ES2235172T3 - Quimioquina humana beta-9. - Google Patents

Quimioquina humana beta-9.

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ES2235172T3 ES95923661T ES95923661T ES2235172T3 ES 2235172 T3 ES2235172 T3 ES 2235172T3 ES 95923661 T ES95923661 T ES 95923661T ES 95923661 T ES95923661 T ES 95923661T ES 2235172 T3 ES2235172 T3 ES 2235172T3
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Abstract

SE DESCRIBEN POLIPEPTIDOS DE CK BE - 9 HUMANA Y ADN (ARN) QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS DE QUEMOQUINA Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR DICHOS POLIPEPTIDOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS PARA UTILIZAR DICHOS POLIPEPTIDOS DE CK{BE} - 9 PARA EL TRATAMIENTO DE LEUCEMIA, TUMORES, INFECCIONES CRONICAS, ENFERMEDADES AUTOINMUNES, ALTERACIONES FIBROTICAS, CURACION DE HERIDAS Y PSORIASIS, ASI COMO ANTAGONISTAS FRENTE A DICHOS POLIPEPTIDOS Y SU USO COMO AGENTES TERAPEUTICOS PARA TRATAR ARTRITIS REUMATOIDE, ENFERMEDADES INFLAMATORIAS AUTOINMUNES Y CRONICAS E INFECCIOSAS, REACCIONES ALERGICAS, FIEBRE NO ASOCIADA A PROSTAGLANDINAS Y DEPRESION DE LA MEDULA OSEA. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS DIAGNOSTICOS QUE DETECTAN LA PRESENCIA DE MUTACIONES EN LA SECUENCIA QUE CODIFICA CK{BE} - 9 Y LA SOBREEXPRESION DE LA PROTEINA CK{BE} - 9.

Description

Quimioquina humana beta-9.
Esta invención se refiere a polinucleótidos recientemente identificados, a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención son quimioquinas humanas beta-9 a las que se alude frecuentemente como "Ck\beta-9". La invención se refiere también a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.
Las quimioquinas, a las que se alude también como citoquinas intercrinas, son una subfamilia de citoquinas estructural y funcionalmente relacionadas. Estas moléculas tienen un tamaño de 8-10 kd. En general, las quimioquinas ponen de manifiesto una homología del 20% al 75% al nivel de aminoácidos y están caracterizadas por cuatro restos de cisteína conservados que forman dos uniones disulfuro. Basado en la disposición de los dos primeros restos de cisteína, las quimioquinas han sido clasificadas en dos subfamilias, alfa y beta.. En la subfamilia alfa, las dos primeras cisteínas están separadas por un aminoácido y por tanto se alude a ella como la subfamilia "C-X-C". En la subfamilia beta, las dos cisteínas se encuentran en posiciones adyacentes y se alude a ellas, por consiguiente, como la subfamilia "C-C". Hasta ahora, se han identificados en los seres humanos por lo menos ocho miembros diferentes de esta familia.
Las citoquinas intercrinas ponen de manifiesto una amplia variedad de funciones. Una característica de contraste es su aptitud para atraer la emigración quimiotáctica de diferentes tipos de células, incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos T, basófilos y fibroblastos. Muchas quimioquinas poseen actividad pro-inflamatoria y están involucradas en muchas etapas que ocurren durante una reacción inflamatoria. Estas actividades incluyen la estimulación de la liberación de histamina, la liberación de la enzima lisosomal y de leucotrieno, la adherencia aumentada de células inmunitarias diana para células endoteliales, la unión intensificada de proteínas complemento, la expresión inducida de moléculas de adhesión de granulocitos y receptores complementarios, así como el esfuerzo respiratorio. Además de su implicación en la inflamación, ciertas quimioquinas han puesto de manifiesto que exhiben otras actividades. Por ejemplo, la proteína 1 inflamatoria de macrófagos (MIP-1) es capaz de suprimir la proliferación de células pluripotentes hematopoyéticas, el factor-4 de las plaquetas (PF.4) es un inhibidor potente del crecimiento de las células endoteliales, la interleuquina-3 (IL-8) favorece la proliferación de queratinocitos, y el GRO es un factor de crecimiento autocrino de las células de melanoma.
A la luz de las diversas actividades biológicas, no es sorprendente el que las quimioquinas hayan sido implicadas en numerosas condiciones fisiológicas y de enfermedad, incluyendo el tránsito de linfocitos, la curación de heridas, la regulación hematopoyética y trastornos inmunológicos tales como la alergia, el asma y la artritis.
Los miembros de la rama "C-C" ejercen efectos sobre las células siguientes: eosinófilos que destruyen parásitos acortando la infección parasítica y causando inflamaciones crónicas en las vías aéreas del sistema respiratorio; macrófagos que suprimen la formación de tumores en los vertebrados; y basófilos que liberan histamina que desempeña un papel importante en las inflamaciones alérgicas. Sin embargo, miembros de una rama pueden ejercer efecto sobre células que responden normalmente a la otra rama de las quimioquinas y, por tanto, no puede asignarse un papel preciso a los miembros de las ramas.
Aun cuando los miembros de la rama C-C actúan predominantemente sobre las células mononucleares y los miembros de la rama C-X-C actúan predominantemente sobre los neutrófilos, una propiedad quimioatrayente diferenciada no puede ser asignada a una quimioquina basándose en esta pauta. Algunas quimioquinas que proceden de una familia ponen de manifiesto características de la otra.
Los polipéptidos de la presente invención han sido identificados putativamente como Ck\beta-9 basándose en la homología de secuencias de aminoácidos.
Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos así como fragmentos biológicamente activos y útiles desde el punto de vista del diagnóstico o terapéutico, que poseen actividad de quimioquinas
C-C. El polipéptido de la presente invención es de origen humano.
Según otro aspecto de la presente invención se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de la presente invención, incluyendo mRNAs, DNAs, cDNAs y DNAs genómicos, así como también sus fragmentos biológicamente activos y útiles desde el punto de vista del diagnóstico o terapéutico.
Todavía, según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir tales polipéptidos mediante técnicas recombinantes que comprenden cultivar células huésped recombinantes procarióticas y/o eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención, en condiciones que favorecen la expresión de dicha proteína y la recuperación subsiguiente de dicha proteína.
Todavía según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tales polipéptidos o los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos con fines terapéuticos, por ejemplo, para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, enfermedades autoinmunitarias, psoriasis, asma, alergia, para regular la hematopoyesis y para favorecer la curación de heridas.
Según, todavía, un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptido.
Según, todavía, otro aspecto de la presente invención, se proporcionan antagonistas para tales polipéptidos, que pueden usarse para inhibir la ación de tales polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias crónicas, reacciones alérgicas que cursan con mediación de histamina, asma, artritis, fiebre independiente de prostaglandinas, fallo de la médula ósea, silicosis, sarcoidosis, síndrome hiper-eosinofílico e inflamación pulmonar.
Todavía, según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan también sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridarse específicamente con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención.
Aún, todavía, según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades relacionadas con la expresión del polipéptido y mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos.
Todavía, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, con fines in vitro relacionados con la investigación científica, la síntesis de DNA y la fabricación de vectores de DNA.
Estos y otros aspectos de la presente invención deben ser evidentes para los expertos en la técnica partiendo de las enseñanzas expuestas en esta memoria.
Los dibujos que siguen son ilustrativos de realizaciones de la invención y en modo alguno limitan el alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones.
