ES2235847T3

ES2235847T3 - Utilizacion de colagenasa en la preparacion de cultivos de celulas madre neuronales.

Info

Publication number: ES2235847T3
Application number: ES00915987T
Authority: ES
Inventors: Nobuko Uchida
Original assignee: StemCells Inc
Current assignee: Microbot Medical Inc
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: EP1155116A1; JP2002536991A; JP2010227127A; DE60017875D1; WO2000050572A9; US20010055808A1; DK1155116T3; US6238922B1; AU764499B2; ATE288481T1; DE60017875T2; EP1533367A1; EP1155116B1; CA2363851A1; WO2000050572A1; US7049141B1; CA2363851C; JP4585124B2; AU3716300A

Abstract

Método para la proliferación in vitro de un cultivo de células madre neuronales, en el que dicho método excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: (a) obtener un tejido neuronal disociado en una suspensión celular, conteniendo la suspensión una o más células madre neuronales multipotentes capaces de producir una progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glías; (b) cultivar la suspensión celular en un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar las células madre neuronales de (a) para generar un cultivo de células madre neuronales; y (c) realizar el pasaje del cultivo celular de (b) mediante el tratamiento del cultivo con una cantidad de una preparación de colagenasa eficaz para disociar las células en el cultivo y realizar el pasaje del cultivo celular a un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar adicionalmente el cultivo de células madre neuronales.

Description

Utilización de colagenasa en la preparación de cultivos de células madre neuronales.

Reivindicación de prioridad

La presente invención reivindica prioridad de la solicitud de la Patente USA 09/258529, publicada el 26 de febrero de 1999.

Sector de la técnica al que pertenece la invención

La presente invención se refiere de modo general a un proceso de producción o de fabricación para la proliferación in vitro y el cultivo de células madre neuronales utilizando colagenasa para disociar las células cultivadas.

Antecedentes de la invención

El desarrollo del sistema nervioso central de mamíferos (CNS) comienza en la etapa inicial del desarrollo fetal y continúa hasta el periodo post-natal. El CNS del mamífero maduro se compone de células neuronales (neuronas), y de células gliales (astrocitos y oligodendrocitos). La primera etapa en el desarrollo neuronal es el nacimiento celular, que es la secuencia temporal y espacial precisa, en el que proliferan células madre y la progenie de células madre (es decir, células hijas y células progenitoras).

Una característica que identifica una célula madre es su capacidad de exhibir autorrenovación o de generar más células iguales a sí misma. Se da una definición de una célula madre por Potten & Loeffler, 110 Development 1001 (1990) que han definido las células madre como "células no diferenciadas capaces de (a) una proliferación, (b) automantenimiento, (c) producción de un gran número de progenies funcionales diferenciadas, (d) regenerar el tejido después de una herida, y (e) una flexibilidad de utilización de estas opciones". El papel de las células madre es reemplazar células que se han perdido por muerte natural, por heridas o por enfermedad.

Las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832 (ambas de Weiss) y 5.753.506 (de Johe) se refieren a cultivos in vitro que contienen células madre neuronales. Las patentes de Weiss se refieren al cultivo en suspensión y adherente, mientras que Johe se refiere a cultivos adherentes particulares. Cuando se propagan las células como neuroesferas en un cultivo en suspensión, durante 3-4 días en presencia de un factor de crecimiento que induce a la proliferación, una célula madre neuronal multipotente comienza a dividirse dando lugar a un grupo de células no diferenciadas que se designan como una "neuroesfera". Las células de una neuroesfera simple son clónicas por naturaleza porque son la progenie de una célula madre neuronal simple. En la presencia continua de uno o más factores de crecimiento que inducen a la proliferación, tales como EGF, bFGF, o similares (y combinaciones de los mismos), las células en la neuroesfera continúan dividiéndose resultando en un incremento de tamaño de la neuroesfera y en el número de células no diferenciadas. Las células en la neuroesfera son inmunorreactivas para la nestina, una proteína intermediaria filamentosa encontrada en muchos tipos de células del CNS no diferenciadas. Por el contrario, los tipos de células diferenciadas maduras derivadas a partir de la progenie de la célula madre neuronal son predominantemente negativas para la nestina.

En la técnica anterior, se han disociado mecánicamente las células en el grupo mediante trituración para producir células simples entre pasajes. La trituración, debido a que es un proceso mecánico, ejerce fuerzas de cizalladura sobre las células, que pueden reducir la viabilidad celular entre los pasajes. El objeto de la presente invención es dar a conocer un cultivo mejorado y un proceso de fabricación que aumenta la viabilidad celular desde un pasaje a otro y que mantiene la mayoría de células primitivas (con el potencial mayor de diferenciación y de capacidad de autorrenovación).

