ES2229800T3 - Conjugados de hapteno-soporte para tratar y prevenir la adiccion a la nicotina. - Google Patents
Conjugados de hapteno-soporte para tratar y prevenir la adiccion a la nicotina.Info
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Abstract
Un conjugado de hapteno-soporte de la siguiente fórmula: en la que m es de 1 a 2500, n es de 0 a 12, y es 1 a 12, X se selecciona entre el grupo compuesto por NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO y S-S; Y se selecciona entre el grupo compuesto por NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO y S-S; y el resto -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- está unido a la posición 3'', 4'' o 5'' de la nicotina.
Description
Conjugados de hapteno-soporte
para tratar y prevenir la adicción a la nicotina.
La presente invención se refiere al tratamiento y
prevención de la adicción a la nicotina. En particular, la
invención se refiere a nuevos conjugados de
hapteno-soporte que son capaces de inducir la
producción de anticuerpos. Tales anticuerpos pueden unirse
específicamente a la nicotina. Además, la presente invención prevé
la prevención o el tratamiento de la adicción a la nicotina por
medio de la administración de un conjugado de
nicotina-soporte en una formulación
farmacéuticamente aceptable. La presente invención también contempla
el uso de los anticuerpos inducidos en respuesta al conjugado de
hapteno-soporte para la prevención y tratamiento de
la adicción a la nicotina.
El hábito de fumar cigarrillos, puros y pipas es
un problema prevalente en los Estados Unidos y en todo el mundo. El
tabaco de fumar y el tabaco que no se fuma son ricos en nicotina,
que es una substancia adictiva conocida. La nicotina es un
alcaloide derivado de la planta del tabaco, que es responsable de
los efectos psicoactivos y adictivos del hábito de fumar. La
nicotina está formada por dos anillos unidos entre sí por un solo
enlace: un anillo aromático de seis miembros (piridina) y un anillo
alifático de cinco miembros (pirrolidina). La pirrolidina está
N-metilada y está unida a través de su carbono 2 al
carbono 3 de la piridina. De esta manera, el carbono 2 es quiral, y
hay una rotación prácticamente libre alrededor del enlace sencillo
que une los dos anillos. Se ha establecido que la configuración
absoluta del carbono 2 es S. De esta manera, la configuración
natural de la nicotina es (S)-(-)-nicotina.
El uso de la nicotina está muy extendido debido a
la fácil disponibilidad de cigarrillos, puros, pipas y tabaco que
no se fuma. De acuerdo con el Departamento de Sanidad y Servicios
Humanos de los Estados Unidos, el hábito de fumar cigarrillos es la
principal causa de muerte prevenible en los Estados Unidos. Véase
también McGinnis et al., J. Am. Med. Assoc., 270,
2207-2211 (1993). También se ha notificado que la
exposición al tabaco por los no fumadores tiene graves efectos
perjudiciales para la salud, incluyendo la exacerbación del
asma.
Aunque la naturaleza adictiva de la nicotina es
bien conocida, el hábito de fumar cigarrillos es prevalente. Se
consiguen niveles máximos de nicotina en la sangre, de
aproximadamente 25 a 50 nanogramos/ml, 10-15 minutos
después de fumar un cigarrillo. En los seres humanos, cuando se
fuma un cigarrillo se alcanzan concentraciones de nicotina arterial
10 veces mayores que las concentraciones de nicotina venosa, porque
la nicotina se libera rápidamente desde los pulmones al corazón
(véase Henningfield (1993) Drug Alcohol Depend.
33:23-29). Esto tiene como resultado un rápido
suministro de altas concentraciones de nicotina arterial al
cerebro. Una vez que la nicotina atraviesa la barrera
hematoencefálica, los indicios sugieren que se une a receptores
colinérgicos, que normalmente se activan por el neurotransmisor
acetilcolina, que está implicado en la respiración, en el
mantenimiento del ritmo cardíaco, memoria, estado de alerta y
movimiento muscular. Cuando la nicotina se une a estos receptores,
puede afectar a la función normal del cerebro activando la
liberación de otros neurotransmisores tales como dopamina. La
dopamina se encuentra en el cerebro en regiones implicadas en las
emociones, motivación y en la sensación de bienestar. Es la
liberación de neurotransmisores, especialmente de la dopamina, la
que es responsable de la adicción a la nicotina del usuario del
tabaco o de otra forma de consumo de nicotina.
Debido a los efectos adversos significativos del
hábito de fumar sobre la salud, los fumadores a menudo intentan
dejar este hábito. Sin embargo, la naturaleza adictiva de la
nicotina y la disponibilidad de cigarrillos contribuyen a que
continúe la dependencia de la nicotina y a la alta tasa de fracaso
de los que intentan dejar de fumar. El síndrome de abstinencia es
desagradable y se alivia fumando.
Se han creado muchas terapias para la adicción a
la nicotina, pero son muy poco eficaces. Las dos terapias más
populares siguen siendo el parche transdérmico de nicotina y la
nicotina incorporada en chicles. Estas terapias, denominadas
"terapias de reemplazo de nicotina" (NRT), reemplazan la
cantidad de nicotina que el usuario recibía previamente al fumar y
actúan haciendo que el usuario deje de consumir nicotina. Sin
embargo, con este tipo de terapias se observan ciertos
inconvenientes. Particularmente, hay una baja penetración de la
nicotina en la corriente sanguínea y, por lo tanto, un mayor deseo
de fumar. Con el uso de chicles de nicotina se han asociado
problemas tales como irritación de la boca, dolor de mandíbula y
náuseas. Con el uso de parches transdérmicos de nicotina se han
asociado problemas tales como irritaciones cutáneas, alteraciones
del sueño y nerviosismo.
Por lo tanto, se necesita una metodología
alternativa para tratar la adicción a la nicotina. La bibliografía
reconoce esta necesidad y ha habido varios intentos de proporcionar
una metodología para tratar la adicción a la nicotina. Uno de los
métodos implica la administración de anticuerpos que se han inducido
en respuesta a la nicotina. Sin embargo, se sabe que las substancias
de bajo peso molecular, denominadas haptenos, no pueden inducir una
respuesta inmune en animales hospedadores. La nicotina no es una
excepción, y como es una molécula pequeña no es inmunogénica. Para
inducir una respuesta de anticuerpos a un hapteno, típicamente se
une covalentemente a una proteína de soporte y el complejo inducirá
la producción de anticuerpos que reconozcan el hapteno.
Por ejemplo, se usó ácido cotinina
4'-carboxílico unido covalentemente a la
hemocianina de lapa californiana (KLH) para generar anticuerpos
contra el metabolito de la nicotina cotinina. Esos anticuerpos se
usaron para determinar la presencia de cotinina en fluidos
fisiológicos. Véase Bjerke et al. J. Immunol.
Methods, 96, 239-246
(1987).
(1987).
Castro et al (Eur. J. Biochem., 104,
331-340 (1980)) prepararon otros anticuerpos contra
la nicotina. Castro et al. prepararon haptenos de nicotina,
conjugados con albúmina de suero bovino (BSA), estando conjugada la
proteína de soporte a través de un enlazador en la posición 6 de la
nicotina. Castro et al. prepararon otros conjugados de
nicotina de BSA que se inyectaron en mamíferos para inducir
anticuerpos. En otra publicación, Castro et al. , en
Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 583-589
(1975) describen dos conjugados de
nicotina-albúmina:
N-succinil-6-amino(\pm)-nicotina-BSA
y
6-(s-aminocapramido)-(\pm)-nicotina-BSA.
En esta publicación de 1975, Castro et al. también usaron
anticuerpos contra el conjugado nicotina-soporte,
6-(s-aminocapramido)-(\pm)-nicotina-BSA,
para determinar los niveles de nicotina en sangre y orina, véase
Res. Commun Chem. Path. Pharm. 51,
393-404
(1986).
(1986).
Swain et al. (documento WO 98/14216)
describen conjugados de nicotina-soporte donde el
hapteno está conjugado en la posición 1, 2, 4, 5, 6 o 1' de la
nicotina. Hieda et al. han demostrado que los animales
inmunizados con
6-(carboximetilureido)-(\pm)-nicotina, que se unió
a la hemocianina de lapa californiana, produjeron anticuerpos
específicos contra la nicotina. J. Pharm. and Exper. Thera.
283, 1076-1081 (1997). Langone et al.
prepararon el derivado de hapteno
O-succinil-3'-hidroximetil-nicotina,
véase Biochemistry, 12, 5025-5030, y usaron
los anticuerpos contra este conjugado de
hapteno-soporte en radioinmunoensayos. Véase
Methods in Enzymology, 84, 628-635 (1982).
El conjugado producido por Langone es susceptible de hidrólisis.
Además, Abad et al. en Anal. Chem., 65,
3227-3231 (1993) describen la conjugación de
hemisuccinato de 3'-(hidroximetil)nicotina con albúmina de
suero bovino para producir anticuerpos contra la nicotina para
poder medir el contenido de nicotina en un condensado de
cigarrillos en un ensayo ELISA.
Por lo tanto, la técnica anterior no enseña un
conjugado de nicotina-soporte estable que conserve
la naturaleza quiral del hapteno de nicotina, y que una el hapteno
al soporte de una manera que conserve la naturaleza del epítopo o
epítopos de la nicotina. Además la técnica no enseña o sugiere
métodos para prevenir y tratar la adicción a la nicotina por medio
del uso de tales conjugados. Seeman, en Heterocycles, 22,
165-193 (1984), describe los resultados de un
estudio del análisis conformacional y la reactividad química de la
nicotina.
