ES2233665T3

ES2233665T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr3.

Info

Publication number: ES2233665T3
Application number: ES01954016T
Authority: ES
Inventors: Bettina Mockel; Caroline Kreutzer
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2021-07-06
Also published as: CN1462308A; CN100368545C; EP1307562B1; ATE284960T1; US20050003423A1; EP1307562A1; WO2002012505A1; AU2001276385A1

Abstract

Una bacteria corineforme aislada, en la cual se elimina la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO:2, en la que el polipéptido tiene la función de un regulador transcripcional de la familia lysR.

Description

Secuencias de nucleótidos que codifican el gen lysR3.

La invención proporciona bacterias aisladas corineformes, en las que se elimina la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido lysR3, y un procedimiento para la preparación fermentativa de L-lisina y
L-valina. El gen lysR3 codifica la proteína LysR3, que es un regulador transcripcional de la familia LysR.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos, en particular la L-lisina y la L-valina, se usan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de la alimentación y, muy particularmente, en nutrición animal.

Se sabe que se preparan aminoácidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. A causa de su gran importancia, se están emprendiendo trabajos constantemente para mejorar los procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento se pueden relacionar con medidas relativas a la fermentación, tales como, por ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o la elaboración de la forma del producto, mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de producción del propio microorganismo.

Se usan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes para mejorar las propiedades de producción de estos microorganismos. Se obtienen, de esta manera, cepas que son resistentes a antimetabolitos o son auxotróficas respecto a metabolitos de importancia regulatoria, y que producen aminoácidos.

También han sido empleados durante algunos años métodos de la técnica del ADN recombinante para mejorar el linaje de cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos.

M. Vrljic et al. (Molecular Microbiology, Blackwell Scientific, Oxford, GB, Vol. 22, No. 5, 1 de Diciembre de 1996 (1996-12-01), páginas 815-826, XP 000675794 ISSN: 0950-382X, describen una cepa corinebacteriana que carece de lysG, un miembro de la familia LysR de reguladores. Sin embargo, no hay una homología secuencial significativa entre la LysG y la LysR, y el efecto en la producción de lisina mostrado allí estuvo relacionado con la disrupción de la proteína de exportación LysE más que relacionado con la disrupción de la LysG.

Objeto de la invención

Los inventores tenían el objeto de proporcionar nuevas medidas para una preparación fermentativa mejorada de
L-lisina y L-valina.

Descripción de la invención

La invención proporciona:

una bacteria aislada corineforme, en la que se elimina la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO:2, en la que el polipéptido tiene la función de un regulador trnscripcional de la familia
lysR.

Preferiblemente, dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

El polipéptido es codificado preferiblemente por la secuencia núcleotida mostrada en la SEQ ID NO.1.

La invención también proporciona:

un vector pCR2.1lysR3int, depositado en Escherichia coli DSM 13618 en el DSMZ [German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures], Braunschweig (Alemania);

y bacterias corineformes que contienen una inserción o una supresión en el gen lysR3, en particular usando el vector pCR2.1lysR3int.

Se describen polinucleótidos que comprenden sustancialmente una secuencia polinucleótida, que son obtenibles por cribado ("screening") por medio de hibridación de una librería genómica correspondiente, que comprende el gen completo con la secuencia polinucleótida correspondiente a la SEQ ID No. 1, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado, acorde con la SEQ ID No. 1 ó un fragmento de ella, y aislamiento de la secuencia de ADN mencionada.

Las secuencias polinucleótidas acordes con la invención son adecuadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, con el fin de aislar, en la longitud completa, ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican la proteína LysR3, o para aislar aquellos ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que tienen una alta similitud con la secuencia del gen lysR3.

Las secuencias polinucleótidas acordes con la descripción son adecuadas además como cebadores, con la ayuda de los cuales se puede preparar ADN de los genes que codifican la proteína LysR3 con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden al menos 30, preferiblemente al menos 20, muy particularmente preferible al menos 15 nucleótidos sucesivos. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 40 ó 50 nucleótidos son adecuados también.

