ES2235013T3

ES2235013T3 - Construccion dirigida de orientacion de plasmidos.

Info

Publication number: ES2235013T3
Application number: ES02711193T
Authority: ES
Inventors: Yitzhak Ben-Asouli; Farhat Osman
Original assignee: Gene Bio Application Ltd
Current assignee: Gene Bio Application Ltd
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2002-02-11
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2022-02-11
Also published as: US20040209272A1; EP1362101B1; WO2002064774A2; US7279278B2; ATE284441T1; IL141392A0; EP1362101A2; WO2002064774A3; DE60202196D1; DE60202196T2

Abstract

Un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción comprende al menos dos segmentos de ácidos nucleicos de interés, comprendiendo dicho método las etapas de: a. proporcionar productos que tienen extremos ramos fosforilados obtenidos de dichos segmentos de ácidos nucleicos de interés; b. realizar reacciones de ligamiento por separado, donde en cada reacción los productos de extremos romos fosforilados de dos segmentos diferentes obtenidos en la etapa (a) se ligan para crear una secuencia ligada combinada; c. realizar una reacción de amplificación por PCR usando dicha secuencia ligada combinada obtenida en la etapa (b) como molde y cebadores de enriquecimiento específico dirigiendo dicha amplificación de PCR hacia la orientación deseada, donde cada secuencia ligada combinada se amplifica en una reacción por separado creando un producto combinado que tiene extremos romos fosforilados; d. aislar y purificar dicho producto combinado que tiene la orientación deseada enriquecida obtenida en la etapa (c); e. opcionalmente, la repetición cíclica de las etapas (b) a (d) para una cantidad deseada de veces, para crear un producto combinado aislado que tiene la orientación deseada; y f. realizar el autoligamiento de dicho producto combinado purificado aislado obtenido en la etapa (e), creando una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa.

Description

Construcción dirigida de orientación de plásmidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende al menos dos segmentos de ácido nucleico de interés. Más particularmente, la presente invención proporciona un método rápido y versátil para la clonación eficaz de construcciones por PCR de enriquecimiento de la orientación deseada.

Antecedentes de la invención

Los vectores genéticos son una de las herramientas básicas más importantes para la investigación en todo el mundo en los campos de la medicina, biología y biotecnología. Casi todos los estudios en estos campos requieren el uso de vectores genéticos. Dichos vectores genéticos no sólo son necesarios en investigación; por ejemplo, en medicina, los vectores genéticos son un medio para emprender terapia genética de enfermedades con un antecedente genético. Este campo prometedor está a la vanguardia de las últimas novedades médicas, cuando se han determinado finalmente las secuencias del genoma humano, disponiendo de una increíble cantidad de información de nuevos genes útiles para la reparación genética para todos los investigadores en el mundo. Además, los biotecnólogos usan vectores genéticos para la introducción de genes en diversos organismos para producir grandes cantidades de la proteína expresada por estos genes. La agricultura también hace uso de vectores genéticos, principalmente para producir plantas transgénicas de rendimiento mejorado o resistencia mejorada tanto a plagas como pesticidas y para la extensión de la vida media de los productos agrícolas.

Los vectores genéticos son lanzaderas que contienen una secuencia de ADN que codifica información genética, expresada in vivo en organismos tales como bacterias, levaduras, agregados celulares y animales transgénicos, o sistemas in vitro. Los vectores genéticos son en la mayoría de los casos segmentos de ADN circular conocidos como plásmidos, que contienen información genética, pero también hay otros vectores genéticos tales como virus y transposones adaptados para el propósito. La información que llevan los vectores está adaptada a su objetivo biológico y al ambiente biológico en el que el vector se introduce. Un vector genético puede contener segmentos genéticos de diferentes fuentes. Por ejemplo, una secuencia de un gen que codifica una proteína de mamífero puede insertarse en secuencias bacterianas para formar un vector genético que expresa la proteína humana en bacterias, de modo que cultivando las bacterias se podrían obtener grandes cantidades de esa proteína humana.

La técnica anterior

La construcción de vectores implica una diversidad de métodos de tecnología de ADN recombinante basados en digerir y religar fragmentos de ADN. La inserción en nuevos genes en fragmentos de ADN diana, es uno de los usos más ampliamente conocidos para la tecnología de ADN recombinante. Este procedimiento incluye la digestión del fragmento diana (que comprende la secuencia del vector) con una enzima de restricción. De manera similar, el ADN de inserción, que lleva el gen de interés, se digiere con la misma enzima o con una enzima apropiada que deja el mismo saliente 3' o 5'. En un tipo de digestión con enzimas de restricción, la escisión tanto del ADN diana como del ADN de inserción deja fragmentos de nucleótidos 3' o 5' solapantes en cada extremo. Estos fragmentos solapantes o "extremos adhesivos" son propiedades bien conocidas de algunas enzimas de restricción.

Están disponibles métodos adicionales de clonación de fragmentos de ADN directamente en secuencias de ADN diana, como el método descrito por Mead et al. [Bio/Technology 9:657 (1991)]. Este método está basado en la capacidad de la Taq polimerasa de añadir de manera inherente desoxiadenosina (dATP) al extremo 3' de algunas moléculas dúplex recién sintetizadas descrito por Clark, J.M. [Nucleic Acids Research 20:9677 (1988)]. Estos salientes de una adenosina forman pares de bases con los salientes de timidita 3' (dTTP) en el sitio de inserción de un vector diseñado específicamente. Se ha descubierto que incluso un único par de bases es suficiente para enlazar con hidrógeno dos secuencias de nucleótidos entre sí.

En otro método más de inserción de un fragmento de nucleótidos en un ADN diana, conocido como ligamiento de extremo romo, los fragmentos a ligar se digieren usando enzimas de restricción que no dejan ningún nucleótido que saliente en 3' o 5' en el sitio de corte y empalme de la enzima. Estas enzimas son conocidas como enzimas "de extremo romo" debido a esta característica de su actividad enzimática. Después de la digestión, las enzimas de restricción de extremo romo mantienen fosfatos "terminales" 5' solos en ambos lados del sitio de restricción. Estos fosfatos 5' terminales se requieren por la ADN ligasa para cualquier religación posterior de la secuencia de ADN digerida.

Ninguno de los métodos mencionados anteriormente permite a un investigador elegir y potenciar una orientación específica para el segmento del inserto. Esto presenta una desventaja distinta en que el ADN de inserción puede posicionarse por sí mismo en cualquiera de las dos orientaciones 5' o 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos diana.

En la mayoría de los procedimientos la orientación del inserto es crítica, por ejemplo, el ligamiento de una secuencia promotora a un gen heterólogo para obtener posteriormente la expresión génica o producir genes o proteínas quiméricos, requieren el ligamiento en la orientación correcta.

Además, muchos de los vectores se auto-ligarán, sin el inserto, en caso de que no se proporcione dirección para el inserto. Además, hasta el 50% de los genes de media, cuando se inserta en vectores diferentes, se ligarán en la orientación incorrecta. Esto reduce drásticamente la eficacia experimental global. Por esta razón, se han ideado muchos métodos para la clonación de manera preferente de fragmentos de ADN de inserción en secuencias diana en una orientación preferida. Estos métodos se conocen habitualmente como técnicas de clonación direccional.

La clonación direccional inicialmente se realiza habitualmente digiriendo las secuencias de nucleótidos diana con dos enzimas de restricción diferentes, dando como resultado moléculas que tienen extremos de ADN distintos en el sitio de inserción diana. El ADN de inserto también se digiere usando las dos mismas enzimas de restricción, produciendo por tanto dos extremos de ADN distintos que corresponden a una orientación específica en el sitio de inserción diana. Siguiendo este procedimiento, el ADN de inserción podría sólo unirse a la secuencia diana en la orientación deseada.

Aunque este método se ha usado ampliamente en la técnica, tiene desventajas. Por ejemplo, digerir tanto el ADN diana como el ADN de inserción con enzimas de restricción múltiples consume mucho tiempo. Además, las digestiones con enzimas múltiples aumentan el riesgo de que la secuencia de ADN diana o de inserción se escinda en un sitio de restricción interno de un modo específico, o inespecífico (actividad estrella) o de manera alternativa, no se escindiría en absoluto. Los problemas asociados con la digestión de los extremos de las cadenas de ADN, también caracterizan los métodos basados en la digestión, tales como los que requieren que se corte la secuencia de inserto. Además, la digestión que usa dos endonucleasas de restricción diferentes, requiere cambio apropiada de la secuencia de ADN. Además, el uso de enzimas de restricción en el diseño de vectores es un factor limitante en la inserción de secuencias que puede afectar a la flexibilidad de la construcción deseada.

Muchos investigadores han intentado mejorar los métodos en relación con la clonación direccional de fragmentos de ADN, como se ha detallado anteriormente. Uno de los procedimientos más ampliamente usados implica el ligamiento direccional en relación con la subclonación de fragmentos de ADN que se han amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El método más habitual para clonación de productos de PCR implica la incorporación de sitios de restricción flanqueantes en los extremos de las moléculas cebadoras. Se realiza la ciclación de PCR y después se purifica el ADN amplificado, se restringe con una endonucleasa o endonucleasas apropiadas y se liga a una preparación de vector compatible. De este modo, los métodos de clonación de PCR típicos requieren la preparación de moléculas cebadoras de PCR acopladas a secuencias base para "añadir" que tienen una secuencia de reconocimiento de restricción preferida. También, estos métodos pueden dar como resultado una restricción interna no pretendida de secuencias no caracterizadas o polimórficas. Dichas limitaciones de los métodos previos aumentan el coste y la complejidad de la clonación de productos de PCR de manera rutinaria.

Además, este protocolo tiene los mismos inconvenientes que el método de digestión doble mencionado anteriormente. Además, los cebadores de PCR tienen más bases para acomodar el sitio de restricción que da como resultado un coste añadido para los cebadores de PCR. Por consiguiente, este método está limitado por la escisión a menudo ineficaz de los sitios de escisión de endonucleasas de restricción cerca de un extremo de un ácido nucleico de doble cadena.

Otro método de clonación direccional de un inserto en una secuencia diana usa la Exonucleasa III [Kaluz, et al., Nucleic Acids Research, 20(16):4369-4370 (1992)] para crear los "extremos adhesivos". En el método descrito por Kaluz et al., los fragmentos de ADN de inserción se digerían con la Exonucleasa III. La cantidad de nucleótidos que digiere la Exonucleasa III a partir del extremo 3' del ADN por minuto es bien conocida. Después de un tiempo de digestión, los fragmentos de inserción se dejan con colas de nucleótidos que solapan en 5'. Estas colas se diseñan de modo que los extremos 5' sólo puedan hibridar en una orientación sobre el apareamiento de bases de la molécula de ADN plasmídica diana.

