ES2235346T3

ES2235346T3 - Composicion para la reduccion del mal olor que comprende una lacasa.

Info

Publication number: ES2235346T3
Application number: ES98937422T
Authority: ES
Inventors: Rie Tsuchiya; Bent Riber Petersen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: CA2300372A1; CN1136309C; US6080391A; EP1007644B1; JP2001514881A; ATE284953T1; AU746146B2; AU8623498A; CN1269828A; DE69828175D1; DE69828175T2; EP1007644A1; WO1999009143A1

Abstract

Composición para la reducción del mal olor que comprende (I) una lacasa derivada de Mycelíophthora thermophila, y (II) un mediador seleccionado del grupo que se compone de ácido clorogénico y ácido cafeico y ésteres derivados, y extracto de té Oolong.

Description

Composición para la reducción del mal olor que comprende una lacasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una lacasa derivada de Myceliopthora thermophila para la eliminación del mal olor, a una composición de reducción del mal olor, y a productos que comprenden una composición de la invención.

Antecedentes de la invención

Se ha establecido generalmente que el mal olor puede ser provocado por varios compuestos, como los compuestos de azufre volátil (VSC), los compuestos que contienen nitrógeno, los ácidos grasos cortos, etc.

Compuestos de azufre volátil (VSC) Mal aliento

El mal olor en forma de mal aliento que emana de la cavidad bucal es normalmente consecuencia de compuestos de azufre volátil (VSC). Los VSCs son producidos por las bacterias gram-positivas anaeróbicas orales debido a la degradación de los sustratos proteínicos que contienen azufre en la salvia. Los VSCs son liberados en el espacio bucal donde se mezclan con el aire espirado desde los pulmones, dando como resultado un olor desagradable que sale de la boca. Los sustratos proteínicos anteriormente mencionados pueden deberse a la ingesta de alimentos, como carne, pescado, especies, verduras, productos lácteos, etc. Los compuestos de azufre volátil, como por ejemplo el dialil sulfuro (un tioéter), pueden encontrarse p. ej. en el ajo, que es muy conocido por provocar un mal aliento repelente.

Sabor a quemado

Cuando se tratan con calor determinados alimentos, como la leche en el tratamiento UHT, puede aparecer un sabor a "quemado" provocado por los compuestos de sulfuro volátil.

Ejemplos de VSCs son sulfuro de hidrógeno (H_{2}S), dimetil sulfuro (CH_{3}SCH_{3}), dialil sulfuro, y el que es considerado como el metil mercaptano (CH_{3}SH) más potente, también llamado metanotiol.

Compuestos que contienen nitrógeno

Los compuestos que contienen nitrógeno, como amonio, indol, escatol y varias aminas, son también muy conocidos por originar mal olor. Una amina como la trimetilamina origina un olor a pescado.

Pañales y similares

Una fuente de compuestos que contienen nitrógeno son la orina, las heces y la sangre, que originan un mal olor conocido por la mayoría de la gente ya sea por los pañales sucios o por otros productos higiénicos, como productos para la incontinencia en adultos, pañales de aprendizaje, compresas, tampones y similares.

El mal olor que viene de los pañales y similares es normalmente consecuencia del crecimiento de bacterias, especialmente Escherichia coli, Enterococcus faecalis y Proteus mirabilis, presentes en la piel en el perineo (la región entre el ano y los órganos sexuales externos). Todas las cepas de Proteus forman la enzima ureasa durante su metabolismo. La ureasa tiene la capacidad de descomponer rápidamente la urea (que constituye aproximadamente un 2% de la orina humana) en amonio, provocando un olor desagradable.

Ácidos grasos cortos

Los ácidos grasos cortos, como el ácido butírico (C4), son también conocidos por producir un mal olor. Después de haber usado los zapatos durante todo un largo día de calor, la mayoría de la gente conoce el mal olor de la transpiración de los pies provocada por los ácidos grasos cortos, como el ácido butírico.

Además, la ropa lavada con un detergente que comprende una lipasa a veces tiene un olor poco atractivo que se asemeja al olor de las babas de los bebés. Se cree que este mal olor surge cuando el producto de la degradación de la lipasa de la suciedad que contiene triglicéridos en el tejido no es completamente eliminado durante el ciclo de lavado o de enjuague. Dicho producto de degradación consiste en ácidos grasos libres cortos (p. ej. ácido butírico).

Eliminación o reducción del mal olor

Diversos agentes y sistemas de control del olor han sido descritos en la bibliografía. Por ejemplo, el carbono es muy conocido, p. ej. en forma de carbón activo, por su capacidad para adsorber moléculas odoríferas.

La patente US nº. 5,593,398 expone ropa interior protectora con un filtro para gases malolientes que comprende carbón activo como agente de control del mal olor.

Se ha observado que los materiales zeolíticos son efectivos contra el mal olor asociado a los fluidos corporales.

La solicitud de patente JP nº 02068117 se refiere a medios de desodorización, p. ej. para pañales, que contienen zeolita, cobre y carbón activo.

La patente US nº 4,026,814 se refiere a un jabón con menor tendencia a generar malos olores durante el almacenamiento. El jabón comprende un sistema de enzimas que contiene una enzima oxido-reductasa, como alcohol dehidrogenasa y/o aldehído-dehidrogenasa, y un aceptador de hidrógeno seleccionado del grupo de nicotinamida-adenina-dinucleótido y/o fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido.

La solicitud de patente JP nº 9038183 (Takasago Perfumery Co Ltd.) se refiere a una composición desodorante capaz de eliminar el olor del mal aliento, los refrigeradores, animales domésticos, etc. La composición comprende compuestos fenólicos y una enzima que oxida los compuestos fenólicos. Como compuestos fenólicos preferidos se mencionan los compuestos difenólicos siguientes: catecol, compuestos de catequina, tirosina y ácido clorogénico. Tirosinasa, peroxidasa, glucosa oxidasa, y lacasa se mencionan como enzimas oxidantes. Las enzimas preferidas son de origen fúngico, pertenecientes a Agrinus bisporus var. albidus y Boletus pulverulentus. o de frutas, como manzana, pera (gobou).

La patente US nº 3,903,259 se refiere un método de desodorización de pañales y excrementos humanos que comprende la aplicación a los pañales o a los excrementos de una composición química, que en su forma más simple consiste en un material ácido, un material antibiótico, y un solvente. La composición de impregnación puede también contener un agente quelante y un agente humectante. El tratamiento de los pañales da como resultado una reducción notable de los olores ofensivos de los excrementos, haciendo por tanto que el cambio de los pañales manejados sea menos desagradable.

La patente US nº 3,935,862 expone un pañal desechable que comprende un medio para inhibir la formación de amonio, el cual incluye un compuesto de ácido aminopolicarboxílico en una cantidad de al menos 0.001 g por pulgada cuadrada.

La patente US nº 4,385,632 se refiere a un cuerpo absorbente germicida para recoger sangre, heces y orina, el cual contiene una sal cúprica hidrosoluble que impide el crecimiento bacteriano, previene la descomposición de la urea en amonio y amonio de enlaces complejos con el fin de evitar la incidencia de un olor desagradable.

La patente US nº 4,551,187 describe una composición de limpieza desodorante para el cuerpo en forma de un líquido o barra opaca sólida, que comprende un detergente y un carbohidrato específico capaz de reducir la población bacteriana que causa el olor en el cuerpo (piel y/o pelo), sin usar antimicrobiales. Los agentes desodorantes esenciales, que son un grupo de carbohidratos eficaces específicamente contra las bacterias de la piel y/o pelo que provocan el olor, son manosa, glucosa, y oligómeros de las mismas, es decir dímeros, trímeros y tetrámeros.

