ES2233097T3 - Formulaciones de cocleato que integran proteina-adn y procedimientos para la transformacion de celulas. - Google Patents
Formulaciones de cocleato que integran proteina-adn y procedimientos para la transformacion de celulas.Info
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Abstract
Estructura de vector de liberación que comprende: a) una composición cocleato que comprende una estructura de bicapa lipídica, elementos lipídicos individuales que contienen un grupo principal cargado negativamente y cationes; b) proteínas que facilitan la integración de una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de una célula diana en la que las proteínas comprenden tanto Rep 68 como Rep 78 y c) un polinucleótido que comprende una o más secuencias de ADN reconocidas por una o más proteínas que facilitan la integración de secuencias nucleotídicas y uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo cada uno una secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una molécula terapéuticamente beneficiosa.
Description
Formulaciones de cocleato que integran
proteína-ADN y procedimientos para la transformación
de células.
La presente invención se refiere a un sistema
vector lipídico que comprende una estructura de bicapa lipídica
multicapa denominada precipitado cocleato. Las capas de la
estructura de bicapa lipídica se encuentran unidas iónicamente entre
sí mediante un catión.
Una o más de las secuencias nucleotídicas
terapéuticas que codifican una molécula terapéuticamente beneficiosa
y las proteínas que facilitan la integración de las secuencias
nucleotídicas terapéuticas físicamente asociadas con el precipitado
cocleato.
Las proteínas son los virus adenoasociados (AAV)
Rep 68 y Rep 78. La secuencia nucleotídica terapéutica
preferiblemente se encuentra situada entre las repeticiones
terminales invertidas del AAV.
Al entrar en contacto con una bicapa lipídica de
una célula diana, la estructura de vector cocleato libera una o más
de las secuencias nucleotídicas terapéuticas y una o más de las
proteínas en el interior de la célula diana. Al entrar en la célula,
la proteína o proteínas facilitan la integración de la secuencia o
secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de la célula
huésped.
Los avances recientes de la biología molecular
han incrementado la comprensión científica de la base genética de
las enfermedades y han proporcionado las herramientas para nuevos
avances en la terapia génica. Por ejemplo, en la actualidad es
posible producir secuencias nucleotídicas de ingeniería genética
capaces de expresar moléculas terapéuticas. Sin embargo, siguen
existiendo obstáculos importantes y uno de ellos ha sido la falta de
medios efectivos para liberar estas secuencias nucleotídicas
terapéuticas en el interior de células diana de una forma capaz de
integrarse en el genoma de la célula diana. La presente invención se
refiere a un sistema de vector de liberación capaz de liberar
materiales genéticos en el interior de una célula junto con las
moléculas necesarias para la integración de tales materiales
genéticos en el genoma de la célula diana. En Advanced Drug Delivery
Reviews 32: 273-287 (1998),
Gould-Fogerite et al. describen la
utilización de cocleatos como sistemas de vector de liberación y en
particular afirman que los cocleatos de proteína y ADN son vacunas
altamente efectivas.
La patente
WO-A-9730725 da a conocer cocleatos
que se utilizan como sistemas de vector de liberación que comprenden
polinucleótidos y elementos reguladores. En uno de los ejemplos, se
incluye proteína fusogénica de virus sendai.
En J. Virol., 1998, 7653-7658,
Lamartina, S. et al. describen liposomas para liberar AAV. La
proteína Rep-68 promueve la integración
sitio-específica de polinucleótido.
La invención incluye una estructura de vector de
liberación tal como se define en la reivindicación 1.
El sistema de vector de liberación de la presente
invención comprende una estructura lipídica denominada precipitado
cocleato o, simplemente, cocleato. El cocleato comprende una
estructura de bicapa lipídica multicapa. La estructura de bicapa
lipídica multicapa generalmente comprende un fosfolípido membranal
que contiene un grupo principal cargado negativamente y un catión,
tal como el calcio (Ca^{++}). El catión sirve de puente, uniéndose
iónicamente con los grupos principales cargados negativamente de los
grupos fosfolípidos y de esta manera une entre sí las bicapas
lipídicas individuales de la estructura multicapa.
Los cocleatos consisten en láminas alternadas de
lípido acomplejado con cationes. En un modo preferido de la
invención, la estructura de bicapa lipídica multicapa existe como
una lámina bicapa lipídica continua enrollada en una conformación
espiral. El catión mantiene la estructura del cocleato uniendo
iónicamente los grupos principales cargados negativamente en las
bicapas lipídicas opuestas. Por ejemplo, en el caso de que el catión
sea Ca^{++}, una carga positiva del Ca^{++} atrae un grupo
principal fosfolípido cargado negativamente en una bicapa y la otra
carga positiva atrae un grupo principal fosfolípido en la bicapa
opuesta.
Los cocleatos son altamente estables y pueden
almacenarse en tampón que contiene calcio. Los cocleatos también
pueden liofilizarse para formar unos polvos, almacenarse a
temperatura ambiente y reconstituirse con líquido previamente a la
administración.
Aunque son conocidos otros sistemas de vector
lipídico de liberación (ver Lee et al., "Lipidic Vector
Systems for Gene Transfer", Critical Reviews in Drug Carrier
Systems 14(2): 173-206 (1997)), típicamente
se encuentran en forma de liposomas y son sustancialmente diferentes
del sistema vector cocleato de liberación indicado en el presente
documento. Un liposoma es un compartimiento lleno de líquido
limitado por una bicapa lipídica fluida. Los materiales como el ADN
o las proteínas puede estar contenidos dentro de un liposoma, y
tales materiales pueden administrarse en el interior de una célula
mediante incorporación endocítica o, en casos especiales, mediante
fusión del liposoma con la membrana celular.
Al contrario que las estructuras cocleato, las
condiciones ambientales duras, tales como los pH extremos o la
presencia de enzimas degradativos de los lípidos, hacen que la
bicapa lipídica de un liposoma sea susceptible de inestabilizarse y
comprometer la barrera membranal. Al comprometerse la barrera
membranal, el contenido del liposoma puede ser atacado por los
elementos externos. Por ejemplo, los enzimas degradativos, tales
como las proteasas y nucleasas, pueden degradar las proteínas y
polipéptidos dentro del liposoma que ha sido comprometido.
Una diferencia adicional entre liposomas y
cocleatos es la presencia de cationes divalentes. Los cocleatos se
preparan mediante fusión de liposomas inducida por calcio. Los
cocleatos pueden contener, por ejemplo, un concentración molar de
cationes divalentes que es la mitad de la concentración molar de los
fosfolípidos. Los cationes divalentes organizan las bicapas
lipídicas negativamente cargadas en láminas sólidas que se enrollan
o apilan sobre sí mismas, excluyendo el agua.
