ES2230603T3

ES2230603T3 - Adnasa ii humana.

Info

Publication number: ES2230603T3
Application number: ES97922379T
Authority: ES
Inventors: Kevin P. Baker; Will F. Baron
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2017-04-23
Also published as: DE69730967D1; US6265195B1; JP2000509275A; ATE278011T1; US20090041742A1; DE69730967T2; EP0914417A2; US20030219428A1; JP5185914B2; EP0914417B1; JP2010154850A; WO1997040134A2; CA2250433A1; AU2806597A; CA2250433C; US6569429B1; US20050130209A1; PT914417E; WO1997040134A3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA DESOXIRRIBUNOCLEASA, DENOMINADA ADNASA II. LA INVENCION PROPORCIONA SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA ADNASA II HUMANA, PERMITIENDO ASI LA PRODUCCION DE ADNASA HUMANA POR PROCEDIMIENTOS DE ADN RECOMBINANTES, EN CANTIDADES SUFICIENTES PARA USO CLINICO. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y A USOS DIAGNOSTICOS Y TERAPEUTICOS DE LA ADNASA II HUMANA.

Description

ADNasa II humana.

Campo del invento

El presente invento se refiere a la proteína de la desoxirribonucleasa (ADNasa) humana recientemente identificada, al ácido nucleico que codifica tal proteína, al uso de tal proteína y ácido nucleico, así como a la producción de tal proteína y ácido nucleico, por ejemplo, por métodos de ADN recombinante.

Antecedentes del invento

La desoxirribonucleasa (ADNasa) es una fosfodiersterasa capaz de hidrolizar ácido polidesoxirribonucleico y se sabe existe en diversas formas moleculares. Basándose en sus propiedades bioquímicas y en sus actividades enzimáticas, las proteínas ADNasa se han clasificado en dos tipos, ADNasa I y ADNasa II. Las proteínas ADNasa I tienen un pH óptimo cercano a la neutralidad, un requerimiento obligatorio de cationes divalentes y producen nucleótidos 5'-fosfato tras hidrólisis de ADN. Las proteínas ADNasa II exhiben un pH óptimo ácido, no precisan de cationes divalentes para su actividad y producen nucleótidos 3'-fosfato tras hidrólisis de ADN.

Se ha purificado ADNasa de numerosas especies hasta un grado variable. Por ejemplo, numerosas formas de ADNasa I bovina se han purificado y secuenciado en su totalidad (Liao et al., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm et al., J. Mol. Biol. 221: 645-667 (1991)) y el ADN que codifica para la ADNasa I bovina se ha clonado y expresado (Worrall et al., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Las proteínas porcinas y orcinas de ADNasa I también se han purificado y secuenciado en su totalidad (Paudel et al., J. Biol. Chem. 261:16006-16011 (1986); Paudel et al., J. Biol. Chem. 261:16012-16017 (1986)).

Se ha aislado y secuenciado ADN que codifica para la ADNasa I humana y el ADN se ha expresado en células hospedantes recombinantes, permitiendo así la producción de ADNasa I humana en cantidades útiles comercialmente. Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990). El término "ADNasa I humana" se empleará de aquí en adelante para referirse al polipéptido maduro descrito en Shak et al.

El ADN que codifica para otros polipéptidos que tienen homología con la ADNasa I humana también se ha identificado. Rosen et al., PCT Publicación de la patente nº WO 95/30428, publicada el 16 de Noviembre de 1995 y Parrish et al., Hum. Mol. Genet. 4:1557-1564 (1995).

La ADNasa I tiene numerosas aplicaciones conocidas y se ha usado con fines terapéuticos. Su uso terapéutico principal consiste en reducir la viscoelasticidad de las secreciones pulmonares (que incluyen mucosidad) en enfermedades tales como neumonía y fibrosis quística (FQ), de modo que ayudan en el aclaramiento de las vías respiratorias. Véase, por ejemplo, Lourenco et al., Arch. Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Hubbard et al., New Engl. J. Med. 326:812-815 (1992); Fuchs et al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson et al., Drugs 48:894-906 (1994). La mucosidad también contribuye a la morbilidad en la bronquitis crónica, bronquitis asmática, bronquiectasis, enfisema, sinusitis aguda y crónica e, incluso, en el resfriado común. La ADNasa I es eficaz en reducir la viscoelasticidad de las secreciones pulmonares al hidrolizar, o degradar, ADN de elevado peso molecular que está presente en tales secreciones. Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Aitken et al., J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951 (1992).

Según se informa, también se han purificado numerosas formas de ADNasa II, incluyendo la ADNasa II bovina (Lesca, J. Biol. Chem. 251:116-123 (1976)), ADNasa II humana (Yamanaku et al., J. Biol. Chem. 249:3884-3889 (1974), Murai et al., J. Biochem. 87:1097-1103 (1980); Harosh et al., Eur. J. Biochem. 202:479-484 (1991); Yasuda et al., Biochem. Biophys. Acta 1119:185-193 (1992)), ADNasa II porcina (Bernardi et al., Biochemistry 4:1725-1729 (1965); Liao et al., J. Biol. Chem. 260:10708-10713 (1990)) y ADNasa II de rata (Dulaney et al., J. Biol. Chem. 247:1424-1432 (1972)). Las propiedades físicas de las proteínas de ADNasa II humana descritas en esas publicaciones varían considerablemente (p. ej., los pesos moleculares publicados varían desde 32.000 hasta 45.000 Daltons), lo que conduce a la incertidumbre acerca de si hay una o múltiples formas de la proteína humana coexistiendo de manera natural.

