ES2234257T3

ES2234257T3 - Utilizacion de las composiciones microbicidas y espermicidas para desactivar los virus no envueltos.

Info

Publication number: ES2234257T3
Application number: ES99923192T
Authority: ES
Inventors: Mary K. Howett; John W. Kreider
Original assignee: Pennsylvania State University; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Pennsylvania State University; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-05-19
Also published as: WO1999059525A2; EP1079790A4; ATE279112T1; PT1079790E; BR9910531A; NZ508226A; AU4001999A; CA2332514C; DE69921119D1; US6192887B1; US20030108509A1; US6635242B2; DE69921119T2; DK1079790T3; CA2332514A1; AU744623B2; WO1999059525A9; US6458346B1; EP1079790B1; EP1079790A2

Abstract

El uso de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato delitio, ácido láurico y sus sales en la elaboración de un medicamento para desactivar un virus no envuelto.

Description

Utilización de las composiciones microbicidas y espermicidas para desactivar los virus no envueltos.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la prevención del embarazo, y con la prevención y el control de las enfermedades de transmisión sexual y otras enfermedades gracias al empleo de composiciones que tienen un espectro amplio de actividad microbicida y espermicida, incluyendo la capacidad de desactivar agentes patógenos particularmente resistentes como el virus del papiloma humano y otros virus no envueltos.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) están entre las enfermedades más habituales y transmisibles y continúan siendo un importante problema de salud pública. Se calcula que más de 250 millones personas en todo el mundo, y cerca de 3 millones de personas en los Estados Unidos, son infectadas anualmente por la gonorrea. El índice mundial anual de la sífilis se calcula de 50 millones de personas, con 400,000 en los Estados Unidos necesitando anualmente de su tratamiento. Más recientemente, el virus de la inmunodeficiencia humana, VIH (HIV, por las siglas de su expresión inglesa, Human Immunodeficiency Virus), que como resultado da el fatal síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), se ha extendido rápidamente en los grupos tanto de los homosexuales, como de heterosexuales. La Organización Mundial de la Salud (WHO, por las siglas de su expresión inglesa, World Health Organization) y el Instituto Nacional de Sanidad de los EE.UU. (National Institute for Health, NIH) recomiendan que las madres que sean VIH positivas no amamanten a sus bebés debido a un riesgo alto de transmitir el VIH en la leche materna. Sin embargo, el fallo en la lactancia a menudo acarrea desnutrición infantil, diarrea, disentería y otras enfermedades contagiosas, porque las áreas con altos índices de VIH endógeno a menudo también tienen tiendas con alimentos de baja calidad y pobres condiciones higiénicas para los alimentos y el agua.

Ahora también se han descubierto fuertes asociaciones entre el cáncer cervical y los virus del papiloma (PVs, por las siglas de su expresión inglesa, Papillomaviruses). Ha sido calculado que mundialmente aproximadamente 25% de las mujeres tienen infección genital del virus del papiloma humano (HPV, por las siglas de su expresión inglesa, Human Papillomaviruses). Los virus del papiloma humanos (HPV), de los que ahora hay más de 90 tipos conocidos, causan papilomas (verrugas) en una variedad de metas epiteliales humanas incluyendo las verrugas comunes de las manos (verruca vulgaris) y pies (verrugas plantares), así como verrugas genitales en epitelios vulvares, vaginales, del cuello del útero y del pene. Las verrugas genitales representan una enfermedad de transmisión sexual (ETS) ubicua. Las mujeres con lesiones genitales, que contienen ciertos tipos de HPV, incluyendo los tipos 16, 18, 31, 33 y 35, tienen incrementado el riesgo de evolución al cáncer cervical. En los Estados Unidos, 15,000 mujeres al año son diagnosticadas con cáncer cervical, y hay aproximadamente 5000 muertes por año. En países en vías de desarrollo, el cáncer cervical es la causa principal de las muertes relacionadas con cáncer entre mujeres.

Los PVs presentan un desafío único para los investigadores al intentar identificar a los agentes virucidas. Los PVs son intrínseca y sumamente resistentes al ataque por agentes antimicrobianos. En adición, los virus PV no existen libres en la naturaleza de la misma manera que existen muchos no envueltos. Frecuentemente, los PVs existen recubiertos en las escamas de las células epiteliales diferenciadas. Por lo tanto, los PVs no sólo están protegidos por sus propias cápsides muy difíciles de traspasar, sino también por las escamas circundantes, en exceso queratinizadas y reticuladas, de las células epiteliales.

Un enfoque para el control general de las ETS es el empleo de microbicidas controlados femeninos, aplicados tópicamente, que desactivan los agentes patógenos relevantes. Más frecuentemente, estos microbicidas son preparaciones espermicidas que contienen el detergente NONOXIL-9 (N-9) que desactiva los virus envueltos, como HSV-2 y HIV-1. Hasta la fecha, estas preparaciones no han sido eficaces, sin embargo, contra los virus no envueltos como los HPVs.

La incapacidad de desactivar los HPVs hace del N-9 una sustancia virucida inadecuada contra esta ETS. Además el uso crónico de N-9 recientemente fue relacionado con una aumentada conversión de suero a la positividad respecto a los anticuerpos del VIH-1 en un grupo de prostitutas, indicando la posibilidad de que el N-9 pueda erosionar el epitelio vaginal. El uso frecuente de N-9 también está positivamente correlacionado con las vaginosis bacterianas, las úlceras genitales y vulvitis, la candidiasis vaginal, el síndrome de choque tóxico, y la interrupción de epiteliales del cuello del útero y la vagina. El detergente, sin embargo, es espermicida y ha sido demostrado que desactiva los virus envueltos. Está presente en un gran número de condones y otros agentes espermicidas.

Otros microbicidas, como octoxinol-9 (0-9), cloruro de benzalconio (BZK) y clorhexidina, son también tensioactivos que pueden afectar las envolturas del HSV-2 y VIH-1 vía las propiedades de agente tensioactivo/detergente. De la misma manera que el N-9, sin embargo, estos microbicidas tampoco desactivan los PVs no envueltos. Los microbicidas tópicos para la desactivación de los PVs y prevención de la transmisión animal o humana no están actualmente disponibles, pero serían muy deseables teniendo en cuenta la naturaleza ubicua de las infecciones por HPV.

La patente de los EE.UU. Nº 5.004.757 es dirigida a un método de desactivar los virus sobre las superficies aplicando una composición de tres partes que contiene gluteraldehído. La composición también contiene moléculas de glicol enlazadas por puente de hidrógeno para eliminar el olor del aldehído y un agente tensioactivo aniónico como dodecil-sulfato de sodio (SDS) como un potenciador de la actividad virucida del componente gluteraldehído. La patente de invención muestra que el SDS tiene una limitada actividad virucida por sí mismo, pero tiene un efecto sinergístico cuando se combina con el gluteraldehído. Debido a la presencia del gluteraldehído, un mutágeno conocido, la formulación no es útil contra las ETS u otras enfermedades porque no puede ser aplicada al epitelio humano.

Lo que se necesita es usar microbicidas seguros y eficaces contra las ETS que extiendan la actividad microbicida a virus no envueltos y, en particular, a los virus de papilomas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al empleo de composiciones farmacéuticas, artículos y métodos para prevenir el embarazo y la transmisión de las ETS, incluyendo el empleo de composiciones vaginales seguras y eficaces para controlar y prevenir las ETS. Las composiciones microbicidas usadas de acuerdo con la presente invención contienen un sulfato de alquilo, como SDS, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico o sus sales, como ingrediente activo capaz de desactivar espermatozoides y a un amplio espectro de microbios patógenos, incluyendo HPVs y otros virus no envueltos.

Adicionalmente, la presente invención proporciona artículos y métodos para desactivar agentes contagiosos como el VIH libre y VIH asociados a células, así como los virus no envueltos, como HPVs papoviruses humanos, picornavirus humanos (virus de la hepatitis A), y parvovirus humano, B-19, en fluidos biológicos, incluyendo, por ejemplo, leche materna humana y animal, suero y plasma. Estos artículos y métodos son proporcionados fijando SDS o un derivado de SDS a una superficie o matriz de gel en contacto con el fluido a ser tratado, o por la retirada rápida del agente tensioactivo del SDS o derivado SDS del fluido después del tratamiento con el agente tensioactivo. En una realización particularmente preferente, la superficie que tiene el tensioactivo fijado a este sitio, colocado dentro de una biberón.