Los cocleatos son estructuras multicapa altamente
estables compuestas de productos naturales no tóxicos y no
inflamatorios. Son precipitados sólidos y liofilizables que contiene
poco o nada de espacio acuoso interno. Aunque la deshidratación de
los liposomas, por ejemplo mediante liofilización, destruye la
morfología e integridad de los liposomas, tal deshidratación no
presenta efectos adversos sobre la morfología o funciones del
cocleato. Las capas del cocleato están compuestas de láminas
alternantes de fosfolípido cargado negativamente y calcio. Esta
estructura única protege de la degradación a las moléculas
"encocleadas" asociadas. Debido a que la estructura entera de
cocleato es una serie de capas sólidas, los componentes en el
interior de la estructura cocleato permanecen intactos, aunque las
capas externas del cocleato pueden quedar expuestas a condiciones
ambientales duras o a enzimas.
La formulación de los complejos integrativos de
ADN y proteína o la utilización de estos complejos como vehículos de
transferencia de genes no ha sido descrita hasta el momento.
Las perturbaciones inducidas por el calcio de
membranas que contienen lípidos cargados negativamente y los sucesos
de fusión membranal posteriores que resultan son mecanismos
importantes en muchos procesos naturales de fusión membranal. De
acuerdo con lo anterior, aunque se desconoce el mecanismo definitivo
de liberación del cocleato, se cree que los cocleatos actúan como
intermediarios en la fusión membranal. De acuerdo con esta teoría, a
medida que la membrana rica en calcio de un cocleato se aproxima a
una membrana natural, se induce una perturbación o reordenación de
la membrana celular, resultando en una fusión entre la capa externa
del cocleato y la membrana celular. Esta fusión resulta en la
liberación de una pequeña cantidad del material encocleado en el
citoplasma de la célula. En teoría, el cocleato puede después
liberarse de la célula y encontrarse disponible para otra fusión,
sea con la misma célula o con otra. Alternativamente, el cocleato
puede ser incorporado por endocitosis y fusionarse con las membranas
celulares desde el interior. En contraste, la bicapa lipídica de la
mayoría de liposomas es altamente estable termodinámicamente y
resiste la fusión con otros liposomas o con otras estructuras unidas
a membranas.
La hipótesis de fusión membranal es consistente
con la observación de que muchas fusiones de membrana que se dan
naturalmente implican la interacción del calcio con fosfolípidos
cargados negativamente (generalmente fosfatidilserina y
fosfatidilglicerol). Esta hipótesis también es consistente con los
estudios experimentales. Por ejemplo, la capacidad de los cocleatos
de mediar en la inducción de linfocitos citotóxicos CD8^{+}
antígeno-específicos apoya la hipótesis de que los
cocleatos facilitan la liberación citoplásmica de las macromoléculas
asociadas a cocleatos. Además, los estudios inmunológicos que
indican una presentación lenta a largo plazo de antígeno son
consistentes con la teoría de que un único cocleato experimenta
múltiples fusiones a lo largo de un periodo extendido de tiempo.
La presente invención hace uso de los cocleatos
como vehículos de liberación para materiales genéticos y proteínas
que facilitan la integración de los materiales genéticos en el
genoma huésped. Los materiales genéticos y proteínas proceden del
virus adenoasociado (AAV). El AAV es un parvovirus ADN de hebra
única naturalmente defectivo que se utiliza comúnmente como
vector.
El AAV de tipo salvaje generalmente requiere la
coinfección con un virus ayudante para poder replicarse. Sin un
virus ayudante, el AAV se integra en el genoma de la célula huésped
y permanece latente durante periodos extendidos de tiempo. El AAV no
ha sido asociado con ninguna enfermedad humana y la integración del
AAV no parece afectar a la replicación celular. La propensión del
genoma del AAV a integrarse con seguridad en el genoma de las
células huésped hace que sea un vector atractivo para la terapia
génica.
El AAV encapsidado dentro de proteínas
estructurales virales ha sido utilizado como vector para la
liberación génica. La presente invención es significativamente
diferente en el aspecto que utiliza elementos genéticos no
encapsidados de AAV acomplejados con proteínas virales seleccionadas
y empaquetados en cocleatos.
El genoma de AAV es de 4,68 kb de longitud y
contiene dos marcos de lectura abierta y dos repeticiones terminales
invertidas de 145 bp (RTI) (Chatterjee et al., Science 258:
1485-88 (1992)). Los dos marcos de lectura abierta,
situados entre los RTI, contiene los genes rep y cap, que contienen
proteínas implicadas en la replicación y encapsidación,
respectivamente. El gen rep del AAV se transcribe a partir de dos
promotores, p_{5} y p_{19}. La transcripción desde el promotor
p_{5} genera transcritos de ARNm que codifican las proteínas Rep
68 y 78. Las Rep 68 y 78 es conocido que median en la formación de
complejos entre ADN y AAV y su sitio de integración en el ADN humano
(ver Weitzman et al., "Adeno-associated
virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA
and its integration site in human DNA", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91: 5808-5812 (1994). Estas proteínas se unen
específicamente al AAV terminal ahorquillado, formado por las 125
bases terminales y posee actividades helicasa y endonucleasa
sitio-específica requeridas para la replicación del
AAV.
Una manera de utilizar la actividad integrativa
del sistema AAV es co-transfectar células con un
vector que exprese las proteínas Rep junto con un vector que
contenga un gen a transferir flanqueado por las RTI. La dificultad
de este enfoque es la potencial producción crónica de las proteínas
Rep y Cap. La Rep es conocido que presenta efectos sobre la
expresión de algunos genes celulares y podría resultar tóxico a
niveles elevados. En particular, la expresión crónica de las
proteínas en células madre hematopoyéticas podría alterar
significativamente su programa genético. Esto podría llevar a
cambios en los patrones de diferenciación y potenciales. Los genes
rep y cap pueden ser eliminados y sustituidos por una secuencia
nucleotídica que contenga uno o más genes que expresen una o más
moléculas terapéuticamente efectivas. Sin embargo, tal como se ha
indicado anteriormente, Rep 68 y Rep 78 son necesarios para la
integración del genoma del AAV en el genoma de la célula diana. La
presente invención resuelve esta dificultad empaquetando in
vitro las proteínas sintetizadas Rep 68 y Rep 78 junto con
material genético del AAV que carece de los genes rep y cap. En una
realización preferida de la invención, se utiliza un cocleato para
liberar una hebra de ADN del AAV del que se han extraído los genes
rep y cap y que presenta uno o más genes terapéuticos empalmados
entre los RTIs, coempaquetados con las proteínas recombinantes Rep
68 y Rep 78 del AAV.
