ES2230554T3 - Recombinacion hologa de las celulas eucariotas con el sistema de reparacion del mal emparejamiento desactivado. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA MODIFICAR EL GENOMA DE CELULAS EUCARIOTAS MEDIANTE UNA RECOMBINACION HOMOLOGA UTILIZANDO SECUENCIAS DE ADN QUE DIFIEREN SUSTANCIALMENTE DEL LOCUS DIANA CON RESPECTO A LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS (UNA DIVERGENCIA DE UN 0,1 A UN 30 %) EN LA REGION EN LA CUAL TIENE LUGAR LA RECOMBINACION. LA RECOMBINACION HOMOLOGA ENTRE LAS SECUENCIAS DIVERGENTES SE LOGRA MEDIANTE LA INACTIVACION GENETICA O TRANSITORIA DEL SISTEMA DE REPARACION DE DESAPAREAMIENTOS DE LA CELULA.

Description

Recombinación homóloga de las células eucariotas con el sistema de reparación del mal emparejamiento desactivado.

Antecedentes de la invención

La introducción de modificaciones específicas en el genoma procariota y eucariota es una herramienta poderosa en el estudio de la función de varios genes tanto a nivel de células individuales y en el contexto del organismo completo. Además, la modificación de genes específicos puede dar lugar a la producción de organismos industrialmente y médicamente importantes, mientras que la corrección de alelos defectivos en células eucariotas puede proporcionar un paso sustancial hacia delante en el desarrollo de los protocolos somáticos de terapia génica.

El método de modificación genética, se basa en la capacidad de que cada tipo de célula prácticamente, pueda intercambiar secuencias de DNA con un elevado grado de secuencias de nucleótidos similares mediante el proceso que es conocido cómo recombinación homóloga (1). Concretamente, el método de modificación genética comporta la generación de una así llamada construcción diana, una secuencia de DNA que es idéntica ampliamente al locus cromosómico específico para ser modificado, pero difiere de este locus por modificaciones específicas. Estas modificaciones pueden ser tan pequeñas cómo la delección, inserción, o sustitución de un par de bases, o tan grandes cómo la delección o inserción de diez pares de kilobases. Al entrar la construcción diana en la célula, el intercambio de secuencias que flanquean la modificación con sus homólogos cromosomales, darán lugar a la introducción de una modificación dentro del cromosoma.

La eficiencia de la recombinación homóloga en los procariotas y eucariotas depende fuertemente, de la identidad de la secuencia completa de intercambio de las cadenas de DNA (2-5) Por esto, las diferencias en la secuencia del 0,5%, pueden impedir fuertemente la recombinación homóloga. En varias especies bacterianas, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Streptococcus pneumoniae, cómo en especies de levaduras cómo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado inequívocamente que el sistema de reparación del mal aparejamiento del DNA es el responsable de la supresión de la recombinación entre homólogos pero no entre secuencias de DNA no idénticas (6-8).

Hemos demostrado ahora que en las células de mamífero deficientes del gen Msh2 responsable de la reparación del mal emparejamiento del DNA, la recombinación homóloga ha perdido los requisitos para identificar una secuencia completa entre las secuencias de intercambio de DNA. Este hallazgo proporciona un nuevo método para modificar el genoma eucariota utilizando construcciones diana de DNA que, sustancialmente difieren del locus diana en la región dónde la recombinación tiene lugar mediante la inactivación genética y/o funcional inactivando el sistema de corrección de la incompatibilidad de las células.

El método obvia el requisito para las construcciones diana de DNA que son ampliamente idénticas al locus diana, por esto permiten la modificación genética eficiente de células somáticas y la línea germinal de organismos no innatos. Esto, puede proporcionar una vía para la terapia genética somática y para la modificación de las especies eucariotas cuyas cadenas innatas no son fácilmente disponibles. También, las secuencias genómicas se pueden reemplazar por pequeños oligonucleótidos que llevan una o más alteraciones de pares de bases o mediante secuencias cromosómicas largas derivadas de otras especies. El método puede también utilizarse, para generar delecciones grandes mediante una recombinación homóloga intra- o extra-cromosómica entre secuencias repetidas pero divergentes.

Modificación genética de los ratones

La introducción de alteraciones genéticas específicas dentro de la línea germinal de ratón se hizo posible gracias a la combinación de nuevas técnicas en biología molecular y embriología que han llegado a ser adecuadas durante los últimos diez años (9-11). El método conlleva la introducción de una modificación genética planificada en las células madre embrionarias (ES), mediante la recombinación homóloga. Las células ES derivan originalmente de la masa de células interna de los embriones de 3,5 días de pre-implantación y puede ser mantenido por cultivo in vitro cómo una línea celular inmortalizada, reteniendo el estado indeferenciado bajo condiciones de cultivo apropiadas. Actualmente, están asequibles un gran número de líneas celulares ES. Las células ES fueron inyectadas dentro del blastocelo de los embriones de 3,5 días en la fase de blastocisto, y pueden eficientemente competir con la masa de células internas del blastocisto en el desarrollo embrionario generando así un ratón quimérico, compuesto de células derivadas del blastocisto y de las células ES inyectadas. Las células ES modificadas in vitro deberían contribuir a la línea germinal de animales quiméricos, el genoma de las células ES puede ser transmitido a la siguiente generación dando lugar a animales que llevan la modificación introducida en todas sus células.

Entrecruzando dichos animales, se revelan las consecuencias fenotípicas de la homozigosidad del gen modificado.

La modificación genética más comúnmente introducida en las células ES es la alteración del gen induciendo a una inactivación del gen. Esto permite estudiar la función del gen mediante el análisis de las consecuencias de la ausencia de un gen particular en el contexto de un organismo completo. También, varias enfermedades humanas hereditarias son el resultado de la hemizigosidad de los genes específicos [p.ej síndromes de predisposición al cáncer cómo el cáncer colorectal no polipósico hereditario (12), el síndrome de Li Fraumeni (13), retinoblastoma (14)]. La generación de modelos de ratones para dichas enfermedades mediante la alteración de los homólogos del ratón de los genes implicados en proporcionar un herramienta no evaluable para estudiar las enfermedades hereditarias en un sentido experimental.

Alteración genética en células ES

La inactivación de un gen específico en las células ES vía recombinación homóloga, empieza con la preparación de una construcción diana de DNA (15). Se pueden utilizar dos tipos de construcciones diana. En un vector de tipo reemplazo, un gen marcador de resistencia a un fármaco (confiriendo a la célula resistencia a fármacos cómo G418, Higromicina B, Puromicina, Histidinol) altera una secuencia que es homóloga a la secuencia en un gen o alrededor suyo, dentro del genoma receptor; en un vector de tipo inserción el gen marcador flanquea la secuencia homóloga. La construcción diana es introducida dentro de las células ES por electroporación (o alternativamente mediante una precipitación por Ca-fosfato, transferencia del DNA mediado por liposoma o microinyección) y las células se seleccionan para una integración estable de la construcción targeting en el genoma receptor mediante el crecimiento en el medio que contiene el fármaco apropiado. Las colonias resistentes al fármaco son el resultado de cualquiera de los siguientes procesos: de la integración de la construcción diana en un sitio al azar en el genoma o de la integración del gen marcador en el locus diana vía recombinación homóloga entre las secuencias flanqueadas y sus homólogos cromosomales. El vector de tipo reemplazo se integra mediante recombinación homóloga en ambos lados del gen marcador; el vector de tipo inserción se integra mediante una recombinación homóloga singular que lleva a la duplicación de la región de homología. Por esto, el gen marcador pretende dos propósitos: permite la selección de células que han albergado la construcción diana y, en la integración vía recombinación homóloga, alterará el gen diana modificando así su función.

Para distinguir los clones de células ES resultantes de la recombinación homóloga de aquéllos que resultan de la integración aleatoria, se requiere analizar los clones individuales de DNA mediante hibridización Southern o la reacción en cadena de la polimerasa.

Desafortunadamente, en varios experimentos diana, se encontró frecuentemente que la integración aleatoria era más eficiente que la recombinación homóloga y también se observaron grandes variaciones en la eficiencia diana para diferentes genes (16). En este aspecto, las células de mamífero se diferencian de bacterias y eucariotas menores cómo levaduras (17), Leishmania major (18) o Trypanosoma brucei (19), en el lugar dónde ocurre la integración del DNA exógeno en el genoma receptor exclusivamente o predominantemente vía recombinación homóloga. Hasta el momento, se han identificado tres factores que claramente afectan a la recuperación de los recombinantes homólogos en células de mamíferos. Primero, la frecuencia de la recombinación homóloga incrementa sustancialmente con la longitud total de las secuencias homólogas superiores a 14 kilo pares de bases (20) Segundo, el nivel de expresión del gen marcador en el locus diana afecta a la frecuencia de recuperación de los recombinantes homólogos: una baja expresión puede llevar a la pérdida de los recombinantes homólogos, mientras que una elevada expresión puede facilitar la selección de los recombinantes homólogos a una concentración de fármaco elevada (21). Tercero, las diferencias de secuencia entre la construcción diana y el locus diana cromosomal fuertemente suprimen la eficiencia de la recombinación homóloga (5).