Se ha despertado un interés reciente en la ADNasa II humana debido a su posible papel en el proceso de muerte celular programada de apoptosis (Barry et al., Arch. Biochem. Biophys. 300:440-450 (1993); Barry et al., Cancer Res. 53:2349-2357 (1993)). Uno de los sucesos que es característico de este proceso es la degradación de ADN nuclear en fragmentos nucleosomales. La capacidad para prevenir o inhibir la expresión de la ADNasa II humana o su actividad enzimática dentro de las células humanas puede ser importante para evitar o limitar tal destrucción intracelular de ADN y, de este modo, puede ser un medio eficaz de interrumpir el proceso de apoptosis. En otros casos, puede ser útil aumentar la expresión de ADNasa II humana dentro de una población determinada de células en un paciente humano, tales como células cancerosas, para inducir apoptosis de esas células.

Compendio del invento

El presente invento proporciona un procedimiento para producir proteína ADNasa II humana, así como sus análogos y variantes. Como es característico de las proteínas ADNasa II en general, la ADNasa II humana producida exhibe un pH óptimo ácido y no precisa catión divalente para su actividad.

Más específicamente, el presente invento se refiere a un procedimiento, según se reivindica en la reivindicación 1, para producir un polipéptido que teniendo actividad hidrolítica del ADN contiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 de la ADNasa II madura humana; tal procedimiento comprende la transformación de una célula hospedante con una molécula de ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y el cultivo de la célula hospedante bajo condiciones tales que el polipéptido se produce en la célula hospedante.

Realizaciones específicas del procedimiento de acuerdo con el presente invento están sujetas a las reivindicaciones dependientes.

Éstos y otros aspectos del invento se harán aparentes para el técnico experto ordinario tras considerar la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ. ID. nº 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ. ID. nº 2) de la ADNasa II humana. La secuencia guía (señal) de aminoácidos predicha está subrayada y el inicio de la proteína madura está indicado con la punta de flecha. Los ocho residuos de cisteína están indicados con asteriscos y los lugares unidos a N de glicosilación posibles están encerrados en cajas.

Descripción detallada

Los diversos aspectos del presente invento se llevan a cabo primero al proporcionar el ADN aislado que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la ADNasa II humana. Al proporcionar la secuencia nucleotídica codificante completa para la ADNasa II humana, el invento permite la producción de ADNasa II humana por medio de la tecnología del ADN recombinante, de modo que hace que estén disponibles, por primera vez, cantidades suficientes de proteína ADNasa II humana sustancialmente pura para usos diagnósticos y terapéuticos.

Según se usa en esta memoria, el término "ADNasa II humana" se refiere al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína madura expuesta en la Figura 1, así como sus formas modificadas o variantes, según se describen en esta memoria. Las formas modificadas y variantes de la ADNasa II humana se producen in vitro por medio de tratamiento químico o enzimático o in vivo mediante la tecnología del ADN recombinante. Tales polipéptidos difieren de la ADNasa II humana, por ejemplo, en virtud de una o más sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones o en el grado o patrón de glicosilación, pero en todos los casos tendrán actividad hidrolítica del ADN. Una "variante" o "variante de la secuencia de aminoácidos" de la ADNasa II humana es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de aquella de la ADNasa II humana. Generalmente, una variante tendrá al menos un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 95% identidad de secuencia y, más preferiblemente, al menos un 98% de identidad de secuencia con la ADNasa II humana. El porcentaje de identidad de secuencia se determina, por ejemplo, mediante el Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983), versión del algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), después de alinear la secuencia para proporcionar homología máxima. Tales variantes incluyen formas alélicas de la ADNasa II humana que existen en la naturaleza, que son de origen humano, así como, homólogos de la ADNasa II humana que existen en la naturaleza que se encuentran en otras especies animales.

"Actividad hidrolítica del ADN" se refiere a la actividad enzimática de la ADNasa II humana de hidrolizar (escindir) un sustrato de ADN para proporcionar como productos finales oligonucleótidos 3'-fosforilados. La actividad hidrolítica del ADN se determina fácilmente mediante cualquiera de los diversos métodos diferentes conocidos en la técnica, incluyendo electroforesis en geles analíticos de poliacrilamida y agarosa, ensayo de hipercromicidad (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) o ensayo de verde de metilo (Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)). De forma rutinaria, el pH y el tampón que se emplean en estos métodos son variados, de manera que proporcionen las condiciones en las que la ADNasa II humana particular exhiba tal actividad, si la tuviera.

Por conveniencia, las sustituciones, inserciones y/o deleciones en la secuencia de aminoácidos de la ADNasa II humana se consiguen normalmente introduciendo mutaciones dentro de la secuencia nucleotídica correspondiente del ADN que codifica para la ADNasa II humana, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a un sitio. La expresión del ADN mutado resulta entonces en la producción de la variante de ADNasa II humana que tiene la secuencia de aminoácidos deseada.

Mientras que cualquier técnica conocida en el campo puede usarse para realizar mutagénesis dirigida a un sitio, por ejemplo, según se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989)), la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos es el método preferido para preparar las variantes de ADNasa II humana de este invento. Este método, que es bien conocido en la técnica (Zoller et al., Meth. Enzymol. 100:4668-5000 (1983); Zoller et al., Meth. Enzymol. 154:329-350 (1987); Carter, Meth. Enzymol. 154:382-403 (1987); Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Horwitz et al., Meth. Enzymol. 185:599-611 (1990)), es especialmente apropiado para fabricar variantes de sustitución, aunque puede usarse también para preparar convenientemente variantes de deleción e inserción, así como variantes que tengan múltiples mutaciones de sustitución, inserción y/o deleción.

