ES2232812T3 - Serina proteasas resistentes a inhibidores. - Google Patents

Abstract

PROTEASAS DE SERINA DE LA SUPERFAMILIA QUIMIOTRIPSINA SE MODIFICAN, DE FORMA QUE EXHIBEN RESISTENCIA A LOS INHIBIDORES DE PROTEASAS DE SERINA. SI TALES PROTEASAS DE SERINA MODIFICADA TIENEN PROPIEDADES FIBRINOLITICAS, TROMBOLITICAS, ANTITROMBOTICAS O PROTROMBOTICAS, SON UTILES EN EL TRATAMIENTO DE ESTADOS O ENFERMEDADES DE COAGULACION SANGUINEA.

Description

Serina proteasas resistentes a inhibidores.

La presente invención se refiere a serina proteasas de la superfamilia de las quimotripsinas que se han modificado de manera que muestran resistencia a los inhibidores de la serina proteasa. La invención también se refiere a los precursores de tales compuestos, su preparación, al ácido nucleico que las codifica y a su uso farmacéutico.

Las serina proteasas son endopeptidasas que usan serina como el nucleófilo en la escisión del enlace de péptidos. Existen dos superfamilias conocidas de serina proteasas y éstas son la superfamilia de la quimotripsinas y la superfamilia de la subtilisina de Streptomices (Barrett, A. J., en Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A. J. y col., Elsevier, Ámsterdam, pp. 3 - 22 (1986) y James, M. N. G., en Proteolysis and Physiological Regulation, Ed. Ribbons, D. W. y col., Academic Press, Nueva York, pp. 125 - 142 (1976).

La presente invención se refiere particularmente a las serina proteasas de la superfamilia de las quimotripsinas que incluye compuestos tales como plasmina, activador de plasminógeno de tejidos (t - PA), activador de plaasminógeno de tipo uroquinasa (u - PA), tripsina, quimotripsina, granzima, elastasa, acrosina, tonina, mieloblastina, antígeno específico de próstata (PSA), gamma - renina, triptasa, serina proteasas de veneno de serpiente, adipsina, proteína C, catepsina G, componentes C1R, C1S y C2 de complemento, factores B, D e I de complemento, quimasa, hepsina, medulasina y proteínas de la cascada de la coagulación de la sangre incluyendo calicreína, trombina, y factores VIIa, IXa, XIa y XIIa. Los miembros de la superfamilia de las quimotripsinas tienen homología de aminoácidos y estructural de los dominios catalíticos, aunque una comparación de las secuencias de los dominios catalíticos revela la presencia de inserciones o supresiones de aminoácidos.

Sin embargo estas inserciones y supresiones mapean la superficie de la molécula plegada y así no afecta la estructura básica aunque es probable que contribuyan a la especificidad de interacciones de la molécula con sustratos e inhibidores (Strassburger, W. y col., FEBS Lett., 157, 219 - 223 (1983)).

Los inhibidores de la serina proteasa se conocen bien y se dividen en las siguientes familias: la familia de los inhibidores de la tripsina pancreática bovina (BTPI), la familia Kazal, la familia de la affa - 2 macroglobulina (A2M), la familia de los inhibidores de la subtilina de Streptomyces (SSI), la familia de las serpinas, la familia de Kunitz, la familia del núcleo de de cuatro disulfuros, la familia de los inhibidores de patata y la familia de Bowman - Birk.

Los inhibidores de las serina proteasas inhiben sus serina proteasas afines y forman complejos estables 1:1 con estas proteasas. Los datos estructurales están disponibles para varios complejos proteasa - inhibidor incluyendo tripsina - BTPI, inhibidor de quimotripsina - ovomucoide e inhibidor de quimotripsina - patata (Read, R. J. y col., en: Proteinase Inhibitors, Ed. Barreto, A. J. y col., Elsevier, Ámsterdam, pp. 301 - 336 (1986)). Una característica estructural que es común a todos los inhibidores de serina proteasas es un bucle que se extiende desde la superficie de la molécula que contiene la secuencia de reconocimiento para el sitio activo de la serina proteasa afín y, de hecho, existe una notable similitud en las interacciones específicas entre los diferentes inhibidores y sus serina proteasas análogas, a pesar de las diversas secuencias de los inhibidores.

Las serina proteasas de la superfamilia de las quimotripsinas juegan un papel importante en la fisiología humana y animal. Alguno de los inhibidores de las serian proteasas más importantes son los que están implicados en la coagulación sanguínea y fibrinolisis. En el proceso de coagulación sanguínea, una cascada de las actividades enzimáticas está implicada en al generación de una red de fibrina que forma el marco conservado de un coágulo o trombo. La degradación de la red de fibrina (fibrinolisis) implica el inhibidor de proteasa plasmina. La plasmina se forma en el cuerpo a partir de su plasminógeno de precursor inactivo mediante la escisión del enlace peptídico entre arginina 561 y valina 562 de plasminógeno. Esta reacción está catalizada por t - PA o por u - PA.

En el balance entre la coagulación y los sistemas fibrinolíticos se llega a alterar localmente, los coágulos intravasculares se pueden formar en localizaciones inapropiadas que conducen a condiciones tales como trombosis coronaria e infarto de miocardio, trombosis de vena profunda, accidente cerebrovascular, oclusión arterial periférica y embolia. Una forma conocida de tratar tales afecciones es administrar a un paciente una serina proteasa de la superfamilia de las quimotripsinas o el precursor de tal enzima. Por ejemplo, t - PA, u - PA y plasminógeno en la forma de plasminógeno anisolado formando complejo con estreptoquinasa se usan en el tratamiento de infarto de miocardio; el plasminóegno se usa para complementar el nivel de plasminógeno circulatorio natural para potenciar la terapia trombolílica; y la proteína C se usa como un agente antitrombótico. Las serina proteasas de la superfamilia de las quimotripsinas, por ejemplo, los factores VIIa y IX, se administran para inducción de la coagulación sanguínea en trastornos tales como hemofilia. Un problema importante con el uso de todos estos agentes en este tipo de terapia es su rápida neutralización mediante los inhibidores de las serina proteasas que reduce la eficacia de la terapia e incrementa la dosis de agente requerida. Por lo tanto sería ventajoso desarrollar análogos modificados de estas endopeptidasas que son resistentes a la inactivación mediante los inhibidores de las serina proteasas mientras mantienen su actividad. Sin embargo, no es fácil predecir modificaciones que darán como resultado un aumento de resistencia a la inhibición sin descenso significativo en al actividad de las endopeptidasas.