Elevada eficiencia en la búsqueda de dianas con construcciones de DNA isogénico

La supresión de la recombinación homóloga en células ES mediante diferencias en secuencias pequeñas puede llegar a esclarecerse mediante un experimento de búsqueda de genes diana apuntada en la alteración del gen de Retinoblastoma con un gen marcador de la resistencia a neomicina. Se prepararon dos construcciones diana, que llevaban un marcador de la resistencia a neomicina colocado en 10,5 Kb de la secuencia Rb. Se derivó una secuencia Rb en una construcción de la cepa de ratón 129, y por esto, fue idéntica al locus correspondiente cromosomal en las células ES, que también derivaron de la cepa de ratón 129. En la otra construcción, la secuencia Rb se derivó de la cepa de ratón BALB/c.

Las dos construcciones, designadas cómo 129Rb-neo y B/cRb-neo, fueron descritas en la publicación Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 5128-5132 en las páginas 5128 y 5129, Fig. 1. Las dos construcciones contenidas corresponden a secuencias Rb y fueron por ello muy similares. Sin embargo, se diferenciaron aproximadamente en un 0,6% al nivel de nucleótidos (que corresponde al nivel de polimorfismo de la secuencia encontrado en la población humana). Así, se secuenció en un margen de 1687 pares de bases, la secuencia BALB/c se diferenció de la secuencia 129 por 9 sustituciones de pares de bases, tres delecciones pequeñas (de 1,4 y 6 nucleótidos) y dos repeticiones CA polimórficas (ver Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 5128-5132, página 5130. Fig. 4). En la introducción de estas construcciones en células ES derivadas de 129, recombinación homóloga en Rb con la construcción derivada de 129 fue de 50 veces más eficiente que con la construcción no isogénica derivada de BALB/c-. Para proporcionar evidencia adicional de que la supresión de la recombinación fue exclusivamente dependiente de los polimorfismos entre los locus endógenos y el DNA diana, se hizo el experimento inverso, p.ej. diana de una línea celular ES derivada de BALB/c con construcciones derivadas de 129 y BALB/c. Este experimento produjo el resultado inverso, esto es, una eficiencia mayor en la diana con la construcción derivada de BALB/c que con la construcción derivada del 129 no isogénica.

Con cualquier construcción de diana diferente, con un gen de resistencia a la higromicina en 17 kb del Rb DNA isogénico, nosotros observamos que un 80% de todas las colonias resistentes a Higromicina B resultaron de la recombinación homóloga (5). Esto demuestra que, en presencia de una perfecta homología, también la recombinación homóloga en células de mamífero puede ser el proceso predominante, mejor que la integración aleatoria. Aunque no todos los problemas de la búsqueda de dianas del gen han sido solucionados, varios genes han sido apuntados actualmente satisfactoriamente mediante el uso de las construcciones dianas de DNA isogénico. Sin embargo, las modificaciones genéticas de las células derivan de un organismo no innato pueden alcanzar un esfuerzo difícil, cómo las construcciones de dianas isogénicas que no son fácilmente asequibles. En este caso, el gen diana eficiente necesitaría una construcción diana para ser preparado a partir del DNA derivado de la célula diana. Especialmente en el contexto de la terapia génica, éste plantearía un obstáculo práctico tremendo para la corrección de un gen defectivo. También, la divergencia de la secuencia base impone una barrera principal para el intercambio de una región cromosomal grande de una especie por la región sintética de otras especies. La presente invención proporciona un camino para vencer estos problemas.

La introducción de mutaciones delicadas

Aunque los protocolos para la alteración de los genes en líneas celulares ES innatas (y en líneas celulares somáticas de las cuales se pueden preparar: las construcciones diana de DNA isogénico) son preferentemente bien desarrollados, la introducción de más mutaciones delicadas no es directa. Los protocolos actuales son variaciones de un procedimiento de dos pasos en el cuál primero un gen marcador es introducido dentro del gen diana mediante el reemplazo del gen marcador por una mutación delicada deseada (5). Este procedimiento requiere el gen marcador para ser seleccionados ambos por su presencia (primer paso) y su ausencia (reemplazo por la mutación delicada).

Los genes marcadores útiles, son los minigenes Hprt para ser utilizados en células ES deficientes en Hprt (selección positiva en medio HAT; selección negativa por 6-tioguanina) y una combinación del gen de resistencia a la neomicina (selección positiva por G418) y el gen de timidina quinasa de Herpes Simplex Virus (Selección negativa por Ganciclovir). En un procedimiento alternativo, la mutación delicada y el gen marcador están presentes en la misma construcción diana y concomitantemente introducida dentro del genoma mediante por recombinación homóloga. Si se utilizó un vector del tipo de inserción, el gen marcador puede ser eliminado por recombinación intracromosomal entre las secuencias duplicadas que fueron generadas durante la primer integración (23). En el caso del vector del tipo reemplazo, el gen marcador se puede eliminar si éste fue flanqueado por dos sitios específicos de recombinación (p.ej. sitios loxP) La recombinación entre estos sitios en la introducción dentro de las células de la recombinasa Cre específica loxP eliminará el gen marcador del genoma (24).

Aunque cualquiera de los procedimientos antes mencionados ha sido aprobado para una modificación delicada de un número de genes en las células ES, éstos están fuertemente demandados como la generación de construcciones diana de DNA y el cultivo de células ES bajo varias condiciones selectivas.

Por esto, una alternativa atractiva para estos procedimientos podría ser el uso de pequeños oligonucleótidos de cadena doble o simple (hasta 100 bases o pares de bases), que son idénticos al locus diana excepto para una o varias alteraciones en el par de bases. Sin embargo, nuestro hallazgo de que las diferencias en la secuencia base son tan pequeñas cómo el 0,6%, suprime fuertemente la recombinación homóloga, y puede imponer un mayor impedimento para utilizar dichos oligonucleótidos para la introducción de modificaciones genéticas delicadas. La presente invención proporciona un camino para eliminar este problema y puede permitir la modificación delicada de las líneas celulares y células derivadas de los organismos vivos y temporalmente cultivados in vitro.

Como se describe antes, las diferencias en la secuencia base tan modestas cómo el 0,6% imponen una fuerte barrera para la recombinación homóloga eficiente en células madre embrionarias de ratón (5). La supresión de la recombinación homóloga mediante pequeñas diferencias de la secuencia base fue tempranamente observada en bacterias (E. coli, S.typhimurium y S.pneumoniae), levaduras y fibroblastos de ratón (2-4). El papel del sistema de corrección del mal emparejamiento del DNA en la recombinación supresora entre homólogos excepto secuencias divergidas, fue lo más dramáticamente demostrado mediante Radman y sus colaboradores durante el estudio de la conjugación bacteriana entre las bacterias de especies relacionadas pero divergentes cómo Escherichia coli y Salmonella typhimurium (6). Este procedimiento se apoyó en la entrada de fragmentos cromosomales de una especie a otra y en la recombinación de estos fragmentos con el cromosoma de la bacteria receptora. La secuencia de divergencia entre las dos especies se estima ser de un 20-30% y por esto, la recuperación de los exconjugantes del cruce interespecies es de 2 x 10^{5} veces inferior que el cruce intraespecies. Sin embargo, la recombinación de los exconjugantes de un cruce entre interespecies incrementa 3 x 10^{3} veces si la bacteria receptora lleva una mutación inactivante en cualquiera de los genes mutS o mutL, ambos siendo esenciales para la corrección del mal emparejamiento del
DNA.

La proteína central en la corrección del mal emparejamiento del DNA en E.coli está codificada por el gen mutS (25). Éste las reconoce y se une a pares de bases desapareadas y a pequeños lazos de más de cuatro nucleótidos desapareados. Después de unirse al heterodúplex de DNA, el complejo MutS-DNA se une mediante el producto del gen mutL que da lugar a la escisión de una región de la cadena simple de DNA, de hasta varias kilobases, que contiene el/los nucleótidos desapareado(s). En este procedimiento también el producto del gen mutU juega un papel importante, puesto que los productos de los genes mutH aseguran la eliminación de las cadenas sintetizadas recientemente antes que las cadenas parentales. El proceso reparador se completa mediante la resíntesis de la cadena escindida y la unión de la cadena que resta. La reparación de mal emparejamiento en E. coli es el responsable del mantenimiento de la estabilidad del genoma en cómo mínimo dos vías: i) mediante el reconocimiento y reparación de los nucleótidos mal emparejados, y no emparejados que ocurre, respectivamente, mediante el error en la incorporación y el corrimiento durante la replicación del DNA; ii) mediante el reconocimiento de malos emparejamientos que ocurren en los heterodúplexs formados en las fases iniciales de la recombinación entre homólogos excepto entre secuencias no idénticas. Éste, tampoco puede llevar al bloqueo del alargamiento de la formación del heterodúplex o a la disociación del heterodúplex de este modo deteniendo así la reacción de recombinación. Consecuentemente, las cepas de E. coli defectivas para cualquiera de los genes mutS o mutL, tienen un fenotipo pleiotrópico: una tasa de mutación incrementada, incluyendo la desestabilización de las repeticiones de secuencias simples y el incremento de la tasa de recuperación entre homólogos excepto secuencias divergentes de DNA. El fenotipo más reciente está manifestado claramente mediante la recombinación eficiente de la bacteria recombinante resultante de un cruce conjugacional entre, las especies relacionadas pero divergentes de Escherichia coli y Salmonella typhimurium, dónde la bacteria receptora era deficiente para mutS o mutL (6.) También, la frecuencia de la redisposición cromosomal mediante recombinación ectópica entre secuencias divergentes está aumentada sustancialmente en bacterias deficientes del sistema de reparación del mal aparejamiento (26).