"Aislada" significa separada de su entorno natural.

"Polinucleótido" se refiere, en general, a polirribonucleótidos y polidesoxirribo- nucleótidos, siendo posible que estos sean ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados.

"Polipéptidos" se entiende que significan péptidos o proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

Los polipéptidos descritos incluyen un polipéptido acorde con la SEQ ID No. 2, en particular aquellos con la actividad biológica de la proteína LysR3, y también aquellos que son idénticos al menos en un 90% a 95% al polipéptido acorde con la SEQ ID No. 2 y tienen la actividad mencionada.

La invención proporciona además un procedimiento para la preparación fermentativa de L-lisina y L-valina usando bacterias corineformes que ya producen en particular dicho aminoácidos, y en las que las secuencias nucleótidas que codifican el gen lysR3 se eliminan.

El término "atenuación", en relación a esto, describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo, usando un promotor débil o usando un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con una baja actividad, o inactiva el correspondiente gen o enzima (proteína), y, opcionalmente, combinando estas medidas.

Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden preparar L-lisina y L-valina, a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Pueden ser representativos de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium. Del género Corynebacterium, se puede mencionar en particular la especie Corynebacterium glutamicum, que es conocida entre los expertos por sus capacidad de producir L-aminoácidos.

Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), son en particular las conocidas cepas de tipo natural:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y

Brevibacterium divaricatum ATCC14020

o mutantes o cepas productoras de L-aminoácidos preparadas a partir de ellas, tales como, por ejemplo, las cepas productoras de L-lisina

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464

Corynebacterium glutamicum DM58-1

Corynebacterium glutamicum DG52-5

Corynebacterium glutamicum DSM 5714 y

Corynebacterium glutamicum DSM 12866

o tales como, por ejemplo, las cepas productoras de L-valina

Corynebacterium glutamicum DSM 12455

Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.

El gen lysR3 de C. glutamicum codifica la proteína LysR3, que es un regulador transcripcional de la familia LysR.

Para aislar el gen lysR3 o también otros genes de C. glutamicum, se crea una librería genómica de este microorganismo en Escherichia coli (E. coli). La creación de librerías genómicas se describe en los libros de texto y manuales conocidos de manera general. Se puede mencionar como ejemplo el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Una librería genómica bien conocida es la de la cepa W3110 de E. coli K-12, creada en vectores \lambda por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) describen una librería genómica de C. glutamicum ATCC13032, que fue creada con la ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)), por su parte, describen una librería genómica de C. glutamicum ATCC13032 usando el cósmido pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291-298).

Para preparar una librería genómica de C. glutamicum en E. coli también es posible usar plásmidos, tales como pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) o pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Son huéspedes adecuados, en particular, aquellas cepas de E. coli que son defectivas en restricciones y recombinaciones, tales como, por ejemplo, la cepa DH5\alpha (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

Los fragmentos largos de ADN clonados con la ayuda de cósmidos u otros vectores \lambda pueden ser subclonados después, por su parte, en los vectores usuales adecuados para la secuenciación de ADN.

Son descritos métodos de secuenciación de ADN, entre otros, por Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA 74:5463-5467, 1977).

Las secuencias de ADN resultantes pueden ser investigadas después con algoritmos conocidos o programas de análisis de secuencias, tales como, p. ej., el de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), el de Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) o el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)).

La secuencia de ADN de C. glutamicum que codifica la proteína lysR3 y que, como la SEQ ID No. 1, se describe en la presente invención, se ha encontrado de esta manera. La secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente ha sido derivada además de la presente secuencia de ADN por los métodos descritos anteriormente. La secuencia de aminoácidos resultante del producto genético lysR3 se muestra en la SEQ ID No. 2.