La patente US nº 5,395,555 se refiere a una composición de limpieza acuosa para alfombras, alfombrillas y textiles, particularmente útil para la reducción del mal olor de las manchas de orina. La composición comprende a) de aproximadamente un 4.23% a aproximadamente un 4.28% en peso de una sal de sodio o potasio de un ácido dietilenotriaminopentaacético, un ácido etilenodiaminatetraacético, un ácido N-hidroxietiletilenodiaminotriacético, o mezclas de los mismos; b) de aproximadamente un 1.95% a aproximadamente un 2.05% en peso de un ácido dietilenotriaminopentaacético, un ácido etilenodiaminatetraacético, un ácido N-hidroxietiletilenodiaminotriacético, o una mezcla de los mismos; c) de aproximadamente un 0.82% a un 0.98% de un lauril sulfato de sodio; d) de aproximadamente un 0.49% a un 0.59% en peso de un copolímero de acrilato de la fórmula CF_{3} (CF_{2})n CH_{2} OCOC(CH_{3})=CH_{2} donde N es de 6 a 8; e) de aproximadamente un 0.22% a aproximadamente un 0.27% en peso de un octilfenoxipolietoxi etanol; f) de aproximadamente un 0.35% a aproximadamente un 0.5% en peso de aroma; y g) de aproximadamente un 0.00003% a aproximadamente un 0.05% en peso de un conservante 1,2-benzoisotiazol-3(2H)-onas.

Resumen de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones mejoradas capaces de reducir el mal olor y productos que comprenden tales composiciones.

En un primer aspecto, la invención se refiere al uso de una lacasa derivada de Myceliopthora thermophila en combinación con un mediador seleccionado del grupo que se compone de ácido clorogénico, ácido cáfrico y ésteres derivados y extracto de té Oolong para la reducción del mal olor.

Además la invención se refiere a un producto que comprende una composición de la invención. Los productos contemplados incluyen productos para el cuidado bucal, productos higiénicos, productos para la eliminación del sabor a quemado, productos sanitarios y detergentes, como detergentes de lavado sólidos y líquidos.

Breve descripción de las tablas y dibujos

Figura 1 muestra un cromatograma GC de control antes de la reacción de la enzima, (sin enzima, sin PPT). El valor máximo 1.28-1.61 indica la presencia de metanotiol (CH_{3}SH).

Figura 2 muestra un cromatograma GC obtenido después de la reacción con la enzima y el PPT.

Descripción detallada de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones mejoradas capaces de reducir el mal olor y productos que comprenden tales composiciones de reducción del mal olor.

En el contexto de la presente invención, el término "mal olor" significa un olor y/o gusto/sabor desagradable provocado por uno de los siguientes tipos de compuestos: VSCs, compuestos que contienen nitrógeno, y ácidos grasos cortos, o una combinación de los mismos. Los inventores han descubierto que se puede obtener la eliminación o al menos la reducción del mal olor mediante el uso de una o más oxidorreductasas en combinación con un mediador. En particular, se reivindica una composición de reducción del mal olor que comprende (i) una lacasa derivada de Myceliophthora thermophila, y (ii) un mediador seleccionado del grupo que se compone de ácido clorogénico y ácido cafeico y ésteres derivados, y extracto de té Oolong.

El término "reducción del mal olor" o "mal olor reducido" significa que el mal olor, determinado por un panel de prueba, es valorado como menos pronunciado en comparación con una muestra en blanco correspondiente que no ha sido expuesta a una o varias oxidorreductasas y un mediador.

Sin estar limitados a ninguna teoría, se cree que el mediador se une de alguna manera al azufre volátil y a los compuestos que contienen nitrógeno dando como resultado un producto de reacción que no tiene el mal olor. Otra teoría es que el mediador media en el enlace de dos o más compuestos volátiles en un compuesto sin mal olor o con el mal olor reducido.

Oxidorreductasas

Las oxidorreductasas (es decir, las enzimas clasificadas bajo el Número de clasificación de Enzimas E.C. 1 (Oxidoreductases) según las Recommendations (1992) de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología molecular (IUBBM)) son enzimas que catalizan oxidorreducciones.

Según la invención, se contemplan especialmente tres tipos de oxidorreductasas:

a): Lacasas o enzimas relacionadas, como enzimas que incluyen tirosinasa, que actúan sobre el oxígeno molecular (O_{2}) y producen agua (H_{2}O) sin ninguna necesidad de peróxido (p. ej. H_{2}O_{2}),

b): Enzimas que incluyen oxidasas, que actúan sobre el oxígeno molecular (O_{2}) y producen peróxido (H_{2}O_{2}), y

c): Enzimas que incluyen peroxidasas que actúan sobre el peróxido (p. ej. H_{2}O_{2}) y producen agua (H_{2}O).

Las oxidorreductasas preferidas son de origen microbiano, especialmente enzimas recombinantes y/o sustancialmente purificadas sin ninguna actividad secundaria. Las enzimas microbianas son mejores que las enzimas vegetales y de frutas, ya que pueden ser producidas más fácilmente en cantidades grandes mediante técnicas recombinantes conocidas en la técnica.

Las enzima microbianas indican, en el contexto de la presente invención, enzimas derivadas de bacterias, hongos filamentosos o levaduras.

En el caso de una enzima que actúa sobre el oxígeno (O_{2}) como aceptador, dicho oxígeno puede ser oxígeno molecular suministrado por el aire.

También se contemplan, según la invención, sistemas enzimáticos que comprenden una combinación de los tres tipos de enzimas. Los sistemas enzimáticos pueden p. ej. consistir en una lacasa o un enzima relacionada y una oxidasa; una lacasa o una enzima relacionada y una peroxidasa; una lacasa o una enzima relacionada y una oxidasa y una peroxidasa; o una oxidasa y una peroxidasa.

Lacasa y enzimas relacionadas

Ejemplos de enzimas específicamente contempladas dentro del grupo de las lacasas y enzimas relacionadas, las cuales son capaces de oxidar los VSCs y los compuestos de nitrógeno en cuestión, son las oxidasas mono- y difenólicas, como catecol oxidasa (1.10.3.1), lacasa (E.C. 1.10.3.2), tirosinasa (E.C. 1.14.18.1) (E.C. 1.10.3.1), y bilirrubina oxidasa (E.C. 1.3.3.5).

La lacasa oxida el o-difenol así como el p-difenol formando sus quinonas correspondientes. La tirosinasa o catecol oxidasa cataliza dos reacciones diferentes: la hidroxilación de monofenoles en o-difenoles y la oxidación de o-difenoles en o-quinonas.

Las lacasas empleadas pueden ser derivadas de una cepa de Polyporus sp., en particular una cepa de Polyporus pinsitus (también llamada Trametes villosa) o Polyporus versicolor, o una cepa de Myceliophthora sp., p. ej. M. thermophila o una cepa de Rizoctonia sp., en particular una cepa de Rizoctonia praticola o Rizoctonia solani, o una cepa de Scytalidium sp., en particular S. thermophilium, o una cepa de Pyricularia sp., en particular Pyricularia oryzae, o una cepa de Coprinus sp., como C. cinereus.

La lacasa puede también derivar de un hongo como Collybia, Forres, Lentinus, Pleurotus, Aspergillus, Neurospora, Podospora, Phlebia, p. ej. P. radiata (WO 92/01046), Coriolus sp., p. ej. C. hirsitus (JP 2-238885), y Botrytis.

En una forma de realización preferida de la invención, la lacasa es derivada de una cepa de Myceliophthora sp., especialmente la lacasa de Myceliophthora thermophila descrita en WO 95/33836 (de Novo Nordisk).