La presente invención también proporciona el empleo de composiciones desinfectantes para destruir microbios patógenos sobre los aparatos médicos, compartimientos de ducha, muebles adheridos a un inmueble de baño, equipos de ejercicios y otras superficies inanimadas, así como el uso de barreras espermicidas cubiertas o impregnadas con un compuesto alquil-sulfato para lograr efectos espermicidas y microbicidas combinados.

Es interesante y sorprendente notar que, aunque ha sido conocido durante varios años que el SDS tiene limitada actividad contra los virus envueltos, y ha sido usado como un agente tensioactivo para jabones, cosméticos y otras aplicaciones tópicas variadas, como los champúes y pastas de dientes, no se ha informado ninguno registro de su uso, o el empleo de otros microbicidas para controlar los PVs. Si efectivamente cualquiera de esos usos ocurriera, no fue intencionado y sin apreciarlo; fue un accidente no reconocido. Ninguno de los estudios informado sobre los usos de los SDS han sido dirigidos por el propósito de controlar las infecciones por los virus del papiloma. Su propósito fue simplemente como agente tensioactivo/detergente, o como máximo como un facilitador de la actividad antimicrobiana del gluteraldehído. A decir verdad, no es conocido ningún uso previo del SDS para aplicación tópica que pueda ser considerado que haya conseguido una consistente actividad virucida, como se describe a continuación.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 muestra los efectos de la desactivación por SDS del virus del papiloma de conejo cottontail (CRPV, por las siglas de su expresión inglesa, Cottontail Rabbit Papillomavirus). La Figura 1a muestra el promedio del diámetro geométrico medio (GMD, por las siglas de su expresión inglesa, Geometric Mean Diameter) de seis lesiones (o) inoculadas con CRPV normal, y (*) CRPV tratado con SDS. La Figura 1b muestra el crecimiento de lesiones individuales.

La Figura 2 muestra los efectos del tratamiento con SDS y N-9 sobre el CRPV. La Figura 2a muestra que el GMD de diez sitios de inoculación que recibieron (*) el virus tratado con SDS en comparación con 10 sitios que recibieron el virus normal (o). La Figura 2b muestra el crecimiento comparativo de papilomas en 10 sitios que recibieron CRPV normal (o) comparado con 10 sitios que recibieron CRPV tratado con N-9 (-).

Las Figuras 3A hasta 3G muestran los síntomas totales por grupo de seis grupos de ratones en 3-12 días, para (A) hinchado, (B) exudado vaginal, (C) enrojecimiento, (D) muerte, (E) parálisis de las piernas, (F) pérdida de pelo perianal y (G) cualquier síntoma, en un experimento in vivo sobre la toxicidad del SDS y la protección de la infección vaginal por HSV-2.

En la Figura 4 (a) es mostrado un pezón de biberón que tiene un aparato de filtro de acuerdo con la presente invención. Las Figuras 4(b) y (c) muestran biberones de acuerdo con las otras realizaciones, en las que el microbicida alquil-sulfato de la presente invención está unido al interior del biberón de plástico y a un pequeño saquito de lactancia dentro del biberón, respectivamente.

La Figura 5 muestra la desactivación de cepas de linfocitos (Figura 5(a)), macrófagos (Figura 5 (b)), dual-trópicas (Figura 5 (c)) y de HIV-1 en presencia de N-9, C31G, y SDS.

La Figura 6 muestra la reducción de la infectividad asociada a células (Figura 6 (a)) y de la viabilidad (Figura 6 (b)) de VIH-1 en las células SupT1 infectadas, empleando N-9, C31G, y SDS.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Hemos descubierto que el SDS y los agentes tensioactivos aniónicos relacionados tienen potente actividad espermicida y virucida, incluyendo la actividad virucida contra los virus no envueltos, incluyendo los virus del papiloma, así como contra los HSV-2 y HIV-1. Como se usa en la presente solicitud, "el SDS o agente tensioactivo aniónico relacionado" significan dodecil-sulfato de sodio y otros miembros del grupo virucida de los alquil-sulfato, incluyendo pero no limitado al dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales y otros derivados.

En los experimentos dirigidos por los presentes inventores, concentraciones muy bajas del detergente/sulfactante SDS a temperaturas fisiológicas desactivaron totalmente a HSV-2 y VIH-1, así como a tres distintos tipos de virus de papiloma después de breves exposiciones al SDS. En todos los casos las concentraciones de 0,1% de SDS estuvieron bien por encima de aquellas que exhibieron la desactivación completa de los virus. Los agentes tensioactivos aniónico y derivados relacionados también presentaban una importante actividad virucida.

Como se usa en la presente solicitud, "Virucida" significa que es capaz de desactivar o destruir un virus. Un virus susceptible es cualquier virus que sea desactivado o destruido por el SDS o agentes tensioactivos aniónicos relacionados. Los virus susceptibles son fácilmente identificados en pruebas como ésas descritas más abajo, en las que la cantidad o concentración del SDS o el agente tensioactivo aniónico relacionado son consideradas virucidas si el virus es reducido en al menos 99,9% (3 unidades lóg.).

La presente invención puede ser llevada tanto in vitro como in vivo. In vitro pretende significar en o sobre cosas inanimadas, especialmente sobre objetos que tengan superficies duras o blandas, ubicadas o usadas en donde es deseado prevenir la transmisión viral. Las superficies duras incluyen las de biberones, aparatos médicos, bolsas, catéteres, tubería y otros aparatos médicos de uso permanente. Tales superficies también incluyen los interiores de edificios, el mobiliario, los muebles fijados a un inmueble de baño, los equipos de gimnasia y vallas exteriores, e. g., para retención de seres vivos. Las superficies blandas incluyen las de papel o vestidos, por ejemplo, almohadillas o tejidos prehumedecidos, tejidos faciales secos, prendas de vestir hospitalarias y ropa de cama. In vivo significa en, o sobre, una persona viva, planta o animal, especialmente sobre piel y membranas mucosas de mamíferos, incluyendo las intravaginales, de forma oral o rectal.

El SDS o un agente tensioactivo aniónico relacionado pueden ser usado a solos o en forma de una composición que contenga o conste esencialmente de una concentración virucida eficaz de SDS o de agente tensioactivo aniónico relacionado, y un portador farmacéutico aceptable. Un efecto virucida puede ser conseguido tanto cuando la composición es puesta en contacto con el virus, o viceversa, siempre que el contacto ocurra con un punto potencial conocido del virus. Las concentraciones virucidas eficaces del SDS o el agente tensioactivo aniónico relacionado están en general en el intervalo de 0,05 a 5,0 por ciento en peso, aunque puede ser usada una concentración mayor o menor en dependencia de las circunstancias especiales.

Las composiciones usadas de acuerdo con la presente invención incluyen los usos virucidas tópicos para los propósitos tanto in vitro como in vivo, especialmente para el empleo intravaginal. Para estos propósitos, el SDS o agente tensioactivo aniónico relacionado puede ser formulado en cualquier vehículo apropiado, a condición de que el agente tensioactivo y el vehículo sean compatibles, es decir, que la actividad microbicida del agente tensioactivo no se vea disminuida por el vehículo. Por tanto, las composiciones pueden estar en forma de crema, espumas, lociones, ungüentos, soluciones o sprays. El portador o vehículo diluyente puede ser acuoso o no acuoso, por ejemplo, alcohólico o oleaginoso, o una de sus mezclas, y podrían adicionalmente contener otros agentes tensioactivos, emolientes, lubricantes, estabilizadores, tinturas, perfumes, agentes antimicrobianos, como ingredientes activos o como conservantes. Además de ácidos o bases para el ajuste del pH. El pH preferido es aproximadamente 4 a 5. En la preparación de las composiciones son usados métodos convencionales.

El microbicida y agente espermicida preferido, usado de acuerdo con la presente invención, es el SDS. Preferentemente, el portador o vehículo farmacéutico aceptable, para composiciones aplicadas tópicamente, está en forma de líquido, jalea, o espuma que contiene el agente tensioactivo. El agente tensioactivo puede ser incluido en: (a) ungüentos y jaleas, (b) insertos (supositorios, esponjas, y análogos, (c) espumas, y (d) duchas.

La composición tópica puede ser aplicada en forma profiláctica o terapéutica a piel o membranas mucosas de seres humanos o de animales para la prevención y el tratamiento de los diversos estados médicos provocados por las bacterias, virus envueltos y virus no envueltos. Estas afecciones incluyen, por vía de ejemplo, las lesiones causadas por el virus del herpes, úlceras apthous, acné, verrugas plantares y las de piel, papilomas respiratorios, herpangina, esofagitis herpética, molluscum contagiosum, leucoplaquia peligrosa, y las infecciones orales o genitales Candida.