No obstante, el método de la Exonucleasa III es específicamente dependiente del tiempo y la enzima continua digiriendo el ADN mientras se incube la reacción. Por esta razón, la Exonucleasa III podría digerir potencialmente a través de los nucleótidos del extremo y en la región codificante de la secuencia de ADN de inserción, provocando un resultado experimental no deseado.

En otro método más, la producción de extremos adhesivos se realiza usando la actividad exonucleasa 3' de la ADN polimerasa T4 [Kuijper, J.L., et al. Gene 112: 147-155 (1992)], un método adicional de PCR de clonación direccional que genera fragmentos en una secuencia de ADN diana basada en la incorporación de uracilo en los cebadores de PCR, seguido por tratamiento con uracil-N-glicosilasa [Nisson, P.C., et al., PCR Methods and Applications 1:120-123 (1991)].

Se describe otro ejemplo en la Patente de Estados Unidos Nº 5.523.221, referida a un método para la clonación direccional de una secuencia de ADN de inserción en una secuencia de ADN diana. Este método incluye generar una secuencia de ADN diana monofosforilada y una secuencia de ADN de inserción monofosforilada, seguido por combinación de la secuencia de ADN de inserción, preferiblemente con ADN ligasa, con la secuencia diana. De este modo, la secuencia de inserción puede sólo ligarse en una orientación con respecto a la secuencia diana. Preferiblemente, la secuencia de ADN diana es un plásmido. Este método usa la fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP) para producir ADN diana monofosfato. El método tiene varias desventajas, el uso de ADN diana monofosforilado y ADN de inserción reduce de manera significativa la eficacia de ligamiento y requiere digestión con enzimas de restricción múltiples.

Todos los métodos de clonación direccional anteriores requieren digestión con enzimas de restricción múltiples, adición de nucleótidos adicionales al inserto, o son caros y consumen mucho tiempo. Por estas razones, existe una necesidad de un método simple, eficaz, rápido y barato de clonación direccional de un fragmento de ADN en su secuencia diana.

Para resolver la complejidad mencionada anteriormente de la implicación de las endonucleasas, se ha usado la tecnología de PCR para diseñar genes híbridos (quiméricos) sin la necesidad de usar enzimas de restricción para segmentar el gen antes de la formación del híbrido. En este enfoque, los fragmentos de los genes diferentes que se pretende que formen el híbrido se genera en reacciones en cadena de la polimerasa por separado. Los cebadores usados en estas reacciones por separado se diseñan de modo que los extremos de los productos diferentes de las reacciones por separado contienen secuencias complementarias. Cuando estos productos de PCR producidos de manera separada se mezclan, desnaturalizan y rehibridan, las cadenas que tienen secuencias que coinciden en sus extremos 3' solapan, y funcionan como cebadores entre sí. La extensión de este solapamiento por la ADN polimerasa produce una molécula en la que las secuencias originales se cortan y empalman entre sí para formar el gen híbrido. De este modo, este método requiere cebadores específicos cada vez que se desea construir una molécula quimérica que contiene los mismos fragmentos en diferente localización u orientación. Además, no permite un medio sencillo para generar secuencias de ADN repetidas invertidas o directamente [Horton, et al., Gene 77:61-68 (1989)].

Globalmente, los métodos habituales usados para la construcción de vectores genéticos implican procesos multietapa que consumen mucho tiempo. De media, el tiempo requerido para introducir un inserto genético en un plásmido existente es más de 3 días. Cuando se requiere ensamblar un vector genético de varios segmentos genéticos diferentes, su construcción puede llevar varias semanas y más. Además, cuando debe incorporarse un segmento genético en una secuencia en una orientación definida, la complejidad del proceso aumenta y los productos requieren un tiempo de exploración más largo.

Se informó de la subclonación libre de ligasa como un método de subclonación rápida [Shuldiner A., et al., Nucleic Acid Research, 18:1920 (1990) y Analytical Biochemistry 194:9-15 (1991)]. Este procedimiento se realiza incorporando en los cebadores de PCR secuencias en los extremos 5' que dan como resultado un producto de PCR cuyos extremos 3' son complementarios a los extremos 3' del plásmido receptor linealizado. El producto PCR y el plásmido se cortan y empalman entre sí en una segunda reacción de PCR en la que la Taq polimerasa extiende los extremos 3' solapantes complementarios. Sin embargo, este método también tiene varias desventajas en comparación con el método de la presente invención. Los cebadores diseñados para el método libre de ligasa deben comprender secuencias complementarias a ambos segmentos de interés, y por lo tanto estos cebadores son bastantes largos (aproximadamente 50 nucleótidos), caros y tienen un potencial aumentado de hibridación no específica con el molde, mientras que los cebadores diseñados por el presente método deben tener la longitud mínima que permite la hibridación específica con el molde. Además, los segmentos así como los cebadores preparados por la presente invención pueden usarse para la construcción de diferentes construcciones. Por ejemplo, un segmento que comprende un origen de replicación y un marcador de selección, o incluso un cierto gen informador, puede ligarse a diferentes segmentos de interés en diferentes construcciones. Estos productos combinados pueden enriquecerse para la orientación deseada usando los mismos cebadores, mientras que el método libre de ligasa de Shuldiner et al., está limitado a la dirección específica y combinación de los segmentos. Por lo tanto, cualquier construcción diferente requerirá la producción de productos diferentes y síntesis de diferentes cebadores, mientras que la presente invención es mucho más versátil y económica. Otras desventajas del método libre de ligasa de Shuldiner et al., son la necesidad de optimización extensiva del número de ciclos de PCR de la PCR de segunda fase, la temperatura a la que el heterólogo rehibrida y la ciclación, la concentración del NaCl. De un modo más importante, la eficacia informadora del método Shulinder et al., es aproximadamente del 50% del número total de colonias, mientras que la eficacia del método de la presente invención es aproximadamente del 95%. Además, la subclonación exitosa con el método de Shulinder et al., se ha conseguido para productos de PCR de una longitud de 1,7 kb. Y finalmente, dos de los cebadores usados por método de Shulinder et al., son complementarios en sus extremos 3' a la secuencia diana y en sus extremos 5' al plásmido. De este modo, para insertar el mismo fragmento en dos plásmidos diferentes se requieren aproximadamente ocho cebadores, mientras que se necesitan sólo seis cebadores para el método OER de la
invención.

La presente invención está basada en el desarrollo de un método rápido diseñado para acortar y facilitar el proceso de construcción de vectores genéticos y racionalizar este proceso, proporcionando vectores genéticos alineados con sus secuencias en la orientación apropiada, sin necesidad de exploración extensiva. El proceso central realizado en el método de la invención se denomina como Reacción de Enriquecimiento de la Orientación (OER). En este proceso hay enriquecimiento en cada ciclo, que enriquece con respecto a los vectores que contienen segmentos genéticos alineados en la dirección apropiada, de modo de que se obtenga al final del proceso un vector genético, en el que todos los segmentos estén alineados apropiadamente. Cada ciclo se hace de una fase de la reacción en cadena de la polimerasa, seguido por una limpieza del producto y después de una fase de ligamento de segmento. De acuerdo con el método de la invención, puede ligarse una cantidad no limitada de segmentos de ADN entre sí por la que el tamaño del segmento final obtenido sólo es el de restricción.

El método de la invención acorta de manera significativa el tiempo necesario para construir un vector genético, volviendo la construcción de los vectores genéticos muy fácil y más versátil. De media, pueden ligarse ocho segmentos genéticos entre sí durante una noche. Cuando se examina la direccionalidad de los vectores genéticos, aproximadamente el 95% de ellos parecen contener la secuencia requerida con la orientación apropiada.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende al menos dos segmentos de ácidos nucleicos de interés, que comprende las etapas de:

a. proporcionar productos que tienen extremos romos fosforilados, estando estos productos obtenidos de los segmentos de ácidos nucleicos de interés a combinar en la construcción;

b. realizar reacciones de ligamiento por separado, donde en cada reacción los productos de extremos romos fosforilados de dos segmentos diferentes obtenidos en la etapa (a) se ligan, dando como resultado de este ligamiento una secuencia ligada combinada, que comprende dos segmentos de interés acoplados entre sí;

c. realizar una reacción de PCR usando dicha secuencia ligada combinada obtenida en la etapa (b) como molde y cebadores de enriquecimiento específicos que dirigen dicha amplificación por PCR hacia la orientación deseada, estando cada secuencia ligada combinada amplificada por PCR en una reacción por separado para crear un producto combinado que tiene extremos romos fosforilados;

d. aislar y purificar el producto combinado obtenido en la etapa (c), teniendo este producto combinado la orientación deseada enriquecida;

e. opcionalmente, repetir de manera cíclica las etapas (b) a (d) para una cantidad deseada de veces, para combinar todos los segmentos de interés, estando dicha repetición cíclica de ligamiento de productos seguida por PCR de enriquecimiento de orientación, y permitiendo la combinación de todos los segmentos de interés para crear el producto combinado aislado final que tiene todos los segmentos alineados en la orientación deseada; y

f. realizar la autoligamiento del producto combinado purificado aislado final obtenido en la etapa (d) o (e), creando una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene todos los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa entre sí.

En una realización específica, se pretende el método de la invención para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende al menos dos segmentos. Uno de los segmentos de interés comprende un segmento replicable y en algunas realizaciones este segmento también puede contener secuencias que codifican un marcador de selección. Como alternativa, cualquier otro segmento de interés puede comprender las secuencias que codifican un marcador de selección.

El segmento replicable contenido en uno de los segmentos de interés comprende una secuencia de origen de replicación (ori).

De acuerdo con una realización específica de la presente invención, el segmento replicable puede obtenerse de un vector replicable seleccionado entre el grupo compuesto por vectores retrovirales, vectores de fagos, vectores plasmídicos, vectores de expresión, vectores autorreplicantes, elementos de transposición, vectores fagémidos y vectores YAC.

De acuerdo con una realización específicamente preferida, los productos de extremos romos fosforilados de la etapa (a) del método de la invención pueden obtenerse por diferentes procedimientos, por ejemplo:

(i) realizando una primera serie de amplificación por PCR usando dichos segmentos como molde, para crear productos que tiene extremos romos fosforilados, estando cada segmento amplificado en una reacción por separado, usando cebadores específicos; o

(ii) creando productos de extremos romos por escisión de los segmentos de ácidos nucleicos de interés por una endonucleasa de extremos romos; o

(iii) creando productos con extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos, seguido por reacción de relleno; o

(iv) crea productos de extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos, seguido por reacción con la ADN endonucleasa de cadena simple, degradando las extensiones de cadena simple de los extremos de ADN.