La bilirrubina oxidasa puede ser derivada de una cepa de Myrothecium sp., como una cepa de M. verrucaria.

Peroxidasas

Las peroxidasas deben ser usadas en combinación con H_{2}O_{2} o con una oxidasa para obtener el resultado deseado, es decir la eliminación o al menos la reducción del mal olor.

Peroxidasas adecuadas pueden ser encontradas dentro del grupo de enzimas que actúan sobre el peróxido como aceptador, p. ej. E.C. 1.11.1, especialmente la peroxidasa (E.C. 1.11.1.7).

Ejemplos específicos de enzimas adecuadas que actúan sobre peróxido como aceptador incluyen peroxidasas derivadas de una cepa de la especie de hongo Coprinus, en particular una cepa de Coprinus cinereus o Coprinus macrorhizus, o derivadas de una cepa del género de bacterias Bacillus, en particular una cepa de Bacillus pumilus.

Las haloperoxidasas son también adecuadas según la invención. Las haloperoxidasas forman una clase de enzimas que son capaces de oxidar haluros (CI-, Br-, 1-) en presencia de peróxido de hidrógeno en los correspondientes ácidos hipohalosos. Una haloperoxidasa adecuada se puede derivar de Curvularia sp., en particular C. verruculosa.

Oxidasas

Las oxidasas que producen peróxido (H_{2}O_{2}) deben ser usadas en combinación con una peroxidasa para ser capaces de eliminar o al menos reducir el mal olor.

Oxidasas adecuadas incluyen glucosa oxidasa (E.C. 1.1.3.4), hexosa oxidasa (E.C. 1.1.3.5), L-amino-ácido oxidasa (E.C. 1.4.3.2), xilitol oxidasa, galactosa-oxidasa (E.C. 1.1.3.9), piranosa oxidasa (E.C. 1.1.3.10), alcohol-oxidasa (E.C. 1.1.3.13).

Si se usa una L-aminoácido-oxidasa, puede ser derivada de una Trichoderma sp. como Trichoderma harzianum, por ejemplo la L-aminoácido-oxidasa descrita en WO 94/25574 (de Novo Nordisk A/S), o Trichoderma viride.

Una glucosa oxidasa adecuada puede originarse de Aspergillus sp., como una cepa de Aspergillus Níger, o de una cepa de Cladosporium sp., en particular Cladosporium oxysporum.

Las hexosa oxidasas del alga marina roja Chondrus crispus (comúnmente conocida como musgo de Irlanda) (Sullivan y Ikawa, (1973), Biochim. Biophys. Acts, 309, p. 11-22; Ikawa, (1982), Meth. in Enzymol. 89, carbohydrate metabolism part D, 145-149) oxidan un amplio espectro de carbohidratos, como D-glucosa, D-galactosa, maltosa, celobiosa, lactosa, D-glucosa 6-fasfato, D-manosa, 2-deoxi-D-glucol, 2-deoxi-D-galactosa, D-fucasa, ácido D-glucúrnico, y D-xilosa.

También el alga marina roja Iridophycus flaccidum produce hexosa oxidasas fácilmente extraíbles, las cuales oxidan diferentes mono- y disacáridos (Bean y Hassid, (1956), J. Biol. Chem, 218, p. 425; Rand et al. (1972, J. of Food Science 37, p. 698-710).

Otro grupo adecuado de enzimas es la xilitol oxidasa (ver p. ej. JP 80892242) que oxida xilitol, D-sorbitol, D-galactitol, D-manitol y D-arabinitol en presencia de oxígeno. Una xilitol oxidasa puede ser obtenida de cepas de Streptomyces sp. (p. ej. Streptomyces IKD472, FERM P-14339). Dicha enzima tiene un pH óptimo q 7.5 y es estable con un pH de 5.5 a 10.5 y a temperaturas de hasta 65ºC.

En el caso de la reducción del mal olor que emana de la cavidad bucal, p. ej. mediante la incorporación de una oxidorreductasa en un producto para el cuidado bucal, resulta ventajoso utilizar enzimas que sean sustancialmente activas en los pHs que predominan en la boca, es decir pH de 5.0 a 9.0, preferiblemente pH de 6.0 a 8.5, especialmente pH de 6.4 a 7.5 y a temperaturas en la gama de 25ºC a 40ºC.

El término enzimas "sustancialmente activas" significa en este contexto que la enzima(s) tiene una actividad relativa (pH óptimo define el 100% en las mismas condiciones) superior al 30%, o mejor al 50%, incluso mejor superior al 70%, o al 80%, y en el mejor caso hasta aproximadamente el 100% de la actividad con el pH óptimo.

Mediador

Según la invención una o más oxidorreductasas son usadas en combinación con un mediador redox adecuado. El denominado "mediador redox" es llamado a veces en la bibliografía como "agente intensificador". En el presente contexto se usará el término "mediador".

Un "mediador" es un agente capaz de aumentar la actividad de las oxidorreductasas.

El mediador puede ser un mediador fenólico o un mediador no fenólico. Qué mediador es el preferido depende del objetivo. Si el concepto de la invención es usado en una aplicación para el cuidado bucal o una aplicación para alimentos, el mediador debería ser preferiblemente no tóxico. Ejemplos de mediadores capaces de aumentar la actividad de las oxidorreductasas incluyen los compuestos descritos en la patente WO 95/01426, la cual está incorporada en la presente como referencia, y se describen por la fórmula general I:

1

La definición de los grupos R1 a R10 y A puede encontrarse en WO 95/010426 (ver p. 9 a 11).

Compuestos específicamente contemplados dentro de la fórmula I anterior incluyen los siguientes: 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato (ABTS); ácido 6-hidroxi-2-naftoico; 7-metoxi-2-naftol; ácido 7-amino-2-naftaleno sulfónico; ácido 5-amino-2-naftaleno sulfónico; 1,5-d iaminonaftaleno; 7-hidroxi-1,2-naftimidazol; 10-metilfenotiazina; ácido 10-fenotiazin-propiónico (PPT); N-hidroxisuccinimida-1 0-fenotiazin-propionato; benzidina; 3,3'-dimetilbenzidina; 3,3'-dimetoxibenzidina; 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; ácido 4'-hidroxi-4-bifenilcarboxílico; 4-amino-4'-metoxiestilbeno; ácido 4,4'-diaminoestilbeno-2,2'-disulfónico; 4,4'-diaminodifenilamina; 2,7-diaminofluoreno; 4,4'-dihidroxi-bifenileno; trifenilamina; ácido 10-etil-4-fenotiazincarboxílico; 10-etilfenotiazina; 10-propilfenotiazina; 10-isopropilfenotiazina; metil-10-fenotiazinpropionato; 10-fenilfenotiazina; 10-alilfenotiazina; ácido 10-fenoxazinpropiónico (POP); 10-(3-(4-metil-1-piperazinil)propil)fenotiazine; 10-(2-pirrolidinoetil)fenotiazina; 10-metilfenoxazina; iminoestilbeno; ácido 2-(p-aminofenil)-6-metilbenzotiazol-7-sulfónico; N-benzilideno-4-bifenilamina; 5-aminoácido-2-naftalenosulfónico; 7-metoxi-2-naftol; 4,4'-dihidroxibenzofenona; N-(4-(dimetilamino)benzilideno)-p-anisidina; 3-metil-2-benzotiazolinona(4-(dimetilamino)benzilideno)hidrazona; 2-acetil-1 0-metilfenotiazina; 10-(2-hidroxietil)fenotiazina; 10-(2-hidroxietil)fenoxazina; 10-(3-hidroxipropil)fenotiazina; 4,4'-dimetoxi-N-metil-difenilamina, vainilin azina.