La composición tópica es preferentemente introducida en la vagina de una hembra; aproximadamente en el momento, y preferentemente antes, de sostener relaciones sexuales, pero también puede ser administrada a otras membranas mucosas. Las composiciones pueden ser empleadas para el tratamiento y protección contra las enfermedades de transmisión sexual. La manera de administración será diseñada preferentemente para obtener un contacto directo de las composiciones del agente tensioactivo de la presente invención con los microbios transmitidos por la vía sexual.

Para aplicaciones tópicas, el portador farmacéutico aceptable podría comprender disolventes orgánicos, emulsionantes, agentes de gelificación, cremas humectantes, estabilizadores, otros agentes tensioactivos, agentes humectantes, conservantes, agentes de liberación sostenida, y cantidades menores de humectantes, agentes secuestrantes, tinturas, perfumes, y adicionalmente otros componentes comúnmente empleados en las composiciones farmacéuticas para administración tópica.

Las formas sólidas de dosificación para administración tópica incluyen supositorios, polvos, y gránulos. En las formas sólidas de dosificación, las composiciones pueden ser mezcladas con, por lo menos, un diluyente inerte como sacarosa, lactosa, o almidón, y adicionalmente podrían comprender agentes lubricantes, agentes búfer y otros componentes bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones usadas de acuerdo con la presente invención también pueden ser impregnadas en materiales de sustratos absortivos, como esponjas, o recubiertas en la superficie de materiales de sustratos sólidos, como condones, diafragmas o guantes médicos, para entregar las composiciones vaginales o a otros epitelios potencialmente infectables, preferentemente antes o durante las relaciones sexuales. Los otros artículos y sistemas de entrega de este tipo serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Entre los artículos actualmente preferidos están los condones, que puede ser recubiertos rociando el SDS sobre las superficies de los condones, o impregnando el SDS en el condón durante su elaboración por los procesos ya conocidos en la técnica. Las composiciones preferentes de recubrimientos incluyen silicotas, las cuales proporcionan lubricidad y entrega el agente tensioactivo en una manera de liberación sostenida. Polímeros bioadhesivos también pueden ser usados para prolongar los aspectos de liberación en el tiempo de los medicamentos tópicos u otros especiales empleados.

Las composiciones usadas de acuerdo con la presente invención pueden prevenir y tratar un amplio espectro de infecciones provocadas por microbios patógenos. Como se usan en la presente solicitud, el término "microbios patógenos" pretende incluir bacterias, hongos, virus, levadura, Clamidia, o protozoos patógenos que no residan en el anfitrión normalmente, o que sean capaces de causar una patología en el anfitrión, y que sean capaces de ser matados por el SDS o por los agentes tensioactivos aniónicos relacionados, como se describe en detalle en la presente memoria.

Entre los microbios patógenos preferidos que constituyen una meta de las composiciones y los métodos de la presente invención están los virus de papiloma (PVs), que representan un grupo de virus de ADN no envuelto e icosahédricos. Los PVs producen neoplasmas benignos que pueden progresar hasta el cáncer. Papilomas animales ocurren en muchas especies; ciertos virus; como los virus del papiloma bovino (BPVs, por las siglas de su expresión inglesa, Bovine Papillomaviruses) y los virus del papiloma de conejo cottontail (CRPV, por las siglas de su expresión inglesa, Cottontail Rabbit Papillomavirus), representan sistemas modelo bien estudiados. Los HPVs causan verrugas a los tejidos epiteliales escogidos como objetivos. El de las verrugas, las verrucas vulgaris, verrugas plantares y los condilomas genitales representan las infecciones clínicas comunes en todos los seres humanos. Las composiciones y los métodos de la presente invención tienen utilidad en prevenir o controlar estas infecciones humanas, y también en prevenir y controlar las lesiones genitales que contienen HPV que puedan progresar hasta la malignidad, si se dejan sin tratar.

Debido a que el cáncer cervical es la causa número una de mortalidad relacionadas con el cáncer en mujeres en los países en desarrollo, la prevención eficaz de la transmisión del HPV debe tener un impacto importante sobre salud en el mundo. Por lo tanto, un método preferente de la presente invención comprende poner en contacto a las composiciones virucidas de la invención con los HPVs transmitidos durante la actividad sexual a la vagina o otras membranas mucosas. El modo preferente del contacto es por el uso de un condón cubierto, o impregnado, con éste, o por el uso de una composición farmacéutica local que contenga el SDS en cantidad suficiente como para controlar o prevenir la transmisión e infección por HPV. La actividad espermicida de los ingredientes activos de los condones y de otros artículos y composiciones de la presente invención proporciona un beneficio adicional, en donde la prevención del embarazo es deseada.

Además, el SDS y las composiciones de agentes tensioactivos aniónicos relacionados y los métodos de la presente invención pueden ser utilizados como un desinfectante para la desactivación eficaz de virus animales y humanos, no envueltos y envueltos, en general sobre las superficies como pisos, aparatos médicos, superficies de baños y equipos de gimnasio. La composición desinfectante que contiene SDS o agente tensioactivo aniónico relacionado es incluida preferentemente en un dosificador del tipo spray, con lo cual puede ser rociado directamente sobre la superficie que debe ser tratada. Un ejemplo de tal uso sería para que una persona pueda rociar la composición sobre las superficies en los baños públicos o equipos de gimnasio, a fin de matar cualquier microbio patógeno presente, proveniente de otras personas que hayan usado las instalaciones. La composición desinfectante contiene el SDS en solución o suspensión, preferentemente con un diluyente como la solución salina de búfer de fosfato, en concentraciones de SDS desde 0,05 hasta 1,0 % en peso.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un biberón de acuerdo con la reivindicación 9.

Una realización particularmente preferente de la presente invención se refiere a la inclusión del SDS o de los agentes tensioactivos aniónicos relacionados fijados sobre una superficie sólida (una superficie de plástico, o de un material similar, o la superficie de cuentas, las que pueden estar en forma, por ejemplo, la matriz de un gel o un dispositivo de filtración). Esta realización incluye, por ejemplo, recipientes o tubos para fluidos biológicos, la superficie de biberones, manguitos de lactancia de plástico para biberones, o filtros que puedan ser incluidos en el conjunto del pezón de biberones u otros recipientes o tubos para fluidos biológicos. El agente tensioactivo preferentemente estará enlazado covalentemente con el propósito de hacerlo incapaz de lixiviarse. Esta realización puede ser usada para desactivar HIV y VIH que se contengan en las células en la leche materna de madres lactantes que sean VIH positi-
vas.

La Figura 4(a) muestra un aparato 10 de pezón de biberón, que incluye un miembro flexible de pezón 11, típicamente hecho de silicona o látex, y una caperuza 12 que tiene un orificio central 13 del cual se extiende y que sobresale una porción del pezón 11. El miembro 11 del pezón incluye una pestaña 15, que se extiende en forma radial hacia afuera del miembro de pezón flexible. La unidad 16 de filtro dentro de una caperuza 12 incluye un alojamiento 17 que contiene un material matriz 18 dentro de ella. La unidad 16 de filtro también incluye un precinto 9 que tiene un hombro, que se extiende a una distancia breve dentro de la cavidad del miembro 11 del pezón flexible. El precinto 9 forma una pestaña anular 20 que se extiende en forma radial entre la pestaña 15 de pezón y las paredes 8 del biberón cuando la caperuza 12 esté en su lugar. La caperuza 12 puede ser mantenida en su lugar sobre las paredes 8 del biberón por medio de la rosca de tornillo o semejante.

El material de la matriz 18 podría contener SDS o un agente tensioactivo aniónico relacionado fijado a la matriz del material, por ejemplo, un gel, cuentas u otro material de filtro a través de los que la leche materna puede pasar siguiendo su camino desde el interior del biberón a la boca del bebé. Por tanto, cualquier VIH libre de células o virus VIH asociado a células de la leche materna se inactiva por el agente tensioactivo antes de ser ingerido por el bebé. La leche de mujer que tenga HIV u otra infección, por lo tanto, es bombeada de la materna de la mujer y se pone dentro del biberón. El miembro de pezón y la unidad de filtro asociada para la desactivación del HIV o de HIV asociado a células de la leche materna de acuerdo con la presente invención son puestos en el biberón luego con la tapa 12 del biberón, pestaña 15 y precinto 9 manteniendo la unidad 16 del filtro en su lugar para que la leche tratada pueda entonces ser alimentada al bebé mientras la leche todavía está tibia.

