ES2235889T3 - Terapia genica de la enfermedad pulmonar. - Google Patents
Terapia genica de la enfermedad pulmonar.Info
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Abstract
Utilización de un vector de expresión recombinante que comprende un casete de expresión para IL-10 viral (vIL- 10) para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un organismo mamífero que padece una enfermedad inflamatoria pulmonar, en la que dicho medicamento es adecuado para ser administrado a los pulmones.
Description
Terapia génica de la enfermedad pulmonar.
Las respuestas inmunes están mediadas en gran
parte por células derivadas del linaje hematopoyético. La regulación
de las células inmunes en la respuesta inflamatoria está mediada por
las interacciones directas célula-célula e
indirectamente por la secreción de citocinas y quimoquinas que
inducen diversos tipos de respuestas fenotípicas cuando se unen a
los receptores. Las respuestas innatas a las citocinas juegan un
papel fundamental en la iniciación de la inflamación y las
respuestas inmunes aferentes y las citocinas también regulan el tipo
de respuesta inmune aferente de diversas células inmunes que
incluyen, pero no están limitadas a, células-T,
células-B, células-NK, macrófagos,
células dendríticas (y otras células presentadoras de antígenos),
neutrófilos y otras células inflamatorias. Un desequilibrio en las
respuestas a las citocinas puede producir la inducción o la
exageración de respuestas inflamatorias destructivas que producen
una respuesta patológica en el huésped. Además, las respuestas
inflamatorias mediadas por las citocinas pueden limitar
considerablemente la efectividad de los procesos de terapia génica
iniciando y regulando positivamente las respuestas inmunes contra
las células transducidas y los transgenes terapéuticos. Tales
procesos están mediados en gran parte por citocinas proinflamatorias
tales como la IL-1-\alpha,
IL-1-\beta, IL-6,
IL-8 y TNF-\alpha. Por
consiguiente, se necesitan procedimientos para modular las
respuestas inflamatorias mediadas por las citocinas para el
tratamiento de las respuestas inmunológicas inflamatorias
patológicas y para modular las respuestas inmunes que impiden las
terapias génicas efectivas.
Una forma grave de inflamación autodestructiva
con pocas opciones de intervención para un tratamiento efectivo es
el Síndrome de Fatiga Respiratoria Adulta (también denominado
Síndrome de Fatiga Respiratoria Agudo y a partir de aquí
colectivamente denominados ARDS). El ARDS se describió primero en
1967 (Ashbaugh, et al., Lancet
2:319-323 (1967) y se caracteriza por daños
microvasculares pulmonares difusos que producen un incremento de la
permeabilidad e hipoxemia causada por desvíos intrapulmonares. Los
siguientes criterios se utilizan para definir ARDS (Dal Nogare,
Am. J. Med. Sci. 298(6):413-430
(1989), Murray et al., Am. Rev. Respir. Dis.
138:720-723 (1988).
- 1)
- evidencia clínica de fatiga respiratoria;
- 2)
- hipoxemia difícil de corregir con suplemento de oxígeno;
- 3)
- evidencia hemodinámica de oclusión de la arteria pulmonar (cuña) presión <18 mm Hg;
- 4)
- sumisión torácica estática inferior a 40 ml/cm de agua;
- 5)
- radiografía de tórax mostrando enfermedad difusa del espacio aéreo bilateral; edema pulmonar.
Aunque el diagnóstico de ARDS es complejo y se
basa en gran parte en la exclusión, existe un conjunto de criterios
fisiológicos que se pueden utilizar para el diagnóstico. Durante la
fase clínica inicial del ARDS los pacientes generalmente se
presentan con disnea (respiración dificultosa) y taquipnea
(velocidad de respiración acelerada), hipertensión pulmonar y
alcalosis inducida por hiperventilación. La progresión a la segunda
fase ocurre generalmente entre 12 y 24 horas y el análisis de los
gases de la sangre arterial generalmente revela una hipoxemia grave
(por ejemplo, PaO_{2}<200 mm Hg y tan baja como 50 mm Hg).
Además, la hipoxemia con ARDS es difícil de corregir por terapia de
apoyo por ventilación con oxígeno supletorio. Además, el análisis
radiográfico revela consolidaciones pulmonares adicionales
indicativas de edema pulmonar y opacidades infiltradas plumosas a
medida que progresa la infiltración de leucocitos polimorfonucleares
(PMN).
Las dos primeras etapas en la progresión del ARDS
(es decir, 12 a 72 horas a partir del inicio) son una ventana
crítica para la intervención ya que se puede invertir el síndrome si
se pueden controlar los factores iniciadores y los mediadores de la
inflamación. Un diagnóstico temprano se puede también facilitar si
se conoce el estímulo iniciador tal como ocurre en la sepsis,
aspiración del contenido gástrico, transfusiones múltiples,
fracturas graves, quemaduras, pancreatitis o trauma grave. Con la
progresión a una tercera etapa de ARDS aumenta la hipertensión
pulmonar, aumenta la velocidad del corazón para compensar lo
hipoxemia y generalmente se necesita terapia de apoyo con
ventilación mecánica. Patológicamente los infiltrados celulares son
más densos con una infiltración continuada de neutrófilos y con
infiltrados crecientes de células mononucleares, linfocitos y
fibroblastos. Esto está asociado con un incremento en la mortalidad
superior al 50%. Sin embargo, una intervención con éxito puede
todavía producir una resolución completa si se detiene el proceso
patológico. La progresión a la cuarta fase, en la que se produce la
fibrosis pulmonar y el fallo respiratorio progresivo, está
generalmente asociada a una mala prognosis y a una mortalidad
superior al 80% después de producirse el fallo de los sistemas de
múltiples órganos (MOSF).
Con base en el proceso patológico progresivo del
ARDS y en el incremento en la proporción de la mortalidad, puede ser
esencial una intervención temprana con tratamientos que puedan
modular el proceso inflamatorio que media el ARDS. Por consiguiente,
los ensayos funcionales y el seguimiento de la función pulmonar son
esenciales y deben ser una parte integral de diagnóstico temprano y
deben utilizarse para determinar el mejor momento para la
intervención médica con los tratamientos recientemente
desarrollados. A los pacientes en los que se sospecha la existencia
de ARDS se les debe colocar un catéter en la arteria pulmonar para
que sirva como herramienta diagnóstica y para seguir el progreso
después del tratamiento.
A pesar de la extensa investigación para entender
la patología del ARDS, se ha progresado poco en la terapia y el
cuidado de apoyo sigue siendo el régimen de tratamiento
predominante. Existen aproximadamente 150.000 casos de ARDS por año
en los Estados Unidos y una mortalidad relativamente elevada de
aproximadamente 50% (comprendida entre el 30% y el 70%). El proceso
patológico de ARDS es esencialmente una forma de inflamación
pulmonar. Una multiplicidad de condiciones predispone al paciente
para que desarrolle ARDS, incluyendo el trauma grave, la sepsis, la
pancreatitis, el choque hemorrágico, la aspiración del contenido
gástrico, la neumonía, la contusión pulmonar, las quemaduras, la
inhalación de humo y las transfusiones múltiples de sangre. Además,
el ARDS no resuelto produce generalmente el desarrollo del síndrome
de fallo orgánico multisistémico (MOSF) que invariablemente está
asociado con una prognosis muy grave.
Mientras que las condiciones que predisponen a
los pacientes al ARDS son diversas, un componente común es la
infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y la inducción
de las respuestas de citocinas asociadas con el inicio del ARDS. La
mera presencia de un gran número de PMN no es dañina para el pulmón
normal sino que se necesita su activación como etapa inicial para
que medien en el daño pulmonar. Los estímulos que activan a los PMN
incluyen los productos de las bacterias tales como el
lipopolisacárido (LPS) y la
formil-metionil-leucina-fenilalanina
(FMLP), que puede estimular la producción de una gran cantidad de
TNF-\alpha por los macrófagos. Por consiguiente,
la respuesta de citocinas a diversos estímulos inflamatorios puede
desencadenar el daño pulmonar. Los mediadores iniciales del daño
pulmonar en el ARDS incluyen los radicales libres, los
intermediarios de oxígeno reactivo, los metabolitos del ácido
araquidónico y las proteasas. Ya que las terapias de apoyo por
ventilación no reducen de forma significativa la mortalidad, se
necesitan procedimientos para modular la respuesta inflamatoria en
si. Además, debido a que está implicada una multiplicidad de
mediadores de la destrucción de la barrera capilar alveolar, pueden
ser necesarias terapias combinatorias que rectifican los
desequilibrios de las citocinas así como también de los radicales
libres, los metabolitos del ácido araquidónico y las proteasas.
La citocina pleiotrópica, IL-10
es un potente regulador de la síntesis de citocinas y un supresor de
las funciones efectoras de los macrófagos, de las células T y NK. La
IL-10 ha sido identificada como útil para el
tratamiento de muchas situaciones que incluyen la inmunoterapia
adoptiva del cáncer (patente US nº 5.776.451 concedida el 16 de
enero de 1991), el choque séptico (patente US nº 5.833.976 concedida
el 10 de noviembre de 1998 y patente US nº 5.753.218 concedida el 19
de mayo de 1998), para modular la inflamación o la función inmune
mediada por células T (patente US nº 5.837.293 concedida el 17 de
noviembre de 1998), la enfermedad inflamatoria intestinal (patente
US nº 5.368.854, concedida el 29 de Octubre de 1994), en combinación
con IL-1 para tratar la hipersensibilidad retardada
(patente US nº 5.601.815 concedida el 11 de febrero de 1997), la
diabetes mellitus insulinodependiente (patente US nº 5.827.513,
concedida el 27 de octubre de 1998), el cáncer en combinación con
IL-2 e IFN-\gamma (patente US nº
5.871.725, concedida el 16 de febrero de 1999), la leucemia aguda
(patente US nº 5.770.190) concedida el 23 de junio de 1998), como
adyuvante de una vacuna (patente US nº 5.866.134, concedida el 24 de
marzo de1995).
Un importante elemento de la actividad de la
IL-10 es que los fenotipos funcionales predominantes
inducidos por la IL-10 dependen del contexto local
en el que se produce la citocina y se une a su receptor.