En respuesta a la demanda de una metodología más
eficaz para tratar la adicción a la nicotina, un objeto de la
presente invención es proporcionar nuevos conjugados de
nicotina-soporte que sean estables, comprendan
nicotina en su formación natural (S)-(-) y empleen un enlace de
nicotina-soporte que conserve la naturaleza del
epítopo o epítopos de la nicotina, y la orientación relativa de los
dos anillos de la molécula de nicotina. Los dos anillos de nicotina
y su orientación relativa se consideran esenciales para el
reconocimiento por parte de los anticuerpos de la nicotina en
solución. Tales conjugados pueden estimular la producción de
anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a la
nicotina. Usando los conjugados de la invención, los inventores han
elevado los niveles de nicotina en suero y han reducido los niveles
de nicotina en el cerebro en mamíferos. Además, usando los
conjugados de la invención, los inventores también han prevenido los
cambios inducidos por la nicotina en la presión sanguínea, y los
efectos locomotores.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para tratar la adicción a la nicotina por
medio de la administración de un conjugado de la invención a un
paciente con adicción a la nicotina generando de esta manera
anticuerpos contra la nicotina en ese paciente. De esta manera,
cuando el paciente fuma (o usa tabaco masticable), la nicotina de
estos productos se unirá a los anticuerpos
anti-nicotina presentes en la sangre, impidiendo que
la nicotina atraviese la barrera hematoencefálica y eliminando de
esta manera las alteraciones inducidas por la nicotina en la
química cerebral, que es la fuente de adicción a la nicotina. A este
respecto, es importante que el conjugado de
nicotina-soporte induzca la producción de
anticuerpos que reconozcan la molécula nativa de nicotina. Como se
ha descrito anteriormente, los nuevos conjugados de
nicotina-soporte de la invención conservan la
quiralidad y el epítopo o epítopos de la nicotina natural.
Los inventores no pretenden limitarse por ninguna
teoría particular sobre cómo los conjugados de nicotina y los
anticuerpos producidos en respuesta a tales conjugados inhiben los
efectos de la nicotina ingerida por los mamíferos. Además de
impedir que la nicotina atraviese la barrera hematoencefálica, los
anticuerpos también pueden prevenir que la nicotina se una a otros
receptores presentes en el sistema nervioso periférico por medio de
un simple bloqueo estérico.
Estos objetos pueden conseguirse proporcionando
un conjugado de hapteno-soporte de fórmula (I):
en la que m es de 1 a 2500, n es de
0 a 12, y es de 1 a 12, X se selecciona entre el grupo compuesto
por NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S; Y se selecciona entre el grupo compuesto por
NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S, y el resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y
está unido a la posición 3', 4' o 5'. En una realización preferida
del conjugado de hapteno-soporte, m es de 11 a 17,
n es 1, y es 2, X es NH-CO, Y es
CO-NH, la proteína de soporte es exoproteína A y el
resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y
está unido a la posición 3'. En otra realización preferida del
conjugado de hapteno-soporte, m es de 11 a 17, n es
1, y es 2, X es NH-CO, Y es CO-NH,
la proteína de soporte es exoproteína A y el resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y
está unido a la posición 4'. En una realización preferida adicional
del conjugado de hapteno-soporte, m es de 11 a 17,
n es 1, y es 2, X es NH-CO, Y es
CO-NH, la proteína de soporte es exoproteína A y el
resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y
está unido a la posición 5'. En otra realización preferida, m se
selecciona entre el grupo compuesto por 1 a 20 y 1 a
200.
Los objetos anteriores también se consiguen
proporcionando un conjugado de hapteno-soporte de
fórmula (III):
en la que n es de 0 a 12, j es de 1
a 1000, k es de 1 a 20 y E es una matriz que contiene aminoácidos.
En una realización preferida, la matriz es poli-ácido
L-glutámico.
Los objetos también pueden conseguirse
proporcionando un anticuerpo que se produce en respuesta al
conjugado de hapteno-soporte de fórmula (I). En una
realización adicional, el anticuerpo es un fragmento funcional. En
una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal. En otra realización de la invención, el anticuerpo es
policlonal.
Los objetos también pueden conseguirse
proporcionando un anticuerpo que se produce en respuesta al
conjugado de hapteno-soporte de fórmula (III). En
una realización adicional, el anticuerpo es un fragmento funcional.
En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal. En otra realización de la invención, el anticuerpo es
policlonal.
Los objetos pueden conseguirse proporcionando un
método para tratar o prevenir la adicción a la nicotina en un
paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende administrar
una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de
hapteno-soporte de fórmula (I) o (III). Como
alternativa, los objetos pueden conseguirse proporcionando un método
para tratar o prevenir la adicción a la nicotina en un paciente en
necesidad de tal tratamiento, que comprende administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo inducido en
respuesta a los conjugados de hapteno-soporte de
fórmula (I) o (III).
Además, los objetos pueden conseguirse
proporcionando una composición de vacuna que comprende el conjugado
de hapteno-soporte de fórmula (I) o de fórmula
(III). Además, la vacuna puede comprender además un compuesto
terapéutico adicional para tratar la adicción a la nicotina.
Los objetos también pueden conseguirse
proporcionando un proceso para producir un anticuerpo, que
comprende inmunizar a un mamífero hospedador con un conjugado de
hapteno-soporte de fórmula (I) o (III). En una
realización preferida, el anticuerpo producido es un anticuerpo
monoclonal. En una realización adicional, el anticuerpo es
policlonal.
Pueden conseguirse otros objetos proporcionando
un kit para determinar la presencia de nicotina en una muestra, que
comprende un anticuerpo inducido en respuesta al conjugado de
hapteno-soporte de fórmula (I) o de fórmula
(III).
Por la invención descrita más adelante en la
descripción detallada y en las reivindicaciones adjuntas se han
conseguido estos objetos y otros evidentes para los especialistas
en la técnica.
La figura 1 es un diagrama que muestra el efecto
de la inmunización activa con una vacuna conjugada
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los niveles
de nicotina en suero sanguíneo en ratas, después de una sola
inyección de nicotina. Se muestran los niveles de nicotina en suero
3 y 10 minutos después de la inyección de la nicotina.
La figura 2 muestra el efecto de la inmunización
pasiva con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los niveles
de nicotina en sangre y cerebro de ratas. Las ratas se trataron con
12,5, 25 y 50 mg de anticuerpo.
La figura 3 muestra los efectos de la
inmunización pasiva con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los niveles
de nicotina en suero sanguíneo y en cerebro en ratas. Los niveles
de nicotina se midieron 30 minutos y 1 día después de la
administración de los anticuerpos y 3 minutos después de la
inyección de nicotina.
La figura 4 muestra el efecto de la inmunización
pasiva con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los niveles
de nicotina en suero sanguíneo, en ratas que recibieron múltiples
dosis de nicotina.
La figura 5 muestra los efectos de la
inmunización pasiva con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los niveles
de nicotina en cerebro de rata, en ratas que recibieron múltiples
dosis de nicotina.
La figura 6 muestra los efectos de la
inmunización pasiva con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre los efectos
locomotores inducidos por la nicotina en ratas.
La figura 7 muestra los efectos de la
inmunización pasiva, con anticuerpos contra
3'AMNic-Suc-rEPA, sobre el aumento
inducido por nicotina en la presión sanguínea sistólica. La figura
demuestra que al aumentar las cantidades de anticuerpo aumenta la
eficacia de los anticuerpos en la reducción del aumento de la
presión sanguínea inducido por la nicotina.
La presente invención proporciona un conjugado de
hapteno de nicotina-soporte para tratar la adicción
a la nicotina. El conjugado de hapteno de
nicotina-soporte tiene la fórmula (I):
en la que m es de 1 a 2.500, n es
de 0 a 12, y es de 1 a 12, X se selecciona entre el grupo compuesto
por NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S; Y se selecciona entre el grupo compuesto por
NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S; y la proteína de soporte es cualquier proteína
o polipéptido inmunogénico adecuado. Preferiblemente, la proteína
de soporte puede comprender un epítopo de células T, y el resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y
está unido a la posición 3', 4' o 5' de la molécula de
nicotina.
nicotina.
En la fórmula (I), m es preferiblemente de 1 a
200. En otra realización preferida, m es de 1 a 20. En una
realización particularmente preferida, m es de 11 a 17. En otra
realización preferida, X se selecciona entre el grupo compuesto por
NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH y
CO-NH-NH-CO.
Si m es mayor que 1, el resto incluido entre
paréntesis se une m veces a diferentes puntos de unión en la
proteína de soporte. Por ejemplo, si m = 2, entonces la fórmula (I)
sería:
como no pueden inducirse
anticuerpos en respuesta a la propia nicotina, los presentes
inventores han creado un hapteno de nicotina que está modificado en
la posición 3', 4' o 5' de la nicotina. Este resto se une a una
proteína de soporte para producir un conjugado de
hapteno-soporte que inducirá anticuerpos contra el
resto de nicotina, cuando se inyecte en un mamífero hospedador
adecuado. A este respecto, para que una composición farmacéutica
que comprende el conjugado de hapteno-soporte
induzca la producción de anticuerpos cuando se administra a un
mamífero, la proteína de soporte debe ser inmunogénica.
Preferiblemente, comprenderá un epítopo de células T. De esta
manera, cuando la proteína de soporte se conjugue con el hapteno de
nicotina y posteriormente se administre a un mamífero, el mamífero
producirá o "inducirá" anticuerpos en respuesta al hapteno de
la
nicotina.
El término "hapteno", como se usa en la
presente invención, se refiere a un compuesto orgánico de bajo peso
molecular que no puede inducir una respuesta inmune por sí mismo,
pero inducirá una respuesta inmune una vez unido a una molécula de
soporte. En una realización preferida, el hapteno se une al soporte
a través de un enlazador. Un hapteno de la presente invención es un
derivado de nicotina. Este hapteno de nicotina contiene un grupo
funcional activo al que el soporte puede añadirse directamente, a
través de un enlazador, a través de una matriz, o a través de un
enlazador y una matriz. Preferiblemente, el hapteno de nicotina se
une a la proteína de soporte a través de un enlace amida o
disulfuro. Los enlaces amida y disulfuro tienen la propiedad
deseable de la estabilidad. Como los conjugados de
hapteno-soporte de la invención se usarán como
vacunas, es importante que los conjugados sean estables para
prolongar la vida media de la vacuna.
En una realización preferida de la presente
invención, el hapteno de nicotina se representa por la fórmula
(II):
en la que n es de 0 a 12 y Z es
NH_{2}, COOH, CHO o SH y
-(CH_{2})_{n}-Z puede unirse a la
posición 3', 4' o 5'. El resto Z puede unirse a un soporte
directamente o a través de un enlazador. El conjugado de
soporte-hapteno inducirá la producción de
anticuerpos tras su introducción en el cuerpo de un paciente o un
animal.
