ES2236690T3 - Espectrofluorimetro en estado solido y su metodo de utilizacion. - Google Patents
Espectrofluorimetro en estado solido y su metodo de utilizacion.Info
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Abstract
UN ESPECTROFLUOROMETRO QUE HACE USO DE UN TUBO DE DESTELLOS DE XENON DISPARABLE (14) QUE SE ACCIONA CON UNA MEMORIA DE CAPACITOR Y SE CONTROLA DESDE UN MICROCONTROLADOR A TRAVES DE INSTRUCCIONES DE PROGRAMA. EL ESPECTROFLUOROMETRO UTILIZA UNA CELULA OPTICA (12) QUE TIENE UNA CONFIGURACION SEGUN LA CUAL EL TUBO DE DESTELLOS DE XENON (14) QUEDA COLOCADO SEGUN UNA RELACION SEPARADA DE UN PAR DE DETECTORES DE SEÑALES (17, 19) Y UN DETECTOR DE REFERENCIA (21). LA RELACION SEPARADA DE ESTOS COMPONENTES PERMITE EL USO DE DETECTORES DE ESTADO SOLIDO (17, 19, 21) CON EL ESPECTROFLUOROMETRO. MEDIANTE LA UTILIZACION DEL MICROCONTROLADOR LOS AMPLIFICADORES DE LOS DETECTORES QUEDAN AISLADOS ELECTRICAMENTE DURANTE TODOS LOS PERIODOS EXCEPTO DURANTE EL CICLO DE DESTELLOS DE LA PORCION DE DETECCION REAL. EL ESPECTROFLUOROMETRO PUEDE REALIZAR UNA DETECCION DE ESTADO SOLIDO QUE SE PUEDE UTILIZAR DE FORMA EFECTIVA PARA LA DETECCION DE LONGITUDES DE ONDA VISIBLES MEDIANTE LA UTILIZACION DE LOS FLUOROFOROS DISPONIBLES EN EL MERCADO.
Description
Espectrofluorímetro en estado sólido y su método
de utilización.
La presente invención se refiere a un
espectrofluorímetro.
Los espectrofluorímetros son utilizados para
detectar la presencia de ciertas estructuras moleculares en un
espécimen. Específicamente cuando está presente fluoróforo en una
solución, algunas estructuras moleculares interactúan con el
fluoróforo de manera que la luz de una longitud de onda concreta
sea absorbida y que la luz de otra longitud de onda sea emitida.
Medir la luz emitida en la longitud de onda del fluoróforo, debida
a la presencia de la estructura molecular de interés en el
espécimen, permite determinar la cantidad de la estructura
molecular de interés presente en el espécimen.
Por ejemplo, el bromuro de etidio (EtBr) se
utiliza como fluoróforo para detectar la presencia de ácidos
nucleicos intercalándolo en la cadena de ácido nucleico. La luz
monocromática que tiene una longitud de onda de 520 nanometros se
irradia en la solución que contiene el espécimen de interés.
Midiendo la cantidad de luz emitida a 600 nanometros de longitud de
onda se puede determinar la concentración de ácido nucleico en el
espécimen.
Aunque la espectrofluorimetría se conoce desde
hace muchos años, los espectrofluorímetros son típicamente de tamaño
muy grande, son delicados y excepcionalmente caros. Existen varias
razones para eso.
Una de esas razones es que los
espectrofluorímetros necesitan típicamente una fuente que genere una
gran cantidad de luz equilibrada. Una fuente de luz tal produce una
gran cantidad de calor, lo cual hace que la distancia entre la
fuente de luz y el espécimen sea bastante grande. Además, estas
fuentes de luz también requieren típicamente limitadores mecánicos y
complicados mecanismos de direccionamiento de luz. Se hace
referencia, por ejemplo, a las patentes U.S. números 3.832.555 y
4.531.834.
Además, para aplicaciones comerciales, es
necesario que los detectores del espectrofluorímetro sean adaptables
para su utilización con tintas de fluoróforo comerciales. También,
el nivel de ruido eléctrico producido por la fuente de luz es
normalmente alto en los espectrofluorímetros. Estos factores han
apartado el uso de detectores en estado sólido de los
espectrofluorímetros. En el pasado, Hofer Scientific ofrecía un
espectrofluorímetro con un detector en estado sólido, pero este
espectrofluorímetro sólo podía medir tintas Hoeschst porque
detectaba en ondas infrarrojas. Por lo tanto, este
espectrofluorímetro no podía usarse para detectar longitudes de
onda en el espectro visible. Además, el espécimen quedaba destruido
cuando se utilizaban tintas Hoeschst.
En WO-A-8907757
se describe una estructura óptica para un espectrofluorímetro. Esta
estructura óptica está formada en un cuerpo de material provisto de
aperturas que reciben y sujetan los elementos ópticos de manera
organizada, proporcionando dicho cuerpo una apertura para espécimen
para recibir el espécimen y mantenerlo en una posición especifica,
una apertura para fuente de radiación para recibir una fuente de
radiación y mantener la fuente en una relación específica respecto
de la apertura, una apertura para camino de radiación de entrada
para proporcionar un camino específico entre la apertura de fuente
de radiación y la apertura de espécimen y una apertura de detector
para definir una apertura de camino de radiación de salida para
proporcionar un camino de radiación de salida desde la apertura de
espécimen hasta los detectores de radiación.
Un método de análisis fluorométrico instantáneo
de un espécimen anticipaba la producción de una primera y específica
radiación fluorescente en una última posición incluyendo la función
de un análisis "en blanco", y el comportamiento similar de un
análisis de espécimen. La función de un análisis "en blanco"
incluye mantener en la citada posición de ensayo un fluoróforo de
referencia para producir una segunda radiación de excitación de
referencia característica; examinar los resultados de una primera
radiación del ensayo en posición del detector respectivo a una
secunda dosis de radiación; y determinar de las respuestas relativas
de los detectores un valor "en blanco" para la proporción de
intensidades de radiación de la posición de ensayo en ausencia de un
espécimen. Una función similar de análisis de espécimen incluye:
soportar en la citada posición de ensayo con presencia mantenida de
fluoróforo de referencia un espécimen, que se espera que produzca la
citada primera radiación específica tras la excitación con radiación
incidente; examinar la radiación en la posición de ensayo con los
citados detectores respectivos, y determinar, con la respuesta
relativa de los detectores un valor espécimen para la relación de
intensidades de radiación en la posición de ensayo en presencia de
un espécimen. El método también incluye el análisis de los datos
"en blanco" y los datos de espécimen para analizar el
espécimen con respecto a la calibración del aparato.