Brevemente, al llevar a cabo mutagénesis dirigida a un sitio de ADN que codifica para la ADNasa II humana (o una de sus variantes), el ADN se altera al hibridar primero un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada a una cadena sencilla del ADN. Después de la hibridación, una ADN polimerasa se emplea para sintetizar una segunda cadena completa, usando el oligonucleótido hibridado como un cebador y empleando la cadena sencilla del ADN como molde. De este modo, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN de doble cadena resultante.

Los oligonucleótidos pueden prepararse mediante cualquier método apropiado, tal como por purificación de un ADN que exista de forma natural o por síntesis in vitro. Por ejemplo, los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente empleando varias técnicas de química orgánica, tal como se describe en Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985). El enfoque general para seleccionar un oligonucleótido adecuado para su uso en mutagénesis dirigida a un sitio se conoce bien. Típicamente, el oligonucleótido contendrá 10-25 o más nucleótidos e incluirá al menos 5 nucleótidos en cualquier sitio de la secuencia que codifiquen para la mutación deseada para así asegurar que el oligonucleótido hibridará de forma preferente en el lugar deseado con la molécula molde de ADN de cadena sencilla.

"La reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere generalmente a un método de amplificación de una secuencia de nucleótidos deseada in vitro, según se describe, por ejemplo, en el documento de EE.UU. Pat. nº 4.683.195. En general, el método de PCR conlleva ciclos repetidos de síntesis de extensión del cebador, empleando cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridar preferentemente a un molde de ácido nucléico.

La mutagénesis por PCR (Higuchi, en PCR Protocols, págs. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)) también resulta adecuada para construir las variantes de ADNasa II humana. Brevemente, cuando se emplean pequeñas cantidades de ADN molde como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en secuencia de la correspondiente región en el molde de ADN pueden usarse para generar relativamente grandes cantidades de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia molde sólo en las posiciones donde los cebadores difieren del molde. Para introducir una mutación en un ADN plasmídico, por ejemplo, la secuencia de uno de los cebadores incluye la mutación deseada y se designa para hibridar a una cadena del ADN plasmídico en la posición de la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a la secuencia nucleotídica dentro de la cadena opuesta del ADN plasmídico, pero esta secuencia puede situarse en cualquier lugar a lo largo del ADN plasmídico. Se prefiere, no obstante, que la secuencia del segundo cebador se sitúe a unos 200 nucleótidos de la del primero, de tal modo que al final la región amplificada completa del ADN unida por los cebadores pueda secuenciarse fácilmente. La amplificación por PCR empleando un par de cebadores como el descrito resulta en una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de una mutación especificada por el cebador y, posiblemente, en otras posiciones, ya que el copiado del molde es de alguna manera propenso a errores. Wagner et al., en PCR Topics, págs. 69-71 (Springer-Verlag, 1991).

Si la proporción de molde a producto amplificado de ADN es demasiado baja, la mayoría de los fragmentos de ADN producidos incorporan la(s) mutación(es) deseada(s). Este ADN producido se emplea para reemplazar la correspondiente región en el plásmido que sirvió de molde de la PCR, empleando métodos estándares del ADN recombinante. Pueden introducirse mutaciones en posiciones separadas de forma simultánea, bien usando un segundo cebador mutante o bien llevando a cabo una segunda PCR con cebadores mutantes diferentes y ligando simultáneamente los dos fragmentos de PCR resultantes al fragmento del plásmido en una ligación de tres (o más) partes.

Otro método para preparar variantes, la mutagénesis de cassette, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que contenga la secuencia de ADN a mutar. Se identifica el codón(es) que va a mutarse en el ADN de partida. Debe haber un único sitio de restricción por endonucleasa a cada lado del sitio(s) de la mutación identificada. Si no existen tales sitios de restricción, éstos deben generarse empleando el método anteriormente descrito de mutagénesis dirigida por un oligonucleótido para introducirlos en los lugares apropiados en el ADN. El ADN plasmídico se corta en esos sitios para linealizarlo. Un oligonucleótido de cadena doble que codifica la secuencia de ADN entre los sitios de restricción, pero contiene la mutación(es) deseada se sintetiza mediante procedimientos estándar, en los que las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan de forma separada y se hibridan juntas entonces por técnicas convencionales. Este oligonucleótido de doble cadena se conoce como el cassette. Este cassette está diseñado para tener extremos 5' y 3' que sean compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que pueda ligarse al plásmido directamente. El plásmido resultante contiene la secuencia de ADN mutada.

La presencia de la mutación(es) en el ADN se determina por métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen mapeo de restricción y/o secuenciación de ADN. Un método preferido para secuenciar ADN es el método de terminación de la cadena por didesoxi de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979).

ADN que codifica para la ADNasa II humana se inserta en un vector de replicación para su posterior clonaje o expresión. Los "vectores" son plásmidos y otros ADNs que son capaces de replicarse dentro de una célula hospedadora y, como tales, son útiles para realizar dos funciones en conjunción con la célula hospedante compatible (un sistema vector-hospedante). Una función es facilitar el clonaje del ácido nucléico que codifica para ADNasa II humana, es decir, producir cantidades utilizables del ácido nucléico. La otra función es dirigir la expresión de la ADNasa II humana. Una o ambas de estas funciones se llevan a cabo por el vector en la célula hospedante particular empleada para el clonaje o expresión. Los vectores tendrán distintos componentes dependiendo de la función que vayan a realizar.