En muchos aspectos, la bioquímica de los sistemas de reparación del mal emparejamiento en eucariotas, se parece al sistema de E.coli mutS, L. Los homólogos de ambos genes han sido identificados en levaduras y células de mamíferos. En base a la unión del mal emparejamiento in vitro, del mutador y de los fenotipos recombinantes mutantes de Saccharomyces cerevisiae, la proteína codificada por el gen de la levadura MSH2 parece ser un homólogo funcional de MutS (27-29). Se identificó un homólogo del gen de hongo MSH2 en células de mamífero mediante el análisis de la actividad del mal emparejamiento en la unión G-T, el clonaje posicional y la amplificación por PCR del DNA de ratón utilizando cebadores degenerados(30). Similarmente, se identificaron los homólogos del gen mutL de E. coli en levaduras y células de mamíferos.

Interesantemente, se encontraron recientemente las mutaciones heredadas en los homólogos humanos mutS y mutL para relacionarlas con el síndrome de predisposición al cáncer HNPCC (cáncer colorectal no polipósico hereditario), que se caracteriza por el desarrollo de tumores del colon proximal a edades tempranas. En estos tumores, la reparación del mal emparejamiento se pierde, cómo lo manifestado en la desestabilización de las repeticiones de secuencias simples, el fenotipo de error positivo de replicación (RER+) (12).

WO 90/07576 se refiere a un procedimiento de recombinación in vivo para secuencias de DNA parcialmente homólogas en organismos, cuyos sistema enzimático para la reparación de malos emparejamientos es deficiente.

Selva et al. (8) proporciona algunas conclusiones del papel de Msh2 y Msh3 en la fidelidad de recombinación en Saccharomyces cerevisiae.

Sin embargo, no hay indicación en el campo previo, en cómo confiadamente se modifica el genoma de una célula de mamífero mediante la recombinación homóloga entre un locus diana específico en el genoma y un homólogo excepto la secuencia diana de DNA introducida dentro de la célula.

La presente invención soluciona este problema mediante el suministro de un método para modificar el genoma de una célula de un mamífero no humano deficiente del gen Msh2 reparador de DNA mal emparejado in vitro mediante recombinación homóloga entre un locus diana específico en el genoma y un homólogo pero la secuencia diana de DNA introducida dentro de la célula deficiente del gen Msh2, reparador del mal emparejamiento de DNA y dicha secuencia diana ha aumentado un 30% las diferencias de la secuencia base con respeto al locus diana en la región dónde la recombinación puede tener lugar o dicha secuencia diana difiere del locus diana a tal nivel que la recombinación homóloga está normalmente fuertemente bloqueada.

La presente invención, desde un punto de vista preferido (parte a), se relaciona con el método antes identificado para la modificación del genoma de una célula de mamífero no humana, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA es inactivado mediante la alteración de ambas copias del gen Msh2.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte b), se relaciona con el método antes identificado para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA de la célula es inactivado mediante la introducción de construcciones de RNA antisentido, conducido mediante un promotor apropiado, así se inactiva funcionalmente el gen Msh2.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte c), se refiere al método identificado antes para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA celular se inactiva por la introducción de oligodeoxinucleótidos antisentido modificados, inactivando así funcionalmente el gen Msh2.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte d), se refiere al método antes identificado para modificar el genoma de células de mamífero no humanas, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA celular se inactiva por la expresión de una versión actuante negativamente dominante de un gen implicado en la reparación del mal emparejamiento del DNA.

La presente invención, en un punto de vista preferido, (parte e), se refiere al método antes identificado para la modificación del genoma de las células de mamífero no humanas, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA celular se inactiva transitoriamente mediante la saturación del gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA celular, mediante la introducción dentro de la célula de moléculas de DNA que llevan una o más bases desapareadas o no apareadas.

La presente invención, en un punto de vista preferido se relaciona con los métodos antes identificados para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde la célula diana es una célula madre embrionaria o un tipo de célula relacionada derivada de especies mamíferas, para ser utilizada para generar animales quiméricos y animales quiméricos que puedan transmitir el genoma mutado mediante la línea germinal.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte 1), se refiere a los métodos antes identificados para modificar el genoma de una célula de mamífero no humana, dónde la célula diana es una línea celular derivada de cualquier especie de mamífero y cultivada in vitro.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte 2), se relaciona con los métodos antes identificados para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde la célula target es derivada de cualquier órgano de especies de mamífero.

La presente invención en un punto de vista preferido (parte 3), se refiere a los métodos antes identificados para la modificación del genoma de las células de mamífero no humanas, dónde la célula diana deriva de organismos no innatos, que contienen copias no idénticas de los cromosomas homólogos.

La presente invención en un punto de vista preferido (parte 4), se relaciona con los métodos antes identificados para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde el DNA diana en la región dónde la recombinación homóloga tiene lugar se deriva de las mismas especies cómo la célula diana, en particular: un método para modificar el genoma de las células de mamífero no humanas, dónde el DNA diana se modifica in vitro en sitios específicos deliberadamente introduciendo secuencias divergentes (parte 5).

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte 6), se relaciona con los métodos antes identificados para modificar el genoma de células de mamífero no humanas, dónde el DNA diana en la región dónde la recombinación homóloga tiene lugar es derivado de las mismas especies que la célula diana pero es no isogénico con el DNA de la célula diana, las dos secuencias difieren hasta en un 5% en el nivel de nucleótidos.

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte 7), se relaciona con los métodos antes identificados para la modificación del genoma de células de mamífero no humanas, dónde el DNA diana en la región dónde tiene lugar la recombinación homóloga se deriva de otras especies cómo la célula diana, la secuencia targeting y el locus diana comprenden más del 30% de divergencia en la secuencia dónde la recombinación homóloga tiene lugar, en particular el DNA diana es un fragmento de DNA cromosomal contenido en un vector YAC o cósmido (parte 8).

La presente invención, en un punto de vista preferido (parte 9) se relaciona con el método antes identificado para modificar el genoma de células de mamífero no humanas, dónde el DNA diana es un oligonucleótido de cadena doble o simple que contiene de 10-100 bases o pares de bases de los cuáles una o varias bases o pares de bases difieren del locus diana.

La presente invención se refiere también a un método para probar la inactivación del gen Msh2 del sistema de reparación del males emparejamiento del DNA celular de mamíferos usando los métodos antes identificados de acuerdo con cualquier de las realizaciones de la a a la e, e incluyendo la comparación de la eficiencia de las dianas de las construcciones isogénicas versus no-isogénicas de DNA diana.

La presente invención también se refiere con un método para probar la inactivación del gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA celular utilizando los métodos antes identificados de acuerdo con las partes de a a e, e incluyendo la recombinación intracromosomal entre las secuencias de DNA homólogas pero divergentes.

La presente invención también se refiere a un método para probar la recombinación homóloga utilizando un método de acuerdo con una de las partes de la 4 a la 9 y utilizando una línea de células madre embriónica no humana o cualquier otra línea celular en la que el sistema de reparación del mal emparejamiento es inactivado mediante la alteración de varias copias del gen Msh2.

La presente invención también se refiere a un método de acuerdo con cualquiera de las partes 1, 2 ó 3. Proporcionando células o líneas celulares para ratones deficientes en la reparación del mal emparejamiento que llevan una alteración en ambas copias del gen Msh2.

Con el propósito de investigar el papel del gen de mamífero Msh2 en la reparación del mal emparejamiento del DNA y de dirigir el papel de la reparación de mal emparejamiento en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, generamos una línea celular ES con una alteración en varias copias del gen de ratón MSH2. Esta línea se le denomina dMsh2-9. Su construcción está descrita aquí.