Una dificultad con la utilización estándar del
cápside del AAV para liberar materiales genéticos del AAV es que el
tamaño de ésta limita la longitud de la secuencia nucleotídica
terapéutica que puede empalmarse entre los RTIs. Debido al pequeño
tamaño del cápside del AAV, las secuencias nucleotídicas de más de 5
kb se integran pobremente. Debido a que los RTIs del AAV comprenden
por lo menos 290 bases, se dejan aproximadamente 4,7 kb para la
secuencia nucleotídica terapéutica de interés. Este límite superior
descarta la utilización de secuencias nucleotídicas más grandes que
podrían ser candidatos atractivos para la terapia génica, tal como
el gen que codifica para la distrofina, la ausencia o disfunción de
la cual conduce a la distrofia muscular de Duchenne y de Becker. En
contraste, aunque no se conoce el límite superior para el número de
bases que pueden empalmarse entre los RTIs del AAV para la
liberación mediante el sistema de vector cocleato de la invención,
se predice que este número será mucho mayor que el número de bases
que pueden empalmarse entre los RTIs del AAV para la liberación por
el cápside del AAV. La capacidad de liberar secuencias nucleotídicas
más grandes debería incrementar grandemente el número de trastornos
genéticos para los que pueden utilizarse como vector los RTIs del
AAV.
Otra desventaja de la utilización del cocleato
como sistema de empaquetamiento para un plásmido basado en AAV es la
capacidad de liberar los materiales genéticos del AAV sin
contaminación con virus ayudante. El método estándar para construir
vectores AAV implica la co-infección de una célula
huésped con (1) el genoma del AAV en el que los genes rep y cap han
sido sustituidos por el gen de interés; (2) un plásmido ayudante que
contiene los genes rep y cap del AAV sin los RTIs del AAV,
conteniendo típicamente promotores de adenovirus; y (3) un
adenovirus ayudante. Los genes rep y cap del AAV producen las
proteínas Rep y Cap pero no pueden ser encapsidados por el cápside
del AAV. El gen foráneo flanqueado por los RTIs del AAV se encapsida
en el cápside del AAV mediante la acción de las proteínas Rep y Cap.
El resultado es una mezcla de AAV recombinante y adenovirus. El AAV
recombinante debe purificarse a continuación mediante centrifugación
en gradiente de densidad de flotación con cierto riesgo de
contaminación con adenovirus residual. En contraste, los sistemas de
vector de liberación de la presente invención pueden construirse sin
la ayuda del adenovirus ayudante, eliminando de esta manera el
riesgo de contaminación con adenovirus.
Un aspecto importante de la presente invención es
la transducción de células madre hematopoyéticas. Éstas son células
progenitoras pluripotentes no diferenciadas desde las que se
desarrollan otras células sanguíneas especializadas. La capacidad de
proporcionar una corrección a largo plazo de muchos trastornos
genéticos de las células hematopoyéticas es necesaria para la
reconstitución de otras células en el sistema hematopoyético.
Desgraciadamente, la transducción de células
hematopoyéticas utilizando vectores retrovirales convencionales
requiere la estimulación de tales células mediante citoquinas. La
estimulación con citoquinas se cree que destruye la naturaleza
pluripotente de estas células madre. Los presentes inventores han
descubierto de manera sorprendente e inesperada un medio para
transformar las células madre hematopoyéticas en ausencia de
estimulación con citoquinas, lo que resulta en la transducción de
las células hematopoyéticas. Debido a que esta transducción se da en
ausencia de estimulación con citoquinas, la integración en el genoma
huésped de los elementos genéticos del AAV puede llevarse a cabo sin
perturbar la capacidad pluripotente de las células madre
hematopoyéticas. La presente invención, por lo tanto, constituye un
avance importante en el campo de la terapia génica, y
particularmente en el campo de la terapia génica para los trastornos
sanguíneos.
Anteriormente no era conocido que los cocleatos
que contienen proteínas rep y ADN con RTIs podían servir como vector
para la liberación eficiente en el núcleo de las proteínas y el ADN
de una forma adecuada para la integración del ADN catalizada por
proteína rep.
También resultó inesperado que los complejos de
proteína rep-ADN pudiesen conservar una asociación
funcional estable a largo plazo. Las formulaciones almacenadas
durante más de un año a 4ºC mostraron pérdidas indetectables de
eficiencia en la transferencia génica.
La figura 1 es un diagrama de un vector génico
plásmido de ADN (CWRSVN) que contiene un gen marcador de la
neomicina fosfotransferasa (NEO) regulado por SV40 y flanqueado por
RTIs 5' y 3' del AAV.
La figura 2 es un diagrama de una conformación de
un cocleato.
La figura 3 es una ilustración de precipitados
cocleato fracturados por congelación tal como se observan mediante
microscopía electrónica de transmisión.
La presente invención se refiere a un sistema
vector lipídico que comprende una estructura de bicapa lipídica de
capas conocida como precipitado cocleato. Los elementos lipídicos
individuales de la bicapa lipídica contienen un grupo principal
cargado negativamente. Las capas de la estructura de bicapa lipídica
se encuentran unidas entre sí mediante un catión asociado que está
unido iónicamente con el grupo principal cargado negativamente.
Asociado con el precipitado cocleato, se prevén
una o más proteínas que pueden facilitar la integración de los
nucleótidos en el genoma de la célula huésped. Se utilizan proteínas
del AAV.
También asociados con la bicapa cocleato se prevé
un oligonucleótido o polinucleótido que contiene una secuencia
nucleotídica terapéutica y secuencias nucleotídicas reconocidas por
proteínas que presenta una función de unión a ADN. Estas secuencias
de ADN reconocidas por proteínas son los RTIs del AAV.
Preferiblemente, los nucleótidos terapéuticos se posicionan entre
las secuencias nucleotídicas reconocidas por las proteínas que
presentan una función de unión a ADN.
La secuencia nucleotídica terapéutica codifica
una o más moléculas terapéuticamente beneficiosas. Una molécula
terapéuticamente beneficiosa de acuerdo con la presente invención es
una cadena de aminoácidos terapéuticos de cualquier longitud que
incluye secuencias más cortas de aminoácidos habitualmente
denominadas péptidos, así como secuencias más largas de aminoácidos,
habitualmente denominadas polipéptidos o proteínas. Muchas de tales
moléculas terapéuticamente beneficiosas son bien conocidas para un
experto ordinario en la materia. Además, o alternativamente, la
molécula de ARN expresada a partir de la secuencia de ADN puede ser
el elemento activo, por ejemplo, el ARN puede presentar actividad
anti-sentido, catalítica o de unión a proteínas.