Otro mediador contemplado incluye el ácido 4-hidroxibenzoico, L-tirosina, ácidos de siringato, ácido ferúlico, ácido sinápico, ácido clorogénico, ácido cafeico y ésteres derivados.

Otros ejemplos incluyen los compuestos orgánicos descritos en la patente WO 96/10079, que está incorporada en la presente como referencia, y por la siguiente fórmula II:

2

donde la fórmula A es un grupo como -D, -CH=CH-D, -CH=CH-CH=CH-D, -CH=N-D, -N=N-D, o -N=CH-D, donde D está seleccionado del grupo que se compone de -CO-E, -SO_{2}-E, -N-XY, y –N^{+}-XYZ, donde E puede ser -H,
-OH, -R, o -OR, y X e Y y Z pueden ser idénticas o diferentes y seleccionadas de -H y -R; siendo R un alquilo C_{1}-C_{16}, preferiblemente un alquilo C^{1}-C^{8}, dicho alquilo puede ser saturado o insaturado, ramificado o de cadena recta y opcionalmente sustituido con un grupo carboxi, sulfo o amino; y B y C pueden ser iguales o diferentes y seleccionados de C_{m}H_{2m+i}; 1 \leq M \leq 5.

Compuestos específicos incluidos en la fórmula I anterior son acetosiringona, siringaldehido, metilsiringato, ácido siríngico, etilsiringato, propilsiringato, butilsiringato, hexilsiringato, octilsiringato y etil 3-(4-hidroxi-3,5-imetoxifenil)acrilato.

Aplicación del concepto de la invención

El concepto/principio de la invención puede ser usado en un gran número de aplicaciones.

Sabor a quemado

El principio de la invención puede también ser usado para la eliminación del sabor a quemado, un problema conocido asociado con p. ej. la leche tratada por UHT.

Depilación de cuero y piel

Durante la depilación de cuero y piel, normalmente se usan grandes cantidades de sulfuro. Esto ocasiona un mal olor provocado por los VSCs. Estos VSCs pueden ser reducidos según la invención.

Rizado permanente del pelo

El rizado permanente del pelo implica la rotura y/o la restauración de los enlaces cruzados de bisulfuro que dan la forma de las fibras de pelo queratináceas. Para este propósito se usan varios agentes reductores orgánicos, como ácido tioglicólico, ácido tioáctico y otros compuestos que contienen azufre. El proceso de rizado ocasiona un mal olor provocado por los VSCs y las aminas formadas como producto secundario. Este mal olor puede ser reducido según la invención.

Pañales

El efecto de eliminación del mal olor de la combinación de una o más oxidorreductasas y un mediador puede también ser usado en relación con el control del olor de los fluidos corporales y gases corporales, mediante la incorporación de una o más de las anteriormente mencionadas oxidorreductasas y mediadores en productos higiénicos, incluyendo pañales, productos para la incontinencia, filtros para la ropa interior, protectores de prendas,
etc.

Detergente

También se contempla según la invención la adicción de una o más oxidorreductasas y un mediador a una composición de detergente, p. ej., polvo para el lavado de la ropa, un detergente líquido o similar. El mal olor retenido provocado por los ácidos grasos cortos puede ser reducido de este modo. El sistema de reducción del mal olor puede también ser parte del suavizante (es decir, la composición de suavización del tejido) añadido durante el ciclo de lavado. Y de la misma manera, en otro tipo de detergentes, como detergentes de lavado de la vajilla.

Las composiciones detergentes pueden ser formuladas, por ejemplo, como composiciones de detergente de lavado a mano y a máquina, que incluyen composiciones aditivas de lavado de ropa y composiciones adecuadas para el uso en el pretratamiento de tejidos manchados, composiciones suavizantes añadidas al enjuague, y composiciones para el uso doméstico en general en operaciones de limpieza de superficies duras y operaciones de lavado de la vajilla.

La composición de detergente comprende una lipasa, y normalmente otras actividades enzimáticas, como la actividad proteasa, como se describirá más abajo, y un agente tensioactivo. Además, opcionalmente puede comprender un constructor, un supresor de espuma, un agente suavizante, un agente de inhibición de la transferencia del tinte y otros componentes usados convencionalmente en los detergentes, como agentes de suspensión de la suciedad, agentes de liberación de la suciedad, blanqueadores ópticos, abrasivos, bactericidas, inhibidores de la decoloración, agentes colorantes, y/o perfumes encapsulados o no encapsulados.

La composición de detergente puede ser líquida, una pasta, gel, barra o en forma granulosa. El pH (medido en solución acuosa en la concentración de uso) usualmente será neutro o alcalino, p. ej. en la gama de 7-11. Las composiciones granulosas según la presente invención pueden también estar en "forma compacta", es decir pueden tener una densidad relativamente más alta que los detergentes granulosos convencionales, es decir de 550 a 950 g/l.

Una lipasa u opcionalmente otra enzima incorporada en la composición de detergente, es normalmente incorporada en la composición de detergente en un nivel del 0.00001% al 2% de proteína enzimática en peso de la composición, preferiblemente en un nivel del 0.0001% al 1% de proteína enzimática en peso de la composición, más preferiblemente en un nivel del 0.001% al 0.5% de proteína enzimática en peso de la composición, incluso más preferiblemente en un nivel del 0.01% al 0.2% de proteína enzimática en peso de la composición.

La cantidad de proteína lipasa puede ser de 0.001-10 mg por gramo de detergente o 0.001-100 mg por litro de solución de lavado. Más específicamente, la lipasa puede estar incorporada en las composiciones de detergente descritas en WO 97/04079, WO 97/07202, WO 97/41212, y PCT/DK 97/00345.

Sistema tensioactivo

El sistema de agentes tensioactivos puede comprender agentes tensioactivos no iónicos, aniónicos, catiónicos, anfolíticos, y/o bipolares. El sistema de agentes tensioactivos preferiblemente consiste en agentes tensioactivos aniónicos o una combinación de agentes tensioactivos aniónicos y no iónicos, p. ej. 50-100% de agentes tensioactivos aniónicos y 0-50% no iónicos. Las composiciones de detergente de lavado pueden también contener agentes tensioactivos catiónicos, anfolíticos, bipolares y semipolares, así como agentes tensioactivos no fónicos y/o aniónicos diferentes de los descritos aquí.

El agente tensioactivo está normalmente presente en un nivel del 0.1% al 60% en peso. Algunos ejemplos de agentes tensioactivos se describen a continuación.

Agentes tensioactivos no iónicos

El agente tensioactivo puede comprender condensados de óxido de polialquileno (p. ej. óxido de polietileno) de alquil-fenoles. El grupo alquilo puede contener de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono, en una cadena recta o ramificada. El óxido de etileno puede estar presente en una cantidad igual a aproximadamente de 2 a aproximadamente 25 moles por mol de alquilfenol.

El agente tensioactivo también puede comprender productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente de 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno. La cadena de alquilo del alcohol alifático puede ser recta o ramificada, y generalmente contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono.

Además, el agente tensioactivo no fónico puede comprender condensados de óxido de polietileno de alquil-fenoles, productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno, alquilpolisacáridos, y mezclas de los mismos. Se prefieren especialmente los etoxilatos de alquil fenol C_{8}-C_{14} que tienen de 3 a 15 grupos etoxi y los etoxilatos de alcohol C_{8}-C_{1} (preferiblemente C_{10} de media) que tienen de 2 a 10 grupos etoxi y mezclas de los mismos.