El documento WO - A - 9010649 describe las serina proteasas de la superfamilia de las quimotripsinas que se han modificado y que se dice que tienen resistencia incrementada a los inhibidores de las serian proteasas. Los autores de ese documento han estudiado la estructura conocida del complejo entre tripsina y BPTI y han reconocido que, aparte de los aminoácidos en el sitio de reconocimiento principal, los aminoácidos de tripsina que forman el contacto directo con BPTI se localizan en la región entre los residuos 37 y 41 en la región entre los residuos 210 y 213 de la cadena polipeptídica. Por lo tanto los inventores han extrapolado a partir de esto basándose en que existe un alto grado de homología estructural entre los dominios catalíticos de las serina proteasas y han sugerido que una mutación de un residuo en cualquier serina proteasa equivalente al residuo Tyr - 39 en tripsina conduciría a un aumento de resistencia de los análogos modificados comparado con la serina proteasa de tipo salvaje. También sugieren que los análogos de t - PA resistentes a la inhibición se pueden realizar por mutación de un tramo adicional de siete aminoácidos que se produce en tPA, pero no en tripsina, adyacente al punto de contacto predicho en Arg - 304 (equivalente a Tyr - 39 de tripsina). Sin embargo, aunque los dominios catalíticos de los miembros de la superfamilia de quimotripsina de las serina proteasas, en general, tienen homología estructural y de secuencias, Tyr - 39 de tripsina está en una estructura de bucle sobre la superficie de la proteína y, como se muestra en la figura 1, las regiones equivalentes de otras serina proteasas son altamente variables dentro de la superfamilia. De hecho, esto se reconoce en el documento WO - A - 9010649. Por lo tanto, no es evidente mediante ningún medio que la conformación específica del bucle en esta región de la proteína se conserve entre diferentes serina proteasas, especialmente en los casos donde el número de residuos en el bucle difiere, como es el caso de tripsina y plasmina. Así pues, aunque los residuos en la región se pueden alinear secuencialmente debido al alineamiento de sus regiones flanqueantes que no tienen secuencias similares, no es del todo evidente que sus cadenas laterales estén en localizaciones espaciales equivalentes y, por lo tanto, los residuos que son equivalente en un alineamiento de secuencias no necesariamente son capaces de formar interacciones equivalentes en la proteína plegada. Si se toma la plasmina como ejemplo, se puede observar en la figura 1 que existen tres residuos hidrófobos (Phe - 22, Met - 24 y Phe - 26) que podrían estar implicados en una interacción similar hidrófoba a la de

\hbox{Tyr -}

39 en el complejo tripsina/BPTI. La numeración de los residuos de plasmina recién mencionados es la numeración de la SEC IID Nº: 2 que muestra el dominio proteasa de la plasmina. El residuo designado 1 en la SEC ID Nº 2 está en la posición 562 de la proteína madura. Un estudio de la figura 1 muestra que cualquiera de estos residuos podría ser equivalente a Tyr - 39 de tripsina que se produce en la posición 29 en la numeración de la figura 1. Evidentemente, por lo tanto, el procedimiento descrito en el documento WO - A - 9010649 para diseñar una proteasa que es resistente a la inhibición no es totalmente fiable y debería ser preferible diseñar mutantes resistentes a la inhibición de una forma diferente.

Los presentes inventores se han dado cuenta que, debido a que los inhibidores de las serina proteasas son estructuralmente homólogos en su bucle central activo y forman interacciones similares con sus serina proteasas homólogas (Read, R. J. y col., en: Proteinase Inhibitors, Ed. Barret, A. J. y col., Elsevier, Ámsterdam, pp. 301 - 336 (1986)), las mutaciones en cualquier serina proteasa dada que dan como resultado resistencia a la inhibición mediante un inhibidor de las serina proteasas pueden ser aplicables a las mutaciones de residuos equivalentes espacial o secuencialmente en cualquier otro miembro de la superfamilia de las quimotripsinas.

La interacción entre enzima e inhibidor responsable de la inhibición de la actividad enzimática implica los aminoácidos del sitio catalítico de la enzima y los aminoácidos del sitio reactivo del inhibidor. Esta principal interacción se establece mediante otras interacciones entre las moléculas. Aunque existe una superficie de interacción comparativamente grande entre la proteasa y el inhibidor, el complejo proteasa/inhibidor se establece principalmente mediante unas pocas interacciones claves. Éstas se ejemplifican mediante las interacciones observadas en el complejo proteasa/inhibidor entre tripsina y BPTI (Huber, R, y col., J. Mol. Biol. 89: 73 - 101 (1974)), que sirve como modelo para la interacción entre los dominios catalíticos de otras serina proteasas y sus inhibidores homólogos. En el complejo tripsina/BPTI, los residuos claves de la proteasa, aparte de aquellos en el sitio de reconocimiento principal, que interactúan con el inhibidor son los residuos 37 - 41 y 210 - 213 (numeración de quimotripsina), con Tyr - 39 siendo el más importante. Esta interacción sirvió como la base para el documento WO - A - 9010649 en el que se identificaron los residuos equivalentes especialmente en el complejo t - PA/PAI - 1, y se describieron los mutantes resistentes a inhibidores.

En contraste a la descripción en el documento WO - A - 9010649, los presentes inventores han reconocido que la interrupción deseada de las interacciones proteasa/inhibidor que conducen a la resistencia a los inhibidores no necesitan producirse por mutación de los residuos específicos identificados en ese documento o sus equivalentes en otras serina proteasas. En cambio, los residuos en proximidad espacial, mejor que secuencial, a estos residuos claves, se pueden mutar dando como resultado un complejo menos estable entre la proteasa y el inhibidor.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una endopeptidasa modificada de la superfamilia de las quimotripsinas de las serina proteasas o un precursor de tal endopeptidasa, que es resistente a los inhibidores de la serina proteasa, caracterizado porque la modificación comprende la mutación de uno o más residuos en proximidad estrecha espacial (distinta de la proximidad secuencial) a un sitio de interacción entre la proteasa y el inhibidor de la proteasas afín.

En el contexto de esta invención, el término "precursor", cuando se usa en relación a una serina proteasa, se refiere a una proteína que se escinde mediante una enzima para producir una serina proteasa activa.

Las mutaciones que dan como resultado resistencia al inhibidor pueden inducir:

i)

un cambio conformacional en el pliegue local de la proteasa de manera que el complejo resultante con el inhibidor es menos estable que el complejo equivalente entre el inhibidor y la proteína de tipo salvaje;

ii)

un cambio en las orientaciones relativas de la proteasa e inhibidor en la formación de un complejo de manera que el complejo resultante es menos estable que el complejo equivalente entre el inhibidor y la proteína de tipo salvaje;

iii)

un cambio en la cantidad estérica de la proteasa en la región del sitio de unión al inhibidor de manera que el complejo resultante es menos estable que el complejo equivalente entre el inhibidor y la proteína de tipo salvaje;

iv)

un cambio en el cambio potencial electrostático en la región del sitio de unión al inhibidor de manera que el complejo resultante es menos estable que el complejo equivalente entre el inhibidor y la proteína de tipo salvaje; o

v)

cualquier combinación de lo anterior.

Los residuos a mutar no necesitan estar próximos secuencialmente a los residuos claves implicados en la interacción proteasa/inhibidor, ya que el plegamiento tridimensional de la cadena de proteasa lleva los residuos distantes secuencialmente en proximidad espacial. Es necesario seleccionar los residuos para mutación basándose en un modelo de bien la proteasa usada para generar el mutante, o de otro miembro de la superfamilia de las quimotripsinas de las serina proteasas. Cuando la estructura tridimensional de la proteasa a mutar se conoce, la selección de los residuos para mutación se puede basar bien en un modelo tridimensional de la proteína a mutar derivada usando modelado de homología u otras técnicas, o sobre los alineamientos de secuencias entre la proteína a mutar y otros miembros de la superfamilia de las quimotripsinas con estructuras tridimensionales conocidas. Si se emplean alineamiento de secuencias, no es necesario generar un modelo estructural dimensional de la proteasa de interés con el fin de seleccionar residuos para mutación que proporcionen resistencia a inhibidores, ya que la proximidad espacial a los residuos se puede inferir de las proteínas en el alineamiento con las estructuras tridimensionales conocidas. La relación espacial entre los residuos a mutar y los residuos claves en la interacción proteasa/inhibidor se puede inferir mediante cualquier procedimiento adecuado. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos adecuados.

La serina proteasa modificada puede ser cualquier serina proteasa de la superfamilia de las quimotripsina ya que todas estas enzimas tienen un mecanismo común de acción. Los ejemplos de los inhibidores de las serina proteasas que se pueden modificar según la presente invención son como sigue:

plasmina, activador de plasminógeno de tejidos (T - PA), activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (u - PA), tripsina, quimotripsina, granzima, elastasa, acrosina, tonina, mieloblastina, antígeno específico de próstata (PSA), gamma - renina, triptasa, serina proteasas de veneno de serpiente, adipsina, proteína C, catepsina G, componentes C1R, C1S y C2 de complemento, factores B, D e I de complemento, quimasa, hepsina, medulasina y proteínas de la cascada de la coagulación de la sangre incluyendo calicreína, trombina, y factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa.