Según la presente invención se desarrolla un
detector para ser utilizado en un espectrofluorímetro que detecta la
presencia de luz emitida por un espécimen en una solución con
fluoróforo, que comprende: un detector que se utiliza en un
espectrofluorímetro que detecta la presencia de luz emitida por un
espécimen en una solución con fluoróforo que comprende medios para
radiar un pulso de luz sobre el citado espécimen, comprendiendo
dichos medios de radiación una fuente de luz instantánea disparada
Xenón: medios para detectar la luz emitida por el citado espécimen
en solución con el citado fluoróforo, incluyendo dichos medios de
detección un primer fotodiodo que emite una señal luminosa
proporcional a la luz emitida; y una célula óptica incorporada en
una cavidad hecha de un medio absorbente de luz, proporcionando
dicha cavidad de célula óptica un primer hueco mecanizado en el
medio absorbente de luz que contiene una zona de apoyo del
espécimen, una segunda cavidad mecanizada en el medio absorbente de
luz que comprende una fuente emisora de luz dispuesta entre los
citados medios de radiación y la citada zona de soporte del
espécimen, y una tercera cavidad mecanizada en el medio absorbente
de luz que contiene una fuente emisora de luz dispuesta entre la
citada zona de soporte del espécimen y el citado primer fotodiodo
caracterizado porque el citado detector comprende además un
fotodiodo de referencia que produce un rayo luminoso que sirve de
referencia y que es proporcional al citado pulso luminoso emitido;
proporcionando además la citada cavidad de célula óptica una cuarta
cavidad mecanizada en el medio de absorción de luz permitiendo la
transmisión directa de luz generada desde la fuente instantánea de
luz Xenón hasta el detector de referencia por el camino de luz de
referencia de la citada cavidad de célula óptica dispuesta entre los
citados medios de radiación y el citado fotodiodo de
referencia.
referencia.
La presente invención proporciona también un
método de detección de cierta estructura molecular presente en un
espécimen utilizando un espectrofluorímetro que comprende las etapas
de: preparar una solución que contenga el citado espécimen y un
fluoróforo; cargar un condensador con energía eléctrica en respuesta
a una señal de carga de un ordenador; conectar eléctricamente el
citado condensador a medios emisores de fuente de luz en respuesta a
una señal instantánea de un ordenador, creando así un pulso luminoso
de longitud de onda en el espectro visible, comprendiendo los
citados medios emisores de fuente de luz una fuente de luz
instantánea tipo Xenón; orientando el citado pulso de luz para
irradiar hacia la citada solución y crear así una luz emitida;
orientando la citada luz emitida para irradiar en un primer
fotodiodo detector en estado sólido y producir así una señal de luz
emitida proporcional a la citada luz emitida; determinando de esta
forma la cantidad de estructura molecular contenida en dicho
espécimen utilizando la citada señal de luz emitida y el citado
fluoróforo, estando estas etapas llevadas a cabo utilizando un
cavidad mecanizada de célula óptica hecha de un medio absorbedor de
luz, proporcionando la citada cavidad de célula óptica un primer
pasaje mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene una
zona de posicionamiento del espécimen para la citada solución, un
segundo pasaje mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene
un camino receptor de luz dispuesto entre los citados medios de
radiación y la citada zona de posicionamiento del espécimen, y un
tercer pasaje mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene
un pasaje de emisión de luz dispuesto entre la citada zona de
posicionamiento del espécimen y el citado primer
fotodiodo;
fotodiodo;
caracterizado por la orientación del
citado pulso de luz para irradiar también en un detector fotodiodo
de referencia en estado sólido que produce una señal de luz de
referencia proporcional al citado pulso de luz de los citados medios
de radiación al citado detector de referencia por transmisión
directa de la luz generada desde la citada fuente de luz al citado
detector de referencia, proporcionando además la citada cavidad de
célula óptica una cuarta abertura mecanizada en el medio absorbedor
de luz para permitir la citada transmisión directa de la luz
generada por la fuente de luz instantánea de Xenón al detector de
referencia a lo largo de un camino de referencia de luz de la citada
cavidad de célula óptica dispuesta entre los citados medios de
radiación y el citado fotodiodo de referencia.
Es un objeto de la presente invención en
realizaciones preferidas proporcionar un espectrofluorímetro en
estado sólido que esté altamente protegido de ruidos
indeseables.
Es otro objeto de la presente invención en
realizaciones preferidas proporcionar un espectrofuorímetro en
estado sólido que utilice una fuente de luz instantánea.
Otro objeto del espectrofluorímetro de la
presente invención en realizaciones preferidas es proporcionar un
espectrofluorímetro en estado sólido que requiera una fuente de luz
de baja energía.
Es otro objeto de la presente invención en
realizaciones preferidas proporcionar un espectrofluorímetro en
estado sólido capaz de detectar luz del espectro visible utilizando
fluoróforos comerciales.
Aún otro objeto de la presente invención en
realizaciones preferidas es proporcionar un espectrofluorímetro de
tamaño pequeño y de fácil utilización.
Para obtener los aspectos de la invención citados
anteriormente, entre otros, la presente invención utiliza
ventajosamente un tubo Xenón instantáneo dirigido. Preferiblemente,
el citado tubo es operado por unos condensadores, estando conectado
eléctricamente en paralelo con una carga resistiva, que incrementa
la vida del tubo Xenón al tiempo que aumenta la duración del propio
pulso de luz.
Además, un espectrofluorímetro según la presente
invención en realizaciones preferidas utiliza una célula óptica
configurada de manera que el citado tubo de Xenón esté situado
cerca de un par de detectores de señal y de un detector de
referencia. La relación de estos componentes permite el uso de los
detectores en estado sólido en el espectrofluorímetro.
Un espectrofluorímetro según la presente
invención en realizaciones preferidas también proporciona
aislamiento eléctrico a los amplificadores del detector durante todo
el tiempo de utilización menos en el momento de pasaje de la luz.
Esto ayuda a aislar del ruido el sistema de detección del
espectrofluorímetro.
Además, un espectrofluorímetro en estado sólido
según la presente invención en realizaciones preferidas utiliza de
forma ventajosa un microcontrolador que permite controlar el tiempo
de emisión de la luz del xenón y el tiempo de aislamiento eléctrico
de los circuitos de amplificación del detector.
Así, un espectrofluorímetro en estado sólido
según realizaciones preferidas descritas anteriormente permite
ventajosamente la detección de estructuras moleculares en un
espécimen utilizando fluoróforos comerciales que son detectables en
el espectro visible.
Se describirán a continuación realizaciones de la
invención a modo de ejemplo, haciendo referencia a las figuras
adjuntas, en las que:
La Figura 1 muestra un diagrama de bloques de un
espectrofluorímetro según la presente invención;
La Figura 2 muestra una vista en perspectiva de
la célula óptica según la presente invención;
La Figura 3 muestra una vista lateral izquierda
de la célula óptica según la presente invención;
La Figura 4 muestra una vista lateral derecha de
la célula óptica según la presente invención;
La Figura 5 muestra una vista en corte
transversal según A-A de la célula óptica de la
figura 3;
La Figura 5A muestra una vista en corte
transversal de otra realización de una parte de la célula óptica de
la figura 3;
La Figura 6 muestra una vista en corte
transversal según B-B de la célula de la figura
3;
La Figura 7 muestra una vista corte transversal
según C-C de la célula de la figura 3;
La Figura 8 muestra una vista en corte
transversal según D-D de la célula de la figura
3;
La Figura 9 muestra la circuitería de
amplificación inicial utilizada con el detector de señal izquierda
del espectrofluorímetro según la invención;
La Figura 10 muestra la circuitería de
amplificación inicial utilizada con el detector de señal derecho del
espectrofluorímetro según la invención;
La Figura 11 muestra la circuitería de
amplificación inicial utilizada con el detector de señal de
referencia del espectrofluorímetro según la invención;
La Figura 12 muestra la circuitería de
acondicionamiento de señal del espectrofluorímetro según la
invención;
La Figura 13 muestra la circuitería de
alimentación utilizada en el espectrofluorímetro según la
invención;
La Figura 14 muestra la circuitería de interfaz
utilizada por el espectrofluorímetro según la invención;
La Figura 15 muestra la circuitería del
microcontrolador utilizada en el espectrofluorímetro según la
invención;
La Figura 16 muestra un gráfico de procesos que
resalta la operación del espectrofluorímetro, controlado con el
microcontrolador, según la presente invención;
La Figura 17 muestra varias opciones de
despliegue posibles para el usuario que utiliza el
espectrofluorímetro según la presente invención; y
La Figura 18 muestra varios ejemplos tomados
durante un único ciclo de muestreo tomados utilizando el
espectrofluorímetro según la presente invención.