Agentes tensioactivos aniónicos

Los agentes tensioactivos aniónicos adecuados incluyen alquil sulfatos alcoxilados que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula RO(A)mSO_{3}M donde R es un alquilo C_{10}-C_{24} no sustituido o un grupo hidroxialquilo que tiene un componente de alquilo C_{10}-C_{24}, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{20}, más preferiblemente alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{18}, A es una unidad etoxi o propoxi, M es superior a cero, normalmente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 6, más preferiblemente entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión metálico (p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), un catión de amonio o amonio sustituido. Los alquil sulfatos etoxilados, así como los alquil sulfatos propoxilados están contemplados en la presente. Ejemplos específicos de cationes de amonio sustituidos incluyen cationes de metil-, dimetil-, trimetil-amonio y cationes de amonio cuaternario, como tetrametil-amonio y cationes de dimetil piperdinio y aquellos derivados de alquilaminas, como etilamina, dietilamina, trietilamina, mezclas derivadas, y similares.

Otro agentes tensioactivos aniónicos adecuados incluyen los agentes tensioactivos de alquil sulfato que son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula ROSO_{3}M donde R preferiblemente es un hidrocarbilo C_{10}-C_{24}, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente de alquilo C_{10}-C_{20}, más preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo C_{12}-C_{18}, y M es H o un catión, p. ej., un catión de metal alcalino (p. ej. sodio, potasio, litio), o amonio o amonio sustituido.

Otros agentes tensioactivos aniónicos incluyen sales (incluyendo, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, y sales amónicas sustituidas, como sales de mono- di- y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos C_{8}-C_{22} primarios o secundarios, olefinsulfonatos C_{8}-C_{24}, ácidos policarboxílicos sulfonatados preparados por sulfonación del producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreo. Los sulfonatos de alquilbenceno se consideran adecuados, especialmente los sulfonatos de alquil benceno (LAS) lineales (de cadena recta), donde el grupo alquilo preferiblemente contiene de 10 a 18 átomos de carbono.

Las composiciones de detergente de lavado normalmente comprenden de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 40%, preferiblemente de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 20% en peso de tales agentes tensioactivos aniónicos.

Sistema constructor

Las composiciones según la presente invención pueden además comprender un sistema constructor. Cualquier sistema constructor convencional es conveniente para ser usado aquí, incluyendo los materiales de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como tetraacetato de etilenodiamina (EDTA), secuestrantes de metales fónicos como aminopolifosfonatos. Los constructores de fosfato también pueden ser usados aquí.

Los constructores adecuados pueden ser un material de intercambio iónico inorgánico, comúnmente un material de aluminosilicato hidratado inorgánico, más particularmente una zeolita sintética hidratada, como la zeolita hidratada A, X, B, HS o MAP.

Las sales constructoras de detergencia son normalmente incluidas en cantidades del 5% al 80% en peso de la composición. Los niveles preferidos del constructor para detergentes líquidos son del 5% al 30%.

Otras enzimas

La composición de detergente puede comprender, además de la lipasa, otra enzima(s) que proporcione un rendimiento de limpieza y/o beneficios en el cuidado del tejido, p. ej. proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (p. ej. lacasas).

Proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere un origen microbiano. Se incluyen los mutantes modificados química o genéticamente. La proteasa puede ser una serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descritas en WO 89/06279) y variantes de las mismas.

Agentes blanqueadores

La composición de detergente (especialmente en el caso de un detergente granulado) puede también comprender agentes blanqueadores, p. ej. un blanqueador de oxígeno o un blanqueador de halógeno. El blanqueador de oxígeno puede ser un agente de liberación de peróxido de hidrógeno, como un perborato (p. ej. PB1 o PB4) o un percarbonato, o puede p. ej. ser un ácido percarboxílico. El tamaño de partícula puede ser de 400-800 micras. En caso de estar presentes, los compuestos blanqueadores de oxígeno normalmente están presentes en niveles de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 25%.

El agente de liberación del peróxido de hidrógeno puede ser usado en combinación con activadores de blanqueo como tetra-acetiletilenodiamina (TAED), nonanoiloxibenzeno-sulfonato (NOBS), 3,5-trimetil-hexsanoloxibenzeno-sulfonato (ISONOBS) o pentaacetilglucosa (PAG).

El blanqueador de halógeno puede ser, p. ej. un agente blanqueador de hipohalita, por ejemplo, ácido tricloro isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y de potasio y N-cloro y N-bromo alcano sulfonamidas. Estos materiales son normalmente añadidos en un 0.5-10% en peso del producto acabado, preferiblemente un 1-5% en peso.

Mal olor en alimentos

Los productos alimenticios como pescados, carnes y similares originan un mal olor provocado principalmente por compuestos que contienen nitrógeno. La trimetilamina de amina, que es conocida por originar un olor a pescado, puede ser reducida según la invención.

Agua y gas residual

El concepto de la invención también puede ser usado para la eliminación de aminas y VSCs en aguas residuales y gases de combustión.

Productos sanitarios

También se contempla el uso del sistema de reducción del mal olor de la invención como un ingrediente activo en productos sanitarios, productos de baño y ducha, incluyendo champús, acondicionadores, lociones, cremas, barras de jabón, jabones de aseo y jabones líquidos y otros productos del cuidado personal. Se cree generalmente que el desarrollo del mal olor corporal se debe a la acción bacteriana en los productos de las glándulas sudoríparas.

Composiciones de limpieza

Otra aplicación en la que se puede usar el principio de la invención es en las composiciones de limpieza para alfombras, alfombrillas, prendas, textiles y similares.

La incorporación práctica del concepto de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones, puede se efectuada fácilmente por un experto en la materia. Un experto en la técnica puede fácilmente adaptar el concepto de la invención a tipos específicos de productos conocidos en los que se desea el control o eliminación o reducción del mal olor.

Composición

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición para la eliminación o reducción del mal olor que comprende una o más oxidorreductasas y un mediador.

Las oxidorreductasas y el mediador pueden ser aquellas descritas arriba en relación al primer aspecto de la invención.

Cuidado bucal

Una composición de la invención puede ser usada en productos para el cuidado bucal.

Un producto para el cuidado bucal según la invención capaz de eliminar el mal olor que emana de la cavidad bucal puede tener cualquier forma física adecuada (es decir polvo, pasta, gel, líquido, pomada, pastilla etc.).

Un "producto para el cuidado bucal" puede ser definido como un producto que puede ser usado para mantener o mejorar la higiene bucal de la boca de seres humanos y animales, mediante p. ej. la prevención caries dentales, impidiendo la formación de placa dental y sarro, la eliminación de la placa dental y sarro, prevención y/o tratamiento de enfermedades dentales, eliminación del mal olor, etc.

Los productos para el cuidado bucal también incluyen productos para la limpieza de dentaduras, dientes artificiales y similares.

Ejemplos de productos para el cuidado bucal incluyen: pasta dental, crema dental, gel o polvo dentífrico, enjuagues dentales y bucales, formulaciones de enjuague antes y después del cepillado, goma de mascar, pastillas y caramelos.

Las pastas dentales y geles dentales normalmente incluyen materiales de pulido abrasivos, agentes espumantes, agentes aromatizantes, humectantes, aglutinantes, espesantes, agentes edulcorantes, agentes de blanqueo/decolora-
miento/eliminación de manchas, agua, y opcionalmente enzimas.

Los enjuagues bucales que incluyen líquidos de eliminación de la placa, normalmente comprenden una solución de agua/alcohol, aromatizantes, humectantes, edulcorantes, espumantes, colorantes, y opcionalmente enzimas.

Producto

En el tercer aspecto, la invención se refiere a los productos que comprenden una composición de la invención para la eliminación o la reducción del mal olor.