Sin embargo, los análogos modificados de plasmina, t - PA, u - PA, proteína C activada, trombina, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor XIa y factor XIIa son particularmente útiles, ya que es una versión modificada de plasminógeno, puesto que todos estos compuestos se pueden usar como agentes fibrinolíticos o trombóticos. Un análogo de plasmina resistente a la inhibición se prefiere particularmente.

El inhibidor de la serina proteasa al que la serina proteasa modificada de la invención es resistente dependerá obviamente de qué serina proteasas se han modificado. En el caso de plasmina, el inhibidor fisiológico primario es \alpha2- antiplasmina que pertenece a la familia de las serpinas de los inhibidores de las serina proteasas. La reacción entre plasmina y \alpha2-antiplasmina consta de dos etapas: una reacción muy rápida reversible entre el sitio de unión de lisina kringle 1 de plasmina y la región carboxi - terminal del inhibidor, seguido de una reacción entre el sitio catalítico de la plasmina y el sitio reactivo del inhibidor que da como resultado la formación de un complejo estequiométrico enzimáticamente inactivo 1: 1 (Holmes, W. E. y col., J. Biol. Chem., 262, 1659 - 1664 (1987)). Por lo tanto, cuando la serina proteasa es plasmina, es particularmente útil si el inhibidor de la serina proteasa al que es resistente la plasmina sea \alpha2-antiplasmina. La plasmina también se inhibe por la \alpha2- macroglobulina y \alpha1-antitripsina y resistencia a la inhibición por estos inhibidores es también útil.

A partir de un modelo tridimensional del complejo plasmina/antiplasmina, (descrito en el procedimiento 1), se ha determinado que, en plasmina, los residuos que están en estrecha proximidad espacial a los residuos clave de la interacción entre la proteasa y el inhibidor son los residuos 17 - 20, 44 - 54, 62, 154, 158, 198 - 213. La numeración usada anteriormente es el sistema de numeración de la SEC ID Nº: 2 que representa el dominio proteasa de plasmina y comienza en la posición 562 de la proteína madura. Con el fin de que sea resistente a la inhibición mediante un inhibidor de la serina proteasa tal como \alpha2-antiplasmina, es necesario modificar la plasmina en la posición 45, 62 y 158. La resistencia a la inhibición de la proteasa se puede inducir en otras serina proteasas de la superfamilia de quimotripsinas modificando las regiones equivalentes de estas proteínas. La figura 1 muestra las secuencias de los dominios de proteasa de una diversidad de proteasas y, a partir de un estudio de la figura 1, es evidente donde se deben hacer las modificaciones con el fin de inducir resistencia a los inhibidores de proteasas. En el sistema de numeración de la figura 1, las regiones de modificación recientemente mencionados se producen en los residuos 45, 62 y 158. Los tipos de mutaciones que son adecuados para inducir resistencia a la inhibición incluyen sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos individuales o múltiples. Sin embargo, las sustituciones se aminoácidos son particularmente preferidas.

En la plasmina, los ejemplos de mutaciones de sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una respuesta modificada a la inhibición por la \alpha2-antiplasmina, usando el sistema de numeración de la SEC ID Nº: 2, son Glu - 62 a Lys o Ala, y Glu - 45 a Lys, Arg o Ala. La resistencia a la inhibición de proteasa se puede inducir en otras serina proteasas haciendo modificaciones en las posiciones equivalentes. El grado de resistencia a la inhibición se puede alterar haciendo bien mutaciones sencillas o múltiples en la proteasa, o alterando la naturaleza del aminoácido usado por sustitución.

Además de la modificación de la invención, la serina proteasa se puede modificar de otras maneras comparada con las proteínas de tipo salvaje. Cualquier modificación se puede realizar para la proteína con tal que no pierda su actividad.

Como alternativa a una serina proteasa modificada, es también posible modificar un precursor de la enzima de manera que la enzima derivada del precursor tendrá la resistencia deseada a la inhibición. Un ejemplo de un precursor de la serina proteasa es plasminógeno que es el precursor inactivo de la plasmina. La conversión de plasminógeno a plasmina se llevo a cabo mediante la escisión de la unión peptídica entre arginina 561 y valina 562 de plasminógeno. En condiciones fisiológicas esta escisión está catalizada por t - PA o u - PA. La escisión de una variante de plasminógeno modificado de la presente invención producirá una variante de plasmina como se ha descrito anteriormente y es, por supuesto, preferible que la variante de plasminógeno se escinda para producir una de las variantes de plasmina preferidas descritas anteriormente.

Igualmente, como con las serina proteasas, los precursores pueden tener otras modificaciones. El análisis de la molécula de plasminógeno de tipo salvaje ha revelado que es una glicoproteína compuesta de un dominio de serina proteasa, cinco dominios kringle y una secuencia N-terminal de 78 aminoácidos que se puede eliminar mediante escisión de la plasmina. La escisión mediante plasmina implica hidrólisis de los enlaces Arg (68) - Met (69), Lys (77) - Lys (78) o Lys (78) - Val (79) para crear formas de plasminógeno con un resto de metionina, lisina o valina N-terminal todos los cuales se denominan comúnmente como lys - plasminógeno. El plasminógeno intacto se denomina glu - plasminógeno debido a que tiene un resto glutámico N - terminal. La glicosilación se produce sobre los restos Asn (289) y Thr (346) pero la amplitud y composición son variables, conduciendo a la presencia de un número de formas de peso molecular diferentes de plasminógeno en el plasma. Cualquiera de las variantes de plasminógeno anteriores se puede modificar para producir una variante según la presente invención. Los estudios de secuenciación de proteínas de Sottrup - Jensen y col (en: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M. O.; ed.) 5 suplemento 3, p. 95 (1978)) indicó que el plasminógeno era una proteína de 790 aminoácidos y que el sitio de escisión era el enlace peptídico Arg (560) - Val (561). Una variante de plasminógeno que es adecuada para modificación según la presente invención es una proteína de 791 restos con un Ile extra en la posición 65 y codificada por el ADNc aislado por Forsgren y col., (FEBS Letters, 213, 254 - 260 (1987)). El dominio de serina proteasa de cualquiera de estos análogos de plasminógenos se pueden reconocer por su homología con las serina proteasas y tras la activación a plasmina es el dominio catalíticamente activo implicado en la degradación de fibrina. Los cinco dominios kringle son homólogos a aquellos en otras proteínas plasmáticas tales como tPA y protrombina y están implicados en la unión a fibrina y por lo tanto la localización de plasminógeno y plasmina a trombina.

Los análogos de plasminógenos de la presente invención también pueden contener otras modificaciones (comparadas con glu - plasminógeno de tipo salvaje) que pueden ser una o más adiciones, supresiones o sustituciones. Los ejemplos de análogos de plasminógenos adecuados se describen en las solicitudes de los inventores en tramitación con la presente WO - A - 9109118 y GB 9222758.6 y comprenden análogos de plasminógeno que se pueden escindir mediante una enzima implicada en coagulación sanguínea para producir plasmina activa. Estos análogos de plasminógeno pueden, según la presente invención, modificarse posteriormente de manera que, tras la escisión, la plasmina que se produce es resistente a la inhibición mediante inhibidores de resina proteasa tal como la \alpha2-antiplasmina. Otros análogos de plasminógenos que se pueden modificar para producir los análogos de plasminógeno de la presente invención son análogos porque han sido una adición, eliminación, sustitución o alteración de uno o más dominios kringle. Otros análogos de plasminógenos adecuados son variantes de Lys - plasminógeno en los que los aminoácidos 68, 77 ó 78 amino terminal se han suprimido. Tales variantes pueden haber potenciado la actividad de unión a fibrina ya que se ha observado para lys - plasminógeno comparado con glu - plasminógeno de tipo salvaje (Bok, R. A. y Mangel, W. F., Biochemistry, 24, 3279 - 3286 (1985)). También incluidos dentro del alcance de la presente invención están los análogos de plasminógenos pluralmente modificados que incluyen una o más modificaciones para prevenir, reducir o alterar los patrones de glicosilación. Tales análogos pueden tener una larga semivida, eliminación en plasma reducida y/o actividad específica más alta.