Como demostraron las consecuencias fenotípicas de la deficiencia de Msh2 en células madre embrionarias de ratón, se proporciona una clara evidencia de un papel esencial de MSH2 en la reparación de DNA mal emparejado en los mamíferos. Primero, las células ES deficientes en Msh2 carecen de la actividad de unirse a una cadena doble de 38-meros oligonucleótidos que lleva un G-T mal emparejado o un dinucleótido TG no emparejado (leyenda en Fig.2) Segundo, las células Msh2- deficientes ES tienen un fenotipo mutante cómo se evidenció cómo mínimo en un incremento de 150 veces, el número de células resistentes a 6-tioguanina, indicando la inactivación mutacional del gen Hprt vinculado a X. Además, la inestabilidad del tramo microsatelite se observó en subclones derivados de la línea celular ES deficiente en Msh2, pero no en subclones derivados de células ES de tipo salvaje. (leyenda Fig.3) (Fig.3) Tercero, las células ES deficientes en Msh2 resistieron una concentración 20 veces mayor del agente metilante N-Metil-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidina que las células ES de tipo salvaje (leyenda en Fig.4) (Fig. 4).

Así, la alteración del Msh2 induce a la inactivación de la reparación del mal emparejamiento del DNA de mamíferos.

Mediante un ensayo del gen diana, demostramos que es el sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA de mamífero el responsable para la supresión de la recombinación homóloga entre secuencias que difieren en como mínimo un 0,6% en el nivel de nucleótidos. Como se describe antes, la recombinación homóloga en el locus Rb con una construcción de DNA diana isogénica fue 50 veces más eficiente que con otro similar, pero la construcción no isogénica contiene un promedio del 0,6% de divergencia en la secuencia con respecto al locus diana (5). Sin embargo, en células ES deficientes en Msh2, la recombinación homóloga en Rb con una construcción no isogénica diana fue tan eficiente cómo con la construcción isogénica.

El actual experimento demostró que el sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA de mamíferos está implicado en la prevención de la recombinación entre homólogos excepto las secuencias de DNA divergentes.

Este hallazgo proporciona un método para modificar el genoma de mamífero pero también el genoma de cualquier otro organismo eucariota vía recombinación homóloga utilizando las secuencias de DNA diana que sustancialmente difieren del locus diana con respeto a la secuencia de nucleótidos, mediante la inactivación genética o funcional del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA de las células.

Modificación genética de células eucariotas utilizando construcciones de DNA con diferencias sustanciales en la secuencia de bases con respeto al locus diana

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Para investigar el papel presuntivo del gen Msh2 en la reparación del mal emparejamiento del DNA (MMR) en la estabilidad del genoma y en la tumorigénesis, hemos generado células y ratones que son deficientes en este gen. Las células deficientes en Msh2 han perdido el sistema de reparación, y han adquirido una inestabilidad micro-satelite, y un fenotipo mutante y tolerancia para agentes metilantes. Además, en estas células, la recombinación homóloga ha perdido la dependencia de identidad completa entre secuencias de DNA interactuando, sugiriendo que el Msh2 esta implicado en salvaguardar el genoma de la recombinación promiscua. Una muestra de ratón deficiente en Msh2 sin anormalidades importantes, pero una fracción significativo desarrolla linfomas a edades tempranas. Así, Msh2 está implicado en MMR, controlando varios aspectos de la estabilidad del genoma; la pérdida de la estabilidad del genoma controlado por MMR predispone al cáncer.

El cáncer es el punto final de un proceso evolutivo en el que las células normales adquieren malignidad completa para alteraciones acumulativas genéticas o epigenéticas, cada una produciendo invasiones proliferativas o potencial metastásico a la célula. En el cáncer colorectal, se requieren cómo mínimo seis mutaciones transformantes independientes en oncogenes o genes supresores del tumor, para que una célula desarrolle un tumor maligno (releer en Vogelstein y Kirtzler, 1993). Este proceso evolutivo podría acelerarse dramáticamente mediante la pérdida temprana de los sistemas que salvaguardan la estabilidad del genoma, dando lugar a un índice de incremento de la mutagénesis y de la redisposición cromosomal (Hartwell, 1992 and Loeb, 1994). Con apoyo a esta hipótesis, un elevado número de síndromes de predisposición al cáncer hereditarios se atribuyen a defectos en la reparación del DNA. Dos de éstos son el Cáncer Colorectal no-polipósico Hereditario (HNPCC) y el síndrome Muir-Torre que son caracterizados por el desarrollo de tumores del colón proximal a edades tempranas. También los cánceres de otras partes del tracto gastrointestinal y del tracto genitourinario son encontrados frecuentemente (Lynch et al., 1993). Los pacientes con el síndrome de Muir-Torre son, además, propensos a cánceres de las glándulas sebáceas y de la piel (Cohen et al., 1991). Los individuos afectados por uno de estos síndromes han heredado probablemente un alelo mutante de cualquier de los cuatro genes relacionados con la reparación del mal emparejamiento (MMR), llamados MSH2, MLHI, PMS1 o PMS2 (Leach et al., 1993; Bronner et al., 1994; Kolodner et al., 1994; Liu et al., 1994, Nicolaides et al., 1994; Papadopoulos et al., 1994; Kolodner et al., 1995; revisado por Jiricny, 1994 y por Modrich, 1994). En los tumores de estos pacientes el MMR se ha perdido, presumiblemente mediante la inactivación o pérdida del alelo de tipo salvaje (Leach et al., 1993; Nicolaides et al., 1994; Papadopoulos et al., 1994; Hernsninki et al. 1994). Los mecanismos de la pérdida del MMR, la causa de la especificidad aparente del tejido de tumorigénesis y el papel de la pérdida del MMR en la evolución de una célula normal para tumores completamente malignos están aun oscuros. Además, los datos recientes sugieren que el MMR se pierde frecuentemente en varios tipos de tumores esporádicos (Han et al., 1993; Parsons et al., 1993; Risinger et al., 1994; Chong et al. 1994; Mironov et al., 1994. Orth et al., 1994; Shibata et al. 1994: Suzuki et al., 1994; Umar et al., 1994b; Wada et al., 1994; Wooster et al., 1994; Liu et al., 1995). Ésto soporta a la idea de que la pérdida del MMR puede jugar un papel general en la evolución del tumor.

El sistema MMR mejor estudiado con respecto a la genética y a la bioquímica es la ruta mutSL de Escherichia coli (revisada por Modrich, 1991). Lo central en esta ruta es la proteina codificada por el gen mutS, que se une a pares de bases desapareadas para hacer lazos de más de cuatro nucleótidos desapareados. Después de unirse al heterodúplex, el complejo MutS-DNA se une mediante el producto del gen mutL, provocando una escisión de una región de la cadena simple de DNA de hasta varias kilobases que contienen el/los nucleótidos mal emparejado(s). El proceso de reparación se completa mediante la resíntesis de la cadena de DNA escindida y la unión a la cadena que permanece intacta. El MMR en E. coli es el responsable de mantener la integridad del genoma por medio de dos caminos cómo mínimo: (i) mediante el reconocimiento y reparación de las bases mal emparejadas y los nucleótidos extrahelicales que tienen lugar respectivamente, por incorporación errónea y corrimiento durante la replicación y (ii) mediante el reconocimiento del mal emparejamiento ocurrido en los intermediarios de la recombinación entre secuencias homólogas pero divergentes, inducen al fracaso de la recombinación. Consecuentemente, las cadenas de E. coli deficientes para mutS o mutL tienen un fenotipo pleiotrópico que puede hacer incrementar el índice de mutación, incluyendo la desestabilización de las repeticiones de las secuencias simples (también llamadas microsatelites: el "Error de Replicación^{+}", o el fenotipo RER^{+}) y la promiscuidad en la recombinación inter- e intragenómica (el fenotipo recombinador, Rayssiguier et al., 1989; Petit et al., 1991).

En muchos aspectos la bioquímica del sistema de MMR en eucariotas se parece al sistema mutSL (Holmes et al., 1990: Varlet et al., 1990: Thomas et al., 1991: Fang y Modrich. 1993). Los homólogos de mutS y mutL se encontraron en los eucariotas. En base a la unión del mal emparejamiento in vitro y en el mutante y los fenotipos recombinantes de los mutantes de Saccharomyces cerevisiae, la proteina codificada por el gen de levadura MSH2 (Reenan y Kolodner. 1992a) parece ser el homólogo funcional de MutS (Reenan y Kolodner, 1992b: Miret et al, 1993; Alani et al, 1995). En eucariotas superiores (Xenopus laevis, ratón y humano) homólogos del gen de levadura MSH2 han sido recientemente identificados, en base a su secuencia de homología, directamente secuenciada mediante una proteína de unión del mal emparejamiento principal o mediante el clonaje posicional (Fishel et al., 1993; Leach et al., 1993; Palombo et al. 1994; Varlet et al., 1994). Una diferencia aparente entre MutS y MSH2, es la unión de la proteína eucariota, cuando se sobreproduce y se purifica a partir de E. coli o levaduras, para alargar hasta 14 nucleótidos extrahelicales (lazo de tipo inserción-delección, así llamado, o IDLs) in vitro (Fishel et al., 1994b; Alani et al., 1995), sugerente de un papel para Msh2 en la reparación de estos lazos (Umar et al, 1994). Los homólogos eucarióticos del gen mutL, llamados MLH1, PMS1 y PMS2 han sido analizados en la levadura (Kramer et al., 1989a: Kramer et al., 1989b. Strand et al. 1993; Prolla et al., 1994a: Prolla et al., 1994b) y en células humanas (Li y Modrich, 1995). El papel preciso de estos homólogos mutS y mutL en la MMR y el papel de la MMR en el mantenimiento de la estabilidad del genoma en células de mamífero falta para ser establecida. Además, falta por ser explorado también, el papel causal de MMR en la sensibilidad celular para agentes metilantes simples, cómo fue sugerido por la pérdida del MMR después de la selección de células tolerantes a estos agentes (Branch et al., 1993; Kat et al., 1993) y por la tolerancia a la metilación de una línea celular deficiente de MMR de un tumor (Koi et al., 1994).