La Figura 1 exhibe la secuencia de cDNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida, de la Ck\beta-9. Los 23 aminoácidos iniciales representan la secuencia conductora, de modo que el polipéptido maduro putativo comprende 111 aminoácidos. Se usa la abreviatura estándar de una letra para los aminoácidos.
La Figura 2 expone la homología de las secuencias de aminoácidos entre la Ck\beta-9 y el péptido maduro de eotaxina (fondo).
Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican los polipéptidos maduros que poseen las secuencias de aminoácidos deducidas, de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o el polipéptidos maduro codificado por el cDNA de los clones depositados como ATCC Deposit No. 75803, el 7 de Junio de 1994.
El polinucleótido que codifica la Ck\beta-9 fue descubierto en una biblioteca de cDNA derivada de un nódulo linfático de pulmón humano. La Ck\beta-9 está relacionada estructuralmente con la familia de las quimioquinas. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 134 restos de aminoácidos de los que aproximadamente los primeros 23 restos de aminoácidos son la secuencia conductora putativa, de modo que la proteína madura comprende 111 aminoácidos. La proteína exhibe el máximo grado de homología con la eotaxina con el 32% de identidad y un 69% de semejanza sobre una extensión de 75 restos de aminoácidos. Es importante también que los cuatro restos de cisteína conservados espacialmente en las quimioquinas, se encuentran en los polipéptidos de la presente inven-
ción.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma de RNA o en la forma de DNA, cuyo DNA incluye cDNA, DNA genómico y DNA sintético. El DNA puede ser de doble cadena o de una sola cadena, y si es de una sola cadena puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica los polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia codificante expuesta en la Figura 1 (SEQ ID No. 1) o la de los clones depositados, o puede ser una secuencia codificante diferente cuya secuencia codificante, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos maduros que el DNA de la Figura 1 (SEQ ID No. 1) o el cDNA depositado.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos maduros de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o los polipéptidos maduros codificados por el cDNA depositado, pueden incluir: solamente la secuencia codificante del polipéptido maduro; la secuencia codificante del polipéptido maduro y secuencia codificante adicional tal como una secuencia conductora o secretora, o una secuencia de proproteínas; la secuencia codificante del polipéptido maduro (y, opcionalmente, secuencia codificante adicional) y secuencia no codificante, tal como intrones o secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante de los polipéptidos maduros.
Así pues, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" incorpora un polinucleótido que incluye solamente la secuencia codificante para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencia codificante y/o no codificante, adicionales.
La presente invención se refiere, además, a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican fragmentos del polipéptido que poseen la secuencia de aminoácidos, deducida, de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o el polipéptido codificado por el cDNA de los clones depositados. La variante de los polinucleótidos puede ser una variante alélica natural de los polinucleótidos o una variante no natural de los polinucleótidos.
Por tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican los mismos polipéptidos maduros expuestos en la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o los mismos polipéptidos maduros codificados por el cDNA de los clones depositados, así como variantes de tales polinucleótidos, cuyas variantes codifican un fragmento de los polipéptidos de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o los polipéptidos codificados por el cDNA de los clones depositados. Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.
Como se ha indicado anteriormente, los polinucleótidos pueden poseer una secuencia codificante que es una variante alélica natural de la secuencia codificante expuesta en la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o de la secuencia codificante de los clones depositados. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.
La presente invención incluye también polinucleótidos en los que la secuencia codificante de los polipéptidos maduros puede estar fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia de polinucleótidos que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped, por ejemplo, una secuencia conductora que actúa como una secuencia secretora para regular el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia conductora es una preproteína y puede tener la secuencia conductora separada por la célula huésped, constituyendo la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también una preproteína que es la proteína madura más restos adicionales de aminoácidos del extremo 5'. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez separada la prosecuencia queda una proteína madura activa.
Así, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o una proteína que posee una prosecuencia o una proteína que posea una prosecuencia y una presecuencia (secuencia conductora).
Los polinucleótidos de la presente invención pueden tener también la secuencia codificante fusionada en el marco de lectura con una secuencia marcadora que permite la purificación de los polipéptidos de la presente invención. La secuencia marcadora puede estar constituida por una marca de hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 que proporciona la purificación de los polipéptidos maduros fusionados al marcador en el caso de un hospedante bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se emplea un hospedante mamífero, por ejemplo, células COS-7. La marca de HA corresponde a un epítopo que deriva de la proteína de hemaglutinina de la influenza (Wilson, I., et al., Cell 37:767 (1984)).
El término "gen" significa el segmento de DNA implicado en la producción de una cadena de un polipéptido; incluye regiones que preceden y que siguen a la región codificante (conductora y arrastrada) así como también secuencias que intervienen (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Fragmentos del gen completo de la presente invención, pueden ser usados como sonda de hibridación para una biblioteca de cDNA, para aislar el cDNA completo, así como aislar otros cDNAs que tengan una alta semejanza de secuencias con el gen o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo poseen, preferiblemente, al menos 10 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 ó más bases. La sonda puede usarse también para identificar un clon de cDNA que corresponde a un transcrito de longitud total y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo, con inclusión de regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un rastreo comprende aislar la región codificante del gen usando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Oligonucleótidos marcados que poseen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención, se usan para explorar una biblioteca de cDNA humano, DNA genómico o mRNA, para determinar qué miembros de la biblioteca se hibridan con la sonda.
La presente invención se refiere, además, a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias anteriormente descritas en esta memoria, si existe al menos 90% y más preferiblemente al menos 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se refiere, en particular, a polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con los polinucleótidos anteriormente descritos en esta memoria. Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "condiciones restrictivas" significa que la hibridación tendrá lugar solamente si hay por lo menos el 95% y de preferencia, por lo menos el 97%, de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos anteriormente descritos en esta memoria, en una realización preferida codifican polipéptidos que o bien retienen sustancialmente la misma función o bien la misma actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los cDNAs de la Figura 1 (SEQ ID NO:1) o el o los cDNAs depositados.
Alternativamente, el polinucleótido puede tener al menos 20 bases, preferiblemente 30 bases, y más preferiblemente, al menos 50 bases, que se hibridan con un polinucleótido de la presente invención y que posee identidad con él, como anteriormente se ha descrito, y que puede retener o no retener actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden ser empleados como sondas para el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, para la recuperación del polinucleótido o como sonda de diagnóstico o como un cebador de PCR.
Por tanto, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tienen por lo menos 90% y más preferiblemente, por lo menos 95%, de identidad con respecto a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2 así como fragmentos del mismo, cuyos fragmentos poseen por lo menos 30 bases y, preferiblemente, por lo menos 50 bases, y a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos.
El depósito o depósitos a que se hace referencia en esta memoria, están mantenidos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con fines de Procedimiento de Patentes. Estos depósitos se proporcionan simplemente como conveniencia para los expertos en la técnica y no son una admisión más que un depósito requerido bajo 35 U.S.C, párrafo 112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como también la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por ella, son reguladoras en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias que figuran en esta memoria. Puede requerirse una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y ninguna de tales licencias es otorgada por este medio.
La presente invención se refiere, además, a polipéptidos de quimioquina que poseen las secuencias de aminoácidos, deducidas, de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, así como fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos.
Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando hacen referencia a los polipéptidos de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o que están codificados por el cDNA depositado, significan polipéptidos que retienen esencialmente la misma función o actividad biológica que tales polipéptidos. Así, un análogo incluye una proproteína que puede ser activada por separación de la porción de preproteína, produciendo una polipéptido maduro activo.