La Figura 1 muestra un diagrama en bloques de un
espectrofluorímetro 10 según la presente invención. Los componentes
principales del espectrofluorímetro 10 incluyen una célula óptica
12, con un Xenón instantáneo 14, un circuito detector de señal
izquierda 16, un detector de señal izquierda 17, un circuito
detector de señal derecha 18, un detector de señal derecha 19, un
circuito detector de señal de referencia 20, y un detector de señal
de referencia 21. El tubo Xenón instantáneo opera con la carga
almacenada en un condensador de almacenaje situado en un circuito de
suministro 22, que también hace funcionar un ventilador 24.
Un circuito de acondicionamiento de señal 26
recibe las señales detectadas desde el circuito detector de señal
izquierda 16, del detector de señal derecha 18, y del circuito
detector de referencia 20. El circuito de acondicionamiento de señal
26 amplifica, modula y suma las señales recibidas, y transmite la
información a un circuito microcontrolador 28. Un circuito de
interfaz 30 transmite las señales entre el circuito de suministro 22
y el circuito de microcontrolador 28 y el circuito de
acondicionamiento de señal 26 como se describirá más adelante.
Los resultados de análisis obtenidos del
funcionamiento del espectrofluorímetro 10 se muestran en una
pantalla 32, que puede ser una pantalla LED que muestra los valores
numéricos o un monitor que proporciona un gráfico. Un teclado 34
permite introducir el modo de operación, las condiciones iniciales,
y varias otras características descritas más adelante. Se pueden
utilizar teclas de una función única o bien teclas arriba / abajo
multifunción que permiten varias entradas utilizando la misma tecla
arriba / abajo que se presiona repetidamente y que se programan por
ordenador.
La figura 2 muestra la célula óptica 12. La
célula óptica 12 contiene una cavidad mecanizada 36, hecha
preferiblemente a base de resina negra fenólica o de aluminio negro
anodizado. La cavidad de célula 36 tiene dimensiones exteriores
aproximadas de 4 centímetros cúbicos y está montada en una placa de
aluminio anodizado 38 que protege el tubo xenón de la cavidad de
célula 36, excepto como se describirá más adelante. La cavidad de
célula 36 tiene también una abertura que permite la inserción de una
cubeta 40, donde estará el espécimen de interés en la solución de
fluoróforo. La cavidad de célula 36 también contiene aberturas para
el detector de señal izquierda 17, el detector de señal derecha 19,
el detector de señal de referencia 21 y el medio absorbedor de luz
42.
Un sujetador 44 mantiene el xenón 14 en su
posición y está hecho de Corian, un compuesto hidróxido aluminio /
acrílico. Cada uno de los detectores 17, 19 y 21 dispuestos en la
célula óptica 12 está conectado eléctricamente al circuito detector
de señal izquierda 16, al circuito detector de señal derecha 18, y
al circuito detector de referencia 20, respectivamente. Cada
circuito detector 16, 18, y 20 está montado directamente sobre los
detectores dispuestos en la célula óptica 12. Esta colocación
minimiza la distancia eléctrica que las señales detectadas han de
recorrer antes de la amplificación inicial, como se describirá más
adelante.
Las figuras 3-8 muestran las
varias vistas en sección transversal de la célula óptica 12. Como se
muestra en la Figura 3, las líneas discontinuas muestran aberturas
formadas en la célula óptica 12 para la inserción de los detectores
17, 19 y 21, así como de la cubeta 40. Además, existen pasajes de
luz en estas aberturas como caminos requeridos la transmisión
óptica.
Como se muestra más claramente en la figura 5,
que es la sección transversal A-A de la figura 3, la
abertura entre el xenón 14 y la cubeta 40 es una ranura rectangular
46 con una anchura de 3 mm y 7 mm de alto.
Una alternativa a la abertura rectangular 46 es
una pluralidad de aproximadamente 10 agujeros 47 de un diámetro de
aproximadamente 0,7 mm dispuesto en una posición rectangular 46,
como se muestra en la figura 5A. Aunque sea mas difícil de mecanizar
esta configuración en agujeros 47, esta disposición permite mejorar
el enfoque de la radiación de luz desde el xenón 14 hasta el
espécimen en la cubeta 40.
La distancia entre el xenón 14 y la cubeta 40 es
de 10 mm. Existe un filtro de interferencia 54 en el camino óptico,
dispuesto entre el xenón 14 y la cubeta 40.
Una abertura 48 permite la transmisión directa de
la luz generada desde el xenón al detector de referencia 21. La
abertura 48 tiene un diámetro de 0,35 mm y durante aproximadamente
tres cuartos de los 35 mm de distancia entre el xenón 14 y el
detector de referencia 20 mantiene este diámetro. El pequeño
diámetro de la abertura 48 respecto de la abertura 46 permite
reducir la cantidad de luz transmitida desde el xenón 14 hasta el
detector 21. Esto permite ecualizar la cantidad de luz que realmente
alcanza cada uno de los detectores 17, 19 y 21.
La figura 7 muestra más claramente el medio
absorbedor de luz 42 dispuesto directamente detrás de la cubeta 40.
Esto ayuda a asegurar que la luz del tubo xenón que pasa a través de
la cubeta 40 no se refleje y, en consecuencia, sea detectada por los
detectores 17 y 19. Esto ayuda a asegurar que sólo la luz
fluorescente sea detectada por los detectores 17 y 19. La figura 3
también muestra el diámetro mayor de la abertura 48 en cercanía del
detector de referencia 21, lo cual es necesario para posicionar
convenientemente el detector de referencia 21. La Figura 3 muestra
también un filtro de referencia con densidad neutra 52 colocado
entre el Xenón y el detector 21, directamente frente al detector 21.
Esto también ayuda a ecualizar la cantidad de luz que realmente
llega a los detectores 17, 19 y 21.
Las figuras 7 y 8 son útiles para describir las
características ópticas de la célula óptica 12. Haciendo referencia
a la Figura 7, se puede ver que la cubeta 40, que contiene el
espécimen para analizar en solución, está situada a medio camino
entre los detectores 17 y 19. La cubeta 40 tiene preferiblemente un
diámetro exterior de aproximadamente 10 mm, aunque se puede utilizar
una cubeta de diferente tamaño y diámetro. La distancia preferida
entre el diámetro exterior de la cubeta 40 y cada detector 17 y 19,
es de 10 mm.
