ES2234896T3 - Saratin para inhibir la adhesion de plaquetas a colageno. - Google Patents

Abstract

Uso del polipéptido Saratin en la preparación de un medicamento para inhibir la acumulación de plaquetas después de daños vasculares o de una endarterectomía, que comprende administrar al tejido vascular una cantidad terapéuticamente eficaz de Saratin que previene la adhesión de plaquetas, inhibiendo con ello la trombosis y la restenosis.

Description

Saratin para inhibir la adhesión de plaquetas a colágeno.

Resumen de la invención

La invención se refiere al efecto de un polipéptido llamado Saratin que disminuye de manera importante la adhesión y acumulación de plaquetas después de daños vasculares, tal como endarterectomía. La invención se refiere además a la inhibición de la unión dependiente de vWF de plaquetas a colágenos de la pared vascular bajo condiciones de alto esfuerzo cortante y, de forma más detallada, a un nuevo uso médico de Saratin como inhibidor de trombosis en donde dicho polipéptido se puede emplear localmente como un agente de uso tópico o como un revestimiento para dispositivos médicos.

Campo de la invención

La adhesión de células sanguíneas, especialmente plaquetas, a la pared de vasos sanguíneos dañados es un fenómeno bien conocido en angioplastia y procedimientos quirúrgicos. Dichos daños pueden presentarse durante diversas terapias quirúrgicas y percutáneas que han sido desarrolladas para reabrir los canales, conductos y otros lúmenes bloqueados, para separar tejido enfermo y para implantar tejido sustituto, o componentes del mismo.

Se han desarrollado varios tipos de técnicas de intervención que facilitan la reducción o eliminación del bloqueo del vaso sanguíneo, permitiendo un mayor flujo de sangre a través del vaso. Una técnica para tratar la estenosis u oclusión de un vaso sanguíneo es la angioplastia de balón percutánea. Se hace pasar un catéter de balón a través del sistema arterial del paciente y se introduce en la zona estrechada o bloqueada y luego se infla el balón para expandir la zona constreñida. La angioplastia transluminal percutánea (PTCA) es el método de angioplastia más ampliamente utilizado para abrir arterias ateroscleróticas obstruidas.

En general, los procedimientos de angioplastia producen excelentes resultados, evitando la necesidad de cirugía de by-pass, pero en aproximadamente el 30-40% de los pacientes, una dilatación inicial de la arteria con ostensible éxito puede venir seguida por un nuevo estrechamiento del vaso (restenosis) transcurrido un periodo de alrededor de 3 a 9 meses. Si esta restenosis es severa, los pacientes pueden requerir un segundo procedimiento de angioplastia, frecuentemente con implantación de un dilatador para que actúe como un andamio en el vaso.

En otros casos, se puede requerir reconstrucción arterial bajo cirugía de by-pass, lo cual es un procedimiento de mayor riesgo. Con más de 800.000 procedimientos de PTCA practicados ahora anualmente a escala mundial, la implicación socio-económica de esta proporción de 30-40% de restenosis ha llegado a constituir una seria preocupación para los cardiólogos intervinientes.

La restenosis suele ser el resultado del daño por estiramiento y aplastamiento, mediado por el balón, de la pared arterial y de la posibilidad de que los alambres de guía de los catéteres usados en dichos procedimientos durante el despliegue causen daños, pudiendo conducir ello a la proliferación de células del músculo liso de la arteria, dando lugar a que la arteria se cierre de nuevo ("restenosis") durante los siguientes meses.

Debido a las complicaciones potenciales, relacionadas con la restenosis y al temor de que se desprenda un émbolo de una placa ulcerativa con las severas consecuencias resultantes, la aplicación de angioplastia repetitiva en las arterias carotídeas está limitando severamente las opciones para una intervención mínimamente invasiva.

Hasta ahora, se han realizado intentos para tratar oclusiones en las arterias carotídeas que conducen al cerebro mediante otros tipos de intervenciones.

La endarterectomía carotídea es un método quirúrgico para eliminar bloqueos de las arterias carotídeas y es uno de los procedimientos quirúrgicos vasculares más comunes realizados en los Estados Unidos. Los resultados de pruebas realizadas en múltiples centros han demostrado la eficacia de este procedimiento en el tratamiento de la enfermedad carotídea extracraneal en pacientes tanto sintomáticos como asintomáticos (JAMA 1995; 273:1421-28; N. Engl. J. Med. 1991; 325:445-53) y los procedimientos de endarterectomía se emplean en el tratamiento de enfermedad vascular oclusiva en otros lechos vasculares (Vasc. Surg. 1999; 33:461-70).

En la endarterectomía, se corta la arteria carotídea y se retira la placa del vaso en la zona cortada. Por medio de cirugía, se expone la bifurcación carotídea a través de una incisión en el cuello del paciente y se colocan grapas en cualquier lado de la oclusión para aislarla, realizándose entonces una incisión para abrir la arteria. Se retira la oclusión, se riega y aspira la zona aislada y se sutura para cerrar la arteria. Se retiran las grapas para restablecer el flujo de sangre a través de la arteria. Los émbolos y restos contenidos dentro de las grapas pueden causar problemas considerables después de abrir la arteria carotídea, permitiendo que la sangre fluya al interior de la zona previamente aislada.

Si bien la endarterectomía es una terapia eficaz, suele dejar expuestas la adventicia y una zona importante de subendotelio trombogénico. A pesar de la eficacia de la endarterectomía carotídea, la operación puede conducir a complicaciones, incluyendo trombosis y el desarrollo de hiperplasia de la íntima, causantes de complicaciones que anulan el efecto beneficioso de la intervención o que crean nuevos problemas.

Estudios clínicos han demostrado una tasa de ataques isquémicos después de la endarterectomía carotídea del 1-10% en el periodo inmediato después de la operación, cuya casi totalidad se debe a la formación de trombo en el punto de la endarterectomía con posterior embolización cerebral (Stroke 1984; 15:950-55). La acumulación de plaquetas puede dar lugar también a restenosis debido al desarrollo de hiperplasia de la íntima, lo cual puede ocurrir en el plazo de 2 años después de la operación. Se ha informado que la restenosis se presenta en el 10-20% de todos los pacientes endarterectomizados a los 2-5 años después de la operación, la mayor parte de la cual se debe a hiperplasia de la íntima, espesamiento de la íntima y reducción del diámetro del vaso, tal como ha quedado documentado por la exploración ultrasónica dúplex de la carótida (J. Vasc. Surg. 1986; 3:10-23).

La respuesta celular y molecular de la pared del vaso a trauma mecánicamente inducido, intervención quirúrgica, colocación del dilatador, colocación de un injerto vascular (injerto arterial o arteriovenoso, por ejemplo, injerto de diálisis) es una interacción compleja de inflamación, migración de células del músculo liso, proliferación y transformación de miofibroblastos que ocurre tan pronto como se presenta el trauma (Futura; 1997. p. 289-317). Si la arteria resulta dañada seriamente por enfermedad y quizá endurecida por deposición de calcio, la intervención puede también causar cierto grado de daño adicional con D-endotelialización local y exposición de los componentes de la matriz extracelular subyacente, tales como colágeno y elastina. En algunos pacientes, el excesivo reclutamiento de plaquetas y fibrinógeno puede dar lugar entonces a una oclusión trombótica aguda.

Los estudios realizados empleando modelos de arteria carotídea de la rata endarterectomizada (Neurosurg 1985; 16:773-79), así como modelos de daños de la embolectomía con balón (Lab. Invest. 1983; 49:327-33) ha demostrado que a medida que las células endoteliales se disgregan durante el daño vascular, las plaquetas comienzan a adherirse al subendotelio expuesto. Spallone et al., (Neurosurg 1985; 16:773-79) empleando microscopía electrónica de barrido han demostrado que, cinco minutos después de una endarterectomía carotídea en una rata, se forma una monocapa de plaquetas sobre la zona dañada. Quince minutos después del daño, se observan agregación de plaquetas y formación de trombo. Treinta minutos después de la endarterectomía, el sitio se cubre con plaquetas activas y se reviste con fibrina y células rojas de la sangre. La formación de trombo alcanza su pico a las tres horas después del daño, observándose una capa espesa de fibrina-plaquetas. Las plaquetas son un componente integral de esta formación de trombo y por tanto de trombosis, pero también parecen jugar un papel en el desarrollo de hiperplasia de la íntima.