La composición de la invención puede ser usada en productos para el cuidado bucal como dentífricos, productos sanitarios, detergentes, suavizantes, alimentos.

Otros ejemplos de productos contemplados incluyen productos higiénicos, como pañales, productos para la incontinencia de adultos, pañales de aprendizaje, compresas, tampones; productos sanitarios, como barras de jabón y similares; productos para la eliminación del sabor a quemado en alimentos como la leche, etc.

Según la invención, el producto puede ser un producto con uno o dos compartimientos. En el producto con un compartimiento, la oxidorreductasa, el mediador y los otros ingredientes se mantienen juntos en una solución estabilizada o mantenidos en condiciones estables (es decir, que no haya nada de oxígeno presente). En el producto con dos compartimientos, la oxidorreductasa y el mediador y los otros ingredientes son mantenidos en dos recipientes separados. El contenido de dichos recipientes es mezclado antes del uso.

Métodos y materiales Materiales Enzima Lacasas

\quad: Lacasa de Myceliopthora thermophila recombinante (rMtL) (disponible por Novo Nordisk) y descrita en WO 95/33836 (Novo Nordisk).

\quad: Lacasa de Coprinus cinereus recombinante (rCcL).

\quad: Lacasa de Polyporus pinsitus recombinante (rPpL).

Tirosinasa

\quad: Tirosinasa T-7755 de Champiñón/Sigma.

Peroxidasa

\quad: Peroxidasa de Coprinus cinereus recombinante (rCiP)

\quad: Peroxidasa de rábano silvestre tipo I/Sigma P-8125

\quad: Peroxidasa de rábano silvestre tipo XII/Sigma P-8415

\quad: Peroxidasa de rábano silvestre ácida: RZ 2.5, pI 4, 5.3, 5.85 y 6.0. No se une con agarosa de ácido benzhidroxónico.

Reactivos

\quad: Mediador: ácido 10-fenotiazina-propiónico (PPT);

\quad: Ácido 10-fenoxazinpropiónico (POP); ácido cafeico;

\quad: Ácido clorogénico; L-tirosina; ácido p-hidroxibenzoico; siringaldehído; metilsiringato.

\quad: Metanotiolato de sodio (comprado de Fluka)

\quad: Tampón: tampón Britten-Robinson con el pH indicado en los ejemplos.

Cromatógrafo GC

\quad: Columna: Columna de teflón 6 ft X 1/8 in. o.d. equipada con una malla 40/60 Carbopack BHT-100 (Supelco).

\quad: Detector: Detector Fotométrico de llama (FPD) (Hewlett Packard)

\quad: Flujo de aire: 100 ml/min (350 kPa)

\quad: H_{2}: 75 ml/min (150 kPa)

\quad: Vehículo + relleno: 30 ml/min (130 kPa).

Condiciones cromatográficas

30 ml/min de N_{2} y He
Temperatura del inyector	150ºC
Temperatura del detector	200ºC
Temp. inicial del horno	35ºC
Tiempo inicial	2.5 minutos
Nivel	10ºC/minuto
Temp. Final	140ºC

Métodos Determinación de la Actividad lacasa (LAMU)

Se utilizó el método LAMU para determinar la actividad lacasa de Myceliophthora thermophila.

Lacasa (E.C. 1.10.3.2), p-difenol: O_{2} oxidorreductasa, conteniendo cobre en el grupo protésico, utiliza oxígeno molecular como aceptador del electrón final. El oxígeno atmosférico es directamente reducido a 2 H_{2}O, durante la liberación de 4 electrones, sin peróxido de hidrógeno en una fase intermedia.

La lacasa en condiciones aeróbicas catalizará la oxidación de siringaldazina formando tetrametoxi-azo bis metileno quinona.

Actividad tirosinasa

Se utilizó la actividad y actividad específica de la tirosinasa definida según Duckwort, H. W. y Coleman, J. E. (1970) J. Biol. Chem. 245, 1613-1625, para calcular la cantidad de proteína enzimática.

Condiciones de la reacción

Sustrato:	Siringaldazina 19 mM
Tampón:	Tris 23 mM
pH:	7.50
Temperatura:	30ºC
Tiempo de reacción:	90 segundos.
Área de trabajo de la enzima:	0.0016-0.0064 LAMU/ml
Longitud de onda:	530 nm
Agua:	MilliQ

Definición de las unidades

Un LAMU es la cantidad de enzima que, bajo las condiciones analíticas dadas, transforma 1 \mumol de siringaldazina por minuto.

Especificidad y sensibilidad

Límite de detección LOD:	0.007 LAMU/ml
Limite de cuantificación LOQ:	0.07 LAMU/ml
Gama:	0.100-0.400 ABS/min.

Reactivos/sustratos Ácido maleico, 1.0 M

Ácido maleico 37% paM *) 800380	23.2 g
Agua desmineralizada, MilliQ	hasta 200 ml

*) pro analysi Merck

Se pesan 23.2 g de ácido maleico en un recipiente para pesar y se añaden a 150 ml de agua en agitación continua. Agitar hasta disolver. Transferencia cuantitativa de la solución a un matraz aforado de 200 ml y añadir agua hasta la marca.

Tampón Tris 1.0 M; solución madre

Tris[hidroximetil]aminometano Sigma T-1378	121.1 g
Agua desmineralizada, MilliQ	hasta 1 l

El tampón Tris es pesado en un recipiente para pesar y es añadido a 800 ml de agua en agitación continua. Agitar hasta disolver. Transferencia cuantitativa de la solución a un matraz aforado de 1 l y añadir agua hasta la marca.

Tampón Tris 25 mM; pH 7.50

Tampón Tris 1.0 M

\dotl

25.0 ml

Ácido maleico, 1.0 M

\dotl

5.0 ml

Agua desmineralizada

\dotl

hasta 1 l

pH ajustado a 7.50 \pm 0.05.

Verter 50 ml de tampón Tris 1.0 M (vaso graduado) en un matraz aforado de 1 l y añadir aproximadamente 700 ml agua. Ahora añadir 5 ml de ácido maleico, 1 M. Ajustar el pH a 7.50 \pm 0.05 y añadir agua hasta la marca. (el pH puede no ser ajustado con HCl, a causa del efecto de inhibición en la enzima Lacasa.)

Medios de dilución

PEG 6000 paM 807491	25.0 g
Tritón X-100, Sigma T-9284	5.0 g
Agua MilliQ hasta	0.5 L

Se pesan 25.0 g de PEG 6000 y 5.0 g de Tritón X-100 en un recipiente para pesar y se añaden 400 ml de agua en agitación continua. Agitar hasta disolver. Transferencia cuantitativa de la solución a un matraz aforado de 0.5 l y añadir agua hasta la marca.

Siringaldazina, 0.56 mM; solución madre

Siringaldazina anh Sigma S-7896	10.0 mg
Etanol 96%	50 ml

Se pesa la siringaldazina en un matraz aforado de 50 ml y se añade etanol en 50 ml. Se agita hasta disolver (aprox. 3 horas). El reactivo es sensible a la luz.

Debería estar contenido en una botella oscura.

Siringaldazina, 0.28 mM; etanol 48%

Siringaldazina, 0.56 mM	25.0 ml
Agua desmineralizada, MilliQ	hasta 50 ml

Se transfieren 25 ml de siringaldazina, 0.56 mM (pipeta completa) a un matraz aforado de 50 ml. Llenar con agua hasta la marca.

Control del Reactivo: Siringaldazina, 0.056 mM; Etanol 48%

Siringaldazina, 0.28 mM	2 ml
Etanol, 96%	4 ml
Agua desmineralizada, MilliQ	hasta 10 ml

La solución debería tener una absorción de aproximadamente 2.2 a 360 nm, medida contra etanol, 6%.