Al entrar en contacto con la bicapa lipídica de
una célula diana, la bicapa lipídica en capas puede liberar una o
más de las secuencia nucleotídicas terapéuticas y una o más
proteínas en el interior de la célula diana. Al entrar en la célula,
la proteína o proteínas facilitan la transferencia en el núcleo y/o
integración de la secuencia nucleotídica terapéutica en el genoma de
la célula huésped.
Las estructuras de vector precipitado cocleato
utilizadas en la invención instantánea pueden prepararse mediante
procedimientos conocidos, tales como los descritos en las patentes
U.S. nº 5.643.574, nº 4.633.161, nº 4.871.488; s.
Goulg-Fogerite et al., Analytical
Biochemistry, vol. nº 148, páginas 15-25 (1985);
S. Gould-Fogerite et al., Advances in
Membrane Biochemistry and Bioenergetics, editado por Kim, C.H.,
Tedeschi, T. Diwan, J.J. y Salerno, J.C., Plenum Press, Nueva York,
páginas 569-586 (1988); S.
Gould-Fogerite et al., Gene, vol. nº
84, páginas 429-438 (1989); Liposome
Technology, 2ª edición, vol. nº I, Liposome Preparation and
Related Techniques, vol. nº II, Entrapment of Drugs and Other
Materials y vol. Nº III, Interactions of Liposomes with the
Biological Milieu, todos editados por Gregory Gregoriadis (CRC
Press, Boca Raton, Ann Arbor, Londres, Tokio), capítulo 4, páginas
67-80, capítulo 10, páginas 167-184
y capítulo 17, páginas 261-276 (1993); R.J. Mannino
y S. Gould-Fogerite, Liposome Mediated Gene
Transfer, Biotechniques, vol. nº 6, nº 1 (1988), páginas
682-690; y Miller et al., "Vaccination of
rhesus monkeys with synthetic peptide in a fusogenic proteoliposome
elicits simian immunodeficiency virus-specific CD8+
cytotoxic T lymphocytes", J. Exp. Med. Vol. nº 176,
páginas 1739-1744 (1992).
Un método para la encocleación
("atrapamiento") implica la adición de calcio a una suspensión
de lípido y material a encoclear. Este procedimiento generalmente se
lleva a cabo de la manera siguiente:
1. Se seca el lípido (y el material a encoclear
si es soluble en disolvente orgánico) hasta formar una película fina
dentro de un recipiente. Alternativamente, se utiliza lípido en
forma de polvos.
2. Se añade tampón y el lípido se suspende
mediante agitación.
3. Se añade el material acuoso soluble a
encoclear a la suspensión de liposomas.
4. La adición de una solución de calcio resulta
en la formación de láminas de bicapas fosfolipídicas queladas con
calcio.
5. Las láminas se enrollan o apilan para formar
cocleatos que contienen el material de interés.
Un procedimiento alternativo de encocleación
implica la eliminación de detergente de una solución de lípido y
material a encoclear, seguido de, o simultáneamente con, la adición
de calcio.
- 1.
- Se añade el material a encoclear a una solución que contiene un detergente (por ejemplo, \beta-D-octilglucopiranósido en un tampón de concentración salina elevada).
- 2.
- Se añade esta solución a los lípidos naturales, fosfatidilserina y colesterol.
- 3.
- Se elimina el detergente mediante diálisis, resultando en la formación de pequeñas vesículas lipídicas.
- 4.
- La adición de calcio como solución o mediante diálisis resulta en la formación de láminas de bicapas lipídicas queladas con calcio.
- 5.
- Las láminas se enrollan o apilan formando cocleatos que contienen el material de interés.
Los elementos lipídicos individuales de la bicapa
lipídica en capas de los precipitados cocleato puede ser cualquier
de las muchas estructuras lipídicas conocidas que presentan un grupo
principal polar cargado negativamente. Preferiblemente la mayoría de
los elementos lipídicos de la bicapa lipídica contienen un grupo
principal fosfolípidos cargado negativamente. Al entrar en contacto
con una bicapa lipídica de una célula diana, la bicapa lipídica en
capas es capaz de liberar una o más secuencias nucleotídicas
terapéuticas y una o más proteínas del AAV en el interior de la
célula diana.
Los precipitados cocleato adoptan la forma de
muchas estructuras físicas dentro de los límites tecnológicos, pero
que son distinguibles funcional y físicamente de los liposomas. En
su estado físico, se han observado cocleatos en formas espirales o
no espirales, cilindros, particulados de hasta varios micrómetros de
diámetro, así como estructuras similares a agujas.
Las capas de la estructura de bicapa lipídica de
los cocleatos están unidas entre sí mediante un catión asociado (por
ejemplo, Ca^{++}, Mg^{++}, etc.) unido iónicamente con el grupo
principal polar cargado negativamente. Preferiblemente el catión es
un catión divalente (por ejemplo, Ca^{++}, Mg^{++}) y
preferiblemente el catión divalente es Ca^{++}. Asociado con el
precipitado cocleato hay un oligonucleótido o polinucleótido que
contiene una secuencia nucleotídica terapéutica que codifica una
molécula terapéuticamente beneficiosa, tal como un ARN o un péptido
o polipéptido o un enzima u otra proteína.
El oligonucleótido o polinucleótido
preferiblemente es un plásmido superenrollado (pero puede ser
circular relajado o lineal). El oligonucleótido o polinucleótido
también contiene los RTIs del AAV. Preferiblemente, la secuencia
nucleotídica terapéutica está situada entre los RTIs del AAV.
La secuencia nucleotídica terapéutica puede
incluir uno o más genes terapéuticos. Un gen terapéutico puede, por
ejemplo, sustituir o suplementar material genético defectivo. Por
ejemplo, el gen terapéutico puede sustituir material genético que ha
sido dañado por mutaciones. Un gen terapéutico también podrían
codificar ARN o proteína que podría interferir con la producción,
estabilidad o actividad de un gen o producto génico endógeno o
foráneo.
Alternativamente, un gen terapéutico podría
añadir nuevo material genético para crear un nuevo fenotipo
deseable. Por ejemplo, el gen terapéutico podría codificar un enzima
de no mamífero que convirtiese un profármaco desde una forma
inactiva a una activa. Resulta fácilmente evidente a un experto
ordinario en la materia que el número de posibles genes terapéuticos
que pueden ser utilizados con la presente invención es inmenso y se
incrementará naturalmente con el avance del conocimiento de los
procesos de las enfermedades.
