ES2231775T5 - Composición de microburbujas estabilizadas para ecografía. - Google Patents

Abstract

UNA PREPARACION DE MICROBURBUJAS FORMADAS DE UNA PLURALIDAD DE MICROBURBUJAS, QUE CONSTA DE UN PRIMER GAS Y UN SEGUNDO GAS ENVUELTOS POR UNA MEMBRANA COMO UN SURFACTANTE, DONDE EL PRIMERO Y EL SEGUNDO GAS SE ENCUENTRAN PRESENTES EN UN INDICE MOLAR DESDE APROXIMADAMENTE 1:100 A 1000:1, Y DONDE EL PRIMER GAS POSEE UNA PRESION DE VAPOR DE AL MENOS APROXIMADAMENTE (760 -X) MM HG A 37 GRADOS C, DONDE X ES LA PRESION DE VAPOR DEL SEGUNDO GAS A 37 GRADOS C, Y DONDE LA PRESION DE VAPOR DE CADA UNO DE LOS DOS GASES ES MAYOR QUE APROXIMADAMENTE 75 MM HG A 37 GRADOS C; TAMBIEN SE MUESTRAN METODOS PARA PREPARAR COMPOSICIONES DE MICROBURBUJAS, QUE INCLUYEN COMPOSICIONES QUE SE MENGUAN RAPIDAMENTE DESDE UN PRIMER DIAMETRO MEDIO A UN SEGUNDO INFERIOR A APROXIMADAMENTE 75% DEL PRIMER DIAMETRO, Y QUE SE ESTABILIZAN EN EL SEGUNDO DIAMETRO; METODOS Y EQUIPOS PARA PREPARAR LAS MICROBURBUJAS; Y LOS METODOS PARA UTILIZAR TALES MICROBURBUJAS COMO AGENTES DE CONTRASTE.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ámbito de la invención 5

La presente invención incluye un procedimiento para preparar microburbujas estables de vida larga para realzar el contraste ecográfico y para otros usos, y las composiciones de las burbujas que se preparan de esta manera. 10

Antecedentes de la técnica

La tecnología ecográfica constituye una alternativa importante y más económica a las técnicas de imagen que usan radiaciones ionizantes. Mientras que se dispone de numerosas tecnologías convencionales de imagen, por 15 ejemplo resonancia magnética nuclear (RMN), tomografía computerizada (TC) y tomografía por emisión de positrones (TEP), usando cada una de estas técnicas un equipo extremadamente caro. Además, la TC y la TEP utilizan radiaciones ionizantes. Al contrario que estas técnicas, 20 el equipo de visualización mediante ecografía es relativamente barato. Además, la visualización con ecografía no utiliza radiaciones ionizantes.

La visualización con ecografía aprovecha las diferencias de densidad y de composición tisular que 25 afectan a la reflexión de las ondas sónicas por parte de esos tejidos. Las imágenes son especialmente nítidas cuando hay variaciones diferenciadas de densidad o de compresibilidad tisular, como en las interfases tisulares. Las interfases entre tejidos sólidos, el sistema 30 esquelético y diversos órganos y/o tumores se visualizan fácilmente con técnica de ecografía.

Según esto, en muchas aplicaciones de imagen la ecografía tiene un rendimiento adecuado sin utilizar agentes para realzar el contraste; sin embargo, para otras 35 aplicaciones, como la visualización del flujo sanguíneo, se han hecho esfuerzos continuos para desarrollar esos agentes para proporcionar un realce del contraste. Una aplicación particularmente significativa de esos agentes de contraste es el área de la visualización de la 5 perfusión. Esos agentes de contraste ecográfico podrían mejorar la visualización del flujo sanguíneo en músculo cardiaco, riñones, hígado y otros tejidos. Esto, a su vez, facilitaría la investigación, el diagnóstico, la cirugía y el tratamiento en relación con los tejidos visualizados. 10 Un agente de contraste del depósito sanguíneo también permitiría la visualización basándose en el contenido sanguíneo (por ejemplo, tumores y tejidos inflamados) y ayudaría a visualizar la placenta y el feto realzando únicamente la circulación materna. 15

Se han propuesto diversos agentes de realce del contraste ecográfico. Los agentes más útiles generalmente constaban de microburbujas que se pueden inyectar por vía intravenosa. En su forma de realización más sencilla, las microburbujas son burbujas en miniatura que contienen un 20 gas, como por ejemplo aire, y se forman mediante la utilización de agentes espumantes, tensioactivos o agentes encapsuladores. A continuación, las microburbujas constituyen un objeto físico en el torrente sanguíneo que tiene una densidad diferente y una compresibilidad mucho 25 mayor que el líquido tisular y la sangre circundantes. En consecuencia, estas microburbujas se pueden visualizar fácilmente mediante técnica de ecografía.

Sin embargo, la mayor parte de las composiciones de microburbujas no ha podido proporcionar un realce del 30 contraste que durara siquiera unos pocos segundos de, y mucho menos minutos. Esto limita mucho su utilidad. Por lo tanto, se han “construido” microburbujas de diferentes maneras en un intento de aumentar su vida efectiva de realce del contraste. Se han seguido varios caminos: 35 utilización de diferentes tensioactivos o espumantes, utilización de gelatinas o microesferas de albúmina que se forman inicialmente en una suspensión líquida y que atrapan el gas durante la solidificación, y formación de liposomas. En teoría cada uno de estos intentos debería 5 crear estructuras de burbuja más fuertes. Sin embargo, los gases atrapados (típicamente aire, CO2 y similares) están bajo una presión creciente en la burbuja debido a la tensión superficial del tensioactivo circundante, como se describe en la ecuación de Laplace (∆P=2γ/r). 10

Este aumento de presión da lugar a su vez a una contracción rápida y desaparición de la burbuja a medida que el gas se desplaza desde un área de alta presión (en la burbuja) hacia un entorno de menor presión (bien hacia el líquido circundante que no está saturado de gas a esta 15 presión elevada, o bien hacia una burbuja de mayor diámetro y de menor presión).

Generalmente se ha demostrado que las cubiertas de fase sólida que encapsulan los gases son demasiado frágiles o demasiado permeables al gas como para tener una 20 vida satisfactoria in vivo. Además, las cubiertas gruesas (por ejemplo, albúmina, azúcar u otros materiales viscosos) reducen la compresibilidad de las burbujas, reduciendo de esta manera su ecogenicidad durante el breve tiempo que pueden existir. Las partículas sólidas o las 25 gotitas de emulsiones líquidas que se convierten en gas o que hierven cuando se inyectan plantean el peligro de sobresaturar la sangre con el gas o con el vapor. Esto dará lugar a un pequeño número de grandes burbujas que pueden embolizar y que se forman en los escasos puntos de 30 nucleación disponibles, en lugar del gran número de burbujas pequeñas que se pretende.

Una propuesta para abordar estos problemas se perfila en Quay, PCT/US92/07250. Quay forma burbujas usando gases seleccionados por ser gases a la temperatura 35 corporal (37°C) y por tener una menor solubilidad en agua, una mayor densidad y una menor capacidad de difusión en solución que el aire. Aunque la reducción de la solubilidad en agua y de la capacidad de difusión pueden afectar a la velocidad a la que el gas abandona la 5 burbuja, sigue habiendo numerosos problemas con las burbujas de Quay. Formar burbujas de un diámetro lo suficientemente pequeño (por ejemplo, 3-5 µm) precisa aportar mucha energía. Esto es una desventaja porque los sistemas sofisticados de preparación de burbujas deben 10 estar disponibles en el lugar de uso. Además, los criterios de selección de gases de Quay son incorrectos porque no consideran ciertas causas importantes de contracción de las burbujas, a saber, los efectos de la tensión superficial de las burbujas, de los tensioactivos 15 y de los efectos osmóticos del gas, y estos errores dan lugar a la inclusión de ciertos gases inadecuados y a la exclusión de ciertos gases óptimamente adecuados.

Según esto, en la técnica existe una necesidad de composiciones, y un procedimiento para preparar dichas 20 composiciones, que proporcionen, o utilicen, un agente de realce del contraste de mayor vida que sea biocompatible, que se prepare fácilmente y que proporcione un realce de contraste superior en la visualización mediante ecografía.

Resumen de la invención 25

Según la presente invención, se proporciona un agente de realce del contraste ecográfico que tiene una longevidad prolongada in vivo, que está formado por prácticamente cualquier formulación convencional de microburbujas junto a un gas o mezcla de gases atrapados 30 que se selecciona teniendo en consideración las presiones parciales de los gases en el interior y en el exterior de la burbuja, y las diferencias resultantes de presión osmótica del gas que se oponen a la contracción de la burbuja. Se pueden proporcionar de manera ventajosa gases 35 que tienen una baja presión de vapor y una escasa solubilidad en la sangre o en el suero (es decir, relativamente hidrófobos) en combinación con otro gas que se intercambia más rápidamente con los gases que están presentes en la sangre o en el suero normales. También se 5 describen las familias de tensioactivos que permiten el uso de agentes osmóticos gaseosos de mayor peso molecular, y mejores procedimientos de producción de las burbujas.

Un aspecto de la presente invención es una preparación de microburbujas estabilizadas rellenas de 10 gas, que comprende una mezcla de un primer gas o gases y un segundo gas o gases (agente osmótico gaseoso) en el interior de membranas generalmente esféricas para formar microburbujas, en la que el primer gas y el segundo gas están presentes respectivamente en un cociente molar de 15 aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1000:1, y en la que el primer gas tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760-x) mm Hg a 37°C, donde x es la presión de vapor del segundo gas a 37°C, y en la que la presión de vapor de cada uno del primer y del segundo gas 20 es mayor de aproximadamente 75 mm Hg a 37°C, con la condición de que el primer gas y el segundo gas no sean vapor de agua. En el contexto de la presente invención, el segundo gas comprende un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, 25 perfluoropentanos, C5F12, perfluorociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 y el primer gas es un gas no fluorocarbonado, seleccionado del grupo de, 30 nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono o una mezcla de los mismos.

Las microburbujas se pueden proporcionar de manera ventajosa en un medio líquido, como un medio acuoso, en el que tienen un primer diámetro medio, el diámetro del 35 primer gas respecto al segundo gas en las microburbujas es al menos 1:1, y las microburbujas están adaptadas para contraerse en el medio como consecuencia de la pérdida del primer gas a través de la membrana hasta un segundo diámetro medio de menos del 75% del primer diámetro, y 5 posteriormente permanecen estabilizadas en el segundo diámetro o aproximadamente en el mismo durante al menos 1 minuto como consecuencia de un diferencial de presión osmótica del gas a través de la membrana. De manera ventajosa el medio está en un contenedor y las 10 microburbujas se han formado realmente en el contenedor. De manera alternativa, el medio es sangre in vivo. En una forma de realización el medio líquido contiene uno o varios gases disueltos en el mismo con una tensión gaseosa de al menos aproximadamente 700 mm Hg, en el que el primer 15 diámetro es de al menos aproximadamente 5 µm, y en el que la tensión del gas o de los gases disueltos en el medio es menor que la presión parcial del mismo gas o gases en el interior de las microburbujas.

En una forma de realización particularmente 20 preferida, la burbuja contiene inicialmente al menos tres gases: un primer gas que tiene una presión parcial mucho mayor que la tensión gaseosa del mismo gas en el líquido circundante (por ejemplo, 1,5, 2, 4, 5, 10, 20, 50, 100 ó más veces mayor que en el líquido circundante); un segundo 25 gas que se retiene en la burbuja debido a una permeabilidad relativamente baja de la membrana de la burbuja al gas, o una solubilidad relativamente baja del gas en el medio circundante (como se describe en otra parte de la presente solicitud); y un tercer gas para el 30 que la membrana es relativamente permeable y que también está presente en el medio circundante. Por ejemplo, en un sistema acuoso expuesto a aire o al menos parcialmente equilibrado con aire (como la sangre), el primer gas puede ser, de manera ventajosa dióxido de carbono u otro gas que 35 no esté presente en grandes cantidades en el aire ni en la sangre; el segundo gas puede ser un gas fluorocarbonado, como perfluorohexano; y el tercer gas puede ser aire o un componente importante del aire, como nitrógeno u oxígeno.

Preferentemente, el primer diámetro antes de la 5 contracción es de al menos aproximadamente 10 µm y el segundo diámetro, al que se estabiliza el diámetro, está entre aproximadamente 1 µm y 6 µm.

Para todas las preparaciones de microburbujas o todos los procedimientos que se describen en la presente 10 solicitud, en una forma preferida de realización, el segundo gas tiene un peso molecular medio de al menos aproximadamente cuatro veces el del primer gas. En otra forma de realización preferida el segundo gas tiene una presión de vapor menor de aproximadamente 750 o 760 mm Hg 15 a 37°C. Además, se prefiere que el cociente molar del primer gas respecto al segundo gas sea desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 500:1, 200:1 o 100:1. En otras formas de realización preferidas el segundo gas comprende un fluorocarbono o una mezcla de al 20 menos dos o tres fluorocarbonos, y el primer gas es un gas no fluorocarbonado. En algunas preparaciones ventajosas el segundo gas comprende uno o más perfluorocarbonos. En otras las microburbujas contienen como segundo gas, perfluorobutano y perfluorohexano gaseosos en un cociente 25 que va desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. De manera alternativa, las microburbujas contienen perfluorobutano y perfluoropentano gaseosos en un cociente desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. Es ventajoso que el segundo gas abandone la microburbuja 30 mucho más lentamente que el primer gas; así, se prefiere que el segundo gas tenga una solubilidad en agua no mayor de aproximadamente 0,5 mM a 25ºC y una atmósfera, y que el primer gas tenga una solubilidad en agua de al menos 10 veces, y preferentemente al menos 20, 50, 100 ó 200 veces 35 mayor que la del segundo gas. De manera similar, se prefiere que la permeabilidad de la membrana para el primer gas sea al menos aproximadamente 5 veces, preferentemente 10, 20, 50 ó 100 veces mayor que la permeabilidad de la membrana para el segundo gas. 5

La preparación de microburbujas puede estar contenida de manera ventajosa en un contenedor, que tiene un líquido en el contenedor en una mezcla con las microburbujas, en el que el contenedor comprende además medios para la transmisión al líquido de una energía 10 ultrasónica suficiente como para permitir la formación de las microburbujas mediante sonicación. De esta manera el médico (u otro profesional) puede formar las microburbujas inmediatamente antes de su uso aplicando a la preparación estéril que está en el interior del contenedor energía 15 ultrasónica a partir de una fuente externa. Este medio de transmisión puede, por ejemplo, ser un material polímero flexible que tiene un grosor menor de aproximadamente 0,5 mm (que permite la fácil transmisión de la energía ultrasónica sin sobrecalentar la membrana). Esas membranas 20 se pueden preparar a partir de dichos polímeros como goma natural o sintética u otro elastómero, politetrafluoroetileno, tereftalato de polietileno y similares.

En las preparaciones de microburbujas de la 25 invención, la membrana que rodea el gas es preferentemente un tensioactivo. Un tipo preferido de tensioactivo comprende un tensioactivo viscoelástico no newtoniano, solo o combinado con otro tensioactivo. Otras categorías generales y específicas preferidas de tensioactivos 30 incluyen carbohidratos, como polisacáridos; derivados de carbohidratos, como ésteres de ácidos grasos de azúcares como sacarosa (preferentemente estearato de sacarosa); y tensioactivos proteináceos, incluyendo albúmina. De manera alternativa, la membrana de la microburbuja no tiene por 35 qué ser un líquido (como un tensioactivo), sino que puede ser un sólido o un semisólido, como material proteináceo endurecido, engrosado o desnaturalizado (por ejemplo, albúmina), carbohidratos y similares.