Especialmente, la IL-10 inhibe la síntesis de
citocinas, incluyendo IFN-\gamma,
TNF-\alpha, GM-CSF y linfotoxina,
por las células mononucleares humanas de la sangre periférica (PBMC)
tanto al nivel de las proteínas como al del ARN (Vieira et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1172-1176
(1991), Hsu, et al., Science 250:830-832
(1990). Además, la IL-10 puede inhibir la
proliferación de las células T. Las funciones inhibitorias están
mediadas de forma dependiente de células presentadoras de antígenos
(APC-dependiente). El mecanismo mediante el cual la
IL-10 inhibe las funciones
APC-dependientes no es completamente conocido pero
está asociado con la regulación depresiva de la expresión
constitutiva e inducida por IFN-\gamma de las
moléculas MHC de clase II así como también con la producción de
citocinas por los macrófagos y monocitos. Además, se ha publicado
que la producción por los monocitos y macrófagos de monocinas y
factores de crecimiento claves, que incluyen
IL-1-\alpha,
IL-1-\beta, IL-6,
IL-8, TNF-\alpha,
GM-CSF y G-CSF, que es inducida por
la activación de LPS y IFN-\gamma, es fuertemente
inhibida por la IL-10. Tales capacidades
antiinflamatorias han sido demostradas in vitro así como
también in vivo en un modelo animal preclínico de choque
inducido por LPS [Fiorentino et al., J. Immunol.
147:3815-3822 (1991); O'Garra, et al.,
Int. Rev. Immunol. 8:219-234 (1992)]. Tal
actividad antiinflamatoria es muy pertinente ya que la inflamación
inducida por LPS comparte muchos aspectos con los múltiples
estímulos que inducen ARDS.
Con respecto a la administración de terapia
génica para la expresión de IL-10, la
IL-10 de producción endógena inhibe la producción de
los monocitos de una forma autorregulada. Ello puede ser
particularmente importante después de la transducción de monocitos,
macrófagos, células dendríticas u otras células presentadoras de
antígenos (APC) y puede influenciar el ambiente local en el que se
expresa la IL-10 así como la capacidad para
promocionar las actividades antiinflamatorias en los escenarios de
terapia génica y el tratamiento localizado de las enfermedades
inflamatorias pulmonares tales como ARDS. Otro conjunto de
mediadores inflamatorios importantes, asociados con el desarrollo de
ARDS, que son inhibidos por IL-10, son los
intermedios de oxígeno reactivo (H_{2}O_{2}) y los intermedios
de nitrógeno reactivo (NO) después de la activación de los
macrófagos. Dicha inhibición se ha demostrado que es debida a la
inhibición del TNF-\alpha (Bogdan et al.,
J. Biol. Chem. Nov. 15;267(32):23301-8
(1992).
Tal como se ha indicado anteriormente, la
IL-10 es una citocina pleiotrópica. Además de las
numerosas actividades antiinflamatorias descritas anteriormente,
también se ha demostrado que la IL-10 incrementa
diversas funciones inmunológicas. Por ejemplo, se ha demostrado que
la IL-10 humana (hIL-10) es
co-estimuladora de la proliferación de las células B
y de la producción de inmunoglobulina (particularmente en
combinación con el entrelazado de CD40). Además, se ha demostrado
que la IL-10 humana es un factor quimiotáctico para
las células T CD8+ y que promueve la proliferación de células CD8+.
La IL-10 viral (vIL-10) derivada del
gen EBV BCRF1 produce repuestas biológicas que difieren de un modo
significativo en algunos contextos de las acciones de la
IL-10 humana. Mientras que retiene la capacidad para
suprimir las respuestas antiiflamatorias, la vIL-10
demuestra un incremento sustancialmente reducido de las funciones
inmunes tales como la capacidad para promocionar las funciones
co-estimuladoras. Ello hace de la
vIL-10 un candidato atractivo para la terapia génica
con IL-10 de las enfermedades inflamatorias en la
que pueden ser deseables las respuestas antiinflamatorias con una
ausencia relativa de incremento inmune. Aunque ARDS es la principal
enfermedad diana para las nuevas terapias con IL-10,
también son asequibles al tratamiento con dicha terapia otras
enfermedades inflamatorias crónicas y agudas.
La presente invención proporciona un
procedimiento para el tratamiento de un individuo que padece una
enfermedad inflamatoria pulmonar mediante la administración de
vectores recombinantes para terapia génica que expresan
IL-10 viral y proporciona un procedimiento para la
utilización de vectores recombinantes que expresan
IL-10 viral para facilitar los regímenes de
tratamiento de terapia génica multidosis.
La Figura 1 es una representación gráfica de los
niveles de \beta-galactosidasa (\medcirc) a
continuación de la administración intratraqueal de
rAd/\beta-gal contra el tiempo. Se utilizó como
control la administración de tampón solamente (\bullet). El eje
vertical es una medida de los niveles de
\beta-galactosidasa en microgramos de
\beta-galactosidasa por gramo de peso de pulmón
húmedo homogeneizado tal como se determina de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Experimento 5. El eje horizontal es el
tiempo después de la administración medido en días.
La Figura 2 es una representación gráfica de los
niveles de hIL-10 en los pulmones (\medcirc)
después de la administración intratraqueal de
rAd/hIL-10, contra el tiempo. La administración de
tampón solo, se utilizó como control (\bullet). El eje vertical
representa los niveles de hIL-10 en nanogramos de
proteína hIL-10 por gramo de pulmón húmedo tal como
se determina de acuerdo con la enseñanza del Ejemplo 6. El eje
horizontal es el tiempo medido en días después de la administración.
Los niveles de hIL-10 en los pulmones de los ratones
tratados con rAd/hIL-10 se representan mediante los
círculos abiertos (\medcirc). Los niveles de IL-10
humana en los pulmones de los ratones tratados con tampón se
representan mediante círculos llenos (\bullet) y fueron
indetectables. Las diferencias en la magnitud de la expresión entre
los dos grupos experimentales son estadísticamente
significativas.
La Figura 3 es una representación gráfica de los
niveles de vIL-10 y hIL-10 en los
pulmones después de la administración intratraqueal de
rAd/vIL-10 y rAd/hIL-10, contra el
tiempo. El eje vertical representa los niveles de
IL-10 en nanogramos de proteína
IL-10 por gramo de homogeneizado de pulmón húmedo
tal como se determinó de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 6.
El eje horizontal es el tiempo en días después de la administración.
Los niveles de fármaco vIL-10 en los ratones
tratados con rAd/vIL-10 se representa mediante los
triángulos llenos (\blacktriangledown). Los niveles de fármaco
IL-10 humana en los ratones tratados con
rAd/hIL-10 se representan mediante los círculos
vacíos (\medcirc). Los niveles en los pulmones de
IL-10 viral en los ratones tratados con tampón se
representan mediante los círculos llenos (\bullet) y fueron
indetectables.
La Figura 4 es una representación gráfica que
compara los niveles de hIL-10 en el suero y en el
tejido de pulmón a continuación de la administración intratraqueal
de rAd/hIL-10 contra el tiempo. El eje vertical
representa los niveles de hIL-10 en nanogramos de
proteína hIL-10 por gramo de tejido (pulmón) o ml de
plasma (plasma) tal como se determina de acuerdo con la enseñanza
del Ejemplo 6. El eje horizontal es el tiempo transcurrido después
de la administración medido en días. Los niveles de
hIL-10 en los pulmones de los ratones tratados con
rAd/hIL-10 están representados por los círculos
abiertos (\circ). Los niveles de hIL-10 en el
plasma de los ratones tratados con rAd/hIL-10 están
representados por los círculos llenos (\bullet).
La Figura 5 es una representación gráfica que
compara los niveles de vIL-10 en el suero y en el
tejido de pulmón a continuación de la administración intratraqueal
de rAd/vIL-10 o solamente tampón, contra el tiempo.
El eje vertical representa los niveles de vIL-10 en
nanogramos de proteína vIL-10 por gramo de tejido
(pulmón) o ml de plasma (plasma) tal como se determina de acuerdo
con la enseñanza del Ejemplo 6. El eje horizontal es el tiempo a
continuación de la administración medido en días. Los niveles de
vIL-10 en los pulmones de los ratones tratados con
rAd/vIL-10 están representados por los círculos
abiertos (\circ). Los niveles de vIL-10 en el
plasma de los ratones tratados con rAd/vIL-10 están
representados por los círculos llenos (\bullet). Los niveles de
IL-10 viral en los pulmones de los ratones tratados
con tampón está representados por los triángulos llenos
(\blacktriangle).
La Figura 6 es una representación gráfica que
ilustra los niveles en el suero de los anticuerpos
anti-hIL-10 y
anti-\beta-galactosidasa a
continuación de la administración intratraqueal de
rAd/\beta-gal y rAd/hIL-10. El eje
vertical representa las unidades de absorbancia (cantidad de
anticuerpo) y el eje horizontal representa el factor de dilución del
suero. La hIL-10 se representa mediante los círculos
llenos (\bullet) y la \beta-galactosidasa por
los círculos abiertos (\circ). Las diferencias en la respuesta de
los anticuerpos fueron muy significativas.
La Figura 7 es un histograma que representa los
títulos de anticuerpo antiadenovirus a continuación de la
administración de tampón (Columna A),
rAd/\beta-gal (Columna B),
rAd/hIL-10, (Columna C) y rAd/vIL-10
(Columna D) mediante administración intratraqueal de 1x10^{10}
partículas de virus. Los títulos de anticuerpo se determinaron a los
14 días después de la instilación. La columna \gamma indica el
título de anticuerpo, dilución inversa para EC_{50}. Los
asteriscos indican que los Grupos A, C y D fueron estadísticamente
diferentes del Grupo B. Los grupos C y D no fueron diferentes del
Grupo A.