Para investigar la implicación del Msh2 en MMR mamíferos y el papel del MMR en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, hemos generado líneas celulares madre (ES) embrionarias de ratón que carecen de ambas copias del gen Msh2. Mostramos que las células deficientes en Msh2 carecen de uniones a algunos malos emparejamientos específicos, han adquirido un fenotipo mutante y son tolerantes a agentes metilantes simples. Además, estas células han perdido la barrera para la recombinación entre secuencias homólogas pero divergentes. Estos resultados, tomados juntos, sugieren que MMR es esencial para la protección de múltiples aspectos de la estabilidad del genoma en células de mamífero. Para estudiar el efecto de la deficiencia del MMR en la etiología y la evolución del cáncer, generamos ratones que carecían de una o ambas copias del gen Msh2 en una parte o en todas sus células. Aunque los ratones heterozigotos, un modelo para la HNPCC, permanecen sanos cómo mínimo 8 meses de edad, una fracción significante de ratones quiméricos y totalmente homozigotos sin el gen Msh2 padecen linfomas. Estos resultados proporcionan la evidencia de que la pérdida de la estabilidad del genoma controlada por MMR puede acelerar el desarrollo del cáncer.

Alteración apuntada del gen Msh-2 en células ES de ratón

Las líneas celulares ES heterozigotas sMsh2-42 y sMsh2-55, llevan un gen de resistencia a la higromicina insertado entre los codones 588 y 589 de un alelo del gen Msh2, fue generado mediante un gen diana utilizando la construcción mostrada en la Fig.1A. La línea celular dMsh2-9, que lleva el marcador hyg en ambos alelos del gen Msh2, se obtuvo mediante la selección de la línea celular sMsh2-55 para la duplicación del cromosoma que lleva el alelo Msh2 diana con una elevada concentración de higromicina B, un método que fue previamente mostrado para ser efectivo utilizando el marcador de resistencia a la neomicina (Mortensen et al, 1992). Los sucesos de targeting se detectaron mediante el análisis de Southern blot, utilizando detectores del flanqueo en ambas caras de la construcción de targeting (Fig. I A). Un ejemplo de dicho Southern blot, que demostró el estado de los alelos Msh2 en las líneas celulares wt-2 (un línea celular control con la construcción targeting integrada mediante recombinación no-homóloga), sMsh2-55 y dMsh2-9 se muestra en la Fig. 1B. La diploidía de las líneas celulares sMsh2-55 y dMsh2-9 se verificó mediante tipificación del cariotipo (no mostrado).

El marcador hyg se insertó, en la orientación antisentido del extremo N-terminal del sitio de unión del ATP (Fig. IA) en una región dónde (en el gen humano) los truncamientos se encontraron en muchos tumores HNPCC (Liu et al., 1994). Además, ningún transcrito Msh2 podría ser detectado en las líneas celulares ES dMsh2-9, mediante Northern blotting (no mostrado), que indica que el marcador hyg suprime fuertemente la expresión del Msh2. El genotipo de la línea celular ES dMsh2-9 será consecuentemente indicado por Msh2-/-.

Enlace del mal emparejamiento en las células Msh 2-/-

Se han descrito actividades de dos diferentes uniones del mal emparejamiento en extractos de células de mamíferos utilizando ensayos de gel-retraso: (i) Una actividad que reconoce los malos emparejamientos GT (Jiricny et al., 1988: Stephenson y Karran, 1989; Griffin y Karran, 1993), un dinucleótido extrahelical TG (Aquilina et al; 1994) que representa un intermediario en el corrimiento replicacional de un microsatelite y, débilmente, los malos emparejamientos de G.A. G.G. A.C y G.U (Stephenson y Karran, 1989: Hughes y Jiricny, 1992). (ii) En una línea celular, se detectó una actividad independiente que reconoce los malos emparejamientos de A.C. y también los malos emparejamientos entre pirimidina-pirimidina (Stephenson y Karran, 1989). En base a la secuenciación de la proteína, se mostró la actividad de unión G.T por contener la proteína MSH2 (Palombo et al., 1994). Para caracterizar las propiedades de unión al mal emparejamiento de las líneas celulares ES Msh2-/-, hemos hecho ensayos de gel-retraso utilizando extractos de células de las líneas celulares ES de tipo salvaje wt-2 y líneas dMsh2-9 deficientes en Msh2. Los extractos se incubaron con oligonucleótidos de doble cadena marcada radioactivamente 38-mer que contienen cada uno un mal emparejamiento, un dinucleótido extrahelical o un lazo del tipo delección-inserción de 14-nucleótidos(IDL) seguido de una electroforesis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizada. Los resultados de éstos experimentos cómo se muestra en la Fig: 2 claramente demuestran la actividad de unión en extractos de células de tipo salvaje con el mal emparejamiento de G.T y con dinucleótidos extrahelicales TG. La unión a varios oligonucleótidos fue enteramente ausente en el extracto de línea celular ES Msh2-/-, demostrando la participación de la proteína Msh2 en esta actividad de unión. Como se ha mostrado antes (Hughes y Jiricny. 1992) la unión se suprimió mediante la inclusión de ATP en la reacción de unión(no mostrado). Fuimos incapaces de detectar la unión específica de los malos emparejamientos entre G.A. G.G, o A.C bajo las condiciones utilizadas en extractos de células de tipo salvaje o de tipo mutante. Además, no se observó unión dependiente de Msh2 al nucleótido 14 IDL (Fig. 2).

Las células Msh2-/- tienen un fenotipo mutante

La línea celular Msh21 fue indistinguible de la línea celular de tipo salvaje wt-2 y la línea celular sMsh2-55 heterozigota paternal con respeto a la eficiencia del crecimiento y del revestimiento (no mostrado). Para dirigir el papel de Msh2 en MMR, determinamos la estabilidad de dos marcadores microsatélites en líneas celulares Msh2-/- dMsh2-9 y líneas celulares Msh2+/+ wt-2. Por este propósito, se derivaron 24 subclones de cada línea celular, que había experimentado aproximadamente 20 divisiones celulares desde su generación. El DNA cromosomal, aislado de cada subclon expandido se sometió a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos pares de cebadores marcados en los extremos (D7Mit17 y D14Mit15; Dietrich et al., 1994). Dado que ninguna de las sublineas wt-2 mostraron ninguna alteración en la longitud del microsatélite, se vieron claramente las alteraciones de longitud en muchas sublineas dMsh2-9 para varios microsatélites (8 de 24 para el marcador D7Mit17 y 6 de 24 para el marcador D14Mit15, Fig.3). Esta observación sugiere fuertemente que la proteína Msh2 está involucrada en la reparación de los intermediarios corridos en la replicación. El índice de corrimiento de microsatélites se estimó para ser 10^{-2} a 10^{-3} por generación.

Posteriormente, investigamos el efecto de la pérdida del gen Msh2 en la frecuencia de mutación del gen funcional. Con este propósito 6 x 10^{6} células de las líneas celulares wt-2 y dMsh2-9 se colocaron en presencia de 6-tioguanina (6-TG) para seleccionar las células que han perdido la actividad del gen Hprt relacionado con X por mutación. Puesto que se vieron las colonias 6-TG-resistentes en el cultivo wt-2, 188 colonias resistentes estaban presentes eb el cultivo dMsh2-9. Este resultado extiende el fenotipo mutante de las células Msh2-/- para genes funcionales.

Células Msh2-/- tolerantes para N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG)

MMR fue sugerido para mediar la hipersensibilidad de los agentes que metilan residuos G en la posición 0^{6}. Ésto considera que MMR reconoce el mal emparejamiento 0^{6}-meG.T que ocurre después de la incorporación errónea de un nucleótido de timidina opuesta a 0^{6}-meG durante la replicación (Griffin et al., 1994). Esto es supuestamente seguido de una escisión y síntesis de reparación, incorporando otra vez timidna opuesta a 0^{6}-meG, provocando una nueva ruta de MMR. El resultado neto de este ciclo entre la escisión y la resíntesis, será la presencia de regiones encadenadas sencillamente en el sitio de los residuos 0^{6}-meG que darán lugar a hendiduras dobles encadenadas cuando se repliquen durante la fase S, resultando en la muerte celular (Para revisiones, mirar Karran and Bignami. 1992; Karran y Bignami, 1994). Se cree que la pérdida de MMR prevendrá este proceso, confiriendo así tolerancia a los agentes de metilación simples. Para ensayar esta hipótesis directamente, la supervivencia de la línea celular Msh2-/- dMsh2-9, la línea celular Msh+/- sMsh2-21 y la línea celular de tipo salvaje wt-2 se determinó después de la exposición a un rango de concentraciones de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). En el medio de crecimiento, se incluyó 0^{6}-bencilguanina para inhibir competitivamente la actividad metiltransferasa endógena que podría quitar de otro modo los grupos metilo adicionados por MNNG (Dolan et al., 1990). La Fig. 4 muestra que la DL_{50} para MNNG se incrementó 20 veces en la línea celular Msh2-/- comparado con las líneas celulares heterozigotas y las líneas celulares de tipo salvaje, directamente probando la implicación del Msh2 en la sensibilidad celular determinada para MNNG. La línea celular heterozigótica sMsh2-21 no exhibió incremento de tolerancia al MNNG.

