ES2231200T3 - Composiciones farmaceuticas y cosmeticas que comprenden serin-proteinasas de bacalao y su uso farmaceutico y cosmetico. - Google Patents

Abstract

1. Una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao para usarse como un medicamento. La presente invención proporciona el uso de tripsinas derivadas de bacalao u otras tripsinas o serín-proteinasas relacionadas tales como quimotripsinas derivadas de animales, en particular animales acuáticos tales como pescados, incluyendo bacalao, en una variedad de contextos médicos y cosméticos. Como se usa aquí, el término ¿enzima¿ es usado para indicar una enzima activa si no es especificada de otro modo. También, como se usa aquí, el término ¿tripsina u otra peptidasa relacionada¿, indica peptidasas del tipo tripsina y todas las peptidasas que tienen 90% o más homología de secuencia con las tripsinas de bacalao del Atlántico. Como se usa aquí, el término ¿quimotripsina u otras peptidasas relacionadas¿, significa todas las peptidasas del tipo quimotripsina y todas las peptidasas que tienen 90% o más de homología de secuencia con las quimotripsinas A y B de bacalao del Atlántico. En particular, las enzimas de conformidad con la invención, son empleadas para tratar dolor, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoatritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematosos sistémico, flebitis, eczema, sarampión, psoriasis, acné, heridas y candidiasis.

Description

Composiciones farmacéuticas y cosméticas que comprenden serín-proteinasas de bacalao y su uso farmacéutico y cosmético.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en su aspecto más amplio, al campo del tratamiento de prevención y enfermedades y al campo cosmético, en particular al uso farmacéutico y cosmético de las serín-proteinasas derivadas del pescado. Específicamente se proporcionan composiciones farmacéuticamente o cosméticamente activas que comprenden como un componente activo, tripsina y/o quimotripsina aisladas de bacalao del Atlántico y serín-proteinasas relacionadas con tales enzimas.

Antecedentes de la invención

Las Patentes Estadounidenses Nos. 4,801,451 y 4,963,491, describen una mezcla de exo y endopeptidasas aisladas de krill del Antártico (Euphasia superba) y el uso de esta mezcla como una solución limpiadora. La Patente Estadounidense No. 4,801,451 describe el uso de tales enzimas para remover la materia extraña y tejido muerto de heridas. La soelicitud de patente internacional WO 85/04809 describe el uso de enzimas krill como un agente que promueve la digestión. La EP-A-01-0170115 describe el uso de enzimas krill para disolver coágulos de sangre.

Sin embargo, todas estas referencias describen materiales impuros o escasamente caracterizados. Una peptidasa purificada o mezcla de peptidasa purificada es deseable para proporcionar un producto farmacéuticamente útil. Además, no se encuentra descripción en donde una peptidasa purificada o mezcla de pepetidasas purificadas sean empleadas para tratar por ejemplo, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis séptica, flebitis, eczema, salpullido, psoriasis o enfermedades infecciosas.

La solicitud de patente internacional WO 96/24371 describe el uso de una enzima proteolítica multifuncional derivada del krill y una familia de enzimas proteolíticas derivadas de crustáceos y pescados que tienen similitud estructural substancial a la enzima multifuncional derivada de krill del Antártico. Esta solicitud también se refiere a métodos de purificación de la enzima multifuncional y a usos farmacéuticos, cosméticos y otros de la enzima multifuncional. La similitud estructural substancial a la enzima multifuncional derivada del krill del Antártico, es definida en tal solicitud como al menos 70% de homología con la hidrolasa multifuncional derivada de krill. La tripsina y la quimotripsina derivadas de bacalao como se describe aquí tienen menos de 70% de homología con la enzima multifuncional derivada del krill. Adicionalmente, las tripsinas y quimotripsinas derivadas de bacalao, no son enzimas multifuncionales. Su actividad principal conocida es que aquella de proteasas tripsinas y proteasas quimotripsinas, respectiva-
mente.

Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar el uso de las tripsinas y quimotripsinas derivadas de bacalao, en composiciones farmacéuticas o medicamentos para la aplicación local y tópica para tratar padecimientos internos y alteraciones y uso cosmético de tales enzimas. El uso tópico para tratar alteraciones internas, locales, sin la enzima que tiene que penetrar a través de las heridas abiertas o tejido mucoso, se encontró sorprendentemente efectivo como se describe en los ejemplos acompañantes. Esto es contrario a las enseñanzas de la técnica anterior de uso relacionado de otras enzimas, en donde por ejemplo, la enzima hidrolasa multifuncional de krill es inyectada para el tratamiento de varios dolores locales. Otro objetivo de la presente invención es el uso de tripsinas y quimotripsinas derivadas de bacalao para uso en las composiciones farmacéuticas o medicamentos para el transporte de otros compuestos proteináceos o no proteináceos activos a través de la piel para aplicación local y tópica para tratar padecimientos y alteraciones internas. Se ha encontrado que tales serín-proteinasas son farmacéuticamente altamente activas contra una variedad de padecimientos.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención pertenece en un primer aspecto a una serín-proteinasa de pescado para uso como un medicamento. En este contexto, las proteinasas particularmente útiles incluyen tripsinas y quimotripsinas derivadas de bacalao, tal como el bacalao del Atlántico.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una serín-proteinasa en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o un animal. Los padecimientos y alteraciones los cuales pueden ser tratados o prevenidos incluyen dolor, inflamación agua, inflamación crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, salpullido, psoriasis, acné, eczema, eczema seborréico facial, eczema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de heridas, heridas y quemaduras, una infección fúngica y una alteración inmunológica incluyendo un padecimiento auto inmune.

En todavía aspectos adicionales, la presente invención proporciona el uso de una serín-proteinasa de pescado en la fabricación de un medicamento para remover la piel muerta o desprendida de otro modo de piel saludable y el uso de una serína-proteinasa de pescado en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un padecimiento en cuya patogénesis está involucrado un enlace mediado por el receptor.

En aún aspectos adicionales, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y cosméticas que comprenden una serín-proteinasa de pescado y a un método para tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o animal, el método comprende administrar a dicho humano o animal, una cantidad farmacéuticamente efectiva de una serín-proteinasa de pescado.

De conformidad con la invención, también se proporciona un método para preparar en una escala comercial, una preparación purificada de isoenzimas de tripsina de bacalao, el método comprende los pasos de (i) preparar un extracto acuoso de vísceras de bacalao, (ii) someter el extracto acuso uno o más pasos cromatográficos, incluyendo un paso de cromatografía de afinidad usando un ligando de afinidad p-aminobenzamidina, y (iii) desorber y eluir el enlace tripsina al ligando de afinidad p-aminobenzamidina y una preparación purificada en una escala comercial de tripsina de bacalao.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona el uso de tripsinas derivadas de bacalao u otras tripsinas o serín-proteinasas relacionadas tales como quimotripsinas derivadas de animales, en particular animales acuáticos tales como pescados, incluyendo bacalao, en una variedad de contextos médicos y cosméticos.

Como se usa aquí, el término "enzima" es usado para indicar una enzima activa si no es especificada de otro modo. También, como se usa aquí, el término "tripsina u otra peptidasa relacionada", indica peptidasas del tipo tripsina (EC 3.4.21.4) y todas las peptidasas que tienen 90% o más homología de secuencia con las tripsinas de bacalao del Atlántico (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989: Gudmundsdottir et al., Eur. J. Bíochem. 217:1091-1097, 1993). Como se usa aquí, el término "quimotripsina u otras peptidasas relacionadas", significa todas las peptidasas del tipo quimotripsina (E:C 3.4.21.1) y todas las peptidasas que tienen 90% o más de homología de secuencia con las quimotripsinas A y B de bacalao del Atlántico (Ásgeirsson y Bjarnason, Comp. Bíochem. Physíol. 99B:327-335-94, 1991; Gudmundsfdottir et al., Biochem et Biophys. Acta 1219:211214, 1994).