En una realización particularmente preferida, el
hapteno de nicotina tiene la siguiente fórmula
(3'-aminometil nicotina):
Para obtener un "conjugado directo", se une
directamente un solo hapteno de nicotina a un soporte, con o sin un
enlazador. Por ejemplo, un solo hapteno de nicotina puede unirse a
cada grupo amino disponible del soporte. G.T. Hermanson en
Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) y Dick y
Beurret en Conjugate Vaccines, Contribu. Microbiol. Immunol.,
Karger, Basal (1989) vol. 10, 48-114, por ejemplo,
describen métodos generales para conjugar directamente haptenos a
proteínas de soporte usando un agente de entrecruzamiento
homobifuncional o heterobifuncional. Con la conjugación directa
usando agentes de entrecruzamiento bifuncionales, la relación molar
entre el hapteno y la proteína está limitada por el número de
grupos funcionales disponibles en la proteína para la química de
conjugación específica. Por ejemplo, con una proteína de soporte que
posee un número n de restos de lisina, habrá teóricamente n
+ 1 aminas primarias (incluyendo el amino terminal) disponibles
para la reacción con el grupo carboxílico del enlazador. De esta
manera, usando este procedimiento de conjugación directa, el
producto se limitará a tener n + 1 enlaces amido formados, es
decir, un máximo de n + 1 haptenos unidos.
El especialista en la técnica reconocerá que
dependiendo de la concentración de los reactivos usados para
conjugar el hapteno de nicotina a la proteína de soporte y la
naturaleza de la proteína de soporte, variará la relación entre el
hapteno y el soporte. Además, dentro de una preparación dada de
conjugado de nicotina-soporte, habrá una variación
en la relación de hapteno/soporte de cada conjugado individual. Por
ejemplo, la exoproteína A tiene, en teoría, 15 aminas disponibles
para la conjugación con el hapteno. Sin embargo, los inventores
determinaron que cuando se conjugaba
3'aminometil-succinil-nicotina con
esta proteína, se unían una serie de 11-17 haptenos
de nicotina a cada soporte de exoproteína A, en una sola
preparación de conjugado. Esta serie se determinó experimentalmente
usando cromatografía de filtración en gas y midiendo el aumento de
absorbancia UV a 260 nm. A algunos soportes se unieron 17 nicotinas
porque el hapteno de nicotina puede unirse a restos no amina del
soporte. Los ejemplos de restos no amina a los que se puede unir el
hapteno incluyen, pero sin limitación, restos -SH y -OH. Sin
embargo, la incidencia de estas reacciones secundarias es baja.
Para superar las limitaciones sobre el número de
haptenos que pueden unirse al soporte usando conjugación directa,
puede usarse una "matriz" de aminoácidos. El término
"matriz" se refiere a un aminoácido, un péptido, dipéptido o un
polipéptido, incluyendo polipéptidos oligoméricos y poliméricos.
Una matriz también puede ser un polipéptido lineal o ramificado. Los
ejemplos de aminoácidos que pueden usarse para formar una matriz
incluyen, pero sin limitación, ácido aspártico, lisina, cisteína y
ácido L-glutámico. Tales materiales de matriz
pueden formularse en polímeros, tales como poli-ácido
L-glutámico. Cuando se usa un aminoácido tal como
cisteína, el grupo tiol se protege, permitiendo de esta manera que
el hapteno se una al grupo carboxílico del aminoácido. Un
especialista en la técnica estará bien familiarizado con los tipos
de grupos protectores y las formas de unir los grupos protectores a
funcionalidades de aminoácido. Como discusión, véase Green,
PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, John Wiley & Sons, New
York, 1991.
Una matriz adecuada posee un grupo funcional
apropiado y se carga con dos o más haptenos. De esta manera, en
otra realización preferida de la invención, la matriz substituida
con nicotina se conjuga con la proteína de soporte para aumentar la
relación molar entre hapteno y soporte en el conjugado de
hapteno-soporte. La matriz juega un doble papel, en
primer lugar como soporte para un gran número de haptenos y, en
segundo lugar, como un agente de entrecruzamiento. La matriz
substituida con nicotina conjugada con una proteína de soporte se
representa por la fórmula (III):
en la que n es de 0 a 12, j es de 1
a 1000, k es de 1 a 20, E es una matriz que contiene aminoácidos a
la que puede unirse un hapteno, y la proteína de soporte es
cualquier proteína o polipéptido adecuado que comprenda un epítopo
de células T. La matriz E que contiene aminoácidos puede ser un
aminoácido, un péptido, dipéptido o un polipéptido, incluyendo
polipéptidos oligoméricos así como poliméricos. La matriz comprende
uno o más aminoácidos que incluyen, pero sin limitación, ácido
aspártico, lisina, cisteína y poli-ácido
L-glutámico. En una realización preferida j es de 1
a 200 y, en otra realización preferida, j es de 1 a
4.
Los conjugados de matriz-soporte
pueden formar "redes" multiméricas. Tal red se representa en
la figura mostrada a continuación. El término "red" se usa para
hacer referencia a un complejo unido covalentemente, que comprende
múltiples matrices, haptenos, enlazadores y proteínas de soporte,
estando todos ellos unidos covalentemente entre sí. Como la matriz
substituida con nicotina comprende múltiples restos de nicotina
disponibles para la conjugación con el soporte, puede formarse una
red que comprende múltiples soportes y múltiples matrices
substituidas con nicotina. Una representación simplificada de una
porción de tal red se representa como se muestra a continuación:
El especialista en la técnica reconocerá que una
red de acuerdo con la invención comprende un conjugado de
hapteno-soporte de fórmula (III).
Este método de conjugación que emplea una matriz
ofrece flexibilidad yy control sobre las relacione molares entre
hapteno y proteína independientemente del número de grupos
funcionales disponibles para la conjugación en la proteína. Esto es
particularmente útil cuando se ha usado una proteína de soporte
específica y cuando necesita obtenerse una relación óptima para
conseguir una mayor inmunogenicidad del conjugado. Aunque no es
necesario usar un enlazador cuando se usa una matriz, puede usarse
tal enlazador. Para usar un enlazador con esta realización, la
matriz substituida con nicotina se hacer reaccionar con un
compuesto enlazador activo. Por ejemplo, como enlazador con los
conjugados de matriz puede usarse ADH, dihidrazida de ácido
adípico.
Una vez que se ha preparado el hapteno de
nicotina, después se conjuga con una proteína de soporte que se
usará para inducir anticuerpos contra el conjugado de soporte de
nicotina. La proteína de soporte usada en el presente conjugado de
nicotina-soporte de la invención se representa
por:
en la fórmula (I) y (III) e incluye
cualquier proteína o polipéptido inmunogénico adecuado. Una
molécula "inmunogénica" es una que puede inducir una respuesta
inmune. Preferiblemente, la proteína de soporte comprenderá un
epítopo de células T. También se incluye por la representación de
una "proteína de soporte" MAP o péptidos
multi-antigénicos, que son péptidos ramificados. Por
medio del uso de un MAP, se maximiza la densidad de los haptenos y
la valencia debido a múltiples restos de aminoácido ramificados.
Los ejemplos de aminoácidos que pueden usarse para formar un MAP
incluyen, pero sin limitación,
lisina.
Una proteína de soporte de la presente invención
comprende una molécula que contiene al menos un epítopo de célula T
que puede estimular las células T del sujeto, y que posteriormente
induce a las células B para que produzcan anticuerpos contra la
molécula de conjugado hapteno-soporte entera. El
término "epítopo", como se usa para describir esta invención,
incluye cualquier determinante sobre un antígeno que sea
responsable de su interacción específica con una molécula de
anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente constan de
agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales
como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen
características estructurales tridimensionales específicas así como
características de carga específicas. Se cree que para tener
propiedades inmunogénicas, una proteína o polipéptido debe ser capaz
de estimular a las células T. Sin embargo, es posible que una
proteína de soporte que carece de un epítopo de células T también
sea inmunogénica.
Por medio de la selección de una proteína de
soporte que se sabe que induce una respuesta inmunogénica fuerte,
puede tratarse una población diversa de pacientes con los
conjugados de hapteno-soporte de la invención. La
proteína de soporte debe ser suficientemente extraña como para
inducir una respuesta inmune fuerte a la vacuna. Típicamente, la
proteína de soporte usada preferiblemente es una molécula grande
capaz de impartir inmunogenicidad a un hapteno unido
covalentemente. Una proteína de soporte particularmente preferida es
una que es intrínsecamente muy inmunogénica. De esta manera, es muy
deseable una proteína de soporte que tiene un alto grado de
inmunogenicidad y puede maximizar la producción de anticuerpos
contra el hapteno.
En el desarrollo de vacunas conjugadas, cuando se
experimenta con animales, se han usado tanto albúmina de suero
bovino (BSA) como hemocianina de lapa californiana (KLH). Sin
embargo, estas proteínas pueden no ser adecuadas para uso en seres
humanos. Las proteínas que se han usado en la preparación de
vacunas conjugadas terapéuticas incluyen, pero sin limitación,
varias toxinas de bacterias patógenas y sus toxoides. Los ejemplos
incluyen la toxina diftérica y tetánica y sus toxoides
correspondientes médicamente aceptables. Otros candidatos son
proteínas antigénicamente similares a las toxinas bacterianas
denominados materiales de reacción cruzada (CRM).
En la preparación de composiciones farmacéuticas
de conjugados de nicotina puede usarse la exoproteína A
recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) como proteína
de soporte porque su estructura y sus actividades biológicas están
bien caracterizadas. Además, esta proteína recombinante se ha usado
satisfactoriamente y de forma segura en seres humanos en las
vacunas de conjugados de polisacárido capsular de Staphylococcus
aureus por los institutos nacionales de la salud y por los
presentes inventores. Fattom et al., Infect Immun. 61
1023-1032 (1993). Esta proteína se ha identificado
como un soporte proteico adecuado porque la actividad enzimática
intrínseca de la exotoxina activa se ha eliminado debido a una
deleción de aminoácidos en la posición 553. Como resultado, rEPA
tiene el mismo perfil inmunológico que la exotoxina A nativa (ETA),
pero no posee las propiedades hepatotóxicas de la ETA nativa. Como
se usa en esta solicitud, "exoproteína A" se refiere a una ETA
modificada no hepatotóxica. Un ejemplo de tal exoproteína A tiene
una deleción de aminoácidos en la posición 553.
