ES2230537T3 - Una tirosina quinasa de tipo receptor (quinasa de tipo eph/elk hunaba-henki y uso de la misma. - Google Patents

Una tirosina quinasa de tipo receptor (quinasa de tipo eph/elk hunaba-henki y uso de la misma.

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ES2230537T3 ES92913639T ES92913639T ES2230537T3 ES 2230537 T3 ES2230537 T3 ES 2230537T3 ES 92913639 T ES92913639 T ES 92913639T ES 92913639 T ES92913639 T ES 92913639T ES 2230537 T3 ES2230537 T3 ES 2230537T3
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Larry David Ward
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA QUINASA DE TIROXINA DE TIPO RECEPTOR AISLADA, DICHA QUINASA DE TIROXINA SE CARACTERIZA POR, EN LA FORMA QUE SE PRODUCE DE FORMA NATURAL, POR SER REACTIVA CON LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES III.A4, QUE TIENEN UN PESO MOLECULAR APARENTE DE APROXIMADAMENTE ENTRE 120 Y 150KD EN SU FORMA GLICOSILADA Y POR TENER UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO DE TERMINAL N QUE COMPRENDE E L I P Q P. MAS PARTICULARMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A LA QUINASA HUMANA SIMILAR AL EPH/ELK (HEK)

Description

Una tirosina quinasa de tipo receptor [quinasa de tipo eph/elk humana-HEK] y uso de la misma.
La presente invención se refiere, en general, a una nueva tirosina quinasa de tipo receptor y a secuencias genéticas que la codifican.
Las tirosina quinasas constituyen una clase importante de moléculas implicadas en la regulación del crecimiento y la diferenciación (1). Un modo de comprobar este papel derivó de la identificación de receptores que se unen a factores de crecimiento solubles conocidos. Se demostró que los receptores para el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (2), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (3) y el factor estimulante de colonias-1 (CSF-1) (4) eran moléculas transmembrana codificando las regiones citoplásmicas un dominio catalítico tirosina quinasa. El receptor de CSF-1 es homólogo al receptor de PDGF tanto en el dominio catalítico como en el dominio extracelular (1, 5). El dominio extracelular de estas proteínas se distingue de otras tirosina quinasas por la presencia de repeticiones de tipo inmunoglobulina (1, 6). Basándose en las propiedades estructurales del dominio quinasa, la proteína c-kit se identificó como otro miembro de esta familia (7). El locus del gen c-kit parece no respaldar los defectos en el ratón W/W anémico congénitamente (8-10). Ahora se ha identificado el ligando (11-14) y se ha demostrado que se codifica por el locus S1. El locus es anormal en el ratón Steel (15) que tiene defectos idénticos a los del ratón W/W, pero codifica un gen c-kit normal.
La otra línea de evidencia de un papel crítico de proteínas tirosina quinasas en el control del crecimiento procede del estudio de oncogenes virales (16-17). Se demostró que estos genes estaban implicados directamente en la desregulación del crecimiento por observaciones de un cambio en el crecimiento celular después de la introducción de ADN que codificaba estos genes en fibroblastos. Se ha demostrado que todos los oncogenes tienen homólogos celulares próximos (proto-oncogenes). Uno de los primeros oncogenes identificados fue v-src, el homólogo celular (c-src) es el representante prototipo de la familia de tirosina quinasas citoplásmicas que, después de la miristilación, se asocian con la cara interna de la membrana celular (18). Dentro del sistema hemopoyético se han definido varias quinasas de tipo src con restricción de linaje (19).
Se ha demostrado que la quinasa de tipo src asociada a células T, lck, se asocia independientemente con glicoproteínas transmembrana tanto CD4 como CD8 para formar un complejo de señalización (20, 21). Por el contrario,
v-erb-B y v-fms, al igual que sus homólogos celulares, el receptor de EGF y el receptor de CSF 1, respectivamente, son moléculas transmembrana que codifican la maquinaria de transducción de señales completa en un sólo polipéptido (1, 17).
Un análisis detallado de las secuencias de aminoácidos de estas proteínas ha revelado motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (5). Tanto las tirosina quinasas como las serina-treonina quinasas tienen una secuencia consenso GXGXXG que se encuentra en muchas proteínas de unión a nucleótidos (5). Unos motivos de secuencia conservados se comparten por los dos tipos de quinasa, mientras que otros son específicos para los subgrupos de tirosina quinasas o treonina-serina quinasas (5). Las tirosina quinasas, aunque tienen regiones de conservación de secuencia específicas de esta familia, pueden subdividirse adicionalmente de acuerdo con las características estructurales de las regiones 5' con respecto al dominio catalítico (1, 4-7). La nueva tirosina quinasa de la presente invención presenta las mismas características generales que las tirosina quinasas conocidas
previamente.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva tirosina quinasa de tipo receptor que se identifica como un miembro de la familia eph/elk de tirosina quinasas (22, 23). El nuevo receptor de tirosina quinasa se denomina HEK ("quinasa de tipo eph/elk humana"). Como los presentes inventores han identificado la expresión de HEK tanto en líneas celulares T como en líneas celulares pre-B, en este documento se contempla que la molécula receptora de la presente invención y/o su ligando tienen aplicabilidad particular para uso como agentes en la modulación in vivo de la producción y/o función de células pre-B, B y T.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona una tirosina quinasa de tipo receptor aislada, estando caracterizada dicha tirosina quinasa porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en la forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P.
Preferiblemente, la tirosina quinasa tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P S N E V N L X D, donde X es cualquier aminoácido y preferiblemente es L.
Más preferiblemente, la tirosina quinasa tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende los aminoácidos:
E L I P Q P S N E V N L X D (S) K X^{1} I Q, donde X y X^{1} son cualquier aminoácido y preferiblemente L y T, respectivamente.