Pérdida de la supresión de la recombinación entre secuencias divergentes en células Msh2-/-

En E. coli (Shen y Huang, 1986), Drosophila (Nassif y Engels, 1993) y células de mamífero (Waldman y Liskay, 1988. Te Riele et al, 1992) la eficiencia de la recombinación entre tramos de DNA homólogo es altamente dependiente de sus secuencias identificativas. Hemos demostrado previamente que en un ensayo de gen diana la recombinación homóloga en el locus del Retinoblastoma (Rb) en las células ES, derivó de la cadena de ratón 129, que fue 50 veces más eficiente con una construcción diana derivada del 129 que con una construcción derivada de una cadena de ratón no-isogénica. (BALB/c) (Te Riele et al, 1992: Tabla 1). Esta construcción contenía un 0,6% de divergencias en la secuencia base con respecto a la construcción isogénica 129. Para proporcionar una evidencia adicional de que la supresión de la recombinación fue exclusivamente dependiente de los polimorfismos entre los locus endógenos y el DNA diana, hicimos el experimento inverso p.ej diana de una línea celular ES BALB/c-derivada con las construcciones 129- y BALB/c- derivadas. Este experimento produjo un resultado inverso, p.ej. una elevada eficiencia diana con la construcción targeting BALB/c que con la construcción diana 129 no-isogénica (Tabla 1). Para investigar si el MMR es el responsable de este efecto de antirecombinación, hemos repetido el experimento de Rb diana en la línea celular ES (129-derivada) dMsh2-9. Hemos encontrado que la recombinación homóloga en la línea celular Msh2-/- en el locus Rb con la construcción no-isogénica fue tan eficiente cómo con la construcción isogénica(Tabla 1). Este experimento demuestra que Msh2 está involucrado en la prevención de la recombinación homóloga entre secuencias divergentes.

Pérdida de la unión del mal emparejamiento en extractos celulares Msh2-I

Mientras que los extractos celulares de tipo salvaje muestran una unión eficiente a ambos malos emparejamientos G.T cómo también a dinucleótidos TG extrahelicales, los extractos de línea celular ES dMsh2-9 carentes de esta unión (Fig. 2), sugieren que la proteína Msh2 es esencial para la unión a estos heterodúplexs. No tenemos capacidad para detectar la actividad de unión específica a otros malos emparejamientos bajo las condiciones utilizadas. Este resultado es compatible con otros estudios de unión que demuestran que la unión al mal emparejamiento G-T es más fuerte que la unión a otros malos emparejamientos (Stephenson y Karran, 1989; Hughes y Jiricny, 1992) puesto que la actividad de unión independiente de A.C es aparentemente específica al tipo de célula (Jiricny et al., 1988; Stephenson y Karran, 1989). Las líneas celulares "clones B" tolerantes a la metilación y RajiF12 fueron también encontradas para ausentar la unión a ambos malos emparejamientos G.T (Branch et al., 1993; Griffin et al., 1994) y dinucleótidos TG extrahelicales (Aquilina et al.,1994). La unión a un mal emparejamiento A.C no fue afectado (Branch et al., 1993). Consecuentemente, estas líneas celulares pueden haber perdido el gen Msh2. Se mostró MSH2 humano purificado, sobreproducido en E. coli, y MSH2 de levadura purificado para unirse a los malos emparejamientos de G.T (Fishel et al., 1994a; Alani et al., 1995) pero también para unirse fuertemente a los IDLs de más de 14 nucleótidos (Fishel et al., 1994b; Alani et al., 1995). Sorprendentemente, no pudimos detectar la unión dependiente de Msh2 al nucleótido 14 IDL en extractos celulares de ES. No somos capaces de explicar esta discrepancia aparente. En contraposición con la unión que observamos en los extractos celulares ES y en la proteína GTBP, el MSH2 contiene una fracción purificada de proteína con una unión del mal emparejamiento G.T de las células HeLa (Hughes and Jiricny, 1992; Palombo et al., 1994), la capacidad de unión de las proteínas purificadas MSH2 no fue eliminada por el ATP (Fishel et al., 1994b: Alani et al., 1995). Ésto sugiere que las proteínas purificadas MSH2 se comportan diferente a las proteínas producidas naturalmente. El hallazgo de que en las células Msh2-/- los cambios en los microsatélites nunca fueron más largos de 4 nucleótidos (representando dos dinucleótidos CA; Fig. 3), sugiere que la actividad de unión del Msh2 a lazos extrahelicales más largos de 4 nucleótidos no es necesaria para mantener la estabilidad del microsatelite. Actualmente, estamos iniciando in vitro los ensayos de reparación utilizando, extractos de células de tipo salvaje y Msh2-/- para aclarar este punto.

Fenotipo mutágeno de las células deficientes en Msh2

La línea celular dMsh2-9 había adquirido la inestabilidad del microsatélite (el fenotipo RER+), indicando el fallo para reparar los corrimientos de los intermediarios de replicación. La frecuencia de la inestabilidad del microsatélite fue similar a aquélla de las líneas celulares de algunos tumores RER+ (Parsons et al., 1993; Bhattacharyya et al., 1994). El fenotipo mutante de estas células también afecta a los genes funcionales cómo se evidenció mediante el índice de deficiencia de Hprt en un cultivo de dMsh2-9 que fue incrementado desde lo no detectable (P.ej. inferior a 1,6 x 10^{-7}) para células de tipo salvaje hasta 3 x 10^{-5}. Esta frecuencia está en concordancia con lo hallado en las líneas celulares de algunos tumores RER+ (Bhattacharyya et al., 1994; Shibata et al., 1994; Eshleman et al. 1995), aunque las líneas celulares que han sido seleccionadas por la deficiencia de MMR utilizando agentes metilantes, tienden a tener un poco baja las frecuencias de mutación (Goldmacher et al., 1986; Branch, et al., 1993: Kat et al., 1993; Aquilina et al., 1994). El índice de crecimiento y la eficiencia de revestimiento de las células deficientes en Msh2, heterozigotas y de tipo salvaje fueron indistinguibles, sugiriendo que el fenotipo mutante no interfiere en la viabilidad de las células. Esto es remarcable, desde que ambas fueran seriamente afectadas en varias líneas celulares que fueron seleccionadas por la deficiencia de MMR utilizando los agentes metilantes (Goldmacher et al., 1986). Ésto sugiere que en las células más recientes, los eventos adicionales pueden tener lugar interfiriendo la viabilidad celular. En base al fenotipo mutágeno de las células dMsh2-9 y de lo estudios de unión descritos antes, concluimos diciendo que el Msh2 está implicado, y es esencial para la postreplicación de MMR.

Sensibilidad a los agentes metilantes simples mediada por MMR

La sensibilidad de las células a los agentes que metilan el DNA en las posición 0^{6} de los residuos G ha sido atribuida a los intentos inútiles de MMR para corregir las pares de bases resultantes 0^{6}-meG.T (mirar resultados). Esta hipótesis se sostiene mediante dos observaciones: (i) la selección prolongada de células tolerantes a metilnitrosourea o MNNG frecuentemente resulta en la pérdida del MMR (Kat et al.,1993) y la pérdida de la actividad de la unión G.T (Branch. et al., 1993; Griffin et al., 1994).(ii) Se halló una línea celular RER+ tumoral para ser tolerante con estos agentes y la sensibilidad fue restablecida mediante la introducción del cromosoma que contiene un alelo de tipo salvaje del gen defectivo de reparación del mal emparejamiento (Koi et al., 1994). Nuestro hallazgo de que la línea celular dMsh2-9 deficiente de Msh2 había adquirido tolerancia para el MNNG proporciona una evidencia directa para el apoyo de esta hipótesis. Este hallazgo puede tener implicaciones importantes clínicas. La clase triazina de fármacos carcinoestáticos probablemente deriva de su efecto de citotoxicidad de la metilación en la posición 0^{6} de los residuos G (Michejda et al., 1994). Como los tumores deficientes de MMR son supuestamente tolerantes a estos fármacos, estos pueden despertar una citotoxicidad severa en los tejidos normales del paciente. Además, la persistencia de las bases desapareadas de 0^{6} meG.T en las células tumorales deficientes de MMR podría inducir al incremento de las transiciones de G a A (Aquilina et al. 1993), resultando en una aceleración de la progresión del tumor. Finalmente, el hallazgo de que los agentes de metilación simple seleccionan o inducen a la deficiencia de MMR en las células que indujeron a la hipótesis, de que este proceso está involucrado en la determinación de la especificidad del tejido de tumorigénesis en pacientes con HNPCC, debido a la presencia de dichos agentes en el intestino (Karran and Bignami, 1994: Varlet et al., 1994).