Frente a cada detector 17 y 19 hay unos filtros
de banda emisora 56 y 58. Estos filtros eliminan las longitudes de
ondas por debajo de la longitud de onda de interés. Si se utiliza
bromuro de etidio (EtBr) como fluoróforo, cada filtro 56 será
preferiblemente un filtro OR570 que permite el paso de luz por
encima de 590nm al tiempo que virtualmente bloquee toda luz por
debajo de 590nm. Cada filtro de emisión de alta banda 56 y 58 está
sujeto sólidamente con aros 60 y 62. Cada aro 60 y 62 se comprime en
la inserción de los detectores 17 y 19 en la célula óptica 12.
La figura 8 muestra el camino 64 que la luz del
xenón 14 ha de recorrer para incidir correctamente en el espécimen
en solución contenido en la cubeta 40. Los caminos 66 y 68 muestran
el camino de la luz fluorescente detectada por los detectores 17 y
19, respectivamente, que forman un ángulo de 90º con el camino
64.
La figura 9 muestra un circuito detector de señal
izquierda 16 representado como diagrama en bloques en la Figura 1 y
como un circuito en la Figura 2. El detector 17 es preferiblemente
un fotodiodo Siemens BPX61 y, al ser un fotodiodo extremadamente
sensible, se usa con un voltaje muy estable.
Un amplificador operacional 80 proporciona la
amplificación inicial de la señal detectada por el detector 17. Los
condensadores y resistencias mostrados en la Figura 9 proporcionan
buena representación de la onda apropiada.
La Figura 10 muestra el circuito detector de
señal derecha 18 que es idéntico al sensor izquierdo 16 descrito
haciendo referencia a la Figura 9. El detector 19 también es un
fotodiodo Siemens BPX61 y se utiliza con voltaje muy estable. Hay
que asegurarse de que los detectores 17 y 19 tengan características
eléctricas complementarias.
La figura 11 muestra el circuito de detector de
referencia 20, que también tiene un fotodiodo Siemens BPX61 como el
detector 21 y que también se utiliza con voltaje muy estable. La
señal detectada se amplifica mediante un amplificador operacional
84. La circuitería de reducción de ruido y de forma de onda asociada
con el amplificador operacional 84 es idéntica a la circuitería
utilizada con los detectores 17 y 19 para obtener unos mejores
resulta-
dos.
dos.
La figura 11 también muestra que una vez que se
han amplificado las señales de los detectores 17 19,
respectivamente, así como la señal amplificada del detector 21,
todas se llevan al circuito acondicionador de señal 26, mostrado en
la Figura 12.
Cada señal detectada pasa por un canal 86 durante
un periodo de tiempo determinado por una señal "no apto"
descrita más adelante. Las señales detectadas y ya amplificadas del
detector de señal izquierda 17 y del detector de señal derecha 19 se
suman en un nodo 88 y luego se amplifican dos veces mediante los
amplificadores operacionales 90 y 92. Una vez más, los resistores y
capacitores asociados ayudan a la diminución del ruido y al
establecimiento de una onda de forma apropiada.
La señal del detector de referencia viene
amplificada dos veces por los amplificadores operacionales 94 y 96.
Idéntica circuitería de disminución de ruido y estabilización de
onda está asociada con los amplificadores operacionales 94 y 96. La
señal de salida detectada 100 del amplificador operacional 92 y la
señal de salida de referencia 102 del amplificador operacional 96
van cada una al circuito del microcontrolador 28 ilustrado en la
figura 15 como se describirá más adelante.
La figura 13 muestra el suministro de corriente
22 empleado para alimentar el xenón 14 y el ventilador 24 mostrado
en la Figura 1. El suministro 22 alimenta el xenón 14 utilizando la
carga acumulada en el condensador 104. Una resistencia 106 se
utiliza para aumentar la duración del pulso del tubo xenón y también
para prolongar la vida del tubo xenón reduciendo el voltaje en los
terminales del propio xenón. En funcionamiento, el condensador 104
se dispara a 240 voltios debido a la presencia de la resistencia 106
y obteniéndose un pulso de 600nm a 30.000 vatios cuando vienen
integrados en el tiempo del pulso.
Una señal carga, va a un circuito de carga de
condensador 108, y empieza a cargar el condensador 104. Se ha de
hacer notar que se emplean un conjunto de diodos Zener con un
voltaje Zener de 15 voltios para estabilizar las cargas del
condensador 104.
El condensador 104, cuando está completamente
cargado, manda una señal VCAP a la línea 110, entrando esta señal en
el circuito microcontrolador 28, y utilizándose como se describirá
más adelante.
Cuando el condensador 104 está completamente
cargado, el xenón está entonces preparado para su encendido. Al
recibir la señal de encendido de la línea 112, un rectificador
controlado por silicio 114 empieza a conducir. Esto hace que un
transformador de transmisión 116 encienda el xenón 14. Así, la carga
almacenada en el condensador 104 alimenta el xenón 14, que ilumina
el espécimen en solución en la cubeta 40 y el detector de referencia
21, mostrado en la Figura 2.
También se muestra en la Figura 13 un dispositivo
de protección de sobrevoltaje, específicamente varistor 118, que
elimina las sobretensiones en el voltaje empleado para cargar el
condensador 104.
El circuito de alimentación 22 obtiene cc
utilizando una configuración escalada de potencia. La corriente ca
de entrada de una línea 120 da unos 24 voltios positivos cc en un
nodo 122 y unos 24 voltios negativos cc en un nodo 124 utilizando
diodos y condensadores de filtrado. Los 12 voltios positivos cc se
obtienen empleando un regulador de voltaje positivo de tres
terminales 126 de modo que se obtengan los 12 voltios positivos cc
en una línea 128. Estos 12 voltios positivos cc entran entonces en
dos reguladores 130 y 132 cc diferentes de tres terminales y baja
corriente, 5 voltios positivos, para obtener un voltaje VCC cc y los
5 voltios positivos cc. Igualmente, los 24 voltios negativos del
nodo 124 entran a su vez en un regulador 134 cc de tres terminales y
baja corriente, 5 voltios negativos, para obtener los 5 voltios
negativos cc.
La Figura 14 muestra un circuito de interfaz 30
entre el circuito de fuente de alimentación 22 mostrado en la
Figura 13 y el circuito microcontrolador 28 mostrado en la Figura
15. El VCAP y la señal ca pasan directamente del circuito de
alimentación 22 al circuito microcontrolador 28. Sin embargo, la
señal de disparo recibida por el circuito microcontrolador 28 se
amplifica previamente utilizando el amplificador 140. La señal de
disparo va entonces al circuito de fuente de alimentación 22 para
disparar el xenón 14 como se describió anteriormente. La señal de
carga entra desde el circuito microcontrolador 28 en un biestable
142. El biestable 142 mantiene en su salida una señal
correspondiente al nivel de la señal de carga hasta que el circuito
microcontrolador 28 genera otra señal de carga en respuesta a una
entrada de la señal VCAP previamente descrita. Esto asegura que el
condensador 104 de la Figura 13 está completamente cargado antes de
disparar el xenón 14.