Incluso más preferiblemente, la tirosina quinasa comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 o cualquier parte o porción de la misma, o tiene una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos un 30% con la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 y tiene las características de identificación de HEK. Más preferiblemente, el grado de homología es de al menos un 40%, aún más preferiblemente de al menos un 55%, incluso más preferiblemente de al menos un 70% y aún más preferiblemente mayor que un 80%.
El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal III.A4 se depositó en Public Healt Laboratory Service, European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down Salisbury, UK, el 20 de junio de 1991, con el número de acceso 91061920.
El término "aislado", como se usa en relación con la tirosina quinasa de la presente invención, incluye una preparación biológicamente pura que comprende al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 60% e incluso más preferiblemente al menos un 80% de la proteína con respecto a otras moléculas, como se determina por peso, actividad u otro medio conveniente. El término también incluye cualquier forma de la proteína que no esté en estado natural tal como, pero sin limitación, una preparación de membranas que contienen la proteína, una preparación de la proteína separada de la membrana o un fluido sobrenadante que comprende dicha proteína. La preparación puede estar glicosilada, parcialmente desglicosilada o completamente desglicosilada o puede tener un modelo de glicosilación alterado del modelo natural.
La tirosina quinasa de la presente invención se expresa en varios tumores de origen humano. En particular, en este documento se presentan datos que muestran la expresión de HEK en líneas celulares de tumores linfoides humanos LK63, Lila-1, JM, MOLT4 y HSB-2, y el tumor epitelial humano HeLa. Sin embargo, un especialista en la técnica reconocerá inmediatamente que pueden existir quinasas similares u homólogas en células no tumorales o en tumores no humanos, y que estas quinasas tienen propiedades similares a la tirosina quinasa de la presente invención. Por ejemplo, los resultados contenidos en este documento muestran alguna expresión de HEK en músculo cardíaco. Por consiguiente, la presente invención incluye una tirosina quinasa funcional y estructuralmente similar en todos los aspectos a la tirosina quinasa descrita en este documento, incluyendo una quinasa de origen no
tumoral.
La presente invención incluye preparaciones que comprenden la forma natural de la proteína tirosina quinasa, incluyendo cualquier forma derivada natural de la misma, así como formas sintéticas y recombinantes de la proteína, incluyendo cualquier substitución, deleción y/o inserción de un solo o de múltiples aminoácidos, en la porción polipeptídica de la quinasa, y análogos y homólogos de la misma. Tales alteraciones de aminoácidos en la molécula son ejemplos de mutantes recombinantes o sintéticos y derivados de la quinasa.
Las inserciones incluyen fusiones de aminoácidos y/o carboxilo terminales, así como inserciones dentro de la secuencia de un solo o de múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxilo terminal, del orden de, por ejemplo, 1 a 4 restos. Son variantes insercionales de secuencias de aminoácidos aquellas en las que se introducen uno o más restos aminoacídicos en un sitio predeterminado de la proteína. Las variantes de deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de substitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto de la secuencia y se ha insertado en su sitio un resto diferente. Tales substituciones generalmente se realizan de acuerdo con la siguiente tabla 1.
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TABLA 1
Resto Original Substituciones Ejemplares
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Ile
TABLA 1 (continuación)
Resto Original Substituciones Ejemplares
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Generalmente, los aminoácidos se reemplazan por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como hidrofobia, hidrofilia, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas, etc.
Las substituciones de aminoácidos típicamente son de un solo resto; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1-10 restos aminoacídicos; y las deleciones variarán de aproximadamente 1 a 20 restos. Las deleciones o inserciones preferiblemente se realizan en pares adyacentes, es decir, una deleción de dos restos o una inserción de dos restos.
Las variantes de aminoácidos mencionadas anteriormente pueden obtenerse fácilmente usando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield; J. Am. Chem. Soc., 85; p2149, 1964) y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones de substitución en sitios predeterminados de un ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis de M13. La manipulación de secuencias de ADN para producir proteínas variantes que se manifiestan como variantes de substitución, inserción o deleción es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Maniatis et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Otros ejemplos de mutantes recombinantes o sintéticos y derivados de la proteína tirosina quinasa de esta invención incluyen substituciones, deleciones y/o adiciones individuales o múltiples a cualquier molécula asociada con la quinasa, tal como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o polipéptidos. Además, es posible que la proteína tirosina quinasa de la presente invención sea una versión genéticamente alterada de una proteína similar en células normales. La presente invención, por lo tanto, incluye la proteína tirosina quinasa de origen tumoral o no tumoral y todas las formas alteradas genéticamente de la misma.
Los términos "análogos" y "derivados" incluyen cualquier equivalente químico funcional de la proteína tirosina quinasa caracterizado por su mayor estabilidad y/o eficacia in vivo o in vitro. Los términos "análogo" y "derivados" también incluyen a cualquier derivado de aminoácido de la proteína tirosina quinasa como se ha descrito
anteriormente.
Los análogos de HEK contemplados en este documento incluyen, pero sin limitación, modificaciones en cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o derivatización de la molécula y el uso de agentes de entrecruzamiento y otros métodos que imponen limitaciones conformacionales a los péptidos o sus análogos. Los ejemplos de modificaciones en las cadenas laterales contemplados por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como por alquilación reductora por reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH4; amidación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2, 4, 6 trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5'-fosfato seguido de reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidino de los restos de arginina puede modificarse por la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede modificarse por activación con carbodiimida por medio de la formación de O-acilisourea seguido de la posterior derivatización, por ejemplo, hasta una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse por métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico para dar ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida substituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; y carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Los restos de triptófano pueden modificarse, por ejemplo, por oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Por otra parte, los restos de tirosina pueden alterarse por nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo de imidazol de un resto de histidina puede realizarse por alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con un pirocarbonato de dietilo.