Hay un gran número de grupos funcionales que
pueden usarse para facilitar la unión o conjugación de un soporte a
una molécula pequeña, tal como un hapteno. Éstos incluyen restos
funcionales tales como ácidos carboxílicos, anhídridos, anhídridos
mixtos, haluros de acilo, azidas de acilo, haluros de alquilo,
N-maleimidas, imino ésteres, isocianatos, aminas,
tioles, e isotiocianatos y otros conocidos para los especialistas
en la técnica. Estos restos pueden formar un enlace covalente con
un grupo reactivo de una molécula de proteína. Dependiendo del resto
funcional usado, el grupo reactivo puede ser el grupo e amino de un
resto de lisina o un grupo tiol de una proteína de soporte o una
molécula de proteína de soporte modificada, que, cuando se hace
reaccionar, tiene como resultado la formación de un enlace amida,
amina, tioéter, amidina urea o tiourea. Un especialista en la
técnica reconocerá que pueden usarse otros grupos activadores
adecuados y otras técnicas de conjugación. Véase, por ejemplo,
Wong, Chemistry of Protein Conjugation and
Cross-Linking, CRC Press, Inc. (1991). Véase
también Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press: 1996 y
Dick y Beurret en Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol.
Immunol., Karger, Basal (1989) vol 10, 48-114.
Se prefieren los restos de enlazadores lineales
sobre los enlazadores cíclicos o ramificados, para la conjugación
de haptenos a proteínas de soporte. Un enlazador preferido es un
resto succinilo. Sin embargo, un enlazador puede ser una estructura
cíclica así como un resto lineal. Otro ejemplo de un enlazador es
ADH.
De esta manera, los conjugados de hapteno de
nicotina-soporte de la presente invención se
preparan haciendo reaccionar uno o más haptenos con una proteína de
soporte para producir un conjugado de
hapteno-soporte que sea capaz de estimular a las
células T, llevar a la proliferación de células T y liberar
mediadores que activen a células B específicas para estimular la
producción de anticuerpos en respuesta al conjugado de
hapteno-soporte inmunogénico. Ciertos anticuerpos
inducidos en respuesta al conjugado de
hapteno-soporte serán específicos para la porción
de hapteno del conjugado de hapteno-soporte. La
presente invención contempla el uso de diversas combinaciones
adecuadas de haptenos con proteínas de soporte para uso en el
tratamiento de la adicción a la nicotina.
Las técnicas para obtener anticuerpos
monoclonales son bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos
monoclonales pueden obtenerse inyectando en ratones una composición
que comprende el conjugado de hapteno de
nicotina-soporte, posteriormente verificando la
presencia de la producción de anticuerpos extrayendo una muestra de
suero, retirando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los
linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas,
clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que
producen anticuerpos contra el conjugado de
hapteno-soporte, cultivando los clones que producen
anticuerpos contra el antígeno, y aislando los anticuerpos a partir
de los cultivos de hibridoma.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y
purificarse a partir de cultivos de hibridoma por una diversidad de
técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen
cromatografía de afinidad con Proteína A Sepharose, cromatografía
de exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico. Véase,
por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y
en las páginas 2.9.1-2.9.3. Véase también, Baines
et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas
79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
En la técnica también se conocen bien técnicas
para preparar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos
policlonales se preparan de acuerdo con técnicas convencionales
conocidas en la técnica. Para preparar un anticuerpo policlonal, en
un animal se inyecta el material inmunogénico y se recoge suero rico
en anticuerpos que contiene una mezcla de anticuerpos que se dirigen
contra numerosos epítopos del inmunógeno que se inyectó. Los
mamíferos hospedadores adecuados para la producción de anticuerpos
incluyen, pero sin limitación, seres humanos, ratas, ratones,
conejos y cabras.
De acuerdo con la presente invención, también
pueden utilizarse fragmentos de anticuerpos funcionales. Los
fragmentos se producen por métodos que incluyen digestión con
enzimas tales como pepsina o papaína y/o escisión de enlaces
disulfuro por reducción química. Como alternativa, los fragmentos de
anticuerpo incluidos por la presente invención pueden sintetizarse
usando un sintetizador de péptidos automático tal como los
suministrados comercialmente por Applied Biosystems, Multiple
Peptide Systems y otros, o pueden producirse manualmente usando
técnicas bien conocidas en la técnica. Véase Geysen et al.,
J. Immunol. Methods 102: 259 (1978). La determinación directa
de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las
cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales de acuerdo
con la invención puede realizarse usando técnicas
convencionales.
Un fragmento de acuerdo con la presente invención
puede ser un fragmento Fv. Un fragmento Fv de un anticuerpo se
obtiene con la región variable de la cadena pesada (Vh) de un
anticuerpo y la región variable de la cadena ligera de un
anticuerpo (Vl). La escisión proteolítica de un anticuerpo puede
producir fragmentos Fv de doble cadena en los que las regiones Vh y
Vl permanecen asociadas de forma no covalente y retienen la
capacidad de unión a antígenos. Los fragmentos Fv también incluyen
moléculas de anticuerpo monocatenarias recombinantes en las que las
regiones variables de la cadena ligera y pesada están conectadas
por un enlazador peptídico. Véase Skerra et al. Science,
240, 1038-41 (1988). Los fragmentos de anticuerpo de
acuerdo con la invención también incluyen Fab, Fab',
F(ab)_{2} y F(ab')_{2}, que carecen del
fragmento Fc de un anticuerpo intacto.
Como la nicotina ejerce muchos de sus efectos
significativos después de atravesar la barrera hematoencefálica, la
presente invención incluye métodos terapéuticos que impiden que la
nicotina atraviese la barrera hematoencefálica. En particular, la
administración de un conjugado de hapteno de
nicotina-soporte a un paciente generará anticuerpos
contra la nicotina en la corriente sanguínea del paciente. Como
alternativa, a un paciente se le pueden administrar anticuerpos
anti-nicotina generados fuera del cuerpo del
paciente a tratar, en un mamífero hospedador adecuado. Si el
paciente fuma, la nicotina de su sangre se unirá a los anticuerpos
anti-nicotina circulantes, impidiendo que la
nicotina alcance el cerebro. Por lo tanto, los anticuerpos
impedirán los efectos fisiológicos y psicológicos de la nicotina
que se originan en el cerebro. Como el fumador experimentará una
reducción o cese de estos efectos, perderá el deseo de fumar. Se
esperan los mismos efectos terapéuticos si un paciente usa tabaco
que no se fuma, después de inmunizarse con un conjugado de hapteno
de nicotina-soporte de la invención. Además, los
conjugados y anticuerpos de la invención pueden ejercer sus efectos
afectando a la capacidad de la nicotina de estimular el sistema
nervioso periférico.
Como se ha descrito anteriormente, los nuevos
conjugados de nicotina-soporte de la invención
conservan la quiralidad nativa y la estructura de la molécula de
nicotina. En particular, el resto de nicotina de estos conjugados
tiene la configuración (S)-(-). Por lo tanto, los anticuerpos
producidos en respuesta a tal conjugado serán específicos para la
forma nativa de la nicotina, y serán los más eficaces para unirse
específicamente a la nicotina que se inhala desde el humo o se
absorbe del tabaco que no se fuma, y para la inhibición de los
efectos de esta nicotina ingerida. Además, los conjugados de la
invención son químicamente estables y la estabilidad es crítica
para producir una vacuna que tenga un largo periodo de validez.
La presente composición de vacuna puede usarse en
combinación con compuestos u otras terapias que sean útiles en el
tratamiento de la adicción. Esto incluye la administración de
compuestos que incluyen, pero sin limitación, fármacos
antidepresivos tales como Zyban y Prozac.
Los conjugados de la invención son adecuados para
tratar y prevenir la adicción a la nicotina. Para tratar la
adicción a la nicotina, un conjugado de
nicotina-soporte de la invención se administra a un
paciente que padece adicción a la nicotina. Para prevenir la
adicción a la nicotina, los pacientes con riesgo de desarrollar
adicción a la nicotina, tales como los adolescentes, se tratan con
un conjugado de acuerdo con la invención. La administración directa
del conjugado a un paciente se denomina "inmunización
activa".
Una composición de vacuna de la presente
invención comprende al menos un conjugado de hapteno de
nicotina-soporte en una cantidad suficiente para
inducir una respuesta inmune al mismo. El conjugado de hapteno de
nicotina-soporte puede permanecer in vivo a
una concentración suficiente como para ser activo contra el consumo
posterior de nicotina.
La vacunación inicial con el conjugado de hapteno
de nicotina-soporte de la presente invención crea
altas titulaciones de anticuerpos que son específicos para la
nicotina. El especialista en la técnica determinará fácilmente la
cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado que se administra a
un paciente en necesidad de tratamiento para la adicción a la
nicotina. Son intervalos de dosificación adecuados
1-1000 \mug/dosis. Generalmente, un paciente tarda
de una a varias semanas en generar anticuerpos contra un antígeno
extraño. La producción de anticuerpos en la sangre de un paciente
puede controlarse usando técnicas bien conocidas para el
especialista en la técnica tales como ELISA, radioinmunoensayo y
métodos de transferencia de Western. La eficacia terapéutica
también puede controlarse evaluando diversos efectos físicos de la
nicotina tales como la presión sanguínea.
Como se describe con detalle más adelante, los
conjugados de hapteno de nicotina-soporte de la
invención pueden procesarse para producir una composición que pueda
administrarse fácilmente a un paciente. Los modos de administración
preferidos incluyen, pero sin limitación, inyección intranasal,
intratraqueal, oral, dérmica, transmucosa o subcutánea e inyección
intravenosa. El especialista en la técnica reconocerá que la
inyección inicial puede seguirse por la administración posterior de
uno o más "refuerzos" del conjugado. Tal refuerzo aumentará la
producción de anticuerpos contra el conjugado de hapteno de
nicotina-soporte de la invención.
Las composiciones de vacuna de la presente
invención pueden contener al menos un adyuvante. El adyuvante usado
en la presente invención se seleccionará de forma que el efecto de
la proteína de soporte no se inhiba. Los adyuvantes usados en la
presente invención son los que son fisiológicamente aceptables para
seres humanos, incluyendo éstos, pero sin limitación, alumbre,
QS-21, saponina y MPLA (monofosforil lípido A).