En particular, las enzimas de conformidad con la invención, son empleadas para tratar dolor, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoatritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematosos sistémico, flebitis, eczema, sarampión, psoriasis, acné, heridas y candidiasis. En modalidades empleadas, la tripsina de bacalao o quimotripsina de bacalao o una mezcla de estas enzimas son administradas localmente y tópicamente en el sitio infectado en una composición farmacéutica que comprende la peptidasa purificada o mezcla de peptidasas purificadas y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, en particular pero no limitado a un hidrogel. Además, las enzimas son empleadas para tratar infecciones virales tales como erupción de herpes, infecciones fúngicas, bacterianas o parasíticas, incluyendo colitis, ulceras, hemorroides, cicatrización de córneas, placa dental y alteraciones autoinmunes incluyendo padecimientos autoinmunes.

Las enzimas que son substancialmente estructuralmente similares a las enzimas tripsina y quimotripsinas derivadas de bacalao, tienen la misma utilidad como las enzimas de bacalao.

En particular, estas enzimas de tripsina y quimotripsina son empleadas para tratar artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica y flebitis. En tales tratamientos, la tripsina o quimotripsina o una mezcla de ambas enzimas son administradas localmente y tópicamente en el sitio de la artritis o inflamación en una composición farmacéutica que comprende las tripsinas o quimotripsinas o ambas enzimas y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en particular, pero no limitado a hidrogel. Además, las enzimas tripsina y quimotripsina de conformidad con la invención, son empleadas para tratar infecciones virales tales como erupciones de herpes, infecciones fúngicas, bacterianas o parasíticas, incluyendo colitis, ulceras, hemorroides, cicatrización de córneas, placa dental, acné, heridas, candidiasis y alteraciones autoinmunes incluyendo padecimientos autoinmunes.

En particular, la invención se refiere a usos médicos, farmacéuticos y cosméticos de las tripsinas derivadas de bacalao del Atlántico u otros animales. Hay tres isoenzimas principales de tripsina en el bacalao del Atlántico que han sido purificadas y caracterizadas. Han sido llamadas Tripsina I, II y III (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Las tripsinas de bacalao tienen la secuencia amino terminal I-V-G-G-Y-Q/E-C-E-/T-K/R-H-S-Q-A-H-QV-S-L-N-S, mientras las tripsinas de mamíferos como la tripsina de bovino tienen la secuencia amino terminal I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S. Todas las tres isoformas de la tripsina de bacalao tienen una masa molecular similar de aproximadamente 24 kDa.

La invención también se refiere a usos médicos, farmacéuticos y cosméticos de las quimotripsinas derivadas de bacalao del Atlántico u otros animales. Hay dos tipos principales de isoenzimas de quimotripsina en bacalao del Atlántico que se han purificado y caracterizado. Han sido designadas Quimotripsinas A y B -(Ásgeirsson y Bjarnason, Com. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991). Las quimotripsinas de bacalao tienen las secuencias amino terminales duales de una de sus formas activas C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I/V-T-G-Y (cadena A), y I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q (cadena B), mientras la quimotripsina de mamífero tal como quimotripsina A de bovino tiene la secuencia aminoterminal C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L (cadena A), y I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D (cadena B). Ambas isoformas de quimotripsina de bacalao tienen masa molecular similar de aproximadamente 26 kDa.

Las tripsinas y quimotripsinas de bacalao son aisladas y purificadas de vísceras de bacalao, excepto el hígado, bazos y hueva. Los inventores han encontrado los métodos descritos abajo útiles para una producción de escala comercial de tripsinas y quimotripsinas de bacalao. Las enzimas son extraídas de la víscera completa o desmenuzada por extracción acuosa con agitación uniforme a cualquier relación de víscera a agua, preferiblemente una relación (p/p) desde 1:1 hasta 1:10 de vísceras o asadura a agua. Después de la separación de la solución de extracto crudo y vísceras o asadura residual, el extracto es clarificado por sedimentación o filtración. La solución clarificada es concentrada preferiblemente por ultrafiltración y/o opcionalmente intercambio de iones y después preferiblemente microfiltrado para alcanzar una solución real de biolímites bajos adecuados para la cromatografía en columna empacada que puede incluir varios pasos. Subsecuentemente, la tripsina de bacalao es purificada por cromatografía de afinidad, preferiblemente por cromatografía de afinidad aminobenzamidina y quimotripsina por cromatografía de interacción hidrofóbica preferiblemente por cromatografía de Fenil Sefarosa.

Como se usa aquí, la producción a escala comercial de las tripsinas y quimotripsinas de bacalao se refieren a métodos que son confiables y fuertes y permiten la producción de lotes en el orden de 1 a 10 g o más, tal como 10 o 100 g o más.

El método preferido de aplicación de las enzimas purificadas o mezcla de enzimas purificadas, está en una preparación de hidrogel y agua que contiene 0 hasta 85% (vol/vol) de un alcohol polivalente (poliol) tal como glicerol. Una concentración adecuada de actividad de tripsina es de 0.1 hasta 10,000 unidades de enzima por actividad de CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (carbobenzoxi-Gly-Pro-Arg-para nitroanalido), por 100 mililitros de la preparación de hidrogel final y la concentración apropiada de actividad de quimotripsina es 0.1 hasta 10,000 unidades de enzima por actividad de Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA por 100 mililitros de la preparación de hidrogel final.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende las tripsinas de bacalao y las peptidasas relacionadas y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

La invención además proporciona (a) medios que se relacionan a ciertas condiciones usando cantidades efectivas de las enzimas purificadas descritas anteriormente, (b) composiciones o substancias para uso en tales métodos, (c) composiciones farmacéuticas que contienen cantidades efectivas de enzimas para usarse en tales métodos, y (d) usos de la enzima o composición de la enzima para la fabricación de un medicamento para el uso en tales métodos. Los medios son para:

tratar o prevenir profilácticamente una indicación seleccionada del grupo que consiste de dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico y flebitis, en donde preferiblemente la cantidad es una cantidad efectiva para tratar o prevenir; tratar o prevenir profilácticamente condiciones dermatológicas tales como por ejemplo acné, salpullido, psoriasis o eczema, incluyendo eczema seborréico facial o eczema de las manos, cara, cuero cabelludo o cuello, hemorroides y similares, en donde preferiblemente la cantidad de las tripsinas de bacalao y peptidasas relacionadas administradas es una cantidad efectiva para tratar o prevenir una condición dermatológica;

tratar o prevenir profilácticamente la infección de heridas y curación de desbridamientos (aplicando a la herida una cantidad efectiva de la enzima para prevenir la infección microbiana, o incrementar la sanación de heridas administrando una cantidad efectiva de la enzima inhibitoria del microbio), cuando se trata la herida puede estar substancialmente libre de tejido necrótico; remover piel muerta o desprendida de otro modo piel saludable para mejorar la apariencia de la piel, en donde preferiblemente la cantidad de la enzima administrada es una cantidad efectiva que remueve la piel muerta;

