ES2231814T3 - Efectos metabolicos de ciertos analogos de glutation. - Google Patents
Efectos metabolicos de ciertos analogos de glutation.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPUESTOS DE FORMULA (1) Y LOS ESTERES, AMIDAS, AMIDA/ESTERES Y SALES DE LOS MISMOS, EN LOS QUE YCO ES GA} UB,2}, O O S; Y X ES UN RADICAL HIDROCARBONADO DE 1 A 20 C; QUE SON UTILES EN LA MODULACION DE LA HEMATOPOIESIS EN LA MEDULA OSEA, MITIGANDO LOS EFECTOS DESTRUCTORES DE MEDULA OSEA DE UN AGENTE QUIMIOTERAPEUTICO, Y EN LA POTENCIACION DE LA TOXICIDAD DE AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS.
Description
Efectos metabólicos de ciertos análogos de
glutatión.
La invención se refiere a los efectos metabólicos
de una clase de análogos de glutatión interactivos con al menos una
clase de glutatión S-transferasa. Más
particularmente, la invención se refiere a la modulación de la
hematopoyesis en la médula ósea o la sangre y a otras respuestas
útiles para esta clase de inhibidores de la glutatión
S-transferasa.
Los efectos secundarios de los agentes
quimioterápicos (antineoplásicos) utilizados en el tratamiento del
cáncer y otras indicaciones se conocen bien. Entre estos efectos
secundarios están las alteraciones en los niveles de diversas
células sanguíneas, incluyendo neutrófilos, plaquetas y linfocitos.
Los resultados de estos efectos pueden ser, en general, neutropenia,
trombocitopenia e inmunosupresión. Estos efectos secundarios no sólo
son desagradables, sino que también limitan la eficacia del
tratamiento contra el cáncer y sitúan al sujeto en un grave riesgo
de infección y hemorragia incontrolada.
En la actualidad, parece haber poco remedio
práctico para estos efectos. Algunos enfoques son meramente
paliativos, tal como la atención complementaria. Otros tienen sus
propios efectos secundarios, tales como grandes dosis de
antibióticos. Todavía otros son caros e invasivos, tales como las
transfusiones. Todavía otro enfoque, la administración de factores
de crecimiento, tal como el factor estimulador de colonias de
granulocitos (GCSF), el factor estimulador de colonias de
granulocitos y macrófagos (GMCSF) y factores más recientemente
desarrollados, tales como el factor de crecimiento y desarrollo de
megacariocitos (MGDF) y la trombopoyetina (TPO) son costosos y deben
administrarse mediante inyección. También tienen sus propios efectos
secundarios negativos.
Claramente hay una necesidad para un enfoque más
simple, por ejemplo un fármaco de molécula pequeña, administrable
por la boca, que pueda proteger y reconstituir la médula ósea y
también estimular la producción de neutrófilos, plaquetas y
linfocitos, tanto en conjunción con los protocolos quimioterápicos,
como en respuesta a otros factores que dan como resultado la
supresión hematopoyética, tales como las neutropenias cíclicas e
idiopáticas, la trombocitopenia y los efectos de los transplantes
de aloinjertos.
Los problemas relacionados con los enfoques
actuales para el tratamiento de los efectos secundarios de la
quimioterapia y que, aparte de eso, traten la supresión de la
hematopoyesis, se resuelven al menos en parte mediante la actividad
biológica de ciertos compuestos tripeptídicos simples que son
inhibidores de las diversas isoenzimas de la glutatión
S-transferasa.
La solicitud PCT número WO 95/08563 publicada el
30 de marzo de 1995, y basada en el documento PCT/US94/
10797, describe estos compuestos tripeptídicos que son análogos de glutatión. Generalmente son inhibidores de la actividad de la glutatión S-transferasa y los diversos compuestos contenidos en este grupo muestran diversas especificidades con respecto a las isoenzimas de la glutatión S-transferasa.
10797, describe estos compuestos tripeptídicos que son análogos de glutatión. Generalmente son inhibidores de la actividad de la glutatión S-transferasa y los diversos compuestos contenidos en este grupo muestran diversas especificidades con respecto a las isoenzimas de la glutatión S-transferasa.
Se ha encontrado ahora que un subconjunto de
estos análogos, que son de la fórmula general
(1)YCO ---
N
\delm{H}{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- X}}CHCO ---
G^{*}
y las amidas y ésteres de los
mismos, en la que YCO es \gamma-glu o
\beta-asp; G* es fenilglicina o glicina; Z es
CH_{2}, O o S; y X es un radical hidrocarbonado de 1 - 20 C, tiene
la capacidad de modular la hematopoyesis en la médula ósea y en la
sangre periférica y, por tanto, ejercen efectos protectores cuando
se administran agentes quimioterápicos destructivos para el sistema
hematopoyético. Estos compuestos también estimulan los efectos
deseados de los agentes quimioterápicos. Este mismo subconjunto de
los análogos de glutatión muestra inhibición de la clase \pi de la
glutatión S-transferasa (GST) y, en algunos casos,
también de otras
clases.
La invención proporciona compuestos que son
útiles en la modulación de la hematopoyesis, en general, y como
adyuvantes para el tratamiento quimioterápico de tumores en virtud
de su capacidad para ejercer un efecto protector sobre el sistema
hematopoyético con respecto a los agentes tóxicos que, por lo demás,
son útiles en quimioterapia. Los compuestos son oralmente activos y
pueden utilizarse en cualquier contexto en el que sea deseable
modular los procesos hematopoyéticos en la médula ósea o en la
sangre periférica o modular otros procesos de la médula ósea.
Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere
al uso de un compuesto en la fabricación de un medicamento para
modular la hematopoyesis en la médula ósea o en la sangre
periférica, o a fracciones de los mismos, en el que dicho
medicamento se va a administrar por vía oral y dicho compuesto es de
la fórmula
(1)YCO ---
N
\delm{H}{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- X}}CHCO ---
G^{*}
o las formas de éster, amida,
éster/amida o sal del
mismo,
en la que YCO es \gamma-glu o
\beta-asp;
G* es fenilglicina o glicina;
Z es CH_{2}, O o S; y
X es un radical hidrocarbonado de 1 - 20 C.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de los compuestos identificados anteriormente en la fabricación de
un medicamento para ejercer un efecto protector frente a los efectos
destructivos de un agente quimioterápico, incluyendo la irradiación,
administrado a un sujeto. Dicha protección incluye el modo de acción
por el que se produce la aceleración de la recuperación de tales
efectos. El compuesto de fórmula (1) ha de administrarse al sujeto
en una cantidad y durante un tiempo eficaces para ejercer dichos
efectos protectores.
En otros aspectos, la invención se refiere a
formulaciones para estimular la producción de neutrófilos, plaquetas
y linfocitos, reconstituyendo la médula ósea dañada, protegiendo a
la médula ósea del tratamiento citotóxico y ejerciendo un efecto
protector frente a la neutropenia, trombocitopenia, linfocitopenia y
anemia producidas por quimioterapia, infección o enfermedades
hematológicas y por la expansión de poblaciones celulares en el
transcurso de un transplante de médula ósea. Los compuestos pueden
usarse como quimio o radiosensibilizadores específicos del tumor,
potenciando así el efecto del tratamiento, y como quimioprotectores
generalizados.
La invención también incluye composiciones
farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención como
principios activos y los métodos para la síntesis de los compuestos
de la invención.
Puede llevarse a cabo un método para modular la
hematopoyesis o para ejercer un efecto protector frente a los
efectos destructivos de un agente quimioterápico mediante un método
que comprende poner en contacto la médula ósea, la sangre periférica
o una fracción adecuada de las mismas con un compuesto que inhibe
las isoenzimas de la glutatión S-transferasa de al
menos una clase, y generalmente inhibe la GST de la clase \pi a un
nivel razonable.