Las composiciones de vacuna de la presente
invención opcionalmente pueden contener uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables. Los excipientes útiles en la presente
invención incluyen agua estéril, soluciones de sales tales como
solución salina, fosfato sódico, cloruro sódico, alcohol, goma
arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicol,
gelatina, manitol, carbohidratos, estearato de magnesio, parafina
viscosa, ésteres de ácidos grasos, hidroximetil celulosa y
tampones. Por supuesto, en la presente invención es útil cualquier
excipiente adicional conocido por el especialista en la
técnica.
Los conjugados de hapteno-soporte
de la presente invención, para administrarse a un paciente en
necesidad de tratamiento o prevención de la adicción a la nicotina,
se incorporan en una composición farmacéutica. Cuando la composición
que contiene el conjugado de hapteno-soporte se va
a usar para inyección, es preferible solubilizar el conjugado de
hapteno-soporte en una solución salina acuosa a un
pH farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, es posible usar una
suspensión inyectable del conjugado de
hapteno-soporte. Además de los excipientes
farmacéuticamente aceptables habituales, la composición puede
contener componentes opcionales para asegurar la pureza, mejorar la
biodisponibilidad y/o aumentar la penetración.
Además, la composición de vacuna puede contener
opcionalmente al menos un agente auxiliar, tal como un medio de
dispersión, recubrimientos, microesferas, liposomas, microcápsulas,
lípidos, tensioactivos, lubricantes, conservantes y estabilizantes.
Por supuesto, en la presente invención será útil cualquier agente
auxiliar adicional conocido para el especialista en la técnica.
También son útiles en la presente invención los agentes que actúan
sinergizando el efecto de la presente composición de vacuna.
La composición farmacéutica de la presente
invención es estéril y es suficientemente estable como para
soportar el almacenamiento, distribución y uso. Además, la
composición puede contener otros componentes para proteger a la
composición de la infestación y del crecimiento de microorganismos.
Se prefiere que la composición se fabrique en forma de un polvo
liofilizado que se va a reconstituir con un diluyente
farmacéuticamente aceptable justo antes de la administración. Los
métodos para preparar soluciones inyectables estériles son bien
conocidos para los especialistas en la técnica e incluyen, pero sin
limitación, secado al vacío, liofilización y secado por
centrifugación. Estas técnicas producen un polvo del ingrediente
activo junto con cualquier excipiente adicional incorporado en la
premezcla.
La inmunización pasiva comprende la
administración o la exposición a un anticuerpo policlonal o
anticuerpo monoclonal que se ha inducido en respuesta a un
conjugado de hapteno de nicotina-soporte de la
invención. Tales anticuerpos pueden generarse en animales o en
seres humanos. Los anticuerpos inducidos en respuesta a un
conjugado de nicotina de la invención pueden administrarse para
prevenir la adicción a la nicotina. Por ejemplo, tales anticuerpos
pueden administrarse a personas consideradas con riesgo de
desarrollar adicción a la nicotina, tales como adolescentes. Los
anticuerpos también son adecuados para tratar a un paciente con
adicción a la nicotina. Como se ha descrito anteriormente, los
anticuerpos se unirán a la nicotina en la sangre y evitarán que la
nicotina atraviese la barrera hematoencefálica. Los anticuerpos
inducidos por medio de la administración del conjugado de hapteno de
la invención-soporte tienen un intervalo de pesos
moleculares de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente
1.000 kDa.
1.000 kDa.
La cantidad terapéuticamente eficaz de un
anticuerpo terapéutico de la invención que se administra a un
paciente en necesidad de tratamiento para la adicción a la nicotina
se determina fácilmente por el especialista en la técnica. Son
intervalos de dosificación adecuados de 1 a 1000 \mug/dosis.
Una composición terapéutica de la presente
invención comprende al menos un anticuerpo producido en respuesta a
un conjugado de nicotina-soporte de la invención.
Estas composiciones de la presente invención pueden contener
opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los excipientes útiles en la presente invención incluyen agua
estéril, soluciones de sales tales como solución salina, fosfato
sódico, cloruro sódico, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales,
alcoholes bencílicos, polietilenglicol, gelatina, manitol,
carbohidratos, estearato de magnesio, parafina viscosa, ésteres de
ácidos grasos, hidroximetil celulosa y tampones. Por supuesto, en la
presente invención es útil cualquier excipiente adicional conocido
por el especialista en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención, para
administrarse a un paciente en necesidad de tratamiento o
prevención de la adicción a la nicotina, se incorporan en una
composición farmacéutica. Cuando la composición que contiene un
anticuerpo se va a usar para inyección, es preferible tener el
anticuerpo en una solución acuosa salina a un pH farmacéuticamente
aceptable. Sin embargo, es posible usar una suspensión inyectable
del anticuerpo. Además de los excipientes farmacéuticamente
aceptables habituales, la composición puede contener componentes
opcionales para asegurar la pureza, mejorar la biodisponibilidad y/o
aumentar la penetración.
Una composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo de la presente invención es estéril y es suficientemente
estable como para soportar el almacenamiento, distribución y uso.
Además, la composición puede contener otros componentes para
proteger a la composición de la infestación y el crecimiento de
microorganismos. Los métodos para preparar soluciones inyectables
estériles son bien conocidos para el especialista en la técnica e
incluyen, pero sin limitación, secado al vacío, liofilización y
secado por centrifugación. Estas técnicas producen un polvo del
ingrediente activo junto con cualquier excipiente adicional
incorporado en la premezcla.
Los anticuerpos de la presente invención también
son útiles para preparar un kit que puede usarse para detectar y
cuantificar los niveles de nicotina en una muestra. Un kit de
acuerdo con la invención comprende un anticuerpo específico de
nicotina de acuerdo con la invención, en un recipiente adecuado.
Para un radioinmunoensayo, el kit también puede contener nicotina
marcada. La nicotina presente en una muestra se detecta uniendo la
nicotina marcada al anticuerpo y después observando la competencia
de la nicotina marcada del anticuerpo con la muestra a ensayar. Un
Kit ELISA también comprendería un anticuerpo de acuerdo con la
invención. El ELISA puede implicar la inhibición de la unión del
anticuerpo con cantidades conocidas de nicotina en comparación con
la inhibición con una muestra que se sospecha que contiene
nicotina. Esto permitiría determinar la nicotina desconocida en una
muestra, por comparación de la muestra con la curva patrón de
inhibición de concentraciones de nicotina conocidas. En otro tipo de
ELISA, una muestra que se sospecha que contiene nicotina se incuba
con una placa de microtitulación que se ha recubierto con una
substancia que se unirá a la nicotina. Se añaden los anticuerpos de
la invención y a las placas se añaden anticuerpos
anti-anticuerpo unidos a enzimas. La adicción de un
substrato cuantifica la cantidad de nicotina unida a la placa.
Los siguientes ejemplos se proporcionan
simplemente para ilustrar la preparación y uso de la presente
invención. El alcance de la invención no se limita a los siguientes
ejemplos.
El material de partida para la síntesis del
hapteno
trans-4'-carboxi-(-)-cotinina,
disponible en fuentes comerciales. Una modificación del
procedimiento descrito por Cushman y Castagnoli, Jr (1972) J.
Org. Chem. 37(8):1268-1271 proporciona la
alcohol,
trans-3'-hidroximetil-(-)-nicotina,
después de la esterificación con metilo del ácido seguido de la
reducción del éster. El alcohol después se sulfona y el sulfonato
se desplaza con un grupo azido, que finalmente se reduce a una
amina.
4 g de
trans-4'-carboxi-(-)-cotinina
se disuelven en 50 ml de una solución de ácido sulfúrico 2 N en
metanol seco y se agitan durante una noche a temperatura ambiente.
La suspensión resultante se filtra a través de un papel de filtro
Whatman Nº 1 y se añade lentamente a 100 ml de una solución
saturada de bicarbonato sódico. El éster se extrae con diclorometano
para producir 4,2 g de un aceite rosa después de la evaporación del
disolvente.
Una solución de 3,9 g del éster en
tetrahidrofurano seco (100 ml) se añade gota a gota a una
suspensión de 4 equivalentes de hidruro de litio y aluminio en
tetrahidrofurano seco (70 ml) en una atmósfera de argón seco. La
suspensión se agita durante dos horas a temperatura ambiente. El
exceso de hidruro se destruye por la adición cuidadosa y controlada
de agua mientras se enfría en un baño de hielo. El precipitado
blanco resultante se retira por filtración y el filtrado se seca
sobre sulfato sódico y se concentra a presión reducida para
producir 2,7 g del alcohol en forma de un aceite amarillo.
El alcohol (1,9 g) se disuelve en 20 ml de
diclorometano. Después se añaden sucesivamente trietilamina (0,75
ml) y cloruro de p-toluenosulfonilo (1 g) a la solución. La
solución naranja se agita durante 24 horas a temperatura ambiente.
Se retira por filtración el clorhidrato de trietilamina precipitado
sobre un lecho de Celite y el filtrado se concentra a presión
reducida para dar un aceite pardo. El sulfonato se purifica en una
columna de cromatografía de sílice ultrarrápida eluida con metanol
al 5% en diclorometano para dar 2,1 g de un aceite amarillo.
El sulfonato (1,8 g) se desplaza usando azida
sódica (0,8 g) en 50 ml de dimetilformamida durante una hora a
80ºC. Después de la evaporación de la dimetilformamida a alto
vacío, el residuo se disuelve en diclorometano, se lava con agua y
salmuera y se seca sobre sulfato sódico. Después de la evaporación
del disolvente, se obtiene la azida (1,1 g) como un aceite
parduzco.
La adición de la azida en tetrahidrofurano seco
(20 ml) a una suspensión de hidruro de litio y aluminio en
tetrahidrofurano seco (50 ml) produjo rápidamente la amina deseada
como se controla por cromatografía de capa fina. Los espectros de
resonancia magnética nuclear de protón y carbono de la amina
purificada correspondieron a la estructura esperada.
La introducción de un brazo funcionalizado en la
posición 4' de la nicotina puede conseguirse por alquilación con
enolato de cotinina seguido de reducción del producto alquilado.