Las serina proteasas modificadas y los precursores de serina proteasas de la invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado y, en un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de tal serina proteasa o precursor de serina proteasa, el procedimiento comprendiendo el acoplamiento junto a los sucesivos restos de aminoácidos y/o oligopéptidos ligantes. Aunque las proteínas, pueden, en principio, sintetizarse completamente o parcialmente mediante procedimientos químicos, se prefiere prepararlos mediante traducción ribosomal, preferiblemente in vivo, de una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente. El procedimiento puede además incluir una etapa de glicosilación apropiada.

Para producir las proteínas de la invención se prefiere el uso de la tecnología de ADN recombinante. El ADN que codifica una serina proteasa de origen natural o precursor se puede obtener a partir de un ADNc o clon genómico o se puede sintetizar. Las sustituciones de aminoácidos, adiciones o supresiones se introducen preferiblemente mediante mutagénesis específica de sitio. Las secuencia de ADN que codifican glu - plasminógeno, lys - plasminógeno, otros análogos de plasminógeno y variantes de serina proteasa se pueden obtener mediante procedimientos familiares a los expertos en la técnica de síntesis por ingeniería genética.

El procedimiento para producir proteínas que usan tecnología de ADN recombinante usualmente incluirá las etapas de insertar una secuencia codificante adecuada en un vector de expresión y transferctar el vector en una célula hospedadora adecuada. Por lo tanto, en un tercer aspecto de la invención se proporciona un ácido nucleico que codifica una serina proteasa modificada como se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico puede ser bien ADN o ARN y puede estar en la forma de un vector tal como un plásmido, cósmido o fago. El vector se puede adaptar para transfectar o transformar células procarióticas, tales como células bacterianas y/o células eucarióticas, tales como células de levaduras o de mamíferos. El vector puede ser un vector de clonación o un vector de expresión y comprende un sitio de clonación y, preferiblemente, al menos un gen marcador. Un vector de expresión tendrá adicionalmente un promotor operativamente unido a la secuencia a insertar en la clonación en el sitio y, preferiblemente, una secuencia que permite que el producto de la proteína se secrete.

La mayoría de las proteínas de la presente invención, incluyendo moléculas tales como tPA, se pueden obtener fácilmente insertando la secuencia codificante en un vector de expresión como se ha descrito y transfectando el vector en una célula hospedadora adecuada que puede ser una bacteria tal como E. coli, un microorganismo eucariótico tal como levaduras o una célula eucariótica superior. Con moléculas tales como plasminógeno que son usualmente difíciles de expresarse, puede ser necesario usar un vector del tipo descrito en la solicitud de los inventores en tramitación con la presente, WO - A - 9109118, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la serina proteasa modificada, operativamente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene un fuerte promotor y secuencia potenciadora derivada de citomegalovirus humano, una tercera secuencia de aminoácidos que codifica una secuencia de poliadenilación derivada de SV40 y una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable expresado a partir de un promotor de SV40 y que tiene una señal de poliadenilación de SV40 adicional en el extremo 3' de la secuencia marcadora seleccionable. Tal vector puede bien comprender una molécula de ácido nucleico individual o una pluralidad de tales moléculas de manera que, por ejemplo, la primera, segunda y tercera secuencias puede estar contenida en una primera molécula de ácido nucleico y la cuarta secuencia puede estar contenida en una segunda molécula de ácido nucleico. Este vector, es particularmente útil para la expresión de plasminógeno y análogos de plasminógeno.

Para cualquier de las proteínas de la invención, el vector se elige preferiblemente de manera que la proteína se expresa y secreta en el medio de cultivo celular en una forma biológicamente activa sin la necesidad de cualquier procedimiento adicional biológico o químico. En el caso de plasminógeno, esto se puede lograr usando el vector descrito anteriormente.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para la preparación de ácido nucleico que codifica una serina proteasa modificada que muestra resistencia a los inhibidores de la serina proteasa, el procedimiento comprendiendo el acoplamiento junto con nucleótidos sucesivos y/o ligación de oligo- y/o polinucleótidos.

En un aspecto adicional de la adición, se proporciona una célula transformada o transfectada mediante un vector como se ha descrito anteriormente. Las células o líneas celular adecuadas incluyen tanto células procarióticas como eucarióticas. Un ejemplo típico de la célula eucariótica es una célula bacteriana tal como E. coli. Las células eucarióticas adecuadas incluyen células de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. Otros ejemplos de células eucarióticas son células de mamíferos que crecen en cultivo continuo y los ejemplos de tales células incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de mieloma de ratón tales como P3X63 - Ag8. 653 y NSO, células COS, células HeLa, células 293, células BHK, líneas celulares de melanoma tales como la línea celular de Bowes, células L de ratón, líneas celulares de hematoma humano tales como HepG2, fibroblastos de ratón y células NIH 3T3 de ratón. Las células CHO son particularmente adecuadas como hospedadoras para la expresión de plasminógeno y análogos de plasminógeno. La transformación de las células se puede lograr mediante cualquier procedimiento conveniente pero la electroporación es un procedimiento particularmente adecuado.

Para algunas moléculas, tales como plasminógeno, puede existir un nivel bajo de activación indeseable durante el cultivo. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula hospedadora eucariótica transfectada o transformada con una primera secuencia de ADN que codifica una serina proteasa resistente a serpina y con una secuencia de ADN adicional que codifica el inhibidor afín.

Las serina proteasas modificadas de la presente invención tienen una diversidad de usos y, si la serina proteasa es una enzima fibrinolítica o trombolítica, será útil en un procedimiento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades o afecciones producidas por coagulación sanguínea, el procedimiento comprendiendo la administración a un paciente de una cantidad eficaz de la serina proteasa.

Por lo tanto, en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una serina proteasa modificada según el primer aspecto de la invención, que es una serina proteasa que tiene propiedades fibrinolíticas, trombolíticas, antitrombóticas o protrombóticas, para uso en medicina, particularmente en el tratamiento de enfermedades mediadas por coagulación sanguínea. Tales afecciones incluyen infarto de miocardio y cerebral, trombosis arterial y venosa, tromboembolia, adherencias post - quirúrgicas, tromboflebitis y vasculopatías diabéticas.

La invención también proporciona el uso de serina proteasa fibrinolítica, trombolítica, antitrombótica o protrombótica modificada según el primer aspecto de la presente invención en la preparación de un agente para el tratamiento de y/o profilaxis de enfermedades o afecciones mediadas por coagulación sanguínea. Los ejemplos de tales afecciones se mencionan anteriormente.

Además, también se proporciona una composición farmacéutica o veterinaria que comprende una o más serina proteasas modificadas del primer aspecto de la presente invención junto con un vehículo farmacéutica y/o veterinariamente aceptable.

La composición se puede adaptar para administración mediante vías orales, tópicas o parenterales que incluyen inyección o infusión intravenosa o intramuscular. Las composiciones inyectables adecuadas pueden comprender una preparación del compuesto en solución salina y/o tampón fisiológicamente aceptable y también pueden incluir un anestésico local para aliviar el dolor de la inyección. Se pueden usar composiciones similares para infusiones. Si el compuesto se administra tópicamente, se puede formular en forma de una crema, pomada o loción en una base adecuada.