Se apreciará que las secuencias nucleotídicas
terapéuticas pueden incluir elementos transcripcionales y/o
traduccionales apropiados. Por ejemplo, una secuencia nucleotídica
terapéutica puede contener diversos elementos de control
transcripcional, tal como uno o más promotores, elementos promotores
corriente arriba, elementos reguladores y/o elementos
intensificadores. La expresión tejido-específica y/o
inducible de un gen terapéutico puede conseguirse mediante la
incorporación en la secuencia nucleotídica terapéutica de secuencias
promotoras/intensificadoras apropiadas.
La secuencia nucleotídica terapéutica puede
incluir una o más secuencias nucleotídicas que codifican diversas
moléculas reguladoras, tales como factores de transcripción. Tales
moléculas reguladoras pueden, por ejemplo, incluir diversos
elementos en trans.
La secuencia nucleotídica terapéutica también
puede incluir diversos elementos marcadores para identificar células
en las que la secuencia nucleotídica terapéutica se haya integrado
con éxito en el genoma de la célula huésped. También puede incluir
moléculas para permitir la selección positiva o negativa de la
célula transfectada, tal como resistencia o sensibilidad a un
fármaco.
Las secuencias nucleotídicas reconocidas por
proteínas que presentan una función de unión a ADN incluyen, pero
sin limitación, secuencias que sirven como sustratos para integrasa,
helicasa, enzimas de restricción, isomerasa, telomerasa, enzimas de
reparación o secuencias reguladoras génicas.
Las proteínas que se unen a las secuencias
nucleotídicas o al genoma de la célula diana y facilitan la
integración de la secuencia nucleotídica terapéutica en tal genoma
están empaquetadas dentro de la bicapa lipídica junto con la
secuencia nucleotídica terapéutica. Al entrar en la célula, la
proteína o proteínas son capaces de facilitar la integración de la
secuencia nucleotídica terapéutica en el genoma de la célula
huésped.
La invención incluye ambas proteínas, Rep 68 y
Rep 78, del virus adenoasociado.
Se apreciará que la célula diana puede ser
cualquier célula en la que la bicapa lipídica en capas sea capaz de
liberar su contenido. Los procedimientos para la determinación de si
una célula es susceptible de transfección por un vector particular
son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica de la
terapia génica y sólo implican experimentación rutinaria. La célula
diana preferiblemente es una célula humana pero puede ser una célula
de cualquier otro primate o animal que sea susceptible de
transfección e integración por la estructura de vector cocleato en
presencia de proteínas adecuadas que presenten una función de unión
a ADN. Alternativamente, la presente invención puede aplicarse a la
liberación de complejos ADN-proteína a
microorganismos o plantas.
La invención puede liberarse in vivo
mediante cualquier medio, lo que hace entrar en contacto la bicapa
lipídica en capas con una célula diana. Los medios ejemplares de
administración incluyen la administración oral, parenteral, rectal,
tópica, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea,
intramuscular, intravenosa, transdérmica, espinal, intratecal,
intraarticular, intraarterial, subaracnoide, bronquial, linfática e
intrauterina. Alternativamente, la invención puede utilizarse en la
terapia génica ex vivo, que implica la extracción de células,
tales como células madre pluripotentes, de un animal mediante
diversos medios conocidos en la técnica, la transfección ex
vivo de tales células con materiales genéticos exógenos y la
sustitución de las células transformadas resultantes en el mismo u
otro animal.
La presente invención contempla la utilización de
composiciones o formulaciones farmacéuticas para la utilización
médica en el hombre que comprende las estructuras de vector cocleato
de la presente invención como ingredientes terapéuticos. Tales
composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores
farmacéuticamente efectivos, y opcionalmente, puede incluir otros
ingredientes terapéuticos. El portador o portadores deben ser
farmacéuticamente aceptables en el sentido de que son compatibles
con los ingredientes terapéuticos y no son excesivamente
perjudiciales para el recipiente de los mismos. El ingrediente o
ingredientes terapéuticos se proporcionan en una cantidad necesaria
para conseguir el efecto terapéutico deseado, descrito
posteriormente.
El modo de administración y formas de
dosificación evidentemente afectará a las cantidades terapéuticas de
los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación de
tratamiento dada. Los materiales genéticos se liberan en una
cantidad capaz de provocar que el recipiente produzca moléculas
terapéuticas en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad
terapéuticamente efectiva es una cantidad necesaria para prevenir,
retrasar o reducir la severidad de la aparición de la enfermedad o
una cantidad necesaria para detener o reducir la severidad de una
enfermedad crónica. Resultará fácilmente evidente a un experto
ordinario en la materia que esta cantidad variará según factores
como el peso y salud del recipiente, el tipo de células que se
transforman, el modo de administración de las presentes
composiciones y el tipo de trastorno médico bajo tratamiento.
Las formulaciones de la presente invención pueden
presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, pastillas,
tabletas o comprimidos, conteniendo cada una cantidad predeterminada
de la estructura de vector de liberación; o como una suspensión.
Tal como ilustran los ejemplos siguientes, los
vectores de expresión del ADN que contiene RTIs del AAV, al
formularse con las proteínas del AAV Rep 68 y Rep 78 y con un
precipitado cocleato, pueden mediar en la transferencia génica
exitosa a células humanas. El coempaquetado de las proteínas Rep del
AAV y los vectores de transferencia de gen ADN que contienen RTI del
AAV permite la rápida transferencia génica a células diana en reposo
tras la manipulación ex vivo limitada en ausencia de
estimulación con citoquinas, resultando en la transferencia génica a
largo plazo de células madre pluripotentes a células madre
potencialmente pluripotentes.
Tal como se indica en los ejemplos
posteriormente, las células progenitoras CD34^{+} humanas adultas
o neonatales pueden transfectarse con genes marcadores mediante este
método tras una exposición ex vivo breve a estructuras de
liberación vector cocleato en ausencia de estimulación con
citoquinas. Tanto el RTI del AAV como las proteínas Rep contribuyen
a la eficiencia de este procedimiento. Dicho procedimiento es
aproximadamente cinco veces más eficiente que la transferencia
génica mediante un vector retroviral estándar en ausencia de
estimulación con citoquinas. Aunque los protocolos de transferencia
génica retroviral estándar que hacen uso de estimulación con
citoquinas resultan en una transferencia génica más eficiente tras
tres días de estimulación in vitro (ver Experimento 3), las
dianas transfectadas de esta manera presentan una capacidad reducida
de reconstitución hematopoyética. En contraste, los procedimientos
de la presente invención son superiores a la transferencia génica
retroviral estándar debido a que permiten la rápida transducción de
células madre hematopoyéticas en ausencia de estimulación con
citoquinas con un mantenimiento probable de la
pluripotencialidad.