Los polipéptidos de quimioquinas de las presente invención, pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos, preferiblemente polipéptidos recombinantes.
El fragmento, derivado o análogo de los polipéptidos de la Figura 1 (SEQ ID No. 2) o el codificado por el cDNA depositado, puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido conservado o sin conservar (de preferencia un resto de aminoácido conservado) y tal resto de aminoácido sustituido puede ser o puede no ser codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto que incrementa la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados con el polipéptido maduro, tal como una secuencia conductora o una secuencia secretora, o una secuencia que se emplea para purificar el polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos están, sin duda, dentro del alcance de los expertos en la técnica, partiendo de las enseñanzas de esta invención.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan, preferiblemente, en una forma aislada y de preferencia son purificados hasta homogeneidad.
El término "aislado" significa que el material ha sido separado de su medio ambiente original (por ejemplo, el medio ambiente natural si el material es natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía ser aislados dado que tal vector o composición no forma parte de su medio ambiente natural.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 (en particular el polipéptido maduro) así como también polipéptidos que tienen al menos un 70% de semejanza (preferiblemente al menos una identidad de 70%) respecto al polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y más preferiblemente, al menos 90% de semejanza (más preferiblemente, al menos 90% de identidad) con el polipéptido de la SEQ ID NO:2 y todavía más preferiblemente, por lo menos el 95% de semejanza (todavía más preferiblemente al menos el 95% de identidad) con respecto al polipéptido de la SEQ ID NO:2 e incluye también porciones de tales polipéptidos conteniendo, en general, tal porción del polipéptido al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente, al menos 50 aminoácidos.
Como se conoce en la técnica, la "semejanza" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutuos de aminoácidos conservados de un polipéptido, con la secuencia de un segundo polipéptido.
Pueden emplearse fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención para producir el correspondiente polipéptido completo mediante síntesis peptídica; por consiguiente, los fragmentos pueden ser empleados como intermedios para producir los polipéptidos completos. Pueden usarse fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención para sintetizar los polinucleótidos completos de la presente invención.
La presente invención se refiere también a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que son tratadas por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.
Células huésped son tratadas por ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral, unfago, etc. Las células huésped tratadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales, modificados según sea apropiado, para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de Ck\beta-9. Las condiciones de cultivo tales como temperaturas, pH y semejantes, son las empleadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos de habilidad ordinaria en la técnica.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en una cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de DNA cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivadas de SV40; plásmidos bacterianos; DNA fágico; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores que derivan de combinaciones de plásmidos y DNA fágico, DNA viral tal como vacunas, adenovirus, poxvirus aviar y pseudorrabia. No obstante, puede emplearse cualquier otro vector en tanto sea replicable y viable en el hospedante.
La secuencia de DNA apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos operatorios. En general, la secuencia de DNA se inserta en sitios apropiados de endonucleasas de restricción mediante procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros se estima que se encuentran dentro del alcance de los expertos en la técnica.
La secuencia de DNA en el vector de expresión está ligada operativamente a una secuencia o secuencias apropiadas del control de la expresión (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de tales promotores pueden citarse: el promotor LTR o el promotor SV40, el E. coli. lac o trp, el promotor fago lambda P_{L} y otros promotores que se sabe regulan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión contiene también un sitio de unión ribosómico para iniciar la traducción y un terminador de la transcripción. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, tales como dihidrofolato-reductasa o resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a la tetraciclina o la ampicilina en E. coli.
El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada según se ha descrito anteriormente aquí, así como un promotor apropiado o una secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un hospedante apropiado permitiendo que el hospedante exprese la proteína.
Como ejemplos representativos de hospedantes apropiados, pueden citarse células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como levadura; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, etc. La selección de un hospedante apropiado se considera que se encuentra dentro del alcance de los expertos en la técnica, a partir de las enseñanzas de esta memoria.
Más particularmente, la presente invención incluye también construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias tan ampliamente descritas anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el que ha sido insertada una de las secuencias de la invención, en una orientación hacia delante o a la inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende, además, secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, ligado operablemente a la secuencia. Numerosos vectores y promotores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y se encuentran disponibles en el comercio. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE.9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia). Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector en tanto sea replicable y viable en el hospedante.
Pueden seleccionarse regiones del promotor desde cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son el pKK232-8 y el pCM7. Promotores bacterianos especialmente nombrados incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp.. Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediato precoz, HSV timidina-quinasa, SV40 precoz y tardío, LTRs procedentes de retrovirus y metalotioneina-I del ratón. La selección del vector y promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de la habilidad ordinaria en la técnica.
En una realización posterior, la presente invención se refiere a células huésped que contienen las construcciones anteriormente descritas. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser efectuada mediante transfección de fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Las construcciones en células huésped pueden ser usadas de un modo convencional para obtener el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente mediante sintetizadores convencionales de péptidos.
Pueden expresarse proteínas maduras en células de mamífero, de levadura, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir tales proteínas usando RNAs que derivan de las construcciones de DNA de la presente invención. Vectores de clonación y expresión apropiados para usar con hospedantes procarióticos y eucarióticos, han sido descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).
La transcripción del DNA que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores resulta aumentada insertando en el vector una secuencia intensificadora. Los intensificadores son elementos de DNA de actuación cis, habitualmente desde aproximadamente 10 a 300 bp que actúan sobre un promotor intensificando sus transcripción. Como ejemplos se incluye el intensificador SV40 sobre el lado remoto del origen de replicación, bp 100 a 270, un intensificador de promotor precoz de citomegalovirus, el intensificador de poliomas sobre el lado remoto del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus.
En general, los vectores de expresión recombinantes incluyen orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 del S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado dirigiendo la transcripción de una secuencia estructural situada aguas abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque por calor, entre otros. La secuencia estructural heteróloga es montada en una fase apropiada con secuencias de iniciación de la traducción y de terminación, y, de preferencia, una secuencia conductora capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación del extremo N-terminal que comunica características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Se construyen vectores de expresión útiles para uso bacteriano insertando una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en una fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprende uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, proporcionar amplificación en el interior del hospedante. Los hospedantes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aun cuando pueden emplearse también otros como materia de elección.
Como un ejemplo representativo pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos que pueden obtenerse comercialmente, que comprenden elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, el pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y el pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "columna vertebral" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que ha de ser expresada.
Después de la transformación de una cepa del hospedante adecuada y del crecimiento de la cepa del hospedante hasta una densidad de células apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células son cultivadas durante un período de tiempo adicional.
Las células son recolectadas típicamente por centrifugación, quebrantadas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante retenido para su purificación posterior.
Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser quebrantadas por cualquier medio conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, quebrantamiento mecánico o el uso de agentes de lisis de células.. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Diversos sistemas de cultivo de células de mamífero pueden ser empleados también para expresar proteínas recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos del riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenden un origen de replicación, un promotor y un intensificador adecuados y también cualesquiera sitios de unión de ribosomas necesarios, sitios de poliadenilación, sitios de donante y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de flanqueo de 5' sin transcribir. Secuencias de DNA procedentes del corte y empalme de SV40, y sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos sin transcribir requeridos.