tratar o prevenir profilácticamente fibrosis cística, cáncer, por ejemplo, administrando una cantidad efectiva para tratar un tumor o una cantidad de enzima que inhibe o previene la metástasis del tumor, aterosclerosis, asma, apoplejías sépticas, síndrome de apoplejía tóxica, adhesión de tejidos tales como envoltura de tendones, adhesiones de coyunturas o post-quirúrgicas abdominales, lesión por reperfusión, malaria, alteraciones inmunes tales como padecimientos autoinmunes, apoptosis, colitis y enteritis, tales como padecimiento de Crohn, en donde preferiblemente la cantidad de tripsinas de bacalao y peptidasas administradas relacionadas son efectivas para el tratamiento o prevención; tratar o prevenir profilácticamente una infección microbiana, por ejemplo, una infección viral tal como una infección del virus del herpes (por ejemplo HSV-1, HSV-2, herpes zoster o infección de herpes genital), VIH, hepatitis, influenza, coronavirus, citomegalovirus, rinovirus, o infección del virus del papiloma; una infección que causa un padecimiento gastrointestinal tal como úlcera o diarrea; una infección fúngica tal como una infección fúngica sistémica de la piel, oral, vaginal o esofageal, incluyendo por ejemplo infección de levadura, incluyendo una infección fúngica de uña e infecciones por cándida; infecciones microbianas del ojo, preferiblemente tratado con administraciones oculares; infecciones bacterianas que incluyen infección por Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia spp., syphilis infecciones por E. coli, e infecciones bacterianas que causan cancroides; infecciones oportunísticas en pacientes inmunocomprometidos, en donde la cantidad administrada de las tripsinas de bacalao es una cantidad efectiva para prevenir o tratar la infección microbiana o tiene actividad inhibitoria contra la adhesión célula-célula o célula-virus;

remoción de la placa dental, en donde preferiblemente la cantidad de enzima administrada es un cantidad efectiva que remueve la placa dental;

y someter a lisis coágulos sanguíneos, en donde preferiblemente la cantidad de enzima es una cantidad efectiva para someter a lisis el coágulo.

El método comprende administrar una composición que comprende las tripsinas y/o quimotripsinas de bacalao, como se describe anteriormente. La composición de la invención puede también ser usada para remover las células muertas o divergentes.

La invención proporciona composiciones cosméticas y médicas tópicas que comprenden la tripsina, quimotripsina de bacalao u otras peptidasas relacionadas descritas anteriormente; y gel, crema o composición de supositorios.

La invención también proporciona (a) medios para tratar o prevenir profilácticamente un síndrome relacionado con la adhesión célula-célula o célula-virus, que comprende administrar una cantidad efectiva anti-adhesión de las tripsinas o quimotripsinas de bacalao o peptidasas relacionadas efectivas para remover o inactivar un componente de adhesión receptor o aceptor viral o celular, que está involucrado en la adhesión célula-célula o célula-virus, (b) composiciones o substancias para usarse en tales métodos, (c) composiciones farmacéuticas que contienen cantidades efectivas de la enzima para usarse en tales métodos, y (d) usos de la composición de enzima para la fabricación de un medicamento para uso en tales métodos. De manera general, el síndrome involucra la inflamación, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, flebitis, eczema, sarampión, psoriasis, acné, heridas, candidiasis y alteraciones inmunes, incluyendo padecimientos autoinmunes, apoplejías, metástasis del tumor, reacciones al rechazo del transplante o infecciones microbianas. Preferiblemente, (a) el síndrome se selecciona del grupo que consiste de infección microbiana, alteración inmune, fibrosis cística, ateroesclerosis, cáncer, asma, apoplejía séptica, síndrome de apoplejía tóxica, conjuntivitis, lesión por reperfusión y dolor, y (b) un receptor de la superficie celular, asociado con el síndrome de adhesión célula-célula o célula-virus, seleccionado a partir de los siguientes, en los cuales la tripsina de bacalao se ha mostrado desdoblar, que consiste de CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11 a/CD18, se remueve o inactiva por la enzima administrada. Preferiblemente, una infección microbiana se trata o previene y la infección microbiana es herpes, VIH, hepatitis o infección de papiloma; una infección que causa colitis o diarrea; una infección por Cándida, tal como infección por Candida oral, vaginal o esofageal; una infección de influenza o frío; una infección por Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus, o E. coli; una infección primaria o secundaria de leprosia; o una infección que causa conjuntivitis o tuberculosis.

En una modalidad, la invención proporciona medios para inhibir o prevenir profilácticamente la transmisión de un microbio patogénico administrando las enzimas tripsina o quimotripsina de bacalao. Preferiblemente, la enzima tripsina y/o quimotripsina de bacalao es aplicada a la porción del cuerpo que comprende la vía de entrada de transmisión primaria para el microbio en cuestión. En una modalidad preferida, un atomizador, o ungüento o lavado es aplicado a un orificio del cuerpo involucrado en la actividad sexual, por ejemplo, para prevenir el VIH o transmisión de hepatitis. En otra modalidad preferida, la peptidasa tripsina de bacalao o relacionada, se aplica a las vías respiratorias superiores, por ejemplo, vía un aerosol, para inhibir o prevenir la transmisión de un virus de resfriado común, tal como un rinovirus o coronavirus.

En un aspecto, el método de tratamiento extra-corporalmente de un tejido, fluido corporal o composición de células, remueve los componentes de adhesión celular, reduce el rechazo inmune del tejido, fluido corporal o composición de células que son transplantadas de un individuo a otro. En otro aspecto, tales tratamientos remueven o inactivan los componentes de adhesión celular encontrados en el tejido tratado, fluido corporal o composición de células involucradas en una infección microbiana.

En el tratamiento o prevención profilácticamente de apoplejía séptica o síndrome de apoplejía tóxica, administrando las peptidasas de tripsina de bacalao o relacionadas, las vías apropiadas de administración incluyen administración sistémica. Para infecciones vaginales asociadas con apoplejías, los flujos vaginales, cremas o geles o supositorios, pueden ser usados como un método de administración.

En el tratamiento o prevención profilácticamente del dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis administrando las tripsinas de bacalao o peptidasas relacionadas, las rutas de administración apropiadas podrían incluir sin limitación, geles o supositorios, en particular pero no limitado a hidrogeles que contienen glicerol u otros polioles.

En el tratamiento o prevención de sarampión, psoriasis, acné, eczema, incluyendo eczema seborréico facial o eczema de las manos, cara, cuero cabelludo o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo de recién nacidos, arrugas, cicatrices y queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica, hemorroides y similares, heridas, infecciones de heridas, heridas y quemaduras, remoción de la piel muerta o desprendida a partir de otro modo piel saludable para mejorar la apariencia de la piel, una infección fúngica tal como sistémica, de piel, oral, vaginal o esofageal fúngica, incluyendo por ejemplo, infección de levadura, incluyendo una infección en uña fúngica e infecciones por cándida y alteraciones inmunes que incluyen padecimientos autoinmunes administrando las tripsinas, quimotripsinas de bacalao o peptidasas relacionada a estas enzimas, las rutas apropiadas de administración podrían incluir cremas, geles, o supositorios en particular pero no limitado a hidrogeles que contienen glicerol u otros polioles.

En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición para el tratamiento del dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, sarampión, psoriasis, acné, eczema, incluyendo eczema seborreico facial o eczema de manos, cara, cuero cabelludo o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica, hemorroides y los similares, heridas, infecciones de heridas, heridas y quemaduras, remoción de la piel muerta o desprendida de otro modo piel saludable para mejorar la apariencia de la piel, una infección fúngica tal como infección sistémica, de piel, oral, vaginal o esofageal que incluye la infección de levadura, incluyendo una infección fúngica de uña e infecciones por Cándida spp, y alteraciones inmunes que incluyen padecimientos autoinmunes. Otro objeto es proporcionar un método para le preparación de una composición para ser usada para el tratamiento de dichos padecimientos. Un tercer objeto es proporcionar un método para la aplicación de dicha composición para el tratamiento de dichos padecimientos, incluyendo niveles de dosis para aplicaciones externas y tópicas. La invención por lo tanto, está basada en composiciones que comprenden enzimas en donde no se han usado previamente enzimas o una enzima mejor en donde las enzimas se han usado.