Pueden usarse diversos agentes alquilantes como una
3-bromo-propilamina protegida de
manera apropiada. Como ejemplos, pueden usarse
3-bromo-N-carbobenciloxi-progilamina
o N-(3-bromopropil)-ftalamida. El
grupo protector de amina tendrá que retirarse después de la
alquilación y reducción y antes de la conjugación con una proteína
de soporte. La alquilación con enolato de lactamas cíclicas (que
contienen el anillo de pirrolidinona) está bien documentada en la
bibliografía (Véase G. Helmchen et al. (1995) Steroselective
Synthesis en Houben-Weyl-Methods
of Organic Chemistry, Vol E21a, 762-881,
Thieme, Stuttgart, Germany, como revisión general, y A.J. Meyers
et al. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119,
4562-4566, para las consideraciones estéricas de la
reacción. También hay algunos ejemplos de alquilación con enolato
de la propia cotinina (N.-H. Lin et al. (1994) J. Med.
Chem., 37, 3542-3553). Se consiguió una
preparación interesante de
4'-acetil-nicotina, como una mezcla
1:1 de dos epímeros, usando una reacción de ciclación en tándem
redisposición de Cope aza catiónica-Mannich a partir
de una cetona o un aldehído y una
2-alcoxi-3-alquenamina
(L.E. Overman (1983) J. Am. Chem. Soc., 105,
6622-6629). Esta reacción puede extenderse para
producir 4'-aldehído-nicotina,
adecuada para la conjugación.
Se suspendió bromhidrato de
3-bromo-propilamina (4,2 g) en 50 ml
de diclorometano y se añadió trietilamina (aproximadamente 7 ml)
hasta que se obtuvo una solución transparente. La solución se
enfrió a 0ºC y se añadió gota a gota cloroformiato de bencilo (2,5
ml). Se dejó que la reacción continuara a temperatura ambiente
durante 16 h con agitación. Las sales precipitadas se retiraron por
filtración y la capa orgánica transparente se lavó con agua fría,
HCl 1 N frío y agua fría, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó
a presión reducida hasta que se obtuvo un aceite amarillo (2,93 g
de material bruto).
Se co-evaporaron por separado
cotinina (62 mg) y
3-bromo-N-carbobenciloxi-propilamina
(100 mg) con tolueno seco. La cotinina se disolvió en 5 ml de
tetrahidrofurano anhidro recién destilado, se añadieron 60 \mul
de N,N,N',N'-tetrametilendiamina (TMEDA) y la
solución se enfrió a -78ºC por inmersión en un baño de
etanol-hielo seco. La solución de cotinina se
añadió gota a gota a una solución de diisopropilamida de litio (LDA,
200 \mul de una solución 2 M en
heptano-tetrahidrofurano) en tetrahidrofurano,
previamente enfriado a -78ºC. La mezcla de color naranja se agitó
durante 15 minutos a -78ºC y después se dejó calentar en un baño de
hielo (de 2 a 6ºC). La reacción después se enfrió de nuevo a -78ºC
y se añadió
3-bromo-N-carbobenciloxi-propilamina
disuelta en tetrahidrofurano anhidro gota a gota durante 15
minutos. La mezcla de reacción se dejó calentar a -10ºC y después
se inactivó con metanol. El producto de reacción se purificó por
cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice. La
reducción de la amida de este derivado de cotinina se consiguió con
borano seguido de fluoruro de cesio en etanol caliente. La amina
final se obtuvo después de la eliminación del grupo carbobenciloxi
en condiciones ácidas.
La introducción de un brazo funcionalizado en la
posición 5' de la nicotina puede conseguirse haciendo reaccionar
compuestos de alquil litio protegidos de manera apropiada con
cotinina, seguido de reducción con cianoborohidruro sódico, en
procedimientos similares a los descritos por Shibagaki et al.
(1986) Heterocycles, 24, 423-428 y N.-H. Lin
et al. (1994) supra.
Se unió exoproteína A recombinante (rEPA) al
hapteno de nicotina derivatizado por medio de un brazo de ácido
succínico. Las 15 lisinas de rEPA se succinilaron fácilmente con
anhídrido succínico. Después, en una reacción de conjugación
típica, se preparó una solución de 5 a 10 mg/ml de la exoproteína A
recombinante succinilada (Suc-rEPA) en un tampón de
ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)
0,05 M que contenía NaCl 0,15 M a pH 6,0. Se añadió un peso igual de
hapteno de
3'-aminometil-(-)-nicotina (3'AMNic)
disuelto en una cantidad mínima de agua destilada a la solución de
proteína. El pH de la solución de hapteno se ajustó a 6,0 con HCl
0,1 N antes de la adición. Finalmente, se añadió un peso igual de
clorhidrato de
1-etil-3-(3-dietilamino)propil
carbodiimida (EDC) a la mezcla de hapteno-proteína
y la reacción se dejó continuar durante 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación. El conjugado de nicotina obtenido de esta
manera se purificó en una columna de Sephadex G-25
eluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Las
recuperaciones del conjugado estuvieron en el intervalo del 80 al
90%.
Este ejemplo describe la síntesis de un conjugado
de hapteno-soporte que comprende
3'-aminometil-(-)-nicotina como
hapteno derivatizado, exoproteína A recombinante (rEPA) como
proteína de soporte, dihidrazida de ácido adípico (ADH) como
enlazador y poli-ácido L-glutámico como
"matriz" o soporte polimérico para los haptenos.
En este ejemplo se usó un poli-ácido
L-glutámico que tenía un peso molecular medio de
39.900 con una polidispersidad de 1,15 y un grado de polimerización
de 264. Las cantidades de reacción del hapteno y el polímero se
calcularon de forma que el grado deseado de substitución fuera de
aproximadamente un 80%. Es decir, cuando se alcanza una
substitución del 80%, se han conjugado aproximadamente 208 unidades
de hapteno, de un total de 264 unidades repetidas en una molécula
media del polímero de ácido glutámico.
El poli-ácido L-glutámico cargado
con nicotina tiene la siguiente fórmula:
Como se indica en la figura, el polímero de ácido
poliglutámico comprende aproximadamente 52 restos de glutamina.
Este número variará dependiendo del lote y de la fuente del resto
de poliaminoácido elegido para la matriz. Además, la figura indica
4 haptenos de nicotina por cada unidad repetida. Este número variará
dependiendo de la relación de reactivos usados cuando se conjugan la
matriz y el hapteno de nicotina.
Después de la conjugación con la nicotina
derivatizada, los grupos carboxílicos sin reaccionar
(aproximadamente 20%) se derivatizaron con ADH. Cuando esta matriz
se conjugó con un soporte, como se describe en el ejemplo 6, la
relación molar entre la matriz cargada con nicotina y la proteína
fue de 1:1. De esta manera, en este conjugado, la relación molar
teórica entre hapteno de nicotina y proteína sería de 200:1, al
finalizar la reacción de conjugación.
La relación real de substitución de nicotina en
el ácido poliglutámico se estimó usando análisis de RMN del
producto. La intensidad del pico de hidrógeno \alpha de ácido
glutámico con respecto a los 4 hidrógenos del anillo de piridina de
la nicotina da la proporción de nicotina incorporada. La relación
media estimada fue de 143:1 (nicotina/proteína de soporte).
Se disolvieron 10 mg de sal de ácido poli
L-glutámico (Sigma, Nº Cat P-4761)
en 2 ml de ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 0,05 M
que contenía NaCl 0,15 M a pH 6,0. Se disolvieron 10 mg de
3'-aminometil-(-)-nicotina en una
cantidad mínima de agua destilada y el pH de la solución se ajustó a
pH 6,0 con HCl 0,1 N. La solución de hapteno de nicotina se añadió
gota a gota a la solución de polipéptido mientras se agitaba y
posteriormente se ajustó a un pH de 6,0. Después, se añadieron 20
mg de clorhidrato de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) sólido en tres porciones a la mezcla de
hapteno-polipéptido durante un periodo de 20
minutos. La reacción se dejó continuar durante 1 hora a temperatura
ambiente. El producto de reacción (matriz substituida con nicotina)
se dializó frente a tres cambios de agua y se liofilizó. Se
obtuvieron 12 mg de ácido poliglutámico substituido con nicotina
como un material esponjoso de color blanco.
Se disolvieron 10 mg de ácido poliglutámico
substituido con nicotina en 2 ml de tampón MES a pH 6,0. Se
añadieron 8 mg de dihidrazida de ácido adípico (ADH) seguido de 10
mg de EDC a la solución mientras se agitaba. La reacción se dejó
continuar durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución
obtenida finalmente se dializó frente a tres cambios de tampón MES
a pH 6,0.
Se disolvieron 10 mg de exoproteína A
recombinante (rEPA) en 2 ml de tampón MES 0,05 M a pH 5,6 que
contenía NaCl 0,15. A la solución de proteína se le añadió un
volumen de solución de ácido poliglutámico substituido con nicotina
unido a ADH que se estimaba que contenía 7,5 mg de este material
derivatizado. A esta mezcla se le añadió EDC sólida en tres
porciones durante un periodo de 20 minutos mientras se agitaba a
temperatura ambiente. La reacción se dejó continuar a temperatura
ambiente durante una noche. El conjugado resultante finalmente se
purificó en una columna de Sephadex G-25 y se eluyó
con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Esto
produce una preparación purificada de conjugado, donde el conjugado
contiene solo la forma S-(-) de nicotina.
La vacuna conjugada purificada del ejemplo 4 se
analizó en una columna de cromatografía de exclusión molecular
Superose 12 y se eluyó con PBS a pH 7,4. Se calculó una relación
molar entre hapteno y proteína de 11 a 17 determinando el aumento
de la absorción UV a 260 nm después de la incorporación de nicotina,
con respecto a la absorción a 280 nm. Este intervalo se determinó
calculando la relación hapteno/proteína de soporte de seis lotes
preparados por separado de conjugado de hapteno/soporte (lote 1:
17,2, lote 2: 16,2, lote 3: 13,2, lote 4: 12,0, lote 5: 11,0, lote
6: 17,2). Un análisis adicional para determinar esta relación usando
espectrometría de masas MALDI-TOF proporcionó
esencialmente los mismos números que se obtuvieron por la
diferencia de absorbancia UV. La concentración de proteínas de la
vacuna conjugada se determinó usando un ensayo de BCA. Se realizó un
estudio de estabilidad del conjugado de
nicotina-soporte del ejemplo 4. El estudio usó la
vacuna introducida en viales de vidrio de 1 ml a una concentración
de 0,5 mg/ml y la estabilidad de la vacuna en viales se ensayó a
tres temperaturas diferentes: -70ºC, de 2 a 8ºC y a temperatura
ambiente.