Los compuestos de la invención se pueden suministrar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en forma de un polvo seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre.

La cantidad de material a administrar dependerá de la cantidad de fibrinolisis o inhibición de coagulación requerida, la velocidad requerida de acción, la seriedad de la posición tromoembólica y el tamaño del coágulo. La dosis precisa a administrar la determinará el médico, debido a la misma naturaleza de la afección con cuyos compuestos de la invención se propone tratar. Sin embargo, como pauta, un paciente que se está tratando de un trombo maduro generalmente recibirá una dosis diaria de un análogo de plasminógeno de entre 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal bien mediante inyección en por ejemplo hasta 5 dosis o mediante infusión.

La invención se describirá ahora a modo de ejemplo solamente con referencia a los dibujos que siguen en los que:

La figura 1 muestra el alineamiento de los aminoácidos del dominio catalítico de la superfamilia de las quimotripsinas;

La figura 2 muestra los mapas de los vectores pGWH y pGWHgP;

La figura 3 muestra el efecto de la \alpha2-antiplasmina sobre la actividad del mutante A3 de plasminógeno.

La figura 4 muestra el alineamiento se secuencia de la ovoalbúmina y la \alpha2-antiplasmina usada para generar el modelo de la \alpha2-antiplasmina.

Los siguientes ejemplos ilustrarán además la invención. Las mutaciones distintas en las posiciones 45, 62 ó 158 no son parte de la invención. Los ejemplos 1 a 5 describen la expresión de diversos análogos de plasminógeno a partir de células eucarióticas superiores y el ejemplo 6 describe un ensayo usado para determinar la resistencia a la \alpha2-antiplasmina.

Ejemplo 1 Construcción y expresión de A1 y A12

El aislamiento del ADNc de plasminógeno y construcción de los vectores pGWHgp y pGWHgP (Figura 2) se han descrito en el documento WO - A - 9109118. En el pGWHgP, la transcripción mediante el ADNc de plasminógeno puede iniciar en el promotor/potenciador de HCMV y se emplea en gpt marcador seleccionable.

La técnica de manipulación genética, expresión y purificación de proteínas usada en la fabricación de los ejemplos de plasminógeno modificado que siguen, los conocen bien los expertos en la técnica de ingeniería genética. Una descripción de la mayoría de las técnicas se puede encontrar en uno de los siguientes manuales de laboratorio: "Molecular Cloning" por T. Maniatis, E. F., Fritsch y J. Sambrook publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Nueva York, o "Basic Meyhods in Molecular Biology" por L. G. Davis, M. D. Dibner y J. F. Battey publicado por Elsevier Science publishing Co Inc, Nueva York.

Las metodologías adicionales y modificadas se detallan en la sección de procedimientos más adelante.

Los análogos de plasminógenos que se han construido se diseñan para que sean resistentes a la inhibición por \alpha2-antiplasmina. A1 es un análogo de plasminógeno en el que el aminoácido Phe - 587 se reemplaza por Asn. A12 es un análogo de plasminógeno en el que Arg - 580 se reempalza por Glu. La estrategia de modificación es este ejemplo es esencialmente como se describe en el documento WO - A - 9109118 ejemplo 3, con la reacción de mutagénesis llevada a cabo en el fragmento kpn I de 1,87 kb a Hinc II del análogo T19 análogo de plasminógeno activable por trombina clonado en el bacteriófago M13mp18. Se preparó el molde de cadena sencilla y la mutación se hizo mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido. Para A1, se usó un oligonucleótido de 24 bases 5'GGTGCCTCCACAATTGTGCATTCC3' (SEC ID Nº: 3) para dirigir la mutagénesis y para A12 se usó un oligonucleótido de 27 bases 5'CCAAACCTTGTTTCAAGACTGACTTGC 3' (SEC ID Nº: 7).

El ADN de plásmido se introdujo en células CHO mediante electroporación usando 800 V y 25 \muF, como se describe en la sección de procedimientos más adelante. Se añadió medio selectivo (250 \mul/ml de xantina, 5 \mug/ml de ácido microfenólico, 1 x hipoxantina - timidina(HT) a las células 24 horas después de la transfección y el medio se cambió cada dos a tres días. Las placas que produjeron colonias resistentes a gpt se seleccionaron para producción de plasminógeno usando un ensayo ELISA. Las células que produjeron los niveles más altos de antígeno se volvieron a clonar y las mejores productoras se pasaron a escala en matraces controlándose cuidadosamente la producción. Las soluciones madres congeladas de todas estas líneas celulares se dejaron reposar. Las células productoras se pasaron a escala en botellas cilíndricas para proporcionar medio reacondicionado a partir del cual la proteína de plasminógeno se purificó usando lisina SEPHAROSE 4B. (La palabra SEPHAROSE es una marca registrada).

Ejemplo 2 Construcción y expresión de A3 y A16

Se siguió el procedimiento del ejemplo 1 excepto que se realizó la mutagénesis sobre un fragemento EcoRV a Hind III (0,85 kb) conteniendo 3' de plasminógeno de tipo salvaje clonado en M13. El oligonucleótido usado era un 27 mero 5'GTTCGAGATTCACTTTTTGGTGTGCAC3' (SEC ID Nº: 4) que cambiaba Glu - 623 a Lys, así pues cambiando un aminoácido ácido a un aminoácido básico. El mutante resultante se clonó como un fragmento EcoRV a Sph1 reemplazando la secuencia correspondiente de tipo salvaje.Se usó el oligonucleótido de 27 bases 5'GTTCGAGATTCACTGCTTGGTGTGCAC3' (SEC ID Nº: 10) para cambiar Glu - 623 a Ala para producir A16.

Ejemplo 3 Construcción y expresión de A4, A14 y A15

El mutante A4 se diseñó para interrumpir las interacciones iónicas sobre la superficie de plasminógeno evitando la unión a antiplasmina. La estrategia de mutagénesis y subclonación era como se describe en el ejemplo 1 usando un oligonucleótido de 24 bases 5'CTTGGGGACTTCTTCAAGCAGTGG3' (SEDC ID Nº: 5) diseñado para convertir Glu - 606 a Lys. Se usó el oligonucleótido de 24 bases 5'CTTGGGGACTTGGCTAGAGAGTGG3' (SEC ID Nº: 8) para cambiar Glu - 606 a Ala para producir A14 y se usó el oligonucleótido de 25 bases 5'CTTGGGGACTTCCTTAGACAGTGGG 3' (SEC ID Nº: 9) para cambiar Glu - 606 a Arg para producir A15.

Ejemplo 4 Construcción y expresión de A5

El análogo A5 de plasminógeno se diseñó para alterar la posición del bucle estructural conteniendo Tyr 39 y se preparó generalmente como se ha descrito en el ejemplo 1. En A5, Ser - 578 se ha reemplazado por Leu usando el 24 mero 5'CTCGTACGAAGCAGGACTTGCCAG3'(SEC ID Nº: 6) sobre el Kpn I a EcoRV de plasminógeno en M13 como molde. La mutación se clonó directamente en pGW1Hg \cdot plasminógeno usando las enzimas de restricción HidIII y SplI. Estos sitios se habían introducido previamente en el extremo del extremo 5' de plasminógeno y en 1850 mediante mutagénesis; la secuencia que codifica plasminógeno no estaba afectada por este procedimiento.

Ejemplo 5 Construcción y expresión del doble mutante A3A4

El mutante A3A4 de plasminógeno combina dos mutaciones A3 y A4como se describe en los ejemplos 2 y 3 respectivamente.

