ES2230267T3 - Mejoras en o relacionadas con la solubilizacion de flavonoles. - Google Patents

Abstract

Método para incrementar la solubilidad en agua de una composición que comprende quercetina aglicona, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una composición que contiene quercetina aglicona; proporcionar una composición que contiene antocianina; y mezclar las dos composiciones.

Description

Mejoras en o relacionadas con la solubilización de flavonoles.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para aumentar la solubilidad en agua y soluciones acosas del flavonol quercetina aglicona, y a un método para proporcionar composiciones que contienen flavonol soluble.

Antecedentes de la invención

Los polifenoles son aquellos compuestos que comprenden más de un grupo fenólico. Entro los polifenoles se encuentran las siguientes clases: flavonoides (un término frecuentemente empleado para representar polifenoles en general, pero más usualmente en Europa para representar únicamente las flavonas), los flavanoles, proantocianidinas (llamadas también procianidoles, procianinas, procianidinas y taninos) y antocioninas.

Las flavonas son compuestos con una estructura básica como la mostrada en la figura 1 en donde los dos anillos bencénicos (A y B) están enlazados con un anillo heterocíclico de seis miembros C que contiene un grupo carbonilo. El anillo B puede estar enlazado en posición 2 (como se ilustra) para proporcionar un flavona o en posición 3 para proporcionar una isoflavona. La hidroxilación puede ocurrir en una o más de las posiciones 3, 5, 7 y 3', 4', 5' para proporcionar compuestos conocidos como flavonoles. Ejemplos típicos de flavonoles son: quercetina (hidroxilada en las posiciones 3, 5, 7, 3', 4'), kaempferol (hidroxilado en las posiciones 3, 5, 7, 4') y miricetina (hidroxilada en las posiciones 3, 5, 7, 3', 4', 5'). Los flavonoles pueden existir de forma natural como la aglicona o como O-glicósido (por ejemplo, D-glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa, etc). También se encuentran otras formas de sustitución, tales como metilación, sulfatación y malonilación.

Los flavanoles tienen una estructura como la mostrado en la figura 2. Los flavanoles más comunes son catequina (grupos hidroxilo en las posiciones 5, 7, 3', 4') y su estereoisómero epicatequina. Los grupos hidroxilo pueden estar esterificados con ácido gálico. La proantocianidinas son polímeros de catequina y/o epicatequina y pueden contener hasta 8 o más unidades recurrentes. Estos compuestos suelen llamarse proantocianidinas, procianidinas o taninos.

Las antocianinas son sustancias de color, llamadas a veces antocianidinas. Las antocianidinas monómeras tienen las estructura básica como la mostrada en la figura 3. Ejemplos típicos son: cianidina (hidroxilada en las posiciones 3, 5, 7, 3', 4'), delfinidina (hidroxilada en las posiciones 3, 5, 7, 4', 5') y pelargodinina (hidroxilada en las posiciones 3, 5, 7, 3'). Los grupos hidroxilo están normalmente glicosilados y/o metoxilados (por ejemplo, la malvidina está sustituida en los grupos 3' y 5' hidroxilo y la paeonidina y la petunidina están sustituidas en el grupo 3' hidroxilo). Además existen polímeros de estas antocianidinas que son clasificados como antocianidinas poliméricas.

Dentro del término general "polifenoles" se incluyen también los ácidos dihidroxi y trihidroxi benzoicos y las fitoalexinas de las cuales un ejemplo típico es resveratrol.

Los polifenoles se encuentran en varias cantidades en grandes números de productos naturales, especialmente materiales vegetales, tales como frutas y hortalizas. Una fuente rica particular es la uva, en donde los polifenoles son abundantes en los pellejos y semillas, pero no en la pulpa. Durante la preparación de zumo de uva, se expresan cantidades de polifenoles en el zumo y el contenido en polifenoles dependerá de factores tales como el tipo de uva, el clima en el cual crece y el proceso de preparación empleado en la producción del zumo. Algún zumo de uva, especialmente el preparado a partir de la uva Concord, puede contener una cantidad tan grande como 2,5 g de polifenol por litro de zumo. Los pellejos y las semillas de la uva son extraídos comercialmente con agua y otros disolventes para obtener polifenoles. Además, los polifenoles de los pellejos y semillas de la uva llegan a incorporarse en el vino durante el proceso de vinificación. El vino tinto se prepara manteniendo el contacto entre el licor de fermentación y el residuo de uva triturada (bagazo) durante períodos prolongados, mientras que en la producción del vino blanco los pellejos de la uva son retirados de un modo relativamente rápido. En consecuencia, el vino en general y el particular el vino tinto contiene cantidades razonables de polifenoles, que ascienden a 1-3 g/l aproximadamente, y de este modo constituye una fuente comercial potencial de compuestos polifenólicos.

Se sabe que los polifenoles tienen propiedades antioxidantes y presentan un uso potencial en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. Entre los polifenoles, los flavonoles han demostrado tener muchas propiedades útiles como antioxidantes, disminuyendo la naturaleza adhesiva de las plaquetas. Estudios epidemiológicos han demostrado que los países y personas con una alta ingesta de flavonoles tienen menos enfermedades coronarias del corazón (Hertog et al, 1995 Arch. Int. Med. 155, 381-6).

En las frutas y hortalizas sin tratar, los flavonoles se presentan como glicósidos y está ausente la aglicona. El flavonol más abundante es la quercetina. Entre las hortalizas, la concentración más alta de quercetina glicósidos se encuentra en cebollas (3 a 500 mg/kg), bretones (100 mg/kg), judías francesas (30 a 45 mg/kg) y brócolis (30 mg/kg). Entre las frutas examinadas, la concentración de quercetina es en promedio de 15 mg/kg, teniendo las manzanas la concentración más elevada de 21 a 72 mg/kg (Hertog et al, 1992 J. Ag. Food Chem. 40, 2379-83).

Los flavonol glicósidos están presentes en uvas y se han registrado valores que van desde 8 a 97 mg/kg de peso en fresco (Macheix et al, 1990 Fruit Phenolics pp 378 CRC Press Boca Raton). Durante el proceso de fermentación, parte del azúcar se disocia de la aglicona formada. En promedio, el 50% aproximadamente del flavonol está presente en el vino como la aglicona. El contenido en flavonol de los pellejos de uva y del vino es muy variable y depende de la variedad de uva y más especialmente de la cantidad de luz solar con la que se desarrollan las uvas. Los flavonoles tienen un color amarillo y actúan como filtro para la luz azul y ultravioleta que resulta muy perjudicial para la uva. Durante períodos de luz solar intensa se sintetizan los flavonoles para proteger la uva y, por tanto, los pellejos de la uva y el vino a partir de la cual se produce, tiene una alta concentración de flavonoles (Price et al, Am. J. Enol. Vitic. 46 187-194, 1995).

Algunos vinos franceses contienen sólo 5 mg/l de flavonol (calculado como aglicona) mientras que en ciertos vinos californianos se han registrado valores de hasta 150 mg/l. Los flavonoles están prácticamente ausentes de la pulpa y semillas de uva y únicamente están presentes cantidades de traza en polvos de antocianina comerciales extraídos del bagazo después de la producción del vino tinto.

Aunque el zumo de uva suele ser menos rico en polifenoles que el vino, contiene flavonoles y es un producto comercial fácilmente disponible, y puede ser empleado también como fuente de polifenoles.