Por otra parte, material 18 de matriz podría incluir un material que retirara químicamente al SDS o al agente tensioactivo aniónico relacionado. De acuerdo con esta realización, el agente tensioactivo puede ser mezclado con la leche materna tibia y luego la leche puede ser alimentada al bebé a través de la unidad pezón de la presente invención. De esta manera, el VIH es desactivado al ser mezclado con el agente tensioactivo. Luego, el agente tensioactivo es retirado por la matriz durante el proceso de alimentación.

Como muestran las Figuras 4(b) y (c), el agente tensioactivo también puede ser fijado a la superficie interior 21 de un biberón 22 de plástico, o al interior de un saquito de lactancia 23 de plástico. La leche puede ser bombeada del pecho de la madre y luego puesta dentro del biberón o del saquito que contenga al agente tensioactivo. El biberón y la leche son preferentemente agitadas durante aproximadamente 10 minutos, y pueden ser incubados y luego dados al bebé. Preferentemente, el agente tensioactivo está covalentemente unido de forma que se resista a ser lixiviado dentro de la leche. Cualquier agente tensioactivo que pueda contaminar la leche puede ser retirado por la unidad 16 de filtro que contenga un material matriz para la retirada rápida del agente tensioactivo de forma que el bebé no contraiga diarrea por ingerir el agente tensioactivo.

De forma análoga, la presente invención es aplicable a la desactivación de los virus y otros microbios en una gran variedad de fluidos biológicos además de la leche materna. Por ejemplo, diversos catéteres, tubos y otros aparatos de uso permanente pueden ser combinados con una unidad de filtro que tenga el SDS o un agente tensioactivo aniónico relacionado, o un material de retiro del agente tensioactivo unido a ésta, o el agente tensioactivo puede ser fijado a la superficie interior de tales aparatos. Por lo tanto, la unión a superficies sólidas del SDS o de un agente tensioactivo aniónico relacionado puede ser usada para la descontaminación microbicida de fluidos biológicos dentro de recipientes, catéteres, tubería médica y farmacéutica y también dentro de dispositivos permanentes en los pacientes. La unión del SDS o de agentes tensioactivos aniónico relacionados a superficies sólidas como se enseña en la presente solicitud también abarca las superficies de artículos usados en la preparación de los alimentos como tablas de corte, agua y recipientes para los alimentos.

El dodecil-sulfato de sodio, CH_{3}(CH_{2})_{10}CH_{2}OSO_{3}Na, y el ácido láurico, CH_{3}(CH_{2})_{10}COOH, así como los agentes tensioactivos aniónico relacionados, poseen todos actividad microbicida. La estructura del SDS se proporciona a continuación como un ejemplo.

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Estructura molecular del dodecil-sulfato de sodio (SDS)

Las moléculas del agente tensioactivo podrían estar covalentemente enlazadas a una unidad de filtración o a otro sustrato por cualquier método apropiado que no obstruya la actividad biológica del agente tensioactivo. En una realización preferente de la presente invención, la molécula del agente tensioactivo es fijada a sílice (cadenas largas de SiO_{2}) vía un enlace de oxígeno entre el SiO_{2} y el extremo ácido del agente tensioactivo, vía el hidroxilo o la equivalente al hidroxilo del agente tensioactivo (por ejemplo, el extremo sulfato de sodio del SDS). Por ejemplo, son retirados el OH sobre el ácido láurico y el oxígeno sobre el SiO_{2}. Un vínculo de oxígeno enlaza entonces al silicato con el extremo CO del ácido láurico. Este método se usa en la industria química para unir cadenas de carbono de diferente longitud a la matriz de sílice, las sustancias resultantes que se usan como materiales de columna en la cromatografía líquida de alta presión. El vidrio está también compuesto por silicatos fundidos y tiene disponibles grupos de sílice libres sobre su superficie. Este enfoque también puede ser usado para fijar agentes tensioactivos de la cadena alquílica a la superficie de los biberones de vidrio. Esta realización proporciona un método para unión a cualquier superficie apropiada incluyendo, por ejemplo, la unión a una matriz compuesta por cuentas.

En una segunda realización preferente, SDS o un detergente relacionado basado en alquil-sulfatos está incluido en, o sobre la superficie de, un material plástico. Los plásticos apropiados incluyen, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo), polietileno, poliuretano o silicona y otras sustancias comunes para tubos, recipientes, y catéteres médicos, etcétera. Estas mismas sustancias pueden también ser usadas en biberones, o en sacos de lactancia, o en bolsas para suero y plasma. La unión a plásticos de los agentes tensioactivos también podría ser realizada vía la posición hidroxilo, o la equivalente a hidroxilo, de la molécula del agente tensioactivo (dejando intacta la cadena de ácidos grasos). La naturaleza del enlace de oxígeno puede ser adaptada a varias sustancias plásticas y otras, por un experto común en la técnica siguiendo las enseñanzas dadas en la presente solicitud.

El SDS o un agente tensioactivo aniónico relacionado también podrían ser incorporados durante la polimerización del polímetro de plástico y luego lixiviados constantemente hacia afuera de la superficie durante un período sustancial de tiempo. Dependiendo de la aplicación prevista para el plástico, por ejemplo, biberones, puede ser deseable retirar el agente tensioactivo después de que se le haya permitido lixiviarse en la disolución (en la leche materna). Este enfoque usaría el plástico impregnado, preferentemente en combinación con una matriz para retirar el agente tensioactivo.

Por lo tanto, además de la unión covalente del SDS y sus derivados a las superficies sólidas, la presente invención también proporciona dispositivos y métodos que abarcan la retirada rápida del SDS y derivados. Esto incluye el paso de los fluidos biológicos tratados con el agente tensioactivo sobre cualquier matriz química apropiada para retirar el agente tensioactivo. Algunas matrices comercialmente disponibles para la retirada de tales detergentes incluyen, por ejemplo, al detergente Extracti-Gel R D Detergent Removal Gel y al SDS-OUT SDS Precipitation Reagent, ambos están disponibles en la Pierce Chemical Company, 3747 N. Meridian Road, P.O. Box 117, Rockford, Illinois 61105 y las cuentas de gel de polímeros Detergent Gel Adorber están disponibles en Roche Molecular, Biochemicals, 9115 Hague Road, P.O. Box 50414, Indianapolis, Indiana 46250-0414.

Con respecto a los aparatos y los métodos de la presente invención para la desactivación de agentes infecciosos que incluyen virus no envueltos en el suero y plasma, el método convencional para hacer esto involucra Triton X-100, pero se reconoce que no desactivan los virus no envueltos. Lotes de gran tamaño de suero y plasma son producidos para hacer los preparados de factores de coagulación, anticuerpos, etcétera. Luego del tratamiento con el agente tensioactivo, el Triton es retirado por filtración en columnas que retiran el detergente. Hay pruebas crecientes de que varios virus no envueltos están presentes en el suero. Éstos podrían incluir al papovavirus humanos, picornavirus humanos y parvovirus humanos. El papovavirus humano, como el virus JC, está circulando en la población humana, latente en la mayoría de las personas, pero puede causar una enfermedad imperceptiblemente fatal del sistema nervioso principal denominada leucoencefalopatía multifocal progresiva al 5-8% de los pacientes con el SIDA. Este virus es de la misma familia de los HPVs y también es desactivado por el SDS y sus derivados. El picornavirus humano, el virus de la hepatitis A, entra al cuerpo vía la ruta oral, se reproduce en el intestino y se propaga al hígado vía la sangre. Este virus causa una hepatitis aguda con mortalidad al 1%. El parvovirus humano, B-19, causa una quinta enfermedad pero puede ser fatal en una pequeña cantidad de personas individuales predispuestas. Este virus entra en el cuerpo por la ruta respiratoria, se reproduce en la orofaringe y es encontrado luego en grandes cantidades en la sangre. La retirada de estos agentes infecciosos del conjunto de la sangre constituye una cuestión de la máxima importancia para la salud pública.