Estudios realizados empleando ratas trombocitopénicas han demostrado además un descenso importante en el espesamiento de la íntima después del daño en la arteria carotídea en comparación con ratas de control (Proc. Natl. Acad. SCI USA 1989; 86:8412-16). Una vez que las plaquetas se adhieren al subendotelio expuesto de un vaso dañado, las mismas se hacen activas y liberan sus gránulos. Estos gránulos contienen factores vasoactivos y trombóticos (serotonina, ADP, fibrinógeno, factor de Von Willebrand, tromboxano A2), así como factores de crecimiento (factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de transformación beta y factor de crecimiento epidérmico) (Circulation 1985; 72:735-40). No se entienden todavía del todo los mecanismos exactos por los cuales las plaquetas realzan el desarrollo de hiperplasia de la íntima. Estudios realizados sugieren que las plaquetas proporcionan principalmente un estímulo quimiotáctico para la migración de células del músculo liso medial hacia la íntima durante la segunda fase del desarrollo de hiperplasia de la íntima (Vasc. Surg. 1991; 13:885-91). Otros estudios, empleando anticuerpos anti-PDGF, han demostrado el papel vital que PDGF juega en la acumulación de células del músculo liso de la neoíntima después de un daño vascular (Science 1991; 253:1129-32). Otro mecanismo por el cual las plaquetas pueden realzar el desarrollo de hiperplasia de la íntima es por vía de la activación de la cascada de coagulación y de la posterior acumulación de trombina en el sitio del daño. Varios estudios han demostrado los efectos mitógenos de la trombina sobre células del músculo liso (J. Clin. Invest. 1993; 91:94-98, J. Vasc. Surg. 1990; 11:307-13). Además, se ha demostrado que la trombina es un estímulo para la activación de plaquetas. Independientemente del mecanismo exacto, la adhesión y activación de plaquetas en el sitio de un daño vascular juegan un papel importante en el desarrollo de trombosis e hiperplasia de la íntima y, por tanto, la inhibición de la adhesión y activación de plaquetas puede ayudar a prevenir o reducir las tasas de trombosis y el desarrollo de hiperplasia de la íntima.

La adherencia de plaquetas a la pared arterial dañada es mediada en primera instancia por el factor de von Willebrand (vWF), una glicoproteína multímera que es liberada de las células endoteliales y circula en el plasma, en donde funciona como una proteína portadora para el factor VIII (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67:395-424). El vWF altamente multimerizado circula también contenido dentro de gránulos alfa de plaquetas, desde donde se libera después de la activación de las plaquetas (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67:395-424). Bajo condiciones de alto esfuerzo cortante, tales como aquellas encontradas en las arterias en sitios de placa ateromatosa o intervención mecánica, el vWF puede unirse, por vía de su dominio A3, a fibras de colágeno expuestas en la superficie (Biochemistry 1986; 25(26):8357-8361, Blood 1987; 70(5):1577-1583, J. Biol. Chem. 1987; 262(28):13835-13841). A su vez, el vWF unido a colágeno "traba" entonces a las plaquetas por vía de la exposición, dependiente del esfuerzo cortante, de un epitopo en el dominio vWF-A1 que interacciona con la plaqueta GPIb/IX/V (Blood 1985; 65(1):85-90, Blood 1985; 65(4):823-831, Br. J. Haematol 1986; 63(4):681-691). De este modo, el vWF actúa como un puente entre el colágeno y las plaquetas y constituye un requisito previo para la adhesión de las plaquetas a colágeno en flujo (J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2):296-300). Sin embargo, el envolvimiento de las plaquetas o del vWF se traduce en una adhesión débil y se requieren interacciones directas adicionales entre colágeno y otros receptores sobre la superficie de las plaquetas, con el fin de facilitar la adhesión, activación y agregación permanentes de las plaquetas (Thromb. Haemost 1997; 78(1):434-438, Thromb. Haemost 1997; 78(1):439-444). Los receptores de colágeno directos sobre las plaquetas incluyen GP VI (Blood 1987; 69(6):1712-1720, Thromb. Haemost 1999; 81(5):782-792, J. Clin. Invest. 1989; 84(5):1440-1445), GP Ia/IIa (\alpha_{2}/\beta_{1}) (J. Clin. Invest. 1989; 84(5):1440-1445, Nature 1985; 318(6045):470-472), y en un menor grado GP IV (CD36) (J. Biol. Chem. 1989; 264(13):7576-7583) y quizá incluso p65 (J. Clin. Invest. 1997; 100(3):514-521). En ausencia de la unión a plaquetas asistida por vWF, dichos receptores han demostrado ser demasiado débiles en la mediación del reclutamiento de plaquetas a colágeno en flujo (Br. J. Haematol 1986; 63(4):681-691). Por último, el vWF, en combinación con fibrinógeno, facilita la reticulación y activación adicional de plaquetas por vía de la unión a la plaqueta GP IIb/IIIa (J. Clin. Invest. 2000; 105(6):783-791), proporcionando así estabilidad y resistencia al trombo en desarrollo.

Con la llegada de antagonistas de la plaqueta GP IIb/IIIa y del receptor de ADP se han dado en los últimos años grandes pasos hacia la terapia anti-agregatoria (Coronary Art Dis 1999; 10(8):553-560, J. Am. Coll. Surg. 2000; 191(1):76-92). Sin embargo, dichas estrategias no están diseñadas para inhibir la adhesión inicial de plaquetas a fibras expuestas de colágeno y, a pesar de la eficacia de los antagonistas de GP IIb/IIIa a la hora de atenuar las interacciones plaqueta-plaqueta, las plaquetas se adhieren todavía a la pared del vaso dañado (Blood 1993; 81(5):1263-1276, Circulation 1995; 91(5):1354-1362). Por otro lado, la activación de las plaquetas se extiende casi con seguridad más allá de la agregación y trombosis aguda, siendo parcialmente afectada la progresión de hiperplasia sub-aguda y crónica de la íntima por mediadores mitógenos, tal como factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), liberados por la activación de plaquetas. En realidad, se ha demostrado que la inhibición de PDGF reduce la hiperplasia de la íntima en varias especies animales (Science 1991; 253(5024):1129-1132, Circulation 1999; 99(25):3292-
3299).

La importancia patofisiológica del vWF es sugerida por el incremento de vWF en circulación en pacientes con infarto de miocardio agudo (Thromb Haemost 2000; 84:204-209, Circulation 1998; 98(4):294-299), estando correlacionados positivamente los niveles de vWF con la pobre prognosis ulterior (Circulation 1998; 98(4):294-299). Estudios in vivo han demostrado además que la neutralización de anticuerpos anti-vWF inhibe la trombosis experimental, confirmando el papel esencial de vWF en la formación del trombo (Thromb. Haemost 1998; 79(1):202-210). Además, con el uso cada vez más extendido de las técnicas de angioplastia en síndromes coronarios agudos, que invariablemente dan lugar a daños en la pared del vaso y a una exposición de colágeno, existe la necesidad cada vez mayor de disponer de estrategias que intervengan farmacológicamente tan pronto como sea posible durante la cascada de adhesión-activación-agregación de plaquetas.

Las dos principales líneas de terapia, que están siendo empleadas actualmente en un intento de controlar la adhesión, activación de plaquetas y posterior trombosis e hiperplasia de la íntima, son los agentes anti-plaquetas y la administración anti-trombótica. Aunque los fármacos tal como aspirina bloquean de un modo eficaz la síntesis de tromboxano A2 a través de la inhibición de la vía de ciclooxigenasa, los mismos no previenen la adhesión y activación de plaquetas, inducidas por colágeno, las cuales estimulan el desarrollo de hiperplasia de la íntima. El uso de heparina como agente antitrombótico está asociado con complicaciones y limitaciones, incluyendo una respuesta a la dosis no predecible, la necesidad de un control estrecho en el laboratorio, la actividad limitada contra trombina unida a coágulos, múltiples sitios inhibidores, dependencia de antitrombina III, riesgo de una importante sangría, así como la necesidad de una infusión continua. Evidentemente, un agente terapéutico ideal será aquel que produzca efectos específicos y localizados en el sitio sin distribución sistémica o una coagulopatía generalizada.

Parece ser que las etapas vitales que precipitan la cascada de acontecimientos que conducen a trombosis y posterior hiperplasia de la íntima se derivan de la interacción entre el colágeno subendotelial expuesto en el sitio de daño en el vaso y una monocapa de plaquetas que se adhieren al colágeno expuesto. Por tanto, un inhibidor específico de la adhesión de plaquetas a colágeno subendotelial puede servir para prevenir o al menos disminuir el desarrollo de trombo e hiperplasia de la íntima.

Se ha informado que varias sustancias derivadas de sanguijuelas inhiben las interacciones colágeno-plaquetas (Blood 1995; 85(3):705-711, Platelets 2000; 11(2)83-86, J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6893-6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6899-6904, Blood Coagul. Fibrinolysis 1991; 2(1):179-184). Se ha indicado que la destabilasa, una isopeptidasa con actividad despolimerizante de fibrina, aislada de Hirudo medicinalis, inhibe la agregación de plaquetas inducida por varios agonistas, incluyendo colágeno, pero se cree que se une de forma directa a la membrana de las plaquetas (Platelets 2000; 11(2):83-86). La proteína antiplaquetas de sanguijuela (LAPP), una proteína de \sim13 kDa de la saliva de Haementeria officinalis, inhibe la adhesión de plaquetas a colágeno bajo condiciones estáticas (J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6899-6904, Thromb. Haemost 1999; 82(3):1160-1163) y flujo elevado (Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 1995; 15(9):1424-1431), con efectos sobre la unión a colágeno mediada por vWF y plaqueta GP Ia/IIa (Thromb. Haemost 1999; 82(3):1160-1163). Calin es una proteína de \sim65 kDa de Hirudo medicinalis para la cual ha emergido un perfil similar. Calin inhibe también las interacciones colágeno-plaquetas bajo condiciones tanto estáticas como de flujo (Blood 1995; 85(3):705-711, Blood Coagul Fibrinolysis 1991; 2(1):179-184, Thromb. Haemost 1999; 82(3):1160-1163). Además, tanto LAPP como Calin son inhibidores potentes de la agregación de plaquetas inducida por colágeno, inhibiendo la agregación a concentraciones similares a aquellas que bloquean la unión de vWF a colágeno (J. Biol. Chem. 1992; 276(10):6893-6898, Blood Coagul Fibrinolysis 1991; 2(1):179-184, Blood 1995; 85(3):712-719).