El procedimiento de conjugación basado en la
formación de enlaces amida entre
hapteno-enlazador-soporte en lugar
de enlaces éster parecía beneficioso como se observó en el estudio
de estabilidad del conjugado durante 6 meses a -70ºC, a una
temperatura de 2 a 8ºC e incluso a temperatura ambiente. El estudio
de estabilidad constaba del control y ensayo de la vacuna de
conjugado usando lo siguiente:
- 1.)
- Observación visual para detectar cualquier partícula formada (turbidez, precipitación).
- 2.)
- Comprobación de cualquier cambio de pH significativo.
- 3)
- Perfil de cromatografía de exclusión molecular en combinación con absorción UV a 260 y 280 nm para determinar si cambiaba la relación de incorporación de nicotina.
- 4)
- Cromatografía de fase inversa para comprobar cualquier degradación de la proteína de soporte.
- 5)
- SDS PAGE con tinción con plata para observar cualquier escisión proteolítica de la proteína conjugada.
El procedimiento de conjugación basado en la
formación de un enlace amida entre el hapteno y el enlazador, así
como entre el enlazador y el soporte, parecía beneficioso como se
observó en el estudio de estabilidad del conjugado durante 6 meses
a -70ºC y a una temperatura de 2 a 8ºC.
Se usaron dos vacunas conjugadas de hapteno de
nicotina-soporte para inmunizar ratones, ratas y
conejos.
Se inmunizaron animales usando protocolos
convencionales. En ratones, se administraron tres inyecciones
subcutáneas de vacuna, dejando un periodo de dos semanas entre las
inyecciones, realizándose extracciones de sangre de ensayo una
semana después de la primera y segunda inyecciones y realizándose
una exanguinación una semana después de la tercera inyección. Las
muestras de suero se evaluaron en un ensayo ELISA descrito en el
ejemplo 10. El ensayo ELISA utilizó 3'AMNic-pGlu
unido a placas de microtitulación.
Se inmunizaron ratas por vía intraperitoneal con
las vacunas tres veces. Se administraron inyecciones espaciadas dos
semanas realizándose extracciones de sangre una semana después de
la primera y segunda inyecciones. Después, las ratas se
exanguinaron una semana después de la tercera inyección. Para la
primera inyección se usó adyuvante completo de Freund y para las
inyecciones posteriores adyuvante incompleto de Freund. Las
muestras de suero se evaluaron en un ensayo ELISA.
Se inmunizaron conejos por vía intramuscular tres
veces, dejando tres semanas entre las inyecciones, con 100 \mug
de vacuna. La inyección inicial contenía adyuvante de Freund,
conteniendo las inyecciones posteriores adyuvante incompleto de
Freund. Se extrajo sangre de los conejos una semana después de la
segunda y tercera inyecciones para asegurar las titulaciones
adecuadas para la producción de sangre. Si se había conseguido una
titulación adecuada, según se mide por el ELISA, los conejos
después se sometieron a un programa de producción de sangre semanal
(de 20 a 40 ml de suero por conejo). Se controlaron las
titulaciones de anticuerpo a lo largo del tiempo y los animales se
sometieron a un refuerzo si era necesario restaurar los niveles de
anticuerpo.
Los resultados de estos estudios de
inmunogenicidad se muestran en las tablas 1-5. Las
tablas 1 y 2 muestran los resultados de un estudio de
inmunogenicidad en ratones. En la tabla 1, el conjugado usado era
3'
aminometil-(-)-nicotina-succinil-rEPA
(ejemplo 4). En la tabla 2, el conjugado usado era
3-aminometil-(-)-nicotina-ácido
poliglutámico-ADH-rEPA (ejemplo 6).
Estas tablas muestran la generación de altas titulaciones de
anticuerpos que se unen específicamente a la nicotina. Además,
estos conjugados mostraron la capacidad de inducir la respuesta de
refuerzo.
Las tablas 3 y 4 muestran los resultados de un
estudio de inmunogenicidad en ratas. En la tabla 3, el conjugado
usado era 3'
aminometil-(-)-nicotina-succinil-rEPA
(ejemplo 4). En la tabla 4, el conjugado usado era
3-aminometil-(-)-nicotina-ácido
poliglutámico-ADH-rEPA (ejemplo
6).
Estas tablas muestran la generación de altas
titulaciones de anticuerpos que se unen específicamente a la
nicotina. Además, estos conjugados mostraron la capacidad de
inducir la respuesta de refuerzo.
La tabla 5 muestra los resultados de un estudio
de inmunogenicidad en conejos. Usando 3'
aminometil-succinil-rEPA (ejemplo 4)
o 3-aminometil-ácido
poliglutámico-ADH-rEPA (ejemplo 6),
se generaron altas titulaciones de anticuerpos contra los dos
conjugados. Estas titulaciones permanecieron elevadas durante más de
6 meses.
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La propia molécula de nicotina no es adecuada
para recubrir placas ELISA y necesita unirse a una molécula de
mayor tamaño que tenga mejores propiedades adhesivas. Para este fin
normalmente se usan poli-L-lisina o
poli-ácido L-glutámico. El hapteno de nicotina
derivatizado
3'-aminometil-(-)-nicotina
(3'AMNic) se conjugó con poli-ácido L-glutámico y el
conjugado de
3'-aminometil-(-)-nicotina-poli-ácido
L-glutámico (3'AMNic-pGlu) obtenido
se usó para recubrir las placas ELISA.
Se evaluaron anticuerpos generados contra la
vacuna 3'AMNic usando un ELISA 3'AMNic-pGlu como se
indica a continuación: se recubrieron 4 placas de microtitulación
Dynatech Immulon (Chantilly, VA) a 100 \mul/pocillo con 10 ng/ml
de 3'AMNic-pGlu en tampón bicarbonato 0,1 M, pH 9,6
y se dejaron incubar durante una noche (UN) a temperatura ambiente
(TA). Las placas después se aspiraron y se bloquearon con BSA al 1%
en PBS durante 1 hora a TA. Se diluyeron muestras y suero de
referencia en PBB (BSA al 1%, BRIJ al 0,3% en PBS, pH 7,2) a una
dilución que daba como resultado una densidad óptica (DO)
aproximada a 450 nm de 2,0. Las placas se lavaron (NaCl al 9%, BRIJ
al 0,1%) 5 veces y se cargaron muestras diluidas y suero de
referencia. La referencia y las muestras se diluyeron 2 veces en
las placas para obtener un volumen final de 100 \mul/pocillo y
las placas se incubaron durante 1 hora a37ºC. Las placas después se
lavaron de nuevo y se cargaron a 100 \mul/pocillo con IgG
anti-especie conjugada con peroxidasa, específica de
Fc (Jackson, West Grove, PA) diluida en PBB e incubada a 37ºC
durante 1 hora. Las placas se lavaron y se incubaron durante 10
minutos a TA con 100 \mul/pocillo de substrato de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (KPL,
Gaithersburg, MD), diluido a 1:1 con H_{2}O_{2} (suministrado
con el kit de reactivo TMB). La reacción se detuvo con la adicción
de 100 \mul/pocillo de ácido fosfórico 1 M y se leyó a 450 nm en
un lector de placas de microtitulación MR4000 (Dynatech). Las
muestras se cuantificaron en relación con la referencia usando un
análisis de líneas paralelas. A la referencia se le asigna un valor
numérico (U/ml) que corresponde a la dilución que proporciona una
DO de aproximadamente 2,0 a 450 nm.
Se evaluaron las especificidades de anticuerpos
usando un ensayo de ELISA de inhibición. Cada suero anti-[3'
AMNic-Suc-rEPA] se diluyó a una
concentración dos veces mayor que la que se obtendría a una
densidad óptica de aproximadamente 2,0 a 450 nm. Usando el ELISA de
3' AMNic-pGlu descrito anteriormente, al antisuero
diluido a ensayar se absorbió 1:1 (v/v) con cantidades crecientes de
antígeno de ensayo (inhibidor) durante tres horas a 37ºC, y la
muestra absorbida se ensayó en el ELISA usando suero no absorbido
como referencia. Para cada muestra se determinó el porcentaje de
absorción con respecto a la muestra no absorbida.
Se calculó la especificidad de suero de rata que
contenía anticuerpos inducidos en respuesta a 3'
AMNic-Suc-rEPA, usando un ELISA de
inhibición con tartrato de nicotina como inhibidor. La IC_{50}
para este anticuerpo fue de 3,5 x 10^{-6} M. Se calculó la
especificidad de suero de conejo que contenía anticuerpos inducidos
en respuesta a 3' AMNic-Suc-rEPA
usando un ELISA de inhibición con tartrato de nicotina como
inhibidor. La IC_{50} para este anticuerpo fue de 2,3 x 10^{-5}
M.
Se midió la capacidad de unión de anticuerpos
usando diálisis en equilibrio durante 4 horas a 37ºC usando 0,7 ml
de plasma, semi-micro células de Teflon, membranas
Spectrapor 2 con un límite de peso molecular de 12 a 14 kD y tampón
de Sorenson (fosfato 0,13, pH 7,4). Véase Pentel et al.,
J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 1061-1066
(1987). Se midió el pH del plasma al final del ensayo de diálisis
en equilibrio y sólo se usaron las muestras si el pH final era de
7,30 a 7,45.
La afinidad del anticuerpo por la nicotina se
calculó usando un radioinmunoensayo soluble, véase Mueller,
Meth. Enzymol., 92, 589-601 (1983). El peso
molecular medido de la IgG fue de 150 kD.
Las constantes de unión y las afinidades
obtenidas con los radioinmunoensayos fueron las siguientes. Para el
suero de rata anti-[3'
AMNic-Suc-rEPA], la IC_{50}
(molar) fue de 1,36 x 10^{-7}. La
K_{a}(molar-1) fue de 2,57 x 10^{7}. La
concentración de sitios de unión fue de 2,61 x 10^{-6} sitios de
unión/l y la concentración de IgG específica de nicotina fue de 0,2
mg/ml.
La vacuna de la presente invención se ha evaluado
en diversos modelos animales. Se usaron modelos de rata para
determinar el efecto de la inmunización activa o pasiva sobre la
distribución de nicotina en plasma y cerebro. Un estudio examinó los
efectos de la inmunización pasiva sobre la atenuación de los
efectos locomotores de la nicotina, que son una acción de la
nicotina en el sistema nervioso central (SNC). Otro experimento
evaluó los efectos de la inmunización pasiva sobre los efectos de
la nicotina en el sistema cardiovascular: elevación de la presión
sanguínea sistólica.