Los niveles de dosificación y concentraciones del agente tensioactivo en las composiciones usadas de acuerdo con la presente invención pueden ser variados a fin de obtener las cantidades en contacto con los fluidos biológicos de transmisión sexual y otros, y así obtener la reacción terapéutica o profiláctica deseada para cada agente tensioactivo especial y para el método de la administración en particular. Por lo tanto, el nivel de dosificación seleccionado o la concentración dependerán de la naturaleza y del sitio de infección, reacción terapéutica deseada, ruta de administración o de contacto, duración deseada del tratamiento o de contacto y otros factores. En general, la concentración preferente y la dosificación para el SDS estarán en el intervalo desde 0,05 a 2,0% en peso. Una forma de dosificación vaginal tópica preferida es una crema o supositorio como se describe arriba que debe contener el 0,05 a 2,0% en peso de la composición de acuerdo con la presente invención. En cada tratamiento, típicamente dos veces diarias, son aplicados de 1 a 5 ml en esta forma de dosificación intravaginal, preferentemente lo más alto del orificio vaginal. Cantidades mayores, en general, son evitadas para minimizar la fuga de la sustancia.

El SDS es de una toxicidad intrínseca baja tanto para la piel, como para las membranas mucosas. Las preparaciones, como champúes y detergentes que se ponen en contacto tanto con la piel, como con las membranas mucosas, contienen derivados del dodecil-sulfato (dodecil-sulfato de sodio o amonio) en concentraciones que sobrepasan los 10%. Además, los productos que son usados con regularidad en las caries orales, como pasta dentífrica, tienen concentraciones máximas (5-8%) de estas composiciones y no son extremadamente tóxicas para la mucosa oral. En los ejemplos proporcionados a continuación, las concentraciones virucidas eficaces de SDS no fueron tóxicas en la piel de conejo y en la epidermis de recién nacidos humanos.

Los ejemplos descritos y discutidos en la presente solicitud se pretende que constituyan ilustraciones de la presente invención, pero no que sean sus restricciones. Diferentes y numerosas modificaciones pueden ser realizadas sin alejarse del alcance de los nuevos conceptos de la presente invención.

Ejemplo 1 Actividad antiviral del SDS Materiales y Métodos Compuestos químicos

El SDS fue comprado en Bio-Rad (Richmond, CA) y las soluciones estériles filtradas fueron hechas en solución salina de búfer de fosfato (PBS, por las siglas de su expresión inglesa, Phosphate Buffered Saline). El N-9 fue obtenido de Rhone-Poulenec Rorer Pharmaceuticals Inc. (Collegeville, PA). Todos los detergentes adicionales fueron comprados en Boehringer Manheim (Indianapolis, IN). Los siguientes reactivos pueden ser obtenidos a través del programa AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HeLa-CD4-LTR-(3-gal del Dr. Michael Emerman.

Ensayo de desactivación de HSV-2. Los bancos maestros de virus de HSV-2 (cepa 333) fueron propagados por infección de baja multiplicidad de células de riñones (CV-1) de mono verdes africanos y preparaciones siguientes de los sobrenadantes libres de células de los preparados congelados y derretidos de cultivos infectados líticamente. Los títulos de virus fueron determinados por ensayos en monocapas de células CV-1. Los bancos maestros de virus fueron mantenidos en el medio de cultivo de células CV-1 que fue el medio Dulbecco complementado con antibióticos y suero de ternero fetal al 10%. La concentración de proteína de los bancos maestros de virus también fue incrementada por proteínas de suero y por proteínas celulares liberadas por congelación y licuación de las células infectadas.

Para la desactivación de HSV-2, 39 \mul del virus fueron mezclados con 1 \mul de una solución 40x concentrada de detergente y luego fueron incubados a 37ºC durante 10 minutos. Después de la desactivación, 40 \mul de la muestras de virus fueron diluidos a 4 ml (1: 100) usando un medio de cultivo de células, y 1 ml del virus diluido fue adsorbido en monocapas de CV-1 durante 1 horas a 37ºC. Luego de la adsorción, las monocapas fueron realimentadas e incubadas a 37ºC, CO_{2} 5%. Entre 20 y 24 horas posteriores a la infección, las monocapas fueron fijadas, teñidas con violeta cristal y las placas contadas usando un microscopio de disección. Los números en la Tabla 1 representan un promedio de 2 placas cada.

Ensayo de desactivación de VIH-1. Un día antes del ensayo, las células HeLa-CD4-LTR-\beta-gal fueron preseleccionadas en las placas de cultivo de 12 pocillos a una concentración de células de 8x10^{4} por pocillo. Un banco maestro de virus de alto título (10^{7,17} TCID_{50}/ml) de HIV-1 (Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD) fue diluida a 1:10 con RPMI 1640 complementado con 10% FBS. Para tasar la desactivación viral por SDS, 78 \mul del virus diluido fueron mezclados con 2 \mul de solución de detergente, e incubados durante 10 minutos a 37ºC. Después del período de la desactivación, el virus y el detergente fueron diluidos con 720 \mul de R10 (1: 10) complementados con dextrana DEAE (20 \mug/ml concentración final). Luego fueron añadidas alícuotas de virus tratado (300 \mul) a los pocillos por duplicado de células HeLa e incubadas a 37ºC durante 2 horas. Luego de la adsorción viral, 2 ml del medio fresco (DMEM complementados con 10% FBS, 0,1 mg/ml G418, y 0,05 mg/ml higromicina B) fueron añadidos a cada pocillo. Después de la incubación a 37ºC y CO_{2} 5% durante 48 horas posterior a la infección, las células fueron fijadas y teñidas para la expresión de \beta-galactosidasa.

Ensayo de focos de BPV-1. Bancos maestros libres de células de BPV-1 fueron preparados por extracción (10% p/v) de verrugas bovinas epidérmicas en solución salina de búfer de fosfato (PBS). Para detectar la capacidad de transformación de BPV-1, fueron preseleccionadas células de ratón de C127 (3x10^{5} de células por matraz) en matraces T-25^{2}. Después de 24 horas de crecimiento, las células subconfluentes fueron infectadas con BPV-1. Para los controles positivos, los bancos maestros de virus (20 \mul) fueron diluidos (1: 1) con PBS, incubados a 37ºC durante 10 minutos, diluidos 1:10000 y luego añadidas (100 \mul) a 5 ml del medio de cultivo de células presente sobre las células. Las células fueron realimentadas a las 24 horas y de forma subsiguiente 2 veces por semana. Fue contada la presencia de focos transformados morfológicamente después de 2 semanas y luego otra vez a las 3 semanas.

Las desactivaciones de virus fueron llevadas a cabo in vitro por adición de soluciones de SDS concentradas a los bancos maestros de virus (20 \mul del virus más 20 \mul de detergente) y la incubación posterior a 37ºC durante 10 o 30
minutos como se ha indicado. Luego de la desactivación, el virus fue diluido 1000 veces para disminuir la concentración del detergente y las preparaciones fueron usadas inmediatamente para la infección como describió más arriba.

Inducción de Shope Papiloma . Los bancos maestros de Shope CRPV fueron generados en papilomas generados en conejos cottontail salvajes. Los bancos maestros de virus fueron extractos (p/v 10%) libres de células de papilomas en PBS. La piel dorsal afeitada fue ligeramente escarificada con una hoja de afeitar. Bancos maestros de virus fueron usados para inocular a conejos cottontail domésticos (Hazelton Research Products, Denver, PA); una alícuota de 40 \mul del virus fue dejada caer sobre la superficie de 4 localizaciones sobre la piel dorsal. Los 2 sitios izquierdos sobre cada conejo recibieron el virus sin tratar y los 2 sitios derechos recibieron el virus tratado. La desactivación sea de una solución 10^{-1} o 10^{-2} de los bancos maestros de virus fue lograda por adición de soluciones concentradas de SDS, las cuales fueron 40 x de las concentraciones finales indicadas. La incubación de SDS y el virus fue a 37ºC durante 10 minutos y el virus fue usado inmediatamente para la inoculación de los conejos. El virus no fue diluido posteriormente, luego de la desactivación, y la concentración de SDS presente durante la desactivación e inoculación fue 0,05%. Los papilomas fueron vistos desarrollarse primero en los sitios de control alrededor de 2 semanas después de la inoculación. Fue medido el diámetro medio geométrico (GMD) de todas las lesiones visibles y resultó igual a la raíz cúbica de la altura x anchura x longitud de las lesiones, tal como se miden en mm con ayuda de un calibrador.