Una forma ventajosa de la invención es un equipo 5 para su uso en la preparación de microburbujas, preferentemente en el lugar de uso. Este equipo puede comprender un contenedor sellado (como un vial con un tabique que actúa como sello para la extracción fácil de las microburbujas útiles usando una aguja hipodérmica), un 10 líquido del contenedor (como agua o un medio acuoso estéril isotónico tamponado), un tensioactivo del contenedor, y un gas fluorocarbonado (incluyendo un vapor fluorocarbonado) en el contenedor, en el que el líquido, el tensioactivo y el gas o el vapor fluorocarbonado están 15 adaptados en conjunto para formar microburbujas después de la aplicación de energía a las mismas. La energía ventajosamente puede ser energía de agitación simple, ya sea manual o mecánica, remover o batir, o energía ultrasónica. Preferentemente el equipo incluye en el 20 contenedor un medio para permitir la transmisión de suficiente energía ultrasónica externa como para que el líquido forme microburbujas en el contenedor. Como se ha señalado anteriormente, en una forma de realización el medio de transmisión puede comprender una membrana de un 25 polímero flexible que tiene un grosor menor de aproximadamente 0,5 mm. En una forma de realización el equipo incluye además en el contenedor un gas no fluorocarbonado, en el que el cociente molar del gas no fluorocarbonado respecto al gas fluorocarbonado es desde 30 aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1000:1, con la condición de que el gas no fluorocarbonado no sea vapor de agua. En todos los equipos de la presente invención, en algunas formas de realización el tensioactivo, el gas o los gases y los otros elementos del equipo pueden ser los 35 mismos que se han mencionado anteriormente para la propia preparación de las microburbujas.

En otra forma de realización el equipo comprende un contenedor, y en el contenedor estructuras secas solubles en líquidos que contienen cavidades, de modo que las 5 estructuras que contienen cavidades definen una pluralidad de cavidades que tienen un diámetro medio menor de aproximadamente 100 µm, un gas en las cavidades, y un tensioactivo, en el que las estructuras que contienen las cavidades, el gas y el tensioactivo están adaptados en 10 conjunto para formar microburbujas tras la adición al contenedor de un líquido en el que son solubles las estructuras que contienen las cavidades. Estas estructuras que contienen cavidades pueden estar hechas al menos en parte del tensioactivo, por ejemplo, mediante 15 liofilización del material que forma las cavidades o mediante deshidratación por aspersión, o se pueden formar a partir de cualquier otro material formador de película soluble en líquidos (preferentemente soluble en agua), como albúmina, enzimas u otras proteínas, carbohidratos 20 simples o complejos o polisacáridos, y similares. Los tensioactivos que se utilizan en el equipo pueden ser de manera ventajosa los que se han descrito anteriormente en relación con las preparaciones de microburbujas en sí mismas. 25

La presente invención también incluye un procedimiento para formar microburbujas que comprende las etapas de proporcionar un primer gas, un segundo gas, un material formador de membrana y un líquido, en el que el primer gas y el segundo gas estén presentes en un cociente 30 molar de desde aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1000:1, y en el que el primer gas tiene una presión de al menos aproximadamente (760 - x) mm Hg a 37°C, donde x es la presión de vapor del segundo gas a 37°C, y en el que la presión de vapor de cada uno del primer y del segundo gas 35 es mayor de aproximadamente 75 mm Hg a 37°C, con la condición de que el primer gas y el segundo gas no sean vapor de agua, y rodeando al primer y al segundo gas con el material formador de membrana para formar microburbujas en el líquido. Los materiales formadores de membrana y los 5 gases pueden ser los que se han descrito anteriormente. El procedimiento preferentemente comprende además las etapas de formar inicialmente microburbujas que tienen un primer diámetro medio en el que el cociente inicial del primer gas respecto al segundo gas en las microburbujas es de al 10 menos aproximadamente 1:1, poner en contacto las microburbujas que tienen un primer diámetro medio con un medio líquido, contraer las microburbujas en el medio como consecuencia de la pérdida del primer gas a través de la membrana, y posteriormente estabilizar las microburbujas a 15 un segundo diámetro medio menor de aproximadamente el 75% del primer diámetro durante un periodo de al menos 1 minuto. Preferentemente las microburbujas se estabilizan en el segundo diámetro proporcionando un diferencial de presión osmótica gaseosa a través de la membrana, de modo 20 que la tensión de un gas o de unos gases disueltos en el medio es mayor que la presión del mismo gas o gases en el interior de las microburbujas o igual a la misma. En una forma de realización el primer diámetro es de al menos aproximadamente 5 µm. 25

La invención también incluye un procedimiento para formar microburbujas que comprende las etapas de proporcionar estructuras secas solubles en líquido que contienen cavidades, de modo que las estructuras que contienen cavidades definen una pluralidad de cavidades 30 que tienen un diámetro menor de aproximadamente 100 µm, proporcionar un gas en las cavidades, proporcionar un tensioactivo, combinar las estructuras que contienen cavidades, el tensioactivo y un líquido en el que son solubles las estructuras que contienen cavidades, y 35 disolver las estructuras que contienen cavidades en el líquido, de modo que el gas de los espacios cerrados forma microburbujas que están rodeadas por el tensioactivo. Como con el equipo, las estructuras preferidas que contienen cavidades están formadas de proteínas, tensioactivo, 5 carbohidratos o cualquiera de los otros materiales que se han descrito anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para producir microburbujas que tienen un aumento de la estabilidad en el interior del vial, que 10 comprende las etapas de deshidratación por aspersión de una formulación líquida de un material biocompatible para producir microesferas huecas a partir del mismo, permear las microesferas con un agente osmótico gaseoso (el segundo gas) mezclado con el primer gas y almacenar las 15 microesferas en un contenedor con la mezcla de gases, y posteriormente añadir al polvo una fase acuosa, en la que el polvo se disuelve en la fase acuosa para atrapar la mezcla de gases en el interior de una membrana tensioactiva líquida para formar microburbujas. En una 20 forma de realización las microesferas comprenden un almidón o un derivado de almidón que tiene un peso molecular de más de aproximadamente 500.000 o un valor de equivalencia de dextrosa menor de aproximadamente 12. Un derivado de almidón preferido es hidroxietil almidón. El 25 agente osmótico gaseoso comprende un perfluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, 30 perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12. En otra forma de realización las microesferas comprenden un éster de azúcar que tiene un componente con un equilibrio hidrófilo-lipófilo menor de aproximadamente 8. Preferentemente el 35 éster de azúcar es triestearato de sacarosa.

La presente invención también incluye un procedimiento para formar microburbujas que comprende la etapa de proporcionar un polvo tensioactivo permeado con un agente osmótico gaseoso, y la combinación del polvo con 5 una fase acuosa.

Otro aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para aumentar la semivida in vivo de las microburbujas, que comprende proporcionar una formulación deshidratada por aspersión en combinación con un agente 10 osmótico gaseoso que permea las formulación, y combinar la formulación con una fase acuosa para formar microburbujas que tienen una semivida in vivo de al menos aproximadamente 20 segundos. En formas de realización preferidas la formulación deshidratada por aspersión 15 comprende un almidón o un derivado de almidón, y el éster de azúcar es triestearato de sacarosa.

La presente invención también incluye el uso de una preparación líquida estabilizada de microburbujas para la fabricación de un agente diagnóstico para visualizar un 20 objeto o un cuerpo, que comprende las etapas de introducir en el objeto o cuerpo cualquiera de las preparaciones de microburbujas que se han mencionado anteriormente y posteriormente visualizar mediante técnica de ecografía al menos una porción del objeto o del cuerpo. Preferentemente 25 el cuerpo es un vertebrado y la preparación se introduce en la vasculatura del vertebrado. El procedimiento puede incluir además la preparación de las microburbujas de cualquiera de las maneras antes mencionadas antes de su introducción en el animal. 30

Otra forma de realización de la invención es una preparación de microburbujas estabilizadas rellenas de gas que comprende:

Un contenedor, y

Una mezcla en el contenedor de un primer gas o gases 35 y de un segundo gas o gases en el interior de las membranas generalmente esféricas para formar microburbujas, en la que el primer gas y el segundo gas están presentes respectivamente en un cociente molar de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 5 1000:1, y en la que el primer gas tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760 - x) mm Hg a 37°C, donde x es la presión de vapor del segundo gas a 37°C, y en la que la presión de vapor de cada uno del primer y del segundo gas es mayor de 10 aproximadamente 75 mm Hg a 37°C, con la condición de que el primer gas y el segundo gas no sean vapor de agua.

El primer gas comprende un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, 15 perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 y el primer gas es un 20 gas no fluorocarbonado seleccionado del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico y una mezcla de los mismos. Preferentemente, el primer gas comprende nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico, o una mezcla de los mismos. La invención además incluye la preparación 25 arriba mencionada, en la que:

Las microburbujas están en un medio líquido y tienen un primer diámetro medio,

El cociente del primer gas respecto al segundo gas en las microburbujas es de al menos 1:1, y 30

Las microburbujas están adaptadas para contraerse en el medio como consecuencia de la pérdida del primer gas a través de la membrana hasta un segundo diámetro medio de menos de aproximadamente el 75% del primer diámetro, y posteriormente a permanecer estabilizadas 35 aproximadamente en el segundo diámetro durante al menos 1 minuto como consecuencia del diferencial de presión osmótica gaseosa a través de la membrana.

De manera ventajosa el medio es acuoso. En una formar de realización alternativa el medio está en un 5 contenedor y las microburbujas se han formado en el contenedor. Preferentemente el medio es sangre in vivo. En otro aspecto de esta forma de realización preferida el medio líquido contiene el gas o los gases disueltos en el mismo con una tensión gaseosa de al menos aproximadamente 10 700 mm Hg, en el que el primer diámetro es de al menos aproximadamente 5 µm, y en el que la tensión del gas o de los gases disueltos en el medio es menor que la presión del mismo gas o gases en el interior de las microburbujas. Preferentemente, el primer diámetro es al menos de 15 aproximadamente 10 µm y el segundo diámetro está entre aproximadamente 1 µm y 6 µm. En otro aspecto de esta forma de realización el segundo gas tiene un peso molecular medio de al menos aproximadamente cuatro veces el del primer gas. De manera ventajosa el segundo gas tiene una 20 presión de vapor menor de aproximadamente 750 mm Hg a 37° y el cociente molar de primer gas respecto al segundo gas es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 500:1. El segundo gas comprende un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, 25 perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 y el primer gas es un gas no fluorocarbonado seleccionado del grupo de 30 nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico y una mezcla de los mismos. De manera alternativa, el segundo gas puede comprender al menos dos fluorocarbonos o un perfluorocarbono seleccionados del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, 35 perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 . En otro aspecto de esta forma de realización, las microburbujas contienen 5 como segundo gas, perfluorobutano y perfluorohexano gaseosos en un cociente desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. En otro aspecto de esta forma de realización, las microburbujas contienen como segundo gas, perfluorobutano y perfluoropentano gaseosos en un cociente 10 desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. Según otro aspecto de la invención, el segundo gas tiene una solubilidad en agua de no más de aproximadamente 0,5 mM a 25°C y 1 atmósfera, y el primer gas tiene una solubilidad en agua al menos 10 veces mayor que la del segundo gas. 15 Preferentemente, la permeabilidad de la membrana al primer gas es al menos aproximadamente cinco veces mayor que la permeabilidad de la membrana al segundo gas. Según otro aspecto de la invención la preparación comprende además un líquido en el contenedor mezclado con las microburbujas, 20 en el que el contenedor comprende además un medio para la transmisión al líquido de suficiente energía ultrasónica como para permitir la formación de microburbujas mediante sonicación. De manera ventajosa el medio para la transmisión comprende un material polímero flexible que 25 tiene un grosor menor de aproximadamente 0,5 mm. Preferentemente la membrana es un tensioactivo; más preferentemente el tensioactivo comprende un tensioactivo viscoelástico no newtoniano o un carbohidrato. El carbohidrato es preferentemente un polisacárido. En formas 30 de realización alternativas, el tensioactivo es un éster de ácido graso de un azúcar; preferentemente es estearato de sacarosa. En una forma de realización alternativa el tensioactivo es proteináceo. Según otro aspecto de la invención, la membrana es sólida o semisólida; de manera 35

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una proyección en perspectiva de un vial de dos cámaras que contiene una 5 preparación para formar microburbujas, con una solución acuosa en una cámara superior y los ingredientes sólido y gaseoso en una cámara inferior.

La Figura 2 ilustra el vial de la Figura 1, en el que 10 la solución acuosa se ha mezclado con los ingredientes sólidos para formar microburbujas para su administración a un paciente.

La Figura 3 es una proyección en perspectiva de un 15 vial de dos cámaras invertido que contiene una preparación para formar microburbujas, con una solución acuosa en la cámara inferior y los ingredientes sólido y gaseoso en la cámara superior. 20

La Figura 4 muestra el vial de la Figura 3, en el que la solución acuosa se ha mezclado con los ingredientes sólidos para formar microburbujas para su administración a un paciente. 25

Descripción detallada de la invención

Como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, los términos “vapor” y “gas” se usan de manera indistinta. De manera similar, cuando se hace referencia a la tensión de un gas disuelto en un líquido, 30 el término más familiar “presión” se puede utilizar de manera indistinta con “tensión”. “Presión osmótica gaseosa” se define con más detalle más abajo, pero se puede considerar que una aproximación sencilla es la diferencia entre la presión parcial de un gas en el 35 interior de una microburbuja y la presión o la tensión de ese gas (en una fase gaseosa o disuelto en una fase líquida) fuera de la microburbuja, cuando la membrana de la microburbuja es permeable al gas. De manera más precisa, se refiere a las diferencias en la velocidad de 5 difusión del gas a través de la membrana. El término “membrana” se usa para referirse al material que rodea o que define una microburbuja, tanto si es un tensioactivo, otro líquido formador de película, o un sólido o un semisólido formador de película. Se considera que las 10 “microburbujas” son burbujas que tienen un diámetro entre aproximadamente 0,5 y 300 µm, preferentemente que tienen un diámetro de no más de aproximadamente 200, 100 o 50 µm, y, para uso intravascular, preferente de no más de aproximadamente 10, 8, 7, 6 o 5 µm (medido como el 15 diámetro ponderado numérico medio de la composición de la microburbuja). Cuando se hace referencia a un “gas” se debe entender que las mezclas de gases en conjunto que tienen las propiedades necesarias se encuadran dentro de la definición, excepto cuando el contexto lo especifica de 20 otra manera. Así, en esta solicitud se puede considerar típicamente que el aire es un “gas”.

La presente invención proporciona microburbujas que tienen una longevidad prolongada in vivo y que son adecuadas para su uso como agentes de realce del contraste 25 para ecografía y para resonancia magnética (RMN). Los agentes de realce del contraste ecográfico típicos muestran un posible realce de contraste durante sólo aproximadamente un paso a través del sistema arterial, o desde unos pocos segundos a aproximadamente 1 minuto, y de 30 esta manera no sobreviven más allá de la aorta de un paciente después de su inyección intravenosa. Por el contrario, los agentes de contraste que se preparan según la presente invención siguen demostrando vidas de realce de contraste medidas en múltiples pasos por todo el 35 sistema circulatorio de un paciente después de la inyección intravenosa. Se pueden demostrar con facilidad vidas de las burbujas de varios minutos. Ese aumento de la duración del potencial de realce del contraste durante la ecografía es muy ventajoso. Además, los agentes de realce 5 del contraste de la invención proporcionan una visualización superior; por ejemplo, se consiguen imágenes claras, vividas y diferenciadas del flujo sanguíneo a través del corazón, del hígado y de los riñones. Así, se pueden administrar dosis pequeñas y no tóxicas en una vena 10 periférica y se pueden usar para realzar las imágenes de todo el cuerpo.