La Figura 8 es un histograma que representa los
títulos de anticuerpo antiadenovirus a continuación de la
administración de una combinación de 5x10^{9}
rAd/\beta-gal y 5x10^{9} rAd/casset vacío
(Columna A), 5x10^{9} rAd/hIL-10 y 5x10^{9}
rAd/\beta-gal (Columna B), 5x10^{9}
rAd/vIL-10 y 5x10^{9}
rAd/\beta-gal (Columna C) y 5x10^{9}
rAd/vIL-10 y 5x10^{9} rAd/casete vacío (columna D)
partículas de cada virus. Los títulos de anticuerpo se determinaron
14 días después de la instilación. La columna \gamma indica el
título de anticuerpo, dilución inversa para EC_{50}. El asterisco
indica que el grupo D fue significativamente diferente de los Grupos
A y B, pero no del C.
Se realizó un estudio para evaluar la eficacia de
los vectores de adenovirus recombinantes que expresan
\beta-galactosidasa, IL-10 humana
o IL-10 viral para reducir la magnitud de la
inflamación pulmonar asociada con la instilación de adenovirus y
para extender la expresión del transgén. Se realizaron experimentos
preclínicos en un modelo en ratón de inflamación pulmonar creada por
la administración de vectores recombinantes adenovirales de
expresión. Se entiende que aunque la inflamación producida por la
instilación de adenovirus a estas dosis es ligera, se presume que
los mecanismos subyacentes (es decir, mediados por citocinas) son
similares a los mecanismos del daño pulmonar asociados a otros
procesos de inflamación crónicos y agudos, tales como el ARDS y la
neumonía. Se utilizó la administración intratraqueal de vectores rAd
que expresan \beta-galactosidasa
(rAd/\beta-gal) en ratones C57BL/6 para inducir
una respuesta inflamatoria bifásica, caracterizada por una
infiltración temprana de neutrófilos y macrófagos, seguida por la
infiltración de linfocitos y la apoptosis. Además, existe una
respuesta proinflamatora de citocinas inmediata e innata a la
instilación de rAd/\beta-gal en los pulmones que
tiene lugar durante las primeras 24 horas y a continuación un
segundo máximo de respuestas de TNF-\alpha durante
los siguientes 5 a 7 días. Dicha respuesta inflamatoria está
asociada con un ligero daño al parénquima y a una disminución en la
duración de la expresión del transgén. En consecuencia, este modelo
proporcionó una base para el estudio de los efectos de la terapia
génica con IL-10 para suprimir los mediadores
proinflamatorios asociados al desarrollo del daño pulmonar. Tal como
se describe más ampliamente en el Ejemplo 4 de la presente
solicitud, los ratones hembra C57BL/6 recibieron la instilación
intratraqueal de 1x10^{10} partículas (PN/ratón) de adenovirus
recombinante (rAd) para la expresión de IL-10 humana
(hIL-10), IL-10 viral
(vIL-10) o \beta-galactosidasa
(\beta-gal) preparadas según las enseñanzas de los
Ejemplos 1, 2 y 3. Se sacrificaron los ratones en los días 1, 3, 5,
7, 9 y 14 y se evaluó la respuesta de las citocinas (niveles de
TNF-\alpha, IL-6 murina,
IL-1 y mieloperoxidasa) y la expresión de los
transgenes (hIL-10, vIL-10 y
\beta-gal) en los pulmones de acuerdo con las
enseñanzas en los Ejemplos 5 y 6.
Los resultados de estos experimentos se
representan gráficamente en las Figuras 1, 2 y 3. Tal como se puede
observar a partir de los datos presentados en la Figura 1, se
observó el máximo nivel de expresión de
\beta-galactosidasa en los días 1 y 5 y decreció
hasta un nivel inconmensurable hacia el día 14. Se obtuvieron
resultados similares con rAd/hIL-10 en los
homogeneizados de pulmón (presentado en la Figura 2). Se observó una
reducción superior al 95% en los niveles de expresión de
\beta-gal y hIL-10 el día 14
(p<0,001). Por el contrario, tal como se muestra en la Figura 3,
la administración de rAd/vIL-10 resultó en la
expresión continua de vIL-10 a niveles elevados
(>150 ng/gm peso mojado) en los pulmones en todos los puntos de
tiempo hasta el día 14 (p<0,001 contra hIL-10).
Los niveles de IL-10 viral después de la instilación
de rAd/vIL-10 fueron consistentemente entre cinco y
diez veces superiores a los niveles de hIL-10 (a
después de la administración de rAd/hIL-10) y han
demostrado una expresión de vIL-10 persistente hasta
los 21 días.
Los niveles de vIL-10 y
hIL-10 en los pulmones después de la administración
intratraqueal de rAd/vIL-10 y
rAd/hIL-10 se compararon con los niveles de
vIL-10 y hIL-10 en el suero. Los
niveles en el suero se determinaron por ensayo ELISA sustancialmente
de acuerdo con las enseñanzas de Ejemplo 6. Los resultados se
presentan en las Figuras 4 y 5 de los dibujos adjuntos. Tal como se
puede observar a partir de los datos presentados en la Figura 4, los
niveles de hIL-10 en el suero son persistentemente
bajos mientras que la expresión en los pulmones muestra un perfil de
expresión de corta vida con máximos de nivel de 11 nanogramos/gramo
de pulmón mojado. Por el contrario, los datos presentados en la
Figura 5 con vectores de vIL-10 demuestran un nivel
de expresión de vIL-10 en los pulmones
persistentemente elevado, con niveles bajos de
vIL-10 en el suero (similares a los obtenidos con
hIL-10).
Se realizó un experimento adicional en el que se
administraron los vectores rAd/hIL-10 y
rAd/vIL-10 por ruta intravenosa (a una dosis de
1x10^{10}, 5x10^{10} y 1x10^{11}) a ratones BALB/c y se
determinaron los niveles de hIL-10 y
vIL-10 en el suero a los días 4, 7, 11 y 21 después
de la administración de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 6.
Los resultados de estos experimentos demuestran un nivel de
expresión elevado de corta vida de las dos especies de
IL-10 (máximo del día 4) y un rápido descenso de la
expresión en el día 7 hasta un nivel insignificante en el día
11.
Estos resultados demuestran la inesperada ventaja
de la administración directa en los pulmones de los vectores
recombinantes que codifican la vIL-10 en comparación
con la hIL-10. Los niveles consistentemente elevados
de expresión de vIL-10 en el tejido pulmonar después
de la administración de rAd/vIL-10 son
particularmente inesperados en vista de la expresión transitoria y a
niveles de expresión semejantes de la hIL-10 y de la
respuesta de vIL-10 observada después de la
administración intravenosa de los mismos vectores. Tales resultados
demuestran que la administración de vectores recombinantes que
codifican vIL-10 en los pulmones produce niveles muy
superiores y persistentes de expresión de IL-10 en
el tejido pulmonar en comparación con la administración intravenosa
de vectores de IL-10 humanos o virales.
Un análisis adicional de las respuestas
proinflamatorias después de la administración intratraqueal de
vectores rAd que expresan hIL-10,
vIL-10 y \beta-galactosidasa
demostró que el tratamiento con rAd/hIL-10 y
rAd/vIL-10 produjo en una producción inferior de
TNF-\alpha en los pulmones en comparación con los
ratones tratados con rAd/\beta-gal (0,48\pm0,18
y 0,63\pm0,10 contra 1,5\pm0,4 ng/gm peso mojado, p<0,05 en
el día uno) lo que sugiere que la hIL-10 y
vIL-10 podrían suprimir la respuesta de la citocina
a TNF-\alpha. Sin embargo, hubo diferencias
significativas en la respuesta inflamatoria de los pulmones de los
ratones tratados con rAd/vIL-10 y
rAd/hIL-10. Los ratones tratados con
rAd/hIL-10 tuvieron una infiltración de neutrófilos
significativamente superior en los pulmones, tal como se determinó
mediante mieloperoxidasa (MPO), que los ratones tratados con
rAd/vIL-10 durante el período de estudio de 14 días
(0,289\pm0,016 contra 0,187\pm0,016 U/gm tejido mojado; p
<0,05), tal como se determinó por análisis de varianza de dos
direcciones. Aunque tanto el rAd/vIL-10 como el
rAd/hIL-10 suprimieron el
TNF-\alpha en el día uno, las concentraciones
generales de IL-1\alpha (1,01\pm0,15 contra
1,95\pm0,15 ng/gm de peso mojado; p<0,05) en los pulmones
durante los 14 días fueron significativamente inferiores en los
ratones tratados con rAd/vIL-10 que en los ratones
tratados con rAd/hIL-10, tal como se determinó por
análisis de varianza de dos direcciones. Este último resultado fue
inesperado.
Estos resultados reflejan la observada propensión
de la hIL-10 a inducir respuestas pleiotrópicas que
incluyen fenotipos antiinflamatorios y proinflamatorios en
comparación con la vIL-10 que está asociada
principalmente a la supresión de las respuestas inflamatorias a la
instilación de adenovirus. Además, los resultados indican que la
transferencia génica de rAd a los pulmones está asociada a una
respuestas inflamatoria caracterizada por el incremento de
TNF-\alpha, MPO y
IL-10-1-\alpha,
así como también por la infiltración de células de neutrófilos. Los
resultados demuestran que la administración de un vector de
expresión vIL-10 recombinante produjo una capacidad
pronunciada para suprimir la respuesta proinflamatoria de citocina
que fue inesperadamente diferente de la del vector de expresión
hIL-10, demostró una prolongada expresión en los
pulmones, no estimuló la infiltración de neutrófilos en los pulmones
al nivel observado con IL-10 humana y tuvo capacidad
para modular negativamente las respuestas de citocinas inducidas por
los estímulos inflamatorios en los pulmones.