Los ejemplos siguientes demuestran la eficacia de
los complejos cocleato específicos de ADN-proteína
para conseguir la transferencia y expresión génicas estables en
células madre hematopoyéticas humanas. Los cocleatos que contienen
un plásmido que codifica la secuencia de repetición terminal iterada
(RTI) dentro del genoma del AAV y las proteínas Rep 68 y Rep 78, se
ha demostrado que presentan una eficiencia de transducción más
elevada que los cocleatos que contienen un plásmido con sólo una
proteína, o que un plásmido que contenga LTRs en lugar de RTIs.
La eficiencia de transducción de un gen marcador
seleccionable (resistencia a la neomicina) puede evaluarse mediante
e número de colonias G418 resistentes producidas. La transducción y
expresión génicas estables del gen de la neomicina fosfotransferasa
(neo) permite la replicación celular y el crecimiento de colonias en
presencia del antibiótico G418. Las células que no se transducen
establemente y no expresan la proteína, no pueden sobrevivir en
presencia de concentraciones apropiadas de G418.
Se expresaron las proteínas Rep 68 y Rep 78 como
proteínas de fusión de proteína de unión a la maltosa (MPB) en E.
coli, tal como se describe en Chiorini et al.,
"Biologically active proteins of adeno-associated
virus type II produced as fusion proteins in Escherichia
coli", Journal of Virology 68: 797-804 (1994)
(la descripción de las cuales se incorpora en el presente documento
como referencia). Se purificaron las proteínas expresadas en
bacterias sobre una columna de afinidad de amilosa.
Se incorporó en cocleatos (se encocleó) solo o
coempaquetado con una o ambas de las proteínas Rep 68 y Re 78, el
vector plásmido ADN de transferencia génica (CWRSVN) que contenía un
gen marcador de la neomicina fosfotransferasa (neo) regulado por
SV40 flanqueado por RTIs 5' y 3' (ver figura 1) (Chatterjee et
al., "Dual target inhibition of HIV-1 in
vitro by means of an adeno-associated virus
antisense vector", Science 258: 1485-1488
(1992)
Las proteínas rep 68 y 78 del AAV se unen
específicamente a los RTIs del AAV pero no se unen a las secuencias
de repetición terminal larga (LTRs) del virus de la leucemia murina
(VLM). Como control de especificidad de la interacción proteína
rep-ADN, se incorporó en los cocleatos solo o
coempaquetado con las proteínas Rep 68 y Rep78 el vector de ADN
G1EN, que contiene un gen marcador de la neomicina fosfotransferasa
(neo) regulado por SV40 flanqueado por los LTRs 5' y 3' del VLM
(Morgan et al., "Retroviral vectors containing putative
internal ribosome entry sited: development of a polycistronic gene
transfer system and applications to human gene therapy", Nucleic
Acids Research 20: 1293-1299 (1992).
En estudios iniciales, se incubaron proteínas Rep
con plásmidos en tampón con el fin de promover la formación de
complejo ADN-proteína. Se añadieron gradualmente los
plásmidos (con o sin proteínas) a una suspensión de liposomas
compuesta de fosfatidilserina (FS) y colesterol (COL) y después se
agitaron con vórtex. Se añadió calcio en alícuotas pequeñas, bajo
agitación, con el fin de formar cocleatos. Los complejos se
incubaron a 37ºC y después se almacenaron a 4ºC.
Protocolo general para la formulación de vectores
integrativos lípido-ADN
- 1.
- Introducir plásmido en tubos apropiados.
- 2.
- Introducir proteínas Rep en tubos apropiados que contengan ADN.
- 3.
- Incubar a temperatura ambiente durante una hora.
- 4.
- Secar el lípido en tubos separados.
- 5.
- Añadir tampón a los lípidos (por ejemplo, suficiente para preparar 0,33 mg/ml de ADN al añadirlos).
- 6.
- Mezclar con vórtex para resuspender los lípidos.
- 7.
- Sonicar para reducir el tamaño de los liposomas.
- 8.
- Añadir tampones que contenga ADN y proteínas a los lípidos.
- 9.
- Insuflar nitrógeno en los tubos para sustituir el aire.
- 10.
- Agitar con vórtex brevemente.
- 11.
- Añadir calcio soluble bajo agitación suave para mezclar.
- 12.
- Almacenar a 4ºC.
Puede modificarse la formulación del vector
cambiando la proporción entre proteínas de unión a ADN y ADN. La
formulación actual consiste en una proporción de 0,66 a 1,0 en peso,
33 a 1,0 proporción en moles. Un intervalo probable de proporciones
útiles para la formulación estaría comprendida entre 1:1 y 1.000:1
proporción molar entre proteínas de unión a ADN y secuencias en el
ADN a las que se unen.
Macroscópicamente, las formulaciones finales
consisten en suspensiones blancas pesadas. La observación mediante
microscopía óptica de contraste de fases (1.000x) indicó
suspensiones pesadas de cristales granulares refráctiles, tanto en
forma libre como de agregado. Se confirmó la existencia de
estructura cocleato de los cristales mediante adición de EDTA, que
provocó la conversión de los cristales de cocleato a liposomas.
Las condiciones que promueven la formación de
complejos ADN-proteína de unión pueden variar pero
pueden determinarse experimentalmente. Las condiciones utilizadas
fueron tampón TES (NaCl 100 mM, TES 2 mM, histidina 2 mM, pH 7,4) a
aproximadamente 2 veces el volumen de proteína en el tampón en el
que se purificó (tamponado con HEPES, pH 7,5, KCl 150 mM, MgCl_{2}
1 mM, EDTA 0,1 mM y maltosa 10 mM) utilizando una proporción de
ADN a lípido de 1,0:10,0 en peso. Un intervalo probable de
proporciones útiles para las formulaciones estaría comprendido entre
1:1 y 1:100 en peso.
Los cocleatos se formularon utilizando:
- 1.
- ningún vector ADN ni proteínas Rep;
- 2.
- El vector ADN G1EN y nada de proteínas Rep;
- 3.
- G1EN y proteínas Rep 68 y Rep 78 (la presente invención)
- 4.
- CWRSVN y nada de proteínas Rep;
- 5.
- CWRSVN y proteína Rep 68;
- 6.
- CWRSVN y proteína Rep 78; y
- 7.
- CWRSVN y Rep 68 y 78 (la presente invención)
(Proporción de ADN a lípido de 1:10 en peso y
proporción de proteína individual a ADN de 0,66:1 en peso)
Las dianas de células progenitoras CD34^{+}
humanas se obtuvieron de sangre de cordón neonatal o mediante
citoferesis de voluntarios adultos pretratados con factor
estimulante de colonias de granulocitos macrófagos
(GM-CSF) bajo un protocolo autorizado Baltimore para
el uso humano de la Universidad de Maryland.