Los polipéptidos de Ck\beta-9 pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos de células recombinantes, por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Etapas de repliegue de proteínas pueden usarse, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado de modo natural, o un producto de procedimientos químicos de síntesis, o producidos mediante técnicas recombinantes partiendo de un hospedante procariótico o eucariótico (por ejemplo por células bacterianas, de levadura, de organismos vegetales superiores, de insecto o de mamífero en cultivo). Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden incluir también una resto de aminoácido inicial de metionina.
Los polipéptidos de Ck\beta-9 pueden ser empleados para inhibir la formación de colonias de células pluripotentes de la médula ósea como tratamiento protector adjunto durante la quimioterapia del cáncer y para la leucemia.
Los polipéptidos de quimioquina pueden usarse también para inhibir la proliferación de queratinocitos epidérmicos para el tratamiento de la psoriasis, que se caracteriza por hiperproliferación de queratinocitos.
Los polipéptidos de quimioquina pueden usarse también para tratar tumores sólidos al estimular la invasión y activación de células de defensa del hospedante, por ejemplo, células T citotóxicas y macrófagos. También pueden usarse para intensificar las defensas del hospedante frente a infecciones resistentes crónicas, por ejemplo, infecciones microbacterianas mediante la atracción y activación de leucocitos microbicidas.
Los polipéptidos de quimioquina pueden ser usados también para tratar enfermedades autoinmunitarias y leucemias linfocíticas, por inhibición de la proliferación de células T mediante la inhibición de la biosíntesis de IL2.
La Ck\beta-9 puede usarse también para la curación de heridas, mediante la captación de clarificación de desechos y de células inflamatorias que favorecen el tejido conjuntivo así como también mediante su control de fibrosis excesiva por mediación de TGF\beta. De este modo, la Ck\beta-9 puede usarse también para tratar otros trastornos fibróticos, incluyendo la cirrosis hepática, la osteoartritis y la fibrosis pulmonar.
Los polipéptidos de quimioquina incrementan también la presencia de eosinófilos que poseen la función distintiva de matar las larvas de parásitos que invaden tejidos, como en la esquistosomiasis, la triquinosis y la ascariasis.
También pueden usarse para regular la hematopoyesis, al regular la activación y diferenciación de diversas células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la médula ósea después de tratamiento de quimioterapia.
Los polinucleótidos y los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos pueden utilizarse también con fines in vitro relacionados con la investigación científica, la síntesis de DNA y la fabricación de vectores de DNA, así como para diseñar tratamientos terapéuticos y de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades humanas.
Fragmentos de los genes de Ck\beta.9 completos pueden ser usados como sonda de hibridación para una biblioteca de cDNA, para aislar el gen completo y aislar otros genes que poseen una alta semejanza de secuencia con el gen, o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo pueden tener, por ejemplo, entre 20 y 2000 bases. Preferiblemente, sin embargo, las sondas poseen entre 30 y 50 pares de bases. La sonda puede usarse también para identificar un clon de cDNA correspondiente a un transcrito completo y un clon o clones genómicos que contienen los genes completos incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un cribado comprende aislar la región codificante de los genes usando la secuencia de DNA conocida para llevar a cabo la síntesis de una sonda de oligonucleótido. Oligonucleótidos marcados que poseen una secuencia complementaria con la de los genes de la presente invención, se emplean para cribar una biblioteca de cDNA humano, DNA genómico o mRNA para determinar que miembros de la biblioteca se hibridan con la sonda.
Esta invención se refiere también al uso del gen de Ck\beta-9 como parte de un ensayo de diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácido nucleico de la Ck\beta-9. Tales enfermedades están relacionadas con la sub-expresión de los polipéptidos de quimioquina, por ejemplo, tumores y cánceres.
Los individuos que son portadores de mutaciones en el gen de Ck\beta-9 pueden ser detectados, al nivel de DNA, mediante una diversidad de técnicas. Pueden obtenerse ácidos nucleicos para diagnosis, de células de un paciente, tales como de sangre, orina, saliva, una biopsia de tejidos y material de autopsias. El DNA genómico puede usarse directamente para efectuar la detección o puede ser amplificado enzimáticamente usando PCR (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. También pueden usarse para el mismo fin RNA o cDNA. Como ejemplo, pueden emplearse cebadores de la PCR complementarios con el ácido nucleico que codifica la Ck\beta-9, para identificar y analizar mutaciones en la Ck\beta-9. Por ejemplo, pueden detectarse supresiones e inserciones mediante el cambio de tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas por hibridación de DNA amplificado, con RNA de Ck\beta-9 radiomarcado o, alternativamente, secuencias de DNA antisentido de Ck\beta-9 radiomarcado. Las secuencias perfectamente igualadas pueden diferenciarse de los duplexes desigualados mediante digestión con RNasa A o mediante diferencias en las temperaturas de fusión.
Un ensayo genético basado en diferencias de las secuencias de DNA puede ser conseguido por detección de alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles, con o sin agentes de desnaturalización. Pequeñas supresiones e inserciones en la secuencia pueden ser visualizadas mediante electroforesis de alta resolución en gel. Fragmentos de DNA de secuencias diferentes pueden diferenciarse sobre geles de gradiente de formamida de desnaturalización en los que las movilidades de fragmentos de DNA diferentes están retardadas en el gel en posiciones diferentes según sus temperaturas de fusión específicas o temperaturas de fusión parciales (véase, por ejemplo, la publicación de Myers et al., Sciende, 230:1242 (1985)).
Cambios en la secuencia en posiciones específicas pueden ser puestas de manifiesto también mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como protección de RNasa y S1 o el método de desdoblamiento químico (por ejemplo, Cotton et al., PNAS, EE.UU., 85:4397-4401 (1985)).
Por tanto, la detección de una secuencia de DNA específica puede ser conseguida por métodos tales como hibridación, protección de RNasa, desdoblamiento químico, secuenciación de DNA directa o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)) y transferencia Southern de DNA genómico.
Además de la electroforesis en gel y secuenciación de DNA, más convencionales, pueden detectarse también las mutaciones mediante análisis in situ.
La presente invención se refiere también a un ensayo de diagnóstico para detectar niveles alterados de proteína de Ck\beta-9 en tejidos diversos dado que una sobre-expresión de las proteínas en comparación con muestras de tejido normal que sirven de testigo, puede detectar la presencia de una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, un tumor. Los ensayos empleados para detectar niveles de proteína de Ck\beta-9 en una muestra que procede de un hospedante, son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos ELISA y ensayo "sandwich". Un ensayo ELISA (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1 (2), Capítulo 6, (1991)) comprende, inicialmente, preparar un anticuerpo específico para el antígeno de Ck\beta-9, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además se prepara un anticuerpo informador frente el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo informador se fija un reactivo detectable tal como radiactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima de peroxidasa de rábano picante. Se separa una muestra desde un hospedante y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, un disco de poliestireno, que fija a las proteínas de la muestra. Cualesquiera sitios de unión de proteínas libres del disco se cubren luego por incubación con una proteína inespecífica tal como albúmina de suero bovino. Seguidamente, se incuba el anticuerpo monoclonal del disco durante cuyo tiempo el anticuerpo monoclonal se fija a cualquier proteína de Ck\beta-9 fijadas al disco de poliestireno, Todo el anticuerpo monoclonal sin unir se lava con solución tampón. El anticuerpo informador ligado a la peroxidasa de rábano picante está colocado ahora en el disco dando como resultado la unión del anticuerpo informador al anticuerpo monoclonal unido a la Ck\beta-9. Después se lava el anticuerpo informador sin unir. Entonces se añaden al disco sustratos de peroxidasa y la intensidad del color que se desarrolla en un período de tiempo dado, es una medida de la cantidad de proteína de Ck\beta-9 presente en un volumen dado de muestra del paciente cuando se compara con una curva estándar.