Características de la invención

La invención da a conocer un método para la proliferación in vitro de un cultivo de células madre neuronales multipotentes, en el que dicho método excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas, utilizando colagenasa para disociar células en neuroesferas entre pasajes. De acuerdo con el método de la presente invención, la utilización de colagenasa resulta en una viabilidad mejorada de cultivo de células madre neuronales, un aumento del número de células proliferadas en aquéllos cultivos a lo largo del tiempo, y en un mantenimiento mejorado de los cultivos celulares, tal como se compara con la disociación mediante trituración u otros tratamientos enzimáticos tales como la tripsinización.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 muestra una comparación entre el método de trituración de la técnica anterior para disociar neuroesferas humanas de proliferación y el método de colagenasa de la invención, demostrando un número incrementado de células viables a lo largo del tiempo utilizando el método de colagenasa.

Descripción detallada de la invención Introducción

La invención da a conocer un nuevo proceso de fabricación para la proliferación de cultivos de células madre neuronales, en el que dicho método excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas, utilizando colagenasa para disociar neuroesferas (células "agregadas"). Este método resulta en una viabilidad de cultivo de células madre neuronales inesperadamente mejorada y en un incremento de número de células proliferadas a lo largo del tiempo, tal como se compara con los métodos de trituración y tripsinización de la técnica anterior para disociar cultivos de células madre neuronales.

En una realización del proceso de fabricación de la colagenasa, se recogen las células neuroesferas y se centrifugan (por ejemplo, a 1000 rpm durante 3-5 minutos). Después de aspirar el medio, se resuspenden las neuroesferas en una solución de colagenasa (por ejemplo, 1 ml de una solución de 0,5 mg/ml precalentada (37ºC)), y se incuban con la colagenasa. Después de la incubación, se diluye la suspensión celular en el medio y se cultivan.

En el método de trituración de la técnica anterior, se recogieron y centrifugaron células neuroesferas. Después de aspirar el medio, se resuspendieron las neuroesferas en \sim200 \mul de medio. Se trituraron las neuroesferas utilizando una pipeta (por ejemplo, un Pipetman P200 con volúmenes de 75 \mul, 100 veces aproximadamente). Luego, se ha diluido la suspensión celular en el medio y se ha cultivado.

Colagenasa. Se puede utilizar cualquier colagenasa que es eficaz para disociar células madre neuronales en un cultivo, en el proceso de fabricación de la invención. La "colagenasa" es una enzima que digiere el colágeno proteico de la matriz extracelular (Harper, 49 Ann. Rev. Biochem. 1063 (1980)). Una fuente de colagenasa es la bacteria Clostridium histolyticum. Un ensayo de la colagenasa es una modificación de Mandl y otros, 32 J. Clin. Invest. 1323 (1953), en la que se incuba la colagenasa durante 5 horas con colágeno nativo. Se determina la proporción de descomposición del colágeno utilizando el método colorimétrico de ninhidrina de Moore & Stein, 176 Biol. Chem 367 (1948). Para la definición de la unidad de colagenasa, una unidad libera un \mumol de equivalentes de L-leucina a partir de colágeno durante 5 horas a 37ºC, pH 7,5.

Se pueden utilizar colagenasas crudas para procedimientos de disociación celular. Las preparaciones de la colagenasa cruda contienen no solamente varias colagenasas, sino también una proteasa de sulfhidrilo, clostripaína, una enzima similar a tripsina, y una aminopeptidasa. En algunas realizaciones, las preparaciones de colagenasa cruda son preferentes debido a la presencia de estas actividades adicionales. Esta combinación de actividades colagenolíticas y proteolíticas es eficaz para descomponer matrices intercelulares, la parte esencial de la disociación del tejido. Se inhibe la colagenasa cruda mediante agentes quelantes de metal tales como cisteína, EDTA u o-fenantrolina. También se inhibe mediante alfa-2-macroglobulina, una glicoproteína grande de plasma. Para la actividad enzimática se requiere la utilización de Ca^{2+}.