Como se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.315.997, los gases y los vapores de perfluorocarbono tienen susceptibilidades magnéticas que son 15 sustancialmente diferentes de las de los tejidos y de la sangre. Por lo tanto, las microburbujas de la presente invención producirán cambios de los campos magnéticos locales presentes en los tejidos y en la sangre durante la RMN. Estos cambios se pueden distinguir en una imagen de 20 RMN y se pueden utilizar para detectar la presencia de un agente de contraste. El agente de la invención persiste en el reservorio sanguíneo durante más tiempo y por lo tanto permite realizar estudios más prolongados y más sensibles de mayores porciones del cuerpo. 25

Mientras que se ha mostrado que las burbujas son los medios de dispersión ecográficos más eficientes para su uso como agentes de contraste ecográfico intravenoso, su principal inconveniente práctico es la vida extremadamente corta de las burbujas pequeñas (típicamente menores de 5 30 µm de diámetro) que son necesarias para atravesar los capilares en suspensión. Esta breve vida está producida por el aumento de la presión del gas en el interior de la burbuja, que se debe a las fuerzas de tensión superficial que actúan sobre la burbuja. Esta elevada presión interna 35 aumenta a medida que se reduce el diámetro de la burbuja. El aumento de la presión interna del gas hace que el gas del interior de la burbuja se disuelva, dando lugar a colapso de la burbuja a medida que el gas es expulsado hacia la solución. La ecuación de Laplace, ∆P=2γ/r, (donde 5 ∆P es el aumento de la presión del gas en el interior de la burbuja, γ es la tensión superficial de la película de la burbuja y r es el radio de la burbuja) describe la presión que ejerce sobre una burbuja de gas la superficie o película que rodea a la burbuja. La presión de Laplace 10 es inversamente proporcional al radio de la burbuja; así, a medida que se contrae la burbuja aumenta la presión de Laplace, aumentando la velocidad de difusión del gas fuera de la burbuja y la velocidad de contracción de la burbuja.

Sorprendentemente, se descubrió que los gases y las 15 mezclas de vapor de gas que pueden ejercer una presión osmótica gaseosa que se opone a la presión de Laplace pueden retrasar mucho el colapso de estas burbujas de pequeño diámetro. En general, la invención usa un gas o una mezcla de gases modificadores primarios que diluyen un 20 agente osmótico gaseoso a una presión parcial menor que la presión de vapor del agente osmótico gaseoso, hasta que el gas modificador se intercambia con los gases que están presentes normalmente en el medio externo. El agente o los agentes osmóticos gaseosos son generalmente relativamente 25 hidrófobos y relativamente impermeables en la membrana de la burbuja, y además tienen la capacidad de desarrollar presiones osmóticas gaseosas mayores de 75 ó 100 mm Hg a una presión de vapor relativamente baja.

El procedimiento de la invención se relaciona con el 30 bien conocido defecto osmótico que se observa cuando una bolsa de diálisis que contiene un soluto al que la membrana es sustancialmente impermeable (por ejemplo, PEG, albúmina, polisacárido, almidón) disuelto en una solución acuosa es expuesta a una fase externa de agua pura. El 35 soluto que está en el interior de la bolsa diluye el agua hacia el interior de la bolsa y de esta manera reduce la velocidad de difusión del agua hacia el exterior de la bolsa en relación con la velocidad de difusión del agua pura (concentración completa) hacia el interior de la 5 bolsa. La bolsa se expandirá en volumen hasta que se establezca un equilibrio con una presión interna elevada en el interior de la bolsa, lo que aumenta la velocidad del flujo de difusión hacia fuera del agua para equilibrar la velocidad del flujo de entrada de agua pura. Esta 10 diferencia de presión es la presión osmótica entre las soluciones.

En el sistema que se ha descrito anteriormente, la presión interna disminuirá lentamente a medida que el soluto difunda lentamente fuera de la bolsa, reduciendo de 15 esta manera la concentración interna del soluto. Otros materiales que están disueltos en la solución que rodea la bolsa reducen aún más esta presión y, si son más efectivos o si están a una mayor concentración, producirán el colapso de la bolsa. 20

Se observó que las burbujas de aire saturadas con perfluorocarbonos crecen en lugar de contraerse cuando se exponen al aire que está disuelto en un líquido debido a la presión osmótica gaseosa que ejerce el vapor de perfluorocarbono. El vapor de perfluorocarbono es 25 relativamente impermeable a la película de la burbuja y de esta manera permanece en el interior de la burbuja. El aire del interior de la burbuja se diluye por el perfluorocarbono, que actúa retrasando el flujo de difusión del aire hacia el exterior de la burbuja. Esta 30 presión osmótica gaseosa es proporcional al gradiente de concentración del vapor de perfluorocarbono a través de la película de la burbuja, de la concentración de aire que rodea la burbuja y del cociente de la permeabilidad de la película de la burbuja al aire y al perfluorocarbono. 35

Como se analiza anteriormente, la presión de Laplace es inversamente proporcional al radio de la burbuja; así, a medida que la burbuja se contrae aumenta la presión de Laplace, aumentando la velocidad de difusión del gas hacia el exterior de la burbuja y la velocidad de contracción de 5 la burbuja, y en algunos casos da lugar a la condensación y a la práctica desaparición del gas de la burbuja a medida que las presiones combinadas de Laplace y externa concentran el agente osmótico hasta que su presión parcial alcanza la presión de vapor del agente osmótico líquido. 10

Hemos descubierto que las microburbujas convencionales que contienen cualquier gas único permanecerán en la sangre durante una duración que depende fundamentalmente de la tensión arterial, del diámetro de la burbuja, de la permeabilidad de la membrana al gas a 15 través de la superficie de la burbuja, de la fuerza mecánica de la superficie de la burbuja, de la presencia o ausencia y de la concentración de los gases que habitualmente están presentes en la sangre o en el suero, y de la tensión superficial que está presente en la 20 superficie de la burbuja (que depende principalmente del diámetro de la burbuja y en menor medida de la identidad y de la concentración de los tensioactivos que forman la superficie de la burbuja). Todos estos parámetros están interrelacionados entre sí, e interactúan en la burbuja 25 para determinar cuánto tiempo permanecerá la burbuja en la sangre.

La presente invención incluye el descubrimiento de que un solo gas o una combinación de gases puede actuar de manera conjunta para estabilizar la estructura de las 30 microburbujas, arrastrándolas y atrapándolas. Esencialmente, la invención utiliza un primer gas o gases (un “gas modificador principal”) seleccionado del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido de carbono y una mezcla de los mismos que de manera opcional está presente 35 habitualmente en la sangre y en el suero normales, en combinación con uno o más gases secundarios adicionales (“agente o agentes osmóticos gaseosos” o “gas secundario”) seleccionado del grupo de seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, 5 perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 que actúan regulando la presión osmótica del interior de la burbuja. 10 Mediante la regulación de la presión osmótica de la burbuja, el agente osmótico gaseoso (definido en esta solicitud como una entidad química única o una mezcla de entidades químicas) ejerce presión en el interior de la burbuja, ayudando a impedir que se desinfle. De manera 15 opcional, el gas modificador puede ser un gas que no está presente habitualmente en la sangre o en el suero. Sin embargo, el gas modificador debe ser capaz de diluirse y de mantener el agente o los agentes osmóticos gaseosos a una presión parcial inferior a la presión de vapor del 20 agente o de los agentes osmóticos gaseosos mientras los gases de la sangre o de otro líquido circundante difunden hacia el interior de la burbuja. En un medio acuoso no se considera que el vapor de agua sea uno de los “gases” en cuestión. De manera similar, cuando las microburbujas 25 están en un medio líquido no acuoso, no se considera que el vapor de ese medio sea uno de los “gases”.

Hemos descubierto que, mediante la adición de un agente osmótico gaseoso que tiene, por ejemplo, una reducción de la permeabilidad de membrana a través de la 30 superficie de la burbuja o una reducción de la solubilidad en la fase líquida externa de la fase continua, la vida de una burbuja que se forma en la misma aumentará de manera radical. Esta influencia estabilizadora se puede entender más fácilmente mediante un análisis de ciertas burbujas 35 teóricas. Primero consideraremos los efectos de la tensión arterial y la tensión superficial sobre una microburbuja hipotética que contiene sólo aire.

Inicialmente se prepara una burbuja hipotética que contiene sólo aire. Para el presente análisis inicialmente 5 se considera que esta burbuja no tiene ninguna presión de Laplace. Generalmente, cuando se equilibra a temperatura y presión estándar (TPE), tendrá una presión interna de 760 mm Hg de aire y la concentración del aire en el líquido circundante también está equilibrada a 760 mm Hg (es 10 decir, el líquido tiene una tensión de aire de 760 mm Hg). Esa burbuja no se contraerá ni crecerá.

Posteriormente, cuando se introduce la burbuja hipotética que se ha señalado anteriormente en el sistema arterial, la presión parcial de aire (o tensión de aire) 15 en la sangre (la presión de aire a la que la sangre está saturada con aire) también será de aproximadamente 760 mm Hg, y habrá una tensión arterial (para este análisis, 100 mm Hg). Este total crea una presión externa sobre la burbuja de 860 mm Hg, y hace que los gases de la burbuja 20 estén comprimidos hasta que la presión interna aumente a 860 mm Hg. Posteriormente se produce una diferencia de 100 mm Hg entre la presión del aire en el interior de la burbuja y la tensión del aire en el líquido que rodea a la burbuja. Este diferencial de presión hace que el aire 25 difunda hacia el exterior de la burbuja, a través de su membrana superficial permeable al aire, haciendo que la burbuja se contraiga (es decir, que pierda aire) a medida que intenta alcanzar el equilibrio. La burbuja se contrae hasta que desaparece. 30

A continuación considérese el efecto adicional, y más realista, sobre la burbuja hipotética de la adición de la tensión superficial de la burbuja. La tensión superficial de la burbuja tendrá lugar a una presión de Laplace que se ejerce sobre el gas del interior de la 35 burbuja. La presión total que se ejerce sobre el gas interior de la burbuja se calcula añadiendo la suma de la presión atmosférica, la presión arterial y la presión de Laplace. En una burbuja de 3 µm se puede conseguir una tensión superficial de 10 dinas por centímetro con 5 tensioactivos bien elegidos. Así, la presión de Laplace que se ejerce sobre la hipotética burbuja de 3 µm es de aproximadamente 100 mm Hg y, además, también se ejerce sobre la burbuja la presión arterial de 100 mm Hg. Por lo tanto, en nuestra burbuja hipotética, la presión externa 10 total que se aplica al gas del interior de la burbuja es de 960 mm Hg.

La burbuja estará comprimida hasta que la presión del aire del interior de la burbuja aumente hasta 960 mm Hg. Según esto, se produce un diferencial de concentración 15 de 200 mm Hg entre el aire del interior de la burbuja y el aire que está disuelto en la sangre. Por lo tanto, la burbuja se contraerá rápidamente y desaparecerá incluso más rápidamente que en el caso anterior, a medida que intenta alcanzar el equilibrio. 20

El descubrimiento de la presente invención está ilustrado por la consideración de una tercera microburbuja hipotética que contiene aire y un agente osmótico gaseoso o un gas secundario. Debemos asumir que una burbuja teórica, que inicialmente no tiene ninguna presión 25 arterial ni ninguna presión de Laplace, se prepara de modo que tenga una presión total de 760 mm Hg, y está formada por aire a una presión parcial de 684 mm Hg y un perfluorocarbono (“PFC”) como agente osmótico gaseoso a una presión de 76 mm Hg. Además, se debe asumir que el 30 perfluorocarbono se selecciona de modo que tenga una o más características que hagan que sea capaz de actuar como un agente osmótico gaseoso adecuado, como una escasa permeabilidad en la membrana de la burbuja o una escasa solubilidad en la fase líquida externa. Hay un diferencial 35 de presión osmótica gaseosa inicial entre los 684 mm Hg del aire del interior de la burbuja y los 760 mm Hg de la tensión del aire del exterior de la burbuja (asumiendo TPE) de 76 mm Hg. Esta diferencia de presión inicial de 76 mm Hg es la presión osmótica gaseosa inicial y hará que la 5 burbuja se expanda. El aire del exterior de la burbuja difundirá hacia el interior de la burbuja y la inflará, arrastrado por el diferencial de presión osmótica, de una manera similar a la manera en la que el agua difunde hacia una bolsa de diálisis que contiene una solución de almidón 10 e infla la bolsa.

La presión osmótica gaseosa máxima que puede desarrollar esta mezcla de gases se relaciona con la presión parcial del PFC y con el cociente de la permeabilidad del PFC respecto a la permeabilidad del aire 15 en el líquido circundante. En teoría, y como se ha observado experimentalmente, la burbuja crecerá de manera indefinida a medida que el sistema intenta alcanzar el equilibrio osmótico entre la concentración de aire (equivalente a la presión parcial del aire) del interior 20 de la burbuja y la concentración de aire que rodea a la burbuja (la tensión de aire).

Cuando la burbuja hipotética que contiene una mezcla de gases se expone a 100 mm Hg de presión arterial, en la que la sangre tiene una tensión de aire disuelto de 760 mm 25 Hg, la presión externa total será igual a 860 mm Hg (760 mm Hg de presión atmosférica y 100 mm Hg de presión arterial). La burbuja se comprimirá bajo la presión arterial, haciendo que la presión interna de la burbuja alcance los 860 mm Hg. La presión parcial del aire 30 aumentará a 770 mm Hg y la presión parcial del PFC (el segundo gas) aumentará a 86 mm Hg. El aire difundirá hacia el exterior de la burbuja hasta que alcance el equilibrio osmótico con el aire disuelto en la sangre (es decir, 760 mm Hg) y la presión parcial del PFC aumentará a 100 mm Hg. 35 La presión parcial del PFC actuará contrarrestando la presión que se ejerce debido a la presión arterial, deteniendo la contracción de la burbuja, en todos los casos, asumiendo que la permeabilidad de la burbuja al PFC es despreciable. 5

Cuando se añade la tensión superficial o el componente de la presión de Laplace de 100 mm Hg (como se ha analizado anteriormente con la burbuja de aire) se ejerce una presión adicional total de 200 mm Hg sobre el gas de la burbuja. Una vez más la burbuja se comprimirá 10 hasta que la presión del interior de la burbuja aumente hasta 960 (presión parcial de aire 864 y presión parcial del PFC 96). El aire difundirá desde la burbuja hasta que alcance 760 mm Hg (en equilibrio con la concentración de aire disuelto en la sangre), y la presión parcial del PFC 15 aumentará hasta 200 mm Hg, donde, una vez más, la presión osmótica gaseosa inducida por el PFC actuará contrarrestando la presión que ejercen la presión de Laplace y la presión arterial, una vez más, asumiendo que la permeabilidad de la membrana de la burbuja al PFC es 20 despreciable.

De manera similar, si la presión parcial del aire de la burbuja es menor que la tensión del líquido circundante, la burbuja realmente crecerá hasta que el PFC esté lo suficientemente diluido por el aire que entra, de 25 modo que la presión del aire en el interior y la tensión del aire en el exterior de la burbuja sean idénticas.

Así, las burbujas se pueden estabilizar de manera efectiva mediante el uso de combinaciones de gases, porque la combinación correcta de gases dará lugar a un 30 diferencial de presión osmótica gaseosa que se puede mantener fijo para contrarrestar los efectos de la presión de Laplace y de la presión arterial que se ejercen sobre el gas del interior de la burbuja en la sangre circulante.