Puede emplearse un ensayo de competición en el que anticuerpos específicos para Ck\beta-9 están fijados a un soporte sólido y Ck\beta-9 marcada y una muestra obtenida del hospedante se hacen pasar sobre el soporte sólido, y la cantidad de marcador detectada, por ejemplo, mediante cromatografía de centelleo líquido, puede correlacionarse con la cantidad de Ck\beta-9 existente en la muestra.
Un ensayo "sandwich" es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo "sandwich" se hace pasar Ck\beta-9 sobre un soporte sólido y se une a un anticuerpo fijado a un soporte sólido. Después un segundo anticuerpo se une a la Ck\beta-9. Un tercer anticuerpo que está marcado y que es específico para el segundo anticuerpo, se hace pasar luego sobre el soporte sólido y se une al segundo anticuerpo, pudiéndose cuantificar entonces una cantidad.
Esta invención proporciona un método de identificación de los receptores de polipéptidos de Ck\beta-9. El gen que codifica el receptor puede ser identificado mediante numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, "panning" de ligando y clasificación de FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). De preferencia, se emplea clonación de expresión en la que se prepara RNA poliadenilado a partir de una célula que responde a los polipéptidos, y una biblioteca de cDNA creada a partir de este RNA se divide en grupos ("pools") que se usan para transfectar células COS u otras células que no responden a los polipéptidos. Las células transfectadas, que se cultivan sobre portas de vidrio, se exponen a los polipéptidos marcados. Los polipéptidos pueden marcarse mediante muchos medios que incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica del sitio. Después de fijación e incubación, los portas son sometidos a análisis autorradiográfico. Se identifican los grupos positivos y se preparan subgrupos volviéndose a transfectar a transfectar usando un proceso iterativo de formación de subgrupos y selección, obteniendo finalmente un clon único que codifica el receptor putativo.
Como un enfoque alternativo para la identificación de receptores, los polipéptidos marcados pueden ser ligados por foto-afinidad con preparaciones de membranas celulares o preparaciones de extractos que expresen la molécula del receptor. El material reticulado es resuelto mediante análisis PAGE y expuesto a película de rayos x. El complejo marcado que contiene los receptores de los polipéptidos puede ser cortado, resuelto en fragmentos de péptidos y sometido a micro-secuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos que se obtiene de la micro-secuenciación pudiera usarse para diseñar un conjunto de sondas de olignucleótidos degeneradas para cribar una biblioteca de cDNA e identificar los genes que codifican los receptores putativos.
Esta invención proporciona un método de selección de compuestos para identificar agonistas y antagonistas de los polipéptidos de Ck\beta-9 de la presente invención. Un agonista es un compuesto que posee funciones biológicas similares a las de los polipéptidos, mientras que los antagonistas bloquean tales funciones. La quimiotaxis puede ser analizada colocando células, que son quimioatraídas por cualquiera de los polipéptidos de la presente invención, sobre la parte superior de un filtro con poros de suficiente diámetro para admitir las células (aproximadamente 5 \mum). Las soluciones de los agonistas potenciales se colocan en la parte inferior de la cámara con un medio de control apropiado en el compartimiento de la parte superior, y así se mide un gradiente de concentración del agonista contando las células que emigran hacia o a través de la membrana porosa a lo largo del tiempo.
Cuando se ensayan los antagonistas, los polipéptidos de la presente invención se colocan en la cámara de la parte inferior y se añade el antagonista potencial para determinar si se ha evitado la quimiotaxis de las células.
Alternativamente, una célula de mamífero o una preparación de membrana que expresan los receptores de los polipéptidos podría ser incubada con un polipéptido de Ck\beta-9 marcado, por ejemplo, con radiactividad, en presencia del compuesto. La aptitud del compuesto para bloquear esta interacción podría medirse entonces. Cuando se ensayan agonistas de este modo, las quimioquinas estarían ausentes y podría medirse la aptitud del propio agonista para interaccionar con el receptor.
Como ejemplos de antagonistas potenciales de la Ck\beta-9 se incluyen anticuerpos. Otro ejemplo de un antagonista potencial es un mutante de los polipéptidos, dominante, negativo. Los mutantes dominantes negativos son polipéptidos que se unen al receptor del polipéptido de tipo salvaje, pero que fallan en la retención de la actividad biológica.
Construcciones antisentido preparadas empleando tecnología de antisentido, son también antagonistas potenciales. Puede utilizarse tecnología de antisentido para regular la expresión génica mediante formación de triple hélice o DNA ó RNA antisentido, ambos de cuyos métodos se basan en la unión de un polinucleótido a DNA o RNA. Por ejemplo, la porción codificante de 5' de la secuencia de polinucleótidos que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de una longitud, aproximadamente, de 10 a 40 pares de bases. Un oligonucleótido es designado para ser complementario de una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, véase la publicación de Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando con ello la transcripción y la producción de los polipéptidos de quimioquina. El oligonucleótido de RNA antisentido se hibrida con el mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA en los polipéptidos (antisentido Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos pueden ser suministrados a células de tal modo que el RNA o DNA antisentido puede ser expresado in vivo inhibiendo la producción de la Ck\beta-9.
Los antagonistas pueden ser empleados para inhibir la quimiotaxis y la activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de células T, por ejemplo, células T citotóxicas activadas y CD8 y células matadoras naturales, en enfermedades auto-inmunitarias e inflamatorias crónicas e infecciosas. Como ejemplos de enfermedades autoinmunitarias se incluyen la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y la diabetes dependiente de insulina. Algunas enfermedades infecciosas incluyen silicosis, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática, al evitar la captación y activación de fagocitos mononucleares, el síndrome hiper-eosinofílico idiopático, al evitar la producción y emigración de eosinófilos y el choque endotóxico, al prevenir la emigración de macrófagos y su producción de los polipéptidos de quimioquina de la presente invención.
Los antagonistas pueden emplearse también para tratar la aterosclerosis, al evitar la infiltración de monocitos en la pared arterial.
Los antagonistas pueden emplearse también para tratar reacciones alérgicas que cursan con mediación de histamina y trastornos inmunológicos que incluyen reacciones alérgicas de fase tardía, urticaria crónica, y la dermatitis atópica, al inhibir la desgranulación, inducida por quimioquinas, de mastocitos y basófilos y la liberación de histamina. También pueden ser tratadas reacciones alérgicas que cursan con mediación de IgE, tales como el asma alérgico, las rinitis y los eczemas.
Los antagonistas pueden emplearse también para tratar inflamaciones agudas y crónicas, al evitar la atracción de monocitos hacia una zona de herida. También pueden emplearse para regular las poblaciones normales de macrófagos pulmonares, dado que las enfermedades inflamatorias pulmonares, agudas y crónicas, están asociadas con el secuestro de fagocitos mononucleares en el pulmón.
También pueden emplearse antagonistas para tratar la artritis reumatoide, al prevenir la atracción de monocitos hacia el fluido sinovial en las articulaciones de los pacientes. El influjo y la activación de los monocitos desempeña un papel importante en la patogénesis de las artropatías tanto degenerativas como inflamatorias.