La figura 1a muestra el efecto de TER199 sobre la
supervivencia de células tumorales tratadas con diversas
concentraciones de clorambucilo.
La figura 1b muestra el efecto tóxico de TER199
en comparación con su forma no esterificada sobre las células
HT4-1.
La figura 2 es un gráfico que muestra el efecto
de diversas combinaciones de clorambucilo, o bien solo o en
combinación con ácido etacrínico o TER199.
La figura 3 es un gráfico que muestra el efecto
dependiente de la dosis de TER199 sobre GM-CFU
(unidad formadora de colonias de granulocitos y macrófagos) de
ratón, 24 horas tras el tratamiento.
La figura 4a es un gráfico que muestra la
comparación de la administración oral frente a la i.p.
(intraperitoneal) de TER199 en GM-CFU de médula
ósea.
La figura 4b es un gráfico que muestra la
comparación de la administración oral frente a la i.v. (intravenosa)
de TER199 en GM-CFU de médula ósea.
La figura 5 muestra el transcurso del tiempo de
la estimulación con TER199 de GM-CFU, administrado
por vía i.p.
La figura 6 es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 sobre los recuentos de neutrófilos y eritrocitos.
La figura 7 es un gráfico que muestra la
dependencia de la forma esterificada o amidada de los tripéptidos
con respecto a la estimulación de GM-CFU.
La figura 8 es un gráfico que muestra el efecto
de la naturaleza del sustituyente "X" de fórmula 1 sobre la
estimulación de GM-CFU.
\newpage
La figura 9a es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 sobre la supresión de GM-CFU por
5-fluorouracilo (5-FU) en
ratones.
La figura 9b es un gráfico que muestra el efecto
con el transcurso del tiempo de la administración i.p. de TER199, 24
horas tras la administración de 5-FU sobre la
recuperación de la capacidad de diferenciación de las células de la
médula ósea.
La figura 9c es un gráfico que muestra el efecto
del pretratamiento con TER199 (i.p.) sobre la supresión de
GM-CFU inducida por 5-FU.
La figura 9d es un gráfico que compara los
efectos de la administración oral e i.p. de TER199, 24 horas después
de la administración de 5-FU, sobre la supresión de
GM-CFU en ratones.
La figura 10 es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 sobre la supresión de GM-CFU inducida por
cisplatino (i.p.) en ratones.
La figura 11 es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 oral sobre la supresión de GM-CFU inducida
por cisplatino en ratones.
La figura 12 es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 sobre la supresión de GM-CFU inducida por
carboplatino en ratones.
La figura 13 es un gráfico que muestra el efecto
de TER199 sobre la supresión de GM-CFU inducida por
ciclofosfamida en ratones.
La figura 14 es una serie de gráficos que
muestran que TER199 acelera la recuperación y disminuye la toxicidad
para los linajes mieloide y linfoide en ratas tras el tratamiento
con 5-FU.
Las figuras 15a - 15d muestran hemogramas de
diversos tipos de células tras la administración de
5-FU solo o 5-FU + TER199.
La figura 16 muestra el efecto de TER199 sobre la
diferenciación de las células CD34^{+++} con respecto a
CFU-GEMM y BFU-E.
La figura 17 muestra un método preferido para la
síntesis de TER199.
Muchos de los compuestos útiles en la invención
inhiben la actividad de al menos una subclase de isoenzimas de las
isoenzimas de la glutatión S-transferasa. Estos
compuestos también modulan la hematopoyesis en la médula ósea,
incluso en presencia de agentes que normalmente destruirían un gran
porcentaje de las células necesarias para mantener la hematopoyesis,
mostrando además otros efectos útiles sobre la médula ósea y las
células sanguíneas. Estos compuestos son de la fórmula
(1)YCO ---
N
\delm{H}{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- X}}CHCO ---
G^{*}
en la que YCO, G^{*}, Z y X son
tal como se definieron anteriormente. Cuando se usan in vivo
o in vitro para el fin de afectar a células intactas, los
compuestos de la invención están preferiblemente en las formas de
amida, éster o el híbrido de
amida/éster.
Será evidente que los compuestos usados en la
invención pueden estar presentes como los ácidos libres, sales,
monoésteres, diésteres, monoamidas, diamidas o formas híbridas de
éster/amida. Las amidas y los ésteres útiles en la invención son
generalmente aquellos de alquil (1 - 10 C); alquenil (1 - 10 C) y
arilalquil (7 - 12 C) alcoholes y aminas. Por tanto, ésteres y
amidas habituales útiles en la invención incluyen ésteres
dimetílicos, ésteres dietílicos, ésteres mixtos de etilo/propilo,
ésteres dihexílicos, ésteres mixtos de hexilo/octilo, ésteres
dibutenílicos, ésteres mixtos de butenilo/vinilo, las amidas
correspondientes y similares. Especialmente preferidas son las
formas de éster dietílico de los compuestos de fórmula (1). Una
realización preferida de Z es O o S, particularmente S; y una
realización preferida de YCO es \gamma-glu.
Las realizaciones preferidas para el resto
hidrocarbonado (1 - 20 C) de X incluyen hexilo, heptilo, octilo,
bencilo y naftilo. Compuestos particularmente preferidos de la
invención son
\gammaE-C(octil)-\varphiG;
\gammaE-C(Hx)-\varphiG;
\gammaE-C(naftil)-\varphiG;
\gammaE-C(Bz)-\varphiG;
y \gammaE-C(octil)-G;
\gammaE-C(Hx)-G; y
\gammaE-C(Bz)-G; y
especialmente sus diésteres y más preferiblemente sus ésteres
dietílicos. Particularmente preferidos son el éster dietílico de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER199) y éster dietílico de
\gammaE-C(octil)-G
(TER183).
Será evidente que los tripéptidos usados en la
invención contienen uno o dos centros quirales. Las designaciones
expuestas anteriormente se refieren al género de los diastereómeros
que resultan de la presencia de esos centros quirales. Sin embargo,
particularmente preferidas son aquellas realizaciones en las que el
aminoácido representado por YCO (\gamma-glu o
\beta-asp) está en la configuración L nativa; la
cisteína o el residuo análogo de la cisteína representados por
NHCH(CH_{2}ZX)CO también está en la configuración L
nativa y, cuando G^{*} es fenilglicina, la fenilglicina está
preferiblemente en la configuración D. Por tanto, los compuestos
preferidos usados en la invención, en los que G^{*} es
fenilglicina, son las formas LLL y LLD, especialmente la forma LLD.
Se reconoce que dependiendo de la naturaleza de "X", pueden
incluirse centros quirales adicionales.
Los compuestos usados en la invención tienen
varias propiedades que los hacen útiles como coadyuvantes para la
quimioterapia y otros indicadores. En primer lugar, modulan la
hematopoyesis en la médula ósea, cuya destrucción es un efecto
secundario común de los agentes quimioterápicos. En segundo lugar,
normalmente inhiben al menos una clase de las isoenzimas de la GST,
incluyendo la subclase \pi, que es particularmente prevalente en
las células tumorales. En tercer lugar, los compuestos de fórmula
(1) potencian directamente el efecto de los agente quimitoterápicos
en la destrucción de las células tumorales. Esta combinación de
cualidades hace que los compuestos sean útiles tanto como agentes
estimuladores de la hematopoyesis directamente, como para mejorar
los efectos negativos de los protocolos quimioterápicos, así como
potenciar los efectos tóxicos para las células diana. Cuando se
formulan para su uso in vivo o en contacto con células
intactas, los compuestos de fórmula (1) se administrarán
preferiblemente como los ésteres, preferiblemente los diésteres, más
preferiblemente los diésteres de alcoholes saturados que contienen 1
- 5 C, más preferiblemente 1 - 3 C, y más preferiblemente como los
ésteres dietílicos.