Los ejemplos de incorporación de aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis de proteínas incluyen, pero sin limitación, uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido
6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o isómeros D de aminoácidos.
Pueden usarse agentes de entrecruzamiento, por ejemplo, para estabilizar las conformaciones 3D, usando agentes de entrecruzamiento homo-bifuncionales tales como imido ésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores 
\hbox{(CH _{2} ) _{n} }
con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos hetero-bifuncionales que normalmente contienen un resto reactivo con amino tal como N-hidroxisuccinimida y otro grupo reactivo específico tal como un resto maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Además, los péptidos podrían estar limitados conformacionalmente, por ejemplo, por la incorporación de C_{\alpha} y N_{\alpha}-metilaminoácidos, la introducción de dobles enlaces entre los átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de aminoácidos y la formación de péptidos cíclicos o análogos por medio de la introducción de enlaces covalentes, tal como la formación de un enlace amida entre el extremo N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el extremo N o C.
Por lo tanto, la presente invención incluye péptidos o polipéptidos y aminoácidos y/o análogos químicos de los mismos que tienen las características de identificación de HEK como se describe en sentido amplio en este documento, y/o regiones de los mismos capaces o responsables de su acción en la transducción de señales o en la estimulación de respuestas celulares tales como el crecimiento y/o la diferenciación.
Por consiguiente, la referencia en este documento a la tirosina quinasa de tipo receptor de la presente invención incluye la molécula natural, formas recombinantes, sintéticas y análogas de la misma y cualquier mutante, derivado y homólogo humano y no humano de la misma. Todas tales quinasas se incluyen en el término "HEK".
La presente invención también incluye el ligando para la nueva tirosina quinasa de tipo receptor descrita en este documento y cualquier agonista y antagonista (por ejemplo, forma soluble del receptor) del enzima. Como la tirosina quinasa es una proteína oncogénica, los antagonistas del receptor tienen una relevancia particular y se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Tales antagonistas incluyen anticuerpos (monoclonales y policlonales), el propio enzima en forma soluble o de otra forma, péptidos específicos, polipéptidos o proteínas y carbohidratos, entre otros. Estos tipos de antagonistas son útiles para crear agentes antitumorales donde el crecimiento o mantenimiento del propio tumor esté soportado por la tirosina quinasa de la presente invención. Por consiguiente, la adición de una cantidad eficaz de un antagonista a la tirosina quinasa de tipo receptor asociada a tumores inhibirá, reducirá o interferirá de otra manera con la actividad receptora de la proteína y de esta manera prevendrá, reducirá y/o inhibirá el crecimiento del tumor. Por lo tanto, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más antagonistas de la tirosina quinasa descrita en este documento y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
El o los ligandos para HEK pueden seleccionarse de varias formas. En un protocolo, se selecciona un vector de expresión (por ejemplo, AP-TAG-HEK) que codifica la región extracelular entera de HEK fusionada a una molécula indicadora apropiada tal como fosfatasa alcalina. La proteína de fusión expresada en las células se recupera de los sobrenadantes celulares y se usa para teñir (usando la molécula indicadora) secciones de tejido usando los métodos descritos por Flanagan y Leder (39), cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. Una vez identificadas las fuentes celulares de ligando, estas células se usan para construir una biblioteca de expresión. Si el ligando está unido a células (por ejemplo, unido a la membrana), el vector de expresión (por ejemplo, AP-TAG-HEK) se usa para teñir el material de reserva para buscar clones positivos. Si el ligando de HEK se secreta, entonces será necesaria otra estrategia. En este caso, pueden usarse sobrenadantes de los materiales de reserva para seleccionar la inducción de la fosforilación de HEK en transfectantes LK63 o HEK.
Como alternativa, pueden usarse sobrenadantes obtenidos a partir de tejidos productores de ligando de HEK como fuente en técnicas de purificación de afinidad en columnas en las que está unido el producto de, por ejemplo,
pEE-14-HEK como un absorbente específico. La secuencia del ligando purificado se determinará y esta información se usará para clonar el ligando de HEK a partir de bibliotecas de ADNc.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un aislado de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la nueva tirosina quinasa de tipo receptor (incluyendo sus formas recombinante, sintética, mutante, derivada, análoga y homóloga). La secuencia de ácido nucleico puede comprender desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y puede existir en una forma monocatenaria o bicatenaria, sola o en combinación con un vector o una molécula de vector de expresión. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN natural, o puede ser ADNc incluyendo formas complementarias del mismo. La molécula de ácido nucleico también puede contener substituciones, deleciones y/o adiciones de uno solo o de múltiples nucleótidos con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la forma natural o recombinante de la proteína. Los vectores que contienen las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden replicarse en eucariotas y/o procariotas y pueden contener secuencias promotoras capaces de expresarse en uno o en estos dos tipos celulares. Las células adecuadas incluyen células de mamífero, insecto, levadura y/o bacterianas. Los tipos celulares particularmente preferidos incluyen CHO, baculovirus y células E. coli. La secuencia de nucleótidos preferida que comprende HEK se indica en la figura 1. Las técnicas generales de tecnología de ADN recombinante, incluyendo el aislamiento de proteínas recombinantes, son bien conocidas y se describen, por ejemplo, en Maniatis et al (supra).
Esta invención también proporciona una célula transgénica o cultivo celular que lleva un aislado de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente.
En otro aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una forma soluble de la tirosina quinasa de tipo receptor como se describe en sentido amplio en este documento, comprendiendo además dicha composición uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Esta invención también incluye métodos de uso de la nueva tirosina quinasa de tipo receptor de esta invención y de antagonistas de la unión de ligandos a esta tirosina quinasa.
En un aspecto, esta invención incluye un método para reducir los efectos de interacción o unión entre HEK y su ligando en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz del antagonista de la unión de un ligando a la tirosina quinasa de esta invención.