Los ejemplos de usos particulares de las 35 microburbujas de la presente invención incluyen la visualización de la perfusión del corazón, del tejido miocárdico, y la determinación de las características de la perfusión del corazón y de sus tejidos durante las pruebas de estrés o de esfuerzo, o los efectos de la 5 perfusión o los cambios debidos a infarto del miocardio. De manera similar, también se puede visualizar el tejido miocárdico después de la administración oral o venosa de fármacos diseñados para aumentar el flujo sanguíneo a un tejido. También se puede realzar la visualización de los 10 cambios del tejido miocárdico debidos a varias intervenciones o durante las mismas, como injertos venosos de tejido coronario, angioplastia coronaria o el uso de fármacos trombolíticos (TPA o estreptocinasa). Como estos agentes de contraste se pueden administrar de manera 15 conveniente a través de una vena periférica para potenciar la visualización de todo el sistema circulatorio, también ayudarán al diagnóstico de patologías vasculares generales y a la posibilidad de monitorizar ecográficamente la viabilidad del tejido placentario. 20

Sin embargo, se debe poner de relieve que estos principios se pueden aplicar más allá de la visualización ecográfica. De hecho, la presente invención es lo suficientemente amplia como para incluir el uso de la presión osmótica gaseosa para estabilizar las burbujas 25 para usos en cualquier sistema, incluyendo aplicaciones no biológicas.

En una forma de realización preferida, las microburbujas de la presente invención tienen una membrana de la burbuja pasada en un tensioactivo. Sin embargo, los 30 principios de esta invención se pueden aplicar para estabilizar microburbujas de prácticamente cualquier tipo. Así, gases o vapores mixtos del tipo que se ha descrito anteriormente pueden estabilizar burbujas basadas en albúmina, microburbujas basadas en polisacáridos, 35 microburbujas derivadas de microesferas deshidratadas por aspersión, y similares. Este resultado se consigue mediante atrapamiento, en el interior de la microburbuja elegida, de una combinación de gases, preferentemente un gas modificador o una mezcla de gases modificadores que 5 diluirán un agente osmótico gaseoso hasta una presión parcial menor que la presión de vapor del agente osmótico gaseoso, hasta que el gas modificador se intercambie con los gases que normalmente están presentes en el medio externo. El agente o agentes osmóticos gaseosos son 10 generalmente relativamente hidrófobos y relativamente impermeables en la burbuja de la membrana y además poseen la capacidad de desarrollar presiones osmóticas gaseosas mayores de 50, 75 ó 100 mm Hg. En una forma de realización preferida, la presión de vapor gaseosa del agente osmótico 15 gaseoso es preferentemente menor de aproximadamente 760 mm Hg a 37°C, preferentemente menor de aproximadamente 750, 740, 730, 720, 710 ó 700 mm Hg, y en algunas formas de realización menos de aproximadamente 650, 600, 500 ó 400 mm Hg. En formas de realización preferidas la presión de 20 vapor del gas modificador primario es de al menos 660 mm Hg a 37°C y la presión de vapor del agente osmótico es de al menos 100 mm Hg a 37°C. Para la visualización in vivo se prefieren diámetros medios de la burbuja entre 1 y 10 µm, y se prefieren más aún entre 3 y 5 µm. En una forma de 25 realización la invención también se puede describir como una mezcla de un primer gas o gases y de un segundo gas o gases en el interior de membranas generalmente esféricas para formar microburbujas, en las que el primer gas y el segundo gas están presentes respectivamente en un cociente 30 molar de aproximadamente 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20 ó 1:10 hasta aproximadamente 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 ó 50:1, y en el que el primer gas tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760- x) mm Hg a 37°C, donde x es la presión de vapor del segundo gas a 35

Las microburbujas que se preparan según una forma de realización preferida de la invención también pueden 5 poseer una propiedad ventajosa adicional. En esa forma de realización se usan mezclas de gases no osmóticos con gases estabilizadores osmóticos (o agentes osmóticos gaseosos) para estabilizar la distribución del tamaño de las burbujas resultantes durante su producción e 10 inmediatamente después. Después de la generación de las burbujas, la mayor presión de Laplace de las burbujas más pequeñas da lugar a la difusión a través de la fase líquida hasta las burbujas de mayor tamaño y de menor presión de Laplace. Esto hace que la distribución de los 15 tamaños medios aumente por encima del límite de la dimensión capilar de 5 µm a lo largo del tiempo. Esto se denomina desproporción molecular. Cuando se usa una mezcla de un gas no osmótico (por ejemplo, aire) con un vapor osmótico (por ejemplo, C6F14), una ligera reducción del 20 volumen de las burbujas más pequeñas, debida al aire que abandona la burbuja, concentra el gas osmótico y aumenta su presión osmótica, retrasando de esta manera la posterior contracción, mientras que las burbujas de mayor tamaño aumentan ligeramente de volumen, lo que diluye el 25 gas osmótico y retrasa el posterior crecimiento.

Una ventaja adicional de usar una mezcla de un gas extremadamente soluble en sangre (por ejemplo, CO2 al 87,5% en volumen) y una mezcla de gases osmóticos (por ejemplo, vapor de C6F14 al 28% más aire al 72%) es que, 30 cuando se inyectan, estas burbujas se contraen rápidamente debido a la pérdida de CO2 hacia la sangre. Después de la inyección, las burbujas experimentaron una disminución de volumen del 87,5% debido a la pérdida del CO2. Esta pérdida de CO2 corresponde a una reducción a la mitad del 35 diámetro de la burbuja. En consecuencia, se pueden preparar burbujas de mayor diámetro (por ejemplo, 9 µm) usando medios mecánicos simplificados, que se contraerán hasta menos de 5 µm después de la inyección. En general estas burbujas inicialmente se preparan de modo que el 5 primer gas esté presente en un cociente de al menos 1:1 en relación al segundo gas, preferentemente al menos 3:0, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ó 10:1. Cuando la membrana de la microburbuja es más permeable al primer gas que al segundo gas (por ejemplo, la membrana tiene permeabilidades 10 relativas a los gases en un cociente de al menos aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ó 10:1, preferentemente incluso mayores, por ejemplo 20:1, 40:1 ó 100:1), de modo que las burbujas de manera ventajosa se contraen bastante rápidamente (por ejemplo, en un plazo de 1, 2, 4 o 5 15 minutos) desde su primer diámetro original hasta un segundo diámetro medio del 75% o menos de su diámetro original. Posteriormente, cuando hay al menos un gas relativamente permeable en la membrana en el medio acuoso que rodea la microburbuja, la burbuja se estabiliza 20 preferentemente al segundo diámetro o cerca del mismo durante al menos aproximadamente 1 minuto, preferentemente durante 2, 3, 4 ó 5 minutos. En una forma de realización preferida las burbujas mantienen un tamaño entre aproximadamente 5 ó 6 µm durante al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 25 minutos, estabilizadas por un diferencial de presión osmótica gaseosa. La tensión gaseosa en el líquido externo es preferentemente de al menos aproximadamente 700 mm Hg. Además, también hay un gas relativamente permeable a la membrana en la microburbuja para crear ese diferencial de 30 presión osmótica.

I. Construcción de las microburbujas

A. Fase líquida formada de membrana

La fase líquida continua externa en la que reside la burbuja típicamente incluye una tensioactivo o un agente 35 espumante. Los tensioactivos adecuados para su uso en la presente invención incluyen cualquier compuesto o composición que ayuda a la formación y al mantenimiento de la membrana de la burbuja formando una capa en la interfase entre las fases. El agente espumante o el 5 tensioactivo pueden comprender un solo compuesto o cualquier combinación de compuestos, como en el caso de los agentes cotensioactivos.

Los tensioactivos o los agentes espumantes adecuados incluyen: copolímeros de bloque de polioxietileno o de 10 polioxipropileno, ésteres de azúcares, alcoholes grasos, óxidos de aminas alifáticas, ésteres alifáticos de ácido hialurónico, sales de ésteres alifáticos de ácido hialurónico, dodecilpoli(etilenoxi)etanol, nonilfenoxipoli (etilenoxi)etanol, derivados de almidones, ésteres de 15 ácidos grasos de hidroxietil almidón, almidones de alimentos vegetales comerciales, dextranos, ésteres de ácidos grasos de dextranos, sorbitol, ésteres de ácidos grasos de sorbitol, gelatina, albúmina sérica, y combinaciones de los mismos. Los ésteres de azúcares que 20 se prefieren particularmente son los que tienen un componente que tiene un equilibrio hidrófilo-lipófilo (EHL) de menos de 8, incluyendo sacarosa mono-, di-, tri- o poliesterificada , trehalosa, dextrosa y fructosa para producir estearato, behenato, palmitato, miristato, 25 laurato y caproato (por ejemplo, triestearato de sacarosa), porque estos ésteres de azúcares prolongan la estabilidad de las microburbujas. Otros ésteres de azúcares que se contemplan para su uso en la presente invención incluyen los que están esterificados con ácidos 30 grasos no saturados para formar oleato, ricinoleato, araquidato, palmitoleato y miristoleato. El EHL es un número entre 0 y 40 que se asigna a los agentes emulsionantes y a las sustancias que son emulsionadas. El EHL es un indicador del comportamiento de emulsificación y 35 se relaciona con el equilibrio entre las porciones hidrófila y lipófila de la molécula (Rosen, M., (1989), Surfactants and Interfacial Phenomena 2ª edición, John Wiley & Sons, Nueva York, pág. 326-329).

En la presente invención los tensioactivos o los 5 agentes espumantes preferidos se seleccionan del grupo formado por fosfolípidos, tensioactivos no iónicos, tensioactivos neutros o aniónicos, tensioactivos fluorados, que pueden ser neutros o aniónicos, y combinaciones de esos agentes emulsionantes o espumantes. 10

Los tensioactivos no iónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Un ejemplo de esta clase de compuestos es Pluronic, como Pluronic F-68. También se contemplan ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, 15 como estearato de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado, aceite de castor etoxilado, y los derivados hidrogenados de los mismos, y colesterol. Además, los alquilglucósidos no iónicos como Tweens(R), 20 Spans(R) y Brijs(R) que tienen un componente con un EHL menor de 8 también están en el ámbito de la presente invención. Los Spans incluyen tetraoleato de sorbitán, tetraestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, tripalmitato de sorbitán, trioleato de sorbitán y 25 diestearato de sorbitán. Los Tweens incluyen triestearato de sorbitán y polioxietileno, tripalmitato de sorbitán y polioxietileno y trioleato de sorbitán y polioxietileno. La familia Brij es otra categoría útil de materiales que incluye éter 10-estarílico de polioxietileno. También se 30 pueden usar tensioactivos aniónicos, particularmente ácidos grasos (o sus sales) que tienen de 12 a 24 átomos de carbono. Un ejemplo de un tensioactivo aniónico es el ácido oleico, o su sal, oleato sódico.

Se apreciará que se puede usar en la presente 35 invención una amplia gama de tensioactivos, prácticamente cualquier tensioactivo o agente espumante (incluyendo los que aún no se han desarrollado) capaces de facilitar la formación de las microburbujas. El tensioactivo o espumante óptimo o una combinación de los mismos para una 5 aplicación dada se puede determinar mediante estudios empíricos que no precisan experimentos indebidos. En consecuencia, una persona que practica la materia de la presente invención debe elegir los tensioactivos o espumantes o las combinaciones de los mismos basándose en 10 propiedades tales como la biocompatibilidad o su comportamiento no newtoniano.

La persistencia en la sangre del agente de contraste es inversamente proporcional a la presión de Laplace, que es proporcional a la tensión superficial de la burbuja. 15 Por lo tanto, la reducción de la tensión superficial aumenta la persistencia en la sangre. Los tensioactivos que forman estructuras ordenadas (láminas y bastones) en solución y que producen tensiones superficiales viscoelásticas no newtonianas son especialmente útiles. 20 Esos tensioactivos incluyen muchos de los tensioactivos basados en azúcares y de los tensioactivos proteicos o glucoproteicos (incluyendo tensioactivos pulmonares bovinos, humanos o de otro origen). Un tipo preferido de tensioactivo de este tipo tiene un azúcar u otro grupo de 25 cabeza de carbohidrato, y un grupo de cola de hidrocarburo o de fluorocarbono. Se conoce un gran número de azúcares que pueden funcionar como grupo de cabeza, incluyendo glucosa, sacarosa, manosa, lactosa, fructuosa, dextrosa, maltosa y similares. El grupo de cola preferentemente 30 tiene desde aproximadamente 2 ó 4 a 20 ó 24 átomos de carbono, y puede ser, por ejemplo, un grupo ácido graso (ramificado o no ramificado, saturado o insaturado) unido covalentemente al azúcar mediante un enlace éster. La tensión superficial de las burbujas que se producen con 35 estos tensioactivos disminuye mucho a medida que se comprime la superficie por contracción de la burbuja (por ejemplo, cuando se contrae la burbuja), y aumenta a medida que aumenta el área superficial de la burbuja (por ejemplo, cuando la burbuja crece). Este efecto retrasa la 5 desproporción molecular, que da lugar a una distribución más estrecha de los tamaños y a una mayor persistencia de las burbujas en el vial e in vivo. Una mezcla preferida de tensioactivos que tiene las propiedades que se asocian a la viscoelasticidad no newtoniana incluye un tensioactivo 10 no iónico u otro tensioactivo espumante en combinación con uno de los tensioactivos viscoelásticos no newtonianos, como uno de los ésteres de azúcar (por ejemplo, Pluronic F-68 al 2% más estearato de sacarosa al 1%). Con frecuencia el cociente del tensioactivo no iónico respecto 15 al tensioactivo no newtoniano es desde aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, de modo que los tensioactivos en conjunto (ya sean no newtonianos o más convencionales) comprenden el 0,5% a 8%, más preferentemente aproximadamente el 1% a 5% (p/v) de la mezcla líquida 20 formadora de microburbujas.

La reducción de la tensión superficial en burbujas pequeñas, al contrario que la presión de Laplace típica, permite el uso de agentes osmóticos gaseosos más eficientes como perfluorocarbonos de mayor peso molecular 25 como agente osmótico gaseoso. Con los tensioactivos convencionales, los PFC de mayor peso molecular se condensarán a las elevadas presiones de la burbuja. Sin estos tensioactivos eficientes sería extremadamente difícil conseguir PFC con menor permeabilidad en las 30 membranas y con un mayor punto de fusión, por ejemplo C6F14.

También se pueden incorporar otros agentes a la fase acuosa. Esos agentes pueden incluir de manera ventajosa modificadores convencionales de la viscosidad, tampones 35 como tampones de fosfato u otros agentes que permiten ajustar el pH biocompatibles convencionales como ácidos o bases, agentes osmóticos (para proporcionar isotonicidad, hiperosmolaridad o hipoosmolaridad). Las soluciones preferidas tienen un pH de aproximadamente 7 y son 5 isotónicas. Sin embargo, cuando se usa CO2 como primer gas en una burbuja diseñada para contraerse rápidamente hasta un primer tamaño, un pH básico puede facilitar la contracción rápida eliminando el CO2 a medida que abandona la burbuja, impidiendo la acumulación del CO2 disuelto en 10 la fase acuosa.

B. La fase gaseosa

Un aspecto importante de la presente invención es la selección de la fase gaseosa. Como se ha discutido anteriormente, la invención depende del uso de 15 combinaciones de gases para fijar o para producir diferenciales de presiones parciales y para generar presiones osmóticas gaseosas, que estabilizan las burbujas. El gas modificador primario se selecciona del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico y una 20 mezcla de los mismos. También aire y/o fracciones del mismo en la sangre y el suero normales. Cuando las microburbujas se van a usar en un entorno distinto a la sangre, el gas modificador primario se selecciona preferentemente de entre los gases que normalmente están 25 presentes en el medio externo. Otro criterio es la facilidad con la que el gas modificador primario difunde hacia el interior o el exterior de las burbujas. Típicamente el aire y/o las fracciones del mismo son también muy permeables a través de superficies de burbujas 30 flexibles o rígidas convencionales. Estos criterios combinados permiten la rápida difusión del gas modificador primario hacia el interior o el exterior de las burbujas, según sea necesario.

También se pueden usar gases modificadores que no 35 están presentes en el medio externo. Sin embargo, en este caso la burbuja crecerá o se contraerá inicialmente (dependiendo de la permeabilidad relativa y de las concentraciones de los gases externos respecto al modificador) a medida que los gases externos sustituyen al 5 gas modificador original. Si, durante este proceso, el agente osmótico gaseoso no se ha condensado, la burbuja permanecerá estable.