Los antagonistas pueden emplearse también para interferir con las cascadas perjudiciales atribuidas, principalmente, a IL-1 y TNF, lo que evita la biosíntesis de otras citoquinas inflamatorias. De este modo, los antagonistas pueden ser empleados para evitar la inflamación. Los antagonistas pueden emplearse también para inhibir la fiebre, independiente de las prostaglandinas, inducida por quimioquinas.
Los antagonistas pueden emplearse también para tratar casos de fallo de la médula ósea, por ejemplo, la anemia aplástica y el síndrome mielodisplástico.
Los antagonistas pueden usarse también para tratar el asma y la alergia, al evitar la acumulación de eosinófilos en el pulmón.
Los antagonistas pueden emplearse también para tratar las fibrosis de la membrana de basamento subepitelial, que es una faceta característica del pulmón asmático.
Los antagonistas pueden ser empleados en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, según se describe más adelante en esta memoria.
Los polipéptidos y agonistas y antagonistas de la Ck\beta-9 pueden ser empleados en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico, del polipéptido, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, aun cuando no está limitado a ellos, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerina, etanol, y sus combinaciones. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
La invención proporciona también un envase farmacéutico o kit que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. En asociación con tal recipiente o recipientes puede haber una nota de la forma prescrita por una agencia gubernamental regulando la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, cuya nota refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración humana. Además, los polipéptidos y agonistas y antagonistas pueden ser empleados en conjunción con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas de un modo conveniente tal como mediante las vías tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de la indicación específica. En general, los polipéptidos se administrarán en una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/ kg de peso y, en la mayor parte de los casos, se administrarán en una cantidad no en exceso de aproximadamente 8 mg/kg de peso por día. En la mayoría de los casos la dosis es desde aproximadamente 10 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso por día, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc.
Los polipéptidos de Ck\beta-9, y agonistas o antagonistas que son polipéptidos, pueden emplearse según la presente invención por expresión de tales polipéptidos in vivo, a lo que se alude frecuentemente como "terapia génica".
Así, por ejemplo, células procedentes de un paciente pueden ser tratadas por ingeniería genética con un polinucleótido (DNA o RNA) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionándose luego las células tratadas a un paciente que ha de ser tratado con el polipéptido. Tales métodos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas por ingeniería genética mediante procedimientos operatorios conocidos en la técnica, mediante el uso de una partícula retroviral que contiene RNA que codifica un polipéptido de la presente invención.
De modo semejante, las células pueden tratarse por ingeniería genética in vivo, para la expresión de un polipéptido in vivo, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica una célula productora que produzca una partícula retroviral que contiene RNA que codifica el polipéptido de la presente invención, puede ser administrada a un paciente para el tratamiento por ingeniería genética de células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos de administración de un polipéptido de la presente invención mediante tal método, deben ser evidentes para los expertos en la técnica, a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para el tratamiento de ingeniería genética de células puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que puede ser usado para tratar por ingeniería genética células in vivo después de combinar con un vehículo de distribución apropiado.
Las secuencias de la presente invención son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia tiene específicamente como objetivo y puede hibridarse con una posición particular sobre un cromosoma humano individual. Además, existe la necesidad actual de identificar sitios particulares sobre los cromosomas. Algunos pocos reactivos que marcan cromosomas, que se basan en datos de secuencias reales (polimorfismos repetidos) se encuentran disponibles en la actualidad para marcar posiciones en los cromosomas. La elaboración de mapas de DNAs para cromosomas, según la presente invención, es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con genes asociados con enfermedades.
En breve, pueden elaborarse mapas de las secuencias para cromosomas preparando cebadores de la PCR (preferiblemente 15-25 bp) a partir del cDNA. Se utiliza análisis por ordenador de la región 3' sin traducir para seleccionar rápidamente cebadores que no se extiendan más de un exón en el DNA genómico, lo que complica así el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan luego para seleccionar por PCR híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solamente aquellos híbridos que contienen el gen humano que corresponde al cebador, pueden proporcionar un fragmento amplificado.
La elaboración de mapas por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótidos, puede conseguirse sublocalización con paneles de fragmentos procedentes de cromosomas específicos o conjuntos (pools) de clones genómicos grandes de un modo análogo. Otras estrategias de elaboración de mapas que pueden usarse similarmente para establecer el mapa de su cromosoma, incluye hibridación in situ, preselección con cromosomas marcados clasificados por flujo y preselección por hibridación para construir bibliotecas de cDNA específicas de cromosomas.
Hibridación in situ por fluorescencia (FISH) de clones de cDNA hasta una dispersión cromosómica de metafase, puede ser usada para proporcionar una localización cromosómica precisa, en una etapa. Esta técnica puede ser usada con un cDNA tan corto como 50 ó 60 bases. Para llevar a cabo una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).
Una vez elaborado el mapa de una secuencia par una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con los datos de mapas genéticos. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en la publicación de V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea por medio de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación existente entre genes y enfermedades, de los que se ha realizado la elaboración de mapas de la misma región cromosómica, se identifica después mediante análisis de segregación (coherencia de genes físicamente adyacentes).
Seguidamente, es necesario determinar las diferencias existentes en el cDNA o la secuencia genómica entre individuos afectados y sin afectar. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.
Con la resolución actual de las técnicas físicas de elaboración de mapas y de elaboración de mapas genéticos, un cDNA localizado con precisión, correspondiente a una región cromosómica asociada con la enfermedad, podría ser uno de entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto supone una resolución en la elaboración de mapas de 1 megabase y un gen por 20 kb).
Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o sus análogos, o células que los expresan, pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos para ellos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención incluye también anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Diversos procedimientos operatorios conocidos en la técnica pueden ser utilizados para producir tales anticuerpos y fragmentos.
Anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención, pueden ser obtenidos por inyección directa de los polipéptidos en un animal o por administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo obtenido de este modo puede unirse después al propio polipéptido. De este modo, puede usarse incluso una secuencia que codifique solamente un fragmento de los polipéptidos, para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos totales. Tales anticuerpos pueden usarse luego para aislar el polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido.
Para preparar anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Como ejemplos, se incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células-B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma del EBV, para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96).
Las técnicas descritas para producir anticuerpos de una sola cadena (patente de EE.UU. 4.946.778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de una sola cadena para los productos polipeptídicos inmunógenos de esta invención. Asimismo, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para los productos polipeptídicos inmunógenos de esta invención.
La presente invención será descrita adicionalmente con referencia a los ejemplos que siguen; sin embargo, ha de comprenderse que la presente invención no se limita a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique de otro modo, son en peso.
Con objeto de facilitar la comprensión de los ejemplos que siguen, se describen ciertos métodos y/o términos y expresiones que se presentan con frecuencia.
Los "plásmidos" son designados por la letra minúscula p precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida que figuran aquí o bien son obtenibles comercialmente, se encuentran a disposición del público sin restricción, o pueden ser construidos a partir de plásmidos obtenibles según procedimientos operatorios publicados. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes para los expertos de habilidad ordinaria en la misma.
"Digestión" de DNA se refiere a la escisión del DNA con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias del DNA. Las diversas enzimas de restricción usadas en esta invención pueden obtenerse comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como podrían conocer los expertos en la técnica. Para fines analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o de fragmento de DNA con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Con la finalidad de aislar fragmentos de DNA para construir plásmidos, se digieren, típicamente, 5 a 50 \mug de DNA con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Soluciones tampón y cantidades de sustratos apropiadas para enzimas de restricción particulares, son especificadas por el fabricante. Se usan ordinariamente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero estos tiempos pueden variar según las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la mezcla de reacción se somete a electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se lleva a cabo usando el gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel. D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).