Las fuentes de colagenasa comercialmente disponibles son útiles en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, la colagenasa purificada contiene actividades proteolíticas secundarias mínimas, pero con una alta actividad de colagenasa. La colagenasa purificada puede ser colagenasa H (cat # 1087789) de Boerhinger Mannheim (Indianápolis, IN). Se prepara una solución de reserva de 0,5 mg/ml de colagenasa en DPBS que contiene 0,1% de BSA, y se almacena a -20ºC. Otras fuentes comercialmente disponibles son Dispase® (Boehringer Mannheim), Liberase® (Boehringer Mannheim) o colagenasa (Serva). El rango de colagenasa utilizado puede estar desde 100-1000 \mug/ml (18-180 mU/ml), preferentemente entre 300-700 \mug/ml, (54-126 mU/ml), siendo el más preferente de 500 \mug/ml (90 mU/ml) aproximadamente.

Aislamiento y proliferación in vitro de células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes

Los neurobiólogos han utilizado varios términos de forma intercambiable para describir las células no diferenciadas del CNS. En la literatura científica, se han utilizado términos tales como "célula madre", "célula precursora" y "célula progenitora". Sin embargo, existen diferentes tipos de células neuronales no diferenciadas, con diferentes características y destinos. La terminología utilizada para las células neuronales multipotentes no diferenciadas ha evolucionado de tal modo que actualmente estas células se nominan "células madre neuronales". La Patente USA 5.750.376 define la célula "madre neuronal" proliferada in vitro como "una célula madre oligopotente o multipotente que es capaz de dividirse sin limite y, bajo condiciones específicas, puede producir células hijas que se diferencian terminalmente en neuronas y glías". La capacidad de una célula en dividirse sin límite y producir células hijas que se diferencian terminalmente en neuronas y glías son características de las células madre del CNS. Una célula madre neuronal del CNS es capaz de automantenerse, lo que significa que con cada división celular, una célula hija será también una célula madre. Se puede inducir una célula madre neuronal del CNS a la proliferación utilizando los métodos de la presente invención.

La progenie de la célula no madre de una célula madre neuronal puede incluir células progenitoras. Las células progenitoras generadas de una célula madre neuronal del CNS que es autorrenovable, multipotente y simple, son capaces de diferenciarse en neuronas, astrocitos (de tipo I y tipo II) u oligodendrocitos. Por el contrario, la célula madre neuronal del CNS es "multipotente" porque su progenie tiene múltiples vías de diferenciación.

Una "célula progenitora neuronal" es una célula no diferenciada derivada de una célula madre neuronal del CNS autorrenovable y multipotente, y no es en sí una célula madre. Algunas células progenitoras pueden producir una progenie que es capaz de diferenciarse en más de un tipo celular. Por ejemplo, una célula O-2A es una célula progenitora glial que da lugar a oligodendrocitos y astrocitos de tipo II y, por lo tanto, se podría nombrar una célula progenitora "bipotencial". Una característica que distingue una célula progenitora es que, a diferencia de una célula madre, la capacidad de proliferación está limitada y, por lo tanto, no exhibe un automantenimiento. Se designa a una vía particular de diferenciación y, bajo condiciones apropiadas, se diferenciará eventualmente en glías o neuronas.

El término "células precursoras" se refiere a la progenie de células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes y, por consiguiente, incluye ambas células progenitoras y células hijas neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes.

Se pueden obtener células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes a partir del tejido neuronal embrionario, post-natal, juvenil o adulto (excluyendo el tejido embrionario humano en vista de la ley 23d EPC). La fuente preferente de tejido neuronal se obtiene a partir de mamíferos, preferentemente de roedores (por ejemplo, ratones y ratas) y de primates, siendo el más preferente a partir de humanos (excluyendo tejidos embrionarios humanos en vista de la ley 23d EPC). Se dan a conocer por Weiss y otros en las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832 un método para el aislamiento, proliferación, y pasaje de células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes a partir de tejido neuronal humano adulto, mono adulto (Rhesus),tejido neuronal, tejido neuronal embrionario de ratón, y de tejido cerebral de ratón juvenil y adulto, incluyendo el establecimiento de células madre neuronales en el cultivo a partir de células madre neuronales del CNS, así como la diferenciación de la progenie de la célula madre neuronal del CNS. Sin embargo, en el método de la presente invención, se tratan las neuroesferas mediante colagenasa para disociar las células agregadas, en vez de la trituración o la tripsinización de acuerdo con los métodos utilizados por Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832 y por Johe en la Patente USA 5.753.506.