La mayoría de los flavonoles entran en la dieta como glicósidos siendo los glucósidos y rutina los flavonoles más comunes consumidos (Bokkenheuser and Winter, 1988 Prog. Clin. Biol. Res., 280, 142-148). La absorción de flavonoles en el hombre ha sido objeto de cierta controversia. Se ha estimado que la absorción de quercetina aglicona es de sólo 0,3 a 0,5%. De este modo, con una ingesta de 50 mg, sólo se absorberían un 0,25 mg (Formica et al Fd. Chem. Toxic. 1995, 33, 1061-1080). Sin embargo, recientes trabajos realizados en sujetos con ileostomía han demostrado que la absorción de quercetina aglicona fue de 25% y la absorción de quercetina de cebollas (en donde existe principalmente como el glucósido) fue del 52% (Hollman et al Am. J. Clin. Nutr. 1995, 62, 1276-1282). Más recientemente, se ha demostrado que el glucósido se absorbe más rápidamente que el rutinósido (Hollman et al, 1997 Crit. Reviews in Science & Nutrition 37, 719-738). Uno de los motivos de la pobre absorción de flavonoles, bien como la aglicona o bien como los glicósidos, es que los mismos son casi insolubles en agua y disolventes lípidos, aunque escasamente solubles en etanol. De este modo, tras la administración oral, se excreta una proporción muy alta de los flavonoles debido a que los mismos se encuentran en un estado físico que no favorece su absorción. Por tanto, si bien los flavonoles son considerados beneficiosos desde el punto de vista farmacológico, los mismos son pobremente absorbidos debido a que en general son de baja solubilidad. Si pudiera disponerse de flavonoles en una forma soluble en agua, los mismos se absorberían más fácilmente y quedarían disponibles biológicamente después del consumo oral.

Las antocianinas son pigmentos solubles en agua responsables de los colores atractivos de muchas flores, frutos y hojas. Las mismas pueden ser extraídas fácilmente de plantas mediante disolventes alcohólicos acidificados y muchas de ellas son comercialmente disponibles como colorantes alimentarios. Las mismas se suministran normalmente con maltodextrina como diluyente en una concentración adecuada para su inclusión en bebidas u otros productos alimenticios (Timberlake 1980 Food Chemistry 5, 69-80).

Se sabe que las antocianinas reaccionan con los flavonol glicósidos según un fenómeno descrito como co-pigmentación (Scheffeldt et al 1978, J. Food Science 43, 517-520). Por ejemplo, se comprobó que la rutina intensifica el color de malvidina-3, 5, diglicósido y desplaza el pico máximo de absorción. Se cree que el proceso es el resultado de un mecanismo de enlace de hidrogeno.

Aunque los flavonoles son insolubles en agua, los mismos están presentes en el vino en concentraciones muy altas que varían de acuerdo con el tipo de uva empleada y país de origen (McDonald et al, J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 368-375). La concentración de flavonoles en total (expresados como la aglicona) en el vino resultó ser de 4,6 a 41,6 mg/l. Dado que el vino contiene alrededor de 12% de etanol y los flavonoles son solubles en etanol, resultó razonable suponer que la solubilidad relativamente alta de los flavonoles en el vino se debía a la presencia de etanol.

Sería de una gran ventaja poder proporcionar flavonoles para administración oral en una forma soluble, en agua o mezclas acuosas o, alternativamente, aumentar la concentración de flavonoles en bebidas que contienen etanol. Al encontrarse en una forma soluble, sería posible hacer uso de flavonoles en bebidas y aumentar así potencialmente su biodisponibilidad.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la solubilidad en agua de una composición que comprende quercetina aglicona, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una composición que contiene quercetina aglicona; proporcionar una composición que contiene antocianina; y mezclar las dos composiciones. El inventor ha comprobado que la presencia de antocianina en una composición aumenta de manera importante la solubilidad en agua (y por tanto la biodisponibilidad) de flavonoles, tal como quercetina aglicona, especialmente a valores de pH neutro o ácido.

El término "flavonol" tal como aquí se emplea se refiere a compuestos que tienen la estructura mostrada en la figura 1 y que están hidroxilados en una o más de las posiciones 3, 5, 7, 3', 4' o 5'. El término "flavonol" está destinado también a incluir derivados asociados que están sustituidos adicionalmente, en especial aquellos compuestos que comprenden uno o más residuos de azúcar (tales como glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa y similares), en particular compuestos O-glicosilados. Otros compuestos, que caen dentro de la definición de "flavonol" como aquí se emplea, incluyen aquellos que comprenden otros grupos sustituyentes tales como grupos alquilo (especialmente metilo), alcoxi (especialmente metoxi), sulfilo y malonilo.

El contenido en flavonol de la composición comprende el compuesto quercetina aglicona o un análogo estructural del mismo. Los glicósidos de quercetina tienden a adquirir sus propios nombres triviales. Por ejemplo, el ramnosa glicósido de quercetina se como quercitrina y el rutinósido se conoce como rutina.

Los análogos de quercetina incluyen aquellos compuestos que comprenden un grupo sustituyente distinto de un grupo -OH en una o más de las posiciones 3, 5, 7, 3' y 4'. Otros grupos sustituyentes posibles incluyen: alquilo inferior (es decir, con menos de 5 átomos de carbono), especialmente metilo o etilo; acetilo; sulfilo y malonilo. Convenientemente, en los análogos de quercetina únicamente unas pocas (es decir, preferentemente sólo una o dos) de las posiciones están sustituidas con grupos distintos de -OH.

Los flavonoles tales como quercetina y sus glicósidos, tal como quercetina glucósidos, quercitrina (quercetina ramnósido) y rutina (quercetina rutinósido) son fácilmente disponibles a partir de proveedores de productos químicos, por ejemplo Sigma, UK e Indofine Inc, USA) con una pureza del 85-99%.

[Los glicósidos pueden ser expresados como la aglicona multiplicando su concentración por:

(FW quercetina + FW quercitrina = \frac{302}{448} = 0,674)

(FW= peso fórmula). El contenido total en flavonol es la suma de los contenidos en aglicona en las formas libre y conjugada].

Alternativamente, dado que los flavonoles en general (incluyendo quercetina) están presentes en muchas sustancias de origen natural, tales como productos alimenticios, la composición de la invención puede comprender quercetina obtenida de una fuente de origen natural. Los productos alimenticios que contienen quercetina en cantidades relativamente grandes incluyen ciertas frutas y hortalizas, tales como manzanas, cebollas y vino tinto. En particular, por tanto, la composición de la invención puede comprender un contenido en quercetina derivada de plantas. A modo de explicación, dichas composiciones derivadas de plantas pueden comprender extractos de plantas o de partes de las mismas (tales como tubérculos, frutos) que son tratadas de algún modo (por ejemplo, por fermentación). Así, las composiciones derivadas de plantas incluyen extractos acuosos o en disolventes orgánicos de plantas o partes de las mismas, zumos de frutas y licores fermentados (por ejemplo, vino) producidos a partir de plantas o zumos de frutas, o composiciones obtenidas a partir de cualquiera de tales materiales. El material vegetal se trata habitualmente (física y/o químicamente) durante la producción de la composición para extraer quercetina de la planta y de este modo aumentar y enriquecer el contenido en quercetina de la composición. Los expertos en la materia podrán apreciar que la invención no intenta incluir dentro de su alcance alimentos de origen natural o materiales vegetales que no han sido sometidos a tratamiento alguno.

Convenientemente, la composición que contiene quercetina puede ser tal que el material de origen vegetal comprende al menos 25% de polifenoles, más preferentemente 35% de polifenoles o con suma preferencia al menos 45% de polifenoles.