A continuación, se enriquecieron adicionalmente
células sanguíneas periféricas mononucleares para dianas CD34^{+}
mediante selección positiva utilizando una columna de inmunoafinidad
CellPro (Bothell, WA).
En una transducción típica (experimento in
vitro de transferencia génica), se resuspendieron 40.000 dianas
celulares de sangre de cordón o células CD34^{+} adultas en 200
\mul de RPMV en FCS al 10% y se incubaron con 5 \mul de una
suspensión de vector cocleato (1,33% del volumen total del cultivo)
que contenía 1,66 \mug de ADN, 16,6 \mug de lípido y 2,2 \mug
de cocleatos de proteína a 37ºC durante 12 horas. Seguidamente, las
células se cultivaron inmediatamente en placa en Methocult HC (Stem
Cell Tech, Vancouver) con G418 con el fin de medir la capacidad de
las células madre de expresar el gen marcador neo transferido y
formar colonias. Un intervalo probable de condiciones útiles de
transducción incluiría 40.000 células diana en 200 \mul de medio
incubado en presencia de una suspensión de vector cocleato
consistente en cantidades comprendidas entre 0,1 \mug de ADN, 1,0
\mug de lípido y 0,13 \mug de proteína y 10 \mug de ADN, 100
\mug de lípido y 13 \mug de proteína. Puede modificarse el
número de células, de la misma manera que el volumen de suspensión
de cocleato.
Inicialmente, se llevaron a cabo estudios de
toxicidad sin selección de G418 con el fin de determinar el
intervalo a utilizar de concentraciones de los cocleatos. Para
40.000 células en 200 \mul de medio, 25 \mul de suspensión de
vector (8,3 \mug de ADN, 83,0 \mug de lípido, 11,0 \mug de
proteína) y cantidades superiores mostraron algo de toxicidad,
mientras que 15 \mul de suspensión de vector (5 \mug de ADN, 50
\mug de lípido y 6,6 \mug de proteína) y cantidades inferiores
mostraron una toxicidad mínima o nula. A continuación se muestran
los resultados de los experimentos de transferencia génica llevados
a cabo con las formulaciones anteriormente indicadas.
| Células CD34^{+} de sangre de cordón neonatal en 1 mg/ml de G418 | |
| Tipo cocleato | Colonias/30 campos* |
| Sin cocleatos | 20 |
| Solo cocleatos CWRSVN | 23 |
| Cocleatos CWRSVN/Rep 68 | 26 |
| Cocleatos CWRSVN/Rep 78 | 27 |
| Cocleatos CWRSVN/Rep 68 y Rep 78 | 38 |
| *media de dos placas |
Estos resultados demuestran que un vector génico
flanqueado por los RTIs del AAV y formulado con las proteínas Rep 68
y Rep 78 y cocleatos pueden transferir un gen marcador capaz de ser
expresado durante 10 a 14 días en cultivo en células hematopoyéticas
formadoras de colonia. Tanto el RTI del AAV como las proteínas Rep
contribuyen a la eficiencia de este proceso. Dicho proceso es
aproximadamente cinco veces más eficiente que la transferencia
génica mediante un vector retroviral estándar en ausencia de
estimulación con citoquinas. Aunque los protocolos de transferencia
génica retrovirales estándar que utilizan la estimulación con
citoquinas resultan en una transferencia génica más eficiente tras
tres días de estimulación in vitro (ver Experimento 3), las
dianas transducidas presentan una capacidad reducida de repoblación
a largo plazo.
Puede utilizarse un vector génico terapéutico
flanqueado por los RTIs del AAV y co-empaquetarse
con las proteínas Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la
transfección y tratamiento de células hematopoyéticas progenitoras
genéticamente anormales incluyendo las células madre. Los ejemplos
de genes terapéuticos y el trastorno hematopoyético con el que están
asociados incluyen un gen normal de la betaglobina que se expresará
en glóbulos rojos de la sangre para corregir la
beta-talasemia o la anemia de células falciformes,
un gen normal para la adenosina desaminasa que se expresará en
linfocitos para corregir algunas formas de inmunodeficiencia
combinada severa, genes normales p47 y p67 phox (oxidasa fagocítica)
que se expresarán en células fagocíticas para corregir la enfermedad
granulomatosa crónica y un gen que codifica ARN antisentido contra
un oncogen transformante que contribuye a la leucemia o a linfoma,
tal como anti-myc en el linfoma de Burkitt.
Puede utilizarse un vector génico terapéutico
flanqueado por los RTIs del AAV y coempaquetado con las proteínas
Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la transfección transitoria o
estable con el fin de sustituir, corregir o modular funciones en
rutas metabólicas. Esto puede conseguirse mediante la transfección
de una diversidad de tipos celulares dependiendo de la aplicación,
tal como el pulmón, la piel y el hígado. Entre los ejemplos de genes
terapéuticos y el trastorno sanguíneo con el que se asocian se
incluyen un gen normal para el inhibidor C1 (proteína complemento)
en el tratamiento del edema angioneurótico hereditario, un gen
normal para el factor de coagulación en el tratamiento de la
hemofilia y un gen normal para la insulina en el tratamiento de la
diabetes.
Puede utilizarse un vector génico terapéutico
flanqueado por los RTIs del AAV y coempaquetado con las proteínas
Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la transfección y tratamiento de
las células tumorales. Entre los ejemplos de genes terapéuticos y el
efecto que presentaría el gen expresado se incluyen un gen regulador
normal para restaurar el crecimiento controlado, tal como p53 y el
retinoblastoma, y un gen normal para una proteína o ARN que regula
la expresión de otros genes alterados o sobreexpresados que sean
responsables del comportamiento oncogénico o metastásico, tales como
ras, myc, ligando fas y receptores de superficie.
- 1.
- Añadir plásmidos en tampón dentro de tubos apropiados.
- 2.
- Añadir proteínas integrativas en tampón a tubos apropiados que contenga ADN.
- 3.
- Incubar a temperatura ambiente durante una hora.
- 4.
- Secar el lípido en tubos separados.
- 5.
- Añadir tampón a los lípidos (por ejemplo, una cantidad suficiente para preparar 0,33 mg/ml de ADN tras la adición).
- 6.
- Agitar con vórtex para resuspender los lípidos.
- 7.
- Sonicar para reducir el tamaño de los liposomas.
- 8.
- Añadir tampones que contengan ADN y proteínas a los lípidos.
- 9.
- Insuflar nitrógeno en los tubos para sustituir el aire.
- 10.
- Agitar brevemente con vórtex.
- 11.
- Añadir calcio soluble gradualmente bajo agitación suave para mezclar.