La ADNasa II humana del presente invento puede expresarse en forma de una pre-proteína en la que la ADNasa II incluye una secuencia guía o señal o puede estar en forma de una proteína madura que carece de secuencia guía o señal. La ADNasa II humana puede también estar en forma de una proteína de fusión, en la que aminoácidos adicionales se unen covalentemente al extremo amino o carboxilo de la preproteína o de la forma madura de la ADNasa.

Para producir ADNasa II humana, un vector de expresión incluirá el ADN que codifica para la ADNasa II humana, según se describe anteriormente, unido operativamente a un promotor y a un lugar de unión al ribosoma. La ADNasa II humana se expresa entonces directamente en el cultivo celular recombinante o como fusión con un polipéptido heterólogo, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio específico de rotura en la unión entre el polipéptido heterólogo y la secuencia aminoacídica de la ADNasa II humana.

"Unido operativamente" se refiere a la unión covalente de dos o más secuencias de ADN, por medio de ligación enzimática o de otra manera, en una configuración relativa tal el uno del otro que la función normal de las secuencias pueda llevarse a cabo. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o una guía secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente a la secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está situado de forma que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN unidas están contiguas y, en el caso de la guía secretora, contigua y en fase de lectura. La conexión se lleva a cabo mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se emplean entonces oligonucleótidos adaptadores o conectores sintéticos, junto con métodos de ADN recombinantes estándar convencionales.

Los procariotas (por ejemplo, cepas de E. coli o Bacillus, Pseudomonas y otras bacterias) son las células hospedantes preferidas para los pasos iniciales del clonaje de este invento. Son particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de las copias de ADN de cadena sencilla empleadas en la mutagénesis dirigida a un sitio y para la secuenciacíón de ADN de las variantes generadas. Las células hospedantes procariotas pueden emplearse también para la expresión del ADN que codifica para la ADNasa II humana. Los polipéptidos que se producen en las células procariotas no estarán glicosilados típicamente.

Además, la ADNasa II humana puede expresarse en células hospedantes eucariotas, que incluyen microbios eucariotas (por ejemplo, levaduras) o células derivadas de un animal u otro organismo multicelular (por ejemplo, células de ovario de hamster chino y otras células de mamífero) o en animales vivos (por ejemplo, vacas, cabras, ovejas). También pueden usarse células de insecto y de hongos.

Las metodologías de clonaje y expresión son bien conocidas en la técnica. Ejemplos de células hospedantes procariotas y eucariotas y vectores de expresión de partida adecuados para su empleo en producir ADNasa II humana son, por ejemplo, los descritos por Shak, publicación de patente PCT nº WO 90/07572, publicado el 12 de julio de 1990. Para conseguir expresión de la ADNasa II humana, un vector de expresión del invento se introdujo en las células hospedantes por transformación o transfección y las células hospedantes recombinantes resultantes se cultivaron en medio nutritivo convencional, modificado de forma apropiada para inducir los promotores, seleccionar las células recombinantes o amplificar el ADN de la ADNasa II humana. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares son las empleadas previamente con la célula hospedante y de tal forma serán aparentes para el técnico de experiencia normal.

"Transformación" y "transfección" se emplean de manera intercambiable para referirse al procedimiento de introducir ADN dentro de una célula. Después de la transformación o transfección, el ADN puede integrarse dentro del genoma de la célula hospedante o puede permanecer como un elemento extracromosómico. Si se emplean como hospedantes células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, los métodos preferidos de transfección de las células con ADN son el método de tratamiento con calcio descrito por Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110-2114 (1972) o el método del polietilenglicol de Chung et al., Nuc. Acids Res. 16:3580 (1988). Si se emplean levaduras como hospedante, la transfección generalmente se lleva a cabo empleando polietilenglicol, según enseñó Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:1929-1933 (1978). Si se emplean células de mamífero como células hospedantes, la transfección se lleva a cabo generalmente por el método de la precipitación del fosfato de calcio, Graham et al., Virology 52:546 (1978); Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990). Sin embargo, otros métodos conocidos para introducir el ADN en células procariotas y eucariotas, tales como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de protoplastos, también son adecuados para su empleo en este invento.

Especialmente útiles en este invento son los vectores de expresión que proporcionan una expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica para la ADNasa II humana. En general, la expresión transitoria conlleva el empleo de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficazmente en una célula hospedante, de modo que la célula hospedante acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que contienen un vector de expresión adecuado y una célula hospedante, permiten la conveniente identificación positiva de polipéptidos codificados por los ADNs clonados, así como la selección rápida de tales polipéptidos por propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Wong et al., Science 228:810-815 (1985); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985); Yang et al., Cell 47:3-10 (1986). De este modo, los sistemas de expresión transitoria se emplean convenientemente para expresar el DNA que codifica para secuencias de aminoácidos de variantes de ADNasa II humana, en conjunto con ensayos para identificar las variantes que tienen tales propiedades de utilidad, como aumento de la vida media o disminución de la inmunogenicidad in vivo o aumento de la actividad hidrolítica del ADN a pH fisiológico.

La ADNasa II humana es secretada preferentemente por las células hospedantes en las que se expresa, en cuyo caso la variante se recupera del medio de cultivo en el que las células hospedantes han crecido. En tal caso, puede ser deseable crecer las células en medio de cultivo sin suero, dado que la ausencia de las proteínas del suero y de otros componentes del suero en el medio puede facilitar la purificación de la variante. Si no se secreta, entonces la ADNasa II humana se recupera a partir de los lisados de las células hospedantes. Cuando la ADNasa II humana se expresa en una célula hospedante de origen distinto al humano, la variante no tendrá ninguna proteína de origen humano. En cualquier caso, será necesario purificar la ADNasa II humana a partir de las proteínas de la célula recombinante para obtener preparaciones sustancialmente homogéneas de la ADNasa II humana. Para usos terapéuticos, la ADNasa II human purificada será de una pureza superior al 99% (es decir, cualquier otra proteína constituirá menos del 1% del total de proteína en la composición purificada).