También se conocen secuencias de ADN codificantes que resultan de la SEQ ID No. 1 por la degeneración del código genético. Del mismo modo, son descritas por la invención secuencias de ADN que se hibridan con la SEQ ID No. 1 o partes de la SEQ ID No. 1. Los intercambios conservativos de aminoácidos, tales como, p. ej., el intercambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en proteínas, son además conocidos entre los expertos como "mutaciones con sentido" que no conducen a un cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir, son de función neutra. Se sabe además que los cambios en los extremos N y/o C de una proteína no pueden perjudicar sustancialmente o incluso pueden estabilizar su función. El experto puede encontrar información en este contexto, entre otros, en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en los textos conocidos de genética y biología molecular. Se describen secuencias de aminoácidos que resultan, en una manera correspondiente, de la SEQ ID No. 2.

Finalmente, se describen secuencias de ADN que se preparan por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que resultan de la SEQ ID No. 1. Tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de al menos 15 nucleótidos.

Las instrucciones para identificar secuencias de ADN por medio de hibridación pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)).

Las instrucciones para la amplificación de secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

En el trabajo de la presente invención, se ha encontrado que las bacterias corineformes producen
L-lisina y L-valina, de una manera mejorada, después de la eliminación del gen lysR3.

Para conseguir una eliminación, pueden ser eliminadas bien la expresión del gen lysR3 o bien las propiedades catalíticas de la proteína enzimática. Las dos medidas se pueden combinar opcionalmente.

La reducción en la expresión del gen puede tener lugar por cultivo adecuado o por modificación genética (mutación) de las estructuras señales de la expresión genética. Son estructuras señales de expresión genética, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión con ribosomas, el codón inicial y los terminadores. El experto puede encontrar información sobre esto, p. ej., en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, p. ej., el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6ª Edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlasgsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Las mutaciones que conducen a un cambio o reducción en las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas se conocen de la técnica anterior; los ejemplos que se pueden mencionar son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) y Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Reports from the Jülich Research Center, Jül-2906, ISSN09442952; Jülich, Alemania, 1994). Se pueden encontrar descripciones resumidas en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, p. ej., el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1986).

Son mutaciones posibles las transiciones, transversiones, inserciones y supresiones. Dependiendo del efecto del intercambio de aminoácidos sobre la actividad enzimática, se denominan mutaciones de sentido erróneo o mutaciones sin sentido. Las inserciones o supresiones de al menos un par de bases (pb) en un gen conducen a mutaciones de cambio en la estructura, como consecuencia de las cuales se incorporan aminoácidos incorrectos o la translación se interrumpe prematuramente. Las supresiones de varios codones conducen típicamente a una pérdida completa de la actividad enzimática. Las instrucciones sobre la generación de tales mutaciones están en la técnica anterior, y se pueden encontrar en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, p. ej., el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik"), 6ª Edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Un método común de mutar genes de C. glutamicum es el método de disrupción de genes y sustitución de genes descrito por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)).

En el método de disrupción de genes, una parte central de la zona codificante del gen de interés se clona en un vector plásmido que puede replicarse en un huésped (típicamente E. coli), pero no en C. glutamicum. Son vectores posibles, por ejemplo, el pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), el pK18mob o pK19mob (Scäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), el pK18mobsacB o pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), el pGEM-T (promega Corporation, Madison, WI, USA), el pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; Patente US 5.487.993), el pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o el pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). El vector plásmido que contiene la parte central de la región codificante del gen se transfiere después a la cepa deseada de C. glutamicum por conjugación o transformación. El método de conjugación es descrito, por ejemplo, por Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Los métodos para la transformación son descritos, por ejemplo, por Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de la recombinación homóloga por medio de un evento "cross-over", la región codificante del gen en cuestión es interrumpida pr la secuencia del vector y se obtienen dos alelos incompletos, uno que carece del extremo 3' y uno que carece del extremo 5'. Este método ha sido usado, por ejemplo, por Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) para eliminar el gen recA de C. glutamicum.

La Figura 1 muestra a modo de ejemplo el vector plásmido pCR2.1lysR3int, con la ayuda del cual el gen lysR3 puede ser disrumpido o eliminado.