Los objetivos anteriores son logrados usando una composición que contiene una cantidad efectiva de tripsina y/o quimotripsina de bacalao, la cual es capaz de mitigar el dolor, inflamación, artritis, hinchazón, edema, eczema psoriasis, dermatitis, sarampión y/o otros síntomas de los padecimientos mencionados en la parte introductoria. Las enzimas de bacalao pueden ser obtenidas a un rendimiento alto y en una manera relativamente simple a partir de vísceras de bacalao. Se ha encontrado que las enzimas de bacalao pueden ser purificadas en una escala comercial en una manera relativamente directa con rendimientos razonables. La tripsina de bacalao purificada contiene tres isoenzimas principales de la enzima y la quimotripsina de bacalao contiene dos isoenzimas principales. Una o todas las isozimas pueden ser usadas para los propósitos de la invención.

Se ha establecido ahora que las enzimas tripsina y quimotripsinas de bacalao de la invención, efectivamente remueven o inactivan ciertas moléculas de adhesión a la superficie celular, enterotoxinas bacterianas, citosina, mediadores de la inflamación y metaloproteinasas de matriz (MMPs) tal como CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CDlla/CD18, TNF-alfa, IL-1 y MMP-9 sin afectar la biodisponibilidad de la célula. Este fenómeno de inactivación o desdoblamiento del sitio de adhesión de citosina, mediadores inflamatorios, y metaloproteinasas de matriz, se cree proporciona al menos una explicación parcial para la efectividad de las tripsinas y quimotripsinas de bacalao contra muchas, aunque probablemente no todas, las indicaciones contra las cuales las tripsinas y quimotripsinas de bacalao son efectivas. Así, el TNF-alfa está implicado en tanto artritis, psoriasis, cáncer e inflamación (Véase Citosinas, Eds., Mire-Slui y Thrope, Academic Press, 1998, p 350).

Las tripsinas y quimotripsinas de bacalao parecen ser más efectivas que otra proteasas convencionales en muchos aspectos. Cuando un panel de 13 de las proteasas más activas en este sentido se compara por su actividad hacia 16 de ciertas moléculas de adhesión de la superficie celular mencionadas anteriormente, enterotoxinas bacterianas, citosinas, mediadores inflamatorios y MMPs, así como también su sensibilidad a la inhibición del suero, la tripsina y quimotripsina de bacalao se encuentran por ser casi las más activas. Las proteasas se registraron 2 puntos por arriba de la actividad muy alta, 1 punto por abajo de la actividad moderada y 0 puntos por muy bajo sin actividad (registros inversos para la actividad inhibitoria del suero para las proteasas). En base a este esquema de registro la tripsina de bacalao del Atlántico registró 30 punto y la quimotripsina de bacalao del Atlántico registró 29 puntos, mientras la proteasa multifuncional de krill conocida registró 16 puntos. Las proteasas de tripsina y quimotripsina de bovino se encontraron carentes en este sentido. Además, las tripsinas y quimotripsinas de bacalao son 2 a 20 veces más activas en sus contrapartes de bovino cuando se usan los substratos cromogénicos pequeños para comparar sus actividades (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Ásgeirsson y Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335- 94, 1991).

Las vísceras de bacalao son fuentes útiles para las enzimas tripsina y quimotripsinas de bacalao de la invención. Por ejemplo, las enzimas pueden ser extraídas en una escala comercial a partir de vísceras de bacalao congeladas como se describe anteriormente. La solución de extracto concentrado y clarificado puede ser fraccionada opcionalmente por cromatografía de intercambio fónico en escala comercial, preferiblemente un primer paso de cromatografía de intercambio de cationes, seguido por un paso de cromatografía de intercambio de aniones para enlazarse y con ello, remover las serín-proteasas tales como elastasa y colagenasa de serina. En un paso final y subsiguiente, la tripsina de bacalao es purificada por cromatografía de afinidad de escala comercial preferiblemente usando cromatografía en columna de afinidad de p-aminobenzamidina, y quimotripsina por cromatografía en columna de interacción hidrófoba preferiblemente usando Fenil Sefarosa.

La tripsina de bacalao usada en la invención puede ser desorbida de la matriz de afinidad aplicando condiciones que desestabilizarán la interacción entre la enzima y el ligando de afinidad.

Tales condiciones incluyen sales altas seguidas por pH bajo, preferiblemente en 30% o más glicerol. El eluente de la columna se deja fluir en una solución amortiguadora de neutralización para estabilizar la tripsina de bacalao después del paso de elución del ácido (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). La quimotripsina de bacalao usada en la invención puede ser liberada por la columna de Fenil Sefarosa aplicando condiciones que desestabilizarán la interacción entre la enzima y la interacción ligando hidrófobo. Tales condiciones incluyen contenido de glicerol alto en agua o solución amortiguadora, preferiblemente 50% o más glicerol en agua o solución amortiguadora (Ásgeirsson y Bjarnason, Com. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991). Por estos métodos las enzimas tripsina y quimotripsina de bacalao con una pureza en exceso de aproximadamente 90% se puede aislar. La fracción de tripsina de bacalao así obtenida contiene 3 formas principales de isoenzimas de tripsina de bacalao como se manifiesta por electroforesis SDS, la cual proporciona un enfoque isoeléctrico, de una banda, que muestra tres bandas y cromatografía de cromatoenfoque la cual da tres picos asociados con las tres isoformas de tripsina (Fig. 1). Al menos cuatro isozimas de tripsina IV están adicionalmente incluidas en la fracción de tripsina si la cromatografía de intercambio de aniones no se emplea. Estas pueden ser separadas como subfracciones con cromatografía de intercambio de aniones mono-Q o DEAE.

Las serín-proteasas a partir de otras fuentes diferentes del bacalao del Atlántico pueden ser comparados con las enzimas de tripsina de bacalao del Atlántico aislados para masa molecular, punto isoeléctrico, secuencia de aminoácido, temperatura, estabilidad de pH, temperatura o pH máximo, especificidad proteolítica y parámetros cinéticos, o para otras propiedades de las enzimas de tripsina de bacalao del Atlántico ejemplificadas en los ejemplos (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). La actividad de la tripsina de bacalao puede ser medida usando el éster metílico de arginina tirosina (TAME) como substrato. La tripsina de bacalao aislada de la purificación de columna de afinidad (90-100% de pureza) preferiblemente tendrá actividad específica de al menos 140 U/mg a 25ºC y pH 8.1, comparado con 60 U/mg para la hidrolasa multifuncional de krill. También la actividad tríptica puede ser medida usando Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilida (Cbz-GPR-pNA) como substrato, proporcionando una actividad específica preferiblemente al menos aproximadamente 100 U/mg. Además, cuando el Bz-Arg-pNA se usa como substrato, se obtienen constantes de eficiencia catalítica (k_{cat}/K_{m})de 52, 20, y 7 4 s^{-1}mM^{-1} para la tripsina de bacalao I, II, y III respectivamente, en comparación con 3 s^{-1} mM^{-1} para la tripsina bovina (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Las diferencias similares se observan para la quimotripsina de bacalao y quimotripsina bovina (Ásgeirsson y Bjarnason, Comp. Biochem. Physíol. 99B:327-335, 1991).