La composición que contiene quercetina puede estar constituida total o sustancialmente por el material de origen vegetal a partir del cual se obtiene el contenido en flavonoles de la composición. Alternativamente, al composición puede comprender otro material, tales como aromatizantes, excipientes, vehículos y similares, tradicionalmente empleados en la formulación de composiciones para consumo humano.

Habitualmente, el contenido en quercetina de la composición, en su totalidad, es de al menos 0,1% p/p, con preferencia al menos 1% p/p, más preferentemente al menos 5% p/p y con suma preferencia al menos 10% p/p.

El término "antocianina" tal como aquí se emplea está destinado a referirse no sólo a antocianinas monoméricas, sino también a formas diméricas y poliméricas (es decir, conteniendo de 3 a 20 residuos monoméricos de antociadinina) de antocianinas y a leucoantocianidinas (conocidas también como flavan-3,4-dioles). Las antocianinas pueden comprender sustituciones (por ejemplo, grupos alquilo, alcoxi, etc) y en particular pueden estar O-glicosiladas, de manera similar a los flavonoles, como anteriormente se ha descrito.

La cantidad de antocianina añadida a la composición deberá controlarse idealmente de forma cuidadosa. Dado que las antocianinas están en general altamente pigmentadas, su presencia en altas concentraciones en ciertos alimentos, bebidas o suplementos alimenticios puede ser indeseable en el caso de que se prefiera evitar el color asociado con la presencia de antocianinas. En consecuencia, puede ser preferible en muchas modalidades añadir la cantidad mínima de antocianina consistente con la consecución del nivel requerido de solubilización del flavonol. Además o alternativamente, puede ser conveniente incluir algún otro componente que enmascare u oculte el color asociado con la antocianina; dicho componente podría ser convenientemente otro colorante u otra sustancia adecuada para consumo humano.

La antocianina de la composición puede consistir en una sola antocianina o puede comprender una mezcla de antocianinas. Preferentemente, la antocianina se elige del grupo consistente en: malvidina, cianidina, delfinidina, paeonidina, pelargonidina y petunidina, y glicósidos de las mismas. Un ejemplo típico es cloruro de malvina (malvidina diglucósido) que comercialmente se encuentra disponible en forma purificada. Alternativamente, la antocianina puede obtenerse por extracción de plantas que contienen antocianina, tales como plantas de uva, zanahoria negra, berza roja, mora negra, grosella negra, arándano americano y similares.

Los expertos en la materia serán conocedores de los muchos métodos que se utilizan para extraer antocianinas desde que las mismas se utilizan ampliamente para la preparación de colorantes alimentarios. La antocianina en la composición se puede encontrar en una forma altamente purificada, o puede consistir en una mezcla con otros polifenoles, especialmente flavonoles, o con un diluyente tal como maltodextrina. Es preferible que el contenido en antocianina en la composición, en su conjunto, sea de al menos 1% (p/p), más preferentemente al menos 5% y con suma preferencia al menos 10%. El contenido en antocianina en la composición deberá ser generalmente suficiente para solubilizar en agua al menos 0,1% p/p de quercetina aglicona, con preferencia suficiente para solubilizar al menos 1% p/p de quercetina aglicona en dicha composición.

Preferentemente, cuando el método comprende mezclar una composición que contiene quercetina aglicona con una solución acuosa de antocianinas, la solución acuosa comprenderá convenientemente antocianina disuelta en una concentración de al menos 10 mg/l, más preferentemente al menos 50 mg/l y con suma preferencia al menos 100 mg/l.

Para los expertos en la materia será evidente que el orden de adición de la quercetina aglicona y antocianinas no es crítico. Así, por ejemplo, se puede preparar una composición que contiene antocianina y añadir a dicha composición una cantidad adecuada de quercetina aglicona o viceversa. En general, sin embargo, a la vista de la pobre solubilidad de la quercetina aglicona, normalmente será preferible añadir la composición que contiene quercetina a la composición que contiene antocianina, de manera que las antocianinas estarán presentes en exceso, al menos inicialmente, lo cual tenderá a evitar la aglutinación de la quercetina aglicona en la mezcla y facilitar así el mezclado.

Puede ser preferible que esté presente un ligero exceso de antocianina una vez finalizada la mezcla de las dos composiciones, con el fin de asegurar la solubilización de al menos la cantidad deseada de quercetina aglicona.

En otra modalidad particular, el método comprende al fortificación de las composiciones (tal como vino tinto o vino tinto sin alcohol) con más flavonol, simplemente por adición de la quercetina aglicona a una composición de flavonol/antocianina ya existente (por ejemplo, vino tinto), siempre que exista suficiente antocianina en la composición ya existente para solubilizar la quercetina aglicona añadida. Si existe ya un exceso insuficiente de antocianina en la composición ya existente, se puede añadir simplemente una cantidad adicional adecuada de más
antocianina.

Sin embargo, los vinos son materiales comparativamente costosos y las antocianinas están presentes en altas concentraciones en zumos de frutas y hortalizas, tales como zumos de uva, arándano americano, grosella negra y mora negra. En modalidades preferidas, la invención comprenderá la adición de quercetina aglicona a zumos de frutas y/u hortalizas, con el fin de fortificar el zumo de frutas u hortalizas con más flavonol.

En algunas modalidades puede ser conveniente facilitar la disolución inicial de la quercetina aglicona. Esto se puede conseguir, por ejemplo, añadiendo etanol a la composición o disolviendo inicialmente la quercetina aglicona en una pequeña cantidad de etanol y añadiendo la quercetina aglicona, disuelta en etanol, al resto de la composición. Además o alternativamente, la composición se puede calentar (por ejemplo, a 50ºC durante alrededor de 30 minutos, o bien a 75ºC durante alrededor de 10 minutos, o bien a 100ºC durante alrededor de 1 minuto). La aplicación de calor puede ser preferible especialmente en el caso de que se desee proporcionar una composición que contiene flavonol libre de etanol.

La composición preparada por el método de la invención, una vez seca, es generalmente sólida a presión atmosférica (760 mm Hg) en todo el intervalo de temperatura de 10-20ºC. La composición puede estar en partículas (por ejemplo, en forma de polvo o gránulos), o bien puede conformarse a cápsulas, comprimidos y similares.

Alternativamente, la composición puede ser un líquido que comprende agua u otro disolvente acuoso tal como etanol acuoso. El inventor ha comprobado de manera sorprendente que las composiciones preparadas según el método de la invención presentan la quercetina aglicona en una forma más soluble en soluciones acuosas. La quercetina aglicona es casi insoluble en agua a pH 7 o inferior, pero en presencia de antocianina, su solubilidad aumenta de manera notable y la quercetina aglicona se hace biodisponible.

Además, cuando una composición que contiene tanto quercetina aglicona como antocianina se administra a voluntarios durante 4 semanas, aumenta de manera importa la capacidad antioxidante del plasma de los voluntarios (tal como se determina por el ensayo FRAP, descrito más adelante).