La síntesis de los tripéptidos usados en la
invención puede llevarse a cabo mediante métodos estándar bien
conocidos en la técnica. Técnicas específicas para la síntesis de
los tripéptidos usados en la invención se explican en la solicitud
PCT número WO95/08563 anteriormente citada. Una vía de síntesis
particularmente preferida se describe en la presente solicitud.
Mediante "modulación de la hematopoyesis en la
médula ósea o la sangre periférica" se quiere decir alteración de
la tasa de formación de células sanguíneas, medida por la capacidad
para formar colonias o células diferenciadas. Las células
diferenciadas incluyen neutrófilos, plaquetas, eritrocitos,
linfocitos, macrófagos, granulocitos, granulocitos - macrófagos, y
similares. No está claro cuál es el mecanismo de esta modulación;
las propias células pueden o no estimularse directamente por los
compuestos de la invención; más bien, el cambio en el número y/o el
tamaño de las colonias de células diferenciadas puede deberse a la
supervivencia preferente, la inhibición de la apoptosis o cualquiera
de varios factores. Tal como se usa en la presente solicitud,
"modulación de la hematopoyesis en la médula ósea o la sangre
periférica" se refiere a la capacidad de la médula ósea o la
sangre tratada con los compuestos de la invención para mostrar
formación de colonias o generación de células diferenciadas en un
nivel diferente del de la médula ósea no tratada. De manera similar,
las fracciones de médula ósea o sangre periférica que contienen los
precursores adecuados mostrarán este efecto. Debe observarse que,
tal como se usa en el presente documento, "sangre periférica"
incluye específicamente sangre del cordón umbilical.
Además de modular la hematopoyesis, los
compuestos usados en la invención afectan a las células de la médula
ósea directamente y ejercen un efecto beneficioso sobre las células
de la médula ósea distintas a las de origen hematopoyético. Por
ejemplo, estos compuestos también estimulan la formación de los
osteoblastos de manera que ayuden en la regeneración ósea. Por
tanto, sus efectos beneficiosos sobre la médula ósea no se limitan a
la modulación de la hematopoyesis per se.
En general, cuando se emplean agentes que
normalmente tienen efectos destructivos sobre la médula ósea o sobre
la hematopoyesis en la sangre, los compuestos usados en la invención
ejercen un efecto protector. Mediante "efecto protector" se
quiere decir que la lesión resultante en la médula ósea o la sangre
es inferior cuando se administra el compuesto que cuando no se
administra. La disminución neta en la lesión puede deberse a la
protección per se, es decir, evitando los efectos
destructivos que se producirían normalmente, o puede resultar de la
aceleración de la recuperación de tal destrucción. Por tanto,
"efecto protector" incluye el efecto de lograr este resultado
deseable independientemente del mecanismo por el que se logra.
Hay varias situaciones en las que el efecto
protector de los compuestos usados en la invención es útil. Estos
incluyen casos en los que la irradiación ha dado como resultado, o
puede dar como resultado posiblemente, efectos negativos, casos en
los que un sujeto está inmunodeprimido por cualquier motivo, casos
en los que un sujeto muestra lesión en los riñones, así como casos
en los que el sujeto se ha sometido a quimioterapia. Además, los
compuestos de la invención pueden usarse en prácticas de
transplantes para aumentar el número de células en la médula ósea de
un donante; normalmente, en este caso, el compuesto puede
administrarse in vivo o ex vivo. También en
estas prácticas, los compuestos usados en la invención estimulan el
movimiento de las células progenitoras en la sangre periférica del
donante que, por tanto, mejora la recuperación del número de
leucocitos de la sangre periférica en este donante; de manera
similar, los compuestos usados en la invención pueden mejorar la
recuperación del número de leucocitos periféricos en el receptor. En
general, los compuestos mejorarán la expansión y estimularán el
injerto final de las células transplantadas tras la exposición a los
compuestos de la invención in vivo o ex vivo. Los
compuestos usados en la invención pueden usarse directamente en el
receptor para acelerar la recuperación.
Además, los compuestos usados en la invención
ayudan a los pacientes sometidos a diálisis renal en la
reconstitución de la sangre. Los compuestos también son útiles en
intensificar el crecimiento óseo generalmente.
Los compuestos usados en la invención pueden
usarse o bien in vitro o in vivo. Por ejemplo, estos
compuestos pueden emplearse para expandir o, en caso contrario,
modular las células hematopoyéticas en la médula ósea antes de los
alotrasplantes o xenotrasplantes. También puede emplearse el
tratamiento de los sujetos usando técnicas ex vivo por medio
de la expansión de células relativamente no diferenciadas desde el
torrente circulatorio. Los compuestos usados en la invención también
pueden formularse para la administración in vivo.
Las formulaciones para la administración in
vivo emplearán métodos estándar tales como los descritos en
Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack
Publishing Company, Easton, PA. Los compuestos han de formularse
para la administración oral. Tal como se muestra más adelante en el
presente documento, los compuestos son eficaces cuando se
administran por vía oral.
Puesto que la administración oral es
particularmente conveniente y puesto que los compuestos son activos
cuando se administran por vía oral, han de usarse formulaciones
adecuadas para la administración por la boca. Tales formulaciones
incluyen, tal como se conoce bien, píldoras, comprimidos, cápsulas,
jarabes, polvos o líquidos con sabor. Las diversas formulaciones
pueden prepararse en formas farmacéuticas unitarias y, si se desea,
pueden administrarse por el propio sujeto. El porcentaje de
compuesto (o mezcla de compuestos) principio activo en la
formulación puede variar en un amplio intervalo de desde
aproximadamente el 0,5% p/p hasta aproximadamente el 95% p/p. El
porcentaje preferido de principio activo dependerá de la naturaleza
de la formulación per se. Los excipientes adecuados incluidos
en estas formulaciones incluyen cargas, agentes tamponantes,
estabilizantes y similares.
Los sujetos adecuados que se beneficiarán de la
administración de los compuestos, o bien de un compuesto individual
o de mezclas de los mismos, incluyen sujetos vertebrados,
particularmente mamíferos o sujetos humanos cuyas células
precursoras de la médula ósea están en un número o un estado
fisiológico inadecuado para preservar la diferenciación y se
diferencian de manera inapropiada. Se produce el fallo de las
células precursoras para dar como resultado los números requeridos
de células efectoras, en particular, cuando el sujeto se ha expuesto
a agentes destructivos de la médula ósea, tales como agentes
quimioterápicos, radiación, exposición a toxinas en el entorno, y
similares. También se incluyen aquellos con enfermedades y estados
degenerativos de la médula ósea. Por tanto, sujetos apropiados para
la administración de los compuestos de la invención incluyen
pacientes que se someten a quimioterapia; pacientes
inmunodeprimidos, pacientes que muestran síntomas de anemia,
neutropenia, trombocitopenia, o falta de niveles adecuados de
plaquetas, y posibles sujetos para el tratamiento con agentes
citotóxicos. Dado que los compuestos usados en la invención también
estimulan la citotoxicidad de los agentes quimioterápicos con
respecto a las células malignas específicamente, los sujetos pueden
beneficiarse del tratamiento con los compuestos, aun cuando el
sistema hematopoyético no esté necesariamente inmunodeprimido por el
tratamiento quimioterápico.
Tal como se estableció anteriormente, puede
incluirse un compuesto individual usado en la invención como
principio activo o el tratamiento puede comprender el uso de mezclas
de estos compuestos. Además, los compuestos pueden mezclarse con o
usarse además de otros agentes beneficiosos, tales como factores de
crecimiento o inmunoestimulantes.