Se pueden obtener células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes a partir de tejido donante excluyendo tejido embrionario humano, mediante disociación de células individuales a partir de la matriz extracelular contigua del tejido, tal como se ha descrito por Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832 y por Johe en la Patente USA 5.753.506. Se elimina el tejido a partir de una región neuronal utilizando un procedimiento estéril, y las células se disocian en el medio de cultivo del tejido utilizando cualquier método conocido en el sector, incluyendo tratamiento con enzimas tales como tripsina, colagenasa y similar, o mediante la utilización de métodos físicos de disociación tales como con un instrumento de aguja corta, tal como se ha descrito por Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832. Se centrifugan las células disociadas a baja velocidad, entre 200 y 2000 rpm, usualmente entre 400 y 1000 rpm, y luego se resuspenden en un medio de cultivo. Se pueden cultivar las células neuronales en suspensión o sobre un sustrato fijo. Se siembran las suspensiones celulares en cualquier recipiente capaz de sostener las células, particularmente frascos de cultivo, placas de cultivo o botellas cilíndricas, y más particularmente en frascos pequeños de cultivo tales como frascos de cultivo de 25 cm^{2}. Se resuspenden las células cultivadas en suspensión a aproximadamente 5x10^{4} a 1x10^{6} células/ml, preferentemente a 1x10^{6} células/ml (durante 20 semanas g. w. tejido). Se depositan las células depositadas sobre un sustrato fijo a aproximadamente 2-3 x 10^{3} 10 células/cm^{2}, preferentemente a 2,5 x 10^{3} células/cm^{2}.

Se pueden hacer proliferar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa, incluyendo las células madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes de las neuroesferas, tanto sobre sustratos como en suspensión, preferentemente formando grupos de células no diferenciadas asociadas que se designan como "neuroesferas". Después del cultivo en ausencia de un sustrato, las neuroesferas de proliferación se despegan del fondo del recipiente de cultivo y tienden a formar grupos de flotación libre característicos de las neuroesferas. Las células precursoras de proliferación de la neuroesfera continúan proliferando en suspensión. Las neuroesferas del cultivo en suspensión pueden realizar pasajes fácilmente para reiniciar la proliferación. En el método de la invención, se separan células individuales en las neuroesferas mediante tratamiento de colagenasa. Luego se depositan las células neuroesferas tratadas con colagenasa a la densidad deseada para reiniciar la proliferación. Se suspenden células simples, que provienen de las neuroesferas disociadas, en un medio de cultivo que contiene el factor de crecimiento, y un porcentaje de estas células proliferan y forman nuevas neuroesferas que se componen de modo amplio de células no diferenciadas. Se puede repetir este proceso de fabricación para obtener como resultado un incremento logarítmico en el número de células viables en cada pasaje. Se continúa el procedimiento hasta que se obtiene el número deseado de
células.

Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832, dan a conocer "medio de cultivo que contiene uno o más factores de crecimiento predeterminados eficaces para inducir la proliferación de células madre neuronales multipotentes". Sin embargo, se pueden utilizar medios básicos diferentes incluyendo, pero sin limitación a los
mismos:

D-MEM/F12 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD);

Ex Vivo 15 (Bio Whittaker, Walkersville, MD);

Medios básicos progenitores neuronales, (Clonetics. San Diego, CA); o

combinación de los medios básicos listados anteriormente.

Se suplementa el medio de cultivo, por lo menos, con un factor de crecimiento que induce a la proliferación. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido u otra molécula que tiene un efecto de crecimiento, proliferación, diferenciación o efecto trófico sobre células madre neuronales y/o progenie de células madre neuronales. Los factores de crecimiento que se pueden utilizar para inducir a la proliferación incluyen cualquier factor trófico que permite la proliferación de las células madre neuronales y de las células precursoras, incluyendo cualquier molécula que se une a un receptor en la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico o un efecto que induce al crecimiento sobre la célula. Los factores preferentes de crecimiento que inducen a la proliferación incluyen miembros de la superfamilia EGF, superfamilia FGF, y superfamilia TGF^{\alpha}, tales como EGF, anfirregulina, factor de crecimiento de fibroblasto ácido (aFGF ó FGF-1), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF ó FGF-2), factor alfa de crecimiento de transformación (TGF^{\alpha}), factor inhibitorio de leucocito (LIF), glicostatina C y combinaciones de los mismos. Una combinación preferente de los factores de crecimiento que inducen a la proliferación es EGF ó TGF^{\alpha} con FGF-1 ó FGF-2. Usualmente, se añaden factores de crecimiento al medio de cultivo a concentraciones que están en un rango de entre 1 fg/ml y 1 mg/ml aproximadamente. Usualmente, las concentraciones que están entre 1 y 100 ng/ml aproximadamente son suficientes. Se pueden realizar fácilmente experimentos de titulación simple para determinar la concentración óptima de un factor de crecimiento particular.