La composición que contiene quercetina aglicona puede comprender flavonoles (incluyendo quercetina) obtenidos de uvas (uvas enteras o partes de las mismas, tales como pellejos o zumos), vino (especialmente vino tinto, que comprende concentraciones de polifenoles mucho más alta que el vino blanco) o subproductos y/o productos residuales del proceso de producción de vino, tal como bagazo (es decir, el residuo de uvas trituradas después de la extracción del zumo) u orujo (sólidos residuales que permanecen después de la fermentación inicial). Sin embargo, los flavonoles, tal como quercetina, están presentes en una amplia variedad de materiales de origen natural, muchos de los cuales contienen un mayor contenido en flavonoles que el vino rojo y son considerados más económicos, por lo que resultan así fuentes más adecuadas de flavonol. Ejemplos de dichos materiales incluyen: frutas en general, tales como manzanas (por ejemplo, var. "Gravensteiner"); especialmente piel de manzana; peras (por ejemplo, var. "Williams Christs"); pimientos campana (por ejemplo, var. "Yolo wonder"; zanahorias rojas; grosellas negras (particularmente preferidas al ser relativamente ricas en flavonoles); limones; cerezas; arándanos; grosellas espinosas; tomates; olivas; y hortalizas en general incluyendo: rábanos (por ejemplo, var "Saxa treib"; colinabos por ejemplo, var. "Primavera"; rábanos picantes; patatas; cebollas; y espárragos.

En una modalidad particular (pero no necesariamente preferida), la composición que contiene quercetina aglicona se deriva de vino tinto y comprende un perfil representativo de prácticamente todos los compuestos de flavonoles presentes en el vino (habitualmente, aunque no necesariamente, presentes en la composición sustancialmente en las cantidades relativas representativas de aquellas del vino a partir del cual se deriva la composición). Dicha composición puede ser referida como un "conjunto total de flavonoles" del vino.

Los flavonoles, tal como quercetina aglicona, se puede obtener convenientemente a partir de vino tinto u otros líquidos que contienen flavonoles (tal como extractos de fruta u hortalizas) por absorción en una columna de resina cromatográfica, con elución de la columna de la fracción enriquecida en polifenoles (generalmente después de una etapa de lavado) mediante el uso de etanol a 40-50% como eluyente, u otro disolvente orgánico adecuado (tal como metanol, acetona, acetato de etilo, cloruro de dimetileno y cloroformo, el cual puede estar en solución acuosa). El disolvente orgánico es con preferencia relativamente volátil (es decir, tiene un punto de ebullición entre 30 y 85ºC a una presión de 760 mm Hg) y de este modo se expulsa fácilmente, para dejar una composición sólida sustancialmente seca (es decir, menos de 10% p/p de agua) que comprende flavonoles. Dicho método se puede emplear con éxito para obtener un conjunto total de flavonoles a partir de vino tinto.

Alternativamente, la quercetina aglicona se puede obtener a partir de vino tinto u otro líquido que contiene flavonoles mediante extracción con disolvente empleando un disolvente orgánico adecuado inmiscible con el vino u otro líquido. Alternativamente, la quercetina aglicona se puede obtener a partir de sólidos que contienen flavonoles mediante extracción con disolvente (generalmente extracción con un disolvente orgánico tal como etanol o acetato de etilo), pudiendo ser separado entonces el sólido del disolvente por filtración o centrifugado. El disolvente puede ser entonces evaporado para dejar una composición sólida, sustancialmente seca que comprende quercetina
aglicona.

Alternativamente, la quercetina aglicona se puede obtener en forma purificada (por ejemplo, con una pureza del 85-99%) a partir de un fabricante de productos químicos, siempre que el material sea adecuado para consumo humano.

En modalidades preferidas, la composición obtenida mezclando las composiciones que contienen quercetina aglicona y que contienen antocianina se presenta en forma de un suplemento alimenticio. Este puede ser una sustancia que se añade como un ingrediente adicional durante la preparación del producto alimenticio, o bien puede ser una sustancia separada que será consumida por un individuo (por ejemplo, como un comprimido o cápsula) sustancialmente por separado (es decir, sin mezcla alguna) de otros componentes alimenticios antes del consumo (aunque, como es lógico, el comprimido o la cápsula se puede ingerir junto con el alimento). Alternativamente, la composición se puede presentar como un sólido que se convertirá en una bebida mediante mezcla con un diluyente fisiológicamente aceptable (tal como leche, agua, soluciones o geles preparadas a partir de Aloe vera, u otro líquido acuoso).

La dosis de la composición administrada a un sujeto depende del grado de actividad del material, pero normalmente estará comprendida entre 10 mg y 10 g por día. La dosis preferida de quercetina aglicona será de 0,1-1000 mg por día, con preferencia de 0,5-500 mg por día, más preferentemente de 2-250 mg por día.

Las composiciones obtenidas mezclando las composiciones que contienen quercetina aglicona y que contienen antocianina de acuerdo con la invención, se pueden preparar según la práctica convencional empleada para suplementos alimenticios o productos farmacéuticos. Los diluyentes, excipientes o vehículos, etc, que se pueden emplear son bien conocidos en la técnica de las formulaciones y la forma elegida para cualquier régimen particular dependerá del contexto dado y de las preferencias del formulador. En general, la dosis dependerá de la concentración de quercetina aglicona en la composición.

Además, las composiciones pueden comprender otros diversos componentes, tales como aquellos habitualmente empleados en la industria alimentaria y/o industria farmacéutica. Dichos componentes pueden incluir nutrientes (especialmente trazas de elementos y vitaminas), antioxidantes, sustancias terapéuticas (especialmente aquellas que tienen un efecto terapéutico en relación a la prevención y/o tratamiento de CHD, en particular, aspirina), aromatizantes y edulcorantes (especialmente edulcorantes artificiales, tal como aspartama, etc).

Ejemplos de los anteriores incluyen los siguientes: un carotenoide tal como luteina, licopeno o \alpha- y/o \beta-caroteno; nutrientes antioxidantes o agentes anti-inflamatorios tales como vitamina A, vitamina C, vitamina E (\alpha-tocoferol y otros tocoferoles activos), ácido fólico, selenio, cobre, zinc, manganeso, ubiquinona (coenzima Q10), ácido salicílico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico y ácido 2,5-dihidroxibenzoico.

Los antioxidantes, tales como carotenoides y vitamina E, son destruidos parcialmente en el tracto gastrointestinal por oxidación. Mediante la inclusión de estos compuestos en la composición de la invención, se cree que este proceso resulta inhibido y se absorben más antioxidantes. El uso de una composición que comprende \alpha-tocoferol y/o aspirina se prefiere especialmente, puesto que se cree que dicha mezcla proporciona un efecto sinérgico en presencia de quercetina aglicona.

Las dosis diarias adecuadas típicas de estos componentes adicionales de la composición (y que por tanto pueden ser incluidos en la composición de manera que el consumo normal de la composición proporcione la dosis adecuada) son como sigue:

Luteina	2 a 50 mg, por ejemplo convenientemente 7,5 mg
Beta caroteno	2 a 20 mg, por ejemplo convenientemente 5 mg
Vitamina A	400 a 600 RE, por ejemplo convenientemente 500 RE
Vitamina C	75 a 250 mg, por ejemplo convenientemente 100 mg
Acido fólico	0,1 a 1,0 mg, por ejemplo convenientemente 0,2mg
Selenio	80 a 120 \mug, por ejemplo convenientemente 90 \mug
Cobre	2 a 4 mg, por ejemplo convenientemente 3 mg
Zinc	10 a 20 mg, por ejemplo convenientemente 15 mg
Coenzima Q10	10 a 200 mg, por ejemplo convenientemente 30 mg
Aspirina	10 a 150 mg, por ejemplo convenientemente 75 mg

De este modo, en una modalidad, la composición asume la forma de cápsulas, conteniendo cada cápsula 50 mg de composición de quercetina aglicona, con una ingesta sugerida de una a cuatro cápsulas por día. Otra presentación es como una bebida no alcohólica que proporciona una dosis eficaz de quercetina aglicona cuando se disuelve en agua (destilada o aireada) de sabor aromatizado y edulcorado, o disuelta en un zumo de frutas, por ejemplo, uva, manzana o naranja, etc; o en soluciones o geles que se han preparado a partir de Aloe vera.