También se evaluó la capacidad de la
hIL-10 para suprimir las respuestas humorales a las
proteínas hIL-10 después de la administración
intratraqueal de rAd/hIL-10. Se obtuvo suero de
ratones C57BL/6 14 días después de la administración intratraqueal
de 1x10^{10} partículas de los vectores rAd/hIL-10
y rAd/\beta-gal. La respuesta de anticuerpos
antiIL-10 se evaluó mediante ELISA de acuerdo con
las enseñanzas del Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la
Figura 6 de los dibujos adjuntos. Dichos resultados demuestran una
respuesta dramáticamente inferior específica al transgén a
continuación de la administración intratraqueal de vector
hIL-10 en comparación con
rAd/\beta-gal. Esto está en contradicción con
otros estudios que describen una duración corta de la expresión (10
días o menos) con vectores adenovirales recombinantes administrados
a las vías respiratorias o a los pulmones. Sin embargo, cuando se
administraron cantidades equivalentes de rAd/hIL-10
a los pulmones, se observó una ausencia de anticuerpos
neutralizantes. Estos resultados son particularmente inesperados en
vista de Ma, et al., (J. Immunol.,
161:1516-24 (1998)) que publican una fuerte
respuesta de anticuerpos anti-vIL-10
a los vectores recombinantes adenovirales vIL-10
administrados intravenosamente en ratones DBA/1.
Se realizó un conjunto adicional de experimentos
para determinar la presencia en el suero de anticuerpos
neutralizantes antiadenovirus en respuesta a la administración de
rAd/vIL-10 y rAd/hIL-10 a los
pulmones. Se obtuvo suero a partir de ratones C57BL/6 14 días
después de la administración intratraqueal de 1x10^{10} partículas
de vector rAd/IL-10. La presencia de anticuerpos
neutralizantes en el suero se determinó de acuerdo con las
enseñanzas del Ejemplo 8. Los resultados se presentan en la Figura 7
de los dibujos adjuntos. Los ratones dosificados con 1x10^{10}
PN/ratón de rAd/\beta-gal por ruta intratraqueal
demostraron una fuerte respuesta de anticuerpos antiadenovirales
neutralizantes en el suero. Por el contrario, los ratones
dosificados con 1x10^{10} PN/ratón de rAd/hIL-10 y
rAd/vIL-10 demostraron una marcada reducción en los
anticuerpos antiadenovirales neutralizantes.
Dicha reducción en anticuerpos neutralizantes
antiadenovirus en el suero sugiere la capacidad de la
IL-10 humana y viral para suprimir las respuestas
humorales antiadenovirales con rAd/IL-10 y facilitar
la readministración de los vectores rAd/IL-10 o la
administración conjunta de vectores adenovirales recombinantes que
codifican diversos transgenes. Para demostrar esto, se administraron
conjuntamente rAd/vIL-10 y
rAd/hIL-10 con rAd/\beta-gal o con
un casete vacío. En breve, se administraron a la vez intratraqueal
5x10^{9} partículas de rAd/hIL-10 y
rAd/vIL-10 con 5x10^{9} partículas de
rAd/\beta-gal o casete de vector vacío. Los
niveles de anticuerpos neutralizantes antiadenovirus en el suero se
midieron de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 8. Los resultados
se muestran e la Figura 8 de los dibujos adjuntos. Tal como se puede
observar a partir de los datos presentados, la administración de
rAd/vIL-10 con un casete vacío produjo
significativamente menos anticuerpos que la administración de
rAd/\beta-gal también con un casete vacío. Tales
descubrimientos están en contradicción con otros estudios de
administración intravenosa de vectores rAd/IL-10 que
produjeron una respuesta fuerte de anticuerpos neutralizantes al
rAd. Estos resultados indican que la administración local de
rAd/vIL-10 puede suprimir la respuesta humoral a los
vectores de adenovirus recombinantes a un nivel significativo. En
consecuencia, la práctica de la presente invención provee la
posibilidad de readministrar vectores virales que codifican
vIL-10 o de administrar conjuntamente vectores
recombinantes que codifican otros transgenes.
De acuerdo con los datos generados con el
presente sistema modelo, la presente invención proporciona un
procedimiento para tratar un organismo mamífero que padece una
enfermedad pulmonar inflamatoria mediante la administración de un
vector de expresión recombinante que comprende un casete de
expresión de IL-10 viral
(vIL-10).
El término "organismo mamífero" incluye, sin
quedar limitado a, humanos, cerdos, caballos, vacas, perros, gatos.
El procedimiento y las composiciones de la presente invención se
pueden utilizar para el tratamiento de una multiplicidad de
organismos que padecen enfermedades pulmonares inflamatorias. Por
ejemplo, las formulaciones y procedimientos de la presente invención
se pueden utilizar para el tratamiento de diversas especies de
mamíferos que padece tales enfermedades, incluyendo los seres
humanos, cerdos, caballos, vacas, perros y gatos.
El término "enfermedad pulmonar
inflamatoria" se utiliza de forma colectiva para referirse a
aquellas enfermedades patológicas agudas y crónicas de los pulmones
asociadas con procesos inflamatorios. Los ejemplos de enfermedad
pulmonar inflamatoria aguda incluyen ARDS, neumonía, neumonitis,
infecciones pulmonares, atelactasis, enfermedades asociadas con las
heridas pulmonares inflamatorias tales como los daños pulmonares
inducidos quimioterapéuticamente (p. ej. la bleomicina), daño
pulmonar inducido por la pacreatitis, daño pulmonar inducido por
hiperoxia, neumonitis inducida por amiodarona, neumonitis inducida
por radiación, daños producidos por inhalación de humo o cloro,
bronquiolitis obliteras/neumonía obstructiva (BOOP), neumonías de
virus y micoplasmas (p. ej. Legionella y pulmón CMV), neumoconiosis.
Los ejemplos de enfermedades patológicas crónicas de los pulmones
incluyen fibrosis quística, silicosis, asbestosis, fibrosis pulmonar
idiopática (UIP), neumonitis intersticial descamativa (DIP),
neumonitis de hipersensibilidad, neumonitis intersticial, enfermedad
del colágeno vascular, sarcoidosis, neumoconiosis de los mineros del
carbón, displasia bronquiopulmonar, pseudo tumor inflamatorio.
El término "vector de expresión
recombinante" significa vectores virales y no virales preparados
mediante procedimientos convencionales de ADN recombinante que
comprenden un casete para la expresión de vIL-10
capaz de expresar vIL-10 en una célula de mamífero.
En la técnica se conoce una multiplicidad de vectores para la
administración, útiles para lograr la expresión de secuencias de
nucleótidos en las células transducidas. Véase, por ejemplo,
Boulikas, T en Gene Therapy and Molecular Biology. Volumen 1
(Boulikas, T. Ed.) 1998 Gene Therapy Press, Palo Alto, CA páginas
1-172. También se conoce en la técnica una
multiplicidad de vectores capaces de expresar vIL-10
y se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, (ver,
p. ej. Moore, et al., patente US nº 5.736.390 concedida el 17
de abril de 1998). Manickan, et al., (Immunology
94(2):129-34 (1998)); Denhan, et
al., (Ann. Surg., Jun.
227(6):812-20 (1998)) y Batteux, et
al., Eur. J. Immunol. 29(3):958-63
(1999) describen vectores de plásmido para la terapia génica con
IL-10. Los vectores adenovirales recombinantes que
codifican IL-10 humana y viral se describen en
Aparally, et al., Ma, et al., y Whalen, et al.,
en los Abstracts 764, 765 y 766, respectivamente, en Arthritis
and Rheumatism, vol.40 (1997); Abstract Supplement. S158.
Además, se pueden utilizar vectores no plasmídicos ni virales que
contienen un casete de expresión para vIL-10 para la
expresión de vIL-10 en los tejidos diana (Kundu,
et al., Int. J. Cancer
76(5):713-9 (1998)).
En una forma de realización de la presente
invención tal como se ejemplifica en la presente solicitud, el
vector es un vector viral. Los términos virus y vector
viral(s) se utilizan de forma intercambiable en la presente
solicitud. Los virus útiles en la práctica de la presente invención
incluyen virus de ARN y ADN con envoltura o sin ella modificados por
procedimientos recombinantes, seleccionados preferiblemente de entre
baculoviridea, parvorviridea, picornoviridea, herpexvirídea,
poxivirídea, adenovirídea o picornavirídea. Los genomas virales se
pueden modificar mediante los procedimientos de ADN recombinante
convencionales para proporcionar expresión de vIL-10
y se pueden modificar para que sean deficientes en la replicación,
de replicación condicional y competentes para la replicación. Los
vectores virales quiméricos que explotan los elementos ventajosos de
cada una de las propiedades de los virus paternos (véase p. ej.
Feng, et al., Nature Biotechnology
15:866-870 (1997) también pueden ser útiles en
la práctica de la presente invención. Los sistemas virales mínimos
en los que el esqueleto del virus contiene solamente las secuencias
necesarias para empaquetar el vector viral y pueden incluir
opcionalmente un casete de expresión de vIL-10
también se pueden utilizar en la práctica de la presente invención.
En algunos casos puede ser ventajoso utilizar vectores derivados de
especies diferentes a la que se ha de tratar que poseen
características patogénicas favorables tales como la de evitar una
respuesta inmune preexistente. Por ejemplo, los vectores de virus
del herpes equino para la terapia génica humana se describen en el
documento WO98/27216 publicado el 5 de agosto de 1998. Tales
vectores se describen como útiles para el tratamiento de los seres
humanos ya que el virus equino no es patogénico para los seres
humanos. De forma semejante, los vectores adenovirales ovinos se
pueden utilizar en la terapia génica humana ya que se reivindica que
evitan los anticuerpos contra los vectores adenovirales humanos.
Dichos vectores son descritos en el documento WO97/06826 publicado
el 10 de abril de 1997.