La optimización de la formulación de los medios permite un porcentaje más alto de neuroesferas iniciadas a partir de tejido cerebral primario que se debe establecer. Es preferente la utilización del medio Ex vivo 15. La optimización de la formulación de los medios permite también un crecimiento más consistente de las neuroesferas. Para maximizar el desarrollo de las neuroesferas, se cultivan típicamente células neuroesferas tratadas con colagenasa en presencia de LIF, bFGF, EGF, y factor de supervivencia neuronal, NSF (Cat. CC-4323, Clonetics, San Diego, CA).

Se presenta en la tabla 1 una formulación típica de los medios para cultivar cultivos de células madre neuronales humanas.

TABLA 1

1

Se añade EGF a 100 ml de medio base para cultivos de células madre neuronales humanas después de filtrar el medio. EGF es relativamente estable en el medio. Cuando el medio está listo para su utilización, se añaden FGF-2 y LIF. Las concentraciones finales de los reactivos de suplemento son:

TABLA 2

2

También se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando los paradigmas de diferenciación tal como se ha descrito por Weiss y otros, patentes USA 5.750.376 y 5.851.832. Por ejemplo, (1) se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa mediante una diferenciación rápida después de depositarse sobre una cubierta de vidrio recubierta con poli-L-omitina en un medio que contiene un 0,5% de suero bovino fetal (FBS); (2) se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando neuroesferas disociadas en un medio completo libre de EGF que contiene un 1% de FBS; (3) se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando neuroesferas simples depositadas sobre cubiertas de vidrio recubiertas con laminina; (4) se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando neuroesferas simples disociadas, tratadas con colagenasa, y depositadas sobre un recipiente de cultivo de 35 mm; (5) se pueden diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando neuroesferas cocultivadas con astrocitos estriatales. En un método preferente de diferenciación, se depositan células neuroesferas sobre un sustrato recubierto con laminina en presencia de FBS. Se prueban las células diferenciadas resultantes mediante inmunocitoquímica indirecta para la presencia de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, por ejemplo, utilizando anticuerpos a MAP-2, tau-1, neurofilamento 168 kDa, \beta-tubulina, GABA, sustancia P (marcadores neuronales), GFAP (un marcador astrocito), O4 y MBP (marcadores oligodendrocitos). Se prevé la identificación de los tres tipos de las células neuronales.

Modificación genética de cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa

Se pueden modificar genéticamente los cultivos de células madre neuronales descritas en la presente invención de acuerdo con cualquier método adecuado y conocido en el sector, incluyendo modificación genética in vitro, o generación de cultivos de células madre neuronales modificadas genéticamente a partir de mamíferos transgénicos. Se realiza la modificación genética de células madre neuronales tanto mediante infección con los retrovirus recombinantes como mediante transfección utilizando métodos conocidos en el sector (ver, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989). Se describen métodos para hacer cultivos de células madre neuronales modificadas genéticamente, por ejemplo, en Weiss, Patente USA 5.750.376.

Generalmente, el término "modificación genética" se refiere a la alteración estable o transitoria del genotipo de una célula precursora mediante la introducción intencionada de ADN exógeno. El ADN puede ser sintético, o derivado de una fuente natural, y puede contener genes, porciones de genes, u otras secuencias útiles de ADN. El término "modificación genética" incluye varios métodos de activación génica conocidos en el sector. Ver por ejemplo, patentes USA 5.733.761 y 5.733.746.

En realizaciones concretas, se modifican genéticamente las células madre neuronales para producir una molécula biológicamente activa, incluyendo hormonas, enzimas, neurotransmisores, anticuerpos, citocinas, linfocinas, factores de crecimiento, factores tróficos, o modificadores de respuesta biológica. Alternativamente, se modifican genéticamente las células madre neuronales para dar una función metabólica o inmunológica bajo implante en un huésped, preferentemente un humano. También puede ser deseable modificar genéticamente células de modo que segreguen un producto concreto de factor de crecimiento. El término "producto de factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido, mitogeno, u otra molécula que tiene un efecto de crecimiento, de proliferación, de diferenciación o efecto trófico (por ejemplo, NGF, BDNF, las neurotrofinas, CNTF, anfirregulina, FGF-1, FGF-2, EGF, TGF-_{\alpha}, TGF-_{\beta s}, PDGF, IGF_{S} y las interleucinas). También, se pueden modificar células progenies de neuroesferas para expresar un receptor concreto de factor de crecimiento (por ejemplo, receptor NGF de baja afinidad p75, receptor CNTF, la familia trk de receptores neurotrofinas, EGF-R, FGF-R, y receptores anfirregulina). Se puede realizar ingeniería sobre cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa para producir varios neurotransmisores, receptores neurotransmisores, o enzimas que sintetizan neurotransmisores.