Aunque puede ser preferible por diversos motivos (por ejemplo, sociales, religiosos y económicos) proporcionar una bebida libre de alcohol que comprenda la composición de la invención, dichas bebidas pueden ser fortificadas con alcohol (por ejemplo, vodka, ginebra, whisky) para proporcionar un nivel deseable de 5-50% de alcohol dependiendo del gusto del consumidor.

Otras presentaciones son como un ingrediente alimenticio en productos lácteos tales como leche y yogur, conservas y productos dietéticos destinados como suplementos o sustitutos de la comida. Los ejemplos anteriores son sólo ilustrativos y no intentan de modo alguno ser una limitación.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para proporcionar una solución acuosa que comprende quercetina disuelta en una concentración mayor de 10 mg/l, comprendiendo el método las etapas de: mezclar, en cualquier orden, agua, una composición que comprende quercetina aglicona, y una antocianina; y formar una solución acuosa a partir de la mezcla, comprendiendo la solución la quercetina disuelta en una concentración mayor de 10 mg/l.

Convenientemente, la solución acuosa no contiene disolvente orgánico y, en particular, está con preferencia sustancialmente libre de etanol, de manera que la solubilización de la quercetina aglicona en agua se debe principalmente a la presencia de la antocianina.

La solución acuosa preparada por el método del segundo aspecto de la invención es segura para consumo humano y generalmente se formulará como una bebida que comprende ingredientes opcionales tales como antioxidantes, agentes aromatizantes, edulcorantes, vitaminas o minerales, como anteriormente se ha descrito.

Como se ha explicado anteriormente, se puede emplear convenientemente calor para facilitar la disolución inicial de los flavonoles, los cuales permanecen sustancialmente en solución tras el enfriamiento a temperatura ambiente. Alternativamente, y con una menor preferencia, se puede emplear etanol para asistir la disolución de la quercetina aglicona. El método puede ser particularmente ventajoso cuando se produce una solución acuosa de flavonoles disueltos a pH neutro o ácido.

La invención se describe adicionalmente por medio de ejemplos ilustrativos y con referencia a los dibujos adjuntos en donde:

La figura 1 es una ilustración esquemática de la estructura de núcleo de flavonas.

La figura 2 es una ilustración esquemática de la estructura de núcleo de flavanoles.

La figura 3 es una ilustración esquemática de la estructura de núcleo de antocianinas.

La figura 4 muestra un gráfico de la solubilidad de quercetina en una solución acuosa de polvo de antocianina derivada de uvas (conteniendo 3,94% de antocianina) después de adición de quercetina en exceso en una solución etanólica.

La figura 5 muestra un gráfico de la solubilidad de quercetina en una solución acuosa de polvo de antocianina derivada antocianina (conteniendo 3,94% de antocianina) en donde un exceso de quercetina sólida se calienta con dicha solución.

La figura 6 muestra un gráfico de la solubilidad de quercetina en una solución acuosa de polvo de antocianina derivada de zanahorias negras (conteniendo 1,21% de antocianina) en donde un exceso de quercetina sólida se calienta con dicha solución.

La figura 7 muestra un gráfico de la solubilidad de quercetina en una solución acuosa de polvo de antocianina derivada de berzas rojas (conteniendo 2,51% de antocianina) en donde un exceso de quercetina sólida se calienta con dicha solución.

La figura 8 muestra un gráfico de la solubilidad de quercetina en una solución acuosa de cloruro de malvina, después de la adición de quercetina en una solución etanólica.

Ejemplos Ejemplo 1 Solubilización de quercetina en vino y zumos de frutas por adición de una solución etanólica de quercetina

La finalidad de la investigación fue la de determinar la solubilidad de quercetina en vino tinto, en vino blanco y en dos zumos de frutas cuando la quercetina añadida se disolvió en etanol. La quercetina empleada en este ejemplo y en otros fue quercetina dihidratada (C_{15}H_{14}O_{9}, FW 238, Sigma, UK).

La solubilidad de quercetina se expresa como la molécula anhidra (C_{15}H_{10}O_{7}, FW 302). Se preparó una solución etanólica de quercetina que se añadió en ligero exceso a vino tinto, vino blanco, zumo de arándanos americanos y zumo de zanahorias negras, a temperatura ambiente. Después de centrifugar para separar la quercetina sólida, se midió la densidad óptica en un espectrofotómetro a 258 nm y 375 nm. A estas longitudes de onda, la quercetina presenta una absorción máxima y su concentración se puede calcular empleando el factor log_{epsilon} = 2,75.

El procedimiento fue como sigue: se preparó una solución madre de quercetina dihidratada en etanol absoluto conteniendo 5 mg de quercetina dihidratada por ml. Se añadieron partes alícuotas de 50 \mul de esta solución a 5 ml de los líquidos a examinar. Las mezclas fueron entonces agitadas vigorosamente en un mezclador Vortex y se dejaron reposar durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente para que se formara un precipitado.

La mezcla se centrifugó entonces a 2000 x g durante 30 minutos a 20ºC. Se tomaron entonces partes alícuotas y se medió la densidad óptica en un espectrofotómetro (Camlad, UK) a 258 nm y 375 nm, diluyendo cuando fuese necesario con un diluyente adecuado, por ejemplo agua para zumos de frutas, etanol al 12% para vinos, etc. Además, se añadieron 50 \mul de etanol a 5 ml de cada uno de los líquidos a examinar y se determinaron las densidades ópticas de manera similar. Los controles fueron agua y etanol al 12%. La solubilidades de la quercetina en los líquidos se determinaron a partir de las diferencias entre las densidades ópticas de los líquidos con y sin quercetina.

La solubilidad de quercetina en los vinos y zumos de frutas examinados se muestra en la Tabla 1.

La quercetina es casi insoluble en agua (1 mg/l) y muy escasamente soluble en etanol al 12% (5 mg/l). Sin embargo, la quercetina es mucho más soluble en vino tinto (40 mg/l), en zumo de arándanos (35 mg/l) y en zumo de zanahorias negras (28 mg/l). La quercetina no fue más soluble en vino blanco (5 mg/l) que en etanol al 12%.

TABLA 1

Solubilidad de quercetina en zumos de frutas, después de la adición de una solución etanólica de quercetina
	Solubilidad de quercetina ^{a} mg/l
Líquido	258 nm^{b}	375 nm^{b}
Vino tinto ^{c} (Cabernet Sauvignon)	44,1	39,8
Vino blanco ^{c}(Vin Ordinaire)	4,2	5,4
Zumo de arándanos ^{d}	33,6	34,7
Zumo de zanahorias negras ^{e}	28,1	31,0
Etanol 12% p/p	4,1	5,3
Agua	2,2	1,8
a Valores expresados como el compuesto anhidro
b Longitudes de onda de la medición de la densidad óptica
c Vinos franceses
d Marca Ocean Spray™
e Marca Ribena™

Dado que el vino blanco no contiene cantidades importantes de polifenoles, se desprende que la quercetina es solubilizada por los polifenoles presentes en el vino tinto y en zumos de frutas, posiblemente mediante la formación de un complejo soluble.

