ES2236175T3 - Estructuracion de particulas solidas desprovistas de carga por multicapa de polimero.multipa. - Google Patents

Abstract

Proceso para la encapsulación de un material constituido por partículas sólidas cristalinas desprovistas de carga que comprende: (a) tratar el material cristalino constituido por partículas con una sustancia anfifílica y (b) recubrir subsiguientemente el material con una capa de un polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de polielectrólitos con cargas opuestas.

Description

Estructuración de partículas sólidas desprovistas de carga por multicapas de polímero.

La invención está dirigida a (i) la encapsulación se sustancias orgánicas desprovistas de carga en cápsulas de polímero por utilización de una estrategia de pasos múltiples que implica la introducción de carga en la superficie de los microcristales con una sustancia anfifílica, seguido por deposición, consecutivamente, de polielectrólitos de carga opuesta para ensamblar una envoltura multiestratificada de material polímero alrededor del molde de microcristales, y (ii) la formación de estructuras multicapa de polímero derivadas de los cristales recubiertos por eliminación fácil del molde cristalino.

En los últimos años, las microcápsulas han recibido una atención considerable debido a su importancia tecnológica en los campos de la medicina, los productos farmacéuticos, la agricultura y los cosméticos.^{1-7} La gran mayoría de las aplicaciones están asociadas con la liberación controlada de ingredientes activos encapsulados (v.g. fármacos, vacunas, anticuerpos, hormonas, plaguicidas y perfumes) en condiciones bien definidas. A pesar del conjunto de tecnologías de encapsulación disponibles, que incluyen las basadas en liposomas, micropartículas y microemulsiones, se ha registrado un gran interés en estrategias para encapsular y suministrar productos farmacéuticos insolubles en agua en formas estables y acuosas.^{8,9} Los métodos para conseguir esto han incluido comúnmente la incorporación de tales fármacos en micelas y microesferas, emulsionamiento del fármaco con aceites, el uso de soluciones concentradas de polímeros solubles en agua, así como la solubilización o suspensión del fármaco con detergentes no iónicos. Un enfoque alternativo y reciente ha sido recubrir fármacos cristalinos insolubles en agua con un lípido de membrana, permitiendo así la dispersión del cristal en un medio acuoso.^{9} Esto representa un método elegante para preparar formas inyectables de sustancias insolubles en agua. Las ventajas de este proceso son las concentraciones significativamente mayores (hasta 40% p/v) del fármaco inyectable suministradas (en comparación con otros métodos), y la estabilidad de la dispersión recubierta.

El acoplamiento de auto-ensamblaje y estructuración coloidal proporciona un medio elegante y versátil para encapsular una diversidad de materiales funcionales que incluyen macromoléculas biológicas, y crear estructuras núcleo-envoltura para uso potencial en los campos de la medicina, los productos farmacéuticos, la catálisis y las separaciones.^{10-18} El método implica recubrir partículas coloidales dispersadas en medios acuosos por el auto-ensamblaje electrostático en nanoescala de materiales polímeros cargados. Esta estrategia aprovecha el hecho de que las entidades coloidales, que sirven como moldes, tienen una carga superficial inherente, que las hace con ello dispersables en agua y proporciona la carga necesaria esencial para la adsorción de capas subsiguientes y la encapsulación de multicapas de polielectrólitos. Recientemente, se ha empleado este enfoque para capturar proteínas^{18} y construir nuevas clases de coloides compuestos. ^{11-17} Los coloides empleados han abarcado desde látex de polímeros cargados^{11-17} hasta moldes biológicos, v.g. células^{10} y cristales de proteínas^{18}.

Los compuestos orgánicos sólidos cristalinos son una clase importante de materiales que se emplean extensamente en productos farmacéuticos como fármacos. El recubrimiento controlado de tales compuestos presenta un interés generalizado.^{19} Sin embargo, muchos materiales cristalinos que tienen importancia en medicina, por ejemplo cristales compuestos de fármacos de peso molecular bajo, están desprovistos de carga, y tienen una solubilidad baja en agua. Para tales fármacos, su encapsulación y aplicación en un medio acuoso representa a menudo un problema sustancial.

Un objeto de la invención fue por consiguiente proporcionar un método para la encapsulación de materiales desprovistos de carga.

El problema subyacente de la invención se resuelve por un proceso para la encapsulación de un material constituido por partículas sólidas cristalinas desprovistas de carga que comprende

(a)

tratar el material cristalino constituido por partículas con una sustancia anfifílica y

(b)

recubrir subsiguientemente el material sólido con una capa de polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de polielectrólitos con cargas opuestas.

La encapsulación de materiales por el uso de estructuración coloidal se ha extendido a moldes sólidos desprovistos de carga, presentando con ello una estrategia alternativa y ventajosa a otros métodos de encapsulación.

Con el proceso de acuerdo con la invención es posible, sorprendentemente, encapsular materiales constituidos por partículas sólidas desprovistas de carga, en particular, moldes cristalinos orgánicos que son en gran parte insolubles en agua y/o hidrófobos. Así pues, el método es aplicable a una gran diversidad de sustancias y en particular a sustancias que presentan un alto interés farmacéutico.

En el primer paso del proceso, los materiales constituidos por partículas sólidas cristalinas desprovistas de carga se tratan con una sustancia anfifílica, que imparte carga a la superficie de los materiales constituidos por partículas. A continuación, en el segundo paso, el material recubierto con la sustancia anfifílica se recubre de nuevo con un polielectrólito que presenta carga opuesta a la superficie de los materiales constituidos por partículas recubiertos. Para la formación de multicapas, el material se trata subsiguientemente con polielectrólitos de cargas opuestas, es decir alternativamente con polielectrólitos catiónicos y aniónicos. Las capas de polímero se autoensamblan sobre los moldes sólidos pre-cargados por medio de deposición electrostática capa-por-capa, formando así una envoltura polímera multiestratificada alrededor de los núcleos sólidos.

Debido a la naturaleza semi-permeable de la envoltura de multicapas de polímero, es adicionalmente posible separar el núcleo sólido estructurado, v.g. por exposición a un disolvente orgánico suave. El proceso de acuerdo con la invención proporciona así un camino nuevo y fácil para la fabricación de microcápsulas multiestratificadas de polímero así como una estrategia excelente para la encapsulación de compuestos hidrófobos tales como fármacos.

El limitado potencial de fármacos médicos está asociado con su baja solubilidad en soluciones acuosas. La mayoría de los fármacos son sustancias cristalinas sólidas, que contienen grupos aromáticos no polares (anfetaminas) y/o grupos heterocíclicos (1,4-benzodiazepina), o grupos aromáticos o alicíclicos condensados (isoprenoides: esteroide, vitamina A, vitamina E) y en la mayoría de los casos uno o más grupos funcionales polares (v.g. amina, hidroxi, carboxi, fenólico, aldehído, cetona). Su formulación es un factor clave para hacer posible su uso en el cuerpo humano.

El método aquí descrito proporciona una estrategia para:

A)

la encapsulación de un material constituido por partículas sólidas desprovistas de carga, insoluble en agua, v.g. cristales de fármacos o/y materiales amorfos (vítreos);

B)

la producción de cápsulas de polímero huecas.

A) El material de partida es la sustancia sólida propiamente dicha. Debido al carácter desprovisto de carga e hidrófobo de estos materiales, los mismos no pueden recubrirse directamente con polielectrólitos. El método descrito hace que sea posible introducir una carga de superficie en el cristal por tratamiento con una especia anfifílica cargada (v.g. agentes tensioactivos iónicos). Esto conduce a la formación de una suspensión estable de la sustancia recubierta en agua. Los potenciales superficiales típicos después de tratamiento con una sustancia anfifílica (v.g. dodecil-sulfato de sodio, SDS) están comprendidos entre -50 y -70 mV, lo que indica una suspensión de cristales cargados con agente tensioactivo de alta estabilidad. Los cristales cargados son entonces moldes adecuados para recubrimiento con polielectrólitos.

Una ventaja de esta innovación es la posibilidad de crear un sistema de liberación de fármaco con una tasa de liberación constante a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Esto es posible debido a la fase sólida existente en el interior de la cápsula. Después que el material sólido encapsulado se aplica en un líquida tal como un tampón o fluido corporal, se establecerá un sistema bifásico por el cristal propiamente dicho y una solución saturada del material cristalino en el interior de la cápsula. Por la puesta en contacto de las cápsulas preparadas de acuerdo con la invención, que están constituidas por un material sólido encapsulado, con un líquido tal como agua, el líquido penetra en las cápsulas. Con ello la pared de la cápsula se hincha en cierto grado y dentro de la cápsula una pequeña porción del material sólido se solubiliza hasta que se alcanza la saturación del líquido penetrado. A medida que se produce la liberación del material, la cantidad de sustancia liberada de la cápsula se restablece continuamente por solubilización ulterior de material sólido dentro de la cápsula. Por consiguiente, la concentración de la sustancia en el líquido dentro de la cápsula se mantiene prácticamente constante. Como consecuencia, puede conseguirse una liberación constante de la sustancia a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

El proceso de la invención es particularmente adecuado para preparar sistemas de liberación, que liberan una pequeña cantidad de sustancia activa constantemente a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Un sistema de este tipo comprende ventajosamente una barrera de difusión alta a través de la pared de la cápsula, lo que da como resultado una pequeña cantidad de sustancia liberada con respecto a la cantidad de sustancia que puede suplirse en el mismo periodo de tiempo por solubilización del material sólido dentro de la cápsula. Tales sistemas de liberación son particularmente útiles en terapia hormonal, en la cual se requiere la liberación constante de pequeñas cantidades de sustancia activa.