El agente osmótico gaseoso es preferentemente un gas que es menos permeable a través de la superficie de la 10 burbuja que el modificador. También es preferible que el agente osmótico gaseoso sea menos soluble en la sangre y en el suero. Por lo tanto, ahora se podrá entender que el agente osmótico gaseoso puede ser un gas a temperatura ambiente o corporal o puede normalmente ser un líquido a 15 temperatura ambiente, siempre que tenga una presión parcial o de vapor suficiente a la temperatura de uso para proporcionar el efecto osmótico deseado.

Según esto, se pueden usar fluorocarbonos u otros compuestos que no son gases a temperatura ambiente o a 20 temperatura corporal, siempre que tengan la suficiente presión de vapor, preferentemente al menos aproximadamente 50 o 100 mm Hg a temperatura ambiente, o más preferentemente al menos aproximadamente 150 o 200 mm Hg. Se debe tener en cuenta que cuando el agente osmótico 25 gaseoso es una mezcla de gases, la medida relevante de la presión de vapor es la presión de vapor de la mezcla, no necesariamente la presión de vapor de los componentes individuales del agente osmótico gaseoso mezclado.

También es importante que cuando se usa un 30 perfluorocarbono como agente osmótico en el interior de una burbuja, el perfluorocarbono particular no se condensa a la presión parcial presente en la burbuja y a temperatura ambiente. Dependiendo de las concentraciones relativas del gas modificador primario y del agente 35 osmótico gaseoso, el gas modificador primario puede abandonar rápidamente la burbuja, haciendo que se contraiga y que se concentre el agente osmótico gaseoso secundario. Esa contracción se puede producir hasta que la presión osmótica gaseosa se iguale a la presión externa 5 que se ejerce sobre la burbuja (tensión arterial absoluta máxima) más la presión de Laplace de la burbuja menos la tensión aérea, o tensión de la saturación de aire, de la sangre (esencialmente 1 atmósfera). Así, la presión parcial de condensación de la mezcla de gas resultante a 10 37°C debe estar por encima de la presión parcial de equilibrio del agente osmótico, que se ha analizado anteriormente.

Los perfluorocarbonos representativos que satisfacen estos criterios, y en capacidad creciente de estabilizar 15 las microburbujas, son los siguientes:

C4F10< C5F12 < C6F14

Según esto, se comprenderá que se prefieren los PFC que tienen ocho átomos de carbono o menos (presiones de vapor a 37° mayores de 80 mm Hg). Sin embargo, como 20 también se comprenderá, es posible construir moléculas de mayor tamaño con un aumento de la volatilidad mediante la adición de heteroátomos y similares. Por lo tanto, la determinación del o de los agentes osmóticos gaseosos secundarios óptimos no está limitada por su tamaño, sino 25 que, por el contrario, se basa en su capacidad de retener su fase de vapor a la temperatura corporal a la vez que proporciona una presión osmótica gaseosa igual a al menos la suma de las presiones arterial y de Laplace.

En la Tabla 1 se presenta una lista de algunos 30 compuestos que poseen criterios adecuados de solubilidad y de presión de vapor:

Tabla 1

Perfluoropropanos, C3F8

Perfluorobutanos, C4F10 35

Perfluoropentanos, C5F12

Perfluorociclopentanos, C5F10

Perfluorometilciclobutanos, C5F10

Perfluorohexanos, C6F14

Perfluorociclohexanos, C6F12 5

Perfluorometilciclopentanos, C6F12

Perfluorodimetilciclobutanos, C6F12

Se apreciará que una persona con conocimientos normales en la materia puede determinar fácilmente otros compuestos que también tienen un rendimiento adecuado en 10 la presente invención y que no satisfacen los criterios de solubilidad y de presión de vapor que se han descrito anteriormente. Por el contrario, se comprenderá que se pueden considerar ciertos compuestos fuera del intervalo preferido tanto de solubilidad como de presión de vapor, 15 si esos compuestos compensan la aberración en la otra categoría y proporcionan una solubilidad superior o una baja presión de vapor.

También se debe tener en cuenta que, para los usos médicos, los gases, tanto el gas modificador como el 20 agente osmótico gaseoso, deben ser biocompatibles o no deben ser fisiológicamente deletéreos. Por último, las microburbujas que contienen la fase gaseosa disminuirán de tamaño y la fase gaseosa se liberará hacia la sangre en forma de gas disuelto o como gotitas del líquido 25 condensado de tamaño inferior a micras. Se comprenderá que los gases se eliminarán del cuerpo principalmente mediante la respiración pulmonar o a través de una combinación de la misma y de otras rutas metabólicas en el sistema reticuloendotelial. 30

Las combinaciones de gases adecuados de los gases modificador primario y secundario se pueden evaluar empíricamente sin experimentaciones indebidas. Esas determinaciones empíricas se describen en los Ejemplos.

Cuando se emplea un tensioactivo eficiente, por 35 ejemplo tensioactivo pulmonar bovino, para producir una burbuja de gran diámetro con una baja tensión superficial, la presión de Laplace es muy baja. Cuando hay aire saturado con perfluorooctilbromuro (PFOB) en el interior de la burbuja y la burbuja se expone a aire o a un líquido 5 casi saturado con aire (por ejemplo, equilibrado con aire,), la presión osmótica gaseosa es mayor que la presión de Laplace y por lo tanto la burbuja crece. Con diámetros de burbuja más pequeños la presión de Laplace es mayor y por lo tanto la burbuja se contrae y se colapsa. 10 Esta contracción se produce a una velocidad reducida y está producida por la diferencia entre la presión de Laplace y la presión osmótica gaseosa. Cuando se crean burbujas de pequeño diámetro sonicando mezclas de gases o de vapor de gases en una solución de un tensioactivo de 15 baja tensión superficial, por ejemplo, Pluronic F-68 al 2% más estearato de sacarosa al 1%, el tiempo que las burbujas persisten in vitro, según se observa mediante microscopia, e in vivo según se observan mediante ecografía de un riñón de conejo después de la inyección 20 intravenosa, se correlacionan con la comparación de las presiones osmóticas gaseosas que se han presentado anteriormente.

En el experimento con Doppler en riñón de conejo (Ejemplo III) se observó realce del contraste durante 25 hasta 10 minutos con mezclas de perfluorohexano/aire en las burbujas en comparación con la desaparición instantánea del contraste con microburbujas de aire puro. Así, estos agentes perfluoroquímicos son capaces de ejercer presiones osmóticas gaseosas que casi equilibran 30 la presión de Laplace y crean agentes de contraste funcionales para microburbujas para ecografía.

Un descubrimiento sorprendente fue que las mezclas de PFC, por ejemplo, C4F10 (como gas modificador y agente osmótico gaseoso en combinación) saturado con vapor de 35 C6F14 (como agente osmótico principal) pueden estabilizar las burbujas durante tiempos más prolongados que cada uno de los dos componentes solos. Esto es así porque C4F10 es un gas a temperatura corporal (y, por lo tanto, puede actuar como gas modificador y como agente osmótico 5 gaseoso), tiene una permeabilidad de membrana ligeramente reducida y es solamente ligeramente soluble en C6F14 a temperatura corporal. En esta situación las presiones osmóticas gaseosas de ambos agentes se suman, dando lugar a un aumento de la persistencia de la burbuja respecto a 10 las mezclas de aire/C6F14 solo. Es posible que el punto de condensación del componente de C6F14 de mayor peso molecular y que persiste más tiempo esté aumentado, lo que permite ejercer una mayor presión osmótica gaseosa máxima. Otras mezclas de PFC tendrán un rendimiento similar. Las 15 mezclas preferidas de PFC tienen cocientes de 1:10 a 10:1, e incluyen mezclas tales como perfluorobutano/perfluorohexano y perfluorobutano/perfluoropentano. Estos agentes perfluoroquímicos pueden ser ramificados o de cadena 20 recta.

Como se comentó anteriormente, también hemos descubierto que las mezclas de gases no osmóticos en combinación con el agente osmótico gaseoso actúan estabilizando la distribución de tamaños de las burbujas 25 antes de la inyección y después de la misma. Después de la generación de las burbujas, las mayores presiones de Laplace en las burbujas más pequeñas producen difusión a través de la fase líquida hacia las burbujas de mayor tamaño, que tienen menor presión de Laplace. Esto hace que 30 la distribución de tamaños medios aumente por encima del límite de la dimensión capilar de 5 µm a lo largo del tiempo. Esto se denomina desproporción molecular.

Sin embargo, cuando se usa una mezcla de un gas modificador (por ejemplo, aire o dióxido de carbono) con 35 un agente osmótico gaseoso (por ejemplo, C6F14), una ligera reducción del volumen de las burbujas más pequeñas, debida a que uno de los gases modificadores abandona la burbuja, concentrará el gas osmótico y aumentará su presión osmótica, reduciendo de esta manera la contracción 5 posterior. Por otro lado, las burbujas de mayor tamaño aumentarán ligeramente de tamaño, diluyendo el gas osmótico y también retrasando su posterior crecimiento.

Una ventaja adicional de usar una mezcla de un gas extremadamente soluble en la sangre (por ejemplo, CO2 al 10 75% a 87,5% en volumen) y una mezcla de gases osmóticos (por ejemplo, vapor de C6F14 al 28% y aire al 72%) es que cuando se inyectan estas burbujas rápidamente, se contraen debido a la pérdida del CO2 hacia la sangre. El dióxido de carbono sale particularmente deprisa debido a un enzima 15 plasmático específico que cataliza su disolución. Una disminución de volumen de 87,5% debido a la pérdida del CO2 corresponde a una reducción a la mitad del diámetro de la burbuja. Según esto, se pueden producir mayores diámetros de las burbujas, que se contraerán hasta un 20 tamaño adecuado (es decir, 5 µm) después de la inyección o de la exposición a una solución que tiene un pH básico o alcalino.

Según esto, hemos descubierto que mediante el uso de un gas que es relativamente hidrófobo y que tiene una 25 permeabilidad de membrana relativamente baja, se puede reducir la velocidad de disminución de las partículas de contraste. Así, mediante la reducción de la velocidad de disminución de las partículas, las semividas de las microburbujas aumentan y se prolonga el potencial de 30 realce del contraste.

II. Otros componentes

Se comprenderá que se pueden incluir otros componentes en las formulaciones de las microburbujas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden añadir 35 agentes osmóticos, estabilizantes, quelantes, tampones, moduladores de la viscosidad, modificadores de la solubilidad en el aire, sales y azúcares, para ajustar las suspensiones de microburbujas para conseguir una vida y una eficacia del realce del contraste máximas. Las 5 consideraciones como esterilidad, isotonicidad y biocompatibilidad deben gobernar el uso de esos aditivos convencionales en las composiciones inyectables. Las personas que tienen conocimientos normales en la materia comprenderán el uso de esos agentes, y se pueden 10 determinar las cantidades, cocientes y tipos específicos de agentes de manera empírica sin experimentación indebida.

III. Formación de las microburbujas de la presente invención 15

Hay diversos procedimientos para preparar microburbujas según la presente invención. Se prefiere la sonicación para la formación de microburbujas, es decir, a través de un tabique que transmite ultrasonidos o atravesando un tabique con una sonda ecográfica que 20 incluye una aguja hipodérmica que vibra de manera ultrasónica. Sin embargo, se apreciará que hay otras diversas técnicas para la formación de burbujas. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de inyección de gas, como la inyección de gas de venturi. 25

Otros procedimientos para formar microburbujas incluyen la formación de microesferas particuladas mediante la ultrasonicación de albúmina o de otra proteína, como se describe en la Solicitud de Patente Europea 0.359.246 de Molecular Biosystems, Inc.; el uso de 30 detergentes TENSIDE y de agentes que aumentan la viscosidad, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.446.442; microburbujas no liposómicas recubiertas de líquidos, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.684.469; liposomas que tienen gases atrapados, como se 35 describe en las Patentes de EE.UU. Nº 5.088.499 y 5.123.414; y el uso de microesferas particuladas de albúmina desnaturalizada, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.718.433.

Se puede emplear cualquiera de los procedimientos 5 anteriormente señalados con un éxito similar para arrastrar los modificadores y los agentes osmóticos gaseosos de la presente invención. Además, se espera que se observe un aumento similar de la longevidad de las burbujas que se crean mediante el uso de la invención. 10

La sonicación se puede conseguir de distintas maneras. Por ejemplo, un vial que contiene una solución y un gas en el espacio del encabezamiento del vial se puede sonicar a través de una membrana fina. Preferentemente la membrana tiene menos de aproximadamente 0,5 ó 0,4 mm de 15 grosor, y más preferentemente menos de aproximadamente 0,3 o incluso 0,2 mm de grosor, es decir, más delgada que la longitud de onda ecográfica en el material, a fin de proporcionar una transmisión aceptable y reducir al mínimo el calentamiento de la membrana. La membrana se puede 20 hacer de materiales como goma, Teflón, Mylar, uretano, película aluminizada, o cualquier otra película de polímero o materia formadora de película sintética o natural transparente a la ecografía. La sonicación se puede realizar poniendo en contacto o incluso deprimiendo 25 la membrana con una sonda ultrasónica o con un “haz” ecográfico enfocado. La sonda ultrasónica puede ser desechable. En cualquiera de los casos, la sonda se puede apoyar en la membrana o se puede insertar a través de la misma y en el interior del líquido. Una vez que se ha 30 conseguido la sonicación, la solución de microburbujas se puede retirar del vial y se puede administrar al paciente.

También se puede hacer la sonicación con una jeringa que tiene un dispositivo de aspiración que vibra con ecografía de baja potencia en la jeringa, de manera 35 similar a una impresora de inyección de tinta. También se puede colocar una jeringa o un vial en el interior de un baño ultrasónico de baja energía que enfoca su energía en un punto del interior del contenedor, y se puede sonicar en el interior del mismo. 5

También se contemplan otros tipos de formación mecánica de microburbujas. Por ejemplo, se pueden formar burbujas con una válvula mecánica de elevada tensión de cizallamiento (o una aguja de jeringa doble) y dos jeringas, o un dispositivo aspirador en una jeringa. Se 10 puede usar incluso la agitación simple. Las técnicas de contracción de las burbujas que se describen en esta solicitud son particularmente adecuadas para las burbujas que se han formado mecánicamente, que tienen una menor entrada de energía que las burbujas sónicas. Esas burbujas 15 típicamente tendrán un diámetro mucho mayor que el medio de visualización biocompatible que se desea en último término, aunque se puede hacer que se contraigan hasta un tamaño adecuado según la presente invención.

En otro procedimiento, se pueden formar 20 microburbujas mediante el uso de una emulsión de un agente osmótico líquido sobresaturada con un gas modificador a una presión elevada, introducida en una solución tensioactiva. Este procedimiento de producción funciona de manera similar a la apertura de un una lata de refresco, 25 en la que el gas produce espuma después de la liberación de la presión que forman las burbujas.

En otro procedimiento, las burbujas se pueden formar de manera similar a la formación de espuma por la crema de afeitar, en la que perfluorobutano, Freon o cualquier otro 30 material similar que hierve cuando se libera la presión. Sin embargo, en este procedimiento es imperativo que el líquido emulsionado hierva a una temperatura suficientemente baja o que contenga numerosos puntos de nucleación de las burbujas para impedir el 35 sobrecalentamiento y la sobresaturación de la fase acuosa. Esta sobresaturación dará lugar a la generación de un pequeño número de grandes burbujas con un número reducido de puntos de nucleación, en lugar del deseable gran número de pequeñas burbujas (una en cada gotita). 5

En otro procedimiento más, se pueden estabilizar con un agente osmótico gaseoso partículas secas que contienen cavidades u otras estructuras (como esferas huecas o panales de abeja) que se disuelven o se hidratan rápidamente, preferentemente en una solución acuosa, por 10 ejemplo albúmina, cristales de azúcar finos, azúcar deshidratado por aspersión, sales, esferas huecas de tensioactivo, esferas secas de polímeros porosos, ácido hialurónico poroso seco, esferas de ácido hialurónico sustituido, o incluso microesferas de lactosa seca 15 disponibles comercialmente que se pueden estabilizar con un agente osmótico gaseoso.