Transplante de cultivos de células madre neuronales para aliviar desórdenes humanos

Se pueden producir cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa y transplantar a mamíferos huéspedes, preferentemente pacientes humanos, para el tratamiento de varios desórdenes en el sistema nervioso central ("CNS") de forma sistemática. Se envían las células al sujeto mediante cualquier medio adecuado conocido en el sector. Si se envía al sistema nervioso central, entonces se administran las células a una región particular utilizando cualquier método que mantiene la integridad de los alrededores del cerebro, preferentemente mediante cánula de inyección. Son preferentes los métodos de inyección descritos como ejemplos en Duncan y otros, 17 J. Neurocytology 351-361 (1988), y mejorados y modificados para su utilización en humanos. También se pueden emplear métodos para la inyección de suspensiones celulares, tales como fibroblastos, en el CNS para la inyección de células precursoras neuronales. Se pueden encontrar enfoques y métodos adicionales en Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund & Stenevi, eds. (1985).

Se pueden producir y transplantar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando los procedimientos anteriores para tratar varios desórdenes neurodegenerativos. Los desórdenes del CNS de este tipo comprenden aflicciones numerosas tales como enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, Alzheimer y Parkinson), herida cerebral aguda (por ejemplo, golpe, herida en la cabeza, parálisis cerebral) y un gran número de disfunciones del CNS (por ejemplo, depresión, epilepsia, y esquizofrenia). En los últimos años la enfermedad neurodegenerativa se ha convertido es una preocupación importante debido a la expansión de la población de mayor edad que están en un gran riesgo para estos desórdenes. Estas enfermedades, que incluyen la enfermedad del Alzheimer, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Parkinson, han estado relacionadas con la degeneración de células neuronales en sitios particulares del CNS, induciendo a la incapacidad de estas células o de la región cerebral para llevar a cabo su función pretendida. En la preparación de la maduración, proliferación y diferenciación en uno o más linajes seleccionados a través de diferentes factores de crecimiento específicos, se pueden utilizar las células progenitoras como una fuente de células comprometidas. En una serie de realizaciones, se pueden producir y transplantar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando los procedimientos anteriores para el tratamiento de enfermedades de desmielinización. Se puede utilizar cualquier método adecuado para el implante de células que están cerca de las dianas desmielinizadas de modo que se pueden asociar las células con los axones desmielinizados.

Se pueden utilizar también cultivos de células madre neuronales preparadas de acuerdo con la presente invención para producir una variedad de tipos de células sanguíneas, incluyendo células mieloides y linfoides, así como células hematopoiéticas precoces (ver, Bjornson y otros, 283 SCIENCE 534 (1999)).

Modelos in vitro del desarrollo del CNS, función y disfunción, y métodos para los efectos del análisis de los medicamentos sobre las células

Se pueden utilizar cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa cultivadas in vitro para el análisis de compuestos potenciales neurológicamente terapéuticos. Se pueden aplicar estos compuestos a células en cultivo a varias dosis, y se controla la respuesta de las células para varios periodos de tiempo. Se pueden analizar las características físicas de las células mediante la observación de la célula y del crecimiento axónico con el microscopio. Se puede analizar la inducción de expresión de niveles nuevos o incrementados de proteínas tales como enzimas, receptores y otras moléculas de superficie celular, o de neurotransmisores, aminoácidos, neuropéptidos y aminas biogénicas, con cualquier técnica conocida en el sector que pueda identificar la alteración del nivel de las moléculas de este tipo. Estas técnicas incluyen la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra moléculas de este tipo, o el análisis bioquímico. El análisis bioquímico de este tipo incluye ensayos de proteína, ensayos enzimáticos, ensayos de unión de receptor, ensayos de inmunoabsorbencia (ELISA) relacionada por enzimas, análisis electroforético, análisis con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ensayo "Western blot", y ensayos radioinmunes (RIA). Se puede utilizar el análisis del ácido nucleico tal como ensayo "Northern blot" para examinar los niveles de codificación de ARNm para estas moléculas, o para enzimas que sintetizan estas moléculas. Alternativamente, se pueden transplantar células tratadas con estos compuestos farmacéuticos a un animal, y se pueden examinar su supervivencia y su capacidad para formar conexiones neuronales, y las características bioquímicas e inmunológicas tal como se ha descrito previamente.