Muchos virus muestran capacidad para infectar una
multiplicidad de tipos celulares. Sin embargo, en muchas
aplicaciones se desearía infectar solamente una determinada
subpoblación de células de un organismo. Por consiguiente, se han
desarrollado diversos procedimientos para generar vectores
selectivos o "vectores dirigidos" para producir infectividad
preferencial por la partícula viral madura de un tipo celular
particular. La especificidad por el tipo celular o la dirección al
tipo celular también se puede lograr en los vectores derivados de
los virus con infectividades característicamente amplias tales como
los adenovirus mediante la modificación de las proteínas del sobre
del virus. Por ejemplo, la dirección al tipo celular se ha logrado
en los vectores adenovirales mediante la modificación selectiva de
las secuencias del genoma viral que codifican la protuberancia y la
fibra para lograr la expresión de dominios modificados de la
protuberancia y de la fibra que tienen interacciones específicas con
receptores únicos en la superficie celular. Wickham et al.,
J. Virol 71(11):8221-8229 (1997)
describen ejemplos de dichas modificaciones (incorporación de
péptidos RGD en las proteínas de la fibra adenoviral); Arnberg,
et al. Virology 227:239-244 (1997)
(modificación de los genes de la fibra de los adenovirus para lograr
un tropismo hacia el ojo y tracto genital); Harris y Lemoine TIG
12(10):400-405 (1996); Stevenson, et
al., J. Virol. 71(6):4782-4790
(1997); Michael, et al., Gene Therapy
2:660-668 (1995) (incorporación de fragmento de
péptido liberador de gastrina en la proteína de la fibra del
adenovirus) y Ohno, et al., Nature Biotechnology
15:763-767 (1997) (incorporación del dominio de
enlace a la IgG de la Proteína A en el virus Sindbis). Se han
obtenido otros procedimientos para hacer diana en células
específicas mediante la conjugación de anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos a las proteínas del sobre (ver p. ej. Michael, et
al., J. Biol. Chem. 268:6866-6869 (1993),
Watkins, et al., Gene Therapy 4:1004-1012
(1997), Douglas, et al., Nature Biotechnology
14:1574-1578 (1996). En la práctica de la presente
invención opcionalmente se pueden utilizar partículas virales que
comprenden una o más de tales modificaciones para hacer diana con
objeto de incrementar la selectividad de la infección y la expresión
de vIL-10 en el tejido de los pulmones,
especialmente el tejido epitelial de los pulmones.
En una forma de realización de la presente
invención tal como se ejemplifica en la presente solicitud, el
vector de vIL-10 es un vector adenoviral. El término
vector adenoviral se refiere colectivamente a los adenovirus de los
animales del género mastadenovirus que incluye, pero no están
limitados, a los subgéneros de los seres humanos, bovinos, ovinos,
equinos, caninos, porcinos, murinos y simios. In particular, los
adenovirus humanos incluyen los subgéneros A a F, así como también
los serotipos individuales de estos, los serotipos individuales y
los subgéneros A a F, que incluye, pero no están limitado a, los
adenovirus humanos de tipos 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
(Ad11A y Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 91. El término
adenovirus bovino incluye, sin quedar limitado a, los adenovirus
bovinos de tipos 1, 2, 3, 4, 7 y 10. El término adenovirus canino
incluye, pero no está limitado a, los tipos caninos 1 (cepas CLL,
Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) y 2. el término
adenovirus equino incluye, sin quedar limitado a, los tipos equinos
1 y 2. El término adenovirus porcino incluye, sin quedar limitado a,
los tipos porcinos 3 y 4. La utilización de vectores adenovirales
para la administración de transgenes exógenos es bien conocida en la
técnica. Ver, p. ej. Zhang, W-W, Cancer Gene
Therapy 6:113-138 (1999). Una forma de
realización particularmente preferida de vector adenoviral para la
expresión de genes vIL-10 es un adenovirus humano
deficiente en la replicación, de serotipo 2 ó 5 creado mediante la
eliminación de los genes adenovirales E1, lo que resulta en un virus
sustancialmente incapaz de replicarse en los tejidos diana.
El término "casete de expresión" se utiliza
en la presente solicitud para definir una secuencia de nucleótidos
capaz de dirigir la transcripción y translación de una secuencia que
codifica la vIL-10 que comprende elementos
reguladores funcionalmente unidos a una secuencia que codifica la
vIL-10 de modo que resulte en la transcripción y
translación de la secuencia de vIL-10 en una célula
de mamífero transducida.
El término "secuencia que codifica
IL-10 viral" significa una secuencia de
nucleótidos que codifica vIL-10.
IL-10 viral significa proteínas
IL-10 derivadas de fuentes virales y análogos
funcionales de estas. El término IL-10 viral
significa moléculas de IL-10 derivadas de una fuente
viral tales como la molécula de IL-10 derivada del
virus Epstein-Barr (EBV) según se describe en Moore
et al., patente US nº 5.736.390 concedida el 7 de Abril de
1998, cuya completa enseñanza se incorpora en la presente solicitud
por referencia. El término "análogos funcionales" significa
análogos peptidílicos sintéticos o naturales de la
IL-10. Será rápidamente evidente para los expertos
en la materia que las secuencias descritas se pueden utilizar para
aislar moléculas análogas a la IL-10 a partir de los
genomas virales mediante procedimientos bien conocidos en la técnica
y que tales secuencias homólogas a IL-10 también se
pueden utilizar en la práctica de la presente invención. En la
práctica preferida de la invención, la molécula de
IL-10 está derivada de EBV.
El término "elemento regulador" significa
promotores, amplificadores, terminadores de la transcripción,
lugares de poliadenilación y semejantes. El término "unido
funcionalmente" significa la unión de elementos de
polinucleótidos en una relación funcional. Una secuencia de ácidos
nucleicos está "unida funcionalmente" cuando está situada en
una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por
ejemplo, un promotor o amplificador está unido funcionalmente a una
secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia
codificante. Unido funcionalmente significa que las secuencias de
nucleótidos unidas están típicamente contiguas. Sin embargo, como
los amplificadores operan generalmente cuando están separados del
promotor por una multiplicidad de kilobases y las secuencias
intrónicas pueden ser de longitudes diversas, algunos elementos de
polinucleótidos pueden estar unidos operativamente pero no estar
directamente flanqueados e incluso pueden funcionar en forma trans
desde un alelo o cromosoma diferente. El casete de expresión también
puede contener otras secuencias que ayudan en la expresión y/o
secreción de los productos proteicos de vIL-10.
El término "promotor" se utiliza en el
sentido convencional para referirse a una secuencia de nucleótidos
en la que se controla la iniciación y la velocidad de la
transcripción de una secuencia codificante. El promotor contiene el
lugar en el que se une la ARN polimerasa y también contiene lugares
para la unión de factores reguladores (tales como los represores o
factores de transcripción). Los promotores pueden ser naturales o
sintéticos. Cuando el vector que se ha de utilizar es un vector
viral, los promotores pueden ser endógenos al virus o derivados de
otras fuentes. Los elementos reguladores se pueden organizar de modo
que solo permitan amplificar o facilitar la expresión del transgén
en un tipo particular de célula. Por ejemplo, el casete de expresión
se puede diseñar de modo que el transgén esté bajo el control de un
promotor constitutivamente activo, o que esté temporalmente
controlado (promotores temporales), que esté activado en respuesta a
un estímulo externo (inducible), que esté activo en un tipo
particular de célula o en un estado celular (selectivo), de
promotores constitutivos, de promotores virales temporales o de
promotores regulables.
El término "promotor selectivo" significa
promotores que están preferentemente activos en tipos de células
específicos y comúnmente se los refiere como promotores específicos
de tejido. En la técnica se conoce una multiplicidad de promotores
específicos de tejido. En la práctica preferida de la presente
invención el promotor es un promotor selectivamente activo en las
células epiteliales, dendríticas (p. ej. CD11c) o células de
macrófagos (p. ej. PU.1) o células epiteliales de pulmón. En la
técnica son bien conocidos los promotores específicos de
epitelio.
Cuando el vector IL-10 es un
vector viral competente para la replicación, es preferible utilizar
un promotor temporal para lograr un elevado nivel de expresión de
vIL-10. El término "promotores temporales"
significa promotores que están temporalmente activos en un punto
tardío del ciclo del virus. Los ejemplos de tales promotores
regulados temporalmente incluyen el Principal Promotor Tardío
Adenoviral (MLP) y el Promotor Latente Activado del virus del
herpes simples.
El término "promotor inducible" significa un
promotor que facilita la transcripción de la secuencia
vIL-10 preferiblemente (solamente) bajo ciertas
condiciones y/o en respuesta a estímulos químicos o de otra
naturaleza. Los ejemplos de promotores inducibles son bien conocidos
en la literatura científica (véase, por ejemplo, Yoshida y Hamada,
Biochem. Biophys. Res. Comm.230:426-430
(1997); Ida, et al., J. Virol.
70(9):6054-6059 (1996); Hwang, et
al., J. Virol. 71(9):7128-7131
(1997); Lee, et al., Mol. Cell. Biol.
17(9):5097-5105 (1997) y Dreher, et
al., J. Biol. Chem.
272(46):29364-29371 (1997). Los ejemplos
de promotores inducibles por irradiación están descritos en Manome,
et al., Human Gene Therapy, 9:1409-1417
(1998). De tal forma, es posible regular la expresión del
vIL-10 en el tejido diana mediante la administración
al organismo del inductor.
En una forma de realización de la presente
invención, el procedimiento proporcionado es aplicado al tratamiento
de la enfermedad inflamatoria aguda de los pulmones. Dicha forma de
realización de la presente invención proporciona un procedimiento
para el tratamiento de un sujeto mamífero que padece de ARDS. Tal
como se discutió anteriormente, ARDS sigue un curso de patología
creciente. En consecuencia, es esencial una intervención temprana
para maximizar la respuesta terapéutica y antes de que se hagan
insuperables las cascadas patológicas de citocinas y sus secuelas.
En la práctica preferida de la invención, el vector recombinante de
vIL-10 se administra a los pulmones no más tarde de
la tercera etapa de la enfermedad y más preferiblemente en la
primera o segunda etapa de la enfermedad. El tratamiento en la etapa
4ª no se debe descartar todavía y la capacidad para mejorar los
síntomas en dicha etapa se ha de determinar empíricamente o en
condiciones experimentales controladas.
La determinación del régimen de dosis óptimo para
el tratamiento de la enfermedad se basará en múltiples factores que
se encuentran a la discreción de los proveedores de sanidad, tales
como la progresión de la enfermedad en el momento del tratamiento,
la edad, peso, género, etc. Sin embargo, se ha demostrado que los
vectores adenovirales recombinantes son seguros y efectivos en dosis
comprendidas entre 1x10^{5} y 1x10^{12} partículas virales por
dosis. En consecuencia, la administración de vectores adenovirales
recombinantes que codifican la vIL-10 se puede
utilizar entre dichas dosis.