La tasa de liberación de una sustancia es función de la diferencia en su concentración dentro y fuera de la cápsula. El enfoque descrito proporciona un método para mantener constante este gradiente de concentración mientras el material sólido no se haya disuelto completamente. Esto podría conducir a una tasa de liberación constante de la sustancia a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Este método proporciona una ventaja sobre otros sistemas de liberación que utilizan una sustancia disuelta en una cápsula o liposoma. La concentración de la sustancia disuelta en dichas cápsulas o liposomas disminuye desde el primer momento de la liberación, por lo que la tasa de liberación no es constante.

B) El método presenta también la posibilidad de producción de cápsulas de polímero huecas. Hasta ahora, el proceso de retirada del molde ha empleado condiciones rigurosas (v.g. pH <1,6, pH >11), con objeto de descomponer el molde de polímero y separarlo de la cápsula. Por la utilización de estos procedimientos rigurosos, la cápsula propiamente dicha se deteriora en muchos casos, con lo cual cambian sus propiedades. Este problema puede resolverse utilizando un molde no polímero tal como una sustancia de peso molecular bajo cristalizada e hidrófoba (como se ha explicado anteriormente). Esta sustancia puede retirarse fácilmente después de la encapsulación por tratamiento con un disolvente orgánico suave (v.g. etanol). La sustancia se disuelve y penetra fácilmente a través de las multicapas de polímero. Las envolturas pueden reducirse luego a un sedimento por centrifugación y resuspenderse en una solución acuosa.

De acuerdo con la invención, un material sólido desprovisto de carga se encapsula en dos pasos. Primeramente, el material sólido desprovisto de carga se trata con una sustancia anfifílica. Este tratamiento da preferiblemente como resultado una dispersión acuosa del material sólido. La sustancia anfifílica se dispone en la superficie del material sólido, haciendo dicho material susceptible al recubrimiento subsiguiente con un polielectrólito cargado. El material desprovisto de carga utilizado en la presente invención es preferiblemente un material que no tiene carga alguna y no tiene tampoco ningún grupo ionizable. Es también posible, sin embargo, utilizar un material desprovisto de carga que tenga grupos ionizables, con lo cual este material puede utilizarse en condiciones en las cuales los grupos ionizables no se ionizan. El proceso de encapsulación de acuerdo con la invención es por consiguiente aplicable a una extensa gama de materiales, cuya encapsulación en forma sólida no ha sido posible hasta ahora o ha sido posible únicamente en condiciones muy específicas. En un segundo paso, el material sólido constituido por partículas que contiene la sustancia anfifílica ensamblada en su superficie, se recubre con una capa de un polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de poli-electrólitos con cargas opuestas. El recubrimiento del polielectrólito cargado sobre la superficie se hace posible por la sustancia anfifílica. Por tratamiento sucesivo con polielectrólitos de cargas opuestas pueden prepararse recubrimientos de capas múltiples. Preferiblemente, se preparan cápsulas que tengan al menos dos, más preferiblemente al menos tres, todavía más preferiblemente al menos cinco y muy preferiblemente al menos ocho capas de polielectrólitos que tienen carga alternante. Sin embargo, es también posible preparar envolturas más gruesas que tengan v.g. hasta 100 o más capas de polielectrólitos, preferiblemente hasta 50 y muy preferiblemente hasta 20 capas. El ensamblaje de envolturas más gruesas tiene el efecto de suavizar la superficie externa y reducir al mismo tiempo la porosidad de las envolturas.

Por el número de capas de polielectrólitos, por la selección de la sustancia anfifílica y los polielectrólitos utilizados y por las condiciones durante el recubrimiento con la sustancia anfifílica, puede modificarse la porosidad de las cápsulas. De este modo, se pueden obtener tamaños de poro diseñados específicamente para la aplicación respectiva. Detergentes monómeros tales como SDS, por ejemplo, conducen a poros pequeños, en tanto que con detergentes polímeros tales como PSS se obtienen poros mayores en la pared de la cápsula. Las condiciones aplicadas cuando se carga el material sólido con la sustancia anfifílica pueden influir en el tamaño de poro, v.g., si se utilizan detergentes polímeros, por determinación de la forma del detergente polímero. La concentración iónica y el valor del pH, por ejemplo, pueden determinar si el detergente polímero está presente en forma alargada o de serpentín. Por ejemplo, pueden obtenerse poros que tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm a >100 nm en las paredes de la cápsula, si se utiliza un polielectrólito anfifílico como la sustancia anfifílica. No obstante, si se utiliza un agente tensioactivo iónico como la sustancia anfifílica, se pueden obtener tamaños de poro más pequeños, inferiores a aproximadamente 5 a 10 nm. La porosidad de la cápsula puede verse reducida por un paso de reticulación ulterior, en el cual se utiliza un reactivo para introducir inter- e intra-reticulaciones de polielectrólitos en las envolturas.

El espesor de la envoltura de la cápsula es de modo preferible aproximadamente 2 a 100 nm, más preferiblemente 5 a 50 nm. El tamaño de las cápsulas propiamente dichas es preferiblemente < 50 \mum, en particular < 20 \mum, y más preferiblemente < 15 \mum; no obstante, es también posible preparar cápsulas mayores. El tamaño mínimo de las cápsulas es preferiblemente al menos 10 nm, más preferiblemente al menos 50 nm. El tamaño de la cápsula depende básicamente del tamaño del material sólido utilizado.

El método de la invención es especialmente adecuado para material sólido desprovisto de carga que tiene una solubilidad baja en agua o es insoluble en agua o no dispersable en agua. La encapsulación de tales materiales ha sido difícil en la técnica anterior y puede conseguirse ahora fácilmente de acuerdo con la invención.

El material sólido desprovisto de carga utilizado como núcleo para la encapsulación puede ser un material orgánico, un material biológico o/y un material inorgánico. Los materiales orgánicos, en particular materiales sólidos de compuestos orgánicos de peso molecular bajo, pueden encapsularse de modo especialmente favorable. De acuerdo con la invención, es posible la encapsulación de moldes cristalinos orgánicos sólidos desprovistos de carga que son en gran parte insolubles en agua. Materiales adecuados que pueden encapsularse de acuerdo con el método de la invención, son por ejemplo fármacos, vitaminas, nutrientes, hormonas, factores de crecimiento, plaguicidas, antibióticos y conservantes. De acuerdo con la invención, no es necesario para ello que los materiales contengan un grupo cargado o ionizable.

La forma de las cápsulas depende en gran parte de la forma del material sólido utilizado. Adecuadamente, el material sólido se emplea como material cristalino, v.g. en la forma de cristales simples. Se prefiere particularmente utilizar microcristales de los compuestos desprovistos de carga a encapsular. Básicamente, puede encapsularse cualquier material sólido desprovisto de carga, v.g. un material sintético, un material aislado a partir de fuentes naturales o un material aislado modificado químicamente.

Como sustancia anfifílica de acuerdo con la invención se puede utilizar cualquier sustancia que tenga grupos iónicos hidrófilos e hidrófobos. Es importante que la sustancia anfifílica tenga al menos un grupo provisto de carga eléctrica para proporcionar cargas eléctricas al material sólido. Por esta razón, puede hacerse referencia también a la sustancia anfifílica utilizada como sustancia iónica anfifílica o detergente iónico. Preferiblemente, se utilizan agentes tensioactivos iónicos, fosfo-lípidos y/o polielectrólitos anfifílicos. Los polielectrólitos anfifílicos, por ejemplo, son polielectrólitos que comprenden un grupo cargado como grupo hidrófilo y un grupo hidrófobo, v.g. grupos aromáticos. Se prefiere utilizar un agente tensioactivo catiónico o/y aniónico. Ejemplos de agentes tensioactivos catiónicos adecuados son sales de amonio cuaternario (R_{4}N^{+}X^{-}), especialmente bromuro de didodecildimetilamonio (DDDAB), bromuros de alquiltrimetilamonio, especialmente bromuro de dodeciltrimetilamonio o bromuro de palmitil-trimetilamonio, o sales de N-alquilpiridinio o aminas terciarias ((R_{3}NH^{+})- X^{-}), especialmente colesteril-3\beta-N-(dimetil-aminoetil)-carbamato o aminas secundarias ((R_{2}NH_{2}^{+})X^{-}) o aminas primarias ((RNH_{3}^{+})X^{-}) o mezclas de las mismas, en donde X^{-} significa un anión de carga opuesta, v.g. un halogenuro. Ejemplos de agentes tensioactivos aniónicos adecuados son alquilsulfonatos (R-SO_{3}M), especialmente dodecil-sulfato, v.g. dodecil-sulfato de sodio (SDS), lauril-sulfato u olefin-sulfonato (R-SO_{3}M), especialmente n-dodecil-benceno-sulfonato de sodio o alquilsulfatos (R-OSO_{3}M) o ácidos grasos (R-COOM), especialmente sal de sodio de ácido dodecanoico o ácido fosfórico o ácidos cólicos o compuestos orgánicos fluorados, especialmente 3-[2-(perfluoroalquil)etiltio]-propionato de litio o mezclas de los mismos. Son particularmente preferidos agentes tensioactivos que tienen 1 a 30 carbonos en su grupo alquilo u olefínico.