Por ejemplo, se puede formular una solución de tensioactivo deshidratado por aspersión atomizando una solución de tensioactivo en un gas calentado como aire, 20 dióxido de carbono, nitrógeno o similar, para obtener esferas huecas o porosas de 1-10 µm o mayores, que se introducen en un vial lleno de un agente osmótico o de una mezcla de gases deseada, como se describe en la presente solicitud. El gas difundirá hacia las cavidades de las 25 esferas. Se puede facilitar la difusión mediante ciclado de presión o de vacío. Cuando se reconstruyen con una solución estéril, las esferas se disolverán rápidamente y dejarán las burbujas estabilizadas con un gas osmótico en el vial. Además, la inclusión de almidón o de dextrinas, 30 un poliéster de azúcar y/o un agente inflador como cloruro de metileno, 1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon 113, EM Science, Gibbstown, NJ) o perfluorohexano, dará lugar a microburbujas que tienen un aumento de la semivida in vivo. Los almidones particularmente preferidos para su uso 35 en la formación de microburbujas incluyen los que tienen un peso molecular mayor de aproximadamente 500.000 dalton o los que tienen un valor de equivalencia de dextrosa (ED) menor de aproximadamente 12. El valor de ED es una medida cuantitativa del grado de hidrólisis del polímero de 5 almidón. Es una medida de la capacidad reductora en comparación con un estándar de dextrosa de 100. Cuanto mayor sea el valor de ED, mayor es la intensidad de la hidrólisis del almidón. Esos almidones preferidos incluyen almidones vegetales aptos para la alimentación del tipo 10 que está disponible comercialmente en la industria alimentaria, incluyendo los que se venden bajo las marcas comerciales N-LOK y CAPSULE por National Starch and Chemical Co. (Bridgewater, NJ), almidones modificados como hidroxietil almidón (disponible bajo las marcas 15 comerciales HETASTARCH y HESPAN de DuPont Pharmaceuticals) (M-Hydroxyethylstarch, Ajinimoto, Tokio, Japón). (Obsérvese que los almidones de cadena corta se deshidratan por aspersión y se pueden usar para producir microburbujas, pero no se prefieren porque los que tienen 20 un peso molecular menor de aproximadamente 500.000 no estabilizan las microburbujas. Sin embargo, se pueden usar en la presente invención en aplicaciones en las que no sea necesaria una estabilización adicional). Como alternativa, se puede colocar una torta liofilizada de tensioactivo y 25 de reactivos formadores de masa producidos con una estructura fina de los poros en el interior de un vial con una solución estéril y una cabeza separada con una mezcla de un gas osmótico. La solución se puede congelar rápidamente para producir una estructura de cristal de 30 hielo final y, por lo tanto, después de la liofilización da lugar a poros finos (cavidades de las que se eliminaron los cristales).

De manera alternativa se puede utilizar cualquier estructura formada de cavidades que se pueda disolver o 35 que sea soluble. En esta forma de realización, en la que el material formador de cavidades no está hecho de tensioactivo o no lo contiene, tanto el tensioactivo como el líquido se suministran en el interior del contenedor con la estructura y el gas o los gases deseados. Después 5 de su reconstitución, estas cavidades atrapan un gas osmótico y, con la disolución de la torta sólida, forman microburbujas que contienen el gas o los gases.

Se apreciará que se pueden preparar equipos para su uso para hacer las preparaciones de microburbujas de la 10 presente invención. Estos equipos pueden incluir un contenedor que contiene el gas o los gases que se han descrito anteriormente para formar las microburbujas, el líquido y el tensioactivo. El contenedor puede contener todos los componentes secos estériles, y el gas, en una 15 cámara, y el líquido acuoso estéril en una segunda cámara del mismo contenedor. Los contenedores de viales de dos cámaras adecuados están disponibles, por ejemplo, bajo las marcas comerciales se WHEATON RS177FLW o S-1702FL de Wheaton Glass Co. (Milville, NJ). Un contenedor de este 20 tipo se ilustra en las Figuras 1-4. En referencia a las Figuras 1 y 2, el contenedor Wheaton 5 que se ilustra tiene una cámara superior 20 que puede contener una solución acuosa 25, y una cámara inferior 30 que puede contener los ingredientes secos 75 y un gas deseado. Se 25 proporciona un émbolo 10 que separa la cámara superior del entorno, y un sello 15 separa la cámara superior 20 de la cámara inferior 30 que contiene microesferas huecas (en polvo) deshidratadas por aspersión 35 y el agente osmótico gaseoso. La depresión del émbolo 10 presuriza el líquido 30 relativamente incompresible, lo que empuja el sello 15 hacia abajo, hacia el interior de la cámara inferior 30. Esto libera la solución acuosa 25 en el interior de la cámara inferior 30, lo que da lugar a la disolución del polvo 35 para formar microburbujas estabilizadas 45 que 35 contienen el agente osmótico gaseoso atrapado. El exceso de agente osmótico gaseoso 40 se libera desde la cámara inferior 30 hacia la cámara superior 20. Esta disposición es conveniente para el usuario y tiene la ventaja añadida e inesperada de sellar la pequeña cantidad de agente 5 osmótico gaseoso impermeable en agua en la cámara inferior cubriendo el sello intercambiador con una capa gruesa (1,27 a 3,18 cm) de solución acuosa, y la ventaja de que la solución acuosa se puede introducir la cámara inferior sin elevar la presión de la cámara que contiene el polvo 10 en más de aproximadamente un 10%. Por lo tanto, no hay necesidad de válvula de presión. (Por el contrario, la reconstitución convencional del soluto en un vial de una cámara única con una aguja y una jeringa sin válvula puede dar lugar a la producción de una considerable presión en 15 el interior de la cámara, que podría colapsar las microburbujas). La formación de las microburbujas mediante este procedimiento se describe en el Ejemplo XI.

De manera alternativa, se puede usar un vial invertido de dos cámaras para la preparación de 20 microburbujas. En referencia a las Figuras 3 y 4, se usa el mismo vial que se ha descrito anteriormente, excepto que el émbolo 50 es alargado, de modo que desaloja el sello interior 15 cuando se deprime. En este procedimiento de preparación de microburbujas, las microesferas huecas 25 deshidratadas por aspersión 35 y el agente osmótico gaseoso 40 están contenidos en la cámara superior 20. La solución acuosa 25 y el agente osmótico gaseoso 40 están contenidos en el interior de la cámara inferior 30. Cuando se deprime el émbolo 50, desaloja el sello 15, lo que 30 permite que las microesferas huecas deshidratadas por aspersión se mezclen con la solución acuosa 25 en presencia del agente osmótico gaseoso 40. Una ventaja que se asocia a este procedimiento de formación de las microburbujas es que la fase acuosa se puede instilar en 35 primer lugar y se puede esterilizar mediante autoclave u otros medios, seguido de la instilación de las microesferas deshidratadas por aspersión. Esto impedirá el posible crecimiento microbiano en la fase acuosa antes de la esterilización. 5

Aunque se ha ilustrado un contenedor de cámara dual particular, se conocen otros dispositivos que están disponibles en el comercio. Por ejemplo, se puede usar de manera ventajosa para reconstituir el polvo deshidratado por aspersión una jeringa de vidrio de dos compartimentos 10 como el sistema de jeringa precargada B-D HYPAK Liquid/Dry 5+5 ml Dual Chamber (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; descrito en la Patente de EE.UU. nº 4.613.326). Las ventajas de este sistema incluyen:

1. Conveniencia de uso. 15

2. El agente osmótico gaseoso insoluble en una solución acuosa está sellado por una cámara de una solución acuosa en un lado y por una zona extremadamente pequeña de elastómero que sella la aguja en el otro lado, y 20

3. Se puede ajustar una aguja de filtración como Monoject #305 (Sherwood Medical, St. Louis, MO) en la jeringa en el momento de la fabricación para asegurar que no se inyecta ningún sólido no disuelto. 25

El uso de la jeringa de dos cámaras para formar microburbujas se describe en el Ejemplo XII.

Una persona con conocimientos normales en la materia apreciará que otros sistemas de reconstitución de dos cámaras capaces de combinar el polvo deshidratado por 30 aspersión con la solución acuosa de manera estéril también están dentro del ámbito de la presente invención. En estos sistemas es particularmente ventajoso que la fase acuosa se pueda interponer entre el gas osmótico insoluble en agua y el entorno, para aumentar la vida útil del 35 producto.

De manera alternativa, el contenedor puede contener el material formador de cavidades y el gas o los gases, y se puede añadir el tensioactivo líquido para formar las microburbujas. En una forma de realización el tensioactivo 5 puede estar presente con los otros materiales en el contenedor, de modo que sólo se debe añadir el líquido a fin de formar las microburbujas. Cuando no hay todavía un material necesario para formar las microburbujas en el contenedor, se puede empaquetar con los demás componentes 10 del equipo, preferentemente en una forma o contenedor adaptado para facilitar la fácil combinación con los otros componentes del equipo.

El contenedor que se usa en el equipo puede ser del tipo que se describe en otra parte de esta solicitud. En 15 una forma de realización el contenedor es un vial convencional con un tabique que actúa como sello. En otra, tiene un medio para dirigir o permitir la aplicación en el interior del contenido del contenedor de suficiente energía formadora de burbujas. Este medio puede 20 comprender, por ejemplo, la malla o lámina fina que se ha descrito previamente.

Varias formas de realización de la presente invención proporcionan ventajas sorprendentes. Las formulaciones de almidón deshidratadas por aspersión dan 25 una prolongada estabilidad de las microburbujas en el interior del vial, particularmente cuando el peso molecular del almidón es mayor de aproximadamente 500.000. El uso de ésteres de ácidos grasos de azúcares que contienen un componente que tiene un EHL menor de 8 30 proporciona una estabilidad in vivo y en el interior del vial muy aumentada. Los ésteres de ácidos grasos de azúcares como monoestearato de sacarosa, así como los copolímeros de bloque como Pluronic F-68 (que tiene un EHL mayor de 12) permiten que el polvo forme burbujas en el 35 momento en que se hidrata. Las formulaciones deshidratadas por aspersión con un agente estructural como almidón, un derivado de almidón o dextrina proporcionan una dosis total significativamente menor de tensioactivo que las formulaciones sonicadas comparables. El uso del vial de 5 dos cámaras con agua que proporciona un sello adicional para el gas fluorocarbonado proporciona un aumento de la vida útil, y una mayor facilidad de uso. Las formulaciones deshidratadas por aspersión con un agente estructural (como almidón o dextrina) y un poliéster de azúcar 10 proporcionan microburbujas que tienen una semivida in vivo muy aumentada.

La inclusión de un agente inflador en la solución para que sea deshidratado por aspersión da lugar a una mayor señal de ecografía por cada gramo de polvo 15 deshidratado por aspersión por la formación de un mayor número de microesferas huecas. El agente inflador nuclea la formulación de burbujas de vapor en el interior de las gotitas atomizadas de la solución que entran en el deshidratador por aspersión a medida que estas gotitas se 20 mezclan con la corriente de aire caliente en el interior del deshidratador. Los agentes infladores adecuados son los que sobresaturan la solución con las gotitas atomizadas con el gas o el vapor, a la temperatura elevada de las gotitas que se están deshidratando (aproximadamente 25 100°C). Los agentes adecuados incluyen:

1. Disolventes disueltos de bajo punto de ebullición (inferior a 100°C) con una escasa miscibilidad con soluciones acuosas como cloruro de metileno, acetona y disulfuro de carbono, que 30 se usan para saturar la solución a temperatura ambiente.

2. Un gas, por ejemplo CO2 o N2, que se usa para saturar la solución a temperatura ambiente y presión elevada (por ejemplo, 3 bar). 35 Posteriormente las gotitas se sobresaturan con el gas a 1 atmósfera y 100°C.

3. Emulsiones de líquidos inmiscibles de bajo punto de fusión (inferior a 100°C) como Freon 113, perfluoropentano, perfluorohexano, 5 perfluorobutano, pentano, butano, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12B2, FC-21, FC-21B1, FC-21B2, FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC-132, FC-133, FC-141, FC-141B, FC-142, FC-151, FC-152, FC-1112, FC-1121 y FC-1131. 10

El agente inflador se evapora sustancialmente durante el proceso de deshidratación por aspersión y por lo tanto no está presente en el polvo final deshidratado por aspersión en cantidades mayores que trazas.

La inclusión de los tensioactivos y de los agentes 15 humectantes en el interior de la cubierta de de la microesfera permite el uso de una menor concentración de tensioactivo. A medida que se disuelve la cubierta de la microesfera, temporalmente rodea la microburbuja que se forma en su interior con una capa de fase acuosa que está 20 saturada con los tensioactivos, lo que favorece su depósito sobre la superficie de la microburbuja. Así, las microesferas deshidratadas por aspersión que contienen tensioactivo precisan sólo concentraciones elevadas localmente de tensioactivo, y evitan la necesidad de una 25 elevada concentración de tensioactivo en toda la fase acuosa.

Cualquiera de las preparaciones de microburbujas de la presente invención se puede administrar a un vertebrado, como un ave o un mamífero, como agente de 30 contraste para visualizar ecográficamente porciones del vertebrado. Preferentemente el vertebrado es un ser humano, y la porción que se visualiza es la vasculatura del vertebrado. En esta forma de realización se introduce por vía intravascular en el interior del animal una 35 pequeña cantidad de microburbujas (por ejemplo, 0,1 mg/kg [2 mg/kg de polvo deshidratado por aspersión] según el peso corporal del vertebrado). También se pueden usar otras cantidades de microburbujas, como desde aproximadamente 0,005 ml/kg a aproximadamente 1,0 ml/kg. 5 La visualización del corazón, de las arterias, de las venas y de órganos ricos en sangre como hígado, pulmones y riñones se puede visualizar ecográficamente con esta técnica.

La descripción anterior se comprenderá mejor en 10 relación con los siguientes Ejemplos. Sin embargo, esos Ejemplos son ejemplificadores de los procedimientos preferidos de poner en práctica la presente invención y no son limitantes del ámbito de la invención o de las reivindicaciones que se adjuntan a la misma. 15

Ejemplo I

Preparación de las microburbujas mediante sonicación

Se prepararon microburbujas con un tamaño ponderado numérico medio de 5 µm mediante sonicación de una fase acuosa isotónica que contenía Pluronic F-68 al 2% y 20 estearato de sacarosa al 1% como tensioactivos, aire como gas modificador y perfluorohexano como agente osmótico gaseoso.

En este experimento se añadieron 1,3 ml de una solución acuosa estéril que contenía NaCl al 0,9%, 25 Pluronic F-68 al 2% y estearato de sacarosa al 1% a un vial de 2,0 ml. El vial tenía un espacio residual en la cabeza de 0,7 ml, que inicialmente contenía aire. Se usó aire saturado con vapor de perfluorohexano (220 mm Hg de perfluorohexano con 540 mm Hg de aire) a 25°C para lavar 30 el espacio de la cabeza del vial. El vial se selló con un tabique delgado de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,22 mm. El vial se puso horizontal, y se aplicó suavemente en el tabique una sonda de sonicación de 3 mm unida a un sonicador de 50 W modelo VC50, disponible en Sonics & 35 Materials. En esta posición, el tabique separa la sonda de la solución. Posteriormente se aplicó potencia a la sonda y se sonicó la solución durante 15 s, formando una solución blanca de microburbujas divididas finamente, que tenían un tamaño ponderado numérico medio de 5 µm, que se 5 midió con el analizador de partículas mediante dispersión de luz láser Horiba LA-700.