La mutagénesis se realizó sobre el fragmento EcoRV a SphI de A4 clonado en M13 usando el oligonucleótido de mutagénesis A3 (SEC ID Nº: 4).

Ejemplo 6 Ensayos de interacción plasmina - antiplasmina

Un ensayo cromogénico se usó para determinar la resistencia de los mutantes de paslmin (ógeno) a la inhibición mediante \alpha2 - antiplasmina. La inhibición de la actividad de plasmina se determinó mediante el cambio en la velocidad de escisión del sustrato S2251 cromogénico de plasmita (Quadratech, P. O. Box 167, Epsom, Surrey. KT17 2SB).

Antes del ensayo, los plasminógenos se activaron a plasmita usando bien uroquinasa para mutantes en plasminógeno de tipo salvaje, o trombina para mutantes de plasminógeno activables por trombina (documento W - O - 9109118). La activación de plasminógeno de tipo salvaje a plasmina se logró mediante la incubación del plasminógeno (aproximadamente 14 \mug) con uroquinasa (16,8 x 10^{-3} U) en 1750 \mul de tampón de ensayo (Tris 50 mM, EDTA 0,1 mM, Triton al 0,00005% X 100, albúmina sérica humana al 0,1% (p/v), pH 8,0) a 37ºC durante 5 minutos. La activación de mutantes de plasminógeno activable por trombina se logró mediante incubación del plasminógeno (aproximadamente 14 \mug) con trombina en 1750 \mul de tampón de ensayo a 37ºC. Se añadió hirudina para inhibir la actividad de trombina a medida que al trombina escinde el sustrato cromogénico.

Se mezcló plasmita (125 \mul) con 250 \mul de S2251 (2 mg/ml en tampón de enasayo) y 125 \mul de antiplasmina (1,25 \mug en tampón de ensayo, nº 4032 de American Diagnostica Inc., 222 Railroad Avenue, P. O. Box 1165, Greennwich, CTO6836 - 1165) o 125 \mul de tampón de ensayo en una cubeta y se midió la absorbancia a 405 nM con el tiempo.

Se usaron un espectrofotómetro Beckman DU64 y un software de captura de datos Beckman "Data Leader" para registrar la absorbancia a 405 nM a intervalos de 1 segundo durante 8 minutos. El paquete de software Data Leader se usó para calcular el primer derivado de los datos para proporcionar la velocidad de cambio de absorbancia a 405 nM frente al tiempo, una estimación de la concentración de plasmina activa frente al tiempo. La plasmina de tipo salvaje se inactivó mediante \alpha2 - antiplasmina; después de 15 segundos solamente la plasmina esencialmente se inactivó. En contraste, el mutante A3 de plasminógeno tiene un fenotipo resistente a antiplasmina y solamente se inactiva lentamente mediante la \alpha2 - antiplasmina con t1/2 (la mitad de la velocidad del cambio de DO a t = 15 segundos) de aproximadamente 75 segundos (figura 3).

Procedimientos

1. Las estructuras de modelo se construyeron mediante homología basándose en las estructura de rayos X de tripsina/BPTI. Una estructura de plasminógeno refinado se modeló mediante homología a la trombina usando la estructura de rayos X de tripsina/BPTI de Bode y col. (Bode, W. y col., EMBO J. 8: 3467 - 3475 (1989). Una estructura de

\hbox{alfa -}

2 - antiplasmina [A2AP] refinada se modeló mediante homología a ovoalbúmina usando coordenadas atómicas del Bookhaven Protein Data Ban, entrada 1OVA, excepto que para el bucle que contenía el enlace reactivo, que se moldeó usando las coordenadas para los residuos 13 a 19 de BPTI a partir de la entrada 2PTC de PDB. El alineamineto usado para generar el modelo A2AP se muestra en la figura 4. El modelo A2AP descrito en este documento no incluye las coordenadas para los 79 residuos N - terminal y los 55 residuos C - terminal.

La mayoría de los inhibidores dirigidos a serina proteasa reaccionan con las enzimas afines según un mecanismo habitual común, similar al sustrato (Bode, W. y Huber, R., Eur. J. Biochem. 204: 433 - 451 (1992). En particular, todos poseen un bucle de unión al sitio activo expuesto con una conformación canónica característica. El bucle de unión sobre el modelo A2AP se modeló por lo tanto sobre el bucle equivalente de BPTI (residuos 13 a 19), usando coordenadas atómicas a partir de la entrada 2PTC de PBD (en el que BPTI se compleja con tripsina).

El complejo de A2AP y el dominio de serina proteasa de plasmina se modeló usando la estructura del complejo tripsina/BPTI a partir de la entrada 2PTC de PBD. El modelo A2AP se ajustó a la estructura de BPTI optimizando la diferencia entre las coordenadas de los átomos de la estructura principal en los bucles de unión al sitio activo de los dos inhibidores. El modelo de dominio de la serina proteasa de plasmina se ajustó a la estructura de tripsina optimizando la diferencia de RMS entre las coordenadas de los átomos C - alfa del residuo conservado en un alineamiento de la secuencia óptima de las dos proteínas. El modelo del complejo A2AP/plasmina se refinó después mediante minimización de energía.

El modelado de homología se realizó sobre un sistema de computación independiente Silicon Graphics Indigo usando el programa de modelado Quanta molecular de Molecular Simulations Incorporated. Los alineamientos de secuencias se produjeron usando Quanta, el software de análisis de secuencias GCG de la Universidad de Wisconsin (Devereux, Haeberli y Smithies, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 - 395 (1984), y el software de alineamiento de secuencias del propietario. Sin embargo, el procedimiento real mediante el que se construyeron los modelos de homología no es crítico para esta invención.

Las secuencia de tripsina y BPTI usadas en el modelado de homología se obtuvieron a partir de la entrada 2PTC de las coordenadas atómicas de Bookhaven Protein Data Bank, la secuencia de protrombina se obtuvo a partir del archivo de coordenadas PPACK/trombina, la secuencia de plasminógeno a partir de la entrada PLMN_HUMAN de la base de datos de SWISSPROT, y la secuencia de A2AP a partir de la entrada A2AP _ HUMAN de SWISSPROT.

2. Digestión por la nucleasa de judía mung

Se añadieron 10 unidades de nucleasa de judía mung a aproximadamente 1 \mu de ADN que se había digerido con una enzima de restricción en un tampón que contenía NaOAc 30 mM, pH 5,0, NaCl 100 mM, ZnCl 2 mM, glicerol al 10%. La nucleasa de judía mung se incubó a 37ºC durante 30 minutos, se inactivó durante 15 minutos a 67ºC antes de extraerse con fenol y se precipitó con etanol.

3. Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante química de fosforamiditos automática usando fosforamiditos de cianoetilo. La metodología se usa ahora ampliamente y se ha descrito (Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H. Tetrahedron Letters 24, 245 (1981) y Caruthers, M. H. Science 230, 281 - 285 (1985)).