La dosis requerida depende de la naturaleza del
sujeto, la naturaleza del estado, la forma de administración y el
criterio del médico o veterinario que atiende. Los intervalos de
dosis adecuada se ajustan según estos parámetros. En general, las
dosis habituales por paciente estarán en el intervalo de 0,1 - 100
mg/kg por día durante 10 - 40 días, más preferiblemente 1 - 10
mg/kg por día durante 14 - 28 días. Estos intervalos son meramente
ilustrativos y la optimización de la dosis correcta puede
determinarse mediante métodos habituales.
Si los compuestos se administran como agentes
protectores con respecto al tratamiento quimioterápico, el momento
de la administración también puede ser importante. Sin embargo, el
momento depende de la naturaleza del agente quimioterápico
utilizado. Tal como se muestra más adelante, por ejemplo, cuando se
usa 5-FU para la quimioterapia, la administración
parece ventajosa aproximadamente 24 horas después de la
administración de 5-FU; por otra parte, aunque este
momento de administración también es eficaz cuando el cisplatino es
el agente quimioterápico, la administración aproximadamente 24 horas
antes de la dosis de cisplatino es más eficaz. Esto está claramente
dentro de la habilidad habitual para determinar el momento apropiado
para el agente quimioterápico específico empleado.
Como compuestos ilustrativos útiles como
inhibidores de las isoenzimas de la GST, se prepararon los
siguientes:
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER117);
\gammaE-C(hexil)-\varphiG
(TER102);
\gammaE-C(naftil)-G
(TER211) y
\gammaE-C(octil)-G
(TER143).
Entre estos compuestos, TER117 mostró la mayor
especificidad por GST P1-1. TER102 también fue
razonablemente específico. Por tanto, se sintetizaron diversos
derivados de TER117. En todos los compuestos anteriormente, los
residuos de \gamma-glutamilo y cisteinilo están
presentes en sus configuraciones L nativas; en TER117 y TER102, la
fenilglicina está en la configuración D.
Se prepararon los siguientes ésteres y amidas de
TER117:
TER199: \gammaE-éster
etílico-C(Bz)-R-(-)-\varphiG-éster
etílico;
TER278:
\gammaE-etilamida-C(Bz)-R-(-)-\varphiG-etilamida;
y
TER300:
\gammaE-etilamida-C(Bz)-R-(-)-\varphiG-éster
etílico.
La semivida in vitro de TER199 en la
sangre de ratón es inferior a 1 minuto, mientras que la semivida en
la sangre humana es de aproximadamente 90 minutos.
Los estudios in vitro de estos compuestos
demostraron que TER278 y TER300 tienen semividas más largas que
TER199 en la sangre de ratón y en cultivo de células
HT-29; sin embargo, la semivida en la sangre humana
para los tres compuestos es aproximadamente la misma.
TER278 es menos tóxico y tiene menos capacidad de
potenciar el clorambucilo que TER199.
TER300 se metaboliza a una velocidad intermedia
entre la de TER199 y TER278 en la sangre de ratón y en cultivo de
células HT-29. Se requieren cuatro veces más de
TER300 que de TER199 para lograr la potenciación equivalente de
clorambucilo.
Los ejemplos siguientes están destinados a
ilustrar, pero no a limitar, la invención. Aquello ejemplos (o
aquellas partes de los ejemplos) en los que se use administración
peritoneal son sólo ilustrativos y no forman parte del alcance de la
protección.
Este ejemplo describe: 1) potenciación en células
tumorales humanas de un agente citotóxico usado actualmente en
quimioterapia contra el cáncer mediante inhibidores de la GST,
incluyendo los compuestos de la presente invención, así como 2)
aumento de la eficacia intracelular de las formas esterificadas de
estos compuestos.
Se obtuvieron células HT-29
(adenocarcinoma de colon humano) del Dr. Roberto Ceriani (Cancer
Research Fund of Contra Costa County, Walnut Creek, CA) y se
utilizaron en la fase logarítmica de crecimiento, a menos que se
especifique lo contrario. El clorambucilo (CMB) se obtuvo de Sigma
(St. Louis, MO) y se disolvió en etanol al 100%. Todos los
inhibidores de la GST se disolvieron en etanol, DMSO
(dimetilsulfóxido), o agua justo antes de su utilización. La misma
cantidad de disolvente añadida al medio de cultivo sirvió como
vehículo control.
En un ensayo clonogénico modificado para
determinar la citotoxicidad, se suspendieron células a 2 x 10^{5}
células/ml en medio libre de suero, en presencia de vehículo o
inhibidor. Los inhibidores se usaron en concentraciones que dan como
resultado \geq 90% de supervivencia en presencia de inhibidor
solo, cuando se compara con células tratadas con vehículo. Las
células se incubaron durante 2 horas, después se añadieron dosis
variables de CMB. Al final de una segunda incubación de 2 horas, las
células se diluyeron hasta 7,5 - 10 x 10^{3}/ml en medio que
contenía suero y se sembraron en placa por cuadruplicado a 200
\mul/pocillo en placas de microtítulo Microtest III.
Las placas se incubaron durante 6 días y se
sometieron a ensayo mediante el método de azul de metileno
modificado. En resumen, las células se fijaron con glutaraldehído al
1,25% en PBS (solución salina tamponada con fosfato), después se
tiñeron con azul de metileno al 0,05% en agua destilada. Las placas
se lavaron varias veces con agua destilada para eliminar el
colorante no retenido y el colorante no retenido se volvió a
solubilizar en HCl 0,03 N. Las placas se leyeron a 650 nm en un
lector de placas Vmax de Molecular Devices (Molecular Devices,
Redwood City, CA). Se determinaron los valores de CI_{50}
(concentración de inhibidor que produce el 50% de reducción en la
viabilidad celular) para el fármaco en presencia o ausencia de
inhibidor a partir de las curvas dosis - respuesta. Se calculó un
factor de modificación de la dosis (DMF), una medida de la
potenciación de la citotoxicidad, para cada inhibidor dividiendo el
valor de CI_{50} de CMB sin tratamiento de inhibidor entre el
valor de CI_{50} para CMB con tratamiento de inhibidor.
Los resultados en las tablas 1 - 3 muestran que
diversos análogos de GSH (glutatión) que se encontró que eran
inhibidores de GSH también potencian la destrucción de las células
tumorales humanas en cultivo por CMB, que es un sustrato para
diversas GST. Los resultados de las pruebas de potenciación con
diversos inhibidores de la GST en cultivos de células HT29 se
resumen en la tabla 1.
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{a}La dosis de prueba se determino a partir de la curva de toxicidad y los análogos se utilizaron a una dosis en la que se produjo \geq 90% de supervivencia en presencia del análogo solo.\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{b}Factor de modificación de la dosis. Los valores son medias \pm D.E. (desviación estándar) de 2 - 3 experimentos.\end{minipage} |
Tal como se muestra en la tabla 1, esta
potenciación se intensifica enormemente mediante la esterificación
que está diseñada para intensificar la captación de inhibidores de
la GST. Por tanto,
\gammaE-C(Bz)-\varphiG a
100 \muM no intensificó la destrucción celular por CMB, reduciendo
la concentración de CMB necesaria para destruir el 50% de las
células mediante un DMF de 1,08. Por el contrario, el éster
dietílico de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER199) a sólo 12,5 \muM intensificó la citotoxicidad de CMB en
un factor de 1,65.
