivo. Los conteos de caldo de cultivo fueron
llevados a cabo de dilución de 10 ramificaciones de serie de un
caldo nutriente de cultivo, después 1 ml de cada dilución se añade a
9 ml de caldo nutriente en tubos de ensayo de 30 ml por triplicado.
Las curvas de crecimiento para E. coli y S. aureus a
través del período de 240 horas en la ausencia de antibióticos se
muestra en la fig. 1. El efecto de la exposición antibiótica sobre
la E. coli y S. aureus durante la fase de crecimiento
tanto de registro como durante la estacionaria se muestra en las
figs. 2 y 3. El tratamiento de los cultivos durante la fase
estacionaria da como resultado la selección de una
sub-población de células resistente a los
antibióticos.
Claims (15)
1. Procedimiento para la preparación de una
sub-población fenotípicamente antibioresistente de
bacterias en fase estacionaria que comprende una de las siguientes
etapas:
- (1)
- cultivo de bacterias hasta la fase estacionaria, y
- (2)
- tratamiento de dicho cultivo en fase estacionaria con uno o varios agentes antibacterianos a una concentración y durante un periodo lo suficientemente largo como para matar las bacterias del cultivo, y de este modo seleccionar una sub-población fenotípicamente antibioresistente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
cual dicho agente antibacteriano se elige dentro del grupo
constituido por la rifampicina, la canamicina, la ampicilina y la
pirazinamida.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el cual dicho agente antibacteriano se emplea a un concentración
de 25 a 150 \muMg/ml, estando presentes las bacterias a una
concentración de 5 a 109 bacterias/ml.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3, en la cual dichas bacterias son
Staphylococcus aureus, Escherischia coli, Haemophilus influenzae,
Streptococcus pyrogenes, Streptococcus gordonii o
Micobacterium tuberculosis.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual dichas bacterias son
Mycobacterium tuberculosis y dicho agente es la
rifamcipina.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual dichas bacterias son
Escherischia coli y dicho agente antibacteriano es la
canamina.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual dichas bacterias son
Staphylococcus aureus y dicho agente antibacteriano es la
ampicilina.
8. Sub-población fenotípicamente
antibioresistente de bacterias en fase estacionaria susceptible de
ser obtenida por un procedimiento como el definido en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Procedimiento para evaluar la actividad
antibacteriana de un agente o de un compuesto de prueba o para
aislar un compuesto o un agente que tiene una actividad
antibacteriana contra bacterias en fase estacionaria, que comprende
las etapas siguientes:
- (i)
- preparación de una sub-población fenotípicamente antibioresistente de bacterias en fase estacionaria según el procedimiento definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
- (ii)
- incubación de una muestra de dicha sub-población fenotípicamente antibioresistente con uno o varios agentes o compuestos de prueba, y
- (iii)
- evaluación de todos los efectos antibacterianos contra dicha sub-población fenotípicamente antibioresistente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9 que
comprende además una etapa suplementaria en la cual se aísla un
compuesto o un agente que presenta una actividad antibacteriana.
11. Procedimiento según la reivindicación 10 que
comprende además una etapa suplementaria en la cual el compuesto o
el agente identificado o aislado es producido a una escala
mayor.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u
11, que comprende la etapa suplementaria que consiste en suministrar
el compuesto o el agente aislado de una forma conveniente para su
utilización en la fabricación de un medicamento destinado a ser
usado como agente antibacteriano.
13. Procedimiento según la reivindicación 12 en
el cual el compuesto o agente aislado está formulado con un
excipiente o un diluyente aceptable desde el punto de vista
farmacéutico.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el cual el compuesto o el agente aislado se formula con por lo menos
un agente antibacteriano, en el cual la fórmula resultante se
presenta como una preparación combinada para una utilización
simultánea, por separado o secuencial en dicho tratamiento de una
infección bacteriana.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el cual dicha infección bacteriana está caracterizada por una
sub-población de bacterias persistentes que pueden
entrar en una fase durmiente tras la infección.
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