Tanto LAPP como Calin se han evaluado en modelos de trombosis in vivo, con un éxito diverso. La LAPP falló a la hora de reducir la formación de trombos en injertos revestidos con colágeno en una derivación arterio-venosa de babuino, a pesar del uso de dosis que inhibían la agregación de plaquetas inducida por colágeno (Arterioscler Thromb 1993; 13(11):1593-1601), mientras que Calin inhibía, de un modo dependiente de la dosis, la formación de trombo en un modelo de trombosis venosa en hámster (Blood 1995; 85(3):712-719).

Se conocen ya en la técnica revestimientos no trombogénicos y anti-trombogénicos para dilatadores y catéteres. Los revestimientos y productos no trombogénicos están basados en polímeros modificados y avanzados y ejemplos de los mismos se ofrecen en WO9301221 y WO9830615.

Los revestimientos anti-trombóticos y anti-restenosis son en general revestimientos biocompatibles que pueden servir también como depósitos para la administración local de fármacos. Los revestimientos están basados principalmente en hidrogeles y ejemplos de la bibliografía de patentes sobre métodos para preparar varios tipos de hidrogeles y dispositivos médicos de revestimiento, incluyen WO9211896, WO9811828, WO0147572, EP0887369 y WO0139811.

El perfil de liberación de las sustancias terapéuticas que están contenidas dentro del revestimiento se pueden ajustar, por ejemplo, variando el espesor de las capas de polímero o seleccionando revestimientos poliméricos específicos que contribuyen a propiedades físico-químicas seleccionadas (tales como carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad) y/o preparando el revestimiento como diferentes capas. Los criterios para la selección del polímero y optimización de la velocidad de liberación resultan evidentes para el experto en la materia. Otros revestimientos son descritos en Fischell Circulation, 1996, 94:1494-95), Topol et al (Circulation, 1998, 98:1802-20) y por McNair et al en device Technology, 1996, 16-22.

El uso de dilatadores, mallas y catéteres en el sistema cardiovascular es una práctica común y el daño en la pared del vaso, embolización y posterior restenosis constituye la principal preocupación de los cardiólogos durante y después de la intervención quirúrgica o cateterizaciones. Los métodos alternativos, tal como endarterectomía, causan problemas comparables. Cualquier procedimiento en donde las arterias son manipuladas, es decir, cirugía vascular y angioplastia, es susceptible al desarrollo de hiperplasia de la íntima. La utilidad de un método para prevenir o disminuir el desarrollo de hiperplasia de la íntima no puede ser sobrevalorado, y las ventajas de un método capaz de realizar esto sin producir efectos sistémicos son incluso más alentadores.

Por tanto, resulta evidente la necesidad de disponer de nuevos y mejorados productos farmacéuticos y métodos para inhibir los acontecimientos iniciales en patofisiología (por ejemplo, adhesión de plaquetas) y cabe esperar que las contribuciones en este campo hagan descender sustancialmente la morbidez y mortalidad asociadas con procedimientos angioplasíticos o quirúrgicos.

Descripción de la invención

En general, la presente invención implica la introducción del inhibidor de la adhesión de plaquetas recientemente descrito Saratin en o sobre una localización seleccionada dentro o sobre un lumen de un tejido, es decir, la vasculatura o un órgano, bajo condiciones tales que Saratin se puede emplear localmente como un agente tópico o como un revestimiento adherente sobre la superficie, para prevenir e inhibir una respuesta trombótica y/o restenótica indeseable al daño de la pared del vaso, incluyendo el daño asociado con angioplastia, dilatadores, graftsand en diálisis distintos de los injertos vasculares, y el tratamiento de formación hipertrófica benigna de cicatrices, así como el tratamiento y pasivación de placas ateroscleróticas inestables.

Saratin es una proteína recombinante de 12 kD recientemente descrita (WO0056885), originalmente aislada de una sanguijuela. La proteína inhibe la unión dependiente de vWF de plaquetas a colágenos de la pared arterial bajo condiciones de alto esfuerzo cortante y este aspecto de la invención es el que hace que Saratin sea adecuado para inhibir la trombosis arterial. Otro nuevo aspecto es que Saratin se puede emplear como un agente tópico en el sitio del daño con la ventaja de disminuir la trombosis y/o hiperplasia de la íntima sin ningún efecto sistémico. Esto representa una modalidad con efectos específicos y localizados bien adecuados para su aplicación por cirujanos y también por radiólogos intervinientes.

Saratin se puede combinar con una variedad de agentes terapéuticos para su administración in situ. Ejemplos de usos en aplicaciones en arterias coronarias son agentes anti-trombóticos, por ejemplo, prostaciclina y salicilatos, agentes trombolíticos, por ejemplo, estreptoquinasa, uroquinasa, activador de plasminógeno de tejido (TPA) y complejo activador de plasminógeno-estreptoquinasa anisoilado (APSAC), agentes vasodilatadores, es decir, nitratos, fármacos bloqueadores de los canales de calcio, agentes anti-proliferativos, es decir, colchicina y agentes alquilantes, agentes intercalantes, factores moduladores del crecimiento tales como interleuquinas, factor de crecimiento de transformación beta y congéneres de factor de crecimiento derivado de plaquetas, anticuerpos monoclonales dirigidos contra factores de crecimiento, agentes anti-inflamatorios, esteroidales y no esteroidales, y otros agentes que pueden modular el tono, la función, la arteriosclerosis de los vasos, y la respuesta de curación al daño del vaso u órgano después de la intervención. También se pueden incluir antibióticos en combinaciones o revestimientos de acuerdo con la invención. Además, se puede emplear un revestimiento para efectuar la administración farmacéutica de manera focal dentro de la pared del vaso. Mediante la incorporación del agente activo en un polímero hinchable, el agente activo se liberará tras el hinchamiento del polímero.

En una modalidad, el revestimiento está constituido por un hidrogel, tal como óxido de polietileno, albúmina, polimetacrilatos hidrófilos y poliuretanos hidrófilos.

La presente invención proporciona además el uso de Saratin y derivados por vía de dispositivos/catéteres para la administración local de fármacos o por vía de las técnicas de dilatadores y revestimientos de dilatadores y de injertos vasculares y revestimientos de injertos, por ejemplo. La invención proporciona también métodos para administrar Saratin en composiciones que eluyen las cantidades reguladas del Saratin en el transcurso del tiempo en una zona localizada.

En particular, se pueden emplear dispositivos a base de catéteres para administrar Saratin localmente. El Saratin se puede aplicar también con o sin otros agentes terapéuticos desde una matriz polimérica a tejidos corporales empleando catéteres. Los requisitos básicos del material polimérico a utilizar en el presente método son los de biocompatibilidad y propiedades de liberación del fármaco que puedan adaptarse a la aplicación específica contemplada.

La liberación local controlada de Saratin se puede conseguir solo por permeación, solo por iontofóresis, solo por electroporación, o bien se puede emplear una combinación de iontofóresis y electroporación, para liberar e incorporar Saratin de un modo eficiente dentro del lumen del vaso. Preferentemente, el catéter es capaz de ejecutar procedimientos diseñados para mantener una alta concentración de fármaco en el espacio del vaso seleccionado, de manera que los resultados proporcionen un revestimiento del vaso mejorado con Saratin solo o con otros agentes de trata-
miento.

La presente invención es particularmente aplicable a la administración local de Saratin durante y después de procedimientos de cardiología intervencional, tal como angioplastia e implantación de dilatadores y endarterectomía.

Descripción detallada de la invención

El Saratin recombinante adecuado para utilizarse en la invención fue expresado y aislado a partir de Hansenula polymorpha y se comprobó que actúa bloqueando la unión de vWF a colágeno y previene de manera eficaz la adhesión de plaquetas a colágeno bajo alto esfuerzo cortante. El Saratin inhibe, de un modo dependiente de la dosis, la unión de vWF humano purificado a colágenos humanos de tipos I y III (IC_{50} = 0,23 \pm 0,004 y 0,81 \pm 0,04 \mug ml^{-1}, respectivamente) y a colágeno de piel de ternero (IC_{50} = 0,44 \pm 0,008 \mug ml^{-1}). Además, el Saratin mostró una potencia inhibidora similar contra la unión de vWF de plasma humano, de roedores y porcino a dichos colágenos. En una cámara de flujo bajo condiciones de alto esfuerzo cortante (2.700 s^{-1}), el Saratin inhibió potentemente, de un modo dependiente de la dosis, la formación de agregados de plaquetas sobre una superficie revestida de colágeno (IC_{50} = 0,96 \pm 0,25 \mug ml^{-1}), pero a un esfuerzo cortante reducido (1.300 s^{-1}) se observó un cambio hacia la derecha de la curva dosis-respuesta (IC_{50} = 5,2 \pm 1,4 \mug ml^{-1}). El análisis por resonancia de plasmón superficial reveló sitios para la unión de alta y baja afinidad de Saratin sobre colágeno humano de tipo III (K_{d} = 5 x 10^{-8} M y 2 x 10^{-6} M, respectivamente), y aunque a bajas concentraciones de Saratin, que inhibían la adhesión de las plaquetas bajo un mayor esfuerzo cortante (es decir, saturación de sitios de unión de alta afinidad), no tenían efectos sobre la agregación de plaquetas inducida por colágeno e independiente de vWF, se encontraron altas concentraciones (es decir, saturación de sitios de unión de baja afinidad) que inhibían la agregación de plaquetas. Estos datos demuestran que Saratin es un potente inhibidor de la adhesión de plaquetas a colágeno, dependiente de vWF, lo cual constituye la base de su potencial terapéutico como agente anti-trombótico.