En el método de sustitución de genes, se establece in vitro una mutación, tal como, p. ej., una supresión, una inserción o un intercambio de bases, en el gen de interés. El alelo preparado es, por su parte, clonado en un vector que no es replicativo para C. glutamicum, y éste es transferido después al huésped deseado de C. glutamicum por transformación o conjugación. Después de una recombinación homóloga por medio de un primer evento de "cross-over", que efectúa la integración, y un segundo evento de "cross-over" adecuado, que efectúa la excisión en el gen diana o en la secuencia diana, se consigue la incorporación de la mutación o del alelo. Este método fue usado, por ejemplo, por Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) para eliminar el gen pyc de C. glutamicum por una supresión.

Se puede incorporar de esta manera una supresión, una inserción o un intercambio de bases en el gen lysR3.

Además, puede ser ventajoso para la producción de L-lisina y L-valina potenciar, en particular sobreexpresar, una o más enzimas de la ruta de biosíntesis particular, de glicólisis, de anaplerosis, del ciclo de la pentosa fosfato o de la exportación de aminoácidos, además de la atenuación del gen lysR3.

Así, por ejemplo, para la preparación de L-lisina, pueden ser potenciados al mismo tiempo, en particular sobreexpresados, uno o más de los genes elegidos del grupo consistente en

\bullet: el gen dapA, que codifica la dihidrodipicolinato sintasa (documento EP-B 0 197 335),

\bullet: el gen eno, que codifica la enolasa (documento DE: 19947791.4),

\bullet: el gen zwf, que codifica el producto genético zwf (documento JP-A-09224661),

\bullet: el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)),

\bullet: el gen lysE, que codifica una proteína para la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222).

Puede ser ventajoso, además, para la producción de L-lisina, además de la eliminación del gen lysR3, que sean atenuados al mismo tiempo uno o más de los genes elegidos del grupo consistente en

\bullet: el gen pck, que codifica la fosfoenolpiruvato carboquinasa (documento DE 199 50 409.1, DSM 13047),

\bullet: el gen pgi, que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa (documento US 09/396.478, DSM 12969),

\bullet: el gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa (documento DE:1995 1975.7, DSM 13114).

Así, por ejemplo, para la producción de L-valina, pueden ser sobreexpresados

\bullet: al mismo tiempo, el gen ilvBN, que codifica la acetohidroxiácido sintasa (Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), o

\bullet: al mismo tiempo, el gen ilvD, que codifica la dihidroxiácido dehidratasa (Sahm y Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979), o

\bullet: al mismo tiempo, el gen mqo, que codifica la malato:quinona oxidoreductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)).

Además de la eliminación del gen lysR3, puede ser ventajoso además, para la producción de L-lisina y L-valina, eliminar reacciones secundarias indeseables, (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982).

La invención también proporciona los microorganismos preparados según la invención, y estos pueden ser cultivados de manera continua o de manera discontinua en el procedimiento por lotes (cultivo por lotes) o en los procedimientos de lote alimentado (procedimiento de alimentación) o lote alimentado repetido (procedimiento de alimentación repetitivo) para el propósito de la producción de L-lisina y L-valina. Se describe un resumen de métodos de cultivo conocidos en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que se use debe cumplir de manera adecuada los requerimientos de las cepas particulares. Están contenidas descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Se pueden usar como fuente de carbono azúcares y carbohidratos, tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas, tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como, por ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias se pueden usar individualmente o como una mezcla.

Se pueden usar como fuente de nitrógeno compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz fermentado, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como una mezcla.

Se pueden usar como fuentes de fósforo ácido fosfórico, dihidrogenofosfato potásico o hidrogenofosfato dipotásico, o las correspondientes sales conteniendo sodio. El medio de cultivo debe comprender además sales de metales, tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, se pueden emplear sustancias de crecimiento esenciales, tales como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias mencionadas anteriormente. Se pueden añadir además al medio de cultivo precursores adecuados. Las sustancias de partida mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de un lote único, o se pueden alimentar durante el cultivo de una manera adecuada.