Se contempla además que la ADNasa II humana pueda producirse por un método que incluya recombinación homóloga y amplificación, por ejemplo, según se describe en la publicación de patente PCT nº WO 91/06667, publicada el 16 de Mayo, 1991. En resumen, este método incluye transformar células que contienen un gen endógeno que codifica para la ADNasa II humana con un ADN homólogo, tal ADN homólogo incluye (1) un gen amplificable (por ejemplo, un gen que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR)) y (2) al menos una secuencia flanqueadora, que tiene una longitud de al menos unos 150 pares de bases, que es homóloga a la secuencia de nucleótidos del genoma de la célula que está dentro o en proximidad al gen que codifica para la ADNasa II humana. La transformación se lleva a cabo bajo condiciones tales que el ADN homólogo se integra en el genoma celular por recombinación. Las células que integran el ADN homólogo se someten entonces a condiciones que seleccionan por amplificación el gen amplificable, por medio de lo cual el gen de la ADNasa II humana se amplifica concomitantemente. Las células resultantes se seleccionan entonces por la producción de cantidades deseadas de ADNasa II humana. Las secuencias flanqueadoras que están en la proximidad a un gen que codifica para la ADNasa II humana son fácilmente identificadas, por ejemplo, por el método del paseo genómico, usando como un punto de partida la secuencia de nucleótidos de la ADNasa II humana mostrada en la Figura 1. Spoerel et al., Meth Enzymol. 152:598-603 (1987).

Generalmente, la purificación de la ADNasa II humana se realiza aprovechando las propiedades fisicoquímicas diferenciales de la ADNasa II humana comparada con las de los contaminantes con los que pudiera estar asociada. Por ejemplo, como un primer paso, el medio de cultivo o el lisado de células hospedantes se centrifugan para retirar restos celulares particulados. A continuación la ADNasa II humana se purifica de proteínas contaminantes solubles y de polipéptidos, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio o etanol, filtración en gel (cromatografía de exclusión molecular), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de inmunoafinidad (por ejemplo, mediante el uso de una columna que contenga anticuerpos contra la ADNasa II humana unidos a sefarosa), cromatografía de intercambio catiónico tentacle (Frenz et al., patente de EE.UU. nº 5.279.823, publicada el 18 de Enero, 1994), HPLC de fase reversa y/o electroforesis en gel.

En algunas células hospedantes (especialmente en células hospedantes bacterianas) la ADNasa II humana puede expresarse inicialmente como una forma insoluble, agregada (referido en la técnica como "cuerpos refractarios" o "cuerpos de inclusión"), en cuyo caso será necesario solubilizar y volver a naturalizar la ADNasa II humana en el curso de su purificación. Métodos para solubilizar y renaturalizar los cuerpos refractarios de proteínas recombinantes se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Builder et al., patente de EE.UU. nº 4.511.502, publicada el 16 de Abril, 1985).

En otra realización de este invento, se realizan directamente modificaciones covalentes sobre la ADNasa II humana para proporcionarle una propiedad deseada (por ejemplo, aumento de la vida media o disminución de la inmunogenicidad in vivo o aumento de la actividad hidrolítica del ADN a pH fisiológico) y pueden efectuarse en lugar de o además de las mutaciones de sustitución, inserción y deleción de la secuencia de aminoácidos descritas anteriormente.

Las modificaciones covalentes se introducen por reacción de aminoácidos fijados de la ADNasa II humana con un agente orgánico derivador que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de aminoácidos o con residuos terminales N- o C-. Agentes de derivatización adecuados y los métodos son bien conocidos en la técnica. El acoplamiento covalente de glicósidos a los aminoácidos de la proteína puede emplearse para modificar o aumentar el número o configuración de los sustituyentes carbohidrato.

La unión covalente de agentes tales como polietilenglicol (PEG) o albúmina sérica humana a la ADNasa II humana puede reducir la inmunogenicidad y/o toxicidad de la ADNasa II humana y/o prolongar su vida media, como se ha observado para otras proteínas. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznansky et al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson et al., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992). Como otro ejemplo, la variante o forma modificada de la ADNasa II humana puede incluir una mutación de la secuencia de aminoácidos u otra modificación covalente que reduzca la susceptibilidad de la variante a la degradación por proteasas (por ejemplo, elastasa neutrófila) que pueden estar presentes en el esputo y en otros materiales biológicos, comparada con la de la ADNasa II humana.

Los anticuerpos frente a la ADNasa II humana se producen inmunizando un animal con ADNasa II humana o con uno de sus fragmentos, opcionalmente en conjunción con un polipéptido inmunogénico y, subsecuentemente, recuperando los anticuerpos del suero de los animales inmunizados. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células de animales inmunizados de la forma convencional. Los anticuerpos también pueden fabricarse en la forma de anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados) o de cadena sencilla o fragmentos Fab, usando métodos bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, los anticuerpos se unirán a la ADNasa II humana, pero no se unirán sustancialmente a (es decir, no presentarán reacción cruzada con) otras proteínas ADNasa (tales como la ADNasa I humana y bovina). Los anticuerpos pueden usarse en métodos relativos a la localización y actividad de la ADNasa II humana, por ejemplo, para detectar ADNasa II humana y medir sus niveles en tejidos o muestras clínicas. Los anticuerpos frente a ADNasa II humana inmovilizados son particularmente útiles en la detección de ADnasa II humana en muestras clínicas con propósitos diagnósticos y en la purificación de la ADNasa II humana.