Adicionalmente, se prefiere utilizar una sustancia polímera que proporciona grupos cargados y cadenas laterales hidrófobas, en particular, poli(estireno-sulfonato) (PSS) como sustancia anfifílica, o utilizar un copolímero de bloques, especialmente poli(etileno)-bloque-ácido estirenosulfónico (PEE-PSS) como sustancia anfifílica.

En general, debe entenderse que los polielectrólitos son polímeros que tienen grupos iónicamente disociables, que pueden ser un componente o sustituyente de la cadena del polímero. Usualmente, el número de estos grupos iónicamente disociables en los polielectrólitos es tan grande que los polímeros en forma disociada (denominados también poliiones) son solubles en agua. En este contexto, debe entenderse que el término polielectrólito abarca también ionómeros, en los cuales la concentración de grupos iónicos no es suficiente para la solubilidad en agua, pero que sin embargo tienen cargas suficientes para experimentar auto-ensamblaje. Sin embargo, la envoltura comprende preferiblemente polielectrólitos "verdaderos", es decir polielectrólitos solubles en agua.

Dependiendo de la clase de grupos disociables, los polielectrólitos se clasifican como poliácidos y polibases.

Cuando se disocian los poliácidos, forman polianiones, con eliminación de protones, que pueden ser inorgánicos, orgánicos y biopolímeros. Ejemplos de poliácidos son ácido polifosfórico, ácido polivinilsulfúrico, ácido polivinilsulfónico, ácido polivinilfosfónico y ácido poliacrílico. Ejemplos de las sales correspondientes, que se denominan también polisales, son polifosfato, polisulfato, polisulfonato, polifosfonato y poliacrilato.

Las polibases contienen grupos que son capaces de aceptar protones, v.g. por reacción con ácidos, con formación de una sal. Ejemplos de polibases que tienen grupos disociables en su cadena principal y/o sus grupos laterales son polialilamina, polietilimina, polivinilamina y polivinilpiridina. Por aceptación de protones, las polibases forman policationes.

Polielectrólitos adecuados de acuerdo con la invención son polímeros orgánicos, bio-polímeros, polímeros inorgánicos y mezclas de los mismos.

Polielectrólitos adecuados de acuerdo con la invención son también biopolímeros tales como ácido algínico, goma arábiga, ácidos nucleicos, pectinas, proteínas y otros así como biopolímeros modificados químicamente tales como carboximetil-celulosa y lignin-sulfonatos y polímeros sintéticos tales como ácido polimetacrílico, ácido polivinilsulfónico, ácido polivinilfosfónico y polietilenimina.

Se pueden utilizar polielectrólitos lineales o ramificados. La utilización de polielectrólitos ramificados conduce a multicapas de polielectrólitos menos compactas, que tienen un grado mayor de porosidad de pared. Para aumentar la estabilidad de las cápsulas, las moléculas de polielectrólitos pueden reticularse dentro de o/y entre las capas individuales, v.g. por reticulación de grupos amino con aldehídos. Preferiblemente, el polielectrólito se reticula después de su estructuración. Adicionalmente, pueden utilizarse polielectrólitos anfifílicos, v.g. bloques anfifílicos o copolímeros aleatorios que tienen carácter polielectrolítico parcial, a fin de reducir la permeabilidad frente a las moléculas polares pequeñas. Tales copolímeros anfifílicos se componen de unidades que tienen funcionalidad diferente, v.g. unidades ácidas o básicas, por una parte, y unidades hidrófobas, por otra parte, tales como estirenos, dienos o siloxanos que pueden estar presentes en el polímero como bloques o distribuidos estadísticamente. Por la utilización de copolímeros que, debido a las condiciones externas, cambian su estructura, la permeabilidad u otras propiedades de las paredes de la cápsula pueden controlarse de manera definida. En este contexto, por ejemplo, son posibles copolímeros que tienen una parte de poli(N-isopropil-acrilamida), v.g. poli(N-isopropilacrilamida-ácido acrílico), los cuales, por vía del equilibrio de enlaces hidrógeno, cambian su solubilidad en agua en función de la temperatura, lo cual va acompañado por hinchamiento.

Por la utilización de polielectrólitos que son degradables en ciertas condiciones, v.g., fotolábiles, lábiles en medio ácido o lábiles en medio básico, la liberación de la sustancia activa encerrada puede controlarse ulteriormente por la disolución de las paredes de la cápsula. Adicionalmente, para ciertas aplicaciones, pueden utilizarse como componentes de las cápsulas polielectrólitos conductores o polielectrólitos que tienen grupos ópticamente activos. Básicamente, no existe limitación alguna en relación con los polielectrólitos y ionómeros a utilizar, respectivamente, con tal que las moléculas utilizadas tengan carga suficientemente alta o/y sean capaces de fijarse a la capa inferior por la vía de otras clases de interacción, v.g. enlaces hidrógeno y/o interacciones hidrófobas.

Así pues, polielectrólitos adecuados son tanto polielectrólitos de peso molecular bajo como poliiones, respectivamente, v.g. que tengan pesos moleculares de unos cuantos centenares de Daltons, hasta polielectrólitos macromoleculares, v.g. polielectrólitos de origen biológico, que tienen un peso molecular de varios millones de Daltons.

Ejemplos adicionales de un polímero orgánico como bioelectrólito son polímeros biodegradables tales como ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA), poliamidas, poli-2-hidroxi-butirato (PHB), policaprolactona (PCL), poli-ácido(láctico-co-glicólico) (PLGA), polímeros con marcadores fluorescentes, polímeros conductores, polímeros de cristal líquido, polímeros de fotocontacto, polímeros fotocrómicos y sus copolímeros y/o mezclas de los
mismos.

Ejemplos de biopolímeros preferidos como polielectrólito son poli(aminoácidos), en particular, péptidos, proteínas de capa S, policarbohidratos tales como dextrina, pectina, alginato, glucógeno, amilosa, quitina, condroitina, ácido hialurónico, polinucleótidos, tales como DNA, RNA, oligonucleótidos o/y biopolímeros modificados tales como carboximetil-celulosa, carboximetil-dextrano o lignin-sulfonatos. Ejemplos preferidos de polímeros inorgánicos como polielectrólito son polisilanos, polisilanoles, polifosfazenos, polisulfazenos, polisulfuros y/o polifosfatos.

También es posible depositar nanopartículas o biomoléculas cargadas como material de cápsula.

El método de la invención se lleva a cabo preferiblemente de tal manera que el material en exceso de las sustancias de partida utilizadas en los pasos individuales se separa después de cada paso de tratamiento. Por ejemplo, se forma primeramente una dispersión acuosa de las partículas del molde por adición de una solución acuosa de la sustancia anfifílica. Después de separar cualquier exceso de moléculas anfifílicas, se añade luego una primera especie de polielectrólito para crecimiento de la primera envoltura de polielectrólito. Después de separar cualquier exceso de moléculas de polielectrólito, se añade luego la especie de polielectrólito con carga opuesta utilizada para crecimiento de la capa siguiente. Subsiguientemente, se aplican de modo sucesivo capas de moléculas de polielectrólito con cargas opuestas. Es posible seleccionar especies de polielectrólitos idénticas o diferentes, o mezclas de especies de polielectrólitos para cada capa que tenga la misma carga, es decir cada segunda capa. Entre cada paso de incubación se realiza un paso de purificación.

El material encapsulado preparado forma preferiblemente una suspensión estable en una fase acuosa.

Una ventaja de la invención reside en el hecho de que el espesor y la permeabilidad de la cápsula para la liberación controlada del material encapsulado puede controlarse de una manera predeterminada, v.g. por el número de capas, la naturaleza de los polielectrólitos utilizados, la naturaleza de las sustancias anfifílicas utilizadas, la naturaleza de las nanopartículas o biomoléculas, en caso de ser utilizadas, un paso adicional opcional de reticulación y las condiciones del ensamblaje de los polielectrólitos.