Como también se muestra en la Figura 14, la señal
de disparo viene amplificada por el amplificador operacional 140, se
suele utilizar como señal de entrada de "no apto" para el
circuito acondicionador de señal 26. La señal de "no apto",
como se describió anteriormente, conecta efectivamente los
detectores 17, 19 y 21 al circuito acondicionador de señal 26, ya
que los interruptores 86 de la Figura 12 están normalmente en
posición abierta. Esto protege los detectores ópticos 17, 19 y 21 y
los circuitos amplificadores asociados 16, 18, 20 y 26 durante la
carga del condensador y en la inserción del cebado.
El xenón 14 da aproximadamente 30.000 vatios
cuando está integrado en el tiempo de duración del pulso empleado
para obtener las muestras de detector. Aunque el pulso de xenón
contiene varios picos y valles, el espectro de emisión de xenón
tienen una base sólida de emisiones todas basadas en el espectro de
luz visible. Activando el condensador 104 y utilizando la carga
resistiva proporcionada por la resistencia 106, es posible alimentar
y disparar el xenón 14 a la frecuencia requerida de al menos 0,5
hertzios.
La Figura 15 muestra el circuito microcontrolador
28, que incluye un microcontrolador 150, preferiblemente Motorola
68HC11. Aunque otros microcontroladores o microprocesadores que
utilicen memoria autónoma pueden, evidentemente, utilizarse como
alternativa. Las señales de entrada al microcontrolador 150 incluyen
una señal de "paso por cero" en la línea 152, derivada de la
corriente ca, como entrada en la base del transistor bipolar a
través de la resistencia mostrada. La señal de "paso por cero"
proporciona una referencia de cero utilizada por el microcontrolador
150 para sincronizar el disparo del xenón 14 con la línea de
frecuencia ca. Sincronizando el disparo del tubo xenón con relación
a la línea de frecuencia ca elimina efectivamente 60 hertzios de
ciclo de ruido, ya que tiene el mismo efecto sobre los circuitos
cada vez que el xenón 14 se dispara. También como entrada en el
microcontrolador 150 está la señal VCAP, así como la señal detectada
de referencia 102 y la señal detectada 100. Las líneas 156 de salida
del microcontrolador 150 conectan con la pantalla 32 mostrada en la
Figura 1. De forma similar, las líneas 158 se utilizan para unir el
teclado 34 al microcontrolador.
También en la salida del microcontrolador 150
está una señal de velocidad del ventilador que controla la velocidad
de un ventilador de múltiples velocidades, en función del calor
generado por el xenón 14 y su circuitería asociada. Este calor se
asume como generado por el microcontrolador 150 cuando se dispara el
xenón. Así, el ventilador de múltiples velocidades se puede poner a
una alta velocidad tras el disparo inicial y hasta que ha
transcurrido algún tiempo tras el último disparo.
El funcionamiento del espectrofluorímetro 10
según la invención utilizando la estructura preferida anteriormente
descrita, se elaborará más haciendo referencia al diagrama de flujo
de la Figura 16, que proporciona la secuencia necesaria para
programar el microcontrolador 150 según la secuencia de
instrucciones del programa, para cada etapa, que controlará el
funcionamiento del espectrofluorímetro según se describió antes y
según se describirá en adelante.
En la etapa de funcionamiento inicial 200, el
usuario fija el espectrofluorímetro 10 en el modo de funcionamiento
deseado, en el modo deseado de salida, así como con las
características deseadas de sensibilidad.
Con respecto al tipo de modo de funcionamiento,
se hace referencia a la Figura 17. Para calibrar correctamente el
epectrofluorímetro 10, se requiere probar primeramente la solución
en la que las muestras van ha ser puestas. Así se obtiene el nivel
cero. Presionando una de las teclas "inserte cero microgramos por
mililitro" se configura el espectrofluorímetro para hacer una
muestra en la solución, sin el espécimen, y utilizar los resultados
para las calibraciones descritas anteriormente. Los resultados de
este ensayo de nivel de cero se guardan en la memoria temporal del
microcontrolador 150 mostrado en la Figura 15.
Durante la calibración inicial del
espectrofluorímetro 10 según la invención, también es necesario un
segundo ensayo del segundo modo de funcionamiento. En este modo de
ensayo, una muestra pura de la estructura molecular buscada en el
espécimen de interés se diluye en la solución y luego se analiza.
Este ensayo se inicia cuando la tecla de entrada de "inserte 50
ug/ml std" se presiona como se muestra en la Figura 17. Cuando se
termina este ensayo, se obtiene un conjunto de resultados de
calibraciones puras. Los resultados de calibración pura y cero se
utilizan para establecer una relación lineal entre la concentración
de la estructura molecular de interés y la intensidad de la luz
fluorescente de detectada por los detectores 17 y 19.
Una vez hechos esos dos ensayos iniciales, es
posible ensayar el espécimen de interés para determinar la cantidad
de estructura molecular hay en el espécimen que tiene una cantidad
desconocida de la estructura molecular. Este tercer modo se inicia
cuando se presiona la tecla de entrada "entrada desconocida"
mostrada en la Figura 17.
Se debe tener en cuenta que los dos modos de
ensayo iniciales necesarios para inicializar convenientemente el
espectrofluorímetro 10 sólo se necesitan hacer una vez, hasta que se
deseen cambiar las condiciones iniciales. El controlador 150 guarda
estas calibraciones en memoria temporal y las utiliza durante cada
análisis subsecuente de un espécimen desconocido.
La segunda condición inicial fijada por el
usuario en la etapa 200 de la Figura 16 se refiere al tipo deseado
de salida por pantalla. Se hace referencia nuevamente la Figura 17.
Cada una de las tres columnas verticales es representativa del tipo
de salida deseada. La columna izquierda indica que se desea una
salida que dé la concentración de la estructura molecular de
interés. La columna del centro indica que se desea un modo de
cuenteo de células. La columna de la derecha indica que se desea un
valor de fluorescencia pura. Este valor puede utilizarse para
cálculos puros como se desee por el usuario.
La tercera condición inicial fijada en la etapa
200 se refiere a la sensibilidad de las detecciones subsecuentes que
tendrán lugar. En particular, debido a las variaciones en la
intensidad de salida de xenón, es preferible en ciertos casos
utilizar sólo valores detectados obtenidos cuando los pulsos de
xenón son extremadamente iguales en intensidad. Así, el usuario
fijará el valor "Y", que será un valor entero entre 0 y 10
correspondiente a la variación permitida del valor de fluorescencia
puro, descrito más adelante. Este valor "Y" representa la
variación aceptable en la intensidad del xenón, la turbidez de la
muestra, y los ruidos ópticos y electrónicos. También se fijará un
valor "X" que indica el número de pulsos xenón, y por lo tanto
detecciones, que el usuario desea tomar y de las que se hará la
media para obtener un valor medio de fluorescencia pura. Este valor
de fluorescencia se utilizará en cálculos posteriores para
determinar o la concentración de estructura molecular o el número de
células en este espécimen, dependiendo del modo de salida que haya
escogido el usuario.