Los estudios demostraron además que Saratin inhibe de forma potente y dependiente de la dosis la unión de vWF no solo a colágeno de piel de ternero, sino también a colágeno humano de los tipos I y III, los cuales son ambos abundantes en las capas sub-endoteliales de la pared arterial y que se cree que son importantes en las interacciones plaquetas-pared del vaso (Thromb Haemost 1997, 78(1):434-438). Puesto que las interacciones colágeno-vWF-GP Ib/IX/V solo tienen lugar a un esfuerzo cortante suficientemente elevado, un aspecto importante de esta invención consistió en demostrar la eficacia de Saratin no solo bajo condiciones estáticas, sino también en un entorno que imita más estrechamente la situación encontrada in vivo. En una cámara de flujo, en donde los esfuerzos cortantes se pueden variar para simular dicho entorno, el Saratin inhibió claramente la acumulación de plaquetas en colágeno, particularmente a un esfuerzo cortante más alto. El cambio hacia la derecha de la curva dosis-respuesta como resultado de reducir el esfuerzo cortante resulta notorio puesto que la implicación de ello es que la eficacia de Saratin in vivo puede localizarse en zonas de alto esfuerzo cortante, en donde la ruptura del flujo sanguíneo laminar surge como consecuencia de cambios en la superficie endotelial presentada a la sangre, por ejemplo en presencia de placa aterosclerótica o después de intervención mecánica.

Los estudios de resonancia de plasmón superficial realizados con Saratin revelaron que el colágeno puede poseer dos sitios de unión independientes para Saratin, uno de alta afinidad y otro de baja afinidad. La inhibición por Saratin de la unión de vWF a colágeno se explica por la saturación del sitio de unión de alta afinidad, con valores IC_{50} de alrededor de 5 x 10^{-8} M, es decir, iguales a la constante de disociación para dicho sitio. Debido a que la agregación de plaquetas inducida por colágeno de forma independiente de vWF únicamente se inhibió a dosis muy altas de Saratin (por encima de 100 \muM), se desprende que la saturación del sitio de unión de colágeno de baja afinidad está asociada con la inhibición de las interacciones directas colágeno-receptor de colágeno.

Otro objetivo de esta invención reside en el efecto del Saratin para afectar el entorno local de un vaso endarterectomizado sin requerir distribución sistémica y sin alterar la función de las plaquetas o alterando la coagulación, siendo así un medio ideal para su aplicación tópica durante procedimientos quirúrgicos vasculares y radiológicos intervencionales.

En este aspecto de la invención, el efecto terapéutico de Saratin fue investigado empleando un modelo de endarterectomía carotídea en la rata (CEA) ya descrito (J. Vasc. Surg. 1998; 28:909-918). Se pensó que la activación de PLT constituía la etapa de inicio en trombosis y restenosis posterior a CEA debido a IH. Se ha observado que la aplicación tópica de Saratin sobre la superficie luminal disminuirá la cantidad de adhesión de plaquetas a la arteria endarterectomizada y de este modo disminuirá la trombosis post-op e IH.

Como un resumen de los resultados experimentales, el efecto anti-adherencia de plaquetas de Saratin, evaluado después de dos tiempos post-operativos diferentes, indicó que el número de plaquetas adheridas a las 3 horas (figura 4) y 24 horas (figura 5) después de la endarterectomía carotídea, se redujo de manera importante en las ratas tratadas con Saratin en comparación con las ratas de control.

La adhesión de las plaquetas se redujo en un 59% a las 3 horas (64\pm17,2 vs 155\pm33,4 PLT por cuadrícula P=0,05) y en 77% a las 24 horas (35\pm11,3 vs 149\pm36,6 PLT por cuadrícula P=0,0110). La adhesión de plaquetas fue similar a las 3 horas y 24 horas en los grupos de control, pero mostró de hecho un descenso en el grupo tratado con Saratin desde 64 a 35 plaquetas por cuadrícula.

Las figuras 6 y 7 muestran una representación típica de la superficie endarterectomizada con y sin aplicación tópica de Saratin, empleando microscopía de barrido electrónico a un aumento de 2.000 X. La figura 6A muestra la superficie de control a las 3 horas después de la endarterectomía carotídea, pudiéndose apreciar la marcada abundancia de material celular, hebras de fibrina, numerosas células rojas sanguíneas y numerosas plaquetas. La figura 6B muestra una superficie tratada con Saratin 3 horas después de la endarterectomía carotídea. Puede apreciarse la ausencia de elementos celulares y la superficie de colágeno casi vacía. La figura 7A muestra una superficie de control a las 24 horas después de la endarterectomía carotídea, evidenciándose las plaquetas como pequeños puntos blancos. La figura 7B es una superficie tratada con Saratin a las 24 horas después de la endarterectomía carotídea. Existe una clara reducción en la adhesión de plaquetas con el tratamiento con Saratin.

La aplicación tópica de Saratin después de una endarterectomía carotídea disminuyó de manera importante el desarrollo de hiperplasia de la íntima en comparación con el grupo de control. El porcentaje de estenosis luminal, como una medida de IH, disminuyó de manera importante con la aplicación de Saratin en comparación con los controles. Este descenso en la formación de IH estaba correlacionado con la inhibición de la adherencia de PLT. En términos de estenosis luminal, las ratas de control mostraron una estenosis luminal de 29,8\pm6,8%, p=0,0042 vs una estenosis luminal de 10,9\pm1,8% en el grupo tratado con Saratin (figura 6). Las ratas tratadas con Saratin tenían un diámetro luminal 18,9% más grande que las ratas de control. A las dos semanas después de la endarterectomía carotídea, 5 de las 15 ratas de control (15%) desarrollaron un trombo completo de la arteria carotídea tras el análisis histológico, mientras que 0 de 15 ratas tratadas con Saratin (0%) desarrollaron trombosis carotídea. Un análisis Chi Cuadrado de la razón de verosimilitud reveló una razón de disparidad de 16.238 lo cual sugiere que la diferencia del grupo de control que desarrolla trombosis oclusiva fue 16 veces mayor que aquella de las ratas tratadas con Saratin P=0,0156.

No se encontró incremento de sangría a lo largo de la línea de sutura arterial en el grupo de Saratin. Se comprobó que los tiempos de sangría y los recuentos sistémicos de plaquetas no cambiaron de manera importante en las ratas tratadas con Saratin en comparación con las ratas de control a las 3 y 24 horas después de la endarterectomía.

El modelo CEA se asemeja estrechamente a la operación CEA en seres humanos y, por tanto, los resultados proponen un mecanismo para disminuir los efectos perjudiciales de la adherencia y agregación de plaquetas en el sitio de la endarterectomía sin afectar sistémicamente a la función de las plaquetas o sin descender la hemostasis. La simple aplicación tópica de Saratin durante una CEA en rata disminuye la adherencia y agregación de plaquetas y la posterior restenosis en el lecho de la carótida debido a hiperplasia de la íntima.

La tabla 3 muestra los resultados de los tipos de sangría y recuentos de plaquetas. No se observaron diferencias estadísticamente importantes entre los tiempos de sangría pre-op y post-op. No se identificó una diferencia estadísticamente importante en las diferencias de recuentos de plaquetas entre las ratas de Saratin y de control.