Después que se ha aplicado el número deseado de capas de polielectrólitos de acuerdo con la invención, las partículas de molde ahora encapsuladas pueden desintegrarse, en caso deseado, conduciendo a la formación de cápsulas huecas. Por consiguiente, la invención abarca también un proceso para la preparación de cápsulas huecas que tienen una envoltura de polielectrólito, que comprende los pasos de:

(a) tratar un material sólido cristalino constituido por partículas desprovistas de carga con una sustancia anfifílica, (b) recubrir subsiguientemente el material sólido cristalino con una capa de un polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de polielectrólitos con cargas opuestas y (c) retirar el núcleo de material sólido cristalino constituido por partículas desprovistas de carga por su solubilización.

La desintegración puede efectuarse por adición de reactivos que son adecuados para disolver el material de núcleo sólido desprovisto de carga, v.g. un disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente orgánico suave, en el cual el material es soluble, o un disolvente ácido o alcalino con el cual el material forma una sal soluble. El disolvente orgánico puede utilizarse en forma anhidra pura o como mezclas H_{2}O/disolvente. Ejemplos representativos de disolventes orgánicos adecuados son, v.g. etanol, cloroformo, etc. De acuerdo con la invención, la disolución de las partículas del molde puede efectuarse de una manera suave durante un periodo de incubación corto, v.g. 1 minuto a 1 h a la temperatura ambiente. Los moldes se desintegran casi completamente, dado que ya no puede detectarse residuo alguno de las partículas ni siquiera cuando se inspeccionan las envolturas remanentes al microscopio electrónico.

Preferiblemente, las cápsulas huecas se redispersan en un disolvente acuoso o en un disolvente orgánico. Dentro de las cápsulas existe entonces preferiblemente disolvente puro.

Otra materia objeto de la presente invención son cápsulas de polielectrólitos que pueden obtenerse por el método de la invención. En una realización, estas cápsulas contienen un núcleo de material sólido desprovisto de carga que ha servido como molde. Así pues, la estructura de tales cápsulas, examinada de dentro afuera, se compone de las capas siguientes: sustancia activa, sustancia anfifílica y una o más capas de polielectrólito. En otra realización, las cápsulas de polielectrólito ya no tienen residuo detectable alguno del material de núcleo sólido desprovisto de carga, es decir que carecen de núcleo. Una cápsula de polielectrólito hueca de este tipo tiene la estructura siguiente: espacio hueco, sustancia anfifílica, y una o más capas de polielectrólito. La ventaja del material anfifílico contenido en las cápsulas de poli-electrólito es que la porosidad puede controlarse y determinarse de este modo. Adicionalmente, por utilización de la sustancia anfifílica se consigue una cubierta uniforme del material de núcleo de tal manera que las cápsulas de polielectrólito tienen preferiblemente una forma externa determinada por el núcleo. Se prefiere especialmente que las cápsulas de polielectrólito de acuerdo con la invención contengan una sustancia activa, en especial una sustancia farmacéuticamente activa. La sustancia activa encapsulada puede ser idéntica por tanto al material encapsulado constituido por partículas sólidas desprovistas de carga; sin embargo, aquélla puede haberse introducido también más tarde en las envolturas de polielectrólito vacías.

Las cápsulas de acuerdo con la invención tienen preferiblemente un diámetro comprendido en el intervalo de 10 nm a 50 \mum, preferiblemente de 50 nm a 10 \mum. Por una selección adecuada de los moldes, pueden obtenerse composiciones de cápsula que tienen monodispersidad alta, es decir, composiciones en las cuales la cantidad de cápsulas, cuya desviación del diámetro medio es > 50%, es menor que 10% y preferiblemente menor que 1%. Las cápsulas de acuerdo con la invención pueden secarse también, particularmente liofilizarse, y redispersarse luego nuevamente en disolventes adecuados.

Sorprendentemente, se ha encontrado que el tipo de sustancia anfifílica utilizada para pre-cargar el material sólido, en particular, los microcristales, determinaba la porosidad de las cápsulas resultante. Así, es posible proporcionar sistemas exclusivos, altamente flexibles, con propiedades de liberación adaptadas para sustancias encapsuladas, en particular, para aplicaciones de suministros de fármacos. Para influir en la porosidad, es también posible almacenar sustancias anfifílicas, en particular fosfolípidos, agentes tensioactivos iónicos o polielectrólitos anfifílicos entre las envolturas de polielectrólito.

Las cápsulas preparadas por el método de la invención pueden utilizarse para encapsular sustancia activa. Estas sustancias activas pueden ser tanto sustancias inorgánicas como sustancias orgánicas. Ejemplos de tales sustancias activas son catalizadores, en particular, enzimas, sustancias farmacéuticamente activas, polímeros, colorantes tales como compuestos fluorescentes, moléculas sensoras, es decir moléculas que reaccionan de modo detectable al cambio de las condiciones ambiente tales como temperatura o pH, agentes de protección de las plantas, y sustancias aromáticas. Las sustancias activas pueden formar por ello los materiales sólidos encapsulados desprovistos de carga propiamente dichos, o pueden introducirse posteriormente en las envolturas huecas de polielectrólito obtenidas por disolución del núcleo en condiciones suaves, v.g. por medio de un disolvente orgánico.

Las cápsulas pueden utilizarse también como cámaras de reacción, especialmente como cámaras de microrreacción, para reacciones químicas. Debido al hecho de que la permeabilidad de las paredes de la cápsula es controlable de tal manera que permita el paso, por ejemplo, de sustancias de peso molecular bajo, reteniendo sin embargo en gran parte las moléculas macromoleculares, los productos de peso molecular alto que se forman en una reacción, v.g. polímeros que se forman durante la polimerización, pueden ser retenidos fácilmente en el interior durante la síntesis.

Las cápsulas pueden utilizarse también en una diversidad de otras aplicaciones, v.g. en sensores, materiales analíticos de superficies, farmacia, medicina, tecnología de los alimentos, biotecnología, cosméticos, tecnología de la información e industria de la impresión (v.g. encapsulación de materiales colorantes).

En lo que sigue, la invención se explica en detalle por las dos sustancias modelo: pireno (PYR) y diacetato de fluoresceína (FDA); sin embargo, aquélla puede llevarse a cabo también en general con otros materiales sólidos desprovistos de carga.

Como los moldes microcristalinos desprovistos de carga se emplearon pireno (PYR) y diacetato de fluoresceína (FDA). Tanto PYR como FDA tienen una solubilidad muy baja en agua. El paso primero y más importante en la encapsulación implicaba impartir una carga a la superficie del cristal por autoensamblaje de una sustancia anfifílica, en particular un agente tensioactivo iónico, un fosfolípido o polielectrólito que tenga una naturaleza anfifílica tal como un polímero cargado que es anfifático. Preferiblemente, los cristales de tamaño micrométrico se dispersaban en agua, v.g. por tratamiento de los mismos mediante ultrasonidos en presencia de un agente tensioactivo iónico.^{20} La película anfifílica estabiliza el microcristal por interacciones tanto hidrófobas como hidrófilas, recubriendo y envolviendo el mismo, protegiéndolo así contra la agregación. Los microcristales estables y cargados recubiertos con la sustancia anfifílica, en particular, un agente tensioactivo cargado, se expusieron luego a un polielectrólito (que llevaba una carga opuesta a la sustancia anfifílica adsorbida en el molde cristalino), dando como resultado su recubrimiento adicional con una capa de polímero. La adsorción consecutiva subsiguiente de polielectrólitos con cargas opuestas daba como resultado la formación de multicapas de polímero sobre el núcleo coloidal del microcristal.^{21}

Así, el ensamblaje de multicapas de polímero sobre los moldes microcristalinos recubiertos puede conseguirse por una adsorción capa-a-capa de polielectrólitos catiónicos y aniónicos.

La Figura 2 muestra el potencial \zeta en función del número de capas de recubrimiento de polímero para microcristales de PYR y FDA pre-expuestos a agente tensioactivo (DDDAB o SDS, Figura 2a), DPPC o PSS (Figura 2b). Los cristales de PYR expuestos a DDDAB (cargado positivamente) exhibían un potencial \zeta de +50 mV, mientras que los cristales de FDA dispersados con SDS (cargado negativamente) exhibían un valor de -50 mV. Adicionalmente, los microcristales de FDA dispersados con DPPC producían un potencial \zeta de +20 mV, y los expuestos a PSS un valor de -40 mV. Estos datos confirman la carga de la superficie de los microcristales por adsorción de las sustancias anfifílicas o PSS, explicando la dispersabilidad de los microcristales en solución acuosa. La capa adsorbida recubre el microcristal, protegiéndolo así contra la agregación.