La invención también incluye un método para fosforilar una proteína, que comprende poner en contacto una preparación de dicha proteína con una cantidad eficaz de la tirosina quinasa de tipo receptor de esta invención durante un periodo de tiempo y en condiciones suficientes como para efectuar la fosforilación de la proteína.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para investigar la unión de un ligando a la tirosina quinasa de tipo receptor de esta invención en células o tejidos, que comprende poner en contacto la tirosina quinasa fusionada a una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable en la muestra de tejido o células a ensayar durante un periodo de tiempo y en condiciones suficientes como para que la tirosina quinasa fusionada se una a un ligando en dicha muestra de tejido o células, y después detectar la molécula indicadora.
La invención también proporciona un método para seleccionar un ligando soluble para la tirosina quinasa de tipo receptor de esta invención, que comprende poner en contacto una muestra a ensayar con una línea celular capaz de expresar la tirosina quinasa e investigar la fosforilación en dicha línea celular.
Sin embargo, un especialista en la técnica reconocerá inmediatamente que pueden realizarse una diversidad de mutaciones, derivados o alteraciones químicas en la secuencia para codificar, por ejemplo, los análogos y derivados descritos anteriormente.
La presente invención también incluye moléculas de ácido nucleico cortas que pueden actuar como sondas de ácido nucleico para investigar la presencia del gen de HEK o mutaciones del mismo.
La presente invención se describe adicionalmente haciendo referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.
En las figuras:
La figura 1 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia codificante de HEK con la secuencia parcial 3' y 5' no traducida. Los números de la derecha indican las posiciones de los nucleótidos y los números situados encima de los aminoácidos se refieren a la secuencia de aminoácidos. Un solo subrayado indica el supuesto péptido señal. Un subrayado doble indica la supuesta región trans-membrana. Una línea superior de trazos indica identidad entre la secuencia de aminoácidos prevista y la secuencia obtenida a partir de la proteína HEK purificada. Los triángulos indican sitios potenciales de N-glicosilación dentro del dominio extracelular. Los puntos indican el supuesto sitio de unión a ATP. Los rombos indican un supuesto sitio de autofosforilación. Los asteriscos indican codones de parada.
La figura 2 es una representación que muestra la alineación de la secuencia proteica de HEK con elk, un gen relacionado dentro de la familia eph/elk. La alineación se realizó usando el programa GAP. Las posiciones de aminoácidos están numeradas a la derecha. Los puntos en la secuencia indican huecos introducidos para optimizar la alineación. Las líneas de trazos indican identidad entre aminoácidos. Los asteriscos indican codones de parada. Los puntos por encima de la línea de los aminoácidos indican restos que contribuyen a las dos repeticiones de homología con la fibronectina de tipo III, dentro de las regiones C-terminales de los dominios extracelulares. Los triángulos por encima de la línea de aminoácidos destacan restos de cisteína conservados dentro de la región N-terminal.
La figura 3 es una representación fotográfica que muestra la expresión de HEK en células COS. El clon de ADNc de 4,5 kb de HEK se subclonó en el vector de expresión CDM8. Se transfectaron células COS con esta construcción usando DEAE-dextrano/cloroquina y DMSO. Dos días después de la transfección, las células se tiñeron in situ con el MAb IIIA4 seguido de Ig de oveja anti-ratón conjugada con FITC y se fotografiaron bajo microscopía óptica (panel A), o microscopía de fluorescencia (panel B). Se utilizaron 400 aumentos.
La figura 4 es una representación fotográfica del análisis de transferencia de Northern de la expresión de HEK en líneas celulares. Se fraccionó poli (A) + ARN de líneas celulares humanas en un gel de agarosa/formaldehído y se transfirió a una membrana extra Hybond-C. El filtro se hibridó con ADNc de 4,5 kb de HEK (panel superior). El mismo filtro se hibridó con GAPDH como control cuantitativo (panel inferior), REH, NALM-1 y FAKEM son líneas celulares leucémicas pre-B. BALL-1 es una línea celular leucémica B temprana. RAMOS es una línea celular leucémica B madura. HSB-2, HPB-ALL y JM son líneas celulares leucémicas T.
La figura 5 es una representación fotográfica que muestra el análisis de transferencia de Northern de la expresión de HEK en líneas celulares. Se sondeó poli A^{+} ARN procedente de líneas celulares humanas con respecto a la expresión de HEK como se ha indicado anteriormente. Molt 4 es una línea de células T inmaduras. RC2a, HL60 y U937 son líneas de células mielomonocíticas. En este experimento, se extrajo ARN a partir de HL60 y U937 después del tratamiento de las células con acetato tetradecanoil forbol mirístico (TPA), un activador de la proteína quinasa C. U266 es una línea de células B maduras.
La figura 6 es una representación fotográfica que muestra el análisis de Northern de la expresión de HEK en tejidos post-mortem adultos. Se adquirió una transferencia de Northern de múltiples tejidos en el mercado y se sondeó con respecto a la expresión de HEK en condiciones sugeridas por el fabricante (Clontech). La banda de 1,3 kb que aparece en páncreas es demasiado pequeña como para representar un transcrito de una forma secretada de HEK y probablemente se debe a hibridación cruzada.
La figura 7 es una representación fotográfica que muestra el análisis de transferencia de Southern de HEK en líneas celulares y ADN de células de sangre periférica humana normales. Las muestras se digirieron con Hind III (calles
1-3) o Bam HI (calles 4-6), se procesaron en un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a una membrana Zetaprobe. La membrana se hibridó con un fragmento de 1,1 kb de HEK que se extendía desde los nucleótidos 1.109 a 2.241 (véase la fig. 1). Las calles 1 y 4, sangre periférica normal; calles 2 y 5, células LK63; calles 3 y 6, células LK63/CD20+.