La expresión preferente de la isoenzima
P1-1 de la GST se ha notificado en una diversidad de
tumores humanos. En el presente estudio, la eficacia de la
potenciación de CMB de los diversos inhibidores de la GST probados
se correlacionó directamente con sus potencias como inhibidores de
la isoenzima de la GST de la clase \pi humana,
P1-1 tal como se muestra en la tabla 2.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{150mm} ^{a} Factor de modificación de la
dosis de éster dietílico.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{150mm}Los valores son medias \pm D.E de 2
– 3
experimentos.\end{minipage} \cr}
También se determinó el efecto de la
esterificación o amidación de los compuestos de fórmula (1) en su
potenciación de la citotoxicidad del clorambucilo en células
HT-29. El DMF se determinó para el éster dietílico,
la diamida y el éster/amida de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG a
concentraciones relevantes. El diéster mostró un DMF de 1,65 \pm
0,04 para la toxicidad del clorambucilo a 12,5 \muM; la diamida
mostró un DMF de 1,0 en un experimento único a 200 \muM; el
híbrido de éster/amida mostró un DMF de 1,45 \pm 0,16 a la
concentración de 50 \muM. Los resultados para el éster dietílico y
el híbrido de éster/amida se facilitan como la media \pm DE de
tres experimentos.
Los ésteres dietílicos de
\gammaE-C(octil)-G (TER183)
y \gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER199) se probaron en un ensayo clonogénico estándar usando tres
líneas celulares: HT4-1, un subclón de
HT-29; SKOV-3, un carcinoma ovárico
y VLB, una variante de SKOV-3 resistente a
vinblastina. Se utilizaron cuatro fármacos quimioterápicos,
clorambucilo, adriamicina, mitomicina C y doxorrubicina, como los
agentes tóxicos. En estos ensayos, las células se sembraron a 300
células/pocillo en 2 ml de medio en placas de 6 pocillos en
presencia de los compuestos usados en la invención como los ésteres
dietílicos. Los compuestos se utilizaron en concentraciones que
dieron como resultado más del 85% de supervivencia cuando se
compararon con los controles. Tras la incubación durante 1 - 2 horas
para permitir que las células se unieran, se añadieron diversas
dosis de los agentes quimioterápicos. Al menos se sembraron en placa
pocillos por triplicado para cada estado de prueba y las placas se
incubaron durante dos semanas. Las colonias se fijaron con etanol al
95% y se tiñeron con cristal violeta para el recuento de las
colonias. Se determinaron los valores de CI_{50} para el agente
quimioterápico en presencia o ausencia del compuesto usado en la
invención y se calcularon los factores de modificación de la dosis
dividiendo el valor de CI_{50} del fármaco sin el compuesto entre
el valor de CI_{50} del fármaco con el compuesto. Los factores de
modificación obtenidos en cada protocolo se muestran en la tabla
3.
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{a}Factor de modificación de la dosis.\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{b}Ausencia de datos debido a la toxicidad del análogo.\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{c}La dosis de prueba fue diferente de la enumerada a la izquierda.\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{150mm}^{d}No determinado.\end{minipage} |
Tal como se muestra en la tabla 3, se obtuvo una
modificación significativa cuando se uso el clorambucilo como el
fármaco frente a las células HT4-1 en presencia de
25 \muM de TER199. También se logró una modificación significativa
en las células VLB cuando se trataron con adriamicina o
doxorrubicina en presencia de 25 \muM del mismo compuesto.
La figura 1a ilustra los resultados de dosis
variables de clorambucilo y el efecto modificador de 25 \muM de
éster dietílico de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER199). Los cuadrados blancos (\boxempty) representan el
clorambucilo solo, los círculos negros (\bullet) representan
clorambucilo en presencia del compuesto. Tal como se observa en la
figura 1a, la tasa de supervivencia está marcadamente disminuida
cuando se añade el compuesto. La figura 1b confirma que el éster
dietílico es necesario para penetrar en las células. Las células
HT4-1 se probaron para determinar la supervivencia
en presencia de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER117) (cuadrados negros, \ding{110}) o su éster dietílico
(TER199) (círculos negros, \bullet). La forma no esterificada,
TER177, no tiene sustancialmente efecto sobre estas células,
mientras que el éster dietílico (TER199) es claramente tóxico.
A ratones macho scid se les implantaron
subcutáneamente tumores HT4-1 de ratones donantes.
HT4-1 es un subclón de HT-29, un
cáncer de colon humano. Cuando los tumores alcanzaron
aproximadamente 100 mm^{3}, los ratones se aleatorizaron en seis
grupos de tratamiento y se trataron durante siete días tal como
sigue:
1. 5 mg/kg de melfalán;
2. 10 mg/kg de ácido etacrínico;
3. 60 mg/kg de TER199;
4. 5 mg/kg de melfalán + 10 mg/kg de ácido
etacrínico;
5. 5 mg/kg de melfalán + 60 mg/kg de TER199;
6. vehículo solo.
Los ratones se monitorizaron para determinar
cambios en el peso y se determinaron los volúmenes del tumor
midiéndolos con calibradores. El crecimiento del tumor se monitorizó
hasta que se alcanzó el tamaño medio del tumor de 1500 mm^{3} para
todos los grupos excepto para el de melfalán con ácido etacrínico.
Este grupo no alcanzó este volumen incluso pasados 72 días.
Los resultados se calcularon en lo que se refiere
al volumen del tumor en los ratones tratados con fármaco como un
porcentaje del volumen del tumor control (es decir, en el grupo al
que se administró vehículo solo). En el grupo 1, al que se
administró melfalán solo, los tumores fueron aproximadamente el 75%
del volumen de los controles. En el grupo 5, en el que se administró
TER199 junto con melfalán, la media del volumen del tumor fue
aproximadamente el 55% del control. Para el grupo 4 al que se
administró una combinación de melfalán y ácido etacrínico, los
volúmenes fueron aproximadamente el 35% del control. Por tanto,
tanto el ácido etacrínico como TER199 potencian los efectos del
melfalán. (Las mediciones de volumen se realizaron en el momento en
el que los tumores control alcanzaron 1500 mm^{3}.)
Los efectos metabólicos relacionados con la
toxicidad de los compuestos de la invención en las células
HT-29 se probaron usando un Cytosensor
Microphysiometer (biosensor que mide las tasas metabólicas de las
poblaciones celulares) fabricado por Molecular Devices, Inc., Menlo
Park, CA y descrito en McConnell, H.M. et al. Science
(1992) 257:1906-1912 y por Wada, H.G. et
al. AATEX (1992) 1:154-164. Se
midieron los cambios en el pH del medio de cultivo como una función
del metabolismo celular. Las tasas de acidificación del pequeño
volumen de líquido que fluye sobre las células se correlaciona con
el número de células vivas en la cámara de reacción; una reducción
de la tasa de acidificación refleja números reducidos de células
supervivientes.
En este ejemplo, las células
HT-29 se sembraron en placa a 4 x 10^{5}
células/cámara en un medio que contenía un 10% de suero de ternera
fetal. Tras 16 - 18 horas, el nivel de suero se redujo hasta el 1% y
las células se mantuvieron durante otras 18 horas. Las células se
expusieron entonces, o bien a ácido etacrínico (50 \muM), a TER199
(20 \muM) o a un vehículo (etanol al 0,1%) durante 4 horas. El
medio se sustituyó entonces por medio de baja capacidad tamponante
libre de suero y se inició el análisis en el Microphysiometer. La
mitad de las cámaras se expusieron a clorambucilo 100 \muM y la
otra mitad a vehículo (etanol al 0,1%). Las tasas de acidificación
se monitorizaron durante 16 horas y los datos se expresaron como
porcentaje de las tasas de acidificación basales (100%).