Etanol, 6%

Etanol, 96%	62.5 ml
Agua desmineralizada, MilliQ	hasta 1000 l

Se transfieren 62.5 ml de etanol, 96% (vaso graduado) a un matraz aforado de 1 l. Llenar con agua hasta la marca.

Muestras y estándares Control

Los análisis son comparados con una muestra de lacasa muy conocida con el objetivo de controlar el nivel del ensayo. La muestra es un lote de la lacasa representativa.

Muestras desconocidas

Las muestras de lacasa son diluidas con los medios de dilución para una actividad esperada de 0.18 LAMU/ml. Dejar reposar las muestras durante 15 minutos antes del análisis.

Area de trabajo: 0.07-0.28 LAMU/ml.

Otras muestras con precipitado son centrifugadas a aproximadamente 3000 rpm durante 10 minutos.

Procedimiento

Se preparan los reactivos y estándares. Las muestras son pesadas y diluidas hasta una actividad esperada de 0.18 LAMU/ml.

Se precalientan 4 ml de tampón Tris, 25 mM; pH 7.5, al menos durante 10 minutos a 30ºC. Se añade una muestra de 100 ml. Mezcla. Se añaden 300 ml de siringaldazina 0.28 mM, con la cual comienza la reacción. Mezcla.

La muestra es colocada en el fotómetro, sobre el cual posteriormente se lee la secuencia cinética a 530 nm, y se calcula un cambio en la absorción por minutos de t90 seg.-t60 seg.. Ver tabla 1 abajo. Entre cada muestra, la cubeta del fotómetro es enjuagada con una solución de etanol 6%.

TABLA 1 Procedimiento para la lacasa

3

Cálculo

\DeltaABS x 0.677 x D = LAMU/mL

Donde:

\DeltaABS:	cambio en absorción por minuto.
4.4:	volumen total en ml
0.1:	volumen de ensayo en ml
0.065:	coeficiente de extinción m molar.
10^{-3}:	LAMU/I \rightarrow LAMU/ml.
D:	dilución adicional.

Ejemplos Ejemplo 1 Experimento de control de la prueba de inhalación

Se estableció un umbral para la prueba sensorial contra el metanotiol. La concentración conocida de metanotiolato de sodio fue preparada en un tampón Britton-Robinson, pH 6.5. Se vertieron 2.0 ml de cada solución en una botella de vidrio de 20 ml. Los sujetos entrenados dieron una puntuación.

Como se muestra en la tabla abajo, si se da la puntuación 0 o "no olor" a una muestra, significa que se ha eliminado más del 95% del metanotiol.

4

Puntuación:

4: Referencia u olor de referencia

3: Olor claro

2: Olor débil

1: Olor muy débil

0: Nada de olor.

Ejemplo 2 Reducción del mal olor (VSC) con lacasa y PTT como mediador

Se añadieron 0.5 \mul de metano tiolato de sodio (CH_{3}SNa) 15% (0.11 mM) a 10.0 ml de tampón Britton-Robinson 40 mM, pH 6.0, en un contenedor cerrado de 50 ml.

Se añadieron 500 pM de PPT y 5 LAMU/ml de Lacasa Myceliophthora thermophila a la mezcla y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La mezcla reactiva fue agitada manualmente durante la incubación.

Después de la reacción de la enzima, se tomaron 0.1 ml de una muestra de gas del espacio de la cabeza y se analizó por GC. Un control fue realizado sin la lacasa y el PPT.

Una inhalación GC mostró que el primer valor máximo a 1 minuto en un control (Fig. 1) fue CH_{3}SH.

Como se puede observar en los cromatogramas (Figura 1 y Figura 2), el valor máximo CH_{3}SH desapareció completamente después de la reacción de la enzima, lo cual refleja que el mal olor del metanotiol ha desaparecido.

Pruebas de inhalación

1. El metanotiol (CH_{3}SH) tiene un olor característico. Después de la reacción de la enzima el olor fue evaluado por inhalación de la mezcla reactiva. El mal olor había desaparecido lo que indica que más del 95% del CH_{3}SH ha sido eliminado.

Ejemplo 3 Reducción de mal olor (VSC) con lacasa y PPT y POP como mediadores

Se añadieron 2 \mul de metanotiolato de sodiol 5% (0.11 mM) a 2.0 ml de tampón Britton-Robinson 40 mM en un contenedor cerrado 50 ml.

La lacasa Myceliophthora thermophila y el PPT o el POP fueron añadidos según la tabla siguiente. La mezcla (volumen total 2.0 ml) fue agitada manualmente durante 10 minutos a temperatura ambiente. El mal olor fue puntuado.

5

El PPT, el POP y la lacasa no produjeron nada de olor

Como se puede observar en la tabla, la lacasa en combinación con un mediador reduce el mal olor del VSC significativamente.

Ejemplo 4 Reducción del mal olor bucal in vitro (VSC)

Se tomó placa lingual de un sujeto y se cultivó en el medio de Infusión de Cerebro y Corazón (BHI) a 37ºC durante toda la noche. Se mezclaron 0.5 ml del caldo de cultivo con 0.5 ml del tampón Britton-Robinson 40 mM, pH 6.0, en un contenedor de vidrio aforado de 20 ml. Se añadieron 500 \muM de PPT o POP y 5 LAMU/ml de la lacasa Myceliophthora thermophila a una mezcla según la tabla siguiente. Se agitó manualmente durante 10 minutos a temperatura ambiente. El mal olor fue puntuado.

6

Ejemplo 5 Reducción del mal olor (trimetilamina)

Se añadieron 5 LAMU/ml de la lacasa Myceliophthora thermophila y 25\mul de trimetilamina a 10.0 ml de tampón Britton-Robinson 40 mM, pH 6.0, en una botella de vidrio aforada de 50 ml. Las botellas fueron selladas con un tapón de caucho. La reacción se inició al añadir 500 \mul del mediador PPT. Tiempo de reacción 30 minutos a 37ºC. Las botellas fueron agitadas manualmente durante las reacciones. El mal olor fue puntuado por un panel de tres personas.

7

Como se puede observar en la tabla anterior casi todo el mal olor provocado por la trimetilamina desapareció después de someterla a una mezcla de lacasa y el mediador PPT.

Ejemplo 6 Reducción del mal olor (ácidos grasos cortos)

Se añadieron 5 LAMU/ml de la lacasa Myceliophthora thermophila y 10 \mul de ácido butírico a 10.0 ml de tampón Britton-Robinson 40 mM, pH 6.0, en una botella de vidrio aforada de 50 ml. Las botellas fueron selladas con un tapón de caucho. La reacción se inició al añadir 500 \mul del mediador PPT. Tiempo de reacción 30 minutos a 37ºC. Las botellas fueron agitadas manualmente durante las reacciones. El mal olor fue puntuado por un panel de tres personas.

8

Ejemplo 7 Reducción del mal olor (VSC) con varios mediadores

La capacidad para eliminar el mal olor provocado por el metanotiol fue evaluada usando 1 \mul de solución de metanotiol 1.5% (0.11 mM) añadida a un volumen total de 2.0 ml de tampón Britton-Robinson 20 mM, pH 6.5, en una botella de vidrio cerrada de 20 ml.

Se añadieron 5 LAMU/ml de la lacasa Myceliophthora termofila y el mediador y fueron reaccionados durante 30 minutos a 37ºC bajo las condiciones de reacción: 37ºC, 30 minutos, agitación manual durante las reacciones.

9

Ejemplo 8 Reducción del sabor cocinado de la leche UHT

Dos muestras de 10 ml de leche UHT fueron tratadas como sigue:

10

La leche UHT usada fue leche desnatada tratada a 140ºC (disponible por Kl\phiver Maelk A.m.b.a., Frederikcia, Dinamarca).