Para controlar el pH se pueden emplear, de una manera adecuada, compuestos básicos, tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar el desarrollo de espuma se pueden emplear antiespumantes, tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácidos grasos. Se pueden añadir al medio sustancias adecuadas que tengan una acción selectiva, tales como, por ejemplo, antibióticos, para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aerobias, se introduce en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno, tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo es usualmente de 20ºC a 45ºC, y preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo es continuado hasta que se haya formado un máximo del producto deseado. Este objetivo se alcanza usualmente después de 10 horas a 160 horas.

Los métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen de la técnica anterior. El análisis, así, se puede llevar a cabo, por ejemplo, como describen Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) por cromatografía de intercambio aniónico con posterior derivación con ninhidrina, o se puede llevar a cabo por HPLC de fase inversa, por ejemplo como describen Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

El siguiente microorganismo ha sido depositado en el Deutsche Sammlung für Mikroarganismen und Zelkulturen, de acuerdo con el Tratado de Budapest:

\bullet: Escherichia coli, cepa TOP10F/pCR2.1lysR3int, como ASTM 13618.

El procedimiento acorde con la invención se usa para la preparación fermentativa de L-lisina y L-valina.

La presente invención se explica con más detalle en lo que sigue, con la ayuda de ejemplos de realizaciones.

El aislamiento de ADN plásmido de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, tratamiento con Klenow y con fosfatasa alcalina fueron llevados a cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Los métodos para la transformación de Escherichia coli también se describen en este manual.

La composición de los medios nutrientes usuales, tales como el medio LB ó TY, también se puede encontrar en el manual de Sambrook et al.

Ejemplo 1 Preparación de una librería genómica de cósmidos a partir de C. glutamicum ATCC 13032

Se aisló ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC 13032 como describen Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) y se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Código no. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN fueron desfosforilados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, Código no. 1758250). El ADN del vector cósmido SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160-2164) obtenido de Stratagene (La Jolla, USA, Descripción de Producto SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Código no. 251301) fue escindido con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Xbal, Código no. 27-0948-02) y fue asimismo desfosforilado con fosfatasa alcalina de camarón.

El ADN cósmido fue entonces escindido con la enzima de restricción BamHI ((Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto BamHI, Código no. 27-0868-04). El ADN cósmido tratado de esta manera fue mezclado con el ADN del ATCC13032 tratado, y el lote fue tratado con ADN ligasa de T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto T4-DNA-Ligase, Código no. 27-0870-04). La mezcla de ligación fue entonces empaquetada en fagos con la ayuda del Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción de Producto Gigapack II XL Packing Extract, Código no. 200217).

Para la infección de la cepa E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575), las células fueron recogidas en MgSO_{4} 10 mM y mezcladas con una alícuota de la suspensión de fagos La infección y titulación de la librería cósmida se llevaron a cabo como describen Sambrock et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), siendo las células puestas en placa en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + ampicilina 100 \mug/ml. Después de la incubación durante toda una noche a 37ºC, se seleccionaron clones individuales recombinantes.

Ejemplo 2 Aislamiento y secuenciación del gen lysR3

Se aisló el ADN cósmido de una colonia individual con el kit Qiaprep Spin Miniprep (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y fue escindido parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Producto No. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN fueron desfosforilados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, Producto No. 1758250). Después de la separación por electroforesis en gel, los fragmentos de cósmido en el intervalo de tamaños de 1500 a 2000 pb fueron aislados con el kit QiaExll Gel Extraction (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).

El ADN del vector secuenciador pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción de Producto Zero Background Cloning Kit, Producto No. K2500-01) fue escindido con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto BamHi, Producto No. 27-0868-04). La ligación de los fragmentos del cósmido en el vector secuenciador pZero-1 se llevó a cabo como describen Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), siendo la mezcla de ADN incubada durante una noche con ligasa de T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de ligación fue entonces sometida a electroporación (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa de E. coli DH5\alphaMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87:4645-4649) y puesta en placa en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con zeocina 50 \mug/ml.