"Oligonucleótidos" hace referencia o bien a un polidesoxinucleótido de una sola cadena o a dos cadenas de polioxinucleótido complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato en 5' y por tanto no se ligan a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético puede ligarse con un fragmento que no haya sido desfosforilado.
"Ligación" alude al proceso de formación de uniones fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T., et al., Id., página 146). A menos que se indique de otro modo, puede conseguirse ligación usando soluciones tampón y condiciones conocidas, con 10 unidades para DNA ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA que han de ser ligados.
A menos que se establezca de otro modo, la transformación fue realizada según ha sido descrito en el método de Graham, F y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).
Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de Ck\beta-9
La secuencia de DNA que codifica la Ck\beta-9, ATCC No. 75803, se amplifica inicialmente usando cebadores de oligonucleótidos por PCR correspondientes a las secuencia de los extremos 5' y 3' del gen de Ck\beta-9 procesado (menos la secuencia putativa del péptido señal). Nucleótidos adicionales correspondientes a la Ck\beta-9 se añadieron, respectivamente, a las secuencias de los extremos 5' y 3'. El cebador de oligonucleótido de 5' tiene la secuencia 5' CCCGCATGC GTGATGGAGGGGCTCAG 3' (SEQ ID No. 3), contiene un sitio de enzima de restricción SphI (negrita) seguido de 17 nucleótidos de la secuencia codificante de Ck\beta-9 (subrayado) partiendo del segundo nucleótido de las secuencias que codifica la proteína madura. El codón ATG está incluido en el sitio SphI. En el siguiente codón que sigue al ATG, la primera base es desde el sitio SphI y las dos bases restantes corresponden a la segunda y tercera bases del primer codón) (resto S_{24}) de la proteína madura putativa. Como consecuencia, la primera base de este codón está cambiada desde A a C en comparación con la secuencia original, lo que da como resultado una sustitución de S a R en la proteína recombinante. La secuencia de 3', 5' AAAGGATCCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTGA 3' (SEQ ID No. 4) contiene secuencias complementarias a un sitio BamH1 (negrita) y va seguida por 21 nucleótidos de secuencias específicas del gen que preceden al codón de terminación. Los sitios de enzima de restricción se corresponden con los sitios de enzima de restricción sobre el vector de expresión bacteriana pQE-70 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). El pQE-70 codifica resistencia a antibióticos (Amp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un operador de promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión de ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios de enzimas de restricción. El pQE-70 se somete a digestión luego con SphI y BamH1. Las secuencias amplificadas se ligan en el pQE-9 y se insertan en el marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se usa luego para transformar la cepa de E. coli M15/rep4 (Quiagen, Inc.) mediante el procedimiento operatorio descrito por Sambrook, J. et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprinh Laboratory Press (1989). M15/rep4 contiene muchas copias del plásmido pREP4, que expresa el represpr lacI y que también comunica resistencia a la kanamicina (Kan'). Se identifican transformantes por su aptitud parta crecer en placas de LB y se seleccionan colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla DNA plasmídico y se confirma mediante análisis de restricción. Clones que contienen las construcciones deseadas son cultivados durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio de LB suplementado con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml). El cultivo de O/N se usa para inocular un cultivo grande en una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se hacen crecer hasta una densodad óptica 600 (O.D.^{600}) de entre 0,4 y 0,6.. Después se añade IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranosido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce por inactivación el represor lacI, clarificando el P/O que conduce a expresión génica aumentada. Se cultivan las células un período de tiempo extra de 3 a 4 horas. Las células se recolectan después mediante centrifugación. El glóbulo de células se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar, pH 5,0. Después de clarificación, la Ck\beta-9 es purificada partiendo de esta solución por cromatografía sobre una columna de quelato de níquel, en condiciones que permiten la fijación estricta por proteínas que contienen la etiqueta 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La Ck\beta-9 ((>98% de pureza) se eluye desde la columna en guanidina. HCl 6M. La renaturalización de proteínas sin GnHCl puede conseguirse mediante distintos protocolos (Jaenicke, R y Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, Nueva York (1990)).. Inicialmente, se utiliza una etapa de diálisis para separar el GnHCl. Alternativamente, la proteína purificada aislada desde la columna de quelato de níquel puede unirse a una segunda columna sobre la que se hace actuar un gradiente lineal descendente de GnHCl, La proteína se deja renaturalizar mientras está unida a la columna y seguidamente se eluye con una solución tampón que contiene Imidazol 250 mM, NaCl 150 mM, Tris.HCl 25 mM, pH 7,5, y glicerina al 10%. Finalmente, la proteína soluble se dializa frente a una solución tampón de almacenamiento que contiene bicarbonato de amonio 5 mM.
Ejemplo 2 Expresión de Ck\beta-9 recombinante en células COS
La expresión de plásmido, Ck\beta-9 Ha es derivada desde un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a la ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor CMV seguido de una región de poliengarce, un intrón de SV40 y sitio de poliadenilación. Un fragmento de DNA que codifica el precursor de Ck\beta-9 entero y una etiqueta tag fusionada en el marco para su extremo 3', es clonado en la región de poliengarce del vector; por tanto, la expresión de la proteína recombinante está dirigida bajo el promotor CMV. La etiqueta HA corresponde a un epítopo que deriva de la proteína de hemaglutinina de la influenza, según ha sido descrito anteriormente (I. Wilson, H. Nima, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La infusión de la etiqueta HA a la proteína diana permite una detección fácil de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconozca el epítopo HA.
La estrategia de construcción del plásmido se describe del modo siguiente:
La secuencia de DNA que codifica la Ck\beta-9, ATCC no- 75803, se construye mediante PCR usando dos cebadores: el cebador de 5' 5' AAAGGATCCAGACATGGCTCAGTCACT 3' (SEQ ID No. 5) contiene un sitio BamH1 seguido de 18 nucleótidos de secuencia codificante de Ck\beta-9, partiendo del codón de iniciación; la secuencia de 3' 5' CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGGCCCTTTAGGGGTCTG 3' (SEQ ID No. 6) contiene secuencias complementarias al sitio XbaI, codón de terminación de la traducción, etiqueta HA y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificante de Ck\beta-9 (sin incluir el codón de terminación). Por consiguiente, el producto de la PCR contiene un sitio BamH1, secuencia codificante de Ck\beta-9 seguida de la etiqueta HA fusionada en el marco, un codón de terminación de la traducción a continuación de la etiqueta HA y un sitio XbaI. El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, son sometidos a digestión con enzima de restricción BamH1 y XbaI y ligados. La mezcla de ligación es transformada en la cepa de E. coli SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se deposita en placas con medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. Se aísla DNA plamídico de los transformantes y se examinan mediante análisis de restricción para detectar la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la Ck\beta-9 recombinante, se transfectan células COS con el vector de expresión mediante el método de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989)). La expresión de la proteína de Ck\beta-9 HA se detecta mediante radiomarcado y el método de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células son marcadas durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Los medios de cultivo se recogen luego y las células son sometidas a lisis con detergente (solución tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). El lisado de las células y los medios de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizan mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 3 Expresión vía terapia génica
Se obtienen fibroblastos de un sujeto mediante biopsia de la piel. El tejido que resulta se coloca en un medio de cultivo de tejidos y se separa en fragmentos pequeños. Pequeños pedazos del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un frasco de cultivo de tejidos, colocándose en cada frasco diez pedazos aproximadamente. El frasco se vuelve la parte de arriba hacia abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Al cabo de 24 horas a temperatura ambiente se invierte el frasco y los pedazos de tejido permanece fijados al fondo del frasco y se añade medio de nueva aportación (por ejemplo, medio de Ham F12 con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina. El conjunto se incuba después a 37ºC durante una semana aproximadamente. Al cabo de este tiempo, se añade medio de nueva aportación y seguidamente se cambia cada varios días. Después de un período de tiempo adicional de dos semanas en cultivo, emerge un monocapa de fibroblastos. La monocapa es tripsinizada y extrapolada a frascos mayores.
pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney, se somete a digestión con EcoRI e HindIII y seguidamente se trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona sobre gel de agarosa y se pirifica usando bolas de vidrio.