El mecanismo de la dispersión y estabilización de los microcristales puede explicarse por las interacciones hidrófobas entre las sustancias anfifílicas y los microcristales. Dado que tanto PYR como FDA son hidrófobos, es de esperar que las cadenas hidrófobas de los agentes tensioactivos y las existentes en DPPC se asocien con la superficie del microcristal, mientas que los grupos iónicos de estas sustancias anfifílicas se proyecten en sentido de alejamiento de la superficie.^{26} Es digno de mención que ni los microcristales de PYR ni los de FDA podían dispersarse fácilmente con los polielectrólitos PAH, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDADMAC), o copolímeros de DADMAC y acrilamida con contenidos variables de DADMAC (8-73% molar). En contraste, los microcristales podían dispersarse por exposición a PSS. La naturaleza anfifílica de PSS, debido al grupo aromático en la cadena principal (y los grupos cargados) del polímero, puede ser responsable de la adsorción con éxito y la carga consiguiente de la superficie del cristal. Los microcristales recubiertos se ven impedidos de crecimiento ulterior (es decir agregación) por las interacciones iónicas y/o estéricas del recubrimiento delgado que está fuertemente asociado con cada partícula de microcristal. Estos microcristales modificados de la superficie representan coloides estables y cargados adecuados para el recubrimiento de multicapas de polielectrólitos.

Como se representa en la Figura 2, se observó una alternancia de signo en el potencial \zeta cuando los cristales pre-cargados se exponían a soluciones de polímeros de carga opuesta. El signo del potencial \zeta dependía del polielectrólito que formaba la capa más externa, es decir, el polímero que se depositaba. Con indiferencia del tipo de microcristal (PYR o FDA), o de la sustancia anfifílica utilizada para recubrir y estabilizar los microcristales, se midieron potenciales \zeta alternantes positivos y negativos para los cristales recubiertos expuestos alternativamente a PAH y PSS, respectivamente. Esto demuestra que se producía un crecimiento gradual de los polímeros sobre el molde microcristalino, y es característico de la formación de multicapas de polímero sobre partículas coloidales cargadas. Se observaron valores de aprox. +50 mV cuando PAH formaba la capa más externa y -50 mV cuando se depositaba en último lugar PSS. Los valores positivos ligeramente inferiores observados para las capas PAH-FITC (FITC: isotiocianato de fluoresceína) (aprox. +20 mV) se atribuyen a la carga elevada de moléculas de FITC cargadas negativamente sobre las cadenas de PAH. Es importante que las sustancias anfifílicas se adsorbían fuertemente sobre los microcristales, permitiendo la formación de multicapas de polímero.

De acuerdo con la invención, pueden utilizarse agentes tensioactivos cargados, lípidos o polímeros anfifílicos para cargar moldes cristalinos hidrófobos, facilitando así su encapsulación con multicapas de poli-electrólitos. Sorprendentemente, las sustancias anfifílicas no se eliminan de las superficies del material sólido desprovisto de carga cuando se añade un polielectrólito, sino que sirven como enlazadores para la fijación del polielectrólito sobre el material sólido desprovisto de carga.

Se obtuvo una evidencia adicional de la encapsulación con éxito de los microcristales desprovistos de carga por medidas de microscopía de transmisión y barrido láser confocal de fluorescencia (CLSM). Se empleó la CLSM para investigar la morfología de los microcristales y comprobar su recubrimiento con multicapas de polímero. Un polielectrólito marcado fluorescentemente (FITC-PAH) se adsorbió como la capa más externa sobre los coloides microcristalinos pre-recubiertos con objeto de permitir su visualización por microscopía de fluorescencia. La cobertura regular de FITC-PAH sobre la superficie del cristal se confirmó por microscopía de fluorescencia, mientras que las micrografías de transmisión demostraron que el microcristal recubierto estaba constituido por un núcleo sólido. Los microcristales recubiertos podían almacenarse durante días sin cambio apreciable alguno en la morfología.

La Figura 3 muestra una imagen CLSM (en modo de transmisión) de un microcristal de FDA que se ha dispersado como resultado del recubrimiento con PSS y se ha recubierto adicionalmente con nueve capas de polielectrólitos (la última capa de las cuales era PAH-FITC). El recuadro muestra la micrografía correspondiente de fluorescencia CLSM. Es evidente, por la imagen de transmisión que el microcristal posee un núcleo sólido. Los microcristales tenían formas diversas, que iban desde cuasi-esféricas hasta semejantes a varillas, cuadradas y rectangulares. La evidencia directa para el recubrimiento de FDA con polímero se proporciona en la imagen de fluorescencia CLSM (recuadro). Ésta presenta la fluorescencia debida a PAH-FITC presente en la capa exterior de un microcristal recubierto. Se observaron imágenes CLSM similares para cristales de FDA y PYR predispersados recubiertos con polímero. Los estudios demostraron que las suspensiones de microcristales recubiertos eran estables durante días cuando se guardaban en un medio acuoso, lo que reflejaba la estabilidad de las capas adsorbidas.

Una prueba directa de que una estructura multicapa de polímero encapsulaba los microcristales se obtuvo por eliminación del núcleo estructurado. El comportamiento de liberación de las moléculas de pireno y diacetato de fluoresceína, a partir de la disolución de los moldes de núcleo, a través de la pared de la cápsula de polímero puede investigarse por utilización de espectroscopia de fluorescencia. Después de centrifugación de las suspensiones de microcristales recubiertos que se expusieron a etanol, se evaluó el sobrenadante respecto a pireno o fluoresceína a intervalos de tiempo regulares.

Los experimentos de control para los microcristales de PYR dispersados con DDDAB y los dispersados con PSS revelaron características de liberación rápida: después de la adición de etanol, el núcleo de pireno se eliminaba dentro de aproximadamente 30 min tanto para los cristales recubiertos con agente tensioactivo como con los recubiertos con PSS. Los poros en las microcápsulas de polímero producidas en este trabajo son suficientemente grandes para permitir la eliminación de las moléculas de núcleo de peso molecular bajo (véase más adelante). Este descubrimiento es concordante con informes previos acerca de las características de permeabilidad de las multicapas de polielectrólito: las multicapas de polímero son permeables a las sustancias de peso molecular bajo^{14,15}, pero esencialmente impermeables a los polímeros mayores que 4000 Da.^{27} Experimentos ulteriores demostraron que la tasa de eliminación era, según se encontró, dependiente de la primera capa adsorbida, del número de capas de polielectrólito, y de la relación de etanol a agua en el medio disolvente. Merece la pena indicar que hasta cinco pares de capas de polielectrólitos se ensamblaron sobre los moldes de microcristales en el presente trabajo. Se observaron tasas de liberación más lentas con el número de capas de polielectrólitos creciente. El ensamblaje de envolturas más gruesas (v.g. con más capas de polielectrólitos) puede tener el efecto de suavizar la superficie externa y al mismo tiempo reducir la porosidad. El ensamblaje capa-a-capa de policationes y polianiones exhibe una auto-regularidad notable: para las películas desarrolladas sobre sustratos escasamente cargados y/o groseramente planos, se ha observado en muchos casos crecimiento irregular para un pequeño número de capas iniciales, alcanzándose un crecimiento regular después de la deposición de varios pares de capas.^{30-32}

Las micrografías CLSM de los microcristales de FDA recubiertos con polímero después de ser expuestos a solución en etanol y dispersados en agua se presentan en la Figura 4. La imagen de transmisión (a) muestra cierto número de las entidades coloidales huecas producidas. No existe evidencia alguna de un núcleo sólido, lo que indica disolución y eliminación del microcristal. El etanol solubiliza el material de núcleo y las moléculas individuales pueden difundirse luego a través de las paredes semi-permeables de las cápsulas de polímero. Las estructuras observadas en la imagen de transmisión se deben al contraste de las capas de polímero remanentes desde el recubrimiento original de los microcristales, lo que indica la formación con éxito de cápsulas de polímero huecas. Los resultados anteriores son concordantes con la observación visual de que las suspensiones de microcristales recubiertas con polímero perdían su turbidez después de la adición de etanol. Se proporciona una evidencia adicional por la imagen de fluorescencia CLSM correspondiente (b), que muestra la fluorescencia de las capas de PAH-FITC. Las diferentes morfologías observadas son debidas a la diversidad de las formas de los microcristales. Algunas indentaciones en las paredes de las cápsulas de polímero pueden ser debidas también al proceso de centrifugación utilizado en su preparación. No había evidencia alguna de ruptura de las paredes de las cápsulas como resultado de la eliminación fácil del núcleo de los microcristales por tratamiento con etanol. Los resultados de la CLSM demuestran que pueden depositarse multicapas de polímero sobre moldes de microcristales pre-cargados, y que el núcleo puede eliminarse por tratamiento con un disolvente apropiado, dejando atrás cápsulas de polímero huecas.