En el caso de que los productos de extremos romos se obtengan por reacción de PCR, debe realizarse una reacción de fosforilación. Puede realizarse una reacción de fosforilación empleando la polinucleótido quinasa T4 en los productos de PCR de extremos romos o preferiblemente, en los cebadores usados para la reacción de PCR.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende más de dos segmentos de ácidos nucleicos. De manera similar a las etapas implicadas en la combinación de dos segmentos, la combinación de más de dos segmentos implica la repetición cíclica de las etapas (a) a (b) del método de la invención, para crear productos combinados aislados que tienen la orientación deseada. Estos productos combinados se ligan después para crear una secuencia ligada combinada. En cada reacción de ligamiento sólo dos de los productos combinados, obtenidos en la repetición cíclica de las etapas del método, se ligan. La siguiente etapa implica reacción de PCR usando dicha secuencia ligada como molde y cebadores de enriquecimiento específico que dirigen esta amplificación por PCR hacia la orientación deseada. Los productos combinados obtenidos, que tienen la orientación deseada, después se aíslan y se purifican.

Las etapas mencionadas anteriormente en este documento pueden repetirse cíclicamente para una cantidad de veces deseada para crear un producto combinado que contiene todos los segmentos de interés alineados en la orientación deseada para crear un producto combinado final. La etapa final es el autoligamiento del producto combinado final aislado, para la creación de una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene todos los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa entre sí.

De acuerdo con otra realización preferida, el método de la invención emplea como cebadores específicos para la primera serie de reacciones de amplificación por PCR, un cebador 5' que comprende una secuencia obtenida del extremo 5' de un segmento de interés (cebador con sentido) y un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremo 3' del segmento específico a amplificar (cebadores antisentido).

Además, los cebadores de enriquecimiento específico empleados en la amplificación de las secuencias ligadas combinadas de acuerdo con el método de la invención, pueden ser: un cebador 5' que comprende una secuencia obtenida del extremo 5' del primer segmento, que está cadena arriba del segundo segmento ligado en el producto ligado combinado (cebador con sentido) y un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremo 3' del segundo segmento ligado (cebador antisentido), de la secuencia ligada combinada.

Otra realización preferida se refiere a los cebadores usados en el método de la invención. Cada uno de dichos cebadores puede comprender de aproximadamente 4 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, cada uno de los cebadores comprende de 5 a aproximadamente 50, y mucho más preferiblemente, dichos cebadores comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

Realizaciones específicamente preferidas de la presente invención se refieren a las enzimas empleadas para el método de la invención. Por ejemplo, la reacción de ligamiento puede realizarse empleando ADN ligasa y la amplificación por PCR puede realizarse empleando una ADN polimerasa de alta fidelidad.

De acuerdo con una realización específica, se pretende el método de la invención para construir una construcción que comprende al menos dos segmentos de interés. Dichos segmentos pueden ser los siguientes: uno de dichos segmentos de interés comprende una secuencia de origen de replicación (ori) y opcionalmente una secuencia que codifica un marcador de selección; al menos un segmento adicional que comprende un ácido nucleico codificante heterólogo u homólogo, o mutaciones, fragmentos o derivados del mismo y opcionalmente un marcador de selección; y opcionalmente, al menos un segmento adicional que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican elementos de expresión, control, promotores y/o reguladores.

Las secuencias codificantes heterólogas u homólogas de interés pueden codificar una proteína seleccionada entre el grupo compuesto por proteínas informadoras, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, proteínas estructurales y proteínas de aplicación industrial, o es por sí misma un producto terapéutico. De acuerdo con otra realización específica, las secuencias codificantes heterólogas pueden codificar una proteína informadora seleccionada entre el grupo compuesto por la proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa, fosfatasa alcalina secretada (SEAP) y \beta-galactosidasa (\beta-gal).

Las construcciones que contienen una secuencia codificante heteróloga u homóloga puede ser, de acuerdo con una realización específica de la invención, vehículos de expresión.

De acuerdo con una realización preferida, el método de la invención puede realizarse manualmente.

De acuerdo con otra realización preferida, el método de la invención puede realizarse automáticamente.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1

Ilustración esquemática del método OER

El ligamiento de dos productos de PCR (fragmentos I y II), realizada usando una ligasa, produjo cuatro posibles orientaciones diferentes (A, B, C, D). El enriquecimiento para la orientación deseada se realizó por reacción de PCR usando cebadores específicos. El cebador 5' es un cebador con sentido obtenido del extremo 5' del segmento cadena arriba y el cebador 3' es un cebador antisentido obtenido del extremo 3' del segmento cadena abajo. Abreviaturas: OER (reacción de enriquecimiento de orientación), frag. (fragmento), Lig. (ligamiento).

Figuras 2A-2C

Construcción de la construcción que tienen las cuatro posibles orientaciones usando el método OER

2A PCR de dos segmentos de ADN, 1: PCR del primer segmento usando los cebadores 335 y 336 (SEQ ID Nº: 7 y 8, respectivamente) para generar un segmento de ADN de un tamaño de 630 nucleótidos; 2: PCR del segundo segmento usando los cebadores 826 y 827 (SEQ ID Nº: 9 y 10, respectivamente) para generar un segmento de un tamaño de 500 nucleótidos; M: marcador de ADN de \lambda/BstE II.

2B PCR para los productos de ligamiento de dos segmentos de ADN que han experimentado PCR en A, 1-4: PCR para los productos de corte y empalme de los dos segmentos con las cuatro posibles orientaciones (335-826, 335-827, 336-826, 336-827, respectivamente); un segmento de un tamaño de 1130 se obtiene por unión de los dos segmentos previos; M: marcador de ADN de \lambda/BstE II.

2C Análisis de la orientación de los segmentos insertados usando enzimas de restricción. Escisión de los productos de PCR usando la enzima de restricción PvuII; la Figura muestra que se obtiene un patrón de escisión diferente para las cuatro orientaciones diferentes; M: marcador de ADN.

Figuras 3A-3C

Construcción de la construcción pcDNAPKRwt usando el método OER

3A Parte superior: ilustración esquemática que muestra la preparación del primer segmento usando los cebadores 2037 y 2038 (SEQ ID Nº:1 y 2, respectivamente) y la preparación del segundo segmento usando los cebadores 546 y 547 (SEQ ID Nº: 3 y 4, respectivamente). Parte inferior: gel de agarosa que muestra los productos de PCR de la primera reacción de amplificación creando el primer y el segundo segmento (2746 pb y 1657 pb, respectivamente).

3B Parte superior: ilustración esquemática que muestra la creación del tercer segmento ligando los segmentos 1 y 2 y enriqueciendo la orientación deseada realizando PCR usando los cebadores 2037 y 547 (SEQ ID Nº: 1 y 4, respectivamente). Parte inferior: gel de agarosa que muestra los productos de PCR del tercer segmento (4403 pb), que es el producto combinado del primer y del segundo producto.

3C Parte superior: análisis de la minipreparación de PKR wt de las colonias. Parte inferior: ilustración que muestra un mapa esquemático del plásmido final resultante.

Abreviaturas: phos. (fosforilado), Hum. (humano), c. (célula), lib. (biblioteca), prim. (cebadores), Amp (ampicilina), ori (origen de replicación), S-lig. (autoligamiento), dig. (digestión).

Figuras. 4A-4B

Construcción de la construcción pcDNA-PKR\Delta6 usando el método OER

4A Parte superior: ilustración esquemática que muestra la creación de un segmento que contiene la mutación de deleción. El segmento se preparó realizando PCR usando los cebadores 548 y 549 (SEQ ID Nº: 5 y 6, respectivamente) y el plásmido pcDNAPKRwt (que se creó anteriormente) como molde. Se muestra el producto de PKR\Delta6. Parte inferior: gel de agarosa que muestra el producto de PCR del segmento final (4385 pb) que contiene la deleción de 18 ácidos nucleicos.

4B Parte superior: gel de agarosa que muestra los productos de digestión del plásmido PKR\Delta6 obtenido después de la minipreparación. Parte inferior: ilustración que muestra un mapa esquemático del plásmido final resultante. Abreviaturas: phos. (fosforilado), prim. (cebadores), Amp (ampicilina), ori (origen de replicación), S-lig. (autoligamiento), dig. (digestión), del. (deleción), pb (pares de bases).

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Figuras. 5A-5E

Ilustración esquemática del uso del método OER en la construcción de dos construcciones diferentes a partir del mismo molde

5A Los plásmidos pGFP-LacP-LacZ y pLacZ-LacP-GFP, que ambos llevan el promotor inducido por IPTG (LacP) se construyeron usando un molde único en dos orientaciones diferentes, por el método OER de la invención.

5B Inserción del promotor LacP y enriquecimiento de la orientación I, da como resultado la expresión de LacZ.

5C Inserción del promotor LacP y enriquecimiento de la orientación II, que da como resultado la expresión de GFP.

5D Aproximadamente el 95% de las bacterias transformadas con la construcción pGFP-LacP-LacZ, producidos por enriquecimiento de la orientación I, dieron como resultado colonias que manifiestan un color azul.

5E Aproximadamente el 95% de las bacterias transformadas con la construcción pLacZ-LacP-GFP, producidos por enriquecimiento de la orientación II, dieron como resultado colonias que manifiestan una señal fluorescente verde en luz U.V.

Abreviaturas: Orien. (orientación), LacP (promotor inducido por IPTG), GFP (proteína fluorescente verde), LacZ (gen de \beta-galactosidasa), Amp (ampicilina), Ori (origen de replicación), bl. (Azul), gr. (verde).