La preparación del plásmido de los clones recombinantes fue llevada a cabo con Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación fue llevada a cabo por el método didesoxi de terminación de cadena, de Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 74:5463-5467) con las modificaciones según Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acid research, 18:1067). Se usó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit", de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044; Weiterstadt, Alemania). La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciación se llevaron a cabo en un Gel "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrilamide" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).

Los datos en bruto de secuencia obtenidos fueron procesados después usando el paquete de programas Staden (1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231) versión 97-0. las secuencias individuales de los derivados de pZero1 fueron ensambladas hasta un contig continuo. Los análisis de regiones codificantes, asistidos por ordenador, se prepararon con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231). Los análisis adicionales se llevaron a cabo con el "programa de búsqueda BLAST" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) frente al banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA).

La secuencia de nucleótidos resultante se muestra en la SEQ ID No. 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos mostró una estructura abierta de lectura de 633 pares de bases, que se llamó gen lysR3. El gen lysR3 codifica un polipéptido de 210 aminoácidos.

Ejemplo 3 Preparación de un vector de integración para la mutagénesis por integración del gen lysR3

A partir de la cepa ATCC 13032, se aisló ADN cromosómico por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994)). En base a la secuencia del gen lysR3 conocida para el C. glutamicum del ejemplo 2, se eligieron los siguientes oligonucleótidos para la reacción en cadena de la polimerasa:

: lysR3intA:

: 5'GAT GTG GTG TTG ATG GAT CT 3'

\newpage

: lysR3intB:

: 5' TCA ATT TCT CTG GCA CTG AG 3'

Los cebadores mostrados fueron sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción PCR se llevó acabo por el método PCR estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de Boehringer. Con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento interno del gen lysR3 de 323 pb de tamaño, siendo este mostrado en la SEQ ID Nº 3.

El fragmento de ADN amplificado fue ligado con el Kit TOPO TA Cloning, de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Número de Catálogo K4500-01) en el vector pCR2.1-TOPO Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657-663).

La cepa de E. coli TOP10F fue sometida después a electroporación con el lote de ligación (Hanahan, In:DNA cloning. A practical approach. Vol I, IRL-Press, Oxford, Whasington DC, USA, 1985). La selección de células portadoras de plásmidos se hizo poniendo en placa el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), que había sido suplementado con kanamicina 25 mg/l. El ADN plásmido fue aislado a partir de un transformante con la ayuda del Kit QIAprep Spin Miniprep, de Qiagen, y comprobado por restricción con la enzima de restricción EcoRI y una electroforesis posterior en gel de agarosa (0,8%). El plásmido se llamó pCR2.1lysR3int.

Ejemplo 4 Mutagénesis por integración del gen lysR3 en el productor de lisina DSM 5715 y en el productor de valina FERM BP-1763

El vector pCR2.1lysR3int mencionado en el ejemplo 3 fue sometido a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Micro-biological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715 y Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a la AEC (5-2-aminoetil-L-cisteína). La cepa FERM BP-1763 es un productor de valina que necesita isoleucina y metionina. El vector pCR2.1lysR3int no puede replicarse independientemente en la DSM 1715 ó la FERM BP-1763, y es retenido sólo si se ha integrado en el cromosoma de la DSM 1715 o la FERM BP-1763. La selección de clones con pCR2.1lysR3int integrado en el cromosoma fue llevada a cabo poniendo en placa el lote de electroporación, en agar LB ((Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que había sido suplementado con kanamicina 15 mg/l.