Se pueden utilizar los cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa en métodos para determinar el efecto de agentes biológicos sobre células neuronales. El término "agente biológico" se refiere a cualquier agente, tal como un virus, proteína, péptido, aminoácido, lípido, hidrato de carbono, ácido nucleico, nucleótido, medicamento, promedicamento u otra sustancia que pueda tener un efecto sobre células neuronales ya sea un efecto nocivo, beneficioso u otro distinto. Los agentes biológicos que son beneficiosos a las células neuronales se refieren en la presente invención como "agentes neurológicos", un término que comprende cualquier sustancia biológica o farmacéuticamente activa que puede ser potencialmente útil para la proliferación, diferenciación o funcionamiento de células del CNS o para el tratamiento de enfermedad o desorden neurológico. Para determinar el efecto de un agente biológico potencial sobre células neuronales, se obtiene un cultivo de los cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa y se proliferan in vitro en presencia de un factor de crecimiento que induce a la proliferación. Generalmente, se solubilizará el agente biológico y se añadirá al medio de cultivo en varias concentraciones para determinar el efecto del agente en cada dosis. Se puede rellenar el medio de cultivo con el agente biológico cada dos días en cantidades suficientes para mantener algo constante la concentración del agente.

Por consiguiente, es posible realizar un estudio para agentes biológicos que aumentan la capacidad de proliferación de células progenitoras que sería útil para generar un gran número de células para finalidades de implante. También es posible realizar un estudio para agentes biológicos que inhiben la proliferación de células precursoras, utilizando cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa. Además, la capacidad de varios agentes biológicos en aumentar, desminuir o modificar de otro modo el número y la naturaleza de células neuronales diferenciadas se puede estudiar en cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa que se han inducido para la diferenciación. Luego se pueden determinar los efectos de un agente biológico o combinación de agentes biológicos sobre la diferenciación y la supervivencia de células neuronales diferenciadas. También, y previamente a la diferenciación, es posible determinar los efectos de los agentes biológicos sobre el proceso de diferenciación mediante su aplicación a cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa.

Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y a partir de las reivindicaciones. En la descripción y las reivindicaciones adjuntas las formas singulares incluyen referentes plurales excepto si el contexto dicta claramente lo contrario. A menos que sea definido lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado tal como se entiende comúnmente por un técnico en la materia a la que pertenece esta invención. Se presentan los siguientes ejemplos para describir más completamente las realizaciones preferentes de la invención. Estos ejemplos no se deben entender de ningún modo como limitantes al ámbito de la invención, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Protocolo de colagenasa

1.: Aclarar el tejido varias veces con solución salina tamponada con fosfato libre de Ca^{++} y Mg^{++} (PBS).

2.: En una placa petri, cortar el tejido en piezas cúbicas de 1-2 mm utilizando bisturís cruzados. Verter el tejido (volumen comprimido de \sim7,5 ml) y PBS (\sim8 ml) en un tubo de centrifugación de 50 ml. Aclarar la placa con PBS tanto como sea necesario para eliminar el tejido, y transferir al tubo de centrifugación.

3.: Centrifugar los tubos suavemente para sedimentar el tejido y las células libres (< 1000 rpm).

4.: Eliminar con cuidado el sobrenadante utilizando una línea de vacío.

5.: Hasta 1,0 gr de tejido, añadir 5,0 ml de 0,1% de colagenasa, 0,1% de hialuronidasa en HBSS sin Ca^{++}, Mg^{++} que contiene 1,0% de albúmina de suero bovino (BSA).

6.: Incubar en baño maría a 37ºC con agitación ligera ocasional durante 1 hora. Al final de la hora, realizar un vórtice durante 3 s aproximadamente, y evaluar la disociación del tejido. Si permanecen grandes piezas de tejido intacto, continuar la incubación a 37ºC durante otros 30-45 min. Poner el tubo recto durante 1-2 minutos para permitir la deposición de los agregados de las células grandes. Transferir el sobrenadante a un tubo fresco (1).

7.: Rellenar hasta arriba el tubo fresco (1) con PBS + 0,1% de BSA y centrifugar a 900 rpm aproximadamente durante 6 min. Eliminar el sobrenadante, que debería ser turbio con restos, a un tubo fresco de centrifugación de 50 ml (2). Recentrifugar ambos tubos (1) y (2) a 900 rpm.