Descripción detallada de la invención

La mayoría de las técnicas de clonación de secuencias de ácidos nucleicos implican el uso de PCR. Estos métodos permiten una clonación fácil de cualquier secuencia de ácidos nucleicos flanqueada por secuencias conocidas, diseñando cebadores que contienen secuencias de escisión de endonucleasas de restricción. Después de la amplificación, el producto de PCR de doble cadena puede digerirse con la correspondiente endonucleasa para obtener pequeñas secuencias salientes características 5' o 3' de las endonucleasas. Los productos de PRC están preparados para clonarse en un vector dirigido con la misma endonucleasa. Sin embargo, estos métodos están limitados por la escisión a menudo ineficaz de los sitios de escisión de endonucleasa de restricción cerca de un extremo de un ácido nucleico de doble cadena. Además, es bien conocido para los especialistas en la técnica que los clones recombinantes con ADN de unión (que contiene una diversidad de sitios de restricción) reduce las eficacias de transfección de E. coli. El método de clonación de la presente invención es ventajoso, ya que no implica el uso de encimas de restricción y por lo tanto, no requiere la inserción de ADN de unión. Por esta razón, las eficacias de transfección de los clones producidos por el método de la presente invención son superiores que los producidos por otras técnicas que requieren el uso de ADN de unión.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende al menos dos segmentos de ácidos nucleicos de interés. En una primera etapa, se proporcionan productos que tienen extremos romos fosforilados. Estos productos se obtienen de los segmentos de ácidos nucleicos de interés que se pretenden combinar en la construcción final. Los segmentos de extremos romos fosforilados pueden obtenerse usando una diversidad de procedimientos como se describirá en este documento a continuación. En una siguiente etapa, se realizan reacciones de ligamento por separado para combinar dos segmentos de interés. En cada reacción, se ligan los productos de extremos romos fosforilados de dos segmentos diferentes obtenidos en la primera etapa. Este ligamiento crea una secuencia ligada combinada, que comprende dos segmentos de interés acoplados entre sí. Como se muestra en el ejemplo ilustrativo en la Figura 1 y en experimento presentado en la Figura 2 (véase Ejemplo 1), el ligamiento de dos segmentos de doble cadena puede dar como resultado productos que tienen cuatro posibles orientaciones diferentes. La siguiente etapa por lo tanto, podría enriquecer la orientación deseada en la población del producto resultante, que puede conseguirse realizando una reacción de PCR usando la secuencia ligada obtenida en la segunda etapa del método de la invención como molde y cebadores de enriquecimiento específico dirigiendo la amplificación de PCR hacia la orientación deseada. Cada secuencia ligada combinada se amplifica por PCR en una reacción por separado, para crear un producto combinado que tiene la orientación deseada así como extremos romos fosforilados. En una cuarta etapa, se asila y purifica el producto combinado obtenido en la tercera etapa. Este producto combinado tiene la orientación deseada enriquecida. Si se desea, la construcción se compone de más de dos segmentos, de la segunda a la cuarta etapa pueden repetirse cíclicamente para cualquier cantidad de veces deseada, para combinar todos los segmentos de interés. La cantidad de veces de repetición de estas etapas depende de la cantidad de segmentos a ligar. La repetición cíclica del ligamiento de los productos seguido por PCR de enriquecimiento de orientación, puede posibilitar la combinación de todos los segmentos de interés para crear el producto combinado asilado final que tiene todos los segmentos alineados a la orientación deseada. La etapa final es realizar el autoligamiento del producto combinado purificado asilado final lineal obtenido en la etapa de formación, creando una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene todos los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa entre si. Se aprecia que en el caso de que se desee un producto lineal, no hay necesidad de dicha etapa de autoligamiento.

Como se usa en este documento, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, donde sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). Los términos también deben entenderse que incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos, y, aplicables a la realización a describir, polinucleótidos de cadena simple (tales como con sentido o antisentido) y de doble cadena. El término ADN usado en este documento también incluye ADNc, es decir, ADN complementario o copia producido a partir de un molde de ARN por la acción de la transcriptasa reversa (polimerasa de ADN dependiente de ARN).

La expresión "unido de manera operativa" se usa en este documento para indicar que la primera secuencia de ácidos nucleicos está unida de manera operativa con una segunda secuencia de ácido nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos está colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está unido de manera operativa a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, donde es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, en la misma pauta de lectura.

Como se usa en este documento "PCR" (reacción en cadena de la polimerasa) se refiere a un proceso para amplificar una o mas secuencias de ácidos nucleicos específicas por ciclos repetidos de síntesis y desnaturalización en "condiciones de amplificación" apropiadas.

Una PCR requiere dos cebadores que son capaces de hibridar con una cadena simple de una secuencia de ácido nucleico diana de doble cadena que es para amplificar en "condiciones de hibridación" apropiadas. En PCR, esta secuencia diana de doble cadena se desnaturaliza y se hibrida un cebador a cada cadena simple de la diana desnaturalizada. Los cebadores se hibridan con el ácido nucleico de los sitios separados (cadena abajo o cadena arriba) a partir de otro y en orientaciones de modo que el producto de extensión de un cebador, cuando se separa de su complementario, puede hibridar con el producto de extensión generado a partir de otro cebador y cadena diana. Una vez hibrida un cebador dado con la secuencia diana, el cebador se extiende por la acción de un ADN polimerasa. Se utiliza generalmente la ADN polimerasa que es estable al calor de modo que no se necesita añadir nueva polimerasa después de cada etapa de desnaturalización. Dicha ADN polimerasa termoestable sería conocida por una especialista en la técnica, por ejemplo, puede ser Taq polimerasa. El producto de extensión después se desnaturaliza a partir de la secuencia diana, y se repite el proceso. Un método particular para minimizar los efectos de contaminación cruzada de amplificación de ácidos nucleicos se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.035.996, incorporada en este documento como referencia. La Patente de Estados Unidos Nº 5.494.810 para Barany et al, titulada "Polymerase chain reaction (PCR)", incorporada en este documento como referencia, se refiere a un proceso patentado (descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202 y 4.683.195) para la amplificación exponencial de un fragmento de ADN utilizando dos cebadores oligonucleotídicos que hibridan con cadenas opuestas y flanquean la región de interés en un ADN diana. La Patente de Estados Unidos Nº 4.459.359, también se incorpora como referencia, y describe ensayos de PCR.

Como se usa en este documento "condiciones de amplificación" son las condiciones en las que una molécula de ácido nucleico puede hibridar con dos cebadores oligonucleotídicos que tienen alguna homología con la molécula de ácido nucleico, y a través de la extensión del cebador, replican la molécula de ácido nucleico haciendo una molécula de ácido nucleico de cadena simple en una molécula de ácido nucleico de doble cadena por medio de la extensión del cebador. Esto es elongación. Las dos cadenas después se funden por separado aumentando la temperatura y las cadenas simples están otra vez disponibles para hibridar con un cebador oligonucleotídico de cadena simple. Dichas condiciones son bien conocidas por un especialista en la técnica y se describen con más detalle para ciertas moléculas de ácido nucleico a continuación en este documento.

Como se usa en este documento, "condiciones de hibridación" incluye temperaturas, concentraciones salinas, secuencias cebadoras, secuencias de ácidos nucleicos, concentraciones de disolvente que permiten que dos moléculas de ácido nucleico de cadena simple formen pares de bases mediante enlaces de hidrógeno como se describe por Watson y Crick. Estas condiciones serán específicas para cada serie de ácidos nucleicos y cebadores. Sin embargo, las condiciones generales son bien conocidas para los especialistas en la técnica y se describen y se hace referencia a ellas más a fondo a continuación.

La mezcla de PCR puede contener el ADN diana, los pares de cebadores de ADN, 4 trifosfatos de desoxirribonucleósidos (A,T,C,G), MgCl_{2}, ADN polimerasa (termoestable), y tampones convencionales. El ADN puede amplificarse para una cantidad de ciclos (habitualmente de 20-40 ciclos). Generalmente es posible aumentar la sensibilidad de detección usando una multiplicidad de ciclos, constando cada ciclo de un corto periodo de desnaturalización para el ADN diana a una temperatura elevada, enfriamiento de la mezcla de reacción, y polimerización con la ADN polimerasa. Elegir las secuencias cebadoras de PCR, preparar los reactivos de PCR y mezclas de reacción, y diseñar y llevar a cabo la PCR son procedimientos bien conocidos en la técnica de PCR.

Brevemente, enzima, cebadores, ácido nucleico diana, dNTP, MgCl_{2} y tampón se mezclan en una mezcla de reacción, se coloca el tubo en un ciclador térmico, muchas versiones del cual están disponibles en el mercado de suministradores tales como Perkin Elmer Cetus Instruments, y se calienta a una temperatura entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 80ºC, preferiblemente entre 70ºC y 80ºC.

Como se usa en este documento, "amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica especificidad de molde. La especificidad de molde aquí se distingue por la fidelidad de replicación (es decir, síntesis de la secuencia polinucleotídica apropiada) y especificidad de nucleótido (ribo- o desoxirribo-).

La detección del producto de ácido nucleico amplificado puede conseguirse por cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. En una realización preferida descrita en la etapa (d) en el método de la invención, el producto amplificado se separa en base al peso molecular por electroforesis en gel, y los productos separados después se visualizan por el uso de colorantes específicos de ácidos nucleicos que permiten observar las muestras discretas de producto amplificado resulto en el gel. Aunque existen numerosos colorantes específicos de ácido nucleico y serían apropiados para visualizar los ácidos nucleicos separados electroforéticamente, se prefiere el bromuro de etidio.

En una realización especifica, se pretende el método de la invención para construir de manera dirigida de orientación una construcción que comprende al menos dos segmentos. Uno de los segmentos de interés comprende un segmento replicable y en algunas realizaciones este fragmento también puede contener secuencias que codifican un marcador de selección. Como alternativa, cualquier otro segmento de interés puede comprender las secuencias codificantes de un marcador de selección. El segmento replicable contenido en uno de los segmentos de interés comprende una secuencia de origen de replicación (ori).

Como se usa en este documento segmento replicable o replicón procariota significa una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada con la misma. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica. De acuerdo con una realización específica de la presente invención, el segmento replicable puede obtenerse de un vector replicable seleccionado entre el grupo compuesto por vectores retrovirales, vectores de fagos, vectores plasmídicos, vectores de expresión, vectores autorreplicantes, elementos de transposición, vectores fagémidos y vectores YAC.

Además, estas realizaciones que incluyen un replicón procariota también pueden incluir un marcador de selección, que es, por ejemplo, un gen cuya expresión confiere resistencia a fármacos a un hospedador bacteriano transformado con el mismo. Los genes de resistencia a fármacos bacterianos típicos son los que confieren resistencia ampicilina, tetraciclina, o kanamicina.

Pueden incorporarse una diversidad de marcadores de selección en cualquier construcción. Por ejemplo, puede usarse un marcador de selección que confiere un fenotipo de selección tal como resistencia fármaco, auxotrofía nutricional, resistencia a un agente citotóxico o expresión de una proteína de superficie. Los genes marcadores de selección que pueden usarse incluyen neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, CAD, e hisD. El fenotipo de selección conferido hace posible identificar y asilar las células receptoras. Los genes amplificables que codifican marcadores de selección (por ejemplo ada, dhfr y el gen CAD multifuncional que codifica la carbamilfosfato sintasa, aspartato transcarbamilasa, y dihidro-orotasa) tienen la característica añadida de que posibilitan la selección de células que contienen copias amplificadas del marcador de selección insertado en el genoma. Esta característica proporciona un mecanismo para aumentar de manera significativa el número de copias de un gen adyacente o unido para el que se desea la amplificación.