La ADNasa II humana purificada se usa para reducir la viscoelasticidad de material que contiene ADN, como el esputo, el moco u otras secreciones pulmonares. La ADNasa II humana es particularmente útil para el tratamiento de pacientes con enfermedad pulmonar que tienen secreciones anormalmente viscosas o espesas y afecciones como la enfermedad pulmonar de bronquitis aguda o crónica, que incluye pneumonia infecciosa, bronquitis o traqueobronquitis, bronquiectasias, fibrosis quística, asma, tuberculosis e infecciones fúngicas. Para tales tratamientos, una solución o una preparación seca finamente dividida de la ADNasa II humana es vertida en la forma convencional en las vías aéreas (por ejemplo, bronquios) o pulmones de un paciente, por ejemplo transformando la misma en aerosol.

La ADNasa II humana también es útil para el tratamiento auxiliar de abscesos o de infecciones graves de espacios cerrados en afecciones como enfisema, meningitis, abscesos, peritonitis, sinusitis, otitis, periodontitis, pericarditis, pancreatitis, colelitiasis, endocarditis y artritis séptica, así como en tratamientos tópicos en numerosas lesiones inflamatorias e infectadas de la piel y/o membranas de la mucosa, heridas quirúrgicas, lesiones ulcerativas y quemaduras. La ADNasa II humana puede mejorar la eficacia de los antibióticos empleados en el tratamiento de tales infecciones (por ejemplo, la actividad de la gentamicina se encuentra marcadamente reducida por unión reversible a ADN intacto).

La ADNasa II humana también es útil en la prevención del desarrollo de nuevas infecciones respiratorias y/o exacerbaciones, tal como puede ocurrir en pacientes que tienen fibrosis quística, bronquitis crónica, asma, neumonía u otras enfermedades pulmonares o en pacientes cuya respiración está asistida por ventilador o por otro aparato mecánico, o en otros pacientes en riesgo de desarrollar infecciones respiratorias, por ejemplo, pacientes que han sido sometidos a cirugía.

La ADNasa II humana también es de utilidad para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico (LES), una enfermedad autoinmune mortal caracterizada por la producción de numerosos autoanticuerpos. El ADN es un componente antigénico importante de los complejos inmunes. En este caso, la ADNasa II humana puede administrarse sistémicamente a los pacientes afectados, por ejemplo, mediante administración intravenosa, subcutánea, intratecal o intramuscular.

Finalmente, la ADNasa II humana es útil para el tratamiento de otras afecciones no infecciosas, en las que hay una acumulación de restos celulares que incluye ADN celular, tales como la pielonefritis y la enfermedad renal túbulo-intersticial.

La ADNasa II humana puede formularse de acuerdo a métodos conocidos para preparar composiciones útiles terapéuticamente. Típicamente, la ADNasa II humana se formula con un excipiente (o vehículo) aceptable fisiológicamente para uso terapéutico. Tales excipientes se emplean, por ejemplo, para proporcionar formulaciones de la ADNasa II humana líquidas y formulaciones de liberación sostenida. La formulación de la ADNasa II humana puede emplearse con nebulizadores disponibles comercialmente, que incluyen nebulizadores jet y nebulizadores ultrasónicos para la administración de la ADNasa II directamente en las vías aéreas o en los pulmones de un paciente afectado afecto. Otra composición terapéutica preferida es un polvo seco de ADNasa II humana, preferiblemente preparado por deshidratación por aspersión de una solución de ADNasa II humana. En todos los casos, es deseable que las composiciones terapéuticas de ADNasa II sean estériles. Preferiblemente, las composiciones terapéuticas se disponen en un recipiente fabricado de plástico o de otro material distinto del cristal.

En una realización adicional, la composición terapéutica incluye células que producen ADNasa II humana activamente. Tales células pueden introducirse directamente en el tejido de un paciente o pueden encapsularse dentro de membranas porosas que después se implantan en un paciente (véase, por ejemplo, Aebischer et al., patente de EE.UU. nº 4.892.538, publicada el 9 de Enero, 1990; Aebischer et al., patente de EE.UU. nº 5.283.187, publicada el 1 de Febrero, 1994), en cualquier caso proporciona la distribución de la ADNasa II humana en áreas dentro del cuerpo del paciente necesitado de concentraciones crecientes de actividad hidrolítica del ADN. En una realización del invento, las células del paciente se transforman, tanto in vivo como ex vivo, con ADN que codifica para la ADNasa II humana y entonces se emplean para producir la ADNasa II humana directamente dentro del paciente. Este último método se denomina comúnmente como terapia génica. En otra realización, las células del paciente se transforman con otro ADN (tal como un promotor, intensificador o gen amplificador) que es capaz de activar o aumentar la expresión de un gen endógeno de ADNasa II humano.

En algunas circunstancias, puede ser deseable disminuir la cantidad de ADNasa II humana expresada en una célula. Con este objetivo, pueden construirse oligonucleótidos de la ADNasa II humana antisentido y un método empleado para disminuir el nivel de ADNasa II humana en la célula incluye la introducción dentro de la célula de uno o más oligonucleótidos antisentido de la ADNasa II humana. El término "oligonucleótido antisentido de la ADNasa II humana" se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de interactuar a través de emparejamiento con una secuencia de nucleótidos complementaria que está relacionada con la expresión de la ADNasa II humana dentro de una célula y, de ese modo, interferir con tal expresión.