La figura 8 es una representación fotográfica que muestra hibridación in situ. El producto de PCR de HEK de -1,1 kb mencionado anteriormente se tradujo con muesca con biotina-14-dATP e hibridó in situ, a una concentración de sonda de 5 ng/\mul, con metafases de dos individuos normales del sexo masculino. Los cromosomas se tiñeron antes del análisis con yoduro de propidio (como tinte de contraste) y DAPI (para la identificación de los cromosomas).
La figura 9 es una representación gráfica que muestra un análisis de hidropatía (longitud: 25) del producto de traducción previsto del ADNc de HEK 4.5. El eje Y indica un índice hidropatía, apareciendo los restos hidrófobos por encima del origen y los restos hidrófilos por debajo. Los ÁA (aminoácidos) que constituyen el producto traducido del ADNc de HEK se numeran a lo largo del eje X de 1-983.
Ejemplo 1 1. Materiales y Métodos Líneas celulares, estructura y función de la proteína HEK por el Mab III4
Las líneas celulares LK63 y LK63/CD20+ se obtuvieron a partir de un niño con leucemia linfoblástica aguda. LK63/CD20+ es una variante tetraploide de LK63, que aparece espontáneamente in vitro y tiene una expresión de HEK potenciada. A diferencia de la línea celular parental, LK63/CD20+ expresa CD20. Estas líneas tienen características citogenéticas de leucemia de células pre-B y no se han transformado con el virus de Epstein-Barr (24). JM y HBS-2 son líneas celulares leucémicas de células T humanas CD8+.
Se generó el Mab IIIA4 contra la línea celular LK63 y se descubrió que reconocía una molécula de la superficie celular del 135 kD (HEK) con actividad quinasa in vitro expresada por LK63, LK63/CD20+ y JM (25).
El Mab IIIA4 se usó para purificar el antígeno HEK para la secuenciación de aminoácidos (25). Las secuencias de aminoácidos obtenidas fueron las siguientes, donde los restos dudosos están entre paréntesis y los restos no identificados están marcados como X: N-terminal-ELIPQPSNEVNLXD(S)KXIQ; interno- GYRLPPPMDCPAALYQLMLDC.
Construcción e investigación de la biblioteca de ADNc de LK63
Se construyó una biblioteca de ADNc cebada con cebadores aleatorios en \lambdagt10 (Amersham) usando 5 \mug de ARNm seleccionado con poli A+ procedente de células LK63/CD20+. Se diseñó un oligonucleótido degenerado basándose en la secuencia de la proteína (3') HEK interna. Se incluyó la base neutra inosina en las posiciones de alta degeneración de codones (26). El 51 mero:
30
se marcó terminalmente usando \gamma32P-desoxiadenosina trifosfato (ATP) y polinucleótido quinasa, seguido de separación en una columna G25 Sephadex como se ha descrito anteriormente (27). Se seleccionaron en tampón de hibridación aproximadamente 250.000 placas en 2xSSC (SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M) a 37ºC, como se ha descrito previamente (27). Los lavados se realizaron en 2xSCC/dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,1% p/v a 42-55ºC. La señal de una placa de duplicación persistía después de 55 lavados. El ADN de esta placa contenía un inserto de 2,5 kb (HEK 2.5). HEK 2.5 se marcó con \alpha^{32}P-ATP (kit de cebadores aleatorios de Amersham) para el análisis de transferencia de Northern de células LK63. Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando HEK 2.5 y cebadores oligonucleotídicos basados en motivos conservados dentro del dominio catalítico de PTK y la secuencia de aminoácidos 3' de HEK, como se ha descrito previamente (28). HEK 2.5 se marcó con \alpha^{32}P-ATP (como se ha indicado anteriormente) y se usó para reseleccionar la biblioteca de ADNc de LK63 cebada aleatoriamente en tampón de hibridación 2xSSC a 65º. Se aislaron treinta y dos positivos con respecto a la duplicación y se seleccionaron por hibridación con un oligonucleótido degenerado basado en la secuencia N-terminal de la proteína HEK. Se eligió un clon de HEK de 4,5 kb (HEK 4.5) que hibridaba con el oligonucleótido N-terminal para la caracterización completa.
Secuenciación de ADN y análisis de ADNc de HEK
HEK 4.5 se subclonó en pGEM7 que se había digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Se purificó ADN bicatenario en un gradiente de cloruro de cesio y se usó como plantilla en reacciones de secuenciación de terminación de cadena didesoxi (29). Se usaron cebadores oligonucleotídicos con sentido y anti-sentido para completar la secuenciación con ADN polimerasa de T7 (Promega). La alineación de la secuencia de la proteína se realizó usando el programa GAP (University of Wisconsin, Genetics Computer Group).
Expresión de HEK en células COS
Los extremos del inserto EcoRI de HEK 4.5 se hicieron romos con ADN polimerasa I de Klenow y dATP más dTTP, seguido de unión a adaptadores BstXI. El inserto adaptado se unió a CDM8 digerido con BstXI (30). Se prepararon construcciones con sentido y antisentido y se utilizaron para transfectar células COS usando DEAE-dextrano/cloroquina con dimetil sulfóxido (DMSO) (17). Dos días después de la transfección, las células COS se tiñeron con IIIA4 seguido de inmunoglobulina (Ig) de oveja anti-ratón conjugada con (FITC) y conjugada con isotiocianato de fluoresceína (Silenus) y se examinaron con un microscopio de fluorescencia.