La entidad solicitante ha demostrado un descenso importante en la adhesión y acumulación de plaquetas después de un daño vascular similar a una endarterectomía. La menor adhesión de plaquetas se aprecia tanto inmediatamente después de la endarterectomía (3 horas) así como a las 24 horas. El efecto a las 24 horas es importante ya que esta entidad solicitante piensa que dicho efecto no se debe al efecto inhibidor directo de Saratin sobre el colágeno (la vida media de Saratin en suero es de 90 minutos), sino que más bien se debe a la inhibición inicial de la agregación de plaquetas y a la posterior ruptura de la cascada de activación de las plaquetas. Una vez que las plaquetas resultan inhibidas inicialmente de su adherencia al colágeno expuesto, la cascada de plaquetas no puede proceder. Las figuras 4 y 5 demuestran que la aplicación tópica de Saratin en el vaso recientemente dañado puede inhibir la adhesión de plaquetas en un grado importante. Saratin inhibió la adhesión de plaquetas en un 60% y un 75% a las 3 y 24 horas respectivamente. Esta inhibición se aprecia en las diferencias visibles en la deposición de elementos celulares entre las arterias de control y las tratadas con Saratin tanto a las 3 horas como a las 24 horas (figuras 7 y 8). Esta ausencia de respuesta celular que propone esta entidad solicitante se debe a la inhibición de la adhesión de las plaquetas. Ello representa un modo único de terapia para la inhibición de la adhesión de plaquetas a un vaso dañado. Las ratas de control tenían un diámetro luminal significativamente reducido a las dos semanas después de la endarterectomía carotídea en comparación con las ratas tratadas con Saratin (figura 9). El grado de desarrollo de hiperplasia de la íntima se redujo de manera importante en las ratas tratadas con Saratin, lo cual se correlaciona con una menor adhesión y acumulación de las plaquetas. El hallazgo de un grado menor de hiperplasia de la íntima y trombosis, que están asociadas con una menor adhesión de las plaquetas, revela puntos finales clínicamente relevantes y resultados de una menor adhesión de las plaquetas. Ello demostró que la inhibición no sistémica y específica al sitio de la agregación y adhesión de plaquetas conduce a una menor trombosis y a una menor tasa de oclusión y, por tanto, reduce la incidencia de posteriores eventos cerebrovasculares relacionados con la endarterectomía carotídea. El nivel de mejora de hiperplasia de la íntima y de estenosis luminal queda demostrado además por el hallazgo importante de una menor tasa de trombosis en ratas tratadas con Saratin. Un total de 33% de ratas de control mostraron trombosis mientras que ninguna de las arterias carotídeas tratadas con Saratin resultaron trombosadas. De particular importancia clínica es la ausencia de efectos sistémicos demostrados por este agente. La aplicación local de Saratin no afectó a los tiempos de sangría o recuentos sistémicos de plaquetas. Ello implica que la menor adhesión de plaquetas y el posterior descenso de trombosis e hiperplasia de la íntima son el resultado de efectos locales. Estos nuevos hallazgos relacionados con Saratin son ciertamente importantes ya que es muy amplio el espectro de aplicaciones clínicas para una modalidad que es capaz de inhibir localmente los efectos perjudiciales de adhesión y activación de plaquetas sin perturbar el mecanismo hemostático sistémico.

Ya se ha indicado con anterioridad que varias intervenciones terapéuticas inducen daños locales que idealmente deberían ser tratados de forma inmediata y local. El hecho de que las células dañadas no sean tratadas inicia una serie de procesos implicados en la coagulación, activación de complemento y respuesta celular para la liberación de citoquinas, inducción de proliferación y otros procesos biológicamente activos. Es difícil detener dichos procesos complejos, interrelacionados, una vez que los mismos han comenzado.

Por tanto, en la presente invención, un aspecto importante es que Saratin queda localizado directamente en los tejidos manipulados. Otro aspecto de la aplicación local es la reducción al mínimo de problemas potenciales relacionados con los efectos sistémicos de los fármacos usados en la intervención.

Idealmente, el tratamiento con Saratin se puede administrar de forma simultánea con la intervención terapéutica adecuada, lo cual se puede conseguir incorporando Saratin en el revestimiento de un dispositivo quirúrgico, tal como un catéter de balón, u otro dispositivo o parte del mismo. Otro aspecto podría implicar también el revestimiento directo de los vasos dañados con Saratin.

Además, en la invención se pueden emplear también medios normales para la administración de Saratin, tal como en forma fluida libre, incluyendo combinaciones con otros agentes terapéuticos. Sin embargo, el uso de matrices de polímero/hidrogel presenta ciertas ventajas con respecto al suministro de fluido libre. El suministro de un agente que ha sido incorporado en una matriz polimérica no requiere lúmenes adicionales en el catéter de soporte para conducir la solución medicamentosa fluida libre dentro y fuera del sitio de tratamiento.

Por otro lado, las matrices poliméricas eliminan el riesgo de fugas aguas debajo de la solución medicamentosa como consecuencia de un defectuoso sellado por el balón de los segmentos de los vasos, evitando con ello el riesgo de exposición de tejido no diana a elevadas concentraciones del fármaco.

Una solución técnica general para la aplicación local de Saratin, bien en un dispositivo médico o bien como un revestimiento, en el baño dañado, consiste, por ejemplo, en la incorporación de Saratin en un revestimiento de polímero o hidrogel.

Con respecto a la composición polimérica, el término "hidrogel" tal como aquí se emplea incluye polímeros sintéticos con poros o intersticios de diferentes tamaños y capacidades y propiedades físico-químicas variables, especialmente con respecto a la carga o la naturaleza hidrófila/hidrófoba de la matriz de gel que puede ser introducida durante la preparación del revestimiento o del dispositivo revestido. Los expertos en la materia son conocedores de diversos elastómeros sintéticos y materiales poliméricos de origen natural. El Saratin se puede incorporar en la matriz bien durante la producción del polímero o bien se puede añadir después del revestimiento o moldeo del polímero a la configuración deseada. Además, se pueden emplear muchos de un número de diferentes materiales poliméricos y métodos de fabricación, para formar las matrices poliméricas empleadas en la presente invención. Ejemplos de materiales poliméricos adecuados o combinaciones de los mismos, incluyen, pero no de forma limitativa, polímeros biocompatibles y/o biodegradables.

Se han investigado varios alquil alquil- y cianoacrilatos para uso quirúrgico y algunos cianoacrilatos de isobutilo han resultado ser especialmente adecuados.

Se puede producir un polímero de hidrogel típico a partir de una mezcla monómera que comprende 40-60 partes en peso de un monoéster purificado de un alquilacrilato de hidroxialquilo que tiene un solo doble enlace olefínico, 40-60 partes en peso de un monómero metacrílico que contiene un doble enlace olefínico y 0,001-5 partes en peso de un iniciador de la polimerización. La polimerización se puede efectuar por técnicas convencionales de polimerización en masa, polimerización en solución, polimerización en suspensión o polimerización en emulsión. La técnica de polimerización usada depende del volumen de polímero requerido y de la naturaleza del producto final a obtener. Un producto de hidrogel típico será aquel descrito por una relación molar de monoéster a monómero metacrílico del orden de 1:1 a 2,3:1, con preferencia 1,5:1, en donde el diámetro de los poros del polímero es mayor de 90 Angstroms.

Como el monoéster de un acrilato de hidroxialquilo que tiene un solo doble enlace olefínico, los compuestos aceptables incluyen, pero no de forma limitativa, metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de glicerilo, metacrilato de 2-hidroxipropilo, metacrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo y acrilato de 2-hidroxipropilo. Los monómeros metacrílicos aceptables son ácido metacrílico, metacrilamida y metacrilonitrilo.

El iniciador de la polimerización puede depender del método de polimerización o del uso al que se destine el polímero. Por ejemplo, cuando el polímero ha de formarse como un objeto sólido, se pueden emplear iniciadores de radicales libres.

Los iniciadores preferidos de ese tipo incluyen poliésteres difuncionales tal como 2,5-dimetil-2,5-bis(2-etilhexoilperoxi)hexano, o peroxipivalato de terc-butilo. Alternativamente, cuando el uso final del polímero es como un revestimiento aplicado en forma de la mezcla monómera y polimerizado in situ, el iniciador puede ser activado por radiación, tal como los catalizadores UV 2,2-azobis(2-metilpropionitrilo) o azobisbutironitrilo (AIBN). Los iniciadores no quedan restringidos a su uso en un método de polimerización particular o para un producto final también particular. Por ejemplo, los iniciadores de radicales libres se pueden emplear en revestimientos y los iniciadores activados por radiación se pueden emplear en la formación de artículos sólidos.

Además de las fracciones sustancialmente similares del monoéster y monómero metacrílico, la mezcla monómera se puede mejorar con cantidades de traza de un comonómero de éster acrilato o metacrilato de alquilo de cadena más larga, tal como metacrilato de ciclohexilo, trimetacrilato de trimetilolpropano o dimetacrilato de etilenglicol. Dichos comonómeros adicionales mejoran la reticulación del polímero en situaciones en donde se desee una mayor resistencia del polímero. Las cantidades de traza de dichos comonómeros son en general menores de 0,1% en peso del total de mezcla monómera.

Los polímeros de hidrogel empleados en la presente invención se pueden conformar para producir un artículo que está suficientemente reticulado por acción intrínseca, de manera que el artículo resultante no requiere monómeros reticulantes adicionales.

Otros ejemplos de polímeros biodegradables son poli(lactidas), poliglicólidos, polianhídridos, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de los mismos y polietilenglicol. Estos pueden asumir la forma de hidrogeles co-poliméricos o estructuras poliméricas reticuladas en donde se pueden incorporar fármacos para una mejor administración local, bien durante la polimerización o bien, en el caso de ciertos hidrogeles, se pueden cargar posteriormente. Las matrices preferidas se adaptarán a medida de acuerdo con las características moleculares del agente para controlar la libre difusión hacia el exterior.

Se pueden construir y utilizar múltiples tipos de catéteres y otros dispositivos médicos revestidos con Saratin, dependiendo de la necesidad terapéutica individual para la cual hayan sido diseñados, o bien para la finalidad más específica de suministrar localmente el polímero cargado con Saratin. La presente invención ha sido ensayada con el catéter de balón comercializado con el nombre Blue medical Devices BV GO de Blue medical, pero no queda limitada a este tipo de catéter.