Los resultados se muestran en la figura 2. Ni el
éster dietílico de
\gammaE-C(Bz)-\varphiG
(TER199) ni el ácido etacrínico solo tuvieron ningún efecto
apreciable sobre las tasas de acidificación; sin embargo, tanto el
pretratamiento con ácido etacrínico como el pretratamiento con
TER199 potenciaron el efecto del clorambucilo. En la figura, los
símbolos blancos reflejan la ausencia de adición de clorambucilo;
los símbolos negros reflejan la adición de clorambucilo; los
cuadrados reflejan el pretratamiento con vehículo, los triángulos el
pretratamiento con ácido etacrínico y los círculos el pretratamiento
con TER199.
Los compuestos usados en la invención, cuando se
esterifican de manera que puedan penetrar en las células, también
estimulan la producción de precursores de GM en la médula ósea,
cuando se administran a sujetos mamíferos. Como un ensayo
ilustrativo, se trataron tres ratones B6D2F_{1} con diversas dosis
de PG de bencilo por vía intraperitoneal. Se extrajeron médulas
óseas femorales 24 horas después y se sometieron a ensayo para
determinar las GM-CFU mediante el método de East,
C.J. et al. Cancer Chemother Pharmacol (1992)
31:123-126. Se obtuvo un aumento en el número
de colonias de manera dependiente de la dosis hasta una dosis de 90
mg/kg de TER199. Estos resultados se muestran en la figura 3. A 90
mg/kg, se obtuvieron aproximadamente 275 colonias/10^{4} células
nucleadas, en comparación con aproximadamente 140 colonias/10^{4}
células nucleadas para los controles.
Se dividieron ratones macho B6D2F_{1}, de cinco
semanas de edad, de 20 - 24 gramos, en grupos de tres ratones y se
les administraron diversas dosis de TER199, o bien por vía oral o
por vía intraperitoneal. El TER199 se preparó en agua Nanopore
estéril y se administró por vía oral usando un tubo de alimentación
por sonda nasogástrica y una jeringa de 1 cc, o por vía
intraperitoneal en solución salina usando una jeringa de 1 cc con
una aguja de calibre 28. A los ratones en el grupo control se les
inyectó agua o solución salina. Se extrajeron células de la médula
ósea 24 horas después del tratamiento con el fármaco y se añadieron
a medio esencial mínimo alfa (MEM alfa) complementado con
metilcelulosa (0,8% p/v), suero bovino fetal (20% v/v), BSA
(albúmina de suero bovino) desionizada (1% p/v), medio acondicionado
de células de bazo estimulado con mitógeno Pokeweed
(PWM-SCCM)^{1} (10% v/v) y gentamicina (50
Tg/ml). Se sembraron en placa alícuotas de un ml (placas por
cuadruplicado) y se incubaron durante siete días a 370ºC. Se utilizó
un microscopio de disección para contar las colonias de granulocitos
/ macrófagos que tenían más de 50 células por colonia
(GM-CFU).
La figura 4a muestra el efecto de la
administración oral frente a la i.p. de TER199 sobre las
GM-CFU de médula ósea en un único tratamiento. Los
datos son medias \pm EEM (error estándar de la media) para tres
ratones por grupo. El asterisco indica que el valor es
estadísticamente significativo a partir del control, P < 0,05.
Tal como se muestra en la figura 4a, la administración i.p.
(cuadrados negros, \ding{110}) es más eficaz a 60 - 90 mg/kg; la
administración oral (círculos negros, \bullet) es más eficaz a 120
- 180 mg/kg. Los resultados muestran que los compuestos usados en la
invención pueden administrarse tanto por vía oral como i.p., aunque
pueden requerirse niveles de dosis más elevada para la
administración oral.
La figura 4b muestra los resultados de un
experimento adicional e incluye la administración i.v. Se obtienen
resultados similares.
Los procedimientos del ejemplo 5 se repitieron
usando una única dosis de 60 mg/kg de TER199 administrada por vía
i.p. el día 0 y extrayendo células de la médula ósea en varios
momentos tras la administración. Las GM-CFU para los
ratones a los que se administró TER199 se compararon con las de los
controles, y los resultados se muestran como una función del día
tras la administración en la figura 5. La estimulación máxima
pareció producirse en el día 2 y el día 5.
Se evaluó el efecto de TER199 sobre la formación
de colonias por las células precursoras de granulocitos - macrófagos
(CFU-GM), eritroides (BFU-E) y
pluripotenciales (CFU-GEMM). TER199 intensifica la
proliferación de células precursoras mieloides humanas y murinas
in vitro. Los efectos son dependientes de la dosis,
normalmente en el intervalo de 1,0 a 10,0 \muM y en la mayoría de
los casos para las células estimuladas por GM-CSF,
G-CSF, M-CSF,
Flt3/Flk-2 y factor Steel (factor de célula madre /
ligando para c-kit). De particular interés fue el
hallazgo de que TER199 potencia la formación de colonias estimulada
por combinaciones de citocinas. Además, el efecto potenciador es más
pronunciado en la médula ósea de humanos que de ratones. Estos
resultados indican que TER199 tiene efectos potenciadores en
múltiples linajes de células madre mieloides y precursores. Que haya
un efecto mayor sobre la médula humana es coherente con la
especificidad de TER199 por la isoenzima P1-1 de
GST. Los resultados de un conjunto representativo de estos
experimentos se presentan en las tablas 4 - 9.
\newpage
| ^{*}Estadísticamente significativo |
| ^{*}estadísticamente significativo | |
| Sólo colonias formadas cuando se añadía Flt-3 o SLF juntas o con GM-CSF, G-CSF o IL-3. |
| ^{*}Estadísticamente significativo |
| ^{*}Estadísticamente significativo | |
| \daggerPWMSCM = medio condicionado de células del bazo estimulado con mitrógeno Pokeweed. |
Las tablas 8 y 9 muestran los resultados de un
experimento diseñado para comparar los resultados obtenidos cuando
TER199 estaba en contacto con células precursoras eritroides y
pluripotenciales de la médula ósea humana, a diferencia de sus
homólogos murinos. Tal como se muestra en estas tablas, los efectos
ex vivo en humanos (tabla 8) son sustancialmente mayores que
los mostrados en sus homólogos murinos (tabla 9).
| ^{*}Aumento significativo en comparación con el control, p < 0,05 |
El efecto de TER199 (90 mg/kg/día x 5 i.p.) sobre
los recuentos en sangre periférica se evaluó en ratas derivadas
Sprague-Dawley. Las ratas se dividieron en dos
grupos y a cada grupo se le extrajo sangre en días alternativos. Los
recuentos medios de leucocitos totales, linfocitos absolutos y
neutrófilos absolutos aumentaron durante el periodo del estudio. Los
datos representativos se presentan en la figura 6. TER199 produce un
aumento de dos veces en los niveles de leucocitos circulantes en
ratas. No hubo cambio significativo en los recuentos de eritrocitos
ni de plaquetas, con la excepción de una disminución media en el
recuento de plaquetas en el día 9 (datos no mostrados). Además,
TER199 no pareció tener ningún efecto perjudicial en estos
animales.
También se determinó el efecto sobre la
diferenciación de la médula ósea por parte de diversos derivados y
análogos estructurales de TER199 como una función del nivel de
dosificación. Se extrajo la médula ósea 24 horas después de la
administración de los compuestos y se midieron los niveles de
GM-CFU tal como se describió anteriormente. La
figura 7 muestra que el éster dietílico (TER199) es
significativamente más eficaz que el éster-amida
mixto (TER300) porque el compuesto no esterificado correspondiente
no es eficaz. En la figura 7, los triángulos blancos (\Delta)
representan el compuesto no esterificado (TER117); los círculos
blancos (\ding{109}) representan el éster-amida
mixto (TER300). Los cuadrados blancos (\boxempty) representan los
resultados con el éster dietílico, TER199. Se sabe que el
éster-amida mixto, TER300, se metaboliza más
lentamente que TER199. El metabolismo de TER300 produce TER117. Los
resultados en la figura 7 concuerdan con la incapacidad de TER117
para entrar en las células y con el metabolismo más lento de
TER300.