La lacasa usada fue una derivada de Myceliophthora thermophila, actividad: 3760 LAMU/g (disponible por Novo Nordisk A/S, Dinamarca).

A la muestra también se añadió ácido clorogénico como mediador.

La concentración de oxígeno en la leche UHT fue medida en 0.94 mg/l usando un electrodo de oxígeno Clark (Rank Brothers, GB) y un Oxímetro Oxi 3000 (Wissenschaftlische Werkstätten G.m.b.H., DE). Se identificó propanal, butanal, hexanal, nonanal y dimetil sulfuro por GS-MS (espectrometría de gas/masa) usando una trampa en el espacio de la cabeza (Büchi, Rotavapor R-134, con un concentrador de purga y trampa con automuestreador y calentador de muestras de bolsillo, tipo Tekmar) acoplada al equipamiento de Cromatografía de Gas-Espectometría de Masa (Hewlett Packard, sistema G1800A GCD). Un sabor a cocinado pronunciado fue identificado por un panel de 7 evaluadores.

El análisis posterior de las muestras mostró que todos los compuestos anteriores habían desaparecido en la muestra del experimento, mientras que seguían presentes en la muestra de control.

El panel sensorial no pudo identificar nada de sabor a cocinado en la muestra del experimento, mientras que fue muy pronunciado en la muestra de control.

Ejemplo 9 Experimentos comparativos entre la Lacasa Myceliophthora thermophila y la Tirosinasa de champiñón

A: se mezclaron 10 1d de una solución de metanotiol de sodio 0.15% (0.11 mM) con 500 \muM del mediador (concentración final) (extracto de té Oolong 0.5%, en caso de ser usado) y Tampón Britton-Robinson 20 mM (concentración final), pH 6.5, en botellas de vidrio aforado de 20 ml hasta un total de 2.0 ml.

Las botellas se dejaron reposar durante 5 minutos a 37ºC. El mal olor fue puntuado.

Se añadieron las enzimas y mediadores usados según la tabla siguiente.

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Clasificación

4: Referencia u olor de referencia

3: Olor claro

2: Olor débil

1: Olor muy débil

0: Nada de olor.

B: En lugar de metanotiol de sodio, su usó 1 ml de la placa lingual cultivada. La placa lingual fue recogida de dos sujetos e inoculada en BHI (el aire fue reemplazado por nitrógeno). La placa inoculada fue cultivada durante toda la noche a 37ºC.

Los resultados se muestran a continuación.

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Como se muestra en las tablas, la lacasa rMt es más eficaz en la eliminación del mal olor que la Tirosinasa de champiñón, en cuanto al peso de proteína enzimática.

Ejemplo 10 Reacción de la lacasa rMt, la tirosinasa de champiñón y los mediadores

Se mezclaron 500 \muM de mediador (excepto el té Oolong que fue del 0.5%), metanotiol de sodio 0.11 mM, tampón Britton-Robinson 20 mM, pH 6.5, en las mismas cantidades y bajo lo mismas condiciones que en el ejemplo 9.

La \Deltaabsorbancia/min/mg proteína enzimática fue medida en 400 nm. El resultado con los diferentes mediadores se muestra en la tabla siguiente.

\Deltaabsorbancia/min/mg proteína enzimática

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Como se puede observar en la tabla, la lacasa rMt desarrolla color más eficazmente que la tirosinasa de champiñón, lo cual indica que la lacasa rMt produce un compuesto reactivo de o-quinona más eficazmente que la tirosinasa de champiñón.

Los resultados se obtienen mediante la dosificación de 0.01-0.2 mg/ml de proteína enzimática en metanotiol de sodio 0.11 mM, ácido clorogénico 500 mM y tampón Britton-Robinson 40 mM, pH 6.5, a temperatura ambiente.

Ejemplo 11 Comparación entre Lacasa rKt, rPp, rCc y Triosinasa de champiñón (Sigma)

Las mezclas del Ejemplo 8A fueron añadidas a las enzimas según la tabla siguiente. El mal olor fue puntuado por un panel tras 5 minutos a 37ºC.

14

Clasificación

4: Referencia u olor de referencia

3: Olor claro

2: Olor débil

1: Olor muy débil

0: Nada de olor.

Como se muestra en la tabla, las diferentes lacasas fueron más eficaces en la eliminación del mal olor que la Tirosinasa de champiñón, en cuanto al peso de proteína enzimática.

Reacción de la lacasa rMt, la tirosinasa de champiñón y los donantes

Se mezclaron 500 \muM de mediador (excepto el té Oolong que fue del 0.5%), metanotiol de sodio 0.11 mM, tampón Britton-Robinson 20 mM, pH 6.5, en las mismas cantidades y bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 9.

La \Deltaabsorbancia/min/mg proteína enzimática fue medida a 400 nm. El resultado con las diferentes enzimas es mostrado en la tabla siguiente.

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Como se muestra en la tabla, las lacasas desarrollan color más eficazmente que la tirosinasa de champiñón, lo cual indica que las lacasas producen un compuesto reactivo de o-quinona más eficazmente que la tirosinasa de champiñón.

Ejemplo 12 Comparación entre peroxidasa y lacasa

Se mezclaron 10 \muL de solución de metanotiol de sodio 0.15% (0.11 0 mM) con 500 \muM de ácido clorogénico y tampón Britton-Robinson 20 mM, pH 6.5, en botellas de vidrio aforado de 20 ml hasta un total de 2.0 ml. En el caso de las peroxidasas, se añadió 1 mM hidrogenperóxido.

Las botellas se dejaron reposar 5 minutos a 37ºC. El mal olor fue puntuado.

Las enzimas fueron añadidas según la tabla de abajo.

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Clasificación del olor:

-: Nada de olor

+: Olor

N.D.: No realizado.

Como se muestra en la tabla, las peroxidasas fueron tan eficaces como la lacasa en la eliminación del mal olor, pero en una concentración inferior.

Reacción de la lacasa rMt y las peroxidasas con ácido clorogénico

Se determinó la \Deltaabsorbancia de soluciones que contenían 500 \muM de ácido clorogénico, 1 mM de peróxido de hidrógeno (sólo para las peroxidasas), metanotiol de sodio 0.11 mM, tampón Britton-Robinson 20 mM, pH 6.5, a temperatura ambiente y las enzimas diferentes, en 400 nm.

Peroxidasa

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Lacasa y Tirosinasa

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Como se muestra en las tablas, las peroxidasas desarrollan color más eficazmente que las lacasas y la tirosinasa de champiñón, lo cual indica que las peroxidasas producen el compuesto reactivo de o-quinona más eficientemente.

La tabla también muestra que la lacasa desarrolla color más eficazmente que la tirosinasa.

Claims

1. Composición para la reducción del mal olor que comprende (I) una lacasa derivada de Mycelíophthora thermophila, y (II) un mediador seleccionado del grupo que se compone de ácido clorogénico y ácido cafeico y ésteres derivados, y extracto de té Oolong.

2. Composición según la reivindicación 1, que además comprende ingredientes usados en detergentes.

3. Composición según la reivindicación 2, que es un detergente que comprende una lipasa como un ingrediente activo.

4. Producto que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Producto según la reivindicación 4, que es un producto para el cuidado bucal.

6. Producto según la reivindicación 4, que es un producto higiénico.

7. Producto según la reivindicación 4, que es un producto para la eliminación del sabor a quemado.

8. Producto según la reivindicación 4, que es un producto sanitario.

9. Uso de la composición según la reivindicación 1 para la reducción del mal olor.