El método de adición de quercetina a un vino tinto o zumos de frutas que contienen polifenoles constituye un medio práctico para fortificar bebidas con un flavonol, de manera que el flavonol queda disponible en solución. Debido a que los flavonoles son casi insolubles en agua o etanol acuoso diluido, resulta impracticable proporcionar flavonoles en estos disolventes puesto que si se añade flavonol sólido la mayor parte del mismo no disuelve sino que sedimenta hacia el fondo del recipiente.

Ejemplo 2 Solubilización de quercetina en una solución acuosa de antocianina de uvas, después de la adición de un exceso de quercetina en una solución etanólica

La finalidad de esta investigación fue la de examinar la solubilidad de quercetina en antocianina de uvas que constituye el principal componente de los polifenoles en vino tinto y en zumos de frutas de color.

El polvo de antocianina de uvas consistió en un producto comercial empleado como colorante alimentario (Phytone Ltd, Burton on Trent, UK) y tenía un contenido en antocianina de 3,94%.

El procedimiento empleado fue como sigue: se disolvió polvo de antocianina en agua desionizada para proporcionar concentraciones de 0,625, 1,25, 2,5, 10 y 20 mg/ml. También se preparó una solución madre de quercetina dihidratada (5 mg/ml) en etanol absoluto. A cada 5 ml de la solución de antocianina anterior se añadieron 133 \mul de la solución de quercetina a temperatura ambiente, seguido por partes alícuotas cada vez mayores de 30 \mul hasta que puedo verse claramente un precipitado. Las mezclas de dejaron en reposo durante 20 a 30 minutos y luego se centrifugaron a 2000 x g durante 30 minutos a 20ºC. Las densidades ópticas fueron medidas a 258 nm y 375 nm como en el Ejemplo 1. A 5 ml de cada solución correspondiente de antocianina se añadió el mismo volumen de etanol determinado anteriormente para proporcionar un precipitado y se midieron las densidades ópticas. La concentración de quercetina se determinó a partir de la diferencia de la densidad óptica entre la soluciones con o sin quercetina. El control fue agua.

Puesto que la quercetina es más soluble en etanol acuoso que en agua, se preparó otra serie de controles en donde se añadió quercetina en etanol al agua en cantidades correspondientes a las utilizadas en el ensayo, y se determinaron las solubilidades de manera similar. Como se muestra en la figura 4, la solubilidad de quercetina aumentó de un modo casi lineal con el incremento de la concentración del polvo de antocianina (al menos a baja concentración del polvo de antocianina [< 10 mg/ml]). Con 20 mg de polvo de antocianina/ml, la solubilidad de quercetina fue de 75 mg/l. Esta solubilidad fue en una solución en etanol al 22%. Sin la presencia de antocianina, la solubilidad de quercetina es de sólo 13 mg/l. El polvo de antocianina comercial contenía 3,94% de antocianina. De este modo, en la solución de 20 mg/ml, la concentración de antocianina fue de 800 mg/l. Por tanto, la relación de quercetina:antocianina en la solución fue de 1:10,7. Para solubilizar quercetina, se necesitó más antocianina que quercetina p/p.

Se llega a la conclusión de que los flavonoles son fácilmente solubles en solución acuosa de antocianina cuando la quercetina se añade como una solución etanólica. Dado que los polvos de antocianina son de una fácil disponibilidad comercial, resulta práctico suplementar bebidas que contienen antocianina con quercetina en una forma soluble.

Ejemplo 3 Solubilización de quercetina en diferentes líquidos que contienen antocianina por medio de calor

Aunque es conveniente añadir quercetina en solución etanólica a las antocianinas, el método aumenta el contenido en etanol de la bebida. Se realizó una investigación sobre la posibilidad de disolver quercetina, sin el empleo de etanol.

El procedimiento fue como sigue: se colocaron partes alícuotas (20 ml) de los líquidos examinados en un tubo de plástico con 50 mg de quercetina dihidratada sólida y se hizo girar a temperatura ambiente (20ºC) durante 3 horas, seguido por centrifugado a 2000 x g durante 30 minutos a 20ºC. Se midió la concentración de quercetina como en los ejemplos anteriores a partir de la diferencia de densidad óptica a 375 nm de líquidos con y sin quercetina.

La solubilidad de la quercetina cuando se mezcló con soluciones que contienen antocianina a temperatura ambiente resultó ser extremadamente pequeña (Tabla 2). Para vino tinto, la solubilidad de quercetina fue de sólo 3 mg/l y para polvo de antocianina de uvas (1 g/l) fue de sólo 0,7 mg/l.

Para investigar la disolución por calor, los líquidos se calentaron en un tubo sellado durante un minuto en horno de microondas (en donde ocurrió la ebullición del líquido) y se enfrió a temperatura ambiente. Bajo estas condiciones (Tabla 2), la quercetina fue mucho más soluble y la solubilidad de la quercetina fue comparable a la conseguida por los métodos anteriores que emplean solución etanólica de quercetina (Tabla 1).

Las concentraciones de antocianina de los líquidos se determinaron también por el método de Miketic-Aleksic et al 1972, Lebensm-Wiss. u Technol. 5 163-165). El método consiste en diluir partes alícuotas de 1 ml de vino o zumo con un tampón a pH 1 y medir la densidad óptica a 520 nm. Los resultados fueron calculados como malvidina-3-glucósido (FW 493,5) empleando el coeficiente de extinción de 28000. Para sólidos, se disolvió un peso conocido de polvo en tampón a pH 1 y los resultados se obtuvieron como g de antocianina/100g de polvo.

Se analizaron muestras de vino tinto, de antocianina de uvas y de extracto de semillas de uvas respecto a los polifenoles por medio de HPLC por ETS Laboratories, St Helena, CA 94574, USA. Los cuatro vinos tintos y el vino rosado produjeron todos ellos una solubilidad de quercetina mayor que en etanol al 12%. Los tres vinos, por encima de 150 g de antocianina/litro proporcionaron una mayor solubilidad que los dos vinos por debajo de 150 g de antocianina/litro. No ocurrió incremento alguno de la solubilidad de quercetina en vino blanco (en donde la antocianina está sustancialmente ausente). La solubilidad más alta fue en zumo de zanahorias negras, que también tenía el contenido más alto en antocianina. Los cuatro zumos de frutas contenían todos ellos antocianina y dieron lugar a un incremento de la solubilidad de quercetina. También se demostró una solubilidad incrementada de quercetina en una solución de antocianina de uvas, la cual fue comparable a la de los vinos y zumos de frutas. Los vinos blancos en donde la antocianina estaba ausente tuvieron un efecto similar al mostrado por el etanol al 12%.

Mientras que el polvo de antocianina tenía un efecto positivo sobre la solubilidad, el extracto de semillas de uvas que no contiene antocianina resultó ineficaz.

El método para proporcionar una bebida rica en flavonol es simple y sólo requiere un breve período de calentamiento. Además, el método deja los líquidos relativamente inalterados en cuanto a composición y no aumenta el contenido en etanol.

La Tabla 3 muestra los resultados del análisis de polifenoles mediante HPLC. Las tres muestras, vino tinto, antocianina de uvas y extracto de semillas de uva, contenían todas ellas cantidades apreciables de fenoles poliméricos. El vino tinto y el extracto de semillas de uvas contenían flavanoles (catequina, epicatequina) y dímeros de procianidina. El vino tinto y la antocianina de uvas contenían monómeros y polímeros de antocianina. Puesto que el extracto de semillas de uvas fue ineficaz a la hora de aumentar la solubilidad de quercetina, se llegó a la conclusión de que las antocianinas constituyen el factor solubilizante y éstas están presentes en vino tinto y en polvo de antocianina de uvas, pero ausentes en el extracto de semillas de uvas.