Análisis de transferencia de Northern y de Southern de las líneas celulares
Se aisló ARNm seleccionado con poli A+ como se ha descrito previamente (31) y se fraccionó en un gel de formaldehído/agarosa al 1% antes de la transferencia a una membrana extra HybondC (Amersham). Los filtros se sondearon con HEK 4.5 y posteriormente con un inserto de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control. Se preparó ADN por lisis con clorhidrato de guanidina (32), se transfirió a membranas Zetaprobe y se hibridó en condiciones sugeridas por el fabricante (Bio-Rad). Para minimizar la hibridación cruzada con otras tirosina quinasas en análisis de Southern de ADN genómico, se usó PCR para generar una sonda de HEK de 1,1 kb que abarcaba una región menos conservada de la molécula (nucleótidos 1.109 a 2.241, fig. 1). El autorradiograma de la transferencia de Southern se digitalizó usando el programa MacScan en un ordenador Macintosh IIx.
Análisis de Scatchard de la unión de IIIA4 a líneas celulares
Se realizó la unión de IIIA4 marcado con ^{125}I a líneas celulares en competición con IIIA4 no marcado como se ha descrito previamente (33).
Análisis de proteínas
La proteína HEK se sometió a un análisis de hidrofobia como se describe por Kyte y Doolittle (40). Los resultados se muestran en la figura 9.
Oligos para construir vectores de expresión que codifican variantes del dominio extracelular de HEK
El cebador HEK5'/92 tiene la siguiente secuencia:
1
Los sitios BamH1 y EcoR1 están indicados por encima de la secuencia y la porción subrayada corresponde a las posiciones 86 a 102 de la secuencia indicada en la figura 1.
El cebador HEK/EE14/92 tiene la secuencia:
2
La porción subrayada después del codón stop es la secuencia invertida y complementada de los nucleótidos 1710-1725 de la figura 1.
3
La secuencia subrayada, cuando se invierte y se complementa, corresponde a los nucleótidos 1708-1723 de la secuencia de la figura 1 y no contiene el codón de parada, lo cual permite la lectura desde el sitio BamH1.
Condiciones de PCR
La PCR se realizó con Taq polimerasa en condiciones convencionales usando pGEM7-HEK purificado con CsCl, que contiene el ADNc de HEK de longitud completa como plantilla. Tiempos y temperaturas de los ciclos:
60' a 97ºC
60' a 55ºC
90' a 73ºC
la reacción se realizó durante diez ciclos.
1. El producto de PCR de 1,7 kb de HEK5'/92 y HEK/EE14/92 se purificó usando Geneclean, se digirió con Eco R1 y BamH1 y se clonó entre el sitio Eco R1 y Bcl I de pEE14 (obtenido en Celltech, Berkshire, UK).
El análisis mostró el inserto de 1,7 kb previsto en los clones que se denominaron "pEE14-HEK".
2. El producto de PCR de 1,7 kb de 5'HEK5'/92 y HEK/TAG/3' se digirió con BamH1, se clonó en el sitio BglII de AP-Tag-1, Flanagan & Leder (39). Usando SnaB1, pudo determinarse el sentido de los clones hacia clones fusionados con la orientación correcta. Los clones resultantes se denominaron AP-TAG-HEK.
Expresión
pEE14-HEK se utilizó para transfectar células CHO y se seleccionaron líneas con metionina sulfoxima.
AP-TAG-HEK se usó para transfectar células 3T3 con pSV2 neo y se seleccionaron clones con G418.
Ejemplo 2 2.HEK Aislamiento y caracterización de clones de ADNc para HEK
Se obtuvo una señal de duplicación por la selección de aproximadamente 250.000 placas de una biblioteca de ADNc de \lambdagt10 derivada de LK63 en condiciones relajadas con un oligonucleótido de 51 unidades degenerado. Esta placa contenía un inserto de 2,5 kb (HEK2.5) que hibridaba con una sola especie de ARNm de 5,5-6,0 kb en un análisis de transferencia de Northern de líneas celulares que expresaban HEK, es decir, LK63 y JM. La PCR usando HEK 2.5 y cebadores oligonucleotídicos basados en motivos conservados dentro de los dominios catalíticos de tirosina quinasas (28), proporcionó productos de ADN del tamaño apropiado. Estos resultados indicaron que HEK 2.5 estaba truncado en el extremo 5'. Se usó HEK 2.5 para re-seleccionar la biblioteca en condiciones más rigurosas y se aisló un clon de HEK de 4,5 kb (HEK 4.5). Este clon hibridó con un oligonucleótido degenerado basado en la secuencia de la proteína N-terminal y produjo bandas de ADN de los tamaños previstos en reacciones de PCR usando los cebadores mencionados anteriormente. Estos datos indicaron que el clon de 4,5 kb probablemente contenía la región codificante de HEK completa.
En la figura 1 se muestra la secuencia de la región codificante de HEK junto con la secuencia no traducida parcial 3' y 5'. Una fase de lectura abierta de 2.952 nucleótidos se extiende desde la metionina de iniciación en la posición 100 al primer codón de terminación en la posición 3051. La traducción del ADNc da como resultado una proteína prevista de 983 aminoácidos (AA). Hay una identidad entre los AA obtenidos por secuenciación de la proteína HEK purificada y el producto de AA previsto del clon de ADNc (véase la fig. 1). El peso molecular previsto de la proteína traducida (menos el supuesto péptido señal) es de 92,8 kD. Esto está de acuerdo con los resultados previos, demostrando la existencia de una proteína nuclear de aproximadamente 95 kD en células LK63 tanto tratadas con tunicamicina como tratadas con endoglicosidasa (25). El producto proteico previsto del clon de ADNc de HEK tiene las características de una proteína de membrana integral de tipo 1a (35). Dos regiones predominantemente hidrófobas indican un supuesto péptido señal (AA 1-20) y un segmento transmembrana (AA 542-565). El dominio extracelular de 521 AA contiene cinco sitios positivos para la N-glicosilación. La región N-terminal (AA 21-376) del dominio extracelular es rica en restos de cisteína. La región C-terminal (AA 326-511) del dominio extracelular contiene dos repeticiones homólogas a las encontradas en la fibronectina de tipo III (36). El dominio citoplásmico (AA 566-983) de HEK contiene un sitio de unión a ATP típico (GXGXXG) en las posiciones de AA 628-633 y un supuesto sitio de autofosforilación (E/DXXYXX) en la posición 779.