Para evaluar la presente inmunoterapia, se ha
creado un modelo animal para simular la rápida absorción de
nicotina de dos cigarrillos en seres humanos. Este modelo animal se
describe en Hieda (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther.
283(3):1076-1081. En este modelo, a las ratas
se les administraron 0,03 mg/kg de nicotina por infusión i.v.
durante 10 segundos, simulando la rápida absorción de la nicotina
desde los pulmones en los fumadores humanos. Se tomaron muestras de
sangre 3 y 10 segundos después de la inyección de nicotina para
medir la nicotina plasmática. Para determinar las concentraciones
de nicotina en el cerebro, los animales se sacrificaron 3 minutos
después de la inyección de nicotina y sus cerebros se extrajeron
rápidamente. La vacuna del ejemplo 4 se evaluó en ratas para
determinar su efecto sobre la distribución de la nicotina en plasma
y cerebro.
Se inmunizaron ratas con la vacuna de nicotina
con tres inyecciones i.p. de 25 \mug en total por inyección de
vacuna (3'AMNic-Suc-rEPA), dejando
dos semanas entre las inyecciones. Estos animales tuvieron mayores
niveles de nicotina en plasma 3 y 10 minutos después de una
infusión de 0,03 mg/kg de nicotina durante 10 segundos en
comparación con los niveles en los controles no inmunizados. Véase
la figura 1. De esta manera, la inmunización activa fue eficaz para
aumentar la unión a la nicotina en plasma. Se sabe una modesta
reducción en la cantidad de nicotina que alcanza el cerebro puede
alterar notablemente los efectos conductuales de la nicotina.
Con inmunización pasiva, fue posible determinar
el efecto de respuesta a la dosis de IgG inmune en el aumento de
los niveles de nicotina en plasma y en la reducción de los niveles
de nicotina cerebral. A ratas se les administraron cantidades
variables de IgG
anti-(3'AMNic-Suc-rEPA) (de 12,5 a
50 mg) total por inyección. Como se muestra en la figura 2, hubo un
claro efecto de respuesta a la dosis - al aumentar la dosis de IgG
aumentaba la nicotina en suero y se reducían los niveles de
nicotina en el cerebro.
La figura 3 demuestra que estaban presentes
anticuerpos anti-nicotina
(anti-3'AMNic-Suc-rEPA)
y que eran activos en el suero de las ratas 30 minutos y un día
después de la administración de anticuerpos (50 mg) totales por
inyección. La figura 3 demuestra que después de la exposición a la
nicotina (infusión de 0,03 mg/kg durante 10 segundos), estos
anticuerpos eran eficaces para reducir las concentraciones de
nicotina en el cerebro y aumentar los niveles de nicotina en el
plasma, 30 minutos y un día después de la administración de los
anticuerpos.
Otra demostración de la eficacia de la
inmunización pasiva con la vacuna de nicotina de la invención es su
capacidad para combatir infusiones consecutivas de nicotina. En un
experimento de inmunización pasiva separado realizado en ratas,
múltiples dosis de nicotina no redujeron los anticuerpos presentes o
redujeron significativamente su capacidad de unirse a la nicotina
recién inyectada. En la figura 4, se infundieron 50 mg de
anti-[3'AMNic-Suc-rEPA] a tiempo
cero. 24 horas después se realizaron 5 inyecciones de nicotina - se
infundieron 0,03 mg/kg de nicotina durante 10 segundos, desde la
vena yugular derecha, cada 20 minutos durante 80 minutos. Se
realizó un total de 5 inyecciones de nicotina. La quinta inyección
de nicotina se suplementó con ^{3}H-nicotina. Se
recogieron sangre total y cerebro un minuto después de la quinta
inyección. Los resultados se muestran a continuación y se
representan gráficamente en las figuras 4 y 5.
Estos resultados demuestran que incluso después
de la quinta dosis de nicotina, los anticuerpos son eficaces para
aumentar los niveles de nicotina en suero y reducir los niveles de
nicotina cerebrales. Los resultados con la
^{3}H-nicotina demuestran que los anticuerpos son
eficaces contra la nicotina inyectada a la quinta dosis.
Este experimento usado se diseñó para determinar
si la inmunización pasiva podría prevenir una acción inmediata de
la nicotina mediada por el SNC. El modelo de rata usado en este
experimento se creó por el Dr. David Malin y se describe en Malin
et al. Nicotine-specific IgG reduced
distribution to brain and attenuates its behavioral and
cardiovascular effects in rats, presentado en la Quinta Reunión
Anual de la Society for Research on Nicotine y Tobacco, San Diego,
CA, 5-7 de marzo de 1999. Para establecer un valor
inicial, se midió el efecto de una inyección subcutánea de 0,8 mg/kg
de tartrato de nicotina sobre el nivel de actividad locomotora de
ratas. La dosis de 0,8 mg/kg de tartrato de nicotina es la máxima
dosis que podría usarse sin inducir anormalidades locomotoras.
Hubo un aumento en el nivel de actividad después
de la inyección de nicotina en ratas que no se habían pretratado
con anti-[3'AMNic-Suc-rEPA], y en
ratas que se pretrataron con 50 mg de IgG de suero de conejo
normal. Véase la figura 6A barra derecha y la figura 6B barra
izquierda. Este efecto se suprimió pretratando a los animales con
50 mg de IgG inmune
anti-[3'AMNic-Suc-rEPA] (fig. 6B,
barra derecha). Esto demuestra que el antisuero
anti-nicotina eliminó un efecto estimulante de la
nicotina in vivo.
En este experimento, se midió otro indicador del
efecto conductual de la nicotina: el cambio en la presión sanguínea
sistólica. Se pretrataron ratas con IgG
anti-[3'AMNic-Suc-rEPA] o IgG de
control. Las ratas se trataron con una inyección subcutánea de 0,1
mg/kg de tartrato de nicotina. Las ratas de control mostraron un
aumento en la presión sanguínea sistólica de 42,6 \pm 3,2 mm Hg,
cuando se trataron con nicotina. Cuando las ratas se pretrataron con
IgG de antisuero anti-nicotina, la exposición a la
nicotina fue menos eficaz. Cuando se administraron cantidades
crecientes de suero anti-nicotina, esto disminuyó la
capacidad de la nicotina de elevar la presión sanguínea. Como se
muestra en la figura 7, hubo una tendencia lineal negativa de la
presión sanguínea en función de la dosis de IgG.
Claims (28)
1. Un conjugado de
hapteno-soporte de la siguiente fórmula:
en la
que
m es de 1 a 2500,
n es de 0 a 12,
y es 1 a 12,
X se selecciona entre el grupo compuesto por
NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S;
Y se selecciona entre el grupo compuesto por
NH-CO, CO-NH,
CO-NH-NH,
NH-NH-CO,
NH-CO-NH,
CO-NH-NH-CO y
S-S;
y el resto
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y-
está unido a la posición 3', 4' o 5' de la nicotina.
2. El conjugado de la reivindicación 1, donde m
se selecciona entre el grupo compuesto por 1 a 20 y 1 a 200.
3. El conjugado de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde m es de 11 a 17, n es 1, y es 2, X es
NH-CO, e Y es CO-NH, donde el
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y-
está unido a la posición 3' de la nicotina.
4. El conjugado de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde m es de 11 a 17, n es 1, y es 2, X es
NH-CO, e Y es CO-NH, donde el
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y-
está unido a la posición 4' de la nicotina.
5. El conjugado de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde m es de 11 a 17, n es 1, y es 2, X es
NH-CO, e Y es CO-NH, donde el
-(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{y}-Y-
está unido a la posición 5' de la nicotina.
6. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteína de soporte es
exoproteína A.
7. Un conjugado de
hapteno-soporte de la siguiente fórmula:
en la que n es de 0 a 12, j es de 1
a 1000, k es de 1 a 20, y E es una matriz que contiene
aminoácidos.
8. El conjugado de la reivindicación 7, donde la
matriz es poli-ácido L-glutámico.
9. Un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde dicho conjugado se obtiene usando
trans-4'-carboxi-(-)-cotinina
como material de partida.
10. Un anticuerpo producido en respuesta al
conjugado de hapteno-soporte de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, que es
monoclonal.
12. El anticuerpo de la reivindicación 10, que es
policlonal.
13. Un fragmento funcional del anticuerpo de la
reivindicación 10.
14. Un kit para determinar la presencia de
nicotina en una muestra, que comprende un anticuerpo o un fragmento
funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13.
15. Un proceso para producir un anticuerpo, que
comprende inmunizar a un mamífero hospedador con el conjugado de
hapteno-soporte de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
16. El proceso de la reivindicación 15, donde el
anticuerpo es monoclonal.
17. El proceso de la reivindicación 15, donde el
anticuerpo es policlonal.
18. Una composición de vacuna que comprende al
menos un conjugado de hapteno-soporte de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
19. Una composición de vacuna que consta
esencialmente de un conjugado de hapteno-soporte de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
20. Una composición de vacuna que consta de un
conjugado de hapteno-soporte de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
21. Una composición de vacuna que consta de un
conjugado de hapteno-soporte de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y al menos un
adyuvante.
22. Una composición de vacuna que consta de un
conjugado de hapteno-soporte de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, al menos un adyuvante y
al menos un excipiente.
23. Una composición de vacuna que consta de un
conjugado de hapteno-soporte de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, al menos un adyuvante, al
menos un excipiente y al menos un agente auxiliar.
24. Un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 9, o un anticuerpo o un fragmento funcional del
mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a
13, para uso como un medicamento.
25. Un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, o un anticuerpo o un fragmento funcional
del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10
a 13, para uso como un medicamento como en la reivindicación 24,
para la prevención o tratamiento de la adicción a la nicotina.
26. Un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para uso como un medicamento como en la
reivindicación 24 o 25, donde el medicamento comprende además un
compuesto útil en el tratamiento de la adicción a la nicotina.
27. Uso de un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, o un anticuerpo o un fragmento funcional del
mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a
13, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o
prevención de la adicción a la nicotina.
28. Uso de un conjugado de
hapteno-soporte de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de un medicamento como
en la reivindicación 27, donde el medicamento comprende además un
compuesto útil en el tratamiento de la adición a la nicotina.
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