Otros ejemplos Ejemplo 1 Unión de vWF purificado y de plaquetas a colágeno bajo condiciones estáticas

La unión de vWF a colágeno fue investigada en placas de microvaloración, esencialmente como ya es conocido (Blood 1995; 85(3):705-711). Diversos colágenos, bien colágeno humano de tipo I, tipo III, o bien colágeno de piel de ternero (Sigma), fueron revestidos durante la noche mediante pipeteado de 50 \mul de colágeno, disuelto en ácido acético 50 mM, a 125 \mug ml^{-1}, en placas de microvaloración de 96 pocillos en presencia de 200 \mul de PBS, para promover la renaturalización. Después del bloqueo de los sitios no revestidos con BSA, se añadió a los pocillos, en presencia de Saratin, vWF humano purificado (1,25 \mug ml^{-1} para placas revestidas con piel de ternero y colágeno I; 0,625 \mug ml^{-1} para placas revestidas con colágeno III) o plasma normal diluido (plasma humano: 1/80 sobre colágeno I y III, 1/40 sobre colágeno de piel de ternero; plasma de hámster, ratón y porcino: 1/80 sobre colágeno III; 1/20 sobre colágeno I y colágeno de piel de ternero) y se incubó durante 2 horas (plasma diluido) o durante 1 hora (vWF purificado). La unión de vWF residual a colágeno se determinó después de una etapa de lavado adicional empleando antisuero de conejo anti-vWF (Dako, Copenhagen, Dinamarca) conjugado con peroxidasa de rábano picante, el cual se desarrolló midiéndose entonces la absorbancia de luz resultante a 492 nm.

Cuando las placas de microvaloración fueron incubadas previamente con colágeno humano I, colágeno humano III o colágeno de piel de ternero, la posterior incubación de vWF purificado en presencia de Saratin se asoció con una inhibición, dependiente de la dosis, de la unión vWF-colágeno, con valores IC_{50} de 0,23\pm0,004, 0,81\pm0,04 y 0,44\pm0,008 \mug ml^{-1} respectivamente (figura 1). Cuando el vWF purificado fue sustituido por plasma humano normal diluido, se mantuvo la potencia inhibidora del Saratin (tabla 1). El Saratin inhibió también la unión de vWF en plasma diluido porcino, de hámster y múrico a los diferentes colágenos ensayados, con una eficacia consistentemente más elevada contra colágeno I (tabla 1).

Ejemplo 2 Adhesión de plaquetas bajo alto esfuerzo cortante

A la vista de la importancia de los esfuerzos cortantes en el control de la adhesión de plaquetas a colágeno, dependiente de vWF (J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2):296-300), se llevaron a cabo estudios de perfusión en cámara de flujo para examinar la actividad inhibidora de Saratin bajo condiciones de flujo similares a las encontradas en arterias dañadas o enfermas. Se revistió colágeno de piel de ternero sobre cubreobjetos de material plástico como ya es conocido (Blood 1995; 85(3):705-711). Se realizaron perfusiones en una cámara de perfusión de placas paralelas con dos soportes de cubreobjetos y con alturas de la cámara de 0,4, 0,6 o 1,0 mm y un ancho de 1,0 cm, bajo flujo pulsante (bomba de rodillos, Watson Marlon 603S, VEL, Leuven, Bélgica) a velocidades de esfuerzo cortante aproximadas de 2.700, 1.300 y 300 s^{-1}, respectivamente. Se perfusionó sangre entera anticoagulada (0,2 IU ml^{-1} de heparina de bajo peso molecular, Clexane) sobre los cubreobjetos revestidos con colágeno durante 5 minutos, tras lo cual los cubreobjetos enjuagados fueron teñidos con Grünwald-Giemsa y evaluados respecto a la deposición de plaquetas mediante microscopía de luz y análisis de imágenes como ya es conocido (Blood 1995; 85(3):705-711), empleando cobertura de superficie como un parámetro cuantitativo.

A una velocidad de esfuerzo cortante de 2.700 s^{-1}, Saratin inhibió, de forma dependiente de la dosis, la adhesión de las plaquetas, con un valor IC_{50} = 0,96\pm0,25 \mug ml^{-1} (figura 2). Sin embargo, a una velocidad de esfuerzo cortante más moderada de 1.300 s^{-1}, se observó un cambio distintivo hacia la derecha en la curva de dosis-respuesta, con un valor IC_{50} = 5,2\pm1,4 \mug ml^{-1} (figura 2). A velocidades de esfuerzo cortante venoso de 300 s^{-1}, Saratin fue incapaz de inhibir la adhesión de plaquetas perfusionadas hasta 10 \mug ml^{-1} (datos no mostrados).

Ejemplo 3 Análisis de la unión por resonancia de plasmón superficial (SPR)

Las interacciones de la proteína fueron identificadas y caracterizadas por SPR empleando un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Freiburg, Alemania). Los reactivos del acoplamiento se emplearon de acuerdo con los protocolos desarrollados por el proveedor. El acoplamiento al chip sensor CM 5 se realizó por vía de grupos carboxilato activados a grupos amina libres de colágeno humano tipo III (Sigma). El reconocimiento del pH y la química del acoplamiento se llevaron a cabo bajo condiciones estándar (Anal. Biochem. 1991; 198(2):268-277, JAI Press Ltd., 1992). Para el acoplamiento, el colágeno fue diluido a 0,125 \mug ml^{-1} en tampón 10 mM acetato (pH 4,5), dando lugar a 331 unidades de resonancia (RU) de material inmovilizado. Esta matriz se utilizó para estudiar la unión de Saratin recombinante purificado que fue diluido en 20 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,005% Tween 20. Todos los experimentos de unión se realizaron a 25ºC. Las valoraciones con Saratin se llevaron a cabo a concentraciones que van desde 7,8 nM a 10 \muM. Los valores de meseta RU experimentales resultantes fueron trazados gráficamente de acuerdo con la ecuación:

R_{eq}/\text{concentración de Saratin} = (-K_{A} \ x \ R_{eq}) + (K_{A} \ x \ R_{max}).

La valoración de Saratin sobre la superficie de colágeno inmovilizada dio lugar a la unión dependiente de la concentración. Además, la cantidad máxima de Saratin unido a colágeno sobre la superficie sensora se tradujo en una señal mayor que la señal máxima calculada para un modelo de unión 1:1. Esto apunta hacia la existencia de más de un sitio de unión para Saratin sobre colágeno de tipo III, confirmado además por la observación de que la adaptación de los datos a un modelo de unión 1:1 de acuerdo con Langmuir no proporcionó resultados satisfactorios.

El análisis Scatchard de los datos de SPR indicó la existencia de dos sitios de unión diferentes con afinidades significativamente diferentes por Saratin (figura 3). El cálculo de las constantes de equilibrio se tradujo en una constante de disociación de 5 x 10^{-8} M para el sitio de unión de alta afinidad y de 2 x 10^{-6} M para el sitio de unión de baja afinidad.

Ejemplo 4 Agregación de plaquetas

La especificidad de Saratin sobre la función de las plaquetas fue evaluada adicionalmente por medio de estudios de agregación en plasma rico en plaquetas empleando colágeno, ADP, ristocetina, ácido araquidónico o el imitador de tromboxano U46619 como agonistas. Sangre citrada (3,13%) de voluntarios sanos no medicados fue centrifugada (15 min, 100 g) para obtener plasma rico en plaquetas, al cual se añadió Saratin (concentración final 0-200 \mug ml^{-1}) durante 1 minuto antes de la inducción de la agregación de plaquetas con colágeno (0,5 \mug ml^{-1}), ADP (2,5 \muM), ristocetina (0,9 mg ml^{-1}), ácido araquidónico (1,0 mM) o U46619 (1,3 \muM). Para cada agonista se observó la agregación máxima (amplitud) durante un periodo de 5 minutos.

Saratin falló a la hora de inhibir la agregación máxima a todos los agonistas ensayados, incluyendo colágeno, en concentraciones finales de hasta 40 \mug ml^{-1} (tabla 2). Sin embargo, Saratin fue capaz de inhibir parcialmente la agregación de plaquetas inducida por colágeno a 100 \mug ml^{-1} (no mostrado), con una inhibición completa a 200 \mug ml^{-1}, aunque la agregación a ADP resultó inafectada, incluso a 200 \mug ml^{-1} de Saratin.

Ejemplo 5 Modelo de CEA en rata

Se utilizó un modelo de CEA en la rata que empleaba una técnica abierta con arteriotomía, separación directa de la íntima y porciones de la media y cierre con sutura de la arteria. Uno de los grupos de ratas recibió Saratin mientras que el otro grupo sirvió como controles. Las mediciones de punto final incluyeron: 1) adhesión de PLT, 2) tasa de trombosis, 3) desarrollo de hiperplasia de la íntima. Se aplicó Saratin directamente a la superficie endarterectomizada de la arteria carotídea antes del cierre arterial. Para el análisis cuantitativo de la agregación de PLT se emplearon micrografías electrónicas (aumento 2.000 X) de arterias carotídeas preparadas. Los números totales de PLT fueron contados empleando una cuadrícula superpuesta transparente normalizada. IH y trombosis se evaluaron mediante análisis morfométrico asistido por ordenador de secciones de la arteria carotídea manchadas con elastina, con medición directa del área de IH.