8.: Quitar el sobrenadante del tubo (1) y examinar el gránulo del tubo (2) para células viables. Si es útil, combinar las células granuladas del tubo (2) con los contenidos del tubo (1). Rellenar el tubo con PBS + 0,1% de BSA y hacer girar durante 6 minutos a 900 rpm, eliminando el sobrenadante al finalizar el vórtice. Resuspender las células en PBS y realizar el contaje con azul tripan. En esta etapa, la suspensión celular debería estar relativamente libre de restos, y debería consistir predominantemente en células sanas.

Ejemplo 2 Resultados de la colagenasa

El tratamiento de colagenasa realizado ha aumentado el número de células madre neuronales viables utilizando el método de colagenasa. Se realiza el contaje de las células en azul tripan sobre hemocitómetro. Un contaje en bruto es el número de células vivas en un área definida.

TABLA 3

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El tratamiento de colagenasa realizado ha aumentado el número de células madre neuronales proliferadas a lo largo del tiempo utilizando el método de colagenasa.

TABLA 4

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TABLA 5

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TABLA 6

6

Se ha presentado la descripción anterior solamente para los propósitos de descripción y no se pretende limitar la invención de la forma precisa descrita, pero sí mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Método para la proliferación in vitro de un cultivo de células madre neuronales, en el que dicho método excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

(a): obtener un tejido neuronal disociado en una suspensión celular, conteniendo la suspensión una o más células madre neuronales multipotentes capaces de producir una progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glías;

(b): cultivar la suspensión celular en un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar las células madre neuronales de (a) para generar un cultivo de células madre neuronales; y

(c): realizar el pasaje del cultivo celular de (b) mediante el tratamiento del cultivo con una cantidad de una preparación de colagenasa eficaz para disociar las células en el cultivo y realizar el pasaje del cultivo celular a un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar adicionalmente el cultivo de células madre neuronales.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo menos, de 60%.

3. Método, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la cantidad de la preparación de colagenasa está entre 18-180 mU/ml.

4. Método, según la reivindicación 3, en el que la cantidad de la preparación de colagenasa está entre 54-126 mU/ml.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la preparación de colagenasa comprende adicionalmente, por lo menos, una molécula seleccionada del grupo que consiste en proteasa de sulfidrilo, clostripaína, aminopeptidasa, o combinaciones de las mismas.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la preparación de colagenasa es sustancialmente pura, y contiene una actividad proteolítica secundaria mínima.

7. Método, según la reivindicación 1, en el que el factor de crecimiento que induce a la proliferación es seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico, anfirregulina, factor de crecimiento de fibroblasto ácido, factor de crecimiento de fibroblasto básico, factor alfa de crecimiento de transformación, factor inhibitorio de leucocitos (LIF), glicostatina C y combinaciones de los mismos.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre neuronales comprende células madre neuronales modificadas genéticamente.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa de diferenciación del cultivo de células madre neuronales de (c) para producir un cultivo celular que comprende células neuronales diferenciadas seleccionadas del grupo que consiste en astrocitos, neuronas, oligodendrocitos, y combinaciones de los mismos.

10. Método, según la reivindicación 1 o la reivindicación 9, que comprende adicionalmente poner en contacto el cultivo de células madre neuronales con un agente biológico, y determinar los efectos del agente biológico sobre células en el cultivo.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre neuronales es un cultivo en suspensión o un cultivo en adherencia.

12. Método, según la reivindicación 2, en el que el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo menos, de 75% después de realizar el pasaje.

13. Método, según la reivindicación 2, en el que el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo menos, de 85% después de realizar el pasaje.

14. Método, según la reivindicación 1, en el que se realiza el pasaje del cultivo celular semanalmente y en el que existe, por lo menos, un incremento de tres veces en el número de células entre los pasajes semanales.

15. Método, según la reivindicación 14, en el que existe, por lo menos, un incremento de cinco veces en el número de células entre los pasajes semanales.

\newpage

16. Método, según la reivindicación 14, en el que se puede ampliar el número de células acumuladas desde 10^{6} células hasta, por lo menos, 10^{9} células en menos de 49 días.

17. Método, según la reivindicación 16, en el que se puede ampliar el número de células acumuladas desde 10^{6} células hasta, por lo menos, 10^{9} células en menos de 42 días.

18. Método, según la reivindicación 14 ó 16, en el que el cultivo de células madre neuronales es un cultivo en suspensión o un cultivo en adherencia.

19. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre neuronales comprende células madre neuronales humanas.