Las cápsulas de polielectrólito producidas se caracterizaron ulteriormente utilizando TEM y AFM. Imágenes TEM de cápsulas de polímero huecas secadas al aire obtenidas a partir de microcristales de PYR dispersados con SDS recubiertos con once capas de polímero, y cristales de FDA dispersados con PSS y recubiertos adicionalmente con nueve capas de polielectrólito, se ilustran en la Figura 5 (a y b, respectivamente). Los recuadros son aumentos mayores. Los pliegues y arrugas observados en las cápsulas de polímero son resultado de la evaporación del contenido acuoso por secado con aire.^{10} La notable diferencia entre la Figura 5a y la Figura 5b es la porosidad de la pared. Las cápsulas producidas cuando los microcristales se dispersaron con agente tensioactivo (cargado positiva o negativamente) exhibían una textura mucho más suave y una menor porosidad que las producidas a partir de microcristales dispersados con PSS. Se observaron poros de diámetro comprendido entre 20 nm y más de 100 nm para cápsulas huecas derivadas de microcristales dispersados con PSS recubiertos de polímero. En contraste, era difícil discernir los poros en las cápsulas de polímero texturizadas muy lisas cuando se utilizó agente tensioactivo para dispersar los microcristales, lo que sugería un tamaño medio de poro menor que aproximadamente 5-10 nm. Estos descubrimientos se confirmaron por medidas de AFM. Las diferencias observadas pueden adscribirse a la conformación inicial de la primera capa adsorbida (en términos de homogeneidad) utilizada para dispersar los cristales. Sin embargo, lo que antecede ilustra la importancia de la primera capa adsorbida en la determinación de la porosidad de las cápsulas de polímero huecas con paredes delgadas resultantes. Es de esperar que el control sobre el tamaño de poro en tales microcápsulas huecas tenga implicaciones importantes en la tecnología, dado que permite la regulación de la tasa de liberación de los materiales encapsulados.

El examen de las alturas aparentes de las cápsulas de polímero secadas al aire por utilización de AFM en modalidad de sangrado producía valores de aproximadamente 25-30 nm para cápsulas constituidas por 10 capas de polielectrólito. Esta dimensión es equivalente al doble del espesor de pared de la cápsula de polímero; por tanto, el espesor medio por capa de polielectrólito está comprendido entre 1 y 1,5 nm, un valor que está próximo a los obtenidos para multicapas de polímero sobre otros moldes coloidales.^{10}

Una característica atractiva del proceso empleado para la formación de cápsulas de polímero huecas es la fácil eliminación del núcleo moldeado de microcristales. Métodos previos han implicado soluciones extremadamente ácidas (pH = 1)^{10,15} o básicas (>12)^{10,17}. Claramente, el uso de tales condiciones está limitado, en particular cuando están presentes compuestos biológicos durante el proceso de eliminación del núcleo. Adicionalmente, pueden evitarse los cambios indeseables en la composición y propiedades de las cápsulas de polímero huecas que ocurren con condiciones tan severas^{29}.

En suma, el enfoque coloide-molde basado en microcristales orgánicos desprovistos de carga complementa otras estrategias que han estado desarrollando los autores de la presente invención para encapsulación de diversos materiales. Este método es particularmente relevante e importante debido a su potencial para encapsular una extensa gama de fármacos cristalinos desprovistos de carga. Adicionalmente, su versatilidad y el control que permite sobre el espesor de pared y la composición de las multicapas de polímero permiten la creación de un sistema de liberación de fármacos con una tasa de liberación adaptable. Los sistemas preparados proporcionan sistemas modelo excelentes de liberación de fármacos para estudiar diversos parámetros concernientes a la tasa de liberación de compuestos encapsulados de peso molecular bajo. Una estrategia interesante consiste en controlar la tasa de liberación por variación del espesor y la composición de las paredes de las cápsulas de polímero.

La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos y figuras siguientes.

La Figura 1 es una representación esquemática de una realización preferida del proceso utilizado para encapsular microcristales orgánicos y crear estructuras de polímero huecas. Los microcristales desprovistos de carga se recubren por el auto-ensamblaje de moléculas de agente tensioactivo cargadas (paso 1), lo que les hace dispersables en agua y por consiguiente dóciles al recubrimiento subsiguiente con multicapas de polielectrólito (paso 2). Cada capa de polielectrólito depositada tiene una carga opuesta a la ya adsorbida. Se forman estructuras multicapa de polímero huecas por exposición directa de los microcristales encapsulados a etanol, lo cual causa su solubilización y eliminación (paso 3). Algunos agentes tensioactivos pueden unirse electrostáticamente a las estructuras de polímero
huecas.

El paso 1 de Fig. 1 puede modificarse, por supuesto, v.g. por el uso de un polielectrólito (v.g. PSS) o fosfolípidos para recubrir y pre-cargar los microcristales.

La Figura 2 muestra el potencial \zeta de microcristales de PYR y FDA estabilizados con compuestos anfifílicos en función del número de capas de polielectrólito: (a) PYR-DDDAB (cuadrados llenos), FDA-SDS (círculos vacíos); (b) FDA-DPPC (círculos llenos); FDA-PSS (cuadrados vacíos). El número de capa = 1 corresponde a los microcristales recubiertos con la sustancia anfifílica. Se observa inversión de la carga superficial con la adsorción de cada capa de polielectrólito. A partir de la capa número 2 en adelante, los valores positivos corresponden a la adsorción de PAH, y los valores negativos a la deposición de PSS. Las capas 9 y 11 para el sistema PYR-DDDAB y la capa 10 para el sistema FDA-PSS corresponden a la adsorción de PAH-FITC.

La Figura 3 muestra las micrografías de transmisión y fluorescencia (recuadro) CLSM de un cristal de FDA dispersado por adsorción de PSS y recubierto ulteriormente con nueve capas de polielectrólito, siendo la capa más externa PAH-FITC, [(PAH/PSS)_{4}/PAH-FITC].

La Figura 4 muestra las micrografías CLSM de transmisión (a) y de fluorescencia (b) de cápsulas de polímero huecas derivadas de microcristales de FDA recubiertos de polímero. Las estructuras de polímero se obtuvieron a partir de microcristales de FDA recubiertos con polímero. Los microcristales de FDA se dispersaron por adsorción de PSS y se recubrieron adicionalmente con nueve capas de polielectrólito, siendo la capa más externa PAH-FITC, [(PAH/PSS)_{4}/
PAH-FITC]. Los recuadros muestran una estructura de polímero hueca individual, obtenida después de disolución a partir del núcleo de FDA dispersado con SDS y recubierto con once capas de polielectrólito [(PAH/PSS)_{4}/PAH-FITC]. Las barras de escala en los recuadros corresponden a 2 \mum.

La Figura 5 muestra las imágenes TEM de cápsulas de polímero huecas secadas al aire, obtenidas después de eliminación del núcleo microcristalino moldeado con etanol. (a) El núcleo de PYR se dispersó con SDS y se recubrió con once capas de polielectrólito. (b) Se dispersó FDA por medio de PSS y se recubrió con nueve capas de polielectrólito. Las cápsulas de polímero se aplastaban como resultado del secado, apreciándose pliegues y arrugas. Se observó una diferencia significativa en porosidad para las cápsulas de polímero, dependiendo de si se utilizó agente tensioactivo (a, menos poroso) o PSS (b, más poroso) para dispersar los microcristales. Se observaron diferencias similares para ambos sistemas, PYR y FDA. Las barras de escala en los recuadros corresponden a 200 nm.

Ejemplos 1. Materiales

El pireno (PYR) se adquirió de Aldrich y el diacetato de fluoresceína (FDA) de Sigma. El policatión, poli(hidrocloruro de alilamina) (PAH), de PM 15.000, y el polianión, poli(4-estirenosulfonato de sodio) (PSS), de PM 70.000, se obtuvieron de Aldrich. Los agentes tensioactivos cargados positivamente bromuro de didodecildimetilamonio (DDDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HDTAB), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DDTMAB), bromuro de miristiltrimetilamonio (MTMAB), y el agente tensioactivo cargado negativamente dodecilsulfato de sodio (SDS) eran todos ellos de Aldrich. La dipalmitoil-DL-á-fosfatidilcolina (DPPC) se adquirió de Sigma. Todos los reactivos se utilizaron tal como se recibieron, excepto el PSS, que se dializó contra agua Milli-Q (punto de corte por PM 14.000) y se liofilizó antes de su utilización.

2. Preparación de PAH marcado con isotiocianato de fluoresceína (PAH-FITC)

Una solución acuosa de 500 mg de PAH en 6 ml de agua se ajusta a un pH de 8,1 con NaOH 1M. Se añade una solución acuosa de 4 mg de FITC en 500 \mul de DMSO a la solución de PAH (la relación de conjugación FITC/PAH-monómero es 1/500). La mezcla se incuba durante una noche a la temperatura ambiente y se filtra luego con un filtro de 3 \mum. El FITC no conjugado se separa del conjugado por filtración en gel a través de una columna PD-10 (Pharmacia). Las fracciones finales se dializan contra agua desionizada durante una noche utilizando un marco Slide-A-Lizer de 0,5-2 ml (Pierce) con un punto de corte por peso molecular de 3500 Dalton. Rendimiento: 25 ml de solución PAH-FITC con una concentración de 9 mg/ml.

3. Ensamblaje de multicapas de polielectrólito sobre microcristales orgánicos

El ensamblaje capa-a-capa de polielectrólitos sobre microcristales de FDA o PYR se llevó a cabo como sigue: Se mezclaron en primer lugar concienzudamente 50 mg de partículas de núcleo (FDA o PYR) molidas finamente con 12 ml de solución al 0,2-0,4% en peso del agente dispersante (agente tensioactivo iónico, lípido o copolímero cargado). El diacetato de fluoresceína o el pireno cristalinos pueden molerse hasta partículas finas utilizando v.g. un almirez. Sin embargo, pueden utilizarse también procedimientos avanzados de molienda con bolas.