Inducción de Papiloma humano. Bancos maestros de HPV 11 infeccioso generado experimentalmente fueron preparados y representaron extractos libres de células del virus al 10% p../Vol. en PBS. Las alícuotas de bancos maestros sin diluir del virus (39 \mul) fueron mezcladas con una solución de 40x de 1 \mul de SDS), incubadas a 37ºC durante 10 minutos y fueron usadas inmediatamente para infectar injertos de grosor escindido de epitelios de epidermis humanas de recién nacidos. El virus no fue diluido posteriormente. Fueron infectados Injertos de control con bancos maestros del virus sin tratar. La adsorción del virus fue llevada a cabo durante 1 horas a 37ºC. La concentración de SDS presente durante el período de desactivación y durante la adsorción del virus fue 0,05%. Los injertos luego fueron trasplantados debajo de la cápsula renal de ratones arrítmicos. Los animales fueron mantenidos en burbujas de aislamiento con agua potable complementada con antibiótico en la colonia animal del Hershey Medical Center. A los tres meses posteriores a la infección fueron sacrificados los animales, sus riñones fueron retirados, y los xenografts fueron revisados exhaustivamente. Los órganos restantes fueron revisados en busca de cualquier anormalidad evidente y no fue encontrado nada. Porciones de cada injerto fueron arregladas inmediatamente en formalina al 10% llevadas a pH neutro con búfer y procesadas por técnicas histológicas estándar para colorear con hematoxilina y eosina.

Un segundo juego de injertos de control fue expuesto solamente a concentraciones idénticas de SDS sin virus. Estos injertos fueron cosechados en los días 1, 5, 11 y 20 posteriores al transplante para seguir la viabilidad y el crecimiento de los injertos después de su exposición al SDS.

Resultados

Desactivación de la Infectividad del HSV-2 por SDS. En cinco experimentos distintos, las concentraciones de tratamiento de SDS tan bajas como 0,0125% a 0,025% fueron eficaces para eliminar la capacidad del virus de producir plaquetas en una monocapa de células de riñón de mono (Tabla 1). La desactivación de HSV-2 total fue conseguida a concentraciones de SDS entre 0,0025% y 0,0125%. Estas concentraciones eficaces son similares a las concentraciones de N-9 necesario para la destrucción de la infectividad de HSV (no se muestran los datos).

TABLA 1

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}{138mm}* Bastones de SDS estériles de la
concentración 40X de tratamiento fueron añadidos a alícuotas de
virus para conseguir la concentración de tratamiento. Después de
mezcladas, las muestras fueron incubadas a 37ºC durante 10
minutos.\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{138mm}**
Luego del tratamiento de SDS, fueron diluidos bancos maestros de del
virus 100 veces y se adsorbieron alícuotas de 1 ml inmediatamente en
células CV-1. Las placas fueron contadas después de
20-24 horas de infección. Cada número representa un
promedio de 2
placas.\end{minipage} \cr}

Desactivación de la infectividad de VIH-1 por SDS y el detergente no iónico C31G. Está establecido que el N-9 puede desactivar al VIH-1. Comparamos la desactivación de VIH-1 por un segundo detergente no iónico, C31G y por SDS. Los bancos maestros del virus HIV-1 de alto título fueron incubadas sea con C31G o SDS y luego el virus fue ensayado en células indicadoras expresando \beta-Gal bajo el control de HIV-1 LTR. Después de 48 horas, las células fueron teñidas y el número de células de expresión aumentó el conteo de \beta-Gal. Ambos de estos detergentes fueron muy eficaces en la desactivación de VIH-1 (Tabla 2). La desactivación total de VIH-1 fue conseguida con concentraciones de C31G tan bajas como 0,0125% y con concentraciones de SDS tan bajas como 0,025%.

TABLA 2

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}{140mm} Cinco campos aleatorios de células
fueron contados en cada placa que exhibía células
azules.\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{140mm}
Placas por duplicado fueron ensayadas para cada muestra; los números
individuales son la desviación estándar dentro de 5 campos de una
placa.\end{minipage} \cr}

Destrucción de la capacidad de BPV-1 para producir focos transformados morfológicamente en monocapas de células C127 de ratón. Aunque el SDS podía reducir eficazmente la infectividad de HSV-2, quedaba posible que esta destrucción fuera mediada por la retirada de la envoltura. Porque los virus del papiloma no son envueltos, la posibilidad remanente que el SDS fallaría de desactivar estos virus. Utilizamos el BPV-1 como un PV prototipo debido a su capacidad de constituir rápidamente (en 2 semanas) focos transformados de capas múltiples en fibroblastos de ratón en un ensayo in vitro. La Tabla 3 describe los resultados de dos experimentos distintos en los que los bancos maestros de BPV-1 fueron incubados a 37ºC con concentraciones diversas de SDS (5% a 5x10^{-4} %) durante 10 o 30 minutos, diluidos para disminuir la concentración de SDS (evitar la toxicidad a las células) y luego usados para infectar células de C127. Luego de la incubación del control o de los cultivos infectados, los focos fueron contados a los 14 y 17 días después de la infección. Los resultados muestran que el SDS, a concentraciones tan bajas como 0,05% o 0,005%, puede totalmente desactivar el BPV- transformando la capacidad después del tratamiento del virus a 37ºC para 10 o 30 minutos, respectivamente. La desactivación del BPV-1 por la concentración más baja de 0,005% después de 30 minutos indicó que la desactivación es proporcional al tiempo, así como a la concentración del detergente. La Tabla 4 relaciona algunos otros detergentes comercialmente disponibles que fueron probados para la desactivación posible de BPV-1. Ninguno de estos detergentes desactivó las propiedades de transformación morfológica del BPV-1.

TABLA 3

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}{140mm}* Bancos maestros estériles de SDS de
la concentración de tratamiento 40x fueron añadidos a alícuotas de
virus para conseguir la concentración de 
tratamiento.\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{140mm}
** Luego del tratamiento del virus, los bancos maestros de virus
tratados fueron adicionalmente  diluidos 1: 1000 para diluir el
detergente\end{minipage} \cr  \+ En el experimento 1, el virus
y SDS fueron mezclados e incubados a 37ºC durante 30 minutos.\cr  \+
En el experimento 2, el virus y SDS fueron mezclados e incubados a
37ºC durante 10 minutos.\cr  \+ N.D. = no se hicieron\cr  \+ En las
placas de control, sin BPV  -  1, no apareció ningún
foco.\cr}

TABLA 4 Detergentes que fallaron en desactivar la transformación morfológica de BPV-1 de células C127

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Nonoxinol-9\cr  C31G\cr 
 \beta -Sulfonato de
[(3-cholamido-propil)-dimetil-amonio]-2-
hidroxi-1-propano (CHAPSO)\cr 
Sulfonato de
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano\cr
 Sulfonato 3
[( \beta -cholamido-propil)-dimetil-amonio]-1-propano
(CHAPS)\cr 
Isotridecil-poli(etileno-glicol-éter)\cr

Octanoil-N-metil-glucamida
(MEGA-8)-100\cr  Triton
X-100\cr 
Thesit\cr}

Todos los detergentes excepto C31G y N-9 fueron comprados de Boehringer Mannheim, N-9 fue comprado de fármacos de Rhone-Poulenec Rorer Pharmaceuticals; C31G fue proporcionado por Biosyn, Inc.

Ninguno de los relacionados más arriba redujeron los focos.

@ 1% SDS de control positivo elimina totalmente los focos de virus.

Todos los detergentes fueron incubados con el virus; la concentración final 1%, 37ºC, 10 minutos.