4. Purificación de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se desprotegieron y retiraron del soporte de CPG mediante incubación en NH3 concentrado. Típicamente, 50 mg de CPG que lleva 1 micromol de oligonucleótido se desprotegió mediante incubación durante 5 horas a 70ºC en 600 \mul de NH3 concentrado. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y se precipitó el oligómero con 3 volúmenes de etanol. Después de la centrifugación el sedimento se secó y se volvió a suspender en 1 ml de agua. Después se determinó la concentración de oligómero bruto midiendo la absorbancia a 260 nm. Para la purificación por gel se secaron 10 unidades de absorbancia del oligonucleótido bruto y se volvieron a suspender en 15 \mul de tinte marcador (90% de formamida desionizada, tris 10 mM, borato 10 mM, EDTA 1 mM, azul bromofenol al 0,1%). Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto y después se cargaron en un gel espeso de poliacrilamida desnaturalizante con ranuras de 1,6 mm de anchura. El gel se preparó a partir de acrilamida al 15%, bisacrilamida al 0,6% y urea 7 M en 1 X TBE y se polimerizó con persulfato amónico al 0,1% y TEMED al 0,025%. El gel se predesarrolló durante 1 hora. Las muestras se desarrollaron a 1500 V durante 4 - 5 horas. Las bandas se visualizaron mediante ensombrecimiento por UV y los correspondientes al producto de longitud completa se cortaron y se transfirieron a microtubos de ensayo. Los oligómeros se eluyeron de la sílice del gel enjuagando en AGEB (acetato amónico 0,5 M, acetato de magnesio 0,01 M y SDS al 0,1%) durante toda una noche. El tampón de AGEB se transfirió después a tubos limpios y se precipitó el oligómero con tres volúmenes de etanol a 70ºC durante 15 minutos. El precipitado se recogió mediante centrifugación en una microcentrífuga Eppendorf durante 10 minutos, el sedimento se lavó en etanol al 80%, el oligómero purificado se secó, se volvió a disolver en 1 ml de agua y finalmente se filtró a través de un

\hbox{micro -}

filtro de 0,5 micrones. (La palabra EPPENDORF es una marca registrada). La concentración del producto purificado se midió determinando su absorbancia a 260 nm. 5. Tratamiento con quinasas de oligómeros

100 pmoles se oligómero se secaron y se volvieron a suspender en 20 \mul de tampón quinasa (Tris 70 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, espermidina 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM). Se añadieron 10 u de polinucleótido quinasa de T4 y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después la quinasa se inactivó mediante calentamiento a 70ºC durante 10 minutos.

6. Secuenciación de didesoxi

Se usó el protocolo esencialmente como se ha descrito (Biggin, M. D., Gibson, T. J., Hong, G. F. P. N. A. S. 80 3963 - 3965 (1983). Cuando era apropiada, el procedimiento se modificó para permitir la secuenciación sobre ADN de plásmido como se ha descrito (Guo, L - H, Wu R Nucleic Acids Research 11 5521 - 5540 (1983).

7. Transformación

La transformación se logró usando procedimientos habituales. La cepa usada como receptora en la clonación usando vectores HW87 o DH5 tiene el siguiente genotipo:

araD139 (ara - leu) de17697 (lacIPOZY) de174 galU galK hsdR rpsl srl recA56

RZ1032 es un derivado de E. coli que carece de dos enzimas del metabolismo del ADN: (a) dUTPasa (dut) que da como resultado una alta concentración de dUTP intracelular, y (b) uracil N-glicosilasa (ung) que es responsable de la eliminación de los uracilos incorporados erróneamente de ADN (Kunkel y col., Methods in Enzymol., 154,

\hbox{367 -}

382 (1987)). Su principal beneficio es que estas mutaciones que conducen a una mayor frecuencia de mutantes en mutagénesis dirigida al sitio. RZ1032 tiene el siguiente genotipo:

HfrKL16PO/45 [lysA961 - 62], dut1, ung1, thi1, re(A), Zbd-279::Tn10, supE44

JM103 es una cepa receptora habitual para manipulación que implica vectores basados en M13.

8. Mutagénesis dirigida al sitio

El cebador de mutagéensis tratado con quinasas (2,5 pmoles) se hibridó al ADN molde de cadena sencilla, que se preparó usando RZ1032 como huésped, (1 \mug) en una mezcla de reacción final de 10 \mul conteniendo Tris 70 mM, MgCl2 10 mM. La mezcla de reacción en un microtubo de ensayo de polipropileno (EPPENDORF) se colocó en un recipiente que contenía 250 ml de agua a 70ºC durante 3 minutos seguido de 27ºC durante 30 minutos. La mezcla hibridaza se colocó después sobre hielo y se añadieron los siguientes reactivos: 1 \mul de 10 X TM (Tris 700 mM, MgCl2 100 mM, pH 7,6), 1 \mul de una mezcla de los 4 desoxirribonucleótidos cada uno a 5 mM, 2 \mul de ADN ligasa de T4 (100 u), 0,5 \mul de fragmento Klenow de ADN polimerasa y 4,5 \mul de agua. La mezcla de reacción de la polimerasa se incubó después a 15ºC durante 4 - 16 horas. Después de completarse la reacción, se añadieron 180 \mul de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0) y la mezcla de mutagénesis se almacenó a -20ºC.

Para el aislamiento de los clones mutantes la mezcla se transformó después en el receptor JM103 como sigue. Un cultivo de 5 ml de cultivo de toda una noche de JM103 en 2 x YT (bactotriptona al 1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 1%) se diluyó 1 en 100 en 50 ml de 2 X YT precalentado. El cultivo se desarrolló a 37ºC con aireación hasta que la A600 alcanzó 0,4. Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en 0,5 volúmenes de CaCl2 50 mM y se mantuvo sobre hielo durante 15 minutos. Después las células se volvieron a centrifugar a 4ºC y se volvieron a suspender en 2,5 ml de NaCl2 50 mM frío. Para la trasnfección, alícuotas de 0,25, 1, 2, 5, 20 y 50 \mul de la mezcla de mutagénesis se añadieron a 200 \mul de células de competencia que se mantuvieron sobre hielo durante 30 minutos. Después las células se sometieron a un choque por calor a 42ºC durante 2 minutos. Después a cada tubo se añadieron 3,5 ml de agar blando de YT conteniendo 0,2 ml de cultivo exponencial tardío de JM103, los contenidos se mezclaron brevemente y después se vertieron en la superficie de una placa precalentada conteniendo 2 X YT solidificada con agar al 1,5%. La fase de agar blando se dejó reposar y las placas se incubaron después a 37ºC durante toda una noche.

Después el ADN de cadena sencilla se preparó a partir de un clon aislado como sigue: placas individuales se sembraron en 4 ml de 2 x YT que se habían sembrado con 10 \mul de un cultivo reciente de toda una noche de JM103 en 2 X YT. El cultivo se agitó vigorosamente durante 6 horas. Después se retiraron 0,5 ml del cultivo y se añadieron a 0,5 ml de glicerol al 50% para proporcionar una solución madre de referencia que se almacenó a -20ºC. El cultivo restante se centrifugó para retirar las células y se transfirió 1 ml de sobrenadante que llevaba las partículas del fago a un tubo EPPENDORF limpio. Después se añadieron 250 \mul de PEG6000 al 20%, NaCl 250 mM, se mezclaron y los tubos se incubaron sobre hielo durante 15 minutos. Después el fago se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y los tubos se volvieron a centrifugar para recoger los indicios de solución de PEG que después se retiraron y se desecharon. El sedimento de fago se volvió a suspender concienzudamente en 200 \mul de TEN (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaOAc 0,3 M). El ADN se aisló mediante extracción con un volumen igual de fenol saturado con Tris. Se separaron las fases mediante una centrifugación breve y la fase acuosa se transfirió a un tubo limpio. El ADN se volvió a extraer con una mezcla de 100 \mul de fenol, 100 \mul de cloroformo y se separaron las fases de nuevo mediante centrifugación. Se retiraron los indicios de fenol mediante tres extracciones posteriores con cloroformo y finalmente el ADN se aisló mediante precipitación con 2,5 volúmenes de etanol a -20ºC durante toda una noche. El ADN se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó y finalmente se resuspendió en 50 \mul de TE.