El cDNA que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica usando cebadores de PCR que corresponden, respectivamente, a las secuencias de los extremos 5' y 3'. El cebador de 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador de 3' incluye además un sitio HindIII. Cantidades iguales de la cadena principal lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento amplificado de EcoRI e HindII se añaden juntos, en presencia de DNA ligasa T4. La mezcla que resulta se mantiene en condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usa para transformar bacterias HB101, que después se depositan en placas sobre agar que contiene kanamicina con el fin de confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado apropiadamente.
Las células anfotrópicas de empaquetamiento de pA317 o GP+am12 se hacen crecer en cultivo de tejidos hasta densidad confluente, en medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de ternera (CS) al 10%, penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se añade luego al medio y las células de empaquetamiento son transducidas con el vector. Las células de empaquetamiento producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (se alude ahora a las células de empaquetamiento como las células productoras).
Se añade medio de nueva aportación a las células productoras transducidas y seguidamente se recolecta el medio desde una paca de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para separar las células productoras desprendidas y este medio se usa luego para infectar células de fibroblastos. Se separa el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y rápidamente se reemplaza con el medio procedente de las células productoras. Este medio es separado y reemplazado con medio de nueva aportación. Si el título de virus es alto, entonces, virtualmente todos los fibroblastos están infectados y no se requiere selección Si el título es muy bajo, entonces es necesario usar un vector retroviral que posea un marcador seleccionable, tal como neo o his.
Los fibroblastos transformados por ingeniería son inyectados luego en el hospedante, o bien solos o después de haber sido cultivados hasta confluencia sobre glóbulos de microsoporte cytodex 3. Los fibroblastos dan lugar ahora al producto de proteína.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE: LI, ET AL.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Quimioquina humana beta-9
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN CECCHI, STEWART Y OLSTEIN
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6 BECKER FARM ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ROSELAND
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NEW JERSEY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 07068
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: DISQUETE DE 8,8 CM (3,5 PULGADAS)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS - DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: COINCIDENTEMENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.134
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800-434
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 201-994-1700
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 201-994-1744
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 405 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: UNA SOLA CADENA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: UNA SOLA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGCATGCG TGATGGAGGG GCTCAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: UNA SOLA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGATCCT GGCCCTTTAG GGGTCTGTGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: UNA SOLA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGATCCA GACATGGCTC AGTCACT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: ÚNICA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTCG TATGGGTATG GCCCTTTAGG GGTCTG 
\hfill
56

Claims (19)

1. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo que consta de
(a)
polinucleótidos que codifican el polipéptido que comprende el aminoácido - 23 hasta el aminoácido 111, según se expone en SEQ ID NO: 2;
(b)
polinucleótidos que codifican el polipéptido que comprende el aminoácido 1 hasta el aminoácido 111, según se expone en SEQ ID NO:2;
(c)
polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 desde el nucleótido 1 hasta el 405;
(d)
polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1, desde el nucleótido 70 hasta el 405;
(e)
polinucleótidos que codifican el polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el cDNA contenido en ATCC 75803;
(f)
polinucleótidos que poseen la secuencia codificante del cDNA contenido en ATCC 75803 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;
(g)
polinucleótidos que codifican un fragmento de al menos 30 aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido según una cualquiera de (a) a (f);
(h)
polinucleótidos cuya cadena complementaria se hibrida con y que es por lo menos 90% idéntica a un polinucleótido según se define en una cualquiera de (a) a (g) y que codifican un polipéptido que posee actividad de quimioquina C-C;
(i)
polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido según una cualquiera de (a) a (f), en donde dicho fragmento retiene actividad de quimioquina C-C;
o la cadena complementaria de un polinucleótido tal.
2. El polinucleótido según la reivindicación 1 que es DNA.
3. Un vector que contiene el polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.
4. El vector según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido está ligado operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células huésped procarióticas o eucarióticas.
5. Una célula huésped transformada por ingeniería genética con el polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2 o con el vector según la reivindicación 3 ó 4.
6. Un procedimiento para producir un polipéptido que posee actividad de quimioquina C-C, que comprende: cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 y recuperar desde el cultivo el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.
7. Un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido que posee actividad de quimioquina C-C, que comprende tratar células por ingeniería genética con el vector según la reivindicación 3 ó 4.
8. Un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, u obtenible mediante el procedimiento según la reivindicación 6.
9. Un anticuerpo contra el polipéptido según la reivindicación 8.
10. Un antagonista/inhibidor contra el polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicho antagonista/inhibidor es un anticuerpo según la reivindicación 9 o una construcción antisentido.
11. Una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente con un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.
12. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, el polipéptido según la reivindicación 8, el anticuerpo según la reivindicación 9 ó 19, o el antagonista/inhibidor según la reivindicación 1 y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
\newpage
13. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2 o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11.
14. El uso del polipéptido según la reivindicación 8, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento protector durante la quimioterapia del cáncer y para la leucemia, para el tratamiento de la psoriasis, tumores sólidos, enfermedades autoinmunitarias, leucemia linfocítica, trastornos fibróticos, curación de heridas, para la defensa contra infecciones crónicas resistentes, para matar larvas de parásitos o para la regulación de la hematopoyesis.
15. El uso del polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la psoriasis, tumores sólidos, enfermedades autoinmunitarias, infecciones crónicas, asma, alergia, para favorecer la curación de heridas o para la regulación de la hematopoyesis.
16. El uso del anticuerpo según la reivindicación 9 ó 19 o el antagonista/inhibidor según la reivindicación 10, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la artritis reumatoide, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias crónicas y agudas, y enfermedades infecciosas.
17. Un método in vitro para diagnosticar si una enfermedad está relacionada con una mutación en el polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, o en el polipéptido según la reivindicación 8, cuyo método comprende:
(a)
determinar las diferencias en las secuencias del polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2, ó el polipéptido según la reivindicación 8, entre individuos que tienen o que no tienen una enfermedad; y
(b)
identificar una mutación observada en individuos que tienen una enfermedad pero no en individuos que no tienen una enfermedad, como agente causante de la enfermedad.
18. Un procedimiento in vitro para analizar la presencia del polipéptido según la reivindicación 8, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra con el anticuerpo según la reivindicación 9, en condiciones que permitan la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido; y
(b)
detectar el anticuerpo unido de este modo, determinando con ello la presencia del polipéptido según la reivindicación 8.
19. El anticuerpo según la reivindicación 9, que es policlonal, monoclonal, quimérico, de una sola cadena, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo humanizado, o un fragmento Fab.
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