Ejemplo II

Medición del tamaño in vitro de las microburbujas

El tamaño in vitro de las microburbujas que se 10 prepararon en el Ejemplo I se midió mediante dispersión de luz láser. Los estudios de las burbujas se realizaron diluyendo las microburbujas en una solución acuosa de dextrosa al 4% (1:50) que circulaba a través de un analizador mediante dispersión de luz láser Horiba LA-700. 15 El tamaño medio de las microburbujas fue de 5 µm, y duplicó su tamaño en 25 min.

De manera interesante, las microburbujas que se prepararon mediante el mismo procedimiento del Ejemplo I sin el uso de un agente osmótico gaseoso (sustituyendo la 20 mezcla de perfluorohexano/aire por aire) tenían un diámetro medio de 11 µm y daban sólo lecturas basales en el analizador de partículas al cabo de 10 s.

Ejemplo III

Medición de la vida in vivo de las microburbujas 25

La vida de las microburbujas que se prepararon según el Ejemplo I se midió en conejos mediante la inyección de 0,2 ml de microburbujas recién formadas en la vena marginal de la oreja de un conejo que se observó con un instrumento de visualización ecográfica Accuson 128XP/5 30 con un transductor de 5 MHz. Se realizaron diversas pruebas, durante las cuales se obtuvieron imágenes del corazón, de la vena cava inferior/aorta y del riñón a la vez que se medía el tiempo y la magnitud del realce de contraste observable. Los resultados se presentan en la 35 siguiente Tabla II:

Tabla II

Órgano

Dosis Tiempo de intensidad máxima Tiempo hasta la intensidad mínima útil Tiempo hasta la ausencia de realce

Corazón

0,1 ml/kg 7-10 s 8-10 min 25 min

VCI/aorta

0,1 ml/kg 7-10 s 8-10 min 25 min

riñón

0,1 ml/kg 7-10 s 8-10 min 25 min

En la Tabla III se presenta una comparación de las microburbujas que se prepararon de una manera idéntica sin el uso de un agente osmótico (sólo se usó aire). Obsérvese 5 que se vieron reflexiones esporádicas sólo en el ventrículo derecho del corazón durante la inyección, aunque desaparecieron inmediatamente después de la administración de la dosis.

Tabla III 10

Órgano

Dosis Tiempo hasta la intensidad máxima Tiempo hasta la intensidad mínima útil Tiempo hasta la ausencia de realce

Corazón

0,1 ml/kg 0 0 0

VCI/aorta

0,1 ml/kg 0 0 0

riñón

0,1 ml/kg 0 0 0

El uso de un agente osmótico aumentó de manera marcada la duración del tiempo durante el que son visibles las microburbujas.

Ejemplo IV

Preparación de microburbujas mixtas estabilizadas 15 osmóticamente

Se prepararon microburbujas con un tamaño ponderado numérico medio de 5 µm mediante sonicación de una fase acuosa isotónica que contenía Pluronic F-68 al 2% y estearato de sacarosa al 1% como tensioactivos y mezclas 20 de perfluorohexano y perfluorobutano como agentes osmóticos gaseosos.

En este experimento se añadieron 1,3 ml de una solución acuosa estéril que contenía NaCl al 0,9% y Pluronic F-68 al 2% a un vial de 2,0 ml. El vial tenía un espacio residual en la cabeza de 0,7 ml, que inicialmente 5 contenía aire. Se usó una mezcla de gases osmóticos de perfluorohexano a 540 mm Hg y perfluorobutano a 220 mm Hg para lavar el espacio de la cabeza antes de sellarlo con un tabique delgado de 0,22 mm de PTFE. El vial se sonicó como en el Ejemplo I, formando una solución blanca de 10 microburbujas finamente divididas que tenían un tamaño medio de partícula de 5 µm, según se midió con el analizador de partículas mediante dispersión de luz láser Horiba LA-700. El procedimiento se realizó dos veces más, una vez con perfluorobutano puro y posteriormente con una 15 mezcla de aire a 540 mm Hg y perfluorohexano a 220 mm Hg. Se determinó la resistencia vascular de las tres preparaciones mediante visualización ecográfica de un conejo después de la inyección IV, y se presenta a continuación: 20

1,5 min 2 min 3 min

perfluorobutano perfluorohexano + aire perfluorobutano + perfluorohexano

La mezcla de perfluorocarbonos persistió más tiempo que cualquiera de los agentes solos.

Ejemplo V

Preparación de microburbujas gaseosas estabilizadas osmóticamente a partir de esferas solubles deshidratadas 25 por aspersión

Se prepararon microburbujas gaseosas estabilizadas osmóticamente disolviendo esferas huecas de lactosa deshidratadas por aspersión, llenas de una mezcla de vapor de perfluorohexano, en una solución de tensioactivo. 30

Se obtuvieron esferas de lactosa deshidratadas por aspersión con un diámetro medio de aproximadamente 100 µm y que contenían numerosas cavidades de 10 a 50 µm de DMV International bajo la marca comercial de PHARMATOSE DCL-11. Se colocaron 90 mg de las esferas de lactosa en un vial de 2,0 ml. Las esferas porosas se llenaron con una mezcla de perfluorohexano a 220 mm Hg y aire a 540 mm Hg 5 ciclando la presión gaseosa en el interior del vial entre una atmósfera y media atmósfera un total de 12 veces a lo largo de 5 min. Se calentó una solución tensioactiva que contenía cloruro sódico al 0,9%, Pluronic F-68 al 2% y estearato de sacarosa al 1% a aproximadamente 45° para 10 facilitar la disolución de la lactosa antes de inyectar 1,5 ml de la solución calentada en el interior del vial. Posteriormente se agitó suavemente el vial mediante inversión durante aproximadamente 30 s para disolver la lactosa antes de inyectar las microburbujas preparadas de 15 esta manera en un analizador de partículas Horiba LA-700. Se obtuvo un diámetro medio ponderado de volumen de 7,7 µm aproximadamente 1 minuto después la disolución. El diámetro de estas microburbujas permaneció casi constante, cambiando a un diámetro medio de 7,1 µm en 10 min. Cuando 20 se repitió el experimento con lactosa llena de aire, el analizador de partículas dio solamente lecturas basales 1 minuto después de la disolución, lo que demostró que se pueden producir microburbujas gaseosas estabilizadas osmóticamente mediante la disolución de estructuras que 25 contienen cavidades llenas de aire.

Ejemplo VI

Preparación de burbujas de mayor tamaño que se contraen hasta un tamaño deseado

Se prepararon microburbujas con un volumen tamaño 30 ponderado en volumen medio de 20 µm que se contrajeron hasta 2 µm mediante la sonicación de una fase acuosa isotónica que contenía Pluronic F-68 al 2% como tensioactivo, CO2 como gas diluyente y perfluorohexano como agente osmótico gaseoso. 35

En este experimento se añadieron 1,3 ml de una solución acuosa estéril que contenía NaCl al 0,9%, Pluronic F-68 al 2% y estearato de sacarosa al 1% a un vial de 2,0 ml. El vial tenía un espacio residual en la cabeza de 0,7 ml, que inicialmente contenía aire. Se usó 5 una mezcla de aire saturado con perfluorohexano a 25°C diluido por un factor de 10 con CO2 (CO2 a 684 mm Hg más aire a 54 mm Hg más perfluorohexano a 22 mm Hg) para lavar el espacio de la cabeza. Se selló el vial con un tabique delgado de 0,22 mm de PTFE. El vial se sonicó como en el 10 Ejemplo I, formando una solución blanca de microburbujas finamente divididas que tenían un tamaño medio de partícula de 28 µm, según se midió con el analizador mediante dispersión de luz láser Horiba LA-700. En la solución de dextrosa al 4% + NaOH 0,25 mM del analizador 15 Horiba, el diámetro medio de las burbujas se contrajo rápidamente en 2 a 4 min desde 28 µm a 5 a 7 µm, y posteriormente permaneció relativamente constante, alcanzando los 2,6 µm después de 27 min. Esto es así porque el CO2 sale de las burbujas disolviéndose en la 20 fase acuosa.

Ejemplo VII

Efecto de un tensioactivo viscoelástico no newtoniano: estearato de sacarosa

Se prepararon microburbujas como en el Ejemplo I, 25 que se señala anteriormente, empleando NaCl al 0,9%, Pluronic F-68 al 2% y estearato de sacarosa al 2% como tensioactivo y con aire saturado con perfluoropropano y aire saturado con perfluorohexano en el espacio de la cabeza. Estas dos preparaciones se repitieron con la misma 30 solución de tensioactivo excepto el estearato de sacarosa. Se evaluaron las cuatro preparaciones de microburbujas como en el Ejemplo III, anteriormente. La persistencia vascular útil de estas microburbujas es la que se enumera a continuación: 35

Persistencia de Pluronic F-68 al 2% + estearato de sacarosa al 2%

Perfluoropropano 2 min

Perfluorohexano 4 min

Persistencia de Pluronic F-68 al 2% sólo 5

Perfluoropropano 2 min

Perfluorohexano 1 min

Como se ve anteriormente, la reducción de la tensión superficial que hacen posible las propiedades viscoelásticas no newtonianas del estearato de sacarosa 10 impidieron que el perfluorohexano, que es menos volátil, se condensara, lo que no permitió producir microburbujas de perfluorohexano de mayor persistencia.

Ejemplo VIII

Deshidratación por aspersión de una emulsión que contiene 15 almidón

Se preparó 1 L de cada una de las siguientes soluciones con agua para inyección: solución A que contenía almidón vegetal N-Lok (National Starch and Chemical Co., Bridgewater, NJ) al 4,0% (p/v) y cloruro 20 sódico (Mallonckrodt, St. Louis, MO) al 1,9% p/v y solución B que contenía Supersonic F-68 (Serva, Heidelberg, Alemania) al 2,0% y estearato de sacarosa Ryoto S-1670 (Mitsubishi Kasel Food Corp., Tokio, Japón) al 2,0% p/v. La solución B se añadió aún mezclador de 25 elevada tensión de cizallamiento y se enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión densa de 40 ml de 1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon, 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en 1 L de la solución B. Esta suspensión se emulsionó usando un dispositivo Microfluidizer (Microfluidics 30 Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a 10.000 ppc a 5°C durante cinco pases. La emulsión resultante se añadió a la solución A para producir la siguiente fórmula para su deshidratación por aspersión:

N-Lok al 2,0% p/v 35

Supersonic F-68 al 1,0%

Estearato de sacarosa S-1670 al 1,0% p/v

Cloruro sódico al 0,95% p/v

1,1,2-triclorotrifluoroetano al 2,0% v/v

Posteriormente se secó por aspersión esta emulsión 5 en un secador por aspersión Niro Atomizer Portable Spray Dryer equipado con un atomizador de dos líquidos (Niro Atomizer, Copenhague, Dinamarca) empleando los siguientes ajustes:

Velocidad del flujo de aire caliente = 39,5 CFM 10

Temperatura del aire entrante = 235°C

Temperatura del aire saliente = 10°C

Flujo de aire el atomizador = 110 l/hora

Velocidad de cebado de la emulsión = 1 l/hora

El producto esférico hueco seco tenía un diámetro 15 entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 15 µm y se recogió en el separador de aire seco, como es estándar para este secado. Se pesaron alícuotas del polvo (250 mg) y se introdujeron en viales tubulares de 10 ml, con nitrógeno saturado con perfluorohexano a 13°C y se 20 sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorohexano haciéndolo pasar a través de tres botellas de lavado de gas llenas de perfluorohexano e inmersas en un baño de agua a 13°C.

Los viales se reconstituyeron con 5 ml de agua para 25 inyección después de insertar una aguja de calibre 18 como válvula para aliviar la presión a medida que se inyectaba el agua. Se inyectó por vía intravenosa 1 ml de la suspensión resultante de microburbujas en un conejo de aproximadamente 3 kg al que se había sometido a 30 instrumentación para monitorizar la señal ecográfica de la arteria carótida. Un manguito de flujo de 10 MHz (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo Doppler System 6 (Triton Technology Inc.) proporcionaba la señal Doppler de RF a un 35 osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). La raíz cuadrática media (RCM) del voltaje de la señal que calculó el osciloscopio se transfirió a un ordenador y se ajustó la curva resultante para obtener una intensidad máxima de la señal ecógena y la semivida de las 5 microburbujas en la sangre. Las señales antes del contraste eran menores de 0,1 V de RCM. Se observó una señal máxima de 1,6 V de RCM con una semivida de 54,2 s, lo que demostraba la capacidad de los polvos secados por aspersión de producir microburbujas ecógenas 10 intravasculares que tienen una semivida prolongada in vivo.

Ejemplo IX

Producción de microburbujas que contienen hidroxietil almidón 15

Se preparó una emulsión para deshidratación por aspersión como en el Ejemplo VIII para dar una composición final de:

Hidroxietil almidón m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) al 2,0% p/v 20

Cloruro sódico (Mallinckrodt) al 2,0% p/v

Fosfato sódico dibásico (Mallinckrodt) al 1,74% p/v

Fosfato sódico monobásico (Mallinckrodt) al 0,26% p/v

Supersonic F-68 (Serva) al 1,7% 25

Estearato de sacarosa S-1670 Ryoto (Mitsubishi Kasel Food Corp.) al 0,2% p/v

Estearato de sacarosa S-570 Ryoto (Mitsubishi Kasel Food Corp.) al 0,1% p/v

1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, 30 Gibbstown, NJ) al 4,0% v/v

Esta emulsión se secó por aspersión como en el Ejemplo VIII usando los dientes parámetros:

Velocidad del flujo de aire caliente = 39,5 CFM

Temperatura del aire entrante = 220°C 35

Temperatura del aire saliente = 105°C

Flujo de aire del el atomizador = 110 l/hora

Velocidad de cebado de la emulsión = 1 l/hora

Se prepararon viales de muestra con 400 mg de polvo deshidratado por aspersión y se enfriaron a chorro como en 5 el Ejemplo VIII. Después de su reconstitución con 5 ml de agua para inyección y de la administración intravenosa de 1,0 ml a un conejo como en el Ejemplo VIII, se obtuvo una señal máxima de 2,4 V de RCM con una semivida de 70,9 s. Esto demuestra la capacidad de los almidones de elevado 10 peso molecular y de sus derivados de grado inyectable y de los poliésteres de azúcares de producir mayores señales in vivo que persisten durante más tiempo, en comparación con el almidón vegetal estándar (Ejemplo VIII). Esto también demuestra la menor concentración de tensioactivo que es 15 necesaria para una fórmula óptima secada por aspersión y el uso de un agente inflador para secado por aspersión, como Freon 113.

Ejemplo X

Estabilidad de las microburbujas que contienen almidón 20

Se reconstituyó el polvo deshidratado por aspersión como se ha descrito en el Ejemplo VIII. Para la comparación, se prepararon las microburbujas sonicadas del Ejemplo I y se examinaron mediante microscopia óptica en un plazo de 2 min después de la preparación y de nuevo a 25 los 10 min de la preparación. Se encontró que la distribución del diámetro inicial de la burbuja del producto sonicado era más amplia (entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 µm) que la del polvo deshidratado por aspersión reconstituido (entre aproximadamente 3 y 30 aproximadamente 15 µm). Después de 10 min se agitaron los viales, se hizo un nuevo muestreo y de nuevo se observaron mediante microscopia óptica. El producto deshidratado por aspersión reconstituido estaba esencialmente no modificado, mientras que las microburbujas sonicadas 35 habían crecido mediante desproporción molecular hasta que casi todas las microburbujas observables tenían más de 10 µm del diámetro. Este experimento demuestra la mayor estabilidad en el interior del vial de las microburbujas que se producen mediante deshidratación por aspersión y la 5 capacidad de los almidones de aumentar la estabilidad in vitro.