Los marcadores de selección pueden dividirse en dos categorías: que se seleccionan positivamente y se seleccionan negativamente (en otras palabras, marcadores para selección positiva o selección negativa). En la selección positiva, las células que expresan el marcador de selección positivo son capaces de sobrevivir al tratamiento con un agente selectivo (tales como neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, mdrl e hisD). En la selección negativa, las células que expresan el marcador de selección negativo se destruyen en presencia del agente selectivo (por ejemplo, tk, gpt).

Se aprecia que el método de la invención puede usarse para la creación de un fragmento que comprende diferentes cantidades de segmentos de interés, apropiadamente alineados en una orientación deseada. Este fragmento puede después insertarse a un vector linealizado existente, para crear la construcción de interés usando técnicas de clonación convencionales.

Los ejemplos de técnicas de clonación convencional incluyen uso de endonucleasas de restricción seguido por ligamiento, como se describe en Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, incorporado en este documento como referencia.

De acuerdo con una realización específicamente preferida, los productos de extremos romos fosforilados de la primera etapa del método de la invención pueden obtenerse por diferentes procedimientos, por ejemplo:

(i) realizando una primera serie de amplificación por PCR usando dichos segmentos como molde para crear productos que tienen extremos romos fosforilados, amplificado cada segmento en una reacción por separado, usando cebadores específicos; o

(ii) creando productos con extremos romos por escisión de segmentos de ácidos nucleicos de interés por una endonucleasa de extremos romos tales como SrfI (GCCC/GGGC), SmaI (CCC/GGG) o EcoRV (GAT/ATC); o

(iii) creando productos de extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos seguidos por reacción de relleno; o

(iv) creando productos de extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos, seguido por la reacción de endonucleasa de ADN de cadena simple, degradando las extensiones de cadena simple de los extremos de ADN.

Después de la digestión, las enzimas de restricción de extremos romos mantienen los fosfatos terminales "terminales" 5' solos de ambos lados del sitio de restricción.

En el caso de que se obtengan los productos de extremos romos por reacción de PCR, debe realizarse reacción de fosforilación. También debe apreciarse que hay muchos métodos alternativos para producir un segmento de ADN fosforilado. Por ejemplo, la enzima polinucleótido quinasa se usa por los especialistas en la técnica para añadir grupos fosfato al extremo 5' de moléculas de ADN. La reacción de fosforilación que emplea la quinasa T4 puede realizarse en los productos de PCR de extremos romos o preferiblemente, en los cebadores usados para la reacción de PCR.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción que comprende más de dos segmentos de ácidos nucleicos. De manera similar a las etapas implicadas en la combinación de dos segmentos, combinar más de dos segmentos implica la repetición cíclica de las etapas (b) a (d) de acuerdo con el método de la invención, para crear productos combinados aislados que tienen la orientación deseada. Estos productos combinados después se ligan para crear una secuencia ligada combinada. En cada reacción de ligamiento sólo dos de los productos combinados obtenidos en la repetición cíclica se ligan. La siguiente etapa implica una reacción de PCR usando dicha secuencia ligada como molde y cebadores de enriquecimiento específico dirigiendo esta amplificación de PCR hacia la orientación deseada. Los productos combinados obtenidos, que tienen la orientación deseada, después se aíslan y purifican.

Las etapas pueden repetirse cíclicamente para una cantidad deseada de veces para crear un producto combinado final que contiene todos los segmentos de interés alineados en la orientación deseada. La etapa final es autoligamiento del producto combinado final aislado, para la creación de una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene todos los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa entre si.

El método de la invención emplea preferiblemente como cebadores específicos para la primera serie de reacciones de amplificación por PCR, un cebador 5' que comprende una secuencia obtenida del extremo 5' del segmento de interés (cebador con sentido) y un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremos 3' del segmento específico a amplificar (cebadores antisentido).

Además, los cebadores de enriquecimiento específico empleados en la amplificación de las secuencias ligadas combinadas de acuerdo con el método de la invención pueden ser: un cebador 5' que comprende la secuencia obtenida del extremo 5' del primer segmento, que esta cadena arriba del segundo segmento ligado en el producto ligado combinando (cebador con sentido) y un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremo 3' del segundo segmento ligado (cebador antisentido) de la secuencia ligada combinada.

El término secuencia de nucleótidos complementaria como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos en una molécula de doble cadena de ADN o ARN que es suficientemente complementaria a otra cadena simple para hibridar de manera específica (no aleatoriamente) a ella con los enlaces de hidrógeno consiguientes.

Por hibridación se pretende decir el apareamiento de secuencias de nucleótidos complementarios (cadenas de ácido nucleico) para formar un dúplex, heterodúplex o complejo que contiene más de dos ácidos nucleicos de cadena simple, estableciendo enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarios. La hibridación es una interacción específica, es decir, no aleatoria, entre/a lo largo de polinucleótidos complementarios que pueden inhibirse competitivamente.

Debe observarse que los mismos cebadores pueden usarse para la primera reacción de PCR creando los segmentos de interés de extremos romos, y la reacción de PCR de enriquecimiento de la orientación, como se ejemplifica en la Figura 1, y en los Ejemplos 1 y 2.

El termino cebador como se usa en este documento es: un polinucleótido, purificado a partir de digestión de restricción de ácido nucleico o producido sintéticamente, que es capaz de funcionar como un punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a una cadena de ácido nucleico molde, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, transcriptasa reversa y similares, en condiciones de reacción apropiadas de temperatura y pH.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos para usar como cebadores de PCR pueden sintetizarse químicamente de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito primero por Beaucage y Carruthers [Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)] usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter [Needham-VanDevanter- D.R., et al, Nucelic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]. La purificación de polinucleótidos se hace por electroforesis en gel de acrilamida en condiciones nativas o por HPLC de intercambio aniónico. La secuencia del oligonucleótido sintético puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert [Maxam, A.M. y Gilbert, W. Methods in Enzymology Grossman, L. y Moldave, D., eds., Academic Press, Nueva York, 65:499-560 (1980)].

La elección de la secuencia de nucleótidos del cebador depende de factores lates como la distancia del ácido nucleico desde la región codificante para la secuencia de ácidos nucleicos específica deseada presente en un ácido nucleico de interés y su sitio de hibridación en el ácido nucleico en relación con cualquier segundo cebador a usar. El cebador se proporciona preferiblemente en una forma de cadena simple para una eficacia máxima, pero como alternativa puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador se trata primero para separar sus cadenas antes de usarse para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un polidesoxirribonucleótido.

Polinucleótido como se usa en este documento es un polímero de nucleótidos de cadena simple o doble. Como se usa en este documento "polinucleótido" y sus equivalentes gramaticales incluirán toda la variedad de ácidos nucleicos. Un polinucleótido típicamente se referirá a una molécula de ácido nucleico comprendida de una cadena lineal de dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de las condiciones últimas de uso, como bien se sabe en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen cebadores, segmentos de ARN/ADN, oligonucleótidos (polinucleótidos relativamente cortos) genes, vectores, plásmidos, y similares.

Los polinucleótidos pueden prepararse por una diversidad de métodos que incluyen la síntesis química de novo y derivación de fragmentos de ácidos nucleicos a partir de secuencias de ácido nucleicos nativas existentes como genes, o partes de genes, en un genoma, plásmido u otro vector, tal como por digestión con endonucleasas de restricción de ácidos nucleicos de doble cadena más grandes y separación de cadenas o por síntesis enzimática usando un molde de ácido nucleico.

La síntesis química de novo de un polinucleótido puede realizarse usando cualquier método apropiado tal como, por ejemplo, los métodos de fosfotriéster o fosfodiéster. Véase Narang et al. [Meth. Enzymo. (1979) 68:90; Patente de Estados Unidos Nº 4.356.270; Itakura et al., (1989) Ann. Rev. Biochem. 53:323-56; y Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109].

Preferiblemente, cada uno de los cebadores usados en el método de la invención comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, cada uno de dichos cebadores comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Mucho más preferiblemente, cada uno de dichos cebadores comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleótidos.

Las enzimas empleadas en el método de la invención pueden ser, por ejemplo, ADN ligasa, para reacción de ligamiento, preferiblemente ligasa T4. Durante el ligamiento, la ADN ligasa se une covalentemente a moléculas de ADN de doble cadena con enlaces de hidrógeno. Esta enzima requiere un fosfato terminal 5' para funcionar como aceptor de electrones.

Para la reacción de amplificación por PCR, se prefiere particularmente ADN polimerasas estables al calor (termófilas) que son estables en la realización mas preferida en la que la PCR se realiza en una solución única en la que se cicla la temperatura. Las polimerasas estables al calor representativas son las ADN polimerasas aisladas de Bacillus stearothermophilus (Bio-Rad, Richmond, Calif.), Thermus thermophilus (FINZYME, ATCC Nº 27634), especie Thermus (ATCC Nº 31674), Thermus aquaticus cepa TV 1151B (ATCC Nº 25105), Sulfolobus acidocaldarius, descrita por Bukhrashuili et al. [Biochem. Biophys. Acta, 1008:102-7 (1989)] y por Elie et al., [Biochem. Biophys. Acta 951:261-7 (1988)], Thermus filiformis (ATCC Nº 43280), la polimerasa aislada de Thermus flavus (Molecular Biology Resources; Milwaukee, Wis.), y "Vent" polimerasas (New England Biolabs, Beverly, Me.). La ADN polimerasa Taq está disponible a partir una diversidad de fuentes incluyendo Perkin Elmer Cetus, (Norwalk, Conn.), Promega (Madison, Wis.) y Stratagene (La Jolla, Calif.), y la ADN polimerasa AmpliTaq™ es una ADN polimerasa Taq disponible por Perkin-Elmer Cetus.

Es particularmente preferida una ADN polimerasa de alta fidelidad que tiene la capacidad de corrección de lectura que es capaz de polimerizar fragmentos de aproximadamente 40 kd que tienen un número mínimo de mutaciones. Dichas polimerasas están disponibles en el mercado, e incluyen, por ejemplo, PFU (por Promega) y TaKaRa Ex Taq (TaKaRa). Puede ser preferido usar para la reacción de PCR una polimerasa que crea productos de extremos romos. También pueden emplearse en la presente invención polimerasas que dejan productos con salientes en 3', sin embargo el uso de la ADN polimerasa T4 requerirá el procedimiento de la exonucleasa para retirar el extremo 3' y crear un producto de extremos romos.