Los agentes surfactantes se utilizan
ocasionalmente para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias
pulmonares agudas. Por ejemplo, se administran agentes surfactantes
a los pulmones de ARDS para evitar el colapso de los alvéolos
inducido por la falta o la deficiencia de los agentes surfactantes
naturales. También se ha observado que los agentes surfactantes
incrementan la administración del vector a través de las membranas
celulares, incrementando el nivel de expresión génica en las células
diana. En consecuencia, en una forma de realización preferida de la
presente invención, la terapia génica con vIL-10 se
puede combinar con dicho régimen de tratamiento convencional lo que
resulta en una eficacia combinada incrementada en el tratamiento de
las enfermedades inflamatorias pulmonares agudas tales como ARDS. El
incremento en la transducción se puede aplicar también a la
utilización de sistemas de administración múltiple que incluyen
vectores virales recombinantes, ADN, complejos de ADN/lípido,
complejos de ADN/proteína y complejos de ADN/agente surfactante. Los
ejemplos de agentes surfactantes son dodecil sulfato sódico (SDS),
lisolecitina, polisorbitano 80, nonilfenoxypolioxietileno,
lisofosfatidilcolina, polietilenglicol 400, polisorbato 80, éteres
de polioxietileno, agentes surfactantes de éter de poliglicol y
DMSO.
Tal como se demostró anteriormente, la
administración de vectores recombinantes de expresión de
vIL-10 suprime la respuesta inmune humoral
generalmente asociada con la administración de los vectores para
terapia génica. En consecuencia, la administración de vectores
recombinantes que codifican vIL-10 permite la
administración repetida de tales vectores o la administración
conjunta de otros vectores con ventajas para la terapia sin la
eliminación rápida mediada por el sistema inmune. En consecuencia,
los procedimientos de la presente invención también se pueden
utilizar para el tratamiento de las enfermedades pulmonares
inflamatorias crónicas. En consecuencia, en una forma de realización
de la presente invención, se administran cantidades terapéuticamente
efectivas de un vector recombinante que codifica
vIL-10 a un organismo que padece la enfermedad
inflamatoria crónica pulmonar. Preferiblemente, el vector se
administra directamente al tejido de los pulmones durante la
enfermedad, lo que puede durar muchos años en un ser humano. En los
casos en que el vector es un vector adenoviral deficiente para la
replicación, el régimen de dosis preferido es la administración a
los pulmones de entre 1x10^{9} y 1x10^{13} partículas virales en
una dosis primaria. Las dosis de seguimiento oscilarán con la
frecuencia del tratamiento y la gravedad de la enfermedad, pero en
general serán inferiores por 1 ó 2 órdenes de magnitud si el vector
de vIL-10 se administra aproximadamente cada 21
días. Una frecuencia superior necesitará una dosis inferior, así
como también lo hará una etiología más benigna. Los parámetros
exactos de administración para un mamífero se pueden determinar de
acuerdo con la evaluación de la respuesta a la dosis en cada
paciente individual.
Además, los efectos inmunosupresores de los
vectores vIL-10 permiten que se practique el
anterior régimen de tratamiento en combinación con otras regímenes
de tratamiento utilizados convencionalmente para el tratamiento de
las enfermedades inflamatorias pulmonares tales como CFTR y
\alpha-1 antitripsina. En particular, se puede
administra un vector recombinante de expresión de
vIL-10 conjuntamente con un vector recombinante de
expresión de un segundo gen terapéutico útil para el tratamiento de
las enfermedades inflamatorias pulmonares tales como CFTR y
\alpha-1 antitripsina, inhibidor de la proteasa de
leucocitos secretorios, superóxido dismutasa, catalasa,
protaglandina sintetasa e inhibidores tisulares de la
metaloproteinasa (TIMP). El término "administración conjunta"
significa la administración dentro de un tiempo suficiente de tal
modo que el efecto terapéutico de un elemento no se ha eliminado
antes de la administración del segundo agente. El vector de
vIL-10 se puede administrar antes, con o a
continuación de la administración del segundo vector que codifica el
segundo agente terapéutico adicional. Más preferiblemente, el vector
de vIL-10 y el vector de expresión que expresa el
segundo gen terapéutico se administran aproximadamente a la vez.
En otra forma de administración de la presente
invención, se puede construir un vector de expresión recombinante
que permita administrar tanto la vIL-10 como un gen
terapéutico adicional en un vector único. Por ejemplo, se podría
proporcionar un vector recombinante que contuviese dos casetes de
expresión, uno que expresase vIL-10 y otro que
expresase CFTR, de modo que permitiese la administración
esencialmente simultánea de dichos agentes a los pulmones.
Tal como se indicó anteriormente, la
administración de vectores vIL-10 reduce de modo
significativo la respuesta inmune humoral a los vectores
recombinantes, en particular a los vectores adenovirales. Sin
embargo, para suprimir más completamente dicha respuesta inmune, los
anteriores regímenes de tratamiento también se pueden suplir con la
administración conjunta de agentes inmunosupresores. Los ejemplos de
agentes inmunosupresores incluyen la ciclosporina, azatioprina,
metotrexato, ciclofosfamida, inmunoglobulina linfocítica,
anticuerpos contra el complejo CD3, adrenocorticoesterioides,
sulfasalzaina, FK-506, metoxalen y talidomida.
Los vectores vIL-10 recombinantes
se formulan para la administración a un sujeto mamífero de acuerdo
con procesos y compuestos bien conocidos en la materia. Cuando el
vector utilizado para administrar el gen vIL-10 no
es un vector viral, se pueden utilizar diversos medios bien
conocidos en la técnica para formular dichos vectores para la
administración en un sujeto mamífero. En una forma de realización,
los vectores vIL-10 se pueden encapsular en
liposomas. El término "liposomas" incluye emulsiones, espumas,
micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de
fosfolípidos, capas de lamellas y semejantes. La administración de
secuencias de nucleótidos a las células diana utilizando vehículos
de liposomas es bien conocida en la técnica. Se dispone de una
multiplicidad de procedimientos para preparar liposomas, tal como se
describe en, por ejemplo, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys.
Bioeng. 9:467-(1980), Szoka, et al., patente US nº 4.394.448
concedida el 19 de Julio de 1983, así como las patentes
Estadounidenses nº 4.235.871, nº 4.501.728, nº 4.837.028 y nº
5.019.369, que se incorporan en la presente solicitud por
referencia. Los liposomas útiles en la práctica de la presente
invención se pueden producir a partir de uno o más de los lípidos
que forma vesículas, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros
y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. Los
ejemplos de tales lípidos que forman vesículas incluyen
DC-chol, DOGS, DOTMA, DOPE, DOSPA, DMRIE, DOPC,
DOTAP, DORIE, DMRIE-HP, carbamato de
n-espermidina, colesterol y otros cationes lipídicos
tal como se describe en la patente US nº 5.650.096. La selección de
lípidos está generalmente guiada por consideraciones de, p. ej.
tamaño de liposoma, labilidad del ácido y estabilidad de los
liposomas en la sangre. A la formulación de los liposomas se le
puede añadir componentes adicionales para incrementar su vida media
en el suero tales como un recubrimiento de polietilenglicol
(denominado "PEG-ylation") tal como se describe
en las patentes US nº 5.013.556 concedida el 7 de mayo de 1991 y nº
5.213.804 concedida el 25 de mayo de 1993. En los sistemas de
administración no virales, para asegurar la eficiente administración
del gen terapéutico en un órgano o tejido determinado, puede ser
ventajoso incorporar elementos que faciliten la dirección a las
células. Por ejemplo, un vector encapsulado en un lípido puede
incorporar ligandos de los receptores de la superficie celular
modificados para facilitar la dirección. Los ejemplos de tales
ligandos incluyen anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos
humanizados, anticuerpos de cadena única, anticuerpos quiméricos o
fragmentos funcionales (Fv, Fab, Fab') de estos. Por el contrario,
la construcción de ADN de la invención se puede unir a través de un
fragmento de polilisina a un fragmento director tal como se describe
en Wu, et al., patente US nº 5.166.320 concedida el 24 de
noviembre de 1992 y Wu, et al., patente US nº 5.635.383
concedida el 3 de junio de 1997, todas cuyas enseñanzas se
incorporan en la presente solicitud por referencia. Los vectores
vIL-10 no virales se pueden formular para
formulaciones orales en complejos con quitosano y pueden ser
administrados mediante la utilización de monopartículas porosas.
(Roy, et al., Nature Medicine,
5:387-391 (1999). Los ejemplos de formulaciones
para la administración de transgenes mediante sistemas de
administración no virales al epitelio de las vías respiratorias se
describen en Debs y Zhu, patente US nº 5.641.622 concedida el 24 de
junio de 1997.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, en particular cuando el vector de
vIL-10 es un vector viral, el vector se administra
en combinación con, o complejado a, un agente para incrementar la
administración para aumentar la adquisición de partículas virales a
través del epitelio de la superficie pulmonar. Los términos
"aumentadores de la administración" o agentes "aumentadores
de la administración" se utilizan de forma intercambiable en la
presente solicitud e incluyen agentes que facilitan la transferencia
de los ácidos nucleicos o de las moléculas de proteína a las células
diana. Los ejemplos de tales agentes que aumentan la administración
son agentes surfactantes, alcoholes, glicoles, tensoactivos, sales
biliares, antagonistas de la heparina, inhibidores de la
ciclooxigenasa, disoluciones de sales hipertónicas y acetatos. Los
alcoholes incluyen por ejemplo, los alcoholes alifáticos tales como
el etanol, N-propanol, isopropanol, alcohol
butílico, alcohol acetílico. Los glicoles incluyen glicerina,
propilenglicol, polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso
molecular tales como el glicerol y el tioglicerol. Los acetatos
tales como el ácido acético, ácido glucónico y el acetato sódico son
todavía más ejemplos de agentes que incrementan la administración.