Para la detección de la integración, el fragmento lysR3int fue marcado con el kit Dig hybridization de Boehringer, por el método de "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim
GmbH (Mannheim, Alemania, 1993). El ADN cromosómico de un integrante potencial fue aislado por el método de Elkmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994)) y, en cada caso, escindido con las enzimas de restricción Sall, Sacl y HindIII. Los fragmentos formados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa e hibridados a 68ºC con el kit Dig Hybridization de Boehringer. El plásmido pCR2.1lysR3int mencionado en el ejemplo 3 había sido insertado en el cromosoma de la DSM 1715 y la FERM BP-1763 dentro del gen cromosómico lysR3. Las cepas se llamaron DSM5715::pCR2.1lysR3int y FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int.

Ejemplo 5 Preparación de L-lisina y L-valina

Las cepas de C. glutamicum y B. lactofermentum DSM5715::pCR2.1lysR3int y FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int obtenidas en el ejemplo 4 fueron cultivadas en un medio nutriente adecuado para la producción de L-lisina y L-valina, y se determinó el contenido en L-lisina y L-valina en el sobrenadante del cultivo.

Para esto, las cepas fueron incubadas primero en una placa de agar con el correspondiente antibiótico (agar cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) durante 24 horas a 33ºC. Partiendo de este cultivo en placa de agar, se sembró un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml). Se usó el medio completo CgIII como medio para el pre-cultivo.

\newpage

Medio Cg III
NaCl	2,5 g/l
Bacto-peptona	10 g/l
Extracto de bacto-levadura	10 g/l
Glucosa (sometida a autoclave separadamente)	2% (p/v)

El pH fue llevado hasta 7,4.

Se añadió kanamicina (25 mg/l) a esto. El pre-cultivo fue incubado durante 24 horas a 33ºC a 240 rpm en una máquina de agitación. Se sembró un cultivo principal a partir de este pre-cultivo de tal modo que la DO (densidad óptica) inicial (680 nm) del cultivo principal fue 0,1 DO. Se usó medio MM para el cultivo principal.

Medio MM
LMF (licor de maíz fermentado)	5 g/l
MOPS (ácido 3-[N-morfolin]-propanosulfónico)	20 g/l
Glucosa (sometida a autoclave separadamente)	50 g/l
Sales:
(NH_{4})SO_{4}	25 g/l
KH_{2}PO_{4}	0,1 g/l
MgSO_{4} * 7 H_{2}O	1,0 g/l
CaCl_{2} * 2 H_{2}O	10 mg/l
FeSO_{4} * 7 H_{2}O	10 mg/l
MnSO_{4} *2 H_{2}O	5,0 mg/l
Biotina (filtrada en filtro estéril)	0,3 mg/l
Tiamina * HCl (filtrada en filtro estéril)	0,2 mg/l
CaCO_{3}	2,5 g/l

El LMF, el MOPS y la solución salina se llevan a pH 7 con amoniaco acuoso y se someten al autoclave. El sustrato estéril y las soluciones vitamínicas se añaden después, así como el CACO_{3} sometido a autoclave en estado seco. Para el cultivo de la DSM 5715, se añadieron adicionalmente al medio 0,1 g/l de leucina. Para el cultivo de la FERM BP-1763, se añadieron adicionalmente al medio 0,1 g/l de isoleucina y 0,1 g/l de metionina.

El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml, en un matraz cónico de 100 ml con muescas ("baffles"). Se añadió kanamicina (25 mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y 80% de humedad atmosférica.

Después de 72 horas, la DO se determinó a una longitud de onda de medida de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de L-lisina y L-valina formadas fue determinada con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivación post-columna con detección con ninhidrina.

Los resultados del experimento se muestran en las Tablas 1 y 2.

TABLA 1

Cepa	DO (660)	Lisina HCl g/l
DSM5715	7,5	13,01
DSM5715::pCR2.1lysR3int	7,6	15,04

TABLA 2

Cepa	DO (660)	Valina g/l
FERM BP-1763	12,1	7,49
FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int	12,5	8,67

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Mapa del plásmido pCR2.1lysR3int.

Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el siguiente significado:

: KmR: gen con resistencia a la kanamicina

: EcoRi: sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI

: lysR3int: fragmento interno del gen lysR3

: ColE1 ori: Origen de replicación del plásmido ColE1

<110> Degussa AG

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevas secuencias de nucleótidos que codifican el gen lysR3

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 000183 BT

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1032

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (201)..(230)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gen lysR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

Claims

1. Una bacteria corineforme aislada, en la cual se elimina la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO:2, en la que el polipéptido tiene la función de un regulador transcripcional de la familia lysR.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha bacteria es de la especie Corynebacterium glutamicum.

3. La bacteria corineforme según la reivindicación 1 ó 2, en la que el polinucleótido se elige del grupo:

a): secuencia de nucleótidos como la expresada en la SEQ ID NO:1, ó

b): secuencias de nucleótidos correspondientes a la secuencia SEQ ID NO:1 dentro de la degeneración del código genético; o

c): secuencias de nucleótidos con mutaciones de sentido neutro en la SEQ ID NO:1.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO:2.

5. Un procedimiento para la preparación de L-lisina o L-valina, que comprende:

: fermentación de dicha bacteria productora de aminoácidos acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio.

6. Un procedimiento para la preparación de L-lisina o L-valina, que comprende la fermentación de bacterias corineformes en las que se elimina la actividad intracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se expresa en la SEQ ID NO:2, particularmente la expresión de los polinucleótidos elegidos del grupo:

a): secuencia de nucleótidos como la expresada en la SEQ ID NO:1, ó

c): secuencias de nucleótidos con mutaciones de sentido neutro en la SEQ ID NO:1

que codifican dicho polipéptido con la función de un regulador transcripcional de la familia lysR3, se eliminan.

7. Un procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6,

a): fermentación de dichas bacterias corineformes que producen el L-aminoácido deseado,

b): concentración de dicho aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y

c): aislamiento del L-aminoácido.

8. El procedimiento según las reivindicaciones 5 a 7, en el que se emplean bacterias en las que están potenciados adicionalmente genes adicionales de la ruta de biosíntesis del L-aminoácido deseado.

9. El procedimiento según las reivindicaciones 5 a 8, en el que se emplean bacterias en las que se eliminan las rutas metabólicas que reducen la formación del L-aminoácido deseado.

10. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se elimina la expresión del (de los) polinucleótido(s) que codifica(n) el gen lysR3.

11. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se eliminan las propiedades regulatorias del polipéptido que es codificado por el polinucleótido lysR3.

12. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que para la preparación de L-lisina, se fermentan bacterias en las que, al mismo tiempo, uno o más de los genes elegidos del grupo consistente en

a): el gen dapA, que codifica la dihidrodipicolinato sintasa,

b): el gen eno, que codifica la enolasa,

c): el gen zwf, que codifica el producto genético zwf,

d): el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa

e): el gen lysE, que codifica una proteína para la exportación de lisina,

está o están potenciado(s), preferiblemente sobreexpresados.

13. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que se fermentan bacterias en las que, al mismo tiempo, uno o más de los genes elegidos del grupo consistente en:

a): el gen pck, que codifica la fosfoenol piruvato carboquinasa,

b): el gen pgi, que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa,

c): el gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa

está o están eliminado(s).

14. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que para la preparación de L-valina, se fermentan bacterias en las que, al mismo tiempo, uno o más de los genes elegidos del grupo consistente en

a): el gen ilvBN, que codifica la acetohidroxiácido sintasa,

b): el gen ilvD, que codifica la dihidroxiácido dehidratasa,

c): el gen mqo, que codifica la malato:quinona oxidoreductasa

está o están sobreexpresado(s).

15. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que se emplean microorganismos de la especie Corynebacterium glutamicum.

16. Un vector para la mutagénesis por integración que comprende el fragmento interno de la SEQ ID NO:1 expresado en la SEQ ID NO:3.

17. El vector pCR2.1lysR3int, depositado en la cepa de E. coli TOP10F/ pCR2.1lysR3int como DSM 13618.

18. Bacterias corineformes transformadas con un vector de integración que lleva el polinucleótido expresado en la SEQ ID NO:3.