TABLA 2

2

TABLA 3

3

Ejemplo 4 Solubilización de quercetina por calentamiento de sólido de quercetina en exceso con soluciones acuosas de tres preparados comerciales diferentes de antocianinas obtenidas de uvas, zanahorias negras y berzas rojas

La finalidad de la investigación fue la de comparar la capacidad de la antocianina de diferentes fuentes para solubilizar quercitina.

El procedimiento fue como sigue: la antocianina de uva se obtuvo en Phytone Ltd, UK (tal como se utilizó en el Ejemplo 2). La antocianina de zanahorias negras y de berzas rojas se obtuvo en Overseal Ltd, Swadlincote Derbyshire UK. Los contenidos en antocianina de cada polvo se midieron de acuerdo con el método de Niketic-Aleksic et al (como en el Ejemplo 3).

Se prepararon soluciones de las antocianinas en agua con concentraciones de 2,5 a 30 mg/ml para la uva, 15-40 mg/ml para la zanahoria negra y 25-150 mg/ml para la berza roja. A 20 ml de solución se añadieron 50 mg de sólido de quercetina dihidratada y la mezcla se calentó durante 1 minuto en un horno de microondas como anteriormente, se enfrío a temperatura ambiente y se centrifugó a 2000 x g durante 30 minutos. Se diluyeron con agua 1:9 partes alícuotas con y sin quercetina y se leyó la densidad óptico a 375 nm. La concentración de quercetina se midió por la diferencia de densidad óptica entre soluciones con y sin quercetina como anteriormente. Como se muestra en las figuras 5 a 7, la quercetina fue más soluble en las tres soluciones de antocianinas que agua únicamente y el efecto fue sustancialmente lineal con el incremento de las concentraciones de polvo de antocianina. El contenido en antocianina de los tres polvos fue como sigue: uva, 3,94 g/100 g; zanahoria negra, 1,21 g/100 g; berza roja, 2,51 g/100 g.

Los resultados demuestran que la mayor solubilidad de quercetina en antocianinas es un fenómeno general y no limitado únicamente a las antocianinas de uva, sino que puede obtenerse con otro material comestible adecuado que contenga antocianinas.

Ejemplo 5 Solubilización de quercetina en una solución acuosa de cloruro de malvina por adición de una solución etanólica de quercetina

Las antocianinas se pueden dividir en dos clases principales: las antocianinas monoméricas y las antocianinas poliméricas. Un ejemplo típico de una antocianina monomérica es cloruro de malvina, una sal del ion oxonio malvidina-3-glucosa y el ion cloruro. Se puede obtener en un alto estado de pureza (Indofine Inc, USA) y, por tanto, se puede emplear para determinar el efecto solubilizante de un monómero de antocianina. El procedimiento fue como sigue: se disolvió cloruro del malvina (2,2 mg) en 2 ml de tampón de citrato (pH 3,0); como control se utilizó 1 ml. Al otro ml se añadió gradualmente 0,25 \mul de etanol conteniendo 5 mg/ml de quercetina dihidratada. Al control se añadieron cantidades iguales de etanol. Cada solución fue diluida (1:9) con etanol acuoso al 5% y se determinó la densidad óptica a 275 nm. La concentración de quercetina se calculó como en los ejemplos anteriores.

Como se muestra en la figura 8, se añadieron hasta 1000 \mug de quercetina a 1 ml de cloruro de malvina. Con 750 \mug de quercetina no apareció precipitado de quercetina, pero se presentó un precipitado ligero a 1000 \mug el cual fue separado por centrifugado. La concentración de quercetina en cloruro de malvina fue lineal hasta 750 \mug.

A esta concentración de etanol añadido (20% p/p) la quercetina es soluble en el grado de 13 mg/l. De este modo, bajo estas condiciones, la quercetina resulta extremadamente soluble por la presencia de cloruro de malvina, aunque es muy posible que la solución se super-sature puesto que, tras el reposo a 4ºC, se presentó un precipitado grande.

Ejemplo 6 Comparación de la solubilización de quercetina, quercitrina y rutina por calor en soluciones de antocianina de uvas y cloruro de malvina

La quercetina es una flavonol aglicona. En zumos de frutas existe como el glicósido. La finalidad de la investigación fue la de examinar la solubilización de glicósidos de flavonoles por las antocianinas. Los tres flavonoles estudiados fueron quercetina dihidratada, quercitrina (quercetina 3-L-ramnósido, C_{21} \cdot H_{20} \cdot O_{11}, FW 448,4 Sigma UK y rutina (quercetina 3\beta-D-rutinósido dihidratado, C_{27} \cdot H_{30} \cdot O_{16}, FW 610,5, Sigma UK).

El procedimiento fue como sigue: a 1 ml de antocianina de uvas (20 mg/ml) en agua se añadieron 2,5 mg del flavonol y la mezcla se calentó durante 1 minuto en un horno de microondas, se enfrío, se centrifugó y se midió la densidad óptica del sobrenadante a 375 nm. Antes de la lectura se diluyeron muestras en agua 1:9. De manera similar se trataron partes alícuotas de antocianina y agua con y sin el flavonol.

Las concentraciones de flavonol expresadas como mg/l de quercetina aglicona se calcularon a partir de las diferencias entre la solución con y sin el flavonol añadido, como anteriormente.

Se utilizó el mismo procedimiento para medir la solubilidad de los flavonoles en cloruro de malvina. En este caso, se disolvieron 1,8 mg de cloruro de malvina en 2 ml de tampón de citrato a pH 3. A 1 ml se añadieron 2 mg del flavonol y el otro ml actúo como control. Después de calentar, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se centrifugó y el sobrenadante se diluyó 1:1 con etanol acuoso al 50%. Las densidades ópticas se midieron a 375 nm.

Como se muestra en la Tabla 4, la solubilidad de quercitrina y rutina en agua fue mucho mayor que la de quercetina. La solubilidad de todos los flavonoles aumentó en presencia de antocianina de uvas y cloruro de malvina. Esto demostró que los glicósidos de quercetina eran más solubles en soluciones de antocianina que en agua. Además, la mayor solubilidad pudo apreciarse también con un monómero de antocianina pura, cloruro de malvina.

TABLA 4

4

Ejemplo 7 Preparación de la composición a partir de un vino tinto que contiene una baja concentración de flavonoles y rico en flavonol puro

El vino tinto tratado fue la variedad francesa de Cabernet Sauvignon. Contenía 1,8 g/l de polifenoles. El contenido en flavonol (calculado como la aglicona) fue de 8,8 mg/l (miricetina glicósidos 1,1 mg/l, quercetina glicósidos 5,4 mg/l, mirecetina 1 mg/l, quercetina 1 mg/l).

El polvo que contiene los polifenoles se preparó como sigue: 1 l de vino tinto se filtró, se evaporó rotativamente bajo presión reducida a 76ºC durante 1 minuto, se enfrió, se evaporó entonces rotativamente bajo presión reducida a 55ºC hasta que el volumen se redujo a 150 ml aproximadamente. Se pesaron 50 g de resina Diaion™ (Supelco, UK) en vaso de precipitados cubierto con metanol y se dejó en reposo durante 15 minutos. El metanol se separó por decantación y se sustituyó por agua. Después de reposar durante 10 minutos, la resina se apiló en una columna de vidrio (llenado de la columna hasta la mitad) y se lavó con agua.