Ejemplo 6 Operación de endarterectomía carotídea

Los animales fueron sedados con isoflurano en una campana de vidrio, pesados y luego anestesiados con una combinación de cetamina (100 mg/kg) y maleato de acepromazina (1 mg/kg) por vía intraperitoneal. Una vez que la anestesia adecuada fue confirmada por la ausencia de respuesta a una estimulación en la pata trasera, se inyectaron subcutáneamente 4 cc de salina normal en la región del espinazo medio superior para servir como un bolo de fluido (10 cc/kg) para compensar cualquier pérdida de sangre intra-operativa. La zona del cuello fue entonces rasurada e impregnada con alcohol isopropílico al 7%. Empleando una técnica estéril y un microscopio de disección (x40, sz40 Olympus, Olympus America Inc., Melvilla, NY) se practicó una incisión cervical central. Los músculos superficiales fueron divididos y se realizó la disección hasta el nivel de la arteria carotídea derecha. Los nervios cervicales en la región de la arteria fueron liberados por disección para preservar la función de la faringe y evitar un compromiso respiratorio post-operatorio.

Después de la adecuada exposición de la arteria carotídea, se obtuvo un control proximal y distal en la bifurcación, con una separación de aproximadamente 1,5 cm, empleando torniquetes de sutura de seda 3-0. Empleando una cuchilla corneal se realizó una arteriotomía que se extendió en una longitud de 6 mm con micro-tijeras. Empleando una aguja del calibre 27, la íntima fue marcada transversalmente de un lado a otro del vaso en dos líneas paralelas, separadas aproximadamente 2 mm entre sí. Las capas de la íntima y medial fueron separadas con micro-forceps. Las ratas del grupo de Saratin recibieron 5 \mul de solución de Saratin aplicada directamente a la superficie endarterectomizada. La arteriotomía se cerró con una sutura de nylon monofilamentosa 10-0 (MS/9, Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ) comenzando en el extremo distal. El torniquete distal fue separado en primer lugar para evaluar la hemostasis en la línea de sutura, seguido por la separación del torniquete proximal. El tiempo de aplicación de Saratin fue de 5 minutos, lo cual representó el tiempo de cierre de la arteriotomía. Cualquier sangría en la línea de sutura fue tamponada suavemente con un aplicador con punta de algodón estéril hasta que se consiguió la hemostasis. La arteria carotídea endarterectomizada fue evaluada con un Doppler manual para confirmar la patencia. La capa del músculo superficial y la piel fueron cerradas entonces con sutura absorbible 3-0.

Ejemplo 7 Adhesión de plaquetas

En los subgrupos de adhesión de plaquetas, las ratas fueron anestesiadas de nuevo y las arterias carotídeas endarterectomizadas fueron recogidas y fijadas en una solución de glutaraldehído al 4% a las 3 horas o 24 horas después de la endarterectomía carotídea. Durante el procedimiento de recogida, los segmentos de carótida fueron abiertos longitudinalmente a lo largo del sitio del cierre con sutura, para exponer así la zona endarterectomizada. Las arterias fueron fijadas después con tetróxido de osmio, deshidratadas en una serie graduada de alcoholes, secadas al punto crítico con CO2 (1072 psi y 31,1ºC), revestidas con oro-paladio y colocadas en un microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM 5410, JEOL, USA Peabody, MA). Las zonas endarterectomizadas fueron barridas con un aumento de 2.000 X y se obtuvieron imágenes fotográficas. Las imágenes fotográficas fueron emparejadas y expuestas en un collage para permitir la visualización de una zona más grande que la que fue posible con un solo campo del monitor del microscopio electrónico de barrido. Una vez montado el collage de fotografías, este se cubrió con una cuadrícula superpuesta transparente. Se utilizó la misma cuadrícula superpuesta para todas las fotografías de las muestras, empleándose 116 cuadrados para contar el número total de plaquetas en cada fotografía. El número 116 es el número máximo de cuadrados que de un modo consistente podrían contarse en todos los collages de fotografías. Los recuentos de las plaquetas fueron realizados por observadores de doble ciego.

Ejemplo 8 Hiperplasia de la íntima

A las dos semanas después de la endarterectomía carotídea, se anestesiaron las ratas del grupo de hiperplasia de la íntima y se expuso la arteria carotídea endarterectomizada. Se abrió el abdomen en la zona central y se expusieron la aorta distal y la vena cava inferior. La vena cava fue transectada y la aorta distal canulada con un catéter de calibre 20 para infusionar salina normal a 100 mm Hg hasta que el efluente de la vena cava corriera claro. A continuación, se infusionó formalina tamponada al 10% a 100 mm Hg en un volumen igual para completar la técnica de perfusión-fijación. Se liberó por disección una sección de 1 cm de la arteria carotídea operada y se colocó en formalina al 10% hasta su tratamiento adicional respecto a la histología. Las arterias fueron bloqueadas con parafina, seccionadas y manchadas con elastina con tintura de Werhoeff y Van Gieson. Se tomaron múltiples secciones en intervalos de 3 micrómetros, continuando cada una de ellas a lo largo de la distancia del cierre de la arteriotomía con sutura continua de nylon 10-0 para normalizar la región de seccionamiento. Las platinas teñidas con elastina fueron fotografiadas empleando una cámara digital KODAK DC 120 Zoom (Eastman KODAK Company, Rochester, NY). En este momento se anotaron cualesquiera secciones trombosadas. Las imágenes no trombosadas fueron descargadas en un ordenador y las zonas luminales de las carótidas fueron analizadas empleando el programa ImagJ Software, Versión 0.991, de National Institutes of Health (Bethesda, MD). Este paquete de software permitió delinear la zona interna de la hiperplasia de la íntima y obtener así una medida exacta del área en sección transversal del lumen del vaso. Igualmente, se determinó el área exterior de la hiperplasia de la íntima. La diferencia entre las dos áreas (área exterior de hiperplasia de la íntima menos el lumen real) se determinó como el área absoluta de hiperplasia de la íntima. Debido a que la sección transversal arterial presentaba variaciones de forma individuales, los valores se expresaron como una relación del área absoluta de hiperplasia de la íntima al límite exterior de hiperplasia de la íntima, y se anotó como un porcentaje de estenosis del lumen. Esta relación representa la proporción del área de lumen ocupada por hiperplasia de la íntima y permitió la comparación de las secciones transversales arteriales de tamaño variable (4). Se apreció una variabilidad mínima entre dos mediciones con observadores de doble ciego.

Ejemplo 9 Tiempos de sangría y recuentos de plaquetas

Con el fin de evaluar los efectos de Saratin sobre los recuentos de plaquetas y tiempos de sangría, sistémicos, se determinaron los recuentos de plaquetas y los tiempos de sangría de 12 ratas. Fue necesario obtener una muestra de sangre pre-operatoria de cada rata de aproximadamente 1-1,5 cc, lo cual representa una porción importante del volumen de sangre total de las ratas. A la vista de esto, es razonable esperar un descenso en los recuentos de plaquetas post-operatorios de las ratas tanto de control como de Saratin. Con el fin de evaluar los efectos de Saratin sobre los recuentos de plaquetas, se determinó la diferencia de los recuentos de plaquetas para cada rata restando el recuento de plaquetas pre-operatorio del recuento de plaquetas post-operatorio, para obtener una puntuación de diferencias. Las diferencias en los recuentos de plaquetas se analizaron empleando el modelo ANOVA de disposición factorial 2 X 2 de tratamientos, el cual no demostró ninguna significación estadística en las diferencias de recuentos de plaquetas entre las ratas de control y las ratas tratadas con Saratin. Antes de la operación se habían determinado los recuentos de plaquetas y tiempos de sangría de todas las ratas. Seis ratas experimentaron una endarterectomía carotídea y fueron recogidas 3 horas después de la operación con los tiempos de sangría y recuentos de plaquetas medidos, y las seis ratas restantes se recogieron 24 horas después de la operación con los tiempos de sangría y recuentos de plaquetas también medidos. Tres de las ratas de cada grupo de tiempo recibieron Saratin por vía tópica y las tres ratas restantes sirvieron como controles.

Los tiempos de sangría se determinaron por transección de los 2 mm distales del rabo de la rata y sumergiendo aproximadamente 4 cm del rabo en una solución tamponada de fosfato a 37ºC. Se midió la cantidad de tiempo transcurrido desde la transección del rabo hasta el cese de la sangría y el valor obtenido se asignó como el tiempo de sangría. Los recuentos de plaquetas se determinaron extrayendo una muestra de 1-1,5 cc de sangre de la vena yugular interna, la cual fue analizada en un analizador de sangre Coulter STKS, y los resultados fueron expresados x 10^{3}.

Ejemplo 10 Métodos estadísticos

Se anotaron los valores medios \pm errores estándar. Se realizaron análisis de ensayo t sin aparear empleando el programa Stat View (SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) versión 5.0 para comparar los grupos tratados con Saratin y los grupos de control respecto a los números de plaquetas adherentes, porcentaje de estenosis luminal y tiempos de sangría. Se utilizó un análisis Chi-Cuadrado de la razón de verosimilitud para evaluar la razón de disparidad respecto al desarrollo de trombosis dos semanas después de la endarterectomía carotídea. Se utilizó un modelo ANOVA de disposición factorial 2 X 2 de tratamientos, para evaluar las diferencias entre los recuentos de plaquetas pre-operatorios y post-operatorios.