Una vez que esas tres condiciones iniciales están
fijadas, al presionar la tecla de inicio 202 se inicia el
funcionamiento del espectrofluorímetro. Siguen después las
siguientes etapas.
En la etapa 204, el microcontrolador 150 de la
Figura 15 saca la señal de carga, que se utiliza por el circuito de
carga del condensador 108 mostrado en la Figura 13 para cargar el
condensador 104. La siguiente es la etapa 206, donde el
microcontrolador 150 espera la señal VCAP generada en la línea 110
que indica que el condensador 104 está completamente cargado. Una
vez que está completamente cargado, se genera otra señal de carga
por el microcontrolador 150 para cambiar el estado del biestable 142
de la Figura 14, terminando así la carga del condensador 104.
La etapa siguiente es la 208, esperando el
microcontrolador 150 para detectar la señal de paso por cero en la
línea 152, mostrado en la Figura 15. Una vez que se ha detectado la
señal de paso por cero por el microcontrolador 150, el
microcontrolador 150 genera la señal de disparo, que sale y se
utiliza para disparar el rectificador controlado por silicio 114
mostrado en la Figura 13. Esto origina el disparo del xenón 14 y el
inicio del pulso de luz. Antes disparar realmente el xenón, la señal
de disparo, llamada señal de no apto después de la amplificación
descrita previamente con referencia a la Figura 14, causa las
conexiones de cada uno de los circuitos detectores 16, 18 y 20,
mostrados en la Figuras 9, 10 y 11 respectivamente, al circuito de
acondicionamiento de señal 26 mostrado en la Figura 12. La conexión
de esos circuitos detectores permite tomar muestras de los valores
del detector para comenzar antes de los resultados de pulso, lo que
permite antes del pulso, lo que permite establecer una línea base y
utilizarla como se describirá en adelante.
Así, en la etapa 214 una señal analógica que
representa la señal fluorescente amplificada, sumada y
posteriormente amplificada de nuevo se mueve por la línea 800, y una
señal de referencia analógica desarrollada de forma similar se mueve
por la línea 102. El microcontrolador 150 coge estas señales
analógicas y obtiene 16 muestras de cada señal. Se ha determinado
que una ventana de 244 microsegundos con xenón como se describió
anteriormente proporciona los mejores resultados.
Una vez que esta ventana de microsegundos 244 ha
pasado, durante la cual ha tenido lugar el muestreo de tiempo, sigue
la etapa 216 y el microcontrolador 15 deja de generar la señal de
disparo. Esto desconecta efectivamente cada uno de los circuito de
detector 16, 18 y 20 del circuito de acondicionamiento de señal 26
mostrado en la Figura 1.
Sigue entonces la etapa 218 sigue en la cual el
microcontrolador 150 realiza una operación de sustracción y sustrae
los datos de la línea base de la señal y muestras de referencia para
obtener valores de una señal de muestra normalizada y valores
normalizados de referencia. Cada uno de estos valores de muestra
normalizada se media para obtener un solo valor de señal normalizada
y un solo valor de señal normalizada de referencia.
Una vez que se han determinado estos valores
normalizados, la etapa siguiente es la 220 y el último valor de
referencia normalizado se compara con los valores de referencia
normalizados obtenidos antes. Si la diferencia entre el último valor
de referencia normalizado y los valores de referencia normalizados
anteriores es mayor que el límite de sensibilidad "Y" descrito
en la etapa 200 anteriormente, entonces tanto los valores de
referencia normalizados como los valores de señal de referencia
normalizada asociados no se utilizan en la siguiente etapa de
adición 222. En la siguiente etapa, el número total, que será un
numero entero, de valores de referencia normalizados dentro de los
límites de sensibilidad "Y" se compara con el valor "X" de
condición inicial para determinar si existe la cantidad de valores
normalizados "X" requerida dentro de los límites
predeterminados de sensibilidad.
Si en la etapa 222 se determina que no hay
suficientes muestras, el microprocesador 150 vuelve a la etapa 204 y
carga el condensador 104 para que se puedan obtener más lecturas.
Evidentemente, se tendrá que repetir la etapa 204, como mínimo, un
número "X" de veces. Se ha determinado que X = 6, que
corresponde a 6 pulsos de xenón 14 proporciona un valor normalizado
final muy efectivo.
Si en la etapa 222 el número de valores
normalizados es el mismo que el valor X, cada uno de los valores de
señal normalizada se media para obtener un "valor", como se
denomina en la Tabla 1, abajo, en la etapa 224. En la etapa 226,
este valor final, de la misma manera, será expuesto en la pantalla
32, mostrada en la Figura 1. Son necesarias operaciones matemáticas
para convertir el valor final en bien un número de concentración de
células, dependiendo de las características de salida deseadas. Las
operaciones matemáticas necesarias para obtener una correcta salida
se detallan en la siguiente tabla 1:
Fluorescencia
- Puro = valor
Concentración
- Bajo = valor para 0 ug/ml
- Alto = valor para 50 ug/ml
\vskip1.000000\baselineskip
- m = 500/ alto-bajo
\vskip1.000000\baselineskip
- b = 0 - m * bajo
- Muestra en ng = m * valor + b
\vskip1.000000\baselineskip
- Original = muestra en ng /volumen de muestra
\vskip1.000000\baselineskip
Cuenteo de célula
- Bajo = valor para 0 ug/ml
- Alto = valor para 50 ug/ml
\vskip1.000000\baselineskip
- m = 500/ alto – bajo
\vskip1.000000\baselineskip
- b = 0 -m* bajo
- Muestra en ng = m * valor + b
- ADN desnaturalizado = Muestra en ng *2
Cuenteo de célula
- Total # de células = ADN desnaturalizado * 1000/ pg /ADN/ Célula
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la presente invención se dirige
preferiblemente a un espectrofluorímetro como el descrito hasta
aquí, con ciertas modificaciones muchas de las características
ventajosas pueden ser utilizadas también en un fotómetro. Haciendo
referencia a la Figura 3, se podría implementar un fotómetro con un
detector con espectro grande dispuesto en vez del medio de absorción
42. Este detector con espectro grande podría comprender varios
detectores individuales, cada uno capaz de detectar una frecuencia
de interés diferente. Cada una de las señales detectadas se
amplificaría e introduciría en el microcontrolador 150, que entonces
digitalizaría cada muestra, y después de las normalizaciones y
comparaciones de sensibilidad como se describió anteriormente para
cada longitud de onda de interés, sacaría y mostraría el valor para
cada longitud de onda detectada de interés. Como fotómetro, los
múltiples detectores individuales reemplazan a los detectores 17 y
19, descritos anteriormente con referencia al espectrofluorímetro
10.