Efecto de la desactivación por SDS de CRPV sobre la formación de Papilomas Shope en conejos. Para extender la observación de la desactivación de PV por SDS a un sistema de modelo animal in vivo, utilizamos el sistema de modelo de CRPV bien establecido. Fue usado un banco maestro estándar de CRPV conocido por formar papilomas con una eficiencia de 100%. La dosis 50 (ID_{50}) contagiosa por los bancos maestros de virus corresponde a 50 \mul de una dilución 10^{-3} del virus de bancos maestros. En nuestros experimentos, fueron usados 40 \mul de una dilución 10^{-1} y posteriormente 40 \mul de una dilución 10^{-2} de la solución del banco maestro de virus. Ambas estas concentraciones superaban con mucho la ID_{50}. El SDS fue mezclado con el virus a una concentración final de 0,05% e incubado posteriormente a 37ºC durante 10 minutos. Inmediatamente después de la incubación, el virus fue inoculado por escarificación de la piel de las partes posteriores de los conejos. Los sitios inoculados contenían dos muestras sin tratar (izquierda; L) y dos tratadas (derecho; R) de virus sobre el mismo conejo. La Figura 1 muestra el GMD medio de seis lesiones inoculadas con la normal (dilución 10^{-1}) y seis lesiones inoculadas con CRPV tratado por SDS. Los GMD fueron medidos y comparados a los 18, 21, 25, 32, 42 y 50 días posteriores a la inoculación. Los resultados indican que una dilución 10^{-1} del banco maestro del virus fue desactivada considerablemente por un tratamiento con SDS a 37ºC, 10 minutos y 0,05%. La Fig. 1b muestra las curvas de crecimiento durante 50 días posteriores a la inoculación para cada lesión individual. Debe señalarse que cada uno de los seis sitios que recibieron las preparaciones (*) tratadas con el SDS se retrasaron en el desarrollo de papilomas, demostrando una desactivación significativa del virus. Sin embargo, una vez que se desarrolló los papilomas la velocidad de crecimiento de las lesiones pareció similar a la que se desarrolló desde un inoculum sin tratar

En un experimento posterior (Figuras. 2a y 2b), una dilución 10^{-2} del banco maestro del virus CRPV también fue incubada a 37ºC durante 10 minutos con 0,05% de SDS o 0,05% de N-9. Esta dilución del banco maestro del virus no sólo contenía menos virus, sino también una concentración de proteína total inferior. Luego de la incubación, las muestras tratadas con el detergente y el virus de control fueron inoculadas en cinco conejos, tanto para las muestras de N-9, como cinco conejos para las muestras tratadas con el SDS. Las muestras de virus sin tratar también fueron inoculadas en los mismos conejos en sitios diferentes. Este experimento fue realizado para dos propósitos: observar la desactivación de una cantidad más pequeña de CRPV por el SDS, y comparar la desactivación con SDS a la conseguida por el tratamiento directamente con N-9. Como en el experimento previo, los sitios de inoculación izquierda (dos por animal) recibieron el virus sin tratar, y los sitios de inoculación derecha (dos por animal) recibieron el tratado con el virus. La Figura 2a muestra el GMD de los diez sitios de inoculación que recibieron el virus tratado con SDS en comparación con el de los diez sitios de inoculación que recibieron el virus normal. Los GMD fueron medidos a las 3, 4, 5, y 6 semanas después de la inoculación del virus. En 8 de los 10 sitios inoculado con el virus tratado con el SDS, el papiloma dejó de desarrollarse; los 2 sitios remanentes desarrollaron papilomas muy pequeños que empezaron a aparecer 4 semanas después de la inoculación. Aunque no fueron llevadas a cabo mediciones cuantitativas, los sitios inoculados con SDS no presentaban irritación durante el experimento. En los 10 sitios inoculados con CRPV normal, el papiloma se desarrolló en 10 de los 10 sitios dentro de las 2 semanas después de la inoculación, y luego creció progresivamente.

La Figura 2B muestra el aumento comparativo de papilomas en 10 sitios que recibieron CRPV normal, comparado con 10 sitios de CRPV tratados con N-9. El GMD de cada papiloma fue medido a las 3, 4, 5 y 6 semanas después de la inoculación con el virus. No hubo una diferencia en el crecimiento de las lesiones que aparecían después de la inoculación con estas dos preparaciones de virus. Además, las velocidades de crecimiento del control y los papilomas experimentales en los animales ensayados con N-9 no fueron diferentes a las velocidades de crecimiento de las lesiones del control en los animales tratados con el SDS (no se muestran los datos).

Efecto de la desactivación con SDS sobre la capacidad del HPV 11 para inducir Condylomata experimental en Xenografts Epiteliales de Epidermis de seres humanos. Fueron usados bancos maestros estándar de HPV 11 como virus sin diluir. Estos bancos maestros de virus normalmente inducen Condylomata en 90-100% de los xenografts infectados cuando se diluyen 1000 veces. En este experimento, 39 \mul sin diluir del banco maestro de HPV 11 fueron mezclados con 1 \mul de SDS a una concentración final de 0,05% SDS y luego se incubaron a 37ºC durante 10 minutos. La infección fue realizada luego durante 1 hora y los injertos posteriormente trasplantados in vivo. Ocho animales (16 riñones) recibieron injertos infectados con el virus tratados con el SDS y 9 animales (17 riñones) recibieron el virus normal. La Tabla 5 muestra los resultados de los injertos cosechados. En las infecciones normales, 17 de los 17 injertos sobrevivieron y de éstos, 14 según el examen histológico fueron transformados morfológicamente y tienen la típica apariencia de papilloma. En los animales que recibieron el virus tratado con SDS, 13 de los 16 xenografts mostraban un tejido viable en el momento de la cosecha, y el examen histológico de los injertos mostró una diferenciación viable, normal, del epitelio humano. Los últimos resultados son compatibles con nuestras observaciones previas usado injertos sin infectar en lo que respecta a los injertos normales, los que ocasionalmente son resorbidos en los ratones y no sobreviven más de 3 mes. Llegamos a la conclusión de que el SDS había prevenido la infección por el virus al realizar eficazmente la desactivación del virus.

TABLA 5

4

Efecto de la exposición al SDS sobre la viabilidad de xenografts de epidermis en seres humanos. Debido a la preocupación sobre el potencial del SDS para acabar con el epitelio humano, los experimentos de control fueron llevados a cabo de forma que los injertos de grosor de escisión de la epidermis neonatal fueron expuestos a 0,05% SDS solo, y luego fueron injertados a continuación. Todas las condiciones en este experimento fueron idénticas a las que se usaron infecciones realizadas con el virus tratado con el HPV 11, excepto que el virus no estaba presente. Los Injertos expuestos al SDS (2 animales de cada vez) fueron cosechados, fijados y seccionados inmediatamente después de la exposición, y en los días 1, 5, 11, y 20 después del tratamiento. El examen de los tejidos demostró que el epitelio estaba completamente viable durante todos estos días y no había ninguna necrosis aparente, relacionada con la exposición al detergente. Los injertos de grosor de escisión originales eran aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm en tamaño; además fueron puncionados muchas veces con la punta de una aguja a fin de permitir la entrada del HPV 11 y/o el SDS a las capas epiteliales. Aunque es posible que algunas células epiteliales pudieran haber sido dañadas o matadas durante la exposición al SDS, el daño fue mínimo y el aumento de epiteliales en los injertos fue normal.

Ejemplo 2 Desactivación de células libres y células asociadas al VIH-1

Como muestra la Figura 5, las cepas linfocito, macrófagas y doble trópica de HIV-1 son desactivadas en presencia de N-9, C31G, o SDS. La cepa IIIB de HIV-1 libre de células (A) fue tratada con N-9, C31G, o SDS, y usada para infectar células HCLB. Las cepas de HIV-1 libres de células (B) (trópicas M) BaL, y (C) 89,6 (trópica doble) fueron tratadas con N-9, C31G o SDS, y usadas para infectar células P4-R5. Los ensayos fueron realizados. La infectividad posterior a la exposición se expresa como un porcentaje en comparación con el número de células 13 \beta-Gal positivas en los pocillos y por duplicado, infectadas con el virus incubados en la falta de un compuesto microbicida. Los resultados mostrados en la Figura 5 son obtenidos del conteo promedio de células para un total de cuatro pocillos por concentración en dos experimentos independientes.

Como se muestra en la Figura 6, el N-9, C31G y SDS pueden reducir la infectividad, asociada a células, de las células SupTi infectadas por VIH-1. (A) linfocitos T SupTi t (8x10^{4}) infectados 5 días antes con la cepa IIIB de HIV-1 fueron peletizados y resuspendidos en nuevos medios para retirar el virus libre de células. Después de la exposición a las concentraciones seleccionadas para cada microbicida durante 10 minutos a 37ºC, las células fueron diluidas a razón de 1:10 y cocultivadas con células HCLB durante 2 h.. Luego de un lavado con PBS para retirar los linfocitos infectados, las células indicadoras fueron cultivadas y ensayadas. La Infectividad posterior a la exposición es expresada como porcentaje en comparación con el número de células \beta-Gal positivas en pocillos por duplicado de las células SupTi infectadas con VIH-1 infectado incubadas en ausencia de un compuesto microbicida. Los resultados mostrados en la Figura 6 (a) son el conteo medio de célula para un total de cuatro pocillos por concentración en dos experimentos independientes. (B) Los linfocitos SupTi t (8x10^{4}) fueron incubados con concentraciones seleccionadas de cada microbicida durante 10 minutos a 37ºC y luego diluidas a razón de 1: 10 con nuevos medios. Luego de un periodo de incubación de 2 h, las células fueron evaluadas con relación a la viabilidad. La supervivencia de las células después del tratamiento se expresa como la fracción de células viables en comparación con el número de células mock expuestas. Los resultados mostrados en la Figura 6 (b) son el promedio de dos experimentos en los que fueron ensayados pocillos por triplicado para cada concentración.