La masa molecular de las tripsinas de bacalao es de aproximadamente 24 kDa, mientras que sus puntos isoeléctricos son 6.6, 6.2 y 5.5 para tripsina I, II y III respectivamente, y aún inferior para isozimas de tripsina IV. Las secuencias de aminoácidos de las isoenzimas de la tripsina de bacalao se pueden expresar con la siguiente secuencia la cual contiene punto de variabilidad debido a las isoformas múltiples:

I-V-G-G-Y-E-C-T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y/F-C-G-G-S-L-I-N-K/E-D/Q-W-V-V-S-A-A-H-C-Y-K-S-V-L-R-V-R-L-G-E-H-H-I-R-V-N-E-G-T-E-Q-Y/F-I-S-S-S-S-V-I/X-R-H-P-N-Y-S-S-Y-N-I-N/D-N-D-I-M-L-I-K-L-T-K/E-P-A-T-L-N-Q-Y-V-H-A-V-A-L-P-T-E-C-A-A-D-A-T-M-C-T-V-S-G-W-G-N-T-M-S-S-V-A/D-D-G-D-K-L-Q-V/C-L-N/S-L-P-I-L-S-H-A-D-C-A-N-S-Y-G-P-G-M-I-T-Q-S-M-F-C-A-G-Y-L-E-G-G-K-D-S-C-Q-G-D-S-G-G-P-V-V-C-N-G-V-L-Q-G-V-G-V-V-S-W-G-Y-G-C-A-E-R-D-H/N-P-G-V-Y-A-K-V-M/I/C-V-L-S-G-W-V-R-D-T-M-A-N/S-Y,

en donde X es cualquier aminoácido o no aminoácido, y la tripsina I de bacalao tiene residuo K de aminoácidos en la posición 9, mientras que las tripsinas II y III de bacalao contienen R en esta posición (Gudmundsdottir et al. 1993 y datos no publicados).

Generalmente, las isoenzimas de tripsina de bacalao serán suficientemente estables de modo que al menos aproximadamente 50% de la actividad de TAME es retenida después de la incubación a 5ºC por 18 horas a pH 7.0 en una solución amortiguadora que contiene 10 mM de cloruro de calcio. Sin embargo, sólo aproximadamente 10% de la actividad de TAME es retenida después de la incubación a 5ºC por 18 horas a pH 2.0 (Figura 2).

El pH óptimo de las tripsinas de bacalao para TAME como substrato está en forma preferible entre aproximadamente 7.0 y 8.7 en forma más preferida aproximadamente 8.0 (Figura 3). Al usar TAME como el substrato, el Km a aproximadamente pH 8.1 y 25ºC en la presencia de cloruro de calcio 10 mM es preferiblemente en forma aproximada 0.029 mM, 0.021 mM y 0.049 mM para tripsinas I, II y III de bacalao respectivamente. En forma preferida, la tripsina de bacalao tiene una temperatura máxima de actividad para TAME como substrato entre 50 y 60ºC (Figura 4).

La tripsina de bacalao y enzimas de quimiotripsina de la invención se administran tópicamente, en forma oral, rectal, vaginal, por instalación (por ejemplo en el tracto urinario o en fístulas), por la vía pulmonar por ejemplo por el uso de un aerosol, por la aplicación de gotas para el ojo, o sistémicamente, tal como parenteralmente, incluyendo, por ejemplo, vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarterial o intravenosa. Las enzimas de bacalao se administran en solución o combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Para el modo de administración oral, las enzimas de bacalao se usan en la forma de tabletas, cápsulas, pastillas, gomas masticables, trozos, polvos, jarabes, elíxires, suspensiones y soluciones acuosas, y semejantes. Para la administración parenteral, las soluciones estériles de las enzimas de bacalao están usualmente preparadas, y los valores de pH de las soluciones se ajustan convenientemente y se amortiguan. Para el uso intravenoso, la concentración total de los solutos se deberán controlar para volver la preparación isotónica. Para la administración ocular, los ungüentos o líquidos para gotas se puede suministrar por sistemas de suministro ocular conocidos en la técnica tal como aplicadores o goteros para ojos. Para la administración pulmonar, los diluyentes y/o portadores se seleccionan que en forma apropiada permitan la formación de un aerosol. Para las administraciones tópicas, las enzimas de tripsina de bacalao típicamente se administran en un hidrogel, que contiene 0 a 85% de glicerol, tal como aproximadamente 20% a 30% de glicerol y posiblemente hasta 85% de glicerol.

Para tratamientos tópicos, una dosis adecuada de las enzimas de tripsina de bacalao por intervalos de aplicación desde aproximadamente 0.01 \mug/cm^{2} a en forma aproximada 1 mg/cm^{2}, preferiblemente de en forma aproximada 0.1 \mug/cm^{2} a aproximadamente 0.01 mg/cm^{2} (que usa por ejemplo, aproximadamente 0.01 mg/ml de gel de enzima). Para tratamientos sistemáticos, las dosificaciones generalmente serán seleccionadas para mantener un nivel de suero de las enzimas de tripsina de bacalao entre aproximadamente 0.1 mg/100 ml y en forma aproximada 100 mg/100m1, de manera preferida entre aproximadamente 0.5 mg/100 ml y en forma aproximada 2.0 mg/100 ml. En una medición alternativa de las cantidades de administración sistemática preferidas, preferiblemente se usarán desde aproximadamente 0.1 mg/kg a en forma aproximada 10 mg/kg, de manera más preferida aproximadamente 1 mg/kg. Para los tratamientos de tracto vaginal y urinario, las soluciones de limpieza/instilación adecuadas de las enzimas de tripsina de bacalao generalmente tendrán concentraciones desde aproximadamente 1 \mug/ml a en forma aproximada 15 mg/ml, en forma preferible desde aproximadamente 100 \mug/ml a en forma aproximada 3 mg/ml. Para todos los tratamientos, la composición de enzima generalmente será aplicada desde aproximadamente 1 a en forma aproximada 10 veces por día, de manera preferible desde aproximadamente 2 a en forma aproximada 5 veces por día. Estos valores, por supuesto, variará con un número de factores incluyendo el tipo y severidad de la enfermedad, y la edad, peso y condición médica del paciente, como se reconocerá por aquellos expertos en el campo médico. Se cree que las dosis substancialmente superiores se pueden usar sin efecto adverso substancial.

Para el sanado de heridas, las enzimas de tripsina de bacalao se aplican preferiblemente de manera más frecuente que simplemente en el periodo de tiempo en el cual el sanado es primero vendado. Preferiblemente, la tripsina de bacalao se aplica al menos aproximadamente cada vez que se cambie el vendado de la herida. Las enzimas de tripsina de bacalao también se pueden aplicar al menos aproximadamente un día si y un día no, en forma más preferida, todos los días, o algunas veces por día. Para situaciones dermatológicas tales como eczema, psoriasis y semejante, la tripsina de bacalao y/o hidrogel de enzima de quimiotripsina se aplica preferiblemente todos los días, en forma más preferida dos veces por día. Para inflamación aguda o crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, y semejantes, las enzimas de tripsina de bacalao se aplican preferiblemente todos los días en forma más preferida dos veces al día.

Como se ilustra en muchos de los ejemplos clínicos posteriormente, el hidrogel de enzima de bacalao de la invención es efectivo para tratar o prevenir las condiciones inflamatorias. Típicamente, las inflamaciones se reducen a niveles aceptables dentro de 2 a 3 días a partir de la iniciación del tratamiento. Los ejemplos también ilustran que la enzima es efectiva para aliviar el dolor. El alivio del 5 dolor frecuentemente se reporta dentro de 20 minutos a 2 horas del inicio del tratamiento. El alivio del dolor no se acompaño por pérdida de sensibilidad en el tejido tratado. El alivio del dolor más completo, de modo que el paciente sólo sufre ligero dolor o una sensibilidad de poco dolor, frecuentemente se experimenta dentro de 1 día del inicio del tratamiento.

Generalmente, las enzimas de bacalao de acuerdo con la invención se administrarán en una cantidad efectiva. Una cantidad efectiva es una cantidad efectiva de ya sea (1) reducir los síntomas de la enfermedad que se desee tratar, (2) inducir un cambio farmacológico relevante para tratar la enfermedad que se desee tratar, (3) inhibir o prevenir la infección o re-infección por un agente infeccioso, o (4) prevenir la aparición de una enfermedad no infecciosa (por ejemplo una enfermedad tratable desbloqueando un fenómeno de adhesión de células). Para el tratamiento de heridas, en un aspecto, una cantidad efectiva incluye una cantidad la cual, si se aplica regularmente, previene la ocurrencia de infección. En otro aspecto, para el sanado de heridas, una cantidad efectiva incluye una cantidad efectiva para reducir el tiempo promedio que toma para sanar una herida.