La cantidad terapéuticamente eficaz de ADNasa II humana dependerá, por ejemplo, de la cantidad de ADN en el material que se ha de tratar, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la afección del paciente. En consecuencia, será necesario que el terapeuta valore la dosis y modifique la vía de administración según se precise para obtener el efecto terapéutico óptimo. Generalmente, la cantidad de la ADNasa II humana eficaz terapéuticamente se corresponderá con una dosis de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 5mg de la variante por kilogramo de peso corporal del paciente, administrada dentro de composiciones farmacéuticas, como se describe en esta memoria.

Opcionalmente, la ADNasa II humana se combina con o se administra en concierto con otro o más agentes farmacológicos empleados para tratar las afecciones enumeradas anteriormente, tales como antibióticos, broncodilatadores, agentes antiinflamatorios, mucolíticos (por ejemplo, n-acetil cisteína), proteínas de unión de actina o proteínas fragmentadoras de actina (por ejemplo, gelsolina; Matsudaira et al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel et al., publicación de patente PCT nº WO 94/22465, publicada el 13 de Octubre, 1994; inhibidores de proteasa o productos de terapia génica (por ejemplo, que incluyen el gen regulador de la conductancia a través de la membrana de la fibrosis quística (CFTR)); Riordan et al., Science 245:1066-1073 (1989)).

Este invento también proporciona métodos para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para la ADNasa II humana en muestras de análisis preparadas a partir de células, tejidos o fluidos biológicos, lo que incluye poner en contacto la muestra a analizar con ADN aislado que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos codificante de la ADNasa II humana y determinar si el ADN aislado hibrida con una molécula de ácido nucleico en la muestra de análisis. El ADN que incluye toda o una parte de la secuencia de nucleótidos codificante de la ADNasa II humana se emplea también en ensayos de hibridación para identificar y aislar ácidos nucleicos que comparten una identidad de secuencia sustancial con la secuencia codificante de la ADNasa II humana, tal como los ácidos nucleicos que codifican para variantes alélicas de la ADNasa II humana que existen de forma natural.

También se proporciona un método para amplificar una molécula de ácido nucléico que codifica para la ADNasa II humana que está presente en una muestra de análisis, lo que incluye el uso de un oligonucleótido que tiene una parte de la secuencia nucleotídica codificante de la ADNasa II humana como cebador en una reacción en cadena de la polimerasa.

Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración solamente y no pretenden limitar el invento de ninguna manera. Todas las patentes y referencias bibliográficas citadas en este documento están incorporadas expresamente.

Ejemplo 1 Clonación del ADNc de la ADNasa II humana

El ADNc de extensión completa que codifica para la ADNasa II humana se identificó por selección de una librería de ADNc de placenta humana (en \lambda-gt11, Clonetech, Palo Alto, California, EE.UU.) con una mezcla de las siguientes sondas de nucleótidos, cada una de las cuales se había marcado en su extremo con la T4 polinucleótido kinasa y con \lambda-^{32}P-adenosina trifosfato de elevada especificidad radiactiva:

5'-GCCCAGAGAGGGCTGCAGTACAAGTATCTGGACGAGAGCTCCGGAGGC-3'(SEQ. ID. Nº: 3)

5'-CCCAGCGCCCCGCAGTCCCAGACACAGATTCCTGGATCTCAGCCC-3' (SEQ. ID. Nº: 4)

5'-GAYCARGARGGNGGNTTYTGGCTNAT-3' (SEQ. ID. Nº: 5)

5'-GAYCARGARGGNGGNTTYTGGTTRAT-3' (SEQ. ID. Nº: 6)

5'-AAYCGNGGNCAYACNAARGGNGT-3' {SEQ. ID. Nº: 7)

5'-AAYAGRGGNCAYACNAARGGNGT-3' (SEQ. ID. Nº: 8)

Las primeras dos sondas oligonucleotídicas enumeradas arriba (SEQ. ID. nº 3 y 4) incluyen partes de la secuencia EST con el código de acceso T53394 en la base de datos del Genbank.

La hibridación de las sondas en la librería de ADNc se llevó a cabo en condiciones de baja estringencia (en 20% vol/vol de formamida, 5x SSPE, solución 5x de Denhardt, 0,1% de sodio dodecilo sulfato (SDS) y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado), a 42ºC, durante 20 horas. Los lavados posteriores a la hibridación se realizaron en 2x SSC, 0,1% SDS, a 42ºC. 1x SSPE es 150 mM de NaCl, 10 mM de fosfato sódico, 1 mM de EDTA a pH 7,4. La solución de Denhardt 1x es 0,02% de Ficoll, 0,02% de albúmina sérica bovina y 0,02% de polivinil pirrolidona. 1x SSC es 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato sódico a pH 7,0.

Los clones de fagos con hibridación positiva se aislaron y sus ADNs se secuenciaron siguiendo procedimientos estándar. Se identificó un inserto de 1575 pares de bases entre los clones de fagos con hibridación positiva, el cual incluye una zona abierta de lectura de 1080 pares de bases que codifica para una proteína predicha que tiene 360 aminoácidos de longitud. La secuencia de nucleótidos del inserto de 1575 pares de bases (SEQ. ID. nº 1) y la secuencia de aminoácidos de la proteína que se predice (SEQ. ID. nº 2) se muestran en la Figura 1.