Ejemplo 3 Actividad microbicida de derivados de alquil-sulfato

Los siguientes datos muestran que los otros miembros del grupo de alquil- sulfatos, concretamente dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y la sal sódica del ácido láurico, tienen actividad antivirus del papiloma en el ensayo de foco C127 usando un virus de papiloma bovino. En las curvas de respuesta de dosis, el SDS continúa siendo el más potente.

TABLA 6

5

En todos los casos, el tratamiento fue durante 10 minutos a 37ºC, seguido por una dilución a razón de 1:1000 de las preparaciones de virus.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

6

Ejemplo 4 Actividad de toxicidad y anti-HSV-2

Los siguientes datos representan un experimento in vivo para evaluar tanto la toxicidad como la eficacia del SDS en la protección de ratones contra la infección vaginal con virus vivo de herpex simplex (HSV-2).

\newpage

Grupo 1	Control normal
Grupo 2	HSV-2 vivo (aproximadamente 5x10^{6} unidades infecciosas)
Grupo 3	HSV-2 vivo plus SDS 4%
Grupo 4	HSV-2 vivo plus SDS 2%
Grupo 5	HSV-2 vivo plus SDS 1%
Grupo 6	HSV-2 vivo plus SDS 0,5%

En el experimento se emplearon ratones Swiss-Webster, de sexo femenino. Los ratones fueron anestesiados y luego en la vagina fueron instaladas soluciones (25 \mu I) de SDS o control, usando una punta de pipeta amarilla. El SDS no fue formulado dentro de una crema vaginal o una espuma, sino simplemente disuelto en solución salina de búfer de fosfato. Estas soluciones tienen una baja viscosidad. Los fluidos fueron instalados en grupos de 10 ratones a un momento determinado. Luego de la administración de las soluciones del SDS o el control al grupo de 10, entonces fueron instalados unos 25 \mul adicionales del virus o el fluido de control. A los ratones se les permitió recuperarse de la anestesia y luego los ratones fueron verificados diariamente en busca de los síntomas, a partir del día tercero y hasta los 12 días después de la inoculación. Las muestras vaginales también fueron tomadas de los ratones diariamente, empezando por el día tercero, a fin de determinar el brote del virus. Las Figuras 3A-3G muestran los síntomas totales por grupo desde los días 3 hasta 12 para cada uno de los siguiente síntomas: fuerte aumento del exudado vaginal, enrojecimiento, muerte, parálisis de piernas, pérdida de pelo perianal y cualquier otro síntoma.

Los resultados muestran claramente que todas las concentraciones de SDS proporcionaron una protección significativa frente a la inoculación de HSV-2 dentro de la vagina. Además, fue evidente una respuesta a la dosis para cada síntoma verificado; con 4% de SDS siendo la que proporciona mayor protección. Los resultados de las determinaciones del brote del virus no se muestran pero confirman y apoyan estos datos.

Ejemplo 5 Actividad espermicida

Los siguientes datos representan un experimento in vitro para evaluar la eficacia del SDS y otros detergentes como agentes espermicidas. Fueron obtenidas muestras congeladas de semen de toro, fundidas y puestas en una probeta. Fueron tomadas alícuotas y puestas en un tubo de ensayo separado, en donde fueron mezcladas con el detergente (SDS, C31G, N-9 o una mezcla de SDS y N-9) a un porcentaje final tal como se relacionan a continuación en las Tablas 8 y 9. Después de mezcladas, las muestras fueron puestas inmediatamente sobre un portabojeto de microscopio y revisadas visualmente para determinar el movimiento del espermatozoide. El experimento fue realizado con una muestra estudiada a la vez con el propósito de que el examen visual fuera llevado a cabo inmediatamente después de la adición del detergente a la muestra. Por consiguiente, las indicaciones en la tabla de la desactivación completa muestran la desactivación prácticamente instantánea del espermatozoide. La desactivación retrasada muestra el retraso de aproximadamente 10 minutos de esas células de espermatozoide que no dejaron de nadar inmediatamente. Los nadadores ocasionales significan pocos, alrededor de aproximadamente 1% de la población de espermatozoides presentes en la muestra, indicando que aproximadamente 99% de los espermatozoides fueron desactivados por el detergente.

TABLA 8

7

TABLA 9

8

Claims

1. El uso de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales en la elaboración de un medicamento para desactivar un virus no envuelto.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho virus es virus del papiloma humano.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es dodecil-sulfato de sodio.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha cantidad está en el intervalo desde 0,05 a 2,0% en peso de dicha composición.

5. El uso de una composición que comprende una cantidad suficiente de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales en la elaboración de un medicamento para la obtención de un efecto espermicida y un efecto virucida contra un virus no envuelto cuando dicho medicamento se pone en contacto con un sitio de epiteliales vaginales.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho medicamento reduce el título de dicha virus no envuelto en aproximadamente 99,9%.

7. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho virus no envuelto es seleccionado entre el grupo que consta del virus de inmunodeficiencia humana, virus herpes simplex y virus del papiloma.

8. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho compuesto está presente en dicha composición en el intervalo desde 0,05 hasta 2,0% en peso de dicha composición.

9. Una biberón que comprende

Un recipiente que tiene una porción del cuerpo para contener leche materna y una porción de caperuza;

Un miembro pezón que se extiende desde dicho recipiente y está adaptado para inserción en la boca de un humano u otro mamífero; y

Una composición virucida que comprende un compuesto seleccionado entre un grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales, en que dicha composición está presente en una cantidad suficiente para reducir el título de virus no envuelto en contacto con dicho compuesto en al menos aproximadamente 99.9%, estando dicha composición microbicida dispuesta dentro de dicho biberón para hacer contacto con dicha leche.

10. El biberón de la reivindicación 9, en el que dicha composición es fijada a una pared interior de dicho biberón.

11. El biberón de la reivindicación 9 que adicionalmente comprende un filtro y, en el que dicha composición es fijada a dicho filtro.

12. El biberón de la reivindicación 9 que adicionalmente comprende un material capaz de retirar dicho compuesto de dicha leche.

13. Un recipiente para sujetar o transportar un fluido biológico, comprendiendo una pared sólida que tiene una superficie interior para retener un fluido biológico, dicha superficie interior que tiene unida a ella una composición microbicida para hacer contacto con dicho fluido biológico y que comprende un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales en que dicha composición está presente en una cantidad suficiente para reducir el título del virus no envuelto en dicho fluido en al menos aproximadamente 99,9%.

14. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicha composición microbicida está covalentemente unida a dicha superficie interior.

15. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicha superficie interior está impregnada con dicha composición microbicida.

16. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicha superficie interior está recubierta con dicha composición microbicida.

17. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicho fluido biológico comprende un material seleccionado entre el grupo que consta de sangre, leche, suero y linfa.

18. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicha recipiente es seleccionado del grupo que consta de una biberón de lactancia y un manguito para leche para un biberón infantil.

19. El recipiente de la reivindicación 13, en el que dicho recipiente es un tubo de catéter.

20. Un filtro para reducir el título en un fluido biológico de un virus no envuelto, que comprende un sustrato que tiene unido a éste una composición microbicida, en el que dicha composición comprende un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de dodecil-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de litio, ácido láurico y sus sales, en que dicha composición está presente en una cantidad suficiente para reducir el título en dicho fluido del virus no envuelto en al menos aproximadamente 99,9%.

21. El filtro de la reivindicación 20, en el que dicho sustrato comprende un material matriz.

22. El filtro de la reivindicación 20, en el que dicho material matriz es seleccionado entre el grupo que consta de geles y cuentas.

23. El filtro de la reivindicación 20, en el que dicho sustrato comprende adicionalmente un material capaz de retirar dicho compuesto de dicho fluido biológico.

24. El filtro de la reivindicación 20, en el que dicho fluido biológico comprende un material seleccionado entre el grupo que consta de sangre, leche, suero y linfa.

25. El filtro de la reivindicación 20, en el que dicho virus no envuelto es el virus de la inmunodeficiencia humana.