El concentrado de vino se aplicó a la columna, seguido por un lavado con agua (300 ml). Los polifenoles fueron eluidos con etanol al 50%. Si inició la recogida a medida que la fracción de color comenzó a salir de la columna y se finalizó cuando el eluado estaba libre de color (después de haberse utilizado un total de 500 ml de etanol al 50%). El contenido fenólico del eluado en este punto se encontró en una concentración de 0,1 mg/l tal como se determinó por el método Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi 1965 Amer. J. Enol. & Viticulture 16 144-158).

La fracción fenólica se redujo por evaporación rotativa a 50ºC a 120 ml aproximadamente y ésta se liofilizó para proporcionar la muestra final. El rendimiento en polvo fue de 2,24 g/l con un contenido en polifenoles de 45%. El contenido en flavonol fue sólo de 4,5 mg de aglicona/g de polifenoles (0,45% p/p).

La fortificación del polvo de polifenol con flavonol puro se efectuó como sigue: se disolvieron 400 g del polvo de polifenol en 10 l de agua desionizada. La quercetina dihidratada (Sigma, UK) que ascendía a 12 g se disolvió en 3,5 l de etanol y se añadió a lo anterior para obtener una solución limpia. Se separó el alcohol mediante un evaporador rotativo bajo vacío y el residuo se liofilizó para proporcionar un sólido con un contenido en humedad de 3-4%, el cual era libremente soluble en agua.

Ejemplo 8 Efecto de la adición de quercetina a un preparado de polifenoles de vino tinto y administración de dicha mezcla a voluntarios

La finalidad de esta investigación fue la de comparar los efectos de los polifenoles de vino tinto con y sin quercetina añadida sobre la capacidad antioxidante de plasma (FRAP) en voluntarios. Intervinieron 13 hombres sanos con una edad de 35 a 65 años no fumadores y que consumieron una dieta UK estándar en un estudio privado y confidencial. Dos semanas antes del estudio, los voluntarios interrumpieron el consumo de vino. A todos los voluntarios se les pidió que mantuvieran su dieta y régimen de vida usual durante el estudio. Los voluntarios se dividieron en tres grupos A, B y C y durante 4 semanas tomaron una de la siguientes bebidas: A: (una bebida placebo consistente en 36,6 g de glucosa, 1,1 g de ácido cítrico, 0,38 g de aromatizante de zanahoria negra, 0,38 g de citrato trisódico) en 300 ml de agua. B: una bebida placebo como en A conteniendo 1 g de polifenoles de vino tinto, preparados como en el Ejemplo 7, o C: una bebida placebo como en A conteniendo 1 g de polifenol de vino tinto + 30 mg de quercetina (preparada como en el Ejemplo 7). La prueba comenzó en el mes de noviembre y finalizó en diciembre.

Se tomaron muestras de sangre en K3 EDTA (1mmol/l) 12 horas después de su supercomida antes y después del consumo de las bebidas durante 4 semanas. Las muestras fueron centrifugadas a 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC para obtener plasma.

La capacidad antioxidante total del plasma se determinó por el análisis Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) (Benzie and Strain, 1996 Analytical Biochem 239, 70-76) en plasma reciente. La estimación se realizó en el mismo día.

Como se muestra en la Tabla 5, se presentó un descenso del 10% en la capacidad antioxidante con la bebida placebo y un descenso del 1% con el polvo de polifenoles de vino tinto, y un incremento del 6% con el polvo de polifenoles con quercetina incorporada.

Se llegó a la conclusión de que la suplementación de quercetina mezclada con polifenoles de vino tinto conteniendo antocianina produjo un incremento de la capacidad antioxidante mayor que la producida por los polifenoles de vino tinto por sí solos o por la bebida placebo. Además, la bebida fue fortificada con un flavonol presente en una forma soluble en agua.

TABLA 5

5

Claims (24)

1. Método para incrementar la solubilidad en agua de una composición que comprende quercetina aglicona, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una composición que contiene quercetina aglicona; proporcionar una composición que contiene antocianina; y mezclar las dos composiciones.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la composición que contiene antocianina comprende un zumo de frutas o un extracto de hortalizas.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde la composición que contiene antocianina se obtiene del grupo consiste en: uvas; arándanos; moras negras; y zanahorias negras.

4. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde la composición que contiene antocianina se obtiene a partir de vino o de vino sin alcohol.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la antocianina se elige del grupo consistente en: malvidina, cianidina, delfinidina, paeonidina, pelargonidina, antocianinas poliméricas, leucocianidinas y glicósidos de las mismas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde, a una solución acuosa de antocianina, se añade y se disuelve una composición que contiene quercetina aglicona.

7. Método según la reivindicación 6, en donde la solución acuosa comprende antocianina disuelta en una concentración de al menos 10 mg/l.

8. Método según la reivindicación 6, en donde la solución acuosa comprende antocianina disuelta en una concentración de al menos 50 mg/l.

9. Método según la reivindicación 6, en donde la solución acuosa comprende antocianina disuelta en una concentración de al menos 100 mg/l.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde una mezcla, preparada por adición de una composición que contiene quercetina aglicona sólida a una solución acuosa de antocianina, se calienta por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo, por encima de 20ºC) para facilitar la disolución del componente de quercetina aglicona; se enfría; y cualquier quercetina aglicona sin disolver que permanezca se separa por filtración y/o centrifugado.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se disuelve una composición que contiene quercetina aglicona sólida en etanol o en una composición etanólica y se añade a una solución acuosa que comprende antocianina.

12. Método según la reivindicación 1, en donde la composición que contiene quercetina aglicona se añade y se disuelve en un vino o vino sin alcohol que comprende una antocianina.

13. Método según la reivindicación 1, en donde la composición que contiene quercetina aglicona se añade y se disuelve en un zumo de frutas o extracto de hortalizas que contiene antocianina.

14. Método según la reivindicación 1, en donde la composición que contiene quercetina aglicona se mezcla con un zumo seleccionado del grupo consistente en zumos de uva; mora negra; y zanahoria negra.

15. Método de preparación de una composición seca que comprende un componente de quercetina soluble en agua, comprendiendo el método la realización del método de la reivindicación 6 y el secado de la solución resultante.

16. Método según la reivindicación 15, cuya realización produce una composición seca que comprende al menos 0,1% de quercetina.

17. Método según la reivindicación 15, cuya realización produce una composición seca que comprende al menos 1% de quercetina.

18. Método según la reivindicación 15, cuya realización produce una composición seca que comprende al menos 5% de quercetina.

19. Método según la reivindicación 15, cuya realización produce una composición seca que comprende al menos 10% de quercetina.

20. Método para proporcionar una solución acuosa que comprende quercetina disuelta en una concentración mayor de 10 mg/l, comprendiendo el método las etapas de mezclar, en cualquier orden, agua, una composición que comprende quercetina aglicona, y una antocianina; y formar una solución acuosa a partir de la mezcla, comprendiendo la solución la quercetina disuelta en una concentración mayor de 10 mg/l.

21. Método según la reivindicación 20, en donde la solución comprende quercetina disuelta en una concentración mayor de 20 mg/l.

22. Método según la reivindicación 20, en donde la solución comprende quercetina disuelta en una concentración mayor de 50 mg/l.

23. Método según la reivindicación 20, en donde la solución comprende quercetina comprende disuelta en una concentración mayor de 100 mg/l.

24. Método según la reivindicación 20, en donde la solución acuosa está esencialmente libre de etanol.