9. Electroporación

Células de ovario de hámster chino (CHO) o la línea celular de mieloma de ratón p3x63 - Ag8 \cdot 653 se hicieron crecer y se recogieron en fase de crecimiento logarítmica suave. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS y se hizo un recuento de células viables. Después las células centrifugaron y se volvieron a suspender a 1 x 10^{7} células/ml. Se añadieron 40 \mug de ADN linealizado a 1 ml de células y se dejaron en reposo en hielo durante 15 minutos. Se administró un pulso de 800 V/25 \muF a las células usando un aparato de electroporación comercialmente disponible (BIORAD GENE PULSER - marca registrada). Las células se incubaron en hielo durante 15 minutos adicionales y después se sembraron en placas de 5 X 96 pocillos con 200 \mul de medio por pocillo (DMEM, FCS al 5%, Pen/Estrep, glutamina) o placas de 3 x 9 cm con 10 ml de medio en cada placa y se incubaron durante toda una noche. Después de 24 horas el medio se retiró y se reemplazó con medio selectivo conteniendo xantina (250 \mug/ml), ácido micofenólico (5 \mug/ml) y 1 x hipoxantina - timidina (HT). Las células se alimentaron cada tercer día. Después de aproximadamente 14 días colonias resistentes a gpt son evidentes en alguno de los pocillos y sobre las placas. Las placas se analizaron para plasminógeno retirando una alícuota de medio de cada pocillo o placa y se ensayaron usando en ensayo ELISA. Los clones que producen plasminógeno se pasaron a escala y se controló el nivel de expresión para dejar la selección del mejor productor.

10. ELISA para plasminógeno humano

Placas ELISA (Pro - Bind, Falcon) se recubren con 50 \mul/pocillo de suero de plasminógeno anti - humano de cabra (Sigma) diluido 1:1000 en tampón de recubrimiento (4,0 g Na2CO3 (10 \cdot H2O), 2,93 g de NaHCO3 por litro de H2O, pH 9,6)) y se incubaron durante toda una noche a 4ºC. Después la solución de recubrimiento se retira y las placas se bloquean mediante incubación con 50 \mul/pocillo de PBS/caseína al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Las muestras se plasminógeno o patrones diluidos en PBS/Tween se añaden a la placa y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. Después las placas se lavan con PBS/Tween y después se añaden 50 \mul/pocillo de una solución 1:1000 en PBS/Tween de un anticuerpo de plasminógeno antihumano monoclonal (por ej nº 3641 y nº 3642 de American Diagnostica, Nueva York, Estados Unidos) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan otra vez 3 veces con PBS/Tween y después 50 \mul/pocillo de IgG anti - ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Como alternativa, el plasminógeno unido se revela mediante incubación con 50 \mul/pocillo de plasminógeno anti - humano de oveja (el sitio de unión) conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las placas se lavan 5 veces con PBS/Tween y después se incuban con 100 \mul/pocillo de sustrato de peroxidasa (tampón acetato sódico 0,1 M/ácido cítrico pH 6,0 conteniendo 100 mg/litros de 3,3',5,5' - tetrametilbenzidina y H2O2 13 mM. La reacción se para después de aproximadamente 5 minutos mediante la adición de 25 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2,5 M y se lee la absorbancia a 450 nm sobre un lector de placas.

11. Purificación de variantes de plasminógeno

Los variantes de plasminógeno se purifican en una etapa individual mediante cromatografía sobre lisina SEPHAROSE 4B (Pharmacia). Se equilibra una columna con al menos 10 volúmenes de columna de tampón fosfato sódico 0,05 M pH7,5. La columna se carga con medio reacondicionado a una relación de 1 ml de resina por 0,6 mg de variante de plasminógeno como se determina por ELISA usando glu - plasminógeno como patrón. Típicamente 400 ml de medio reacondicionado conteniendo plasminógeno se aplican a una columna de 10 ml (H:D = 4) a un caudal lineal de 56 ml/cm/h a 4ºC. Después de que se completa la carga, la columna se lava con un mínimo de 5 volúmenes de columna de tampón fosfato 0,05 M pH 7,5 conteniendo NaCl 0,5 M hasta que al proteína unida no específicamente cesa para ser eluida. La desorción de plasminógeno unido se logra mediante la aplicación de ácido epsilón - amino - caproico 0,2 M en agua desionizada pH 7,0. La elución requiere 2 volúmenes de columna y se lleva a cabo a un caudal lineal de 17 ml/cm/hora. Después del análisis por SDS PAGE para comprobar pureza, el ácido epsilón - amino - caproico 0,2 M \mul se retira posteriormente y se reemplaza con un tampón adecuado, por ejemplo, Tris, PBS, HEPES o acetato, mediante cromatografía sobre columnas pre - compactadas, desechables, PD10 que contienen SEPHADEX G - 25M (Pharmacia). (La palabra SEPHADEX es una marca registrada). Típicamente, 2,5 ml de cada mutante plasminógeno a una concentración de 0,3 mg/ml se tratan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se reúnen las fracciones que contienen plasminógeno, como se determina mediante A280.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE British Bio - technology Limited

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Watlington Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Cowley, Oxford

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Gran Bretaña

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP) OX4 5LY

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

título de la invención: PROTEASAS MODIFICADAS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEIBLE DE ORDENADOR:

\hskip1,9cm

No aplicable

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\hskip1,9cm

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 690 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

POLARIDAD OPUESTA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 690

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /parcial

\hskip3,3cm

/codón _ inicio = 1

\hskip3,3cm

/función = "codifica el dominio de plasmina proteasa"

\hskip3,3cm

/producto = "nucleótido con la proteína correspondiente"

\hskip3,3cm

/número = 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

1

2

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 230 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A1"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGCCTCCA CAATTGTGCA TTCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A3"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCGAGATT CACTTTTTGG TGTGCAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A4"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGGGACT TCTTCAAGCA GTGG

\hfill

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS USADO PARA A5"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGTACGAA GCAGGACTTG CCAG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A12"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAACCTTG TTTCAAGACT GACTTGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A14"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGGGACT TGGCTAGACA GTGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 . . 25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A15"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGGGACT YCCTTAGACA GTGGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc _ característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1. . 27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "CEBADOR DE MUTAGÉNESIS PARA A16"

\hskip3,3cm

/producto = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCGAGATT CACTGCTTGG TGTGCAC

\hfill

27

4

5

6

7

8

9

10

11

Claims (10)

1. Una plasmina o un precursor de la misma, que se ha modificado de manera que muestra resistencia a inhibidores de plasmina, caracterizada porque la modificación comprende la mutación de uno o más residuos correspondiente a los residuos 45, 62, y 158 (usando la numeración de la SEC ID Nº: 2).

2. Una plasmina según la reivindicación 1, que tiene una o más de las siguientes mutaciones: GLu - 62 a Lys o Ala, o Glu - 45 a Lys, Arg o Ala, (donde la numeración es la de la SEC ID Nº: 2).

3. Un precursor de plasmina según la reivindicación 1, que, cuando se escinde, forma una plasmina según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un precursor de plasmina según la reivindicación 3, que se puede escindir mediante una enzima implicada en la coagulación sanguínea para producir una plasmina según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

5. Un ácido nucleico que codifica una plasmina modificada o precursor de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 5 que es un vector incluyendo un plásmido, cósmido, o fago.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 6 que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la plasmina modificada o precursor de la misma, unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene un fuerte promotor y secuencia potenciadora derivada de citomegaloviris humano, una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de poliadenilación derivada de SV40 y una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable expresado a partir del promotor SV40 y que tiene una señal de poliadenilación de SV40 adicional en el extremo 3' de la secuencia marcadora seleccionable.

8. Una célula transformada o transfectada mediante ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Una composición farmacéutica o veterinaria que comprende una plasmina modificada o precursor de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con un vehículo farmacéutica y/o veterinariamente aceptable.

10. Una célula según la reivindicación 8 adicionalmente transfectada mediante un vector de expresión para la expresión de antiplasmina.