Los cristales se suspendieron por tratamiento inmediato de los mismos con ultrasonidos durante 5 min. La suspensión se dejó en reposo durante 30 min, permitiendo con ello que los cristales mayores se sedimentaran, o se centrifugó suavemente. El sobrenadante blanco turbio se extrajo luego, se centrifugó y se lavó varias veces, resuspendiéndose finalmente en agua.

Las partículas microcristalinas resultantes se recubrieron luego capa-a-capa con PSS y PAH.^{18} Cuando se utilizaron agentes tensioactivos cargados positivamente o DPPC como la primera capa, se añadió en primer lugar 1 ml de solución de PSS (5 mg ml^{-1}, que contenía NaCl 0,5M). Se añadió primeramente la solución de PAH (1 ml de 5 mg ml^{-1}, que contenía NaCl 0,5M) cuando se adsorbieron sobre los microcristales PSS o SDS. Después de un tiempo de adsorción de 15 min para la adsorción de PAH o PSS, la suspensión se centrifugó a 3000 g durante 5 min. Se separó luego el sobrenadante y se aplicaron 3 ciclos de lavado con agua y redispersión para eliminar el exceso de poli-electrólito no adsorbido en solución. Se depositaron de manera idéntica capas subsiguientes de polielectrólito, que llevaban una carga opuesta a la ya adsorbida sobre la partícula, para producir microcristales recubiertos con multicapas. En algunos casos, se aplicó el polielectrólito marcado fluorescentemente, PAH-FITC (como una solución de 2 mg ml^{-1} que contenía NaCl 0,5M) para formar una capa fluorescente sobre la superficie de los microcristales.

El orden de recubrimiento con polielectrólitos y los potenciales \zeta resultantes se dan en las Tablas 1 y 2 y se representan también gráficamente en la Fig. 2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Potencial \zeta de los cristales de diacetato de fluoresceína en función del número de capas y del polielectrólito

Molde: diacetato de fluoresceína
Capa No.	Recubrimiento	Potencial \zeta
1	Detergente SDS	-50 mV
2	PAH	+42,9 mV
3	PSS	-37,7 mV
4	PAH	+51,5 mV
5	PSS	-42,2 mV
6	PAH-FTTC	+48,2 mV

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TABLA 2 Potencial \zeta de los cristales de pireno en función del número de capas y del polielectrólito

Molde: Pireno
Capa No.	Recubrimiento	Potencial \zeta
1	SDS detergente	-68,5 mV
2	PAH	+59 mV
3	PSS	-46,5 mV
4	PAH	+54,3 mV
5	PSS	-37,2 mV
6	PAH-FTTC	+47,3 mV

El tratamiento de los cristales con la solución de SDS conduce a una carga superficial negativa alta (véase capa No. 1 en las Tablas 1 y 2). Las suspensiones resultantes son sumamente estables e idealmente adecuadas como moldes para el recubrimiento con polielectrólitos. La carga alternante del potencial \zeta indica el recubrimiento con éxito. El recubrimiento se confirmó también por la aplicación de PAH conjugado con FITC, y su visualización por microscopía fluorescente.

La morfología de los cristales no se altera durante los procedimientos de recubrimiento. El rendimiento de sustancia recubierta se reduce solamente por una pequeña pérdida en el paso de centrifugación/lavado, y puede optimizarse a tasas altas, próximas a 98%.

Además del experimento previamente descrito, se realizaron también con éxito encapsulaciones en condiciones diferentes (concentración de agente tensioactivo 0,2-0,4% en peso, tratamiento por ultrasonidos 5-30 min, concentraciones menores de polielectrólito).

4. Experimentos de Liberación

Se dosificaron 12 ml de disolvente (etanol o mezclas etanol/agua) en tubos de 15 ml. Se añadió luego rápidamente a cada tubo 0,1 ml de la suspensión de microcristales recubierta del Ejemplo 3 y, después de tiempos definidos (2, 5, 10 min, etc.) se centrifugó la suspensión a 3000 g durante 5 min. Se apartó una porción del sobrenadante y se ensayó en cuanto a la presencia de PYR o FDA por fluorescencia. En el caso de PYR, la intensidad de emisión de fluorescencia del sobrenadante se midió directamente utilizando una longitud de onda de excitación (\lambda_{ex}) de 350 nm y observando la emisión (\lambda_{em}) a 373 nm. La FDA se hidrolizaba primeramente en fluoresceína por tratamiento con esterasa o base diluida antes de la medida de la fluorescencia (\lambda_{ex} = 492 nm, \lambda_{em} = 513 nm). Como experimentos de control, se estudiaron también las características de liberación de partículas sin recubrimiento, como se ha reseñado anteriormente.

5. Producción de cápsulas de polímero huecas por eliminación del molde hidrófobo con disolventes orgánicos

El núcleo microcristalino se eliminó por exposición de 0,2 ml de la suspensión de partículas recubiertas del Ejemplo 3 a 1 ml de etanol (o cloroformo), dejando luego 30 min para disolución del núcleo. Las cápsulas de polímero huecas resultantes se centrifugaron después a 10.000 g durante 10 min, se expusieron nuevamente a etanol, se lavaron dos veces más con agua, y finalmente se resuspendieron en agua.

Las envolturas resuspendidas se analizaron por microscopía de fluorescencia confocal, demostrando que se obtienen por el método envolturas huecas. La forma de las envolturas es irregular debido a la forma inicial del molde. Ésta puede optimizarse o adaptarse por elección adecuada del molde.

6. Instrumentos y Métodos de Ensayo Microelectroforesis

La movilidad microelectroforética de los microcristales orgánicos recubiertos se midió con un instrumento Malvern Zetasizer 4 tomando el promedio de 5 medidas al nivel estacionario. Las movilidades (\mu) se convirtieron en los potenciales electroforéticos (\zeta) utilizando la relación de Smoluchowski \zeta = \mu \eta/\varepsilon, donde \eta y \varepsilon son la viscosidad y permitividad de la solución, respectivamente.^{25} Todas las medidas se realizaron sobre microcristales redispersados en agua pura equilibrada al aire (pH \sim 5,6).

Microscopía de Barrido Láser Confocal (CLSM)

Las imágenes CLSM se tomaron en un microscopio Aristoplan de barrido láser confocal de Leika con un objetivo de inmersión en aceite 40x.

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

Las medidas TEM se realizaron en un microscopio Philips CM12 que operaba a 120 kV. Las muestras para TEM se prepararon por deposición de una suspensión diluida de partículas sobre una rejilla de cobre recubierta con carbono. La mezcla se dejó secar al aire durante 1 minuto, después de lo cual se eliminó el exceso de solución por secado con papel de filtro.

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)

Las imágenes AFM se obtuvieron utilizando un Nanoscopio IIIa AFM (Digital Instruments, CA) en modalidad de sangrado. Las muestras se prepararon por aplicación de una gota de una solución diluida sobre una superficie de mica recién exfoliada, dejando 1 min para secado al aire, y secando luego con papel secante el exceso de solución.

Espectroscopia de Fluorescencia

Los espectros de fluorescencia en estado estacionario se registraron utilizando un espectrómetro Spex Fluorolog 1680. Tanto la anchura de banda de extinción como la de emisión se ajustaron a 1,0 nm. Todas las medidas se realizaron sobre soluciones equilibradas al aire a 25ºC.

Referencias y Notas

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2.

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3.

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Rilling, P.; Walter, T.; Pommersheim, R.; Vogt, W. J. Membrane Sci. \underline{1997}, 129, 283.

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9.

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For a review, see: Caruso, F. Chem. Eur. J. \underline{2000}, 6, 413.

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12.

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20.

Se añadieron 50 mg de núcleo cristalino finamente molido (PYR o FDA, Aldrich) a 12 ml de una solución acuosa de agente tensioactivo (SDS o DDDAB, Aldrich) al 0,2% en peso. Los cristales se suspendieron por tratamiento inmediato de los mismos con ultrasonidos durante 5 min. La suspensión se dejó en reposo durante 30 min, permitiendo con ello que los cristales mayores se sedimentaran. El sobrenadante blanco turbio se extrajo luego, se centrifugó y se lavó varias veces, resuspendiéndose finalmente en agua.

21.

Se prepararon multicapas PAH/PSS sobre los moldes utilizando el procedimiento descrito previamente.^{5} En forma resumida, los microcristales recubiertos con agente tensioactivo se expusieron a 1 ml de una solución con 5 mg ml^{-1} de polielectrólito (PSS, de PM 70.000, o PAH, de PM 15.000 (Aldrich), dependiendo del agente tensioactivo utilizado) que contenía NaCl 0,5M. Después de un tiempo de adsorción de 15 min, se eliminó el exceso de polielectrólito por ciclos repetidos de centrifugación y lavado. Se depositaron de manera idéntica capas de polielectrólito subsiguientes.