De acuerdo con una realización específica, se pretende el método de la invención para construir una construcción que comprende al menos dos segmentos de interés. Dichos segmentos pueden ser, por ejemplo, un segmento de interés que comprende una secuencia de origen de replicación (ori) y opcionalmente una secuencia que codifica un marcador de selección, un segmento que comprende una secuencia de interés y opcionalmente un marcador de selección; al menos un segmento adicional que comprende una secuencia codificante de ácido nucleico heterólogo u homólogo, o mutaciones, fragmentos o derivados del mismo; y opcionalmente, al menos un segmento adicional que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican elementos de expresión, control, promotores y/o reguladores.

De este modo, de acuerdo con la invención, una construcción de ADN puede incluir un origen de replicación bacteriano y marcadores de resistencia antibióticos bacterianos, que permiten la propagación del plásmido a gran escala en bacterias. Puede usarse una construcción de ADN que incluye ADN que codifica un marcador de selección, junto con secuencias adicionales de control, tales como un promotor, sitio de poliadenilación y uniones de corte y empalme, para conferir un fenotipo de selección.

Por consiguiente, el término elementos de control y reguladores incluyen promotores, terminadores y otros elementos de control de la expresión. Dichos elementos reguladores se describen en Goeddel; [Goeddel et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, Calif. (1990)]. Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de una secuencia de AND cuando se une de manera operativa a ella en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican cualquier proteína deseada usando el método de esta invención.

Dichas secuencias reguladoras pueden estar comprendidas por promotores, potenciadores, regiones de unión a la estructura, elementos reguladores negativos, sitios de iniciación de la trascripción, sitios de unión a proteínas reguladoras o combinaciones de dichas secuencias. Además, pueden añadirse secuencias que afectan a la estructura de estabilidad del ARN o proteína producida. Estas secuencias incluyen señales de poliadenilación, elementos de estabilidad de ARNm, sitios de corte y empalme, secuencias líder para potenciar o modificar las propiedades de transporte o secreción de la proteína, u otras secuencias que alteran o mejoran la función o estabilidad de la proteína o moléculas de ARN.

Como se usa en este documento, la expresión "secuencia codificante homóloga o heteróloga" o "gen" se refiere a un ácido nucleico que comprende una pauta de lectura abierta que codifica cualquier gen deseado construido por el método de la presente invención, incluyendo tanto secuencias exónicas como (opcionalmente) intrónicas. El término "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado, que no se traduce en una proteína y, generalmente, se encuentra entre exones.

La secuencia codificante heteróloga u homóloga de interés de acuerdo con la invención puede codificar una proteína seleccionada entre el grupo compuesto por proteínas informadoras, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, proteínas estructurales y proteínas de aplicación industrial, o que son por sí mismas un producto terapéutico.

Además, las secuencias codificantes heterólogas u homólogas incorporadas en una construcción por el presente método puede ser ADN que codifica un producto de traducción o trascripción cuya expresión en células se desea, o una porción de un producto de traducción o trascripción, tal como un producto proteico o producto de ARN útil en el tratamiento de una afección existente o prevenir que suceda (por ejemplo, hGH o EPO); o ADN que no codifica un producto génico pero es útil por si mismo, tal como una secuencia reguladora de la transcripción o ADN útil para tratar una afección existente o prevenir que suceda.

Las secuencias de AND introducidas en una construcción de acuerdo con el método de la invención puede codificar un producto deseado entero, o pueden codificar, por ejemplo, una porción o porciones activas o funcionales del producto. El producto puede ser, por ejemplo, una hormona, una citoquina, un antígeno, un anticuerpo, una enzima, un factor de coagulación, una proteína de trasporte, un receptor, una proteína reguladora, una proteína estructural, un factor de trascripción, un ARN antisentido, o una ribozima. Además, el producto puede ser una proteína o un ácido nucleico que no sucede en la naturaleza (es decir, una proteína nueva o ácido nucleico nuevo). El ADN puede obtenerse de una fuente en la que sucede en la naturaleza o puede producirse, por técnicas de ingeniería genética de acuerdo con la invención. El ADN puede codificar uno o más productos terapéuticos.

De acuerdo con otra realización específica, la secuencia codificante heteróloga puede codificar una proteína informadora seleccionada entre el grupo compuesto por la proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa, fosfatasa alcalina secreta (SEAP) y \beta-galactosidasa (\beta-gal).

Se aprecia que el método de la invención puede usarse para construir segmentos que comprenden secuencias codificantes heterólogas u homólogas, mutaciones, derivados y fragmentos de las mismas. Por lo tanto, el método de la presente invención puede usarse para construir construcciones que tienen mutaciones específicas, como se describe en este documento a continuación.

Por "derivados" se pretende decir los "fragmentos", "variantes", "análogos" o "derivados" de regiones codificantes y/o no codificantes de dichas secuencias de ácidos nucleicos. Un "fragmento" de una molécula, tal como cualquiera de las secuencias de ADN o ADNc usadas por el método de la presente invención, pretende significar que se refiere a cualquier subconjunto de nucleótidos de la molécula. Una "variante" de dicha molécula pretende significar que se refiere a una molécula que sucede la naturaleza sustancialmente similar a la molécula entera o un fragmento de la misma. Un "análogo" de una molécula puede ser una molécula homóloga de la misma especie o de diferente especia. La secuencia de aminoácidos de un análogo o derivado puede diferir de la secuencia original, cuando al menos un resto se deleciona, se inserta o sustituye. Específicamente, un análogo o derivado de la secuencia de ácidos nucleicos que puede usarse por el método de la invención puede comprender al menos una mutación, mutación puntual, mutación sin sentido, mutación de sentido erróneo, deleción, inserción o reordenamiento. La región codificante también puede alterarse tomando ventajas de la degeneración del código genético para alterar la secuencia codificante de tal modo que, mientras que la secuencia de nucleótidos este sustancialmente alterada, codifica sin embargo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencias de fusión descritas.

Se aprecia que la longitud total de la construcción de ADN variará de acuerdo con la cantidad de componentes (ADN exógeno, secuencias diana, gen de marcador de selección) y la longitud de cada uno. La longitud de la construcción completa generalmente será de al menos 20 nucleótidos.

La construcción descrita en este documento, que contiene una secuencia codificante heteróloga u homóloga, puede, de acuerdo con una realización específica de la invención, ser un vehículo de expresión.

"Vehículos de expresión", como se usa en este documento, abarca vectores tales como plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos, que posibilitan la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedador. Los vectores de expresión típicamente son construcciones de ADN o ARN autorreplicantes que contienen los genes deseados o sus fragmentos, y elementos de control genético unidos de manera operativa que se reconocen en una célula hospedadora apropiada y provocan la expresión de los genes deseados. Estos elementos de control son capaces de provocar la expresión en un hospedador apropiado. Generalmente, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariota o un sistema de control de expresión promotor eucariota. Como se ha descrito anteriormente, dicho sistema típicamente incluye un promotor de la transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de la trascripción, potenciadotes de la trascripción para elevar el nivel de expresión de ARN, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma apropiado, uniones de corte empalme de ARN, secuencias que terminan a trascripción y la traducción y etc. Los vectores de expresión habitualmente contienen un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera independiente de la célula hospedadora.

Los plásmidos son la forma de vector usada más habitualmente pero otras formas de vectores que tienen una función equivalente y que son, o llegan a ser conocidos en la técnica son apropiadas para usar en este documento. Véase, por ejemplo, Pouwels et al, Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 y suplementos), Elsevier, N.Y.; y Rodriguez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), que se incorporan en este documento como referencia.

En general, dichos vectores contienen genes específicos adicionales, que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. También se contempla el uso de vectores de expresión virales procariotas y eucariotas.

El vector se introduce en una célula hospedadora por métodos conocidos por los especialistas en la técnica. La introducción del vector en una célula hospedadora puede conseguirse por cualquier método que introduce la construcción en la célula, incluyendo, por ejemplo, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, electroporación o transformación. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausuble, F.M, ed, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

El método de la invención también puede emplearse para la construcción dirigida de orientación de una construcción de ADN mutada, que tiene al menos una mutación específica. La mutación específica puede introducirse a la construcción durante una de las reacciones de amplificación por PCR creando los segmentos iniciales de interés de extremos romos. Para mutaciones puntuales, la mutación deseada puede introducirse a través de cebadores usados para la reacción de PCR creando el segmento de interés. La creación de una mutación de deleción puede conseguirse usando cebadores obtenidos a partir de regiones, que no incluyen la región que debe delecionarse.

En una realización específicamente preferida, el método de la invención puede realizarse automáticamente.

Varios métodos de la técnica de biología molecular no se detallan en este documento, ya que son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Dichos métodos incluyen mutagénesis dirigidas de sitio, expresión de ADNc, análisis de proteínas o péptidos recombinantes, transformación de células bacterianas, transfección de células de mamífero, y similares. Los libros de texto que describen dichos métodos son, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0879693096, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, por F.M. Ausubel, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc. 1988, y Short Protocols in Molecular Biology, por F.M. Ausubel et al, (eds.) 3^{a}ed. John Wiley & Sons; ISBN: 0471137812, 1995. Estas publicaciones se incorporan en este documento en su totalidad como referencia. Por lo tanto, varias técnicas inmunológicas no se describen en ningún caso en este documento en detalle, porque son bien conocidas por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan et al, (eds), John Wiley & Sons. Inc., Nueva York, NY.

Revelada y descrita, se entiende que esta invención no limita los ejemplos particulares, etapas de proceso, y materiales descritos en este documento ya que dichas etapas de proceso y materiales pueden variar de algún modo. También se entiende que la terminología usada en este documento se usa sólo para el propósito de describir realizaciones particulares y sin pretender limitar ya que el alcance de la presente invención se limitará sólo por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas.

Durante toda esta memoria descriptiva y la reivindicaciones adjuntas, salvo que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero de estados o etapas o grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Debe observarse que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales salvo que el contenido dicte claramente lo contrario.

Los siguientes ejemplos son representativos de técnicas empleadas por los inventores en aspectos realizados de la presente invención. Debe apreciarse que mientras que estas técnicas son ejemplares de realizaciones preferidas de la práctica de la invención, los especialistas en la técnica, en luz de la presente descripción, reconocerán que pueden hacerse numerosas modificaciones sin alejarse del espíritu y el alcance pretendido de la invención.