Numerosos métodos para determinar el porcentaje de homología de proteínas, son conocidos en la técnica. Un método preferido es usar la versión 6.0 del programa de computadora GAP para hacer comparaciones de secuencias. El programa está disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group y utiliza el método de alineamiento de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970) como se revisa por Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2, 482 (1981). Otro método conveniente usa el programa de computadora FASTA.

La invención se ilustrará ahora en forma adicional en los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos en esta:

La Figura 1 muestra una cromatógrafo cromatoenfocado de la fracción de tripsina de bacalao del Atlántico fuera del paso de purificación de la columna de afinidad de aminobenzamidina. La fracción eluida de la columna para aminobenzamidina fue gel filtrado en una columna Sephadex G-25 equilibrada en 25 mM de monoetanolamina/ácido acético pH 9.4 que contiene cloruro de calcio 10 mM y subsecuentemente se aplica a una columna de material de intercambio iónico PBE-94 (Pharmacia) equilibrado en la misma solución amortiguadora. La columna se eluyó entonces con Polybuffer 94 (ajustado a pH 5.5 con ácido acético) que contiene 10 mM de cloruro de calcio. Se observó la actividad para el substrato TAME (círculos rellenos), absorbencia a 280 nm (círculos abiertos) y pH (diamantes abiertos). La primera fracción eluida se llamó tripsina I, la segunda fracción tripsina II y la tercera fracción tripsina III;

La Figura 2 ilustra el efecto de pH en la estabilidad de tripsina de bacalao del Atlántico purificada por para aminobenzamidina como se mide por la actividad de TAME residual después de la incubación a varios valores de pH y dos periodos de tiempo diferentes. Las muestras de tripsina de bacalao del Atlántico se incubaron a 5ºC por 30 minutos (círculos abiertos) y 18 horas (cuadros cerrados) a valores de pH variantes. La actividad residual para el substrato de TAME se midió subsecuentemente a pH 8.1 y 25ºC;

La Figura 3 muestra la dependencia de pH de la actividad de tripsina de bacalao del Atlántico purificada por para-aminobenzamidina como se midió usando el substrato TAME. Las soluciones amortiguadoras usadas a una concentración final 0.1 M fueron acetato (pH 3.0-5.9), hepes/HCl(pH 6.0-8.0) y glicinato (pH 8.3-9.0) que contienen todos 10 mM de cloruro de calcio; y

La Figura 4 muestra la dependencia de temperatura de la actividad de tripsina I de bacalao del Atlántico comparado con la actividad de tripsina de bovino medida usando el substrato TAME. Las enzimas se adicionaron a una cubeta con termostato precalentada y después de un periodo de equilibrio corto la velocidad promedio de hidrólisis se determinó durante los siguientes 3 minutos.

Ejemplo 1 Preparación de una mezcla de proteasas de bacalao

Aproximadamente 100 kg de víscera de bacalao congelada se descongelan y adicionan a un volumen de cuatro veces de agua potable fría en un tanque de extracción y el pH se ajusta a pH 8 a 9 con una solución de hidróxido de sodio. La mezcla se agitó por aproximadamente 2-6 horas por 0 a 5ºC. Después de un corto periodo de sedimentación cruda (aproximadamente 30 minutos) el extracto acuoso se extrajo de la víscera insoluble remanente con una bomba y se colectó en un tanque de sedimentación. El extracto acuoso se dejó permanecer en el tanque de sedimentación enfriada para sedimentar por aproximadamente 24 a 60 horas. El sobrenadante se decantó del tanque de sobrenadante a un tanque de mantenimiento usando una bomba. El sobrenadante se concentró 10 a 20 veces por ultrafiltración y se diafiltró a un nivel aceptable de resistencia iónica con conductividad por debajo de aproximadamente 3 mS/cm. Aproximadamente se obtuvieron 1015 litros de concentrado de proteína ultrafiltrada y
diafiltrada.

Ejemplo 2 Puridicación de tripsina fría a partir de extracto de víscera frío concentrado

Aproximadamente 10 litros de concentrado ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvo en el Ejemplo 1, se aplicó a una serie conectada continua de columnas para cromatografía empacadas de aproximadamente 1 litro, la primera contiene una resina de intercambio catiónico de flujo rápido de CM (Pharmacia, Suecia), la segunda una resina de intercambio aniónico de flujo rápido de DEAE (Pharmacia, Suecia) y la tercera un ligando de afinidad de paminobenzamidina acoplado a una resina de sefarosa (Pharmacia, Suecia). Las columnas se pre-equilibraron con aproximadamente 10 volúmenes de columna de 25 mM de solución amortiguadora de Tris de pH 7.8, que contiene 2.5 mM de cloruro de calcio (solución amortiguadora A). El producto concentrado se bombeó en las columnas a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la aplicación de la solución concentrada en las columnas se completó, el material residual se lavó fuera del sistema de columnas continuas con aproximadamente 8 litros de solución amortiguadora A.

Después de que este lavado se completó, la columna de afinidad de p-aminobenzamidina se desconectó de las otras columnas y se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de columna de una solución alta en sal de 25 mM de solución amortiguadora Tris pH 7.5 que contienen 0.5 M de NaCl y 2.5 mM de cloruro de calcio. Las tripsinas de bacalao se desorbieron entonces a partir del ligando de afinidad y se eluyeron fuera de la columna con una solución ácida de 25 mM de ácido acético pH 3.2 que contiene 10 mM de cloruro de calcio y 30% de glicerol. La fracción de tripsina de bacalao se colectó en una solución amortiguadora neutralizante a 200 mM de Tris pH 8.5 que contiene 30% de glicerol.

La preparación de tripsina de bacalao purificada fue homogénea por electroforesis de SDS PAGE y cromatografía FPLC Mono Q y mostró las tres bandas de isozima de tripsina en enfocado isoeléctrico. La preparación de la enzima tuvo una actividad específica de aproximadamente 100 U/mg usando a Cbz-GPR-pNA como substrato como se describió previamente. La preparación purificada fue esterilizada por filtro a través de un filtro de 0.22 micras y se almacenó congelada a aproximadamente -20ºC.

Ejemplo 3 Purificación de escala comercial alternativa de tripsina de bacalao de extracto de víscera de bacalao concentrado

Aproximadamente 10 litros de concentrado ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvieron en el Ejemplo 1, se aplicaron a un ligando de afinidad de paminobenzamidina acoplada a una resina de sefarosa (Pharmacia, Suecia). La columna se pre-equilibró con aproximadamente 10 volúmenes de columna de 25 mM de solución amortiguadora Tris de pH 7.8, que contiene 2.5 mM de cloruro de calcio (solución amortiguadora A). El concentrado se bombeó en la columna a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la aplicación de la solución concentrada en la columna se completó, el material residual se lavó fuera de la columna con aproximadamente 8 litros de solución amortiguadora A.

La columna de afinidad se lavó subsecuentemente con aproximadamente 5 volúmenes de columna de una solución altamente salina de 25 mM de solución amortiguadora Tris pH 7.5 que contiene 0.5 M de NaCl y 2.5 mM de cloruro de calcio. Las tripsinas de bacalao se desorbieron entonces a partir del ligando de afinidad y se eluyeron fuera de la columna con una solución ácida de 25 mM de ácido acético pH 3.2 que contiene 10 mM de cloruro de calcio y 30% de glicerol. La fracción de tripsina de bacalao se colectó en una solución amortiguadora neutralizante de 200 mM de Tris pH 8.5 que contiene 30% de glicerol, y contiene aproximadamente 5 a 6 g de
tripsina.