- 12.
- Almacenar a 4ºC.
Puede modificarse la formulación del vector
cambiando la proporción entre proteínas de unión a ADN y el ADN.
Otras estructuras integrativas proteína/ADN que pueden utilizarse
son los elementos transponibles entre organismos procarióticos y
eucarióticos que incluyen bacterias, levaduras, virus, células
animales y células vegetales. Entre los ejemplos de elementos
transponibles se incluyen las retrotransposasas y sus sustratos
secuencias procedentes de ADN de retrotransposones de proteínas
transposasa de levadura, bacterianas o de bacteriófago y sus
secuencias sustrato, e integrasas retrovirales y las secuencias de
repetición terminal larga (RTL) a las que se unen, catalizando la
integración en los cromosomas de la célula huésped (por ejemplo, el
virus del sarcoma de Rous o VIH-1 ó
VIH-2).
Claims (25)
1. Estructura de vector de liberación que
comprende:
a) una composición cocleato que comprende una
estructura de bicapa lipídica, elementos lipídicos individuales que
contienen un grupo principal cargado negativamente y cationes;
b) proteínas que facilitan la integración de una
o más secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de una
célula diana en la que las proteínas comprenden tanto Rep 68 como
Rep 78 y
c) un polinucleótido que comprende una o más
secuencias de ADN reconocidas por una o más proteínas que facilitan
la integración de secuencias nucleotídicas y uno o más
oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo cada uno una
secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una molécula
terapéuticamente beneficiosa.
2. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que el polinucleótido se selecciona de entre
el grupo que consiste en un plásmido o constructo de ácido
nucleico.
3. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que la estructura no incluye un
polinucleótido que expresa una o más proteínas que facilitan la
integración.
4. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que el catión es un catión divalente.
5. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que el catión es calcio.
6. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que una o más secuencias de ADN reconocidas
por una o más proteínas de unión son las regiones de repetición
terminal invertida de virus adenoasociado.
7. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que uno o más oligonucleótidos o
polinucleótidos comprenden un segmento de ADN que está flanqueado en
cada extremo por como mínimo una de las regiones de repetición
terminal invertida.
8. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que la célula diana es una célula
humana.
9. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 1, en la que la célula diana es una célula madre
pluripotente.
10. Estructura de vector de liberación para
liberar en el interior de una célula diana una o más secuencias
nucleotídicas terapéuticas y una o más proteínas que se unen a ADN
para facilitar la integración de una o más secuencias nucleotídicas
terapéuticas en el genoma de la célula huésped, comprendiendo la
estructura de vector de liberación:
a) un cocleato que comprende un elemento de
bicapa lipídica en el que las capas del elemento de bicapa lipídica
están unidas entre sí mediante un catión divalente de calcio;
b) una proteína de unión a ADN del virus
adenoasociado de tipo II que comprende una proteína Rep 68 y una
proteína Rep 78; y
c) un polinucleótido que comprende una o más
regiones de repetición terminal invertida de virus adenoasociado de
tipo II y uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo
cada uno una secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una
molécula terapéuticamente beneficiosa.
11. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 10, en la que el polinucleótido se selecciona de
entre el grupo que consiste en un plásmido o constructo de ácido
nucleico.
12. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 10, en la que uno o más oligonucleótidos o
polinucleótidos comprende un segmento de ADN que está flanqueado en
cada extremo por como mínimo una de las regiones de repetición
terminal invertida.
13. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 10, 11 ó 12, en la que la estructura no incluye un
polinucleótido que expresa una o más proteínas que facilitan la
integración.
14. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 10, en la que la célula humana es una célula
humana.
15. Estructura de vector de liberación según la
reivindicación 10, en la que la célula diana es una célula madre
pluripotente.
16. Composición farmacéutica que comprende una
estructura de vector de liberación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente
aceptable.
17. Procedimiento in vitro para la
transformación de una célula diana con una o más secuencias
nucleotídicas terapéuticas, comprendiendo el procedimiento la
transfección de una célula diana in vitro con una estructura
de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
15.
18. Estructura de vector de liberación según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su utilización en un
procedimiento destinado al tratamiento de un cuerpo humano o animal
mediante cirugía o terapia y/o procedimientos diagnósticos aplicados
sobre el cuerpo humano o animal.
19. Utilización de estructura de vector de
liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la
preparación de una composición de utilización en un procedimiento
destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía
o terapia y/o en un procedimiento diagnóstico aplicado sobre el
cuerpo humano o animal.
20. Utilización según la reivindicación 19, en la
que el procedimiento implica la etapa de transfectar células diana
en cultivo y una etapa de introducir las células transfectadas en un
cuerpo humano o animal.
21. Utilización según la reivindicación 20, en la
que dicha célula diana es una célula humana.
22. Utilización según la reivindicación 21, en la
que la célula diana humana es una célula madre pluripotente.
23. Utilización según la reivindicación 22, en la
que el procedimiento se lleva a cabo en ausencia de estimulación con
citoquinas.
24. Procedimiento para la producción de la
estructura de vector de liberación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 que comprende las etapas siguientes:
a. introducir un vector de ADN en tampón en tubos
apropiados;
b. introducir una proteína integrativa en tampón
en tubos apropiados que contiene un vector de ADN;
c. incubar a temperatura ambiente durante una
hora;
d. secar un lípido en un tubo separado;
e. introducir un tampón en el lípido a un volumen
en el que al mezclar con el tampón que contiene el vector, una
solución final contenga el vector de ADN a una concentración de 0,33
mg/ml;
f. mezclar con vórtex para suspender el lípido en
una forma liposomal;
g. sonicar para reducir el tamaño del
liposoma;
h. después introducir el tampón que contiene el
vector de ADN y la proteína en el tubo que contiene el tampón que
contiene lípido;
i. insuflar nitrógeno en el tubo de (h) para
sustituir el aire;
j. mezclar brevemente el tubo con vórtex;
k. después, añadir gradualmente calcio soluble
como catión en el tubo de (j) bajo agitación suave para mezclar y
para formar un cocleato que comprende un elemento de bicapa lipídica
y el catión y que comprende además la proteína integrativa y el
vector; y
l. almacenar la proteína integrativa,
vector-cocleato a 4ºC.
25. Procedimiento para la producción de la
estructura de vector de liberación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, que comprende las etapas siguientes:
(a) incubar un vector de ADN y una o más
proteínas integrativas en tampón para formar complejo de vector
ADN-proteína integrativa;
(b) mezclar el complejo de vector
ADN-proteína integrativa con una suspensión de
liposomas; y
(c) añadir catión para formar un cocleato de
vector ADN-proteína integrativa.
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