La proteína predicha incluye una secuencia señal que tiene 16 aminoácidos de longitud. El corte de esta secuencia señal libera la proteína madura (ADNasa II humana) que tiene 344 aminoácidos de longitud y un peso molecular estimado de 38000 Daltons y un pI estimado de 9,0.

Ejemplo 2 Expresión del ADNc de la ADNasa II humana

El ADNc que codifica para la ADNasa II humana se subclonó dentro de un vector de expresión de mamífero pRK5 (Gorman et al., DNA and Protein Engineering Techniques 2:1 (1990); publicación de patentes europeas EP 307.247, publicada el 15 de Marzo, 1989). El vector recombinante resultante se refiere como pRK5/ADNasa II humana. Las células 293 de riñón embrionario humano (colección americana de cultivos, American Type Culture Collection, CRL 1573) crecieron en medio Eagle con suero modificado por Dulbecco (DMEM) hasta una confluencia del 70% y entonces se tranfectaron transitoriamente con pRK5/ADNasa II humana o, como control, pRK5 solo. 24 horas después de la transfección, las células se lavaron con tampón fosfato salino y se transfirieron a un medio sin suero con insulina. Entre 72 y 96 horas más tarde, el medio condicionado se recogió de los cultivos celulares y se concentró aproximadamente 10 veces. Las proteínas expresadas en los cultivos celulares se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Se encontró que las células transfectadas con pRK-5/ADNasa II humana producían una única proteína de aproximadamente 42.000-44.000 Daltons, que no se producía en las células transfectadas con pRK5 solo.

La secuencia del extremo amino de esta proteína secretada se determinó preparando una versión de la ADNasa II humana etiquetada con poli-His. La versión de la ADNasa II humana etiquetada con poli-His se preparó uniendo una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos

Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His (SEQ. ID. Nº 9)

al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la ADNasa II humana que se muestra en la Figura 1. Las células 293 de riñón embrionario humano se transfectaron transitoriamente con el ADN y se empleó Ni-NTA-silica (Qiagen, Inc., Chatsworth, California, EE.UU.) para purificar la ADNasa II humana etiquetada con poli-His secretada. Se determinó que la secuencia de aminoácidos del extremo amino de la proteína secretada era Leu-Thr-Cys-Tyr-Gly-Asp-Ser-Gly-Gln, de acuerdo con la secuencia de aminoácidos predicha para la proteína madura de la ADNasa II humana mostrada en la Figura 1.

Ejemplo 3 Actividad biológica de la ADNasa II humana

Los sobrenadantes concentrados de los cultivos celulares, preparados según se ha descrito anteriormente, se analizaron para determinar la actividad hidrolítica del ADN en un ensayo de hipercromicidad (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)), en el que se usó el tampón 0,1 M de acetato sódico a pH 4,6, 1 mM de cloruro de magnesio. Tal actividad se detectó en los sobrenadantes de las células transfectadas con pRK5/ADNasa II humana, pero no en los sobrenadantes de las células transfectadas con pRK5 solo. Al analizar también los lisados celulares se determinó que aproximadamente un 20%-30% del total de la actividad ADNasa II humana en las células transfectadas con pRK5/ADNasa humana se secretaba.

Ejemplo 4 Patrón de expresión de la ADNasa II humana en tejido humano

Las transferencias de Northern de varios tejidos humanos se llevaron a cabo empleando una sonda marcada radiactivamente que contenía una parte de la secuencia codificante del ADNc clonado de la ADNasa II humana. Se encontró expresión del ARN mensajero (ARNm) de la ADNasa II humana en todos los tejidos examinados (cerebro, colon, corazón, intestino delgado, riñón, hígado, pulmón, linfocitos de sangre periférica, músculo esquelético, ovario, páncreas, placenta, próstata, bazo, testículos y timo).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\hskip4cm

Baker, Kevin P.

\hskip4cm

Baron, Will F.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DEL INVENTO: ADNasa II humana

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, disco extraíble de 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM compatible PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE APLICACIÓN ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE APLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS PREVIOS A LA APLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE APLICACIÓN: 08/639294

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE ARCHIVO: 04/25/1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Johnston, Sean A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.910

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: P1024PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 415/225-3562

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.575 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 360 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(XI): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCAGAGAG GGCTGCAGTA CAAGTATCTG GACGAGAGCT CCGGAGGC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGCGCCC CGCAGTCCCA GACACAGATT CCTGGATCTC AGCCC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAYCARGARG GNGGNTTYTG GCTNAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAYCARGARG GNGGNTTYTG GTTRAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAYCGNGGNC AYACNAARGG NGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAYAGRGGNC AYACNAARGG NGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His}

Claims

1. Un procedimiento para producir un polipéptido con actividad hidrolítica del ADN que tiene, al menos, un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 de la ADNasa II humana madura, tal procedimiento incluye transformar una célula hospedante con una molécula de ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y cultivar la célula hospedante bajo condiciones tales que el polipéptido se produce en la célula hospedante.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha célula hospedante se transforma con un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene, al menos, un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 para la ADNasa II humana madura unida operativamente a un promotor reconocido por dicha célula hospedante.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 para la ADNasa II humana madura por la sustitución de un aminoácido por otro en una única posición solamente.

4. El procedimiento de las reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 para la ADNasa II humana madura por la sustitución de un aminoácido por otro en dos posiciones solamente.

5. El procedimiento de las reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 para la ADNasa II humana madura.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha célula hospedante es una célula eucariota.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha célula eucariota es una célula de mamífero.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha célula hospedante es una célula 293 de riñón embrionario humano.