Las disoluciones salinas hipertónicas tales como el NaCl 1 M también
son ejemplos de agentes que incrementan la administración. Se pueden
utilizar las sales biliares tales como el taurocolato,
tauro-deoxicolato sódico, deoxicolato,
quenodeoxicolato, ácido glicocólico, ácido
deoxyglicoquenodeoxicólico y otros astringentes tales como el
nitrato de plata. Se pueden también utilizar los antagonistas de la
heparina como las aminas cuaternarias, tales como el sulfato de
protamina. También se pueden utilizar para aumentar la transferencia
de genes los agentes surfactantes aniónicos, catiónicos,
zwitteriónicos y no iónicos. Los ejemplos de agentes surfactantes
incluyen pero no quedan limitados a taurocolato, doxicolato,
taurodeoxicolato, cetilpiridium, cloruro de benzalconio, agente
surfactante Zwittergent 3-14, CHAPS (hidrato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamoniol]-1-propansulfonato).
Big CHAPS, Deoxi Big CHAPS, agente surfactante Triton
X-100, C12E8,
Octil-B-D-Glucopiranósido,
agente surfactante PLURONIC-F68, agente surfactante
Tween 20 y agente surfactante Tween 80 (CalBiochem
Biochemicals).
Biochemicals).
Las formulaciones también pueden incluir
moléculas vehículo convencionalmente utilizadas en la formulación de
agentes farmacéuticos. El término "vehículo" quiere decir un
compuesto comúnmente utilizado en la formulación de un compuesto
farmacéutico utilizado para incrementar la estabilidad, esterilidad
y capacidad para administrar del compuesto terapéutico. Cuando el
sistema viral, no viral o de proteína se formula como una disolución
o suspensión, el sistema de administración está en un vehículo
aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se pueden utilizar
múltiples vehículos acuosos p. ej. agua, agua tamponada, disolución
salina al 0,8%, 0,3% glicerina, ácido hialurónico y semejantes.
Dichas composiciones se pueden esterilizar mediante procedimientos
convencionales, procedimientos de esterilización bien conocidos, o
se pueden esterilizar por filtración. Las disoluciones acuosas
resultantes se pueden empaquetar para la utilización tal cual, o se
pueden liofilizar, combinándose la preparación liofilizada con una
disolución estéril antes de la administración. Las composiciones
pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables
tal como sea necesario para aproximarse a las condiciones
fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y agentes
tamponantes, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes
y semejantes, por ejemplo acetato sódico, lactato sódico, cloruro
sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de
sorbintano, oleato de trietanolamina, etc.
La administración in vivo utilizará
típicamente las composiciones de la presente invención formuladas
para la administración directa a los pulmones tales como las
micropartículas recubiertas, las formulaciones aerosolizadas y
encapsuladas en micropartículas y semejantes.
Los ejemplos siguientes proporcionan los
procedimientos y resultados de experimentos que demuestran la
construcción de los vectores híbridos ejemplares de la invención.
Será evidente para los expertos en la materia a la que pertenece la
invención, que la presente invención puede ser realizada de otras
formas que las que se dan a conocer específicamente en los presentes
ejemplos, sin apartarse del espíritu o de las características
esenciales de la invención. Las formas de realización particulares
de la invención descritas más adelante, han de considerarse por
consiguiente como ilustrativas y no restrictivas. En los ejemplos
siguientes, "g" significa gramos, "ml" significa
mililitros, "ºC" significa grados Centígrados, "min"
significa minutos, "FBS" significa suero bovino fetal.
Se utilizó un derivado del adenovirus de serotipo
5 (descrito en Smith, et al., Circulation,
96:1899-1905 (1997) como fuente del esqueleto de
ADN viral. Tiene eliminada la región temprana 1, el polipéptido IX,
la región temprana 3 y parte de la región temprana 4.
Específicamente, el vector contiene una delección de los pares de
bases 355 a 3325 para eliminar las funciones E1a y E1b, una
delección de los pares de bases 3325 a 4021 para eliminar la función
de la proteína IX y una delección de los pares de bases 28592 a
30470 para eliminar la función E3. Véase Wills, et al.,
Human Gene Therapy 5:1079-1088 (1994).
Los adenovirus recombinantes se construyeron
utilizando procedimientos estándar de recombinación homóloga
esencialmente de acuerdo con las enseñanzas de Graham y Prevec,
Meth. Mol. Biol. 7:109-128 (1991). Se
construyó un plásmido de transferencia recombinante (pACN) para
ayudar en la transferencia de los casetes de expresión génica a los
vectores virales. El plásmido pACN se basa en el plásmido pBR322 y
contiene, en orden, la repetición terminal invertida 5 del
adenovirus y la señal de empaquetamiento (Ad5 pares de bases 1 a
358), el amplificador/promotor inmediatamente temprano del
citomegalovirus humano (CMV), la secuencia guía tripartita de tipo 2
del adenovirus (TPL), un lugar de clonación múltiple y una secuencia
de ADN equivalente a los pares de bases desde 4021 hasta 10457 del
adenovirus humano serotipo 2. La preparación del pACN está descrita
en Wills, et al., supra.
Para generar un vector adenoviral recombinante
para la expresión de hIL-10, se aisló una secuencia
de ADNc que codifica la IL-10 a partir del plásmido
pDSRG-IL10 (obtenido de DNAX Research Institute,
Inc., Palo Alto CA). El vector pDSRG-IL10 se digirió
con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI y se aisló
mediante electroforesis en gel el fragmento que contiene la
secuencia que codifica la hIL-10. El plásmido
pBK-RSV (comercialmente disponible de Stratagene,
11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) se linearizó
mediante la digestión con HindIII y Eco RI. El fragmento
linearizardo se ligó al fragmento Hind III-Eco RI
que contiene el gen de la hIL-10 y se híbrido para
producir el vector pBK-RSV-IL10. A
continuación se digirió el vector
pBK-RSV-IL10 con XbaI y BamHI y se
aisló mediante electroforesis en gel un fragmento Xba
I-Bam HI de 592 pares de bases que contiene la
secuencia IL-10. El plásmido pACN (preparado según
las enseñanzas del Ejemplo 1) se digirió con Xba I y Bam HI y se
ligó con el fragmento Xba I-Bam HI de 592 pares de
bases que contiene la secuencia IL-10 para generar
el plásmido de transferencia pACN-hIL10.
Se linearizó pACN-hIL10 con la
endonucleasa de restricción NgoMI y se transfectó conjuntamente en
células 293 con el fragmento grande de la digestión con Cla I de un
vector adenoviral modificado dl327. (Wills, et al., (1994)
supra) utilizando el Equipo para Transferencia a Mamíferos
MBS de fosfato cálcico (Stratagene). La línea celular 293 de riñón
embrionario humano, capaz de proporcionar las funciones E1
adenovirales en trans (ATCC CRL-1573), utilizada
para la propagación de los adenovirus recombinantes, se creció en
medio de Eagle modificado por Dulbecco conteniendo 10% de suero
bovino fetal. La transfección conjunta produce eventos de
recombinación entre el vector de transferencia y el fragmento Cla I
que resultan en la producción de un vector adenoviral recombinante
que expresa hIL-10. Los recombinantes se aislaron
mediante ensayos en placa a partir de las células 293 trasfectadas y
además se purificaron por placa mediante dos rondas de purificación
por placa. Las placas virales se aislaron y purificaron por
cromatografía de columna (Huyghe, et al., Hum. Gene Ther.
6:1403-1416 (1995). Tales virus se
caracterizaron tanto mediante digestión con enzimas de restricción
como mediante secuenciación de ADN a lo largo de las secuencias del
transgén y del promotor.
La construcción del adenovirus recombinante que
expresa vIL-10 se realizó esencialmente según las
enseñanzas del Ejemplo 1 anterior, excepto que el
pACN-BCRF1 se produjo mediante el siguiente
procedimiento. El plásmido
pBCRF1(SR-\alpha) que contiene el ADNc que
codifica vIL-10 se obtuvo del DNAX Research
Institute. Se ha depositado un cultivo de células de E. Coli
que contiene dicho vector (MC1061) con la American Type Culture
Collection con numero de ascensión 68193 y se describe en la patente
US nº 5.736.390. El plásmido
pBCRF1(SR-\alpha) se modificó mediante PCR
para añadirle los lugares de restricción Xba I y Bam HI en los
extremos 5' y 3' de la secuencia de ADNc de vIL-10,
respectivamente. Los cebadores para PCR utilizados con la secuencia
Xba I en 5' fueron:
5'-TGCTCTAGAGCTCCATCATGGAGCGAAGGTTAGTG-3'
y la secuencia antisentido 3' que contiene Bam HI fue
5'-CGCGGATCCGCGTCACCTGGCTTTAATTGT-3'.
El fragmento resultante de 530 pares de bases se subclonó en el
plásmido de transferencia pACN digerido con Xba I y Bam HI y se
ligó.
Se preparó un adenovirus recombinante de control
esencialmente según las enseñanzas del Ejemplo 1 anterior excepto
que el plásmido de transferencia pACN no contuvo la secuencia de
ADNc que codifica proteína.
Se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembra
específicamente libres de patógenos obtenidos de The Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME) (20-25 g) o del Helth
Science Center Animal Resources Department de la Universidad de
Florida. Los ratones se mantuvieron en instalaciones con barrera en
grupos de cinco por jaula durante el experimento. Los ratones se
anestesiaron con 35 mg/kg peso corporal de fenobarbital
intraperitoneal. Después de la inoculación de anestesia, se realizó
una incisión media en el cuello, se levantó el panículo de grasa
caudalmente y se visualizó la traquea. Bajo visualización directa,
se canuló la tráquea con una aguja estéril de grosor 30 y se
administró una dosis por animal de 32 \mul de tampón o de
1x10^{10} partículas virales que codifican
\beta-gal (rAd/\beta-gal),
hIL-10 (rAd/hIL-10),
vIL-10 (rAd/vIL-10) y virus control
con casete vacío (rAd/vacío) preparados esencialmente según las
enseñanzas de los Ejemplo 1 a 3 de la presente solicitud. Se cerró
la incisión y se devolvieron los ratones a la jaula para su
recuperación.