22.

F. Caruso, H. Lichtenfeld, E. Donath y H. Möhwald, Macromolecules, \underline{1999}, 32, 2317.

23.

D. Myers, Surfactant Science and Technology, Segunda Edición, VCH, Weinheim, \underline{1992}.

24.

Los microcristales no podían dispersarse fácilmente por simple exposición de los mismos a polielectrólito (v.g. PAH, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDADMAC) y copolímeros de DADMAC y acrilamida). La única excepción era PSS, que contiene un grupo aromático que es posiblemente responsable de su comportamiento anfifílico en el recubrimiento de los microcristales y estabilización de los mismos.

25.

Hunter, R.J., Foundations of Colloid Science, Clarendon Press, Oxford, \underline{1989}, Vol. II, pág. 807.

26.

Myers, D., Surfactant Science and Technology, Segunda Edición, VCH, Weinheim, \underline{1992}.

27.

Sukhorukov, G.B.; Brumen, M.; Donath, E.; Möhwald, H. J. Phys. Chem. B\underline{1999}, 103, 6434.

28.

Moya, S; Sukhorukov, G.B.; Auch, M.; Donath, E.; Möhwald, H., J. Colloid Interface Sci.\underline{1999}, 216, 297.

29.

Moya, S.; Dähne, L.; Voigt, A.; Donath, E.; Möhwald, H. Propuesto para publicación.

30.

Decher, G.; Schmitt, J., Prog. Colloid Polym. Sci.\underline{1992}, 89, 160.

31.

Lvov, Y.; Decher, G.; Möhwald, H., Langmuir\underline{1993}, 9, 481.

32.

Caruso, F.; Niikura, K., Furlong, D.N.; Okahata, Y. Langmuir\underline{1997}, 13, 3422.

Claims (40)

1. Un proceso para la encapsulación de un material constituido por partículas sólidas cristalinas desprovistas de carga que comprende

(a)

tratar el material cristalino constituido por partículas con una sustancia anfifílica y

(b)

recubrir subsiguientemente el material con una capa de un polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de polielectrólitos con cargas opuestas.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el material sólido tiene una baja solubilidad en agua, es insoluble en agua o no es dispersable en agua.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el material sólido es un material orgánico, un material biológico o un material inorgánico.

4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el material sólido se selecciona del grupo constituido por fármacos, vitaminas, nutrientes, hormonas, factores de crecimiento, plaguicidas, antibióticos y conservantes o mezclas de los mismos.

5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el material sólido se selecciona del grupo constituido por cristales simples.

6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el material sólido es un material sintético o un material aislado de fuentes naturales o un material aislado modificado químicamente.

7. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la sustancia anfifílica se selecciona de agentes tensioactivos iónicos, fosfolípidos y polielectrólitos anfifílicos.

8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual se utiliza un agente tensioactivo catiónico o aniónico o una combinación de agentes tensioactivos aniónicos y catiónicos.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el agente tensioactivo catiónico se selecciona de la clase de sustancias que comprende sales de amonio cuaternario ((R_{4}N^{+})X^{1}), especialmente bromuro de didodecildimetilamonio (DDDAB), bromuros de alquiltrimetilamonio, especialmente bromuro de dodeciltrimetilamonio o bromuro de palmitiltrimetilamonio o sales de N-alquil-piridinio o aminas terciarias ((R_{3}NH^{+})X^{-}), especialmente carbamato de colesteril-3\beta-N-(dimetil-aminoetilo) o aminas secundarias ((R_{2}NH_{2}^{+})X^{-}) o aminas primarias ((RNH_{3}^{+})X^{-}) o sus mezclas.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el agente tensioactivo aniónico se selecciona de la clase de sustancias constituida por alquilsulfonatos (R-SO_{3}M), especialmente dodecilsulfato, laurilsulfato u olefinsulfonatos (R-SO_{3}M), especialmente n-dodecil-bencenosulfonato de sodio o alquilsulfatos R-OSO_{3}M o ácidos grasos (R-COOM), especialmente sal de sodio del ácido dodecanoico o ácidos fosfóricos o ácidos cólicos o compuestos orgánicos fluorados, especialmente 3-[2-(perfluoroalquil)etiltio]propionato de litio o mezclas de los mismos.

11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la sustancia anfifílica es una sustancia polímera que proporciona grupos cargados y lados hidrófobos, especialmente poli(estirenosulfonato) (PSS), o es un copolímero de bloques, especialmente poli(etiletileno-bloque-ácido estirenosulfónico (PEE-PSS).

12. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polielectrólito se selecciona de polímeros orgánicos, polímeros biológicos, polímeros inorgánicos y mezclas de los mismos.

13. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polielectrólito es un polímero lineal o no lineal, o mezclas de los mismos.

14. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polielectrólito es un copolímero de bloques.

15. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polielectrólito se reticula después de su estructuración.

16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual la reticulación se proporciona entre los polímeros de una sola capa o/y entre las capas.

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el polielectrólito es un polímero orgánico seleccionado de polímeros bio-degradables, especialmente ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA), poliamidas, poli-2-hidroxi-butirato (PHB), policaprolactona (PCL), poli ácido(láctico-co-glicólico) (PLGA), polímeros fluorescentes marcados, polímeros conductores, polímeros de cristal líquido, polímeros fotoconductores, polímeros fotocrómicos y sus copolímeros y/o mezclas de los mismos.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el polielectrólito es un bio-polímero seleccionado de poli(amino-ácidos), especialmente péptidos, proteínas de capa S, poli-carbohidratos, especialmente dextrina, pectina, alginato, glucógeno, amilosa, quitina, condroitina, ácido hialurónico, polinucleótidos, especialmente DNA, RNA, oligonucleótidos o/y bio-polímeros modificados, especialmente carboximetil-celulosa, carboximetil-dextrano o lignin-sulfonatos.

19. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual el polielectrólito es un polímero inorgánico seleccionado de polisilanos, polisilanoles, polifosfazenos, polisulfazenos, polisulfuros y polifosfatos y mezclas de los mismos.

20. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual se depositan nanopartículas y/o biomoléculas cargadas como materiales de cápsula.

21. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el material en exceso de sustancias anfifílicas, polielectrólitos y/o nanopartículas así como biomoléculas, que no han contribuido a la formación del recubrimiento, se separan después de cada paso de recubrimiento.

22. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el material encapsulado forma una suspensión estable en una fase acuosa.

23. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el espesor y la permeabilidad de la cápsula para la liberación controlada del material encapsulado está controlado por al menos una de las características siguientes: la naturaleza del agente tensioactivo, el número de capas, la naturaleza del polielectrólito, la naturaleza de las nanopartículas o biomoléculas, un paso de reticulación adicional, las condiciones en ensamblaje del polielectrólito y la naturaleza del recubrimiento anfifílico.

24. Un proceso para la preparación de cápsulas que tienen una envoltura de polielectrólitos, que comprende los pasos:

(a)

tratar un material de molde sólido cristalino desprovisto de carga con una sustancia anfifílica,

(b)

recubrir subsiguientemente el material sólido cristalino con una capa de un polielectrólito cargado o con una multicapa que comprende capas alternantes de polielectrólitos con cargas opuestas y

(c)

eliminar el núcleo de material de molde sólido cristalino desprovisto de carga.

25. El proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual se producen cápsulas huecas a partir del material encapsulado por eliminación del material de núcleo mediante exposición a un disolvente orgánico en el cual el material es soluble o un disolvente ácido o alcalino en el cual el material forma una sal soluble, o mezclas de los mismos.

26. El proceso de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, en el cual las cápsulas huecas se redispersan en un disolvente acuoso o un disolvente orgánico o mezclas de los mismos.

27. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el cual se incorpora ulteriormente un fármaco en las cápsulas.

28. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tamaño de los poros dentro de la pared de la cápsula está controlado por la clase de sustancia anfifílica utilizada y/o las condiciones de recubrimiento de la sustancia anfifílica.

29. Una cápsula de polielectrólito, que puede obtenerse por un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

30. Una cápsula de acuerdo con la reivindicación 29, que comprende un núcleo constituido por material sólido desprovisto de carga.

31. Una cápsula de acuerdo con la reivindicación 29, que no contiene residuo detectable alguno del material de núcleo sólido.

32. Una cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, que tiene una forma final que está determinada por el material de núcleo sólido desprovisto de carga.

33. Una cápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, que comprende un fármaco.

34. Uso de cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, para la encapsulación de fármacos.

35. Uso de cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 como cámaras de reacción.

36. Uso de cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en aplicaciones de sensores, de análisis de superficies o de tecnología de la información.

37. Uso de cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en farmacia, medicina, tecnología de alimentos, biotecnología, cosmética o en aplicaciones de impresión.

38. Uso de cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 como sistemas de liberación lenta, direccionada o controlada.

39. Una composición que contiene cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en forma seca.

40. Una composición que comprende cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, que tiene una distribución de tamaños monodispersa.