Ejemplo 11 Animales experimentales

Se organizaron ratas Sprague-Dawleyu (350-400 g) en grupos de endarterectomía carotídea en base a dos objetos principales. 1) Evaluación de la adhesión de plaquetas y 2) Evaluación de la estenosis luminal como consecuencia de hiperplasia de la íntima, y tasa de trombosis. Dentro de estos dos objetivos, las ratas de dividieron en animales de control y animales tratados con Saratin. Todas las ratas experimentaron una endarterectomía carotídea (véase más adelante), las ratas tratadas con Saratin recibieron una aplicación tópica de 5 \mul de solución de Saratin en la superficie luminal de la arteria carotídea inmediatamente después de la separación de la capa de íntima/media. El grupo de adhesión de plaquetas consistió en la evaluación por microscopía electrónica a las 3 horas después de la endarterectomía carotídea (n = 17) y a las 24 horas después de la endarterectomía carotídea (n = 19). El grupo de hiperplasia de la íntima (n = 25) se recogió dos semanas después de la endarterectomía carotídea.

Ejemplo 12 Preparación del catéter de hidrogel revestido con saratin

Se activaron las superficies de materiales a base de PA-12 por inmersión de los dispositivos en una solución de 2 moles% de macro-iniciador (poli(anhídrido de ácido octadecen-alt-maleinacético) con un per-éster (11-16 moles%) disuelto en isopropanol y 0,5 moles de dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA)/1 mol de macro-iniciador. Después de secar el revestimiento de macro-iniciador/EGDMA, el revestimiento se recoció durante otros 5-10 minutos a 120ºC, lo cual ayudó a mejorar la fijación del macro-iniciador en la superficie, mejorando así la reticulación.

Para optimizar las condiciones de revestimiento, se utilizaron revestimientos de hidrogel generados en una lámina de soporte de PA-12. Antes del revestimiento, las láminas se habían lavado con isopropanol o acetona y secado.

Para el revestimiento con hidrogel, se habían utilizado Blue Medical Devises GO del tipo de catéter de balón (catéter RX PTCA) consistente en Vestamid (PA-12). Se mezclaron soluciones acuosas de 5 moles% de ácido acrílico 100 ml y 0,2 bis 0,8 moles% de metilen-bis-acrílico, y se emplearon para revestir láminas o catéteres. Después de la polimerización, el dispositivo revestido se lavó con agua y durante otras 24 horas en tampón de PBS.

A continuación, el polímero se recoció en el horno a 60-80ºC durante 0,5-3 horas.

El espesor de los revestimientos de hidrogel secos fue del orden de 1 a 4 \mum, y el hinchamiento del hidrogel en solución acuosa fue del orden de 10 a 50 g de hidrogel húmedo/1 g de hidrogel seco.

Cuando se realizó la inmersión (30 minutos) de una solución de Saratin tamponada con tampón de PBS pH 7,4, se utilizó una concentración de 50 \mug ml.

Se utilizaron disolventes orgánicos para preparar las soluciones de revestimiento a pulverizar sobre un catéter de balón empleando un equipo de revestimiento por aspersión a pequeña escala, estándar, similar al suministrado por EFD.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Efecto del Saratin sobre la unión de vWF humano purificado a colágeno humano tipos I (círculos) y III (cuadrados) y a colágeno de piel de ternero (triángulos). IC_{50} con tipo I = 0,23\pm0,004 \mug ml^{-1}, tipo III = 0,81\pm0,04 \mug ml^{-1} y colágeno de piel de cordero = 0,44\pm0,008 \mug ml^{-1}.

Figura 2. Efecto del esfuerzo cortante sobre la inhibición por Saratin de la formación de agregados de plaquetas sobre colágeno humano de tipo III en una cámara de flujo in vitro. Los círculos indican una velocidad de esfuerzo cortante de 2.700 s^{-1} (IC_{50} = 0,96\pm0,25 \mug ml^{-1}), mientras que los cuadrados indican una velocidad de esfuerzo cortante de 1.300 s^{-1} (IC_{50} = 5,2\pm1,4 \mug ml^{-1}).

Figura 3. Análisis Scatchard de la unión de Saratin a colágeno humano inmovilizado tal como se detecta mediante resonancia de plasmón superficial, indicando la presencia de un sitio de unión de alta afinidad (K_{d} = 5 x 10^{-8} M, línea continua) y de un sitio de unión de baja afinidad (K_{d} = 2 x 10^{-6} M, línea discontinua) para Saratin sobre colágeno III.

Figura 4. Número de plaquetas adheridas a la superficie subendotelial expuesta 3 horas después de la endarterectomía carotídea, comparando grupos de aplicación de Saratin (n = 7) y grupos de control (n = 10). Los datos son valores medios \pmSE. El grupo de Saratin recibió 5 \mul de solución de Saratin aplicada tópicamente a la superficie subendotelial expuesta. Star indica un valor P de 0,05.

Figura 5. Número de plaquetas adheridas a la superficie subendotelial expuesta 24 horas después de la endarterectomía carotídea, comparando los grupos de aplicación de Saratin (n = 9) y los grupos de control (n = 10). Los datos son valores medios \pmSE. Las plaquetas se contaron empleando el microscopio de barrido de electrones. El grupo de Saratin recibió 5 \mul de solución de Saratin aplicada tópicamente a la superficie subendotelial expuesta. Star indica un valor P de 0,01.

Figura 6. Micrografía electrónica (2.000 X) de una arteria carotídea de rata endarterectomizada 3 horas después de la endarterectomía carotídea. A, superficie de control. B, superficie que recibe Saratin tópico (5 \mul). La superficie de control muestra abundantes elementos celulares incluyendo hebras de fibrina, células rojas de la sangre y plaquetas. La superficie tratada con Saratin muestra un notable descenso en elementos celulares.

Figura 7. Micrografía electrónica (2.000 X)) de una arteria carotídea de rata endarterectomizada 24 horas después de la endarterectomía carotídea. A, superficie de control. B, superficie que recibe Saratin tópico (5 \mul). La superficie de control muestra numerosas células rojas de la sangre y plaquetas. La superficie tratada con Saratin muestra un notable descenso en la adhesión de plaquetas.

Figura 8. Porcentaje de estenosis luminal secundaria con respecto a hiperplasia de la íntima dos semanas después de la endarterectomía carotídea. Se muestran el grupo de Saratin (n = 15) y un grupo de control (n = 10). El grupo de Saratin recibió 5 \mul de Saratin aplicado por vía tópica a la superficie subendotelial expuesta. Star indica un valor P de 0,004.

Figura 9. Secciones transversales a través de arterias carotídeas que muestran la reducción de hiperplasia de la íntima en arterias tratadas con Saratin (B) en comparación con la rata de control sin tratar (A). IH = hiperplasia de la íntima.

Tabla 1. Concentraciones IC_{50} de Saratin necesarias para inhibir la adhesión de plaquetas en PRP de varias especies que se unen a colágeno humano de los tipos I y III y colágeno de piel de ternero.

Tabla 2. Efecto de Saratin sobre la agregación máxima de plaquetas (%) en PRP inducida por varios agonistas, indicándose las concentraciones extremas de reactivos.

Tabla 3. Tiempos de sangría y recuentos de plaquetas pre-operatorios y post- operatorios.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

TABLA 3

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Claims (7)

1. Uso del polipéptido Saratin en la preparación de un medicamento para inhibir la acumulación de plaquetas después de daños vasculares o de una endarterectomía, que comprende administrar al tejido vascular una cantidad terapéuticamente eficaz de Saratin que previene la adhesión de plaquetas, inhibiendo con ello la trombosis y la restenosis.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde el daño vascular está asociado con aterosclerosis, vasculopatía de transplante cardiaco, restenosis de la coronaria después de una intervención coronaria, angioplastia de balón, colocación de dilatadores, rotablación, endarterectomía, incluyendo endarterectomía carotídea, derivaciones de injertos de diálisis y otras anastomosis de injertos, angina inestable, infarto de miocardio agudo, ataque de apoplejía, hipertrofia benigna o hipertrofia prostática benigna.

3. Uso según la reivindicación 1, en donde el Saratin se administra localmente por vía de un catéter o en donde el Saratin se incorpora dentro del pavimento endoluminal de un catéter que es dirigido localmente hacia el tejido.

4. Uso según la reivindicación 1, en donde el Saratin se incorpora en un polímero administrado por vía local que permite la liberación sostenida local de Saratin.

5. Uso según la reivindicación 4, en donde el Saratin formulado en polímero se administra localmente por vía de un catéter.

6. Uso según la reivindicación 1, en donde el Saratin se incorpora en un dilatador o en el revestimiento de un dilatador que se coloca localmente en o sobre el tejido.

7. Uso según la reivindicación 1, en donde el Saratin se incorpora en un injerto endovascular o en un revestimiento de injerto endovascular que se coloca localmente en o sobre el tejido.