La figura 8 muestra los resultados de
experimentos similares para TER199 y sus análogos. Los cuadrados
blancos (\boxempty) representan TER199; los círculos blancos
(\ding{109}) representan TER183 en el que el grupo bencilo en
TER199 está sustituido por octilo y \varphiG por G. Los rombos
blancos (\lozenge) y los triángulos blancos (\Delta) representan
los compuestos inactivos TER317 y TER206, respectivamente; en
TER317, la fenilglicina de TER199 está sustituida por
(S+)fenilalanina; en TER206 el bencilo de TER199 está sustituido por
naftilo y la fenilglicina por glicina.
Estos resultados se correlacionan con la
selección como diana de la isoenzima de la GST P1-1
por TER199 y TER183, tal como se muestra en la tabla 10, aunque
TER183 es un mejor inhibidor de A1-1 que de
P1-1.
| ^{*}determinado en la forma no esterificada | |
| ^{**}potenciación de la diferenciación de la médula ósea. |
A los ratones macho B62F_{1} descritos en el
ejemplo 5 se les administraron 75 mg/kg de
5-fluorouracilo (5-FU) preparado en
solución salina estéril al 0,9% y administrados por vía i.p. A los
ratones, en grupos de tres, se les inyectó i.p. 60 mg/kg de TER199
en agua estéril, o bien simultáneamente con la administración de
5-FU, 24 horas antes, 1 hora antes, o 24 horas
después de la administración de 5-FU. El grupo
control no se trató con ningún fármaco. Las médulas óseas se
extrajeron y se determinaron las GM-CFU 24 horas
después de la inyección final. Los resultados de consenso se
muestran en la figura 9a. TER199 a -24 h; a 1 h; y a +24 h significa
que TER199 se administró 24 horas antes, 1 hora antes o 24 horas
después de 5-FU, respectivamente. El tratamiento con
5-FU sólo reduce las GM-CFU hasta el
15% de los ratones control. TER199 disminuye significativamente la
supresión de GM-CFU inducida por
5-FU. La inyección simultánea de TER199 con
fluorouracilo da como resultado un aumento de cuatro veces en el
número de GM-CFU por fémur, en comparación con la
inyección de fluorouracilo solo. La inyección de TER199, 24 horas
después del fluorouracilo, da como resultado valores mayores que el
control de los recuentos de GM-CFU por fémur.
La administración de TER199 tal como se describió
anteriormente 24 horas después de la administración de
5-FU aceleró la recuperación de las células de la
médula ósea y dio como resultado en última instancia la estimulación
de esta capacidad por encima de los controles a los que no se
administró 5-FU. Estos resultados se resumen en la
figura 9b que muestra que hacia el día 4 después de la
administración de 5-FU, los ratones a los que se
administró 5-FU sólo (barra, negra, \ding{122})
mostraron GM-CFU aproximadamente iguales que el
control, mientras que los que habían recibido TER199 además de
5-FU (barra sombreada, 100 )
mostraron GM-CFU aproximadamente el doble que el
control. Experimentos similares, pero administrando TER199 24 horas
antes de 5-FU no tuvieron esencialmente ningún
efecto sobre GM-CFU, tal como se muestra en la
figura 9c.
También pudieron obtenerse los efectos de TER199
administrado 24 horas después de la inyección de
5-FU mediante una vía i.p. cuando TER199 se
administró por vía oral. Se extrajo la médula ósea 48 horas después
de la administración de 75 ó 150 mg/kg de 5-FU por
vía i.p. Cuando se administró 24 horas después de
5-FU (75 ó 150 mg/kg i.p.), TER199 (150 mg/kg v.o.)
produce un aumento de dos veces en GM-CFU en la
dosis inferior de 5-FU (el 90% frente al 47% del
control), y un aumento de nueve veces con la dosis superior (el 75%
frente al 8%); véase la figura 9d. Los valores son la media \pm DE
de tres ratones por punto.
El efecto de una única dosis v.o. o i.p. de
TER199 se evaluó por su capacidad para reducir la supresión de
GM-CFU inducida por cisplatino en ratones. TER199
(60 mg/kg i.p.) se administró 24 horas antes, una hora antes, o
simultáneamente con cisplatino (15 mg/kg i.p.). Se extrajeron las
médulas óseas 24 horas después de la administración de cisplatino.
Los valores de GM-CFU son la media \pm DE de tres
ratones por punto. La figura 10 muestra que la administración
anterior de TER199 aumenta las GM-CFU, en
comparación con la administración de cisplatino solo (figura 10). La
inyección de TER199 24 horas antes del cisplatino da como resultado
un aumento de dos veces en el número de GM-CFU por
fémur, en comparación con la inyección de cisplatino sólo (el 62%
frente al 31% del control).
El experimento presentado en la figura 11 muestra
el efecto de la administración oral de TER199 24 horas antes del
tratamiento o 24 horas después del tratamiento sobre la supresión de
GM-CFU inducida por cisplatino. Las médulas óseas se
extrajeron 24 horas después de la administración del segundo
fármaco. Los valores son la media \pm DE de tres ratones por
punto. Cuando se administra por vía oral 24 horas antes del
cisplatino (20 mg/kg i.p.), TER199 (150 mg/kg v.o.) da como
resultado casi un aumento de cuatro veces en GM-CFU
(el 52% frente al 14% del control). La administración de TER199 24
horas después del cisplatino da como resultado un aumento de 2,5
veces en GM-CFU (el 40% frente al 14%). Estos
resultados indican que TER199 puede ser útil en la prevención y el
tratamiento de la neutropenia inducida por cisplatino.
El efecto de TER199 sobre la reducción de la
supresión de GM-CFU inducida por carboplatino se
determinó en experimentos similares a los descritos anteriormente.
TER199 (120 mg/kg, i.p.) se administró 24 horas antes, 24 horas
después o simultáneamente con carboplatino (90 mg/kg, i.p.). Las
médulas óseas se extrajeron 24 horas después de la administración
del segundo fármaco. La figura 12, panel A, muestra que TER199
reduce la supresión de GM-CFU inducida por
carboplatino en ratones. Los valores mostrados son la media \pm DE
de tres ratones por punto. La figura 12, panel B, muestra que la
administración oral de TER199 (150 mg/kg, v.o.) es incluso más
eficaz.
La figura 13, panel A, muestra que la
administración de TER199 (120 mg/kg, i.p.), 24 horas después de
ciclofosfamida (200 mg/kg, i.p.) reduce la supresión de
GM-CFU en ratones. La administración oral de TER199
(150 mg/kg, v.o.) es similarmente eficaz (véase la figura 13, panel
B). Los valores mostrados son la media \pm DE de tres ratones por
punto.
El efecto de TER199 sobre la reducción de la
supresión de GM-CFU inducida por melfalán se
determinó en experimentos similares a los descritos anteriormente.
La inyección con melfalán (10 mg/kg i.p.) solo da como resultado que
sólo quede el 2% de GM-CFU. La adición de TER199 (90
mg/kg i.p.) administrado 1 hora antes del melfalán aumenta las
GM-CFU cuatro veces hasta el 8% del valor control
(datos no mostrados).
\newpage
Se evaluó el efecto de TER199 por su capacidad
para disminuir el grado y acortar la duración de la supresión
hematológica producida por 5-FU. Ratas derivadas
Sprague-Dawley se trataron según el programa
siguiente (tabla 11). Los resultados de este estudio se presentan en
la figura 14.