MMR edita la recombinación homóloga en células de mamífero

Previamente, ha sido demostrado que la presencia de menos de un 1% de diferencias entre nucleótidos puede fuertemente suprimir la recombinación homóloga en células de mamífero (Waldman y Liskay, 1988, Te Riele et al., 1992). Aquí, hemos extendido estos resultados y hemos demostrado que las células Msh2 /- han perdido la supresión de la recombinación dependiente de la heterología. En base a los resultados obtenidos en E.coli (Worth et al., 1994), esta función es probablemente mediada por la proteína Msh2 que reconoce los malos emparejamientos ocurridos durante la formación del heterodúplex entre dos cadenas de DNA no perfectamente complementarias. Esto puede directamente desestabilizar el heterodúplex o, alternativamente, evitar la elongación de la cadena intercambiada. Los resultados similares han sido recientemente obtenidos con las cadenas de levaduras deficientes en MSH2 (Alani et al., 1994; Selva et al. 1995), sugiriendo que este papel del MMR está fuertemente preservado durante la evolución. En E.coli, la pérdida del MMR ha sido mostrada para resultar en una elevada frecuencia de reordenaciones inter- e intracromosomales debido a la recombinación ectópica entre las secuencias divergentes (Rayssiguier. et al., 1989; Petit et al. 1991). A parte del genoma de E coli, los genomas de mamíferos contienen varias secuencias repetidas pero divergentes. Los ejemplos de estas son familias de genes cómo secuencias SINE, secuencias LINE y pseudogenes (Brosius and Gould, 1992; Nowak, 1994). La recombinación ectópica entre estas secuencias podría llevar a reorganizaciones genómicas que pueden ser perjudiciales para la viabilidad de la célula debido a la pérdida de la información genómica esencial o, alternativamente, da lugar a la activación de los oncogenes o a la inactivación de los genes supresores del tumor (Bouffler et al., 1993). La recombinación homóloga entre los alargamientos del DNA idénticos deben ser aceptados para proceder, sin embargo, para aceptar la reparación recombinacional de la doble cadena se rompe utilizando (idéntica) cromátida hermana cómo secuencia donante. Por este motivo, los mecanismos que contrarestan la recombinación homóloga cuando ambos alargamientos recombinantes contienen divergencias, mientras que permiten la recombinación para proseguir cuando ambos alargamientos son idénticos, puede ser de gran importancia para las células de mamífero para ser capaces de reparar sin peligro de desordenación del genoma. En base al efecto de la deficiencia de Msh2 en el gen diana, es probable que MMR juegue un papel de examinador.

Nuestro hallazgo de que el Msh2 actúa no sólo cómo anti-mutagénico sino también cómo anti-recombinogénico, sugiere que la deficiencia de MMR puede contribuir a la tumorigénesis mediante el índice de ambas mutaciones puntuales y reorganizaciones cromosomales.

Procedimientos experimentales Alteración del Msh2 en células ES de ratón

Los fragmentos genómicos Msh2 se obtuvieron por cribaje de una librería de DNA derivada del genoma 1290LA con una muestra de cDNA Msh2 murino (Varlet et al., 1994). La construcción de dianas se preparó por subclonación del fragmento BamH con 12.5 kbp, e insertando un gen de resistencia a la higromicina (de PGKhyg, te Riele et al., 1990) en el único sitio SnaB I localizado dentro de una secuencia de exón Msh2. Los procedimientos de clonaje se llevaron a cabo de acuerdo con Sambrook et al. (1989).

La construcción de dianas se separó de las secuencias del vector por electroforesis en gel purificado, mediante electroelución, e introducido dentro de la línea celular ES E14 derivada de 1290LA mediante electroporación cómo lo ya descrito (te Riele et al., 1992). Las células electroporadas se sembraron en placas de 10cm cubiertas de gelatina (10^{7} células, por pocillo) y las sometieron a la selección con higromicina B (150 \mug por ml) en medio-BRL condicionado (Hooper et al., 1987) el siguiente día. Después de 10 días, las colonias resistentes a la higromicina B se seleccionaron al azar y se extendieron en estratos de alimentación de fibroblastos embrionarios de ratón. El DNA se extrajo de las colonias expandidas, se digerió con EcoRI y se analizó con hibridización Southern utilizando sondas para el flanqueamiento de ambos lados de la construcción diana (Fig. IA). Se obtuvieron dos líneas celulares de entre 135 colonias resistentes a la higromicina B que muestran grupos diagnósticos para la integración correcta del marcador hyg entre los codones 588 y 589 de una copia del gen Msh2. Estas líneas celulares fueron designadas sMsh2-42 y sMsh2-55. Se utilizó una línea celular obtenida de este experimento, designada cómo wt-2, que lleva un gen hyg integrado aleatoriamente, cómo gen control Msh2+/+.

Para obtener una línea celular ES que lleva una alteración en ambas copias de Msh2, se colocaron 10^{6} células de la línea celular sMsh2-55 en placas de 10cm y se cultivaron en medio condicionado de BRL que contiene 1,0 o 1,5 mg por ml de higromicina B. Después de 12 días de cultivar en medio selectivo y 7 días en un medio no selectivo, se obtuvieron 24 colonias que han sobrevivido a 1,5 mg por ml de higromicina B. El DNA se extrajo de las colonias expandidas, se digerió con EcoRI y se analizó por hibridización Southern. Una línea celular, designada cómo dMsh2-9, llevaba 2 alelos alterados Msh2, había perdido la copia de tipo salvaje y contenía el número normal de cromosomas. Las líneas celulares ES que habían sobrevivido a una cantidad de higromicina B de 1,0 mg por ml contenían una alteración y una copia de tipo salvaje de Msh2. Una de estas líneas Msh2+I- se designó cómo sMsh2-21 y se utilizó para varios experimentos.

Creación del mutante de ratón Msh2

Se obtuvieron ratones quiméricos mediante la inyección de 10-15 células de líneas celulares sMsh2-55, sMsh2-42 y dMsh2-9 dentro de los blastocistos C57B1/6. Los machos quimeros obtenidos con células ES Msh2+/- se cruzaron con ratones de tipo salvaje 1290LA y FVB, y se buscó la transmisión del alelo Msh2 mutado a través de la línea germinal. Se obtuvieron ratones mutantes homozigotos Msh2 mediante el entrecruzamiento de heterozigotos Fl.

Ensayo del gel de desplazamiento

La preparación de extractos celulares, la hibridación de los oligonucleótidos, la unión de extractos celulares a oligonucleótidos mal emparejados o nucleótidos extrahelicales, a los que se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante esencialmente cómo se describe (Stephenson y Karran, 1989). Sin embargo, se hizo una electroforesis en gel preferentemente en el tampón TAE que en el tampón TBE. Para obtener oligonucleótidos dúplex, el oligonucleótido U: 5'-GGGAAGCTGCCAGGCCCCAGTGTCAGCCTCCTATGCTC-3' (secuencias derivadas de Aquilina. et al 1994) se marcó radioactivamente y se hibridó con cualquiera de los siguientes oligonucleótidos sin marcar: L-G.T: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACATTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un mal emparejamiento G.T); L-G.A: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACAATGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un mal emparejamiento G.A): L-G.G: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACAGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un mal emparejamiento G.G); L-A.C: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un mal emparejamiento A.C); L-TG: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACACTGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un dinucleótido extrahelical TG): L-HOM: S'-GAGCATAGGAGGCTGACACTGGGGCCTGG
CAGCTTCCC-3' (resultando en un homodúplex); L-LOOP14: 5'-GAGCATAGGAGGCTGACACATACGTGAG
TACTCTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3' (resultando en un lazo IDL de 14 nucleótidos extrahelicales). En todos los ensayos, se incluyó el doble de exceso del oligonucleótido competidor homodúplex no marcado. Como control positivo, se utilizó un oligonucleótido dúplex que contiene un sitio de unión para la familia E2F de factores de transcripción. (Beijersbergen et al., 1995).

Amplificación de microsatélites por PCR

Los clones de las líneas celulares ES dMsh2-9 y wt-2 se generaron mediante la siembra de células en estratos de alimentación de fibroblastos embrionarios de ratón a una densidad de 10^{3} células por cada 10 cm^{2}. En aquel momento, las líneas celulares ES estuvieron en el cultivo durante aproximadamente 20 divisiones desde su generación. Se desarrollaron 24 colonias de cada línea celular. El DNA cromosomal se aisló y se sometió a la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los dos pares de cebadores marcados en los extremos (D14Mit15 y D7Mit17, Dietrich et al., 1994). Los productos amplificados se electroforizaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante.