La preparación de tripsina de bacalao purificada fue homogénea por electroforesis de SDS PACE y mostró las tres bandas de isozima de tripsina en enfoque isoeléctrico. Una fracción menor (<5%) podría ser preparada por cromatografía FPLC Mono Q subsecuente y se identificó como al menos cuatro isoenzimas adicionales; tripsina IVa, IVb, IVc, y IVd. La preparación de enzimas tuvo una actividad específica de aproximadamente 100 U/mg que usa para Cbz-GPRpNA como substrato como se describió previamente. La preparación purificada se esterilizó por filtro a través de un filtro de 0.22 micras y se almacenó por congelamiento a aproximadamente -20ºC.

Ejemplo 4 Preparación de una preparación de hidrogel de tripsinas de bacalao

La preparación de tripsina de bacalao purificada del Ejemplo 2, se mezcló con gel hidrocoloide que comprende 0.8% peso/volumen de Carbomero 940, 30% de glicerol y 0.08% de paraoxibenzoato. La preparación de tripsina de bacalao se mezcló en una proporción 1:1 con el hidrogel para dar una concentración final de 1 unidad de enzima por mg (U/mg) de la mezcla de enzima de gel final (el ungüento hidrogel de la enzima), la unidad de enzima es determinada usando Cbz-GPR-pNA como substratos como se describe previamente. Así, el ungüento hidrogel de la enzima contiene aproximadamente 0.01 mg/ml, o 1 U/ml de las enzimas de tripsina de bacalao, 0.4% de Carbomero 940, 20% de glicerol y 0.04% de paraoxibenzoato. En lo siguiente, este ungüento de hidrogel de enzima es referido como Penzyma 100.

Ejemplo 5 Tratamiento de osteoartritis con Penzyma 100

Diecisiete individuos con osteoartritis, algunos con síntomas agudos o muy severos, se trataron con el ungüento de hidrogel de la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima de aplicó unas ves a dos veces por día, siempre una vez en la noche antes de retirarse en la cama y en muchos casos también en la mañana. Aproximadamente 5 mililitros del gel de enzima se aplicó en cada área afectada, tal como rodillas, cadera o ambas manos. Cantidades más grandes pueden ser aplicadas en casos severos. El gel se dejó secar por aproximadamente 10 a 30 minutos, dependiendo de la cantidad aplicada, el tiempo disponible y las necesidades y requerimientos del paciente. Este secado se puede acelerar por el uso de un dispositivo de bombeo de aire tal como una secadora de cabello. Todos estos pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de una semana, la mayoría de ellos dentro de 2 a 4 días. El paciente No. 71 fue incapaz de comenzar a subir escaleras antes del tratamiento pero no tuvo problemas en el progreso después del tratamiento. Estos resultados están resumidos en la siguiente tabla
5:1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5.1. Tratamiento de osteoartritis con Penzima 100

1

Unos cuantos de los pacientes (Nos. 19 y 21) han sido capaz de discontinuar el tratamiento y así parecen haber disfrutado el alivio de largo término o permanente de la enfermedad, pero la mayoría de ellos mantienen los síntomas bajo control con uso constante o intermitente de la Penzyma 100.

Ejemplo 6 Tratamiento de pacientes que sufren de tendinitis

Ocho individuos con tendinitis, algunos con síntomas muy severos que causan problemas con dormir en la noche, se trataron con el ungüento de hidrogel de enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área afectada una vez a dos veces por día, aproximadamente 5 a 10 mililitros en cada área afectada, dependiendo del tamaño del área. El gel se dejó secar por aproximadamente 10 hasta 30 minutos, dependiendo de la cantidad aplicada, tiempo disponible y las necesidades y requerimientos del paciente. Todos estos pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de dos semanas, la mayoría de ellos dentro de 2 a 4 días, pero otros, también más largo, especialmente aquellos con tendinitis del codo (codo de tenista o codo de golfista). Estos resultados se resumen en la siguiente Tabla 6.1:

TABLA 6.1. Tratamiento de pacientes que sufren de tendinitis

3

Todos estos pacientes han disfrutado el alivio permanente de la condición y han descontinuado el tratamiento.

Ejemplo 7 Tratamiento de firbomialgia

Dos pacientes que sufren de fibromialgia severa se trataron con el ungüento hidrogel de enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área afectada dos veces por día, aproximadamente 5 a 10 mililitros en cada área afectada, dependiendo del tamaño del área. El gel se dejó secar por aproximadamente 10 hasta 30 minutos, dependiendo de la cantidad aplicada, tiempo disponible y las necesidades y requerimientos del paciente. Ambos pacientes (No. 78, F-50 y No. 92, F-53), experimentaron alivio de los síntomas dentro de tres semanas. Ambos usan el tratamiento del gel de enzima cuando reaparecen los dolores.

Ejemplo 8 Tratamiento de artritis reumatoide

Cinco pacientes con artritis reumatoide, algunos con síntomas muy severos, se trataron con el ungüento de hidrogel de la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área afectada usualmente dos veces por día, aproximadamente 3 a 5 mililitros en cada área afectada, dependiendo del tamaño del área. El gel se dejó secar por aproximadamente 15 minutos, dependiendo del espesor del gel aplicado. Este periodo de secado se puede acortar por el uso de dispositivo de bombeo de aire tal como secadora de cabello. Todos los cinco pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de 5 días. Estos resultados se resumen en la siguiente tabla 8.1:

4

La paciente No. 61 no pudo irse de la cama en la mañana y dirigirse sin asistencia antes del tratamiento, pero fue capaz de progresar en sí misma después del tratamiento. La paciente No. 94 tiene dolor en el tórax cuando respira debido a una complicación de la efusión pleural. Ella se alivió de estos síntomas después de 3 días de tratamiento con la Penzyma 100. Todos estos pacientes mantuvieron los síntomas bajo el control con uso constante o intermitente del tratamiento del gel de enzima.

Ejemplo 9 Tratamiento de flebitis

Cinco pacientes con varias formas de flebitis, tales como tromboflebitis, flebotrombosis, síndrome post-flebítico crónica y venas varicosas, en todos los casos en las pantorrillas, algunos con síntomas muy severos que causan dolor con dificultad para dormir, se trataron con el ungüento hidrogel de la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de la enzima se aplicó tópicamente en la pantorrilla al menos una vez por día, es decir, en la tarde y en algunos casos en la mañana, aproximadamente 5 mililitros en cada pantorrilla. El gel se dejó secar por aproximadamente 15 minutos. Todos los cinco pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de unas cuantas semanas. Estos resultados están resumidos en la siguiente tabla 9:1.

TABLA 9.1. Tratamiento de flebitis

6

La paciente No.2 se diagnosticó con síndrome postflebítico crónico. La paciente No. 68 no duerme adecuadamente en la noche debido al dolor si ella no se aplica el gel antes de la hora de dormir. Todos estos pacientes mantuvieron los síntomas bajo control con uso constante o intermitente del tratamiento de gel de enzima.