Aunque se han descrito ejemplos de la invención
en relación a lo que se consideran las realizaciones más prácticas y
preferidas, se entiende que la invención no está limitada a la
realización descrita, pero, por el contrario, se pretende que quede
definida por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (36)
1. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro que detecta la presencia de luz emitida de un
espécimen en una solución con un fluoróforo, que comprende:
- -
- medios (14) para irradiar un pulso de luz al dicho espécimen, comprendiendo los citados medios (14) de radiación una fuente de luz instantánea xenón:
- -
- medios para detectar la luz emitida por el citado espécimen en solución con el citado fluoróforo, incluyendo los citados medios de detección:
- un primer fotodiodo (17) que produce una señal de luz emitida proporcional a la citada luz emitida; y
- una cavidad de célula óptica mecanizada (36) hecha de un medio absorbedor de luz, proporcionando la citada cavidad de célula óptica (36) un primer hueco mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene una zona de apoyo del espécimen (40), un segundo hueco mecanizado (46, 47) mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene un camino de recepción de luz (64) dispuesto entre los citados medios de radiación de luz (14) y la citada zona de apoyo del espécimen (40), y un tercer hueco mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene un camino de luz emitida (68) dispuesto entre la citada zona de apoyo del espécimen (40) y el citado primer fotodiodo (17):
- caracterizado porque
- el citado dispositivo detector comprende además un fotodiodo de referencia (21) que produce una señal luminosa de referencia proporcional al citado pulso irradiado de luz; y
- dicha cavidad de célula óptica (36) proporciona además un cuarto hueco mecanizado (48) en el medio absorbedor de luz para permitir la transmisión directa de la luz generada por la fuente de luz xenón hacia el detector de referencia (21) en el camino de luz de la citada cavidad de célula óptica (36) dispuesta entre los citados medios radiantes (14) y los citados fotodiodos de referencia (21).
2. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 1 que comprende también
medios (16) para amplificar la citada señal de luz emitida producida
por el citado primer fotodiodo(17), estando dispuestos los
citados medios de amplificación en un panel de circuito (16) que
está junto a la citada célula óptica (12).
3. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 2 en el que:
- los citados medios de detección incluyen un segundo fotodiodo (19) que produce una segunda señal de luz emitida proporcional a la citada luz emitida detectada por el citado segundo fotodiodo; y
- la citada cavidad de célula óptica (36) contiene un segundo camino de luz emitida (66) dispuesto entre la citada zona de apoyo del espécimen (40) y el citado segundo fotodiodo (19), estando el citado camino de luz emitida (68) y el citado segundo camino de luz emitida (66) sustancialmente a 90º con respecto al citado camino receptor de luz (64).
4. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 3 en el que los citados
medios de amplificación comprenden además:
- primeros medios (16) para amplificar la citada señal de luz emitida producida por el citado primer fotodiodo (17);
- segundos medios (18) para amplificar la citada señal de luz emitida por el citado segundo fotodiodo (19);
- terceros medios (20) para amplificar la citada señal de luz de referencia producida por el citado fotodiodo de referencia (21), estando dispuestos cada uno de los citados primeros, segundos y terceros medios de amplificación en el citado panel de circuito junto a citada célula óptica.
5. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 2 en el que la citada
cavidad de célula óptica (36) contiene varias superficies exteriores
de cara plana estando el citado panel de circuito (16) dispuesto
sobre la primera superficie plana exterior, siendo la citada primera
superficie plana exterior la más cercana en proximidad al citado
primer fotodiodo (17).
6. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 4 en el que la citada
cavidad de célula óptica (36) contiene varias superficies
exteriores de cara plana y en el que el citado panel de circuito
está separado en partes primera, segunda y tercera (16, 18, 20)
conteniendo, respectivamente, los citados medios de amplificación
primero, segundo y tercero (16, 18, 20) y en el que las citadas
partes primera, segunda y tercera de panel están sujetas a la
superficie exterior plana estando más cerca en proximidad al citado
fotodiodo (17), al citado segundo fotodiodo (19) y al citado
fotodiodo de referencia (21), respectivamente.
7. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 4 en el que los citados
medios de detección incluyen además:
- medios (88) para sumar las señales de luz emitida amplificadas primera y segunda de salida de los citados medios de amplificación primero y segundo para obtener una señal de salida sumada; y
- medios (90,92) para amplificar la citada señal de salida sumada.
8. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 4 en el que cada uno de
los citados medios de amplificación primero, segundo y tercero
incluye un amplificador operacional (80, 82, 84).
9. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según la reivindicación 8 en el que los citados
amplificadores operacionales de los citados medios de amplificación
primero y segundo (16, 18) tienen características eléctricas
sustancialmente idénticas.
10. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que la citada cavidad de célula óptica (36)
contiene varias superficies exteriores planas que define una forma
sustancialmente rectangular de dimensiones de aproximadamente 4
d^{3}.
11. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el citado camino de recepción de luz (64) mide
aproximadamente 10 mm y el citado camino de emisión de luz (68) mide
aproximadamente 10 mm.
12. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el citado camino de recepción de luz (48)
incluye una abertura rectangular (46) que tiene una anchura de 3 mm
y altura de 7 mm.
13. Dispositivo detector para usar en un
espectrofluorímetro según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el citado camino de referencia de luz (64) mide
más de 10 mm.
14. Dispositivo detector según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la citada zona de apoyo del
espécimen (40) de la citada cavidad de célula óptica tiene una
sección transversal circular para inserción de una cubeta (40) que
contiene el citado espécimen en solución, teniendo una sección
transversal circular.
15. Dispositivo detector según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que otra abertura de la citada
cavidad de célula óptica (36) está situada a lo largo de un camino
de luz emitida (50) detrás de la citada zona de apoyo del espécimen
(40).
16. Dispositivo detector según la reivindicación
15 en el que detrás de la citada otra abertura a lo largo del camino
de luz emitida detrás de la citada zona de apoyo del espécimen se
encuentra un material de absorción de luz (42).
17. Dispositivo detector según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que cada uno del citado primer
fotodiodo (17) y del citado fotodiodo de referencia (21) está
dispuesto en una configuración de luz fija en los citados huecos
mecanizados de la citada célula óptica (36) utilizando un aro (60,
62).
18. Dispositivo detector según la reivindicación
12 en el que el citado pulso de luz es aproximadamente un pulso de
600 nm de 30.000 Vatios.
19. Espectrofluorímetro con dispositivo según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que los citados
medios para producir un pulso de luz en el citado espécimen
incluyen:
- una fuente de luz instantánea (14);
- un condensador (104);
- medios (108) para cargar el citado condensador con energía eléctrica; y
- medios (114,116) para disparar la citada fuente de luz, conectando por tanto eléctricamente el citado condensador con la citada fuente de luz para descargar la citada energía eléctrica y originar un pulso de luz;
- los citados medios para detectar la luz emitida por el citado espécimen incluyendo medios (16, 18) para amplificar la citada señal de luz emitida; y
\newpage
- comprendiendo el citado espectrofluorímetro unos dispositivos de computadora (28) para controlar con una secuencia de instrucciones de programa:
- cargar y descargar el citado condensador (104) generando una señal de carga para originar la carga del citado condensador y generar una señal de disparo para hacer que los dispositivos de disparo descarguen el citado condensador y disparen por consiguiente la citada fuente de luz;
- introduciendo en los citados medios de computadora (28) la citada señal de luz emitida obtenida del citado fotodiodo (17) y amplificada por los citados medios de amplificación (80).