Frecuencia de mutación

Se colocaron 6 x 10^{6} células de las líneas celulares ES dmsh2-9 y wt-2 en 486 cm^{2} de superficie del cultivo del tejido recubierto de gelatina en medio condicionado BRL. Después de 2 días, se añadió 6-Tioguanina a una concentración de 10 \mug por ml. Después de dos semanas el número de colonias resistentes se contó.

Sensibilidad a MNNG

Las líneas celulares ES dMsh2-9, sMsh2-21 y wt-2 se sembraron en los estratos de alimentación MEF a una densidad de 10^{3} células por cada 4 cm^{2}. El siguiente día, las células se expusieron durante una hora a un rango de concentración de MNNG desde cero hasta 36,45 \muM en medio libre de suero. Después de 4 días de incubación, las células se tripsinizaron teñidas con Trypan blue y se contaron. Durante todo el procedimiento a partir de una hora después de la exposición a MNNG; se incluyó O^{6}-bencilguanina (20 AM, proporcionada gentilmente por A. Pegg) al medio para inhibir competitivamente la actividad de la metiltransferasa endógena que podría quitar los grupos metil añadidos por MNNG (Dolan et al. 1990).

Señalización de dianas Rb con DNA isogénico y no-isogénico

Se realizó una señalización de dianas y un análisis del locus Rb en una línea celular ES derivada de BALB/c (Proporcionada amablemente por S.Rastan) y las líneas celulares ES dMsh2-9 derivadas de 129/OLA esencialmente cómo se describe (te Riele et al. 1992). Las construcciones de 129Rb-neo diana (derivadas del genoma 1290LA) y B/cRb-neo (derivadas del genoma BALB/c) llevan una inserción de marcador pMClneo en el exón 19 del gen Rb y difiere aproximadamente en un 0,6% del nivel de nucleótidos (te Riele et al, 1992).

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Figuras

Fig. 1

Alteración señalizada como diana del gen de ratón Msh2

A: Arriba: un diagrama esquemático de la proteína de ratón Msh2. La unión a ATP y a HTH: dominios ATPasa y la hélice-giro-hélice putativos, respectivamente (Varlet et al, 1994). Se indicó la posición en la que la proteína es alterada por la inserción del marcador Hyg. Abajo: el locus genómico Msh2; indicado debajo es la construcción diana que lleva el marcador Hyg marker insertado en un único sitio SnaB I dentro de la secuencia del exón de Msh2. Se indicaron las posiciones de las sondas externas utilizadas para la detección de los sucesos diana.

B: El locus Msh2 en la línea celular Msh2+/+ wt-2, Msh2+/- sMsh2-55 y línea celular Msh2-/- dMsh2-9. El DNA genómico de estas líneas celulares fue digerido con EcoRI y analizado con hibridización Southern utilizando la sonda I (Fig. IA). Las flechas indican las posiciones de los alelos de tipo salvaje (wt, 20 kbp), y alterados (ko, 7.5 kbp).

Fig. 2

Actividad de la unión del mal emparejamiento en las células de tipo salvaje y deficientes en Msh2

La actividad de unión en los extractos de la línea celular Msh2+/+ wt-2 y de la línea celular Msh2-/- dmsh2-9 a los oligonucleótidos de doble cadena que contiene un mal emparejamiento (G.T. G.A. G.G. o A.C), un dinucleótido extrahelical (Extrahelical-TG), o un lazo de 14 nucleótidos (lazo 14') y un homodúplex se ensayó utilizando un ensayo de gel de retroceso. Las secuencias de los oligonucleótidos se dan bajo procedimientos experimentales. Las flechas indican las posiciones de los complejos específicos de mal emparejamiento. E2F: Unión a un oligonucleótido que lleva un sitio E2F que sirve cómo control positivo (Beijersbergen et al, 1995).

Fig. 3

Estabilidad del microsatélite en células de tipo salvaje y deficientes de Msh2

El DNA genómico de 24 subclones que deriva de la línea celular Msh2+/+ wt-2 y Msh2-/- dmsh2-9 se amplificó por PCR utilizando el grupo de cebadores D7Mit17 y DI4Mit15. Las flechas indican los alelos microsatélite con una amplia alteración detectable.

Fig. 4

Tolerancia de células deficientes en Msh2 para el agente metilante simple MNNG

Las líneas celulares ES wt-2 (Msh2+/+), sMsh2-55 (Msh2+/-) y dMsh2-9 (Msh2-/-) se expusieron a cantidades crecientes de MNNG durante una hora en presencia de 06-bencilguanina. Después de cuatro días de incubación las células se tripsinizaron y se contaron.

TABLA 1 Recombinación homóloga ha perdido la dependencia en la identidad de secuencia en las células ES deficientes de Msh2

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}[t]{150mm} 129 Rb-neo  y
 B/cRb-neo  son construcciones Rb diana,
preparadas de las  cadenas 129 y BALB/c de ratón, respectivamente,
con una divergencia en la  secuencia del 0,6%. Las frecuencias diana
en células ES 1290LA ( Msh2+/+ ) se  derivan de te Riele  et
al .,
1992.\end{minipage} \cr}

Claims (20)

1. Un método para modificar el genoma de células de mamífero no humanas deficientes en el gen Msh2 del sistema de reparación de los malos emparejamientos, in vitro mediante la recombinación homóloga entre un locus diana específico en el genoma y uno homólogo pero con una secuencia divergente diana de DNA introducida en la célula deficiente del gen Msh2 reparador del mal emparejamiento de DNA y dicha secuencia diana tiene hasta un 30% de diferencias en la secuencia base con respecto al locus diana en la región dónde tiene lugar la recombinación o dicha secuencia diana difiere del locus diana a tal nivel que la recombinación homóloga está normalmente fuertemente impedida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento se inactiva por la alteración de ambas copias del gen Msh2.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento se inactiva por la introducción de construcciones de RNA antisentido, conducidas por un promotor apropiado, de esta manera funcionalmente se inactiva el gen Msh2.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento es inactivado mediante la introducción de oligodeoxinucleótidos antisentido modificados, por ello funcionalmente se inactiva el gen Msh2.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento se inactiva mediante la expresión de una versión del gen negativamente dominante implicada en la reparación del mal emparejamiento del DNA.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, dónde el gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento está inactivado transitoriamente mediante la saturación del gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento y la introducción dentro de la célula de moléculas de DNA que contienen una o más bases desapareadas.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en dónde la célula diana es una célula madre embrionaria o una célula de tipo afín derivada de varias especies de mamíferos, para ser utilizada para generar animales quiméricos y animales quiméricos que pueden transmitir el genoma mutado mediante la línea germinal.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en dónde la célula diana es una línea celular derivada de cualquier especie de mamífero y cultivada in vitro.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en dónde la célula diana deriva de cualquier órgano de cualquier especie de mamífero.

10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en dónde la célula diana deriva de organismos no innatos que implica que éstas tengan copias no idénticas de cromosomas homólogos.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en dónde el DNA diana en la región dónde la recombinación homóloga tiene lugar deriva de las mismas especies que la célula diana.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en dónde el DNA diana se modifica in vitro en los sitios específicos deliberadamente introduciendo secuencias divergentes.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en dónde el DNA diana en la región dónde la recombinación homóloga tiene lugar se deriva de las mismas especies que la célula diana pero no es isogénico con el DNA de la célula diana, las diferencias entre las secuencias difieren hasta un 5% al nivel del nucleótido.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en dónde el DNA diana en la región dónde tiene lugar la recombinación homóloga se deriva de otras especies cómo la célula diana, la secuencia de señalización de dianas y el locus diana que comprende más de un 30% de divergencias de secuencia en la región dónde la recombinación homóloga tiene lugar.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en dónde el DNA diana es un fragmento cromosomal de DNA que lleva un YAC o un vector cósmido.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en dónde el DNA diana es un oligonucleotido de cadena simple o doble que consiste en 10-100 bases o pares de bases de las cuales una o varias bases o pares de bases difieren del locus diana.

17. Un método para ensayar la inactivación del gen Msh2 del sistema de reparación del mal emparejamiento utilizando un método de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 ó 6 e incluyendo la comparación de la
eficiencia de las construcciones diana de DNA isogénicas versus no isogénicas.

18. Un método para ensayar la inactivación del gen Msh2 de reparación del mal emparejamiento utiliza un método de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 ó 6 e incluye la recombinación intracromosomal entre homólogos excepto entre secuencias divergentes de DNA.

19. Un método para ensayar la recombinación homóloga utilizando un método de acuerdo con las reivindicaciones 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 y usando una línea celular madre embrionaria no humana o cualquier otra línea celular en la que el sistema de reparación del mal emparejamiento se inactiva mediante la alteración de ambas copias del gen Msh2.

20. El método de acuerdo con las reivindicaciones 8, 9 ó 10 que proporciona células o líneas celulares del ratón deficiente de la reparación del mal emparejamiento que llevan una alteración en ambas copias del gen Msh2.