La alineación de la secuencia proteica muestra un alto grado de homología entre HEK y eph, elk, eck, eek y erk en los dominios catalíticos. HEK tiene la siguiente homología de secuencia proteica total con cada uno de los tres miembros secuenciados de la familia eph RTK: (pollo) CEK 56,4%, (rata) elk 56,1%; (rata) eck (50,6%); (ser humano) eph 42,3%. La alineación de la secuencia proteica entre HEK y un HEK relativo próximo se muestra en la figura 2. La homología entre estas moléculas es mayor dentro de los dominios catalíticos. Fuera de los dominios catalíticos, numerosos motivos cortos que pueden ser de significado estructural o funcional están conservados entre HEK, eph, elk y eck, particularmente hacia el extremo N. Hay una conservación estricta del número y disposición espacial de restos de cisteína dentro de los dominios extracelulares de HEK, eph, elk y eck (34). Estos restos de citoquina se agrupan dentro de la porción N-terminal de los dominios extracelulares (36). Las regiones C terminales de los dominios extracelulares contienen repeticiones que son homólogas a las encontradas en la fibronectina de tipo III (36). HEK tiene una cisteína en la cola C terminal (AA928), en lugar de la tirosina que se conserva en esta posición entre otros miembros de la familia EPH/ELK. Esto puede ser importante, ya que la fosforilación de restos de tirosina C-terminales puede regular la actividad de la tirosina quinasa (37). Sin embargo, HEK tiene una tirosina C-terminal en la posición 937, que también parece estar en un mejor contexto para la autofosforilación (38).
Transfección y expresión de HEK en células COS
Para demostrar que el clon de ADNc aislado efectivamente codificaba la molécula reconocida por el Mab IIIA4, se subclonó HEK 4.5 en el vector de expresión CDM8 y se utilizó para transfectar células COS tanto en orientación con sentido como en orientación antisentido. Como se muestra en la figura 3, las células COS transfectadas con HEK en la orientación con sentido se tiñeron específicamente con IIIA4, confirmando que el clon de ADNc contiene la secuencia codificante completa y es idéntica a la molécula reconocida por IIIA4. Las células COS transfectadas con HEK en la orientación antisentido no se teñían con IIIA4.
Expresión de HEK en líneas de células linfoides humanas
La tinción de la superficie celular con IIIA4 reveló un modelo muy restringido de expresión de HEK en LK63 - una línea de células pre B, y JM - una línea de células T. Para explorar adicionalmente la expresión de HEK, se realizó un análisis de transferencia de Northern con HEK 4.5 (figuras 4 a 6). Se observó una sola banda de 5,5-6,0 kb tanto en células LK63 como en células JM. Sin embargo, hubo una banda menos intensa del mismo tamaño en otra línea de células T - HSB-2 - que no se teñía con IIIA4. Otras líneas celulares en las que se detectaron transcritos de HEK incluyen Lila-1, MOIT4 y HeLa. No se detectó ningún transcrito de HEK en una serie de líneas celulares distintas, aunque se observó una banda débil en músculo cardíaco (figura 6). El número de moléculas de HEK se determinó en HSB-2, LK63/CD20+ y otras células usando análisis de Scatchard de la unión del MAb IIIA4. Las células LK63/CD20+ tenían aproximadamente 15.000 sitios por células y las células JM tenían 9.500 sitios por célula. Por el contrario, HSB-2 tenía aproximadamente 1.070 sitios por célula, lo cual es demasiado bajo para la detección por inmunofluorescencia frente al efecto de fondo de autofluorescencia de esta línea celular. Las constantes de afinidad para la unión de anticuerpos estaban en el intervalo de 2,5-4,0 x 10^{9}. Las células Raji y K562 no mostraron ninguna unión de anticuerpo detectable por encima del nivel de fondo. Las tablas 1 y 2 resumen el fenotipo de expresión de HEK en las líneas celulares.
Análisis de transferencia de Southern
Para investigar la base de la sobreexpresión de HEK en la línea de células tumorales linfoides LK63, se realizó un análisis de Southern del ADN genómico (figura 7). Se usó un fragmento de 1,1 kb que incluía una región menos conservada de HEK (véase anteriormente) como sonda para minimizar el efecto de fondo debido a las regiones conservadas de los dominios catalíticos de moléculas de tirosina quinasa relacionadas. En comparación con el ADN de células mononucleares de sangre periférica normal, no hay ninguna amplificación aparente o redisposición del gen HEK en las líneas de células tumorales LK63 o LK63/CD20+.
Asignación cromosómica de HEK
Se usó ADNc de HEK como sonda para localizar la posición del gen HEK dentro del complemento del cromosoma humano normal. Se realizó una asignación cromosómica de dos formas - por hibridación in situ y por análisis de Southern de híbridos de células somáticas. Se examinaron treinta metafases masculinas normales con respecto a una señal fluorescente: veinticuatro de estas metafases mostraron señal en una o en las dos cromátidas del cromosoma 3 en la región de 3cen\rightarrow3p12.1. El 85% de esta señal estaba en 3p11.2 (figura 8). Se observó un total de nueve manchas de fondo no específicas en estas 30 metafases. Se obtuvieron resultados similares a partir de la hibridación con el segundo individuo de sexo masculino. El análisis de transferencia de Southern del panel de células híbridas mostró hibridación de la sonda de HEK sólo con híbridos que contenían material del cromosoma humano 3. Se obtuvieron bandas de 5,2, 4,8, 4,3, 2,4 y 1,9 kb a partir del producto de digestión de Hind III y se obtuvieron bandas de 4,3, 3,2 y 1,9 kb a partir de la digestión con Taq1. El panel de células híbridas usado representa el genoma humano entero excepto por los cromosomas 2, 6q, 8, 11p e Y. De esta manera, los resultados de las dos técnicas localizaron el gen HEK en el cromosoma 3 y el análisis de hibridación in situ situó este gen de manera más precisa en 3p11.2. Esta región no era citogenéticamente anormal en tumores HEK-positivos. De forma similar, no hubo ningún cambio aislado en el número de copias del cromosoma 3 en líneas de células HEK positivas ni tampoco se observó formación de isocromosomas en los que estuviera implicado el cromosoma 3.