Ejemplos Procedimientos experimentales Medios

El medio Luria-Bertani (LB) contenía triptona, extracto de levadura y NaCl a 10 g, 5 g y 10 g por litro, respectivamente. Las placas LB se suplementaron con 20 mg por litro de ampicilina para resistencia a \beta-lactamasa.

Cepas bacterianas

Cepa JM109 de E. coli (Promega).

Enzimas

ADN ligasa T4 (TaKaRa), Polinucleótido Quinasa T4 (TaKaRa), ADN Polimerasa Pfu (Promega), enzimas de Restricción - PvuII y EcoRI (BioLab).

Cebadores

Cebador 2037	5'-GACTCTAGAGGATCCCCGG-3'	(SEC.ID.Nº: 1)
Cebador 2038	5'-GACCTGCAGGCATGCAAGC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 2)
Cebador 546	5'-AATGGCTGGTGATCTTTCAGC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 3)
Cebador 547	5'-TCTAACATGTGTGTCGTTC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 4)
Cebador 548	5'-TTCTGTGATAAAGGGACC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 5)
Cebador 549	5'-GCACTTAGTCTTTGACC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 6)
Cebador 335	5'-GAACCCCGAGTGACAAGC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 7)
Cebador 336	5'-TCATACCAGGGCTTGGCC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 8)
Cebador 826	5'-GCTTCGTGCTTTGGACTACC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 9)
Cebador 827	5'-GGGCCCCAGGCAGCAGAACC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 10)
Cebador 732	5'-GCTGTTTCCTGTGTGAA-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 11)
Cebador 110	5'-AGCTGATACCGCTCGCCG-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 12)
Cebador 592	5'-AATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 13)
Cebador 622	5'-TATGACCATGATTACGCCA-3'	(SEC.ID.Nº ID Nº: 14)

Preparación de cebadores fosforilados

Se fosforilaron 20 \mug de cebadores con 50 unidades de Polinucleótido Quinasa T4 en presencia de ATP 1 mM durante 30 minutos a 37ºC. La reacción de fosforilación se paró por inactivación de la Quinasa por incubación de la reacción durante 20 minutos a 65ºC. Se extrajeron los cebadores con fenol tamponado con Tris y se precipitaron con 0,1 volúmenes de KAc 3 M (pH 5,4) y 2,5 volúmenes de etanol enfriado en hielo. Los cebadores fosforilados se resuspendieron a 0,2 ng/\mul en TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM).

Reacción de PCR

La reacción de PCR se realizó usando de cada cebador 1 \muM por 20 \mul, dNTP 200 \muM, 10 ng de ADN molde y 1,5 unidades de ADN polimerasa Pfu en tampón de polimerasa Pfu 1X. Las condiciones de ciclo de PCR fueron 30 segundos a 92ºC, 1 minuto a 50ºC, 3,5 minutos a 72ºC durante 25 ciclos, seguido de 10 minutos a 72ºC.

Aislamiento del producto de PCR - Electroelución

Después de la amplificación por PCR, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa y se extrajo el segmento específico de interés usando métodos de electroelución convencionales.

Ligamiento

La reacción de ligamiento se realizó en 20 \mul de tampón de ADN ligasa T4 1x que contenía 10 ng de cada producto de PCR, ATP 500 nM y 400 Unidades de ADN ligasa T4. Se incubó la reacción durante 30 minutos a 22ºC seguido de calentamiento durante 10 minutos a 65ºC.

Transformación y minipreparación de plásmidos

La cepa JM106 de E. coli (100 \mul) (Promega) se transformó con 10 \mul de la reacción de autoligamiento y se sembró en placas LB+Amp. Se incubaron las placas a 37ºC durante una noche. Las colonias resistentes a Ampicilina se pasaron en 5 ml de LB+ampicilina y se incubaron durante una noche. Después de la incubación, se aislaron los plásmidos por protocolos de minipreparación convencionales. Después de la minipreparación de plásmido, se analizó el ADN con una enzima de restricción apropiada. Después del análisis, se purificó el plásmido por protocolos de ADN plasmídico a gran escala convencionales.

Se purificó el ADN plasmídico de la purificación plasmídica a gran escala y el ADN plasmídico de la minipreparación por el método de lisis alcalina [Birnboim, H.C., et al., Nucleic Acids Research, 7:1513-1522 (1979), Birnboim, H.C., Methods Enzymol. 100:243-255 (1983)].

Ejemplo 1 Creación de construcciones que tienen las cuatro posibles orientaciones diferentes usando el método OER

Para crear el primer fragmento, se realizó una reacción de PCR usando una biblioteca de ADNc de células T humanas como molde, los cebadores fosforilados 335 (SEC.ID.Nº: 7) y 336 (SEC ID Nº: 8) y la ADN polimerasa Pfu termoestable de alta fidelidad, que generó un producto de extremos romos. Ambos cebadores se fosforilaron como se ha descrito anteriormente en los métodos.

El segundo segmento se creó realizando una reacción de PCR usando una biblioteca de ADNc de células T humanas como molde, los cebadores fosforilados 826 (SEC.ID.Nº: 9) y 827 (SEC ID Nº: 10). Después de las amplificaciones por PCR de ambos segmentos, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa al 1,5% y se extrajeron los productos deseados (producto de PCR 1 de la primera reacción de PCR, producto de PCR 2 de la segunda reacción de PCR) usando métodos de electroelución convencionales (Figura 2A).

Se creó un producto combinado que comprende ambos segmentos realizando una reacción de ligamiento con los productos de PCR aislados descritos anteriormente. El producto de la reacción de ligamiento se amplificó por separado por cuatro reacciones de PCR usando los cebadores fosforilados flanqueantes 335 y 826 (SEC.ID.Nº: 7 y SEC.ID.Nº: 9, respectivamente), los cebadores 335 y 827 (SEC.ID.Nº: 7 y SEC.ID.Nº: 10, respectivamente), los cebadores 336 y 826 (SEC.ID.Nº: 8 y SEC.ID.Nº: 9, respectivamente) y los cebadores 336 y 827 (SEC.ID.Nº: 8 y SEC.ID.Nº: 10, respectivamente) para generar un tercer segmento de ADN (Figura 2B). Después de la amplificación por PCR, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa y se extrajeron los segmentos específicos por electroelución. A continuación se analizó el producto combinado que tenía la orientación deseada usando la enzima de restricción PvuII. Como se muestra en la Figura 2C, los productos resultantes tenían todas las posibles orientaciones.

Ejemplo 2 Uso del método OER en la preparación de los plásmidos pcDNAPKRwt y el plásmido mutado pcDNAPKR\Delta6

Como ejemplo para la creación de construcciones usando el método OER de la invención, se construyeron el pcDNAPKRwt así como su correspondiente construcción mutada.

Para crear el primer segmento, se realizó una reacción de PCR usando el Plásmido BlueScript (pBS) (Stratagene) como molde, los cebadores fosforilados 2037 (SEC.ID.Nº: 1) y 2038 (SEC.ID.Nº: 2) y la ADN polimerasa Pfu termoestable de alta fidelidad, que generó un producto de extremos romos. Ambos cebadores se fosforilaron como se ha descrito en los métodos anteriormente en este documento. Este primer producto de ADN comprende el gen de resistencia a \beta-lactamasa (Amp^{r}) y se amplificó por PCR la región de origen de replicación (Ori) del plásmido pBS.

El segundo segmento se creó por hibridación de una biblioteca de ADNc de células T humanas con los cebadores fosforilados 546 (SEC.ID.Nº: 3) y 547 (SEC.ID.Nº: 4) en una concentración de ADNc de 100 ng/\mul, y realizando una reacción de PCR.

Después de las amplificaciones por PCR de ambos segmentos, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa al 1% y se extrajeron los productos deseados (producto de PCR 1 (Amp-Ori) de la primera reacción de PCR, producto de PCR 2 (PKRwt) de la segunda reacción de PCR) usando métodos de electroelución convencionales (Figura 3A).

Se creó un producto combinado que comprende ambos segmentos realizando una reacción de ligamiento con los productos de PCR aislados descritos anteriormente. El producto de la reacción de ligamiento se amplificó por PCR usando los cebadores flanqueantes fosforilados 2037 y 547 (SEC.ID.Nº: 1 y SEC.ID.Nº: 4, respectivamente), generando un tercer segmento de ADN (Figura 3B). Después de la amplificación por PCR, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa y se extrajo el segmento específico (producto de PCR: Amp-Ori-PKRwt) por electroelución. A continuación se autoligó el producto combinado que tiene la orientación deseada para crear una construcción de ADN de doble cadena. La transformación de la cepa de E. coli (Promega) se realizó usando el plásmido resultante, seguido por la minipreparación del ADN. Se escogieron las colonias positivas y después se analizaron usando la enzima de restricción EcoRI. Como se muestra en la Figura 3C, la mayoría de la colonias contenían el plásmido pcDNAPKRwt que tenía la orientación deseada.

Preparación de un plásmido que contiene ADNc mutado de PKR (PKR\Delta6)

Como ejemplo para inserción de una mutación y la creación de construcciones mutadas usando el método OER de la invención, a continuación se construyó el plásmido PKR\Delta6.

El ADN plasmídico de pcDNAPKRwt (que se describió anteriormente) se usó como molde para la amplificación por PCR. Se creó un producto de extremos romos que tiene la mutación deseada (mutación de deleción, en este caso), usando los cebadores oligonucleotídicos flanqueantes fosforilados 548 y 549 (indicados por SEC.ID.Nº: 5 y 6, respectivamente). Después de la amplificación por PCR, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa y se extrajo el segmento específico (PKR-Amp-Ori-PKR) usando métodos de electroelución convencionales (Figura 4A).

A continuación se autoligó el producto combinado que tiene la orientación deseada para crear una construcción de ADN de doble cadena. La transformación de la cepa de E. coli (Promega) se realizó usando el plásmido resultante, seguido por la minipreparación del ADN. Se escogieron las colonias positivas y después se analizaron usando la enzima de restricción EcoRI. Como se muestra en la Figura 4B, la mayoría de las colonias contenían el plásmido pcDNAPKR\Delta6 que tenía la orientación deseada.

Ejemplo 3 Uso de dos conjuntos de cebadores diferentes para dirigir la orientación deseada de dos construcciones diferentes a partir del mismo molde por el método OER

Para ejemplificar el potente uso del método OER en la construcción de dos plásmidos diferentes que tienen una orientación deseada a partir del mismo molde, se construyeron tanto el plásmido pGFP-LacP-LacZ como el pLacZ-LacP-GFP, que contenían el gen de \beta-galactosidasa (LacZ), el promotor inducido por IPTG (LacP) y la proteína fluorescente verde (GFP).