Ejemplo XI

Formación de microburbujas utilizando un vial de dos cámaras 10

Se pesaron 800 mg del polvo deshidratado por aspersión del Ejemplo X y se introdujeron en la cámara inferior de un vial de dos cámaras Wheaton RS-177FLW (Figura 1). Se lavó el vial con nitrógeno saturado con perfluorohexano a 3°C antes de insertar el sello entre las 15 cámaras. Se llenó la cámara superior con 10 ml de agua estéril para inyección. Se insertó el émbolo de la cámara superior para eliminar todas las burbujas de aire de la cámara superior. Después de la depresión del émbolo superior, se introdujo en la cámara inferior el sello que 20 ya había entre las cámaras, permitiendo que fluyera el agua hacia la cámara inferior y reconstituyera el polvo (Figura 2). Se formaron numerosas microburbujas estables, como se demostró mediante microscopia óptica. Este procedimiento demuestra la conveniencia de esta forma de 25 empaquetamiento y la eliminación de la necesidad de proporcionar una válvula para eliminar la formación de presión cuando se añade la fase acuosa al polvo.

Ejemplo XII

Formación de microburbujas usando una jeringa de dos 30 cámaras

Se pesaron 100 mg del polvo deshidratado por aspersión del Ejemplo IX y se introdujeron en una jeringa de cámara dual B-D HYPAK Liquid/Dry 5+5 ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y se agitaron en la cámara 35 que contenía el polvo (extremo de la aguja). Posteriormente se colocó el sello entre las cámaras inmediatamente encima del canal de derivación. Posteriormente se ajustó a la jeringa una aguja de cinco µm que contenía un filtro. Posteriormente se llenó la 5 cámara que contenía el polvo con el agente osmótico gaseoso colocando el dispositivo en una cámara de vacío, evacuando y rellenando la cámara con el agente osmótico gaseoso, nitrógeno saturado con perfluorohexano a 13°C. La aguja con filtro permite la evacuación y el relleno de la 10 atmósfera de la cámara que confine polvo. Posteriormente se colocó sobre la aguja una cubierta de sellado de aguja. Posteriormente se llenó la cámara del líquido con 4 ml de agua para inyección y se fijó el pistón usando una válvula temporal (un alambre insertado entre el émbolo de la 15 jeringa de vidrio y el pistón para eliminar todas las burbujas de aire).

Para la reconstitución, se quitó la cubierta de sellado de la aguja para evitar la aparición de presión en la cámara que contenía el polvo. Posteriormente se 20 deprimió el pistón, haciendo que el sello que había entre las cámaras pasara a la posición de la derivación, lo que permitió que el agua fluyera alrededor del sello que había entre las cámaras y hacia la cámara que contenía el polvo. Se interrumpió el movimiento del pistón cuando toda el 25 agua estaba en la cámara que contenía el polvo. Se agitó la jeringa para disolver el polvo. Se expulsó el exceso de gas y cualquier burbuja de gran tamaño sujetando la jeringa con el extremo de la aguja hacia arriba y deprimiendo aún más el pistón. Posteriormente se expulsó 30 la solución que contenía numerosas microburbujas estabilizadas (según se observa con microscopia óptica) de la jeringa deprimiendo el pistón hasta el límite.

Claims (47)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para formar microburbujas estabilizadas en un líquido, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: 5

   proporcionar un primer gas, un segundo gas, un material formador de membrana y un líquido, en el que dicho primer gas y dicho segundo gas están presentes en un cociente molar de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1000:1, y en el que dicho primer gas 10 tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760-x) mm Hg a 37°C, donde x es la presión de vapor del segundo gas a 37°C, y en el que dicha presión de vapor de cada uno de dicho primer y segundo gas es mayor de aproximadamente 75 mm Hg a 15 37°C, con la condición de que dicho primer gas y dicho segundo gas no sean vapor de agua donde dicho primer gas no fluorocarbonado se selecciona del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico y una mezcla de los mismos y dicho segundo gas comprende un 20 fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, 25 perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12; y

   rodear dichos primer y segundo gas con dicho material formador de membrana para formar microburbujas en dicho líquido. 30

2. 2. El procedimiento de la Reivindicación 1, que además comprende las etapas de:

   formar inicialmente microburbujas que tienen un primer diámetro medio en el que el cociente inicial 35 de dicho primer gas a dicho segundo gas en dichas microburbujas es de al menos aproximadamente 1:1;

   poner en contacto dichas microburbujas que tienen un primer diámetro medio con un medio líquido;

   contraer dichas microburbujas en dicho medio como 5 consecuencia de la pérdida de dicho primer gas a través de dicha membrana; y posteriormente

   estabilizar dichas microburbujas a un segundo diámetro medio de menos de aproximadamente el 75% de dicho primer diámetro durante un periodo de al menos 10 1 minuto.

3. 3. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dichas microburbujas están estabilizadas a dicho segundo diámetro mediante la consecución de un diferencial de 15 presión osmótica gaseosa a través de dicha membrana, tal que la tensión de un gas o gases disueltos en dicho medio es igual a la presión parcial del mismo gas o gases en el interior de dichas microburbujas o mayor que la misma.

   20

4. 4. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que dicho primer diámetro es de al menos aproximadamente 5 µm.

5. 5. Una composición de microesferas huecas deshidratadas por aspersión capaz de formar microburbujas estabilizadas 25 después de su adición a un líquido, de modo que dichas microesferas huecas tienen un diámetro medio de menos de aproximadamente 100 µm y comprenden un tensioactivo en combinación con uno o más carbohidratos seleccionados del grupo formado por almidones, derivados de almidón, 30 dextrinas y combinaciones de los mismos, y en el que el primer gas y el segundo gas están presentes respectivamente en un cociente molar de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1000:1 y donde dicho primer gas no fluorocarbonado se selecciona del grupo de nitrógeno, 35 oxígeno, anhídrido carbónico y una mezcla de los mismos y dicho segundo gas comprende un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, 5 C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12.

6. 6. La composición de microesferas huecas de la 10 Reivindicación 5 en la que dicho tensioactivo tiene un componente con un equilibrio hidrófilo/lipófilo de menos de aproximadamente 8.

7. 7. La composición de microesferas de la Reivindicación 15 5 en la que el primer gas y el segundo gas están respectivamente presentes en un cociente molar de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 100:1, y en el que el primer gas tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760-x) mm de Hg a 37ºC, en el que x es la 20 presión de vapor del segundo gas a 37ºC, y en el que la presión de vapor de cada uno del primer y segundo gases es mayor que aproximadamente 75 mm de Hg a 37ºC.

   25

8. 8. Una preparación de microburbujas estabilizadas rellenas de gas, que comprende

   una mezcla de un primer gas o gases y de un segundo gas o gases en el interior generalmente de membranas esféricas para formar microburbujas, en la que dicho 30 primer gas y dicho segundo gas están presentes respectivamente en un cociente molar de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1000:1, y en el que dicho primer gas tiene una presión de vapor de al menos aproximadamente (760-x) mm Hg a 37°C, en el que x es la presión de vapor 35 del segundo gas a 37°C; donde dicho primer gas no fluorocarbonado se selecciona del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico y una mezcla de los mismos y dicho segundo gas comprende un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, 5 C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12. 10

9. 9. La preparación de microburbujas estabilizadas rellenas de gas de la Reivindicación 8 que además comprende

   un contenedor que incorpora dichas microburbujas 15 estabilizadas que comprenden una mezcla de dicho primer gas o gases y dicho segundo gas o gases.

10. 10. La preparación de la Reivindicación 8, en la que:

    dichas microburbujas estabilizadas están en un medio 20 líquido y tienen un primer diámetro medio;

    el cociente de dicho primer gas a dicho segundo gas en dichas microburbujas estabilizadas es de al menos 1:1; y

    dichas microburbujas estabilizadas están adaptadas 25 para contraerse en dicho medio como consecuencia de la pérdida de dicho primer gas a través de dicha membrana hasta un segundo diámetro medio de menos de aproximadamente el 75% de dicho primer diámetro, y posteriormente para permanecer estabilizadas en dicho 30 segundo diámetro o aproximadamente en el mismo durante al menos aproximadamente 1 minuto como consecuencia de un diferencial de presión osmótica a través de dicha membrana.

    35

11. 11. La preparación de la Reivindicación 10, en la que dicho medio es acuoso.

12. 12. La preparación de la Reivindicación 10, en la que dicho medio está en un contenedor y dichas microburbujas 5 se han formado en dicho contenedor.

13. 13. La preparación de la Reivindicación 10, en la que dicho medio es sangre in vivo.

    10

14. 14. La preparación de la Reivindicación 10, en la que dicho medio líquido contiene uno o varios gases disueltos en el mismo con una tensión gaseosa de al menos aproximadamente 700 mm Hg, en la que dicho primer diámetro es de al menos aproximadamente 5 µm, y en la que la 15 tensión del gas o de los gases disueltos en dicho medio es menor que la presión del mismo gas o gases en el interior de dicha microburbuja.

15. 15. La preparación de la Reivindicación 10, en la que 20 dicho primer diámetro es de al menos aproximadamente 10 µm y dicho segundo diámetro está entre aproximadamente 1 µm y 6 µm.

16. 16. La preparación de la Reivindicación 8, en la que 25 dicho segundo gas tiene un peso molecular medio de al menos aproximadamente cuatro veces el de dicho primer gas.

17. 17. La preparación de la Reivindicación 8, en la que dicho segundo gas tiene una presión de vapor menor de 30 aproximadamente 750 mm Hg a 37°C.

18. 18. La preparación de la Reivindicación 17, en la que dicho cociente molar de dicho primer gas respecto a dicho segundo gas es desde aproximadamente 1:10 a 35 aproximadamente 500:1.

19. 19. La preparación de la Reivindicación 8 ó 17, en la que dicho segundo gas comprende al menos dos fluorocarbonos y en la que dicho segundo gas comprende 5 perfluorohexano.

20. 20. La preparación de la Reivindicación 9, que además comprende un líquido en dicho contenedor en una mezcla con dichas microburbujas, en la que dicho contenedor comprende 10 además medios para la transmisión de energía ultrasónica suficiente para la transmisión a dicho líquido de suficiente energía ultrasónica como para permitir la formación de dichas microburbujas mediante sonicación.

    15

21. 21. La preparación de la Reivindicación 20, en la que dicho medio para la transmisión comprende un material polímero flexible que tiene un grosor menor de aproximadamente 0,5 mm.

    20

22. 22. La preparación de la Reivindicación 8, en la que dicha membrana generalmente esférica es un tensioactivo.

23. 23. La preparación de la Reivindicación 22, en la que dicho tensioactivo es un carbohidrato, preferentemente un 25 polisacárido.

24. 24. La preparación de la Reivindicación 22, en la que dicho tensioactivo es proteináceo.

    30

25. 25. La preparación de la Reivindicación 8, en la que dicha membrana es sólida o semisólida.

26. 26. La preparación de la Reivindicación 8, en la que dicha membrana es un material proteináceo, preferentemente 35 albúmina.

27. 27. Un sistema para formar microburbujas estabilizadas a partir de un precursor sólido, comprendiendo dicho sistema: 5

    un vial que contiene una fase gaseosa y estructuras sólidas o semisólidas sustancialmente solubles en agua que contienen cavidades y que definen una pluralidad de cavidades que tienen un diámetro medio menor de aproximadamente 100 µm; 10

    un tensioactivo en dicho vial y comprendida dicha fase gaseosa por un fluorocarbono seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, 15 perfluorociclohexanos, C6F12, perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12;

    y un gas seleccionados del grupo constituido por oxígeno, anhídrido de carbono, nitrógeno o las mezclas de los mismos . 20

28. 28. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dicha fase gaseosa comprende un agente osmótico gaseoso que tiene una solubilidad en el agua de no más de aproximadamente 0,5 mM a 25°C y 1 atmósfera. 25

29. 29. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dichas microburbujas se forman mediante la aplicación de energía.

30. 30. El sistema de la Reivindicación 29, en el que dicha 30 aplicación de energía es mediante agitación mecánica, agitación sencilla, sonicación o vibración ultrasónica.

31. 31. El sistema de la Reivindicación 27, en el que después que se forman e inyectan las microburbujas 35 estabilizadas, el segundo gas se difunde en y sale de la microburbuja desde el medio externo.

32. 32. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dicha estructura que contiene cavidades comprende un almidón 5 deshidratado por aspersión o un derivado de almidón deshidratado por aspersión.

33. 33. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dicha estructura que contiene cavidades comprende un 10 tensioactivo.

34. 34. El sistema de la Reivindicación 33, en el que dicho tensioactivo es un tensioactivo no newtoniano.

    15

35. 35. El sistema de la Reivindicación 33, en el que un componente de dicho tensioactivo tiene un equilibrio hidrófilo/lipófilo de al menos 12.

36. 36. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dicho 20 vial incluye una cantidad de un éster de azúcar que tiene un EHL de menos de 8, que es efectivo para aumentar la semivida in vivo de las microburbujas que se forman a partir del mismo.

    25

37. 37. El sistema de la Reivindicación 27, en el que dicha estructura que contiene cavidades comprende microesferas deshidratadas por aspersión.

38. 38. El sistema de la Reivindicación 37, en el que dichas 30 microesferas comprenden un tensioactivo y (a) un almidón o un derivado de almidón o una dextrina, o (b) un éster de azúcar.

39. 39. Un equipo para su uso en la preparación de 35 microburbujas estabilizadas directamente en líquido, comprendiendo dicho equipo:

    un contenedor sellado;

    un líquido en dicho contenedor;

    un tensioactivo en dicho contenedor; y 5

    un gas o vapor fluorocarbonado seleccionado del grupo de perfluoropropanos, C3F8, perfluorobutanos, C4F10, perfluoropentanos, C5F12, perflurociclopentanos, C5F10, perfluorometilciclobutanos, C5F10, perfluorohexanos, C6F14, perfluorociclohexanos, C6F12, 10 perfluorometilciclopentanos, C6F12, perfluorodimetilciclobutanos, C6F12 y un gas no fluorocarbonado seleccionado del grupo de nitrógeno, oxígeno, anhídrido carbónico o una mezcla de los mismos en dicho contenedor, en el que dicho líquido, 15 dicho tensioactivo y dicho gas o vapor fluorocarbonado están adaptados en conjunto para formar microburbujas después de la aplicación de energía a los mismos.

    20

40. 40. El equipo de la Reivindicación 39, que además comprende un medio en dicho contenedor para permitir la transmisión a dicho líquido de suficiente energía externa como para formar microburbujas en dicho contenedor.

    25

41. 41. El equipo de la Reivindicación 39, en el que dicha aplicación de energía es mediante agitación mecánica, agitación sencilla, sonicación o vibración ultrasónica.

42. 42. El equipo de la Reivindicación 39, que además 30 comprende un gas no fluorocarbonado en dicho contenedor, en el que el cociente molar de dicho gas no fluorocarbonado respecto a dicho gas fluorocarbonado es de desde aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1000:1, con la condición de que dicho gas no fluorocarbonado no sea 35 vapor de agua.

43. 43. La composición, preparación, o equipo de la Reivindicación 5, 22, ó 33, en el que dicho tensioactivo comprende uno o más fosfolípidos. 5

44. 44. La preparación de la Reivindicación 22, en la que dicho tensioactivo es un tensioactivo viscoelástico no newtoniano.

    10

45. 45. La preparación o equipo de la Reivindicación 22, en el que dicho tensioactivo es un éster de ácido graso de un azúcar.

46. 46. La preparación de la Reivindicación 22, en la que 15 dicho tensioactivo es estearato de sacarosa.

47. 47. La preparación o equipo de las Reivindicaciones 8, 27 ó 39, en el que la microburbuja es una microburbuja recubierta de lípidos. 20