TABLA 1
4 
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TABLA 2
5
Los especialistas en la técnica apreciarán que la invención descrita en este documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Se entenderá que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones de dos cualesquiera o más de dichas etapas o características.
Referencias
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Claims (25)

1. Una tirosina quinasa de tipo receptor aislada, estando caracterizada dicha tirosina quinasa porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures que tiene el Nº de Acceso 91061920, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en su forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P
2. La tirosina quinasa de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P S N E V N L X D (S) K X' I Q
donde X y X' son cualquier aminoácido.
3. La tirosina quinasa de acuerdo con la reivindicación 2, donde X y X' son L y T, respectivamente.
4. Una tirosina quinasa de tipo receptor aislada que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 o una porción de la misma que comprende los aminoácidos 21 a 541, 21 a 376, 326 a 511 ó 566 a 983, o que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad total de al menos un 70% con la secuencia indicada en la figura 1.
5. La tirosina quinasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en forma recombinante o sintética.
6. Un aislado de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a una secuencia que codifica la tirosina quinasa de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula transformada o cultivo celular que lleva el aislado de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una células transformada o cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 7 que es una célula de mamífero, insecto, levadura o bacteriana.
9. Una célula transformada o cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 8, donde la célula es una célula CHO, baculovirus o E. coli.
10. Un antagonista de la unión de un ligando a la tirosina quinasa de la reivindicación 1, donde el antagonista es una forma soluble de la tirosina quinasa de tipo receptor como se ha definido en la reivindicación 4.
11. Una composición farmacéutica que comprende una forma soluble de una tirosina quinasa de tipo receptor como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo además dicha composición uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
12. Un producto que contiene un antagonista de acuerdo con la reivindicación 10 y otro compuesto activo como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en la inhibición, reducción o interferencia de otra manera con la actividad receptora de la tirosina quinasa de tipo receptor definida en la reivindicación 4.
13. El producto de acuerdo con la reivindicación 12, donde el otro compuesto activo es una citoquina o un agente contra el cáncer.
14. Un anticuerpo que se une al dominio extracelular de la tirosina quinasa de tipo receptor aislada o una porción de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
15. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho anticuerpo es como se ha definido en la reivindicación 1.
16. Uso de un antagonista de la unión de un ligando a una tirosina quinasa de tipo receptor aislada, donde el antagonista es una forma soluble de HEK, siendo HEK una tirosina quinasa de tipo receptor que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 o una porción de la misma que comprende los aminoácidos 21 a 541, 21 a 376, 326 a 511 ó 566 a 983, o que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad total de al menos un 70% con la secuencia indicada en la figura 1, donde dicha tirosina quinasa se caracteriza porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures que tiene el Nº de Acceso 91061920, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en su forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P para la preparación de una composición para uso en la inhibición, reducción o interferencia de otra manera con la actividad receptora de HEK.
17. Un método para fosforilar una proteína que comprende poner en contacto una preparación de dicha proteína con una cantidad eficaz de la tirosina quinasa de tipo receptor, estando caracterizada dicha tirosina quinasa porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures que tiene el Nº de Acceso 91061920, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en su forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P, durante un periodo de tiempo y en condiciones suficientes para efectuar la fosforilación de la proteína.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, donde la tirosina quinasa de tipo receptor tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 o una porción de la misma que comprende los aminoácidos 21 a 541, 21 a 376, 326 a 511 ó 566 a 983, o tiene una secuencia de aminoácidos con una homología total de al menos un 70% con la secuencia indicada en la figura 1.
19. Un método para investigar la unión de un ligando en un tejido o en células a la tirosina quinasa de tipo receptor, estando caracterizada dicha tirosina quinasa porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures que tiene el Nº de Acceso 91061920, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en su forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P, que comprende poner en contacto la tirosina quinasa fusionada a una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable en la muestra de tejido o células a ensayar durante un periodo de tiempo y en condiciones suficientes como para que la tirosina quinasa fusionada se una a un ligando en dicho tejido o células, y después detectar la molécula indicadora.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde la molécula indicadora es fosfatasa alcalina.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, donde la tirosina quinasa se codifica por AP-TAG-HEK que se puede obtener por el método descrito en este documento en el ejemplo 1.
22. Un método para seleccionar un ligando soluble de la tirosina quinasa de tipo receptor, y estando caracterizada dicha tirosina quinasa porque, en su forma natural, es reactiva con el anticuerpo monoclonal III.A4 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures que tiene el Nº de Acceso 91061920, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 120-150 kD en su forma glicosilada y tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende:
E L I P Q P, que comprende poner en contacto una muestra a ensayar con una línea celular capaz de expresar la tirosina quinasa e investigar la fosforilación en dicha línea celular.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, donde la línea celular es la línea de células tumorales linfoides LK63 o una línea de células transformantes HEK, donde HEK es una tirosina quinasa de tipo receptor que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 o una porción de misma que comprende los aminoácidos 21 a 541, 21 a 376, 326 a 511 ó 566 o 983, o que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad total de al menos un 70% con la secuencia indicada en la figura 1.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, donde la muestra es el fluido de cultivo de la línea celular.
25. El método de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende, como alternativa, pasar la muestra a través de una columna de afinidad que tiene la tirosina quinasa inmovilizada en la misma.
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