Ejemplo 10 Tratamiento de psoriasis

Seis pacientes con psoriasis, algunos casos crónicos con síntomas muy severos, se trataron con el hidrogel de la enzima del Ejemplo 4, pero en la mayoría de los casos de psoriasis, se usó una composición de hidrogel designada Penzyma 200 con el doble de la concentración de tripsina de bacalao o 2 U/mg, puesto que la Penzyma 100 (1U/ml de tripsina de bacalao), proporciona resultados preferentemente lentos y en algunos casos inciertos. Los pacientes reivindicaron grandes mejoramientos en el tratamiento con el gel que contiene el contenido de tripsina de bacalao superior (Penzyma 200) comparado con el gel que contiene el contenido de tripsina inferior (Penzyma 100). Una combinación de tripsina de bacalao y quimotripsina de bacalao, con una concentración de 1 U/ml de cada enzima, designada Penzyma 200-C, también se sometió a prueba, y dio resultados positivos similares como la Penzyma 200. El gel de enzima se aplicó una vez a dos veces por día, siempre una vez en la tarde antes de irse a dormir, después de lo cual el gel de enzima se dejo en la piel durante la noche y en algunos casos en la mañana después del baño y antes de vestirse. El gel se aplica como una capa o película delgada y toma aproximadamente 5 minutos para secar. Todos los seis pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de dos semanas. El tratamiento fue en algunos casos suplementado con métodos auto-ayuda convencionales, tales como baños o tratamientos con luz solar. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 10.1:

TABLA 10.1 Tratamiento de psoriasis

7

La Paciente No. 3 ha sufrido de psoriasis crónica y muy severa, desde la edad de 5 años. Ella probó todos los tratamientos disponibles con resultados limitados. El tratamiento con la Penzyma 200 ha proporcionado solamente al alivio de largo término de los síntomas para ella. Ella reivindica que el alivio de los síntomas es notable después de 4 días y el alivio total se abarca dentro de 2 a 3 semanas de tratamiento con una aplicación por día antes de irse a dormir.

El paciente No. 69, también con psoriasis crónica, ha experimentado la desaparición de algunas manchas. Todos estos pacientes mantienen los síntomas bajo control con tratamiento del gel de enzima constante o intermitente.

Ejemplo 11 Tratamiento de acné y exacerbación

Dos individuos (paciente Nos. 25, F-16 y No. 63, M17) que sufren de acné y uno que sufre de exacerbación (No. 64, M-22), se trataron con el ungüento de hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área afectada (cara) una vez por día, aproximadamente 5 mililitros cada vez. El gel se dejó secar por aproximadamente 15 minutos después de lo cual se dejó en la piel. Todos los tres individuos experimentaron alivio total de los síntomas dentro de dos semanas, y se usó solamente el tratamiento de gel de enzima ocasionalmente cuando los síntomas comenzaron a aparecer.

Ejemplo 12 Tratamiento de eczema, dermatitis, y otras condiciones de la piel

Dieciocho pacientes que sufren de eczema, dermatitis y varias otras condiciones de la piel, se trataron con el ungüento hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de la enzima se aplicó una vez por día (ocasionalmente dos veces), usualmente en el atardecer antes de retirarse a la cama. El gel se aplicó como una capa o película delgada. El secado ocurre después de aproximadamente 5-10 minutos. Una cantidad superior puede aplicarse en casos severos. Este secado puede ser acelerado por el uso de un dispositivo de bombeo de aire tal como un secador de pelo. Todos estos pacientes experimentaron alivio de los síntomas dentro de una semana, la mayoría de ellos en 2 a 4 días. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 12.1:

TABLA 12.1. Tratamiento de eczema, dermatitis y otras condiciones de la piel

8

9

Algunos de los pacientes (Nos. 40, 41, 48, 66, 50, 20, 46, 87, 97, 100) han sido capaces de discontinuar el tratamiento y así parecen haber disfrutado alivio permanente o de largo término del padecimiento, pero otros mantienen los síntomas bajo el control con uso constante o intermitente de la Penzyma 100.

Ejemplo 13 Sanación de Heridas

Dos individuos (pacientes Nos. 44, M-4 y 85, M-9) con quemaduras, se trataron con el ungüento de hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma 100) del Ejemplo 4. Otros dos pacientes (No. 62, F-47 y 96, M-70), se trataron por heridas post-operacionales que no podrían sanar. El gel de enzima se aplicó tópicamente en las heridas al menos dos veces por día y se dejaron en el área afectada. Todos los cuatro individuos experimentaron sanación buena y libre de complicación de sus heridas dentro de una a tres semanas.

Ejemplo 14 Tratamientos con quimotripsina de bacalao

Para cada uno de los ejemplos 5-13, el hidrogel de la enzima tripsina se substituyó con un hidrogel de enzima quimotripsina de bacalao o un hidrogel que contiene una mezcla de tripsina de bacalao y quimotripsina de bacalao.

Claims (26)

1. Una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao para usarse como un medicamento.

2. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en una tripsina, una quimotripsina y cualquier mezcla de las mismas.

3. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1 o 2, que no es multifuncional.

4. Una proteinasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se deriva de bacalao del Atlántico.

5. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1, que es una tripsina derivada de bacalao del Atlántico.

6. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 5, que se selecciona del grupo que consiste en tripsina I, tripsina II, tripsina III, tripsina IV a, tripsina IV b, tripsina IV c, y tripsina IV d.

7. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 4, que se selecciona del grupo que consiste en quimotripsina A y quimotripsina B.

8. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1, que es una tripsina que tiene al menos, 90% de homología de secuencia de aminoácido con cualquiera de la tripsina I, tripsina II, tripsina III, y tripsina IV aisladas a partir de bacalao del Atlántico.

9. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 5, que es una quimotripsina que tiene al menos 90% de homología de secuencia de aminoácido con cualquiera de quimotripsina A y quimotripsina B aislada de bacalao del Atlántico.

10. Una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1, para usarse como un medicamento para tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o un animal, dicho padecimiento se selecciona del grupo que consiste de dolor, inflamación agua, inflamación crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, sarpullido, psoriasis, acné, eczema, eczema seborréico facial, eczema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de heridas, heridas de quemaduras, una infección fúngica y una alteración inmunológica incluyendo un padecimiento auto inmune.

11. Un método para la remoción de la piel muerta o desprendida de piel de otro modo saludable mediante el uso de una proteinasa de conformidad con la reivindicación 1.

12. Uso de una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o animal, dicho padecimiento se selecciona del grupo que consiste en dolor, inflamación aguda, inflamación crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, sarpullido, psoriasis, acné, eczema, eczema seborréico facial, eczema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de heridas, heridas de quemaduras, una infección fúngica y una alteración inmunológica incluyendo un padecimiento auto inmune.

13. Uso de una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao para remover la piel muerta o desprendida de piel de otro modo saludable.

14. Uso de una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un padecimiento causado por un organismo patogénico seleccionado del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un parásito y un protozoario, estando la enfermedad seleccionada del grupo de una infección del virus del herpes (por ejemplo HSV-1, HSV-2, herpes zoster o infección de herpes genital), VIH, hepatitis, influenza, coronavirus, citomegalovirus, rinovirus, o infección del virus del papiloma; una infección que causa un padecimiento gastrointestinal tal como úlcera o diarrea; una infección fúngica tal como una infección fúngica sistémica de la piel, oral, vaginal o esofageal, incluyendo por ejemplo infección de levadura, incluyendo una infección fúngica de uña e infecciones por cándida; infecciones microbianas del ojo, infección por Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp, Chlamydia spp., syphilis infecciones por E. coli, e infecciones bacterianas que causan cancroides.

15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde la serín-proteinasa de pescado es una proteinasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

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16. Una composición farmacéutica, que comprende una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao.

17. Una composición de conformidad con la reivindicación 16, en la que la serín-proteinasa de pescado es una proteinasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-11.

18. Una composición de conformidad con la reivindicación 16 o 17, que es una composición para uso tópico.

19. Una composición de conformidad con la reivindicación 18, que es un hidrogel.

20. Una composición de conformidad con la reivindicación 19, que además comprende un alcohol polivalente que incluye glicerol.

21. Una composición de conformidad con la reivindicación 16, que además comprende un compuesto farmacéuticamente activo.

22. Una composición cosmética, que comprende una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao.

23. Una composición de conformidad con la reivindicación 22, en la que la serín-proteinasa de pescado es una proteinasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-11.

24. Una composición de conformidad con la reivindicación 22, que es un hidrogel.

25. Una composición de conformidad con la reivindicación 22, que además comprende un alcohol polivalente que incluye glicerol.

26. Una composición de conformidad con la reivindicación 22, que comprende un compuesto adicional cosméticamente activo.