La inserción del promotor LacP usando la orientación I (Figura 5A), conduce a la expresión del gen de \beta-galactosidasa (LacZ), que da como resultado un color azul de las colonias transformadas (Figura 5D). La inserción del promotor LacP usando la orientación II (Figura 5A), conduce a la expresión del gen de GFP (proteína fluorescente verde), que da como resultado en las colonias transformadas que se produzca una señal fluorescente verde en luz UV.

El segmento LacP (promotor inducido por IPTG) se creó realizando una reacción de PCR usando el Plásmido pBlueScript (pBS) (Stratagene) como molde, los cebadores fosforilados 110 (SEC.ID.Nº: 12) y 732 (SEC.ID.Nº: 11) así como la ADN polimerasa Pfu termoestable de alta fidelidad, que genera un producto de extremos romos. Ambos cebadores se fosforilan como se ha descrito anteriormente en los métodos.

El segundo segmento se creó por una segunda reacción de PCR usando el Plásmido pLacZ-GFP (pLG) (Gene Bio-Application) como molde, los cebadores fosforilados 622 (SEC.ID.Nº: 14) y 592 (SEC.ID.Nº: 13) y la ADN polimerasa Pfu termoestable de alta fidelidad. Este fragmento de ADN comprende LacZ, el gen de resistencia a \beta-lactamasa (Amp^{r}), la región de origen de replicación (Ori) y los genes GFPuv (Figura 5A).

Después de las amplificaciones por PCR de ambos segmentos, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa al 1% y se extrajeron los productos deseados (producto de PCR 1 (LacP) de la primera reacción de PCR y producto de PCR 2 (LacZ-Amp^{r}-Ori-GFP) de la segunda reacción de PCR) usando métodos de electroelución convencionales.

Se creó un producto combinando que comprende ambos segmentos realizando una reacción de ligamiento con los productos de PCR aislados descritos anteriormente. El producto de la reacción de ligamiento se amplificó por dos reacciones de PCR por separado usando los cebadores flanqueantes fosforilados 592 y 110 (SEC.ID.Nº: 13 y SEC.ID.Nº: 12, respectivamente) generando un tercer segmento de ADN (LacP a LacZ) como se muestra por la Figura 5B, o 592 y 732 (SEC.ID.Nº: 13 y SEC.ID.Nº: 11, respectivamente) generando un tercer segmento de ADN (LacP a GFPuv) compuesto se muestra por la Figura 5C. Después de la amplificación por PCR, se separaron los productos de PCR en gel de agarosa y se extrajeron los segmentos específicos (producto de PCR 1: GFP-Amp-Ori-LacP-LacZ, producto de PCR 2: LacZ-Amp-Ori-LacP-GFP) por electroelución. A continuación se autoligaron los productos combinados que tenían la orientación deseada para crear construcciones de ADN de doble cadena. A continuación se realizó la transformación de la cepa de E. coli (Promega) con dos construcciones diferentes. Como se muestra en la Figura 5D, la mayoría de las colonias transformadas con el plásmido pGFP-LacP-LacZ produjeron un color azul y la mayoría de las colonias transformadas con el plásmido pLacZ-LacP-GFP manifestaron un color verde en luz UV. De este modo, el método OER de la presente invención se realizó con versatilidad y alta eficacia en la creación de construcciones que tienen la orientación deseada a partir de un molde idéntico.

<110> GEBA- Gene Bio Application Ltd.

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<120> CONSTRUCCIÓN DIRIGIDA DE ORIENTACIÓN DE PLÁSMIDOS

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<130> 11611

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<140>

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<141>

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<160> 14

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<170>PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 2037

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gactctagag gatccccgg

\hfill

19

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<210> 2

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 2038

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacctgcagg catgcaagc

\hfill

19

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 546

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatggctggt gatctttcag c

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21

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<210> 4

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 547

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<400> 4

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tctaacatgt gtgtcgttc

\hfill

19

\newpage

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 548

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttctgtgata aagggacc

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18

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<210> 6

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 549

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<400> 6

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gcacttagtc tttgacc

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17

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<210> 7

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 335

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<400> 7

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gaaccccgag tgacaaga

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18

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<210> 8

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 336

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<400> 8

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tcataccagg gcttggcc

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18

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<210> 9

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 826

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<400> 9

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gcttcgtgcg ttggactacc

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20

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<210> 10

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 827

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<400> 10

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agctgatcgg cagcagaacc

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20

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<210> 11

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 732

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<400> 11

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gactgtttcct gtgtgaa

\hfill

17

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<210> 12

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 110

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<400> 12

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agctgatacc gctcgccg

\hfill

18

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<210> 13

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 592

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatgagtaaa ggagaagaac

\hfill

20

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<210> 14

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: CEBADOR 622

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<400> 14

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tatgaccatg attacgcca

\hfill

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Claims

1. Un método para la construcción dirigida de orientación de una construcción comprende al menos dos segmentos de ácidos nucleicos de interés, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. proporcionar productos que tienen extremos ramos fosforilados obtenidos de dichos segmentos de ácidos nucleicos de interés;

b. realizar reacciones de ligamiento por separado, donde en cada reacción los productos de extremos romos fosforilados de dos segmentos diferentes obtenidos en la etapa (a) se ligan para crear una secuencia ligada combinada;

c. realizar una reacción de amplificación por PCR usando dicha secuencia ligada combinada obtenida en la etapa (b) como molde y cebadores de enriquecimiento específico dirigiendo dicha amplificación de PCR hacia la orientación deseada, donde cada secuencia ligada combinada se amplifica en una reacción por separado creando un producto combinado que tiene extremos romos fosforilados;

d. aislar y purificar dicho producto combinado que tiene la orientación deseada enriquecida obtenida en la etapa (c);

e. opcionalmente, la repetición cíclica de las etapas (b) a (d) para una cantidad deseada de veces, para crear un producto combinado aislado que tiene la orientación deseada; y

f. realizar el autoligamiento de dicho producto combinado purificado aislado obtenido en la etapa (e), creando una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde un primer segmento dicho de interés comprende un segmento replicable, y dicho primer segmento de interés y/o cualquier otro segmento dicho de interés comprende una secuencia que codifica un marcador de selección.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichos productos de extremos romos fosforilados de la etapa (a) se obtienen por una cualquiera de:

(i) realización de una primera serie de amplificación por PCR usando dichos segmentos como molde, para crear productos que tienen extremos romos fosforilados, donde cada segmento se amplifica una reacción por separado, usando cebadores específicos;

(ii) creación de productos de extremos romos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos romos;

(iii) creación de productos de extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos, seguido por una reacción de relleno; y

(iv) creación de productos de extremos cohesivos por escisión de dichos segmentos de ácidos nucleicos empleando una endonucleasa de extremos adhesivos, seguido por una reacción de endonucleasa de ADN de cadena simple y degradando las extensiones de cadena simple de los extremos de ADN.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dichos productos de extremos romos fosforilados se obtienen por fosforilación de uno cualquiera de los productos de PCR de extremos romos en (i) o los cebadores de PRC empleando la quinasa T4.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, donde dicha construcción comprende más de dos segmentos de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. repetición cíclica de las etapas (a) a (d) como se ha definido en la reivindicación 1, para crear los productos combinado aislados que tienen la orientación deseada;

b. realizar reacciones de ligamiento por separado, donde en cada reacción de ligamiento los productos de PCR de dos de los productos combinados obtenidos en la etapa (a) se ligan para crear una secuencia ligada combinada;

c. realizar una reacción de PCR usando dicha secuencia ligada combinada obtenida en la etapa (d) como molde, y cebadores de enriquecimiento específico dirigiendo dicha amplificación de PCR hacia la orientación deseada, donde cada secuencia ligada combinada se amplifica en una reacción por separado creando un producto combinado;

d. aislar y purificar dichos productos combinado que tienen la orientación deseada obtenidos en la etapa (c);

e. repetición cíclica de las etapas (b) a (d) para una cantidad de veces deseada para crear un producto combinado que contiene todos los segmentos de ácidos nucleicos alineados en la orientación deseada para crear un producto combinado final; y

f. realizar un autoligamiento de dicho producto combinado final aislado obtenido en la etapa (e), creando una construcción de ADN de doble cadena circular que contiene los segmentos deseados alineados apropiadamente y unidos de manera operativa.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde dichos segmentos replicables comprenden una secuencia de origen de replicación (ori).

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho segmento replicable se obtiene de un vector replicable seleccionado entre el grupo compuesto por vectores retrovirales, vectores de fagos, vectores plasmídicos, vectores de expresión, vectores autorreplicantes, vectores fagémidos y vectores YAC.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dichos cebadores específicos empleados en la primera serie de reacciones de amplificación por PCR (etapas (a) a (d)) son: un cebador 5' que comprende una secuencia obtenida del extremo 5' de un segmento de interés (cebador con sentido) y un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremo 3' del segmento especifico a amplificar (cebadores antisentido).

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dichos cebadores de enriquecimiento específico empleados en la amplificación de las secuencias ligadas combinadas son:

(i) un cebador 5' que comprende una secuencia obtenida del extremo 5' del primer segmento, que está cadena arriba del segundo segmento ligado en el producto ligado combinado (cebador con sentido); y

(ii) un cebador 3' que es complementario a la secuencia del extremo 3' del segundo segmento ligado (cebador antisentido), de la secuencia ligada combinada.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, donde cada uno de dichos cebadores comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde cada uno de dichos cebadores comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha reacción de ligamiento se realiza empleando una ADN ligasa.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicha amplificación por PCR se realiza empleando una AND polimerasa de alta fidelidad.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5, donde dicha construcción comprende:

a. uno de dichos segmentos de interés que comprende una secuencia de origen de replicación (ori) y una secuencia que codifica un marcador de selección;

b. al menos un segmento adicional que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de interés codificante heteróloga u homologa, o mutaciones, fragmentos o derivados de la misma; y

c. opcionalmente, al menos un segmento adicional que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican elementos de expresión, control, promotores y/o reguladores.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha secuencia codificante heteróloga u homóloga de interés codifica un proteína seleccionada entre el grupo compuesto por proteínas informadoras, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, proteínas estructurales y proteínas de aplicación industrial, o es por si misma un producto terapéutico.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicha secuencia codificante heteróloga codifica una proteína informadora seleccionada entre el grupo compuesto por proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa, fosfatasa alcalina secretada (SEAP) y \beta-galactosidasa (\beta-gal).

17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde dicha construcción es un vehículo de expresión.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho método se realiza manualmente.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho método se realiza automáticamente.