Los ratones se sacrificaron mediante dislocación
cervical en los días uno, cinco, siete, nueve o catorce después de
la instilación de virus (a continuación referida como días 1, 3, 5,
7, 9 ó 14). Se recogió sangre mediante una punción en la vena retro
orbital utilizando un tubo capilar heparinizado. La sangre se
centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm y se recogió el suero.
Los pulmones y la tráquea se extrajeron en bloque y se congelaron de
golpe en nitrógeno líquido.
Los pulmones congelados de golpe preparados según
las enseñanzas del Ejemplo 4, se homogeneizaron durante un minuto en
15 peso:volúmenes de disolución salina tamponada con fosfato. Las
muestras homogeneizadas se centrifugaron durante 20 minutos a 10.000
rpm a 4ºC y se recogió el sobrenadante. La actividad de
\beta-galactosidasa se detectó en los pulmones
utilizando el sistema GalactoLight^{TM} para el ensayo por
quimioluminiscencia de genes trazadores (comercialmente disponible
de Tropix Inc. 47 Wiggins Avenue, Bedford, MA 01730) esencialmente
de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. La
reacción se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente y la
actividad de \beta-galactosidasa se midió
utilizando el luminómetro Monolight 500 (de EG&G Wallac Inc.
Gaithersburg, MD). La actividad basal de
\beta-galactosidasa se obtuvo a partir del pulmón
de un animal no tratado analizado simultáneamente y se sustrajo de
las mediciones de \beta-galactosidasa obtenidas a
partir de los ratones tratados. La actividad basal de
\beta-galactosidasa en los pulmones de los
animales control fue inferior al 1% de la actividad máxima observada
en los pulmones de los ratones instilados con vectores adenovirales
para la administración de ADNc de
\beta-galactosidasa.
El TNF-\alpha bioactivo se
midió en el plasma y en los homogeneizados de pulmón utilizando la
línea celular murina de fibrosarcoma WEHI 164 clon 13 sensible a
TNF-\alpha esencialmente de acuerdo con las
enseñanzas de Espevik & Nissen-Meyer, J.
Immunol. Methods, 95:99-105 (1986). En breve,
las células se cultivaron en placas de 96 pocillos en medio completo
con 1 \mug/ml de actinomicina D y a continuación se las expuso a
homogeneizado de pulmón (preparados de acuerdo con las enseñanzas
del Ejemplo 4), a muestras de suero diluidas uno a cinco o a
concentraciones crecientes de TNF-\alpha humano.
La viabilidad celular se determinó mediante la reducción de bromuro
de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difeniltetrazolium
y se cuantificó espectrofotométricamente la absorbancia a 570 nm. Se
generó una curva estándar con TNF-\alpha y la
sensibilidad del ensayo fue de 5 a 25 pg/ml.
Los niveles de IL-6 murina,
IL-1 murina e IL-10 murina y humana
en los homogeneizados de pulmón y en el plasma, cuando fue
apropiado, se midieron mediante ELISA en sándwich. La
IL-6 murina y la IL-10 humana se
midieron utilizando un equipo de ELISA para IL-6 de
ratón y un equipo de ELISA para IL-10 humana
(disponibles comercialmente de Endogen, Inc. 30 Commerce Way,
Woburn, MA con números de catálogo EM-IL6 y
EH-IL10, respectivamente) esencialmente de acuerdo
con las instrucciones de fabricante. La IL-1 murina
se midió utilizando un equipo ELISA para IL-1 murina
(comercialmente disponible de R&D Systems, 614 McKinley Place
NE, Minneapolis, MN 55413 con número de catálogo M1000)
esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El secuestro de neutrófilos pulmonares en los
pulmones se cuantificó mediante la medición del contenido en
mieloperoxidasa tisular (MPO) de acuerdo con el siguiente
procedimiento. Se pesaron pulmón congelado de golpe (-70ºC) y se
homogeneizaron durante un minuto en una proporción de 15
peso:volúmenes de 0,01 M KH_{2}PO_{4} con 1 mM EDTA (Tampón PE).
A continuación de la homogeneización, el precipitado resultante se
resuspendió en un tampón de 13,7 mM bromuro de cetilmetrimetilamonio
(C-TAB) con ácido acético 50 mM, utilizando el mismo
volumen de C-TAB como de tampón PE. A continuación,
el precipitado resuspendido se sonificó durante cuarenta segundos en
la posición 60% utilizando un sonicador Sonic Dismembrator, Model
300 (disponible de Fischer Scientific) y se centrifugó a 10.000 rpm
durante 15 minutos.
Los sobrenadantes resultantes se recogieron y se
incubaron en un baño de agua durante 2 horas a 60ºC. La actividad
MPO se midió a continuación en dicha disolución mediante oxidación
dependiente de H_{2}O_{2} de
3,3'5,5-tetrametil-bencidina, que
genera una reacción colorimétrica. La absorbancia espetrofotométrica
se determinó a 650 nm y se comparó con una curva estándar lineal con
una sensibilidad de 0,03125 EU.
Para determinar si se desarrolló una respuesta
humoral contra la \beta-galactosidasa expresada o
contra la IL-10 humana, se realizó un ELISA directo
para anticuerpos (IgG o IgM) esencialmente de acuerdo con las
enseñanzas de Solorzano, Kaibara, et al., Journal of
Applied Physiology 84:1119-1130 (1998). En
breve, se recubrieron placas de poliestireno de 96 pocillos Corning
de fondo plano para ELISA, con \beta-galactosidasa
recombinante (obtenida de Sigma Chemicals Inc., St. Louis, Mo) o con
IL-10 humana (obtenida de
Schering-Plough Research Institute, Kenilworth,
NJ.). Una vez bloqueadas las placas con solución salina tamponada
con Tris (TBS) 5% albúmina de suero bovino (BSA Sigma Fraction V) y
1% leche en polvo libre de grasa (Alba), los sueros de ratón
obtenidos al principio y a los 14 días después de la instilación
intratraqueal se diluyeron desde 1:50 hasta 1:100.000 en TBS 5% BSA
y se aplicaron a los pocillos (100 \mul). Se lavaron las placas y
se añadió IgG de cabra antiratón conjugada a peroxidasa de rábano
diluida 1:3000 o inmunoglobulina IgM antiratón (comercialmente
disponible de Promega, 2800 Woods Hollow Road, Madison WI 53711).
Los resultados se visualizaron con 3,3',5,5'tetrametilbencidina. Se
registró una respuesta de anticuerpos positiva cuando la absorbancia
de las muestras del día 14 fue por lo menos dos veces superior a la
máxima absorbancia determinada para las muestras del día cero. Las
cantidades de anticuerpo se estimaron a partir de las mayores
diluciones inversas de la muestra que produjeron una señal
positiva.
De acuerdo con el siguiente procedimiento se
realizó un ensayo funcional para determinar la capacidad
neutralizadora de los antisueros para evitar la capacidad de los
vectores adenovirales recombinantes para infectar y transducir
células HeLa. Se diluyeron los antisueros desde 1:20 hasta 1:2560
mediante diluciones seriadas 1:2. Los antisueros diluidos se
mezclaron con 8x10^{8} partículas por mililitro de un vector
adenoviral recombinante que expresa la proteína verde fluorescente
(rAd/GFP) en una proporción 1:1 con las muestras de los antisueros
diluidos en serie y se incubaron durante una hora a 37ºC. A
continuación, la mezcla se colocó sobre células HeLa en placas de
cultivo de 96 pocillos y se incubó durante la noche para permitir la
transducción. A continuación se midió la intensidad de fluorescencia
de las placas a 450 nm utilizando un lector de placas
espectrofotométrico CytoFluor Multi Reader Series 4000
(comercialmente disponible de Perseptive Biosystems, Inc). Las
unidades de fluorescencia resultantes se normalizaron contra células
HeLa no tratadas que solamente contenían medio y se compararon con
la fluorescencia máxima (células HeLa transducida con 4x10^{8}
partículas por mililitro rAd/GFP). El título de anticuerpos
neutralizantes se estimó determinando el título inverso a una
absorción del 50% de la absorción máxima normalizada.
Claims (15)
1. Utilización de un vector de expresión
recombinante que comprende un casete de expresión para
IL-10 viral (vIL-10) para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un
organismo mamífero que padece una enfermedad inflamatoria pulmonar,
en la que dicho medicamento es adecuado para ser administrado a los
pulmones.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el vector es un vector viral.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que el vector es un vector adenoviral.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que el vector adenoviral es deficiente en replicación.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el vector de expresión recombinante en un vector no viral.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la
que el vector no viral es un plásmido.
7. Utilización según las reivindicaciones 4 ó 6,
en la que el casete de expresión comprende un promotor
constitutivamente activo.
8. Utilización según las reivindicaciones 5 ó 7,
en la que la secuencia que codifica vIL-10 es la
secuencia de ADNc de vIL-10 derivada de EBV.
9. Utilización según la reivindicación 5, en la
que el vector de expresión recombinante está además complejado con
un agente surfactante.
10. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento está destinado a la administración conjunta de
un vector de expresión recombinante capaz de dirigir la expresión de
CFTR y 1 \alpha-antitripsina, inhibidor de
proteasa de linfocito secretorio, superóxido dismutasa, catalasa,
prostaglandina sintetasa e inhibidores tisulares de
metaloproteinasas (TIMP).
11. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho vector de expresión recombinante comprende además un
casete de expresión capaz de dirigir la expresión de CFTR y
\alpha-antitripsina, inhibidor de proteasa de
leucocito secretorio, superóxido dismutasa, catalasa, protaglandina
sintetasa e inhibidores tisulares de metaloprotinasa (TIMP).
12. Utilización según la reivindicación 3, en la
que la enfermedad inflamatoria pulmonar es una enfermedad
inflamatoria pulmonar aguda.
13. Utilización según la reivindicación 12, en la
que dicha enfermedad inflamatoria pulmonar aguda es ARDS.
14. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el vector es adecuado para ser administrado en las primera y
segunda etapas de ARDS.
15. Utilización según la reivindicación 14, en la
que el vector adenoviral es adecuado para ser administrado en una
dosis comprendida entre 1x10^{8} y 1x10^{12} partículas.
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