La respuesta en los niveles de leucocitos,
neutrófilos y linfocitos en los grupos tratados con TER199 alcanzó
los niveles anteriores a la prueba antes que el grupo tratado con
5-FU y en el día 12 superó los niveles anteriores a
la prueba. Las diferencias de patrón en estas respuestas para cada
una de estas poblaciones celulares para los grupos tratados con
TER199 fueron significativamente diferentes del grupo control
tratado con 5-FU (p < 0,05). Estos datos
demuestran que, en ratas, los niveles de población de leucocitos,
neutrófilos y linfocitos en el aporte de sangre periférica suprimida
por 5-FU, se recuperaron y alcanzaron los niveles
anteriores a la prueba más rápidamente tras el tratamiento con
TER199 en comparación con los animales tratados con placebo.
En los animales tratados con TER199, los niveles
de plaquetas se recuperaron hasta los niveles normales hacia el día
12 del estudio. Por el contrario, los niveles de plaquetas de los
animales control con 5-FU permanecieron gravemente
suprimidos. Esta respuesta para las plaquetas en los grupos tratados
con TER199 fue significativamente diferente del grupo control
tratado con 5-FU (p < 0,05).
Los recuentos de eritrocitos disminuyeron
continuamente en todos los grupos durante el transcurso de este
estudio. Aunque la disminución observada se reduce en los animales
tratados con TER199 en comparación con los animales control con
5-FU, el estudio se terminó demasiado pronto como
para determinar si la disminución reducida es un retraso o una
reducción real en el punto más bajo.
Al protocolo de tratamiento de la administración
de 150 mg/kg de 5-FU i.p. le siguió 24 horas después
una dosis oral de 150 mg/kg de TER199 o un vehículo en los
controles, seguido 48 horas después por la administración de
5-FU que se repitió con grupos adicionales de seis
ratones cada uno. A los ratones se les extrajo sangre a través del
plexo retroorbital y las muestras de sangre se analizaron para
determinar los cambios en los hemogramas. Los resultados en la
figura 15a - 15d muestran los hemogramas de diversos tipos de
células para la administración de 5-FU sólo
(círculos blancos, \ding{109}) o 5-FU más TER199
(círculos negros, \bullet). La figura 15a muestra los resultados
para los recuentos de leucocitos totales; esencialmente no se
encontró diferencia significativa. La figura 15b muestra los
resultados para los neutrófilos; se obtuvo una diferencia
estadísticamente significativa sólo en el día 9. La figura 15c
muestra los resultados para los linfocitos; no se encontraron
diferencias. La figura 15d muestra los resultados para monocitos;
hubo una diferencia estadísticamente significativa sólo en el día
9.
Se establecieron cultivos de células del estroma
humanas a partir de médula ósea humana obtenida recientemente, tal
como se describe por East, C.J. et al., Blood 5: 1172
(1992). En el día 2, las células se expusieron durante una hora a
100 \muM de TER199; el medio de cultivo se eliminó y se sustituyó
con medio nuevo, y 24 y 48 horas después, los sobrenadantes del
cultivo se recogieron y se probaron para determinar la presencia de
interleucina 1 (IL-1). Los resultados se muestran en
la tabla 12. Los niveles de IL-1 fueron más de dos
veces las de los controles en los puntos de tiempo de 24 y 48
horas.
Células CD34^{+++} sumamente purificadas
procedentes de sangre del cordón umbilical o de la médula ósea
humanos sembradas en placa a 300 células/ml se trataron con diversas
concentraciones de TER199 en presencia de diversas citocinas. La
figura 16 muestra el efecto de las concentraciones de 0,1 \muM -
10 \muM de TER199 en la formación de colonias de granulocitos -
eritrocitos - macrófagos - megacariocitos (CFU-GEMM)
en presencia de 1 unidad/ml de eritropoyetina recombinante, 100
unidades/ml de IL-3 recombinante y 50 ng/ml de
factor Steel recombinante. La figura 16 también muestra el efecto de
estas concentraciones de TER199 sobre las células precursoras de
eritrocitos (BFU-E) en presencia de 1 unidad/ml de
eritropoyetina recombinante y 100 unidades/ml de
IL-3 recombinante. Tal como se muestra, estas
concentraciones tienen efectos positivos moderados tanto sobre
CF-GEMM como sobre BFU-E incluso en
la concentración inferior (0,1 \muM) de TER199. Estos resultados
parecen concordar en lo que concierne a dos donantes
individuales.
En la figura 17 se muestra el esquema global para
la síntesis de TER199.
TER199 es un polvo blanco esponjoso con un punto
de fusión de 145 - 150ºC que tiene la configuración L nativa para
los residuos de cisteína y \gamma-glutamilo y la
forma D de la fenilglicina. Cuando se sintetiza mediante el método
mostrado en la figura 17, el producto obtenido se analiza utilizando
técnicas estándar para confirmar su identidad.
Claims (10)
1. Uso de un compuesto de fórmula
(1)YCO ---
N
\delm{H}{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- X}}CHCO ---
G^{*}o un éster, amida, éster/amida o
sal del
mismo,
en la que YCO es \gamma-glu o
\beta-asp;
G* es fenilglicina o glicina;
Z es CH_{2}, O o S; y
X es un radical hidrocarbonado
C_{1-20};
para la fabricación de un medicamento para
modular la hematopoyesis en la médula ósea, la sangre periférica, o
una fracción de ellas, en el que dicho medicamento ha de
administrarse por vía oral.
2. Uso de un compuesto de fórmula
(1)YCO ---
N
\delm{H}{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- X}}CHCO ---
G^{*}o un éster, amida, éster/amida o
sal del
mismo,
en la que YCO es \gamma-glu o
\beta-asp;
G* es fenilglicina o glicina;
Z es CH_{2}, O o S; y
X es un radical hidrocarbonado
C_{1-20};
o de un medicamento que comprende el compuesto,
para la fabricación de un medicamento para ejercer un efecto
protector frente a los efectos destructivos de un agente
quimioterápico o radiación administrados a un sujeto, en el que
dicho medicamento ha de administrarse por vía oral.
3. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que el éster, amida, o éster amida es
un alquil (1 - 10 C), alquenil (1 - 10 C) o arilalquil (7 - 12 C)
monoéster, diéster, monoamida, diamida o híbrido de éster/amida.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el residuo de aminoácido YCO en el
compuesto de fórmula (1) está en la configuración L, el residuo
NHCH(CH_{2}ZX)CO está en la configuración L y la
fenilglicina está en la configuración D.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que el
compuesto es
\gammaE-C(Bz)-R-(-)-\varphiG,
o una forma éster, amida, éster/amida o sal del mismo.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el
compuesto es \gammaE-éster
etílico-C(Bz)-R-(-)-\varphiG-éster
etílico, o una forma de sal del mismo.
7. Composición farmacéutica en forma farmacéutica
unitaria que contiene, como principio activo, una cantidad eficaz
del compuesto de fórmula (1) tal como se define en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 en mezcla con un excipiente
farmacéuticamente aceptable, que está en la forma de un comprimido,
píldora, cápsula, jarabe, polvo o líquido con sabor.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, en la que el residuo de aminoácido YCO en el
compuesto de fórmula (1) está en la configuración L, el residuo
NHCH(CH_{2}ZX)CO está en la configuración L y la
fenilglicina está en la configuración D.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8, en la que el compuesto de fórmula (1) es
\gammaE-C(Bz)-R-(-)-\varphiG,
o una forma éster, amida, éster/amida o sal del mismo.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9, en la que el compuesto de fórmula (1) es
\gammaE-éster
etílico-C(Bz)-R-(-)-\varphiG-éster
etílico, o una forma de sal del mismo.
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