20. Espectrofluorímetro según la reivindicación
19, en el que los citados medios de computadora (28) son o un
microcontrolador o un microprocesador.
21. Espectrofluorímetro según las
reivindicaciones 19, 20 en el que la citada señal de luz emitida que
se introduce en los citados medios de computadora (28) está
normalizada utilizando la citada señal de línea de base y la citada
señal de luz de referencia.
22. Espectrofluorímetro según la reivindicación
21 en el que:
- los citados medios de computadora (28) controlan los citados medios de disparo inicializando las citadas señales de carga y disparo varias veces, generando por tanto una pluralidad de pulsos de luz que resultan en una pluralidad de señales de emisión de luz que entran en los citados medios de computadora y se normalizan por los citados medios de computadora.
23. Espectrofluorímetro según la reivindicación
22 en el que los citados medios de computadora (28) utilizan nuevas
instrucciones de programa para comparar la citada pluralidad de
señales de emisión de luz normalizadas con el rango de sensibilidad
límite de modo que las señales de emisión de luz normalizadas que
tengan un valor por debajo del rango de sensibilidad límite no se
utilicen luego para determinar la cantidad del citado espécimen en
la citada solución.
24. Espectrofluorímetro según la reivindicación
19 que comprende además medios (32) para configurar un modo de
visualización de salida.
25. Espectrofluorímetro según la reivindicación
24 en el que el citado modo de visualización de salida incluye o un
valor de fluorescencia pura, o de concentración o de cuenteo de
células.
26. Espectrofluorímetro según la reivindicación
23 en el que se debe obtener un número mínimo de señales de emisión
de luz normalizadas antes de que los citados medios de computadora
(28) determinen la citada cantidad del citado espécimen en la citada
solución.
27. Espectrofluorímetro según la reivindicación
26 en el que dicho número mínimo es 6.
28. Espectrofluorímetro según la reivindicación
25 en el que los citados medios de computadora (28) guardan en una
memoria (150) una señal de calibración de nivel cero obtenida de una
primera muestra de la citada solución sin el citado espécimen y una
señal de calibración de nivel puro obtenida de una segunda muestra
de la citada solución con una muestra pura del citado espécimen y
utiliza las citadas señales de calibración de nivel cero y puro para
determinar la citada concentración y el citado cuenteo de
células.
29. Espectrofluorímetro según la reivindicación
19 que incluye además medios para la detección de la referencia de
paso por cero (152) de una señal cíclica ca para generar una señal
de paso por cero y en el que los citados medios de computadora (28)
utilizan la citada señal de paso por cero para determinar cuándo
disparar la citada fuente de luz.
30. Espectrofluorímetro según la reivindicación
23 que incluye además medios para la detección de la referencia de
paso por cero (152) de una señal cíclica ca para generar una señal
de paso por cero y en el que los citados medios de computadora (28)
utilizan la citada señal de paso por cero para determinar cuándo
disparar la citada fuente de luz.
31. Espectrofluorímetro que tiene un dispositivo
detector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que
los citados medios para emitir pulsos de luz en el citado espécimen
incluyen:
- un fuente de luz instantánea
- un condensador (104)
- medios (108) para cargar el citado condensador con energía eléctrica; y
- medios (114, 116) para disparar la citada fuente de luz, conectando así eléctricamente el citado condensador a la citada fuente de luz para descargar la citada energía eléctrica y dar un pulso de luz;
- incluyendo los citados medios para detectar la luz emitida desde el citado espécimen medios (16, 18) para amplificar la citada señal de luz emitida;
- comprendiendo además el citado espectrofluorímetro:
- medios para detectar una referencia de paso por cero (152) de una señal ca cíclica para generar una señal de paso por cero; y
- medios de computadora (28) para controlar con una secuencia de un programa de instrucciones;
- cargar y descargar el citado condensador (104) generando una señal de carga que origine la carga del citado condensador y generar una señal de disparo tras introducir la citada señal de paso por cero para hacer que los citados medios de disparo descarguen el citado condensador y por lo tanto disparen la citada fuente de luz; e
- introducir en los citados medios de computadora (28) la citada señal de luz emitida obtenida del citado fotodiodo (17) y amplificada por los citados medios de amplificación.
32. Espectrofluorímetro según la reivindicación
31 en el que los citados medios de computadora (28) controlan con la
citada secuencia de programa de instrucciones la entrada a los
citados medios de computadora para disparar la citada fuente de
luz.
33. Espectrofluorímetro que tiene un dispositivo
detector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que
los citados medios para emitir pulsos de luz en el citado espécimen
incluyen:
- un fuente de luz instantánea (14);
- un condensador (104);
- medios (108) para cargar el citado condensador con energía eléctrica; y
- medios (114, 116) para disparar la citada fuente de luz, conectando así eléctricamente el citado condensador a la citada fuente de luz para descargar la citada energía eléctrica y dar un pulso de luz;
- incluyendo los citados medios para detectar la luz emitida desde el citado espécimen medios (16, 18) para amplificar las citadas señales de luz emitida; y
- comprendiendo además el citado espectrofluorímetro:
- medios de computadora (28) para controlar con una secuencia de un programa de instrucciones;
- cargar y descargar el citado condensador (104) generando una pluralidad de señales de carga que originen la carga del citado condensador y generen una pluralidad de señales de disparo para hacer que los citados medios de disparo descarguen el citado condensador y por lo tanto disparen la citada fuente de luz una pluralidad de veces y por lo tanto se obtenga dicha pluralidad de señales de luz emitida,
- introduciendo en los citados medios de computadora (28) la citada pluralidad de señales de luz emitida obtenidas del citado fotodiodo (17) y amplificadas por los citados medios de amplificación,
- comparando la citada pluralidad de señales de luz emitida con un rango límite de sensibilidad de modo que aquellas señales de luz emitida que tengan un valor por debajo del citado rango de sensibilidad límite no se utilizarán en adelante para determinar la cantidad de del citado espécimen en la citada solución.
34. Espectrofluorímetro según la reivindicación
33 en el que se debe obtener un número mínimo de señales de luz
emitida antes de que los citados medios de computadora (28)
determinen la citada cantidad del citado espécimen en la citada
solución.
35. Método para detectar una cierta estructura
molecular en un espécimen utilizando un espectrofluorímetro que
comprende las etapas de:
- preparar una solución que contenga el citado espécimen y un fluoróforo;
- cargar un condensador (104) con energía eléctrica en respuesta a una señal de carga de un ordenador (28);
- conectar eléctricamente el citado condensador (104) a unos medios emisores de fuente de luz (14) en respuesta a una señal instantánea de un ordenador (28), creando así un pulso luminoso de longitud de onda en el espectro visible, comprendiendo los citados medios emisores de fuente de luz (14) una fuente de luz instantánea tipo Xenón;
- orientando el citado pulso de luz para irradiar hacia la citada solución y crear así una luz emitida;
- orientando la citada luz emitida para irradiar en un primer fotodiodo detector en estado sólido (17) y producir así una señal de luz emitida proporcional a la citada luz emitida; y
- determinando la cantidad de la citada estructura molecular contenida en dicho espécimen utilizando la citada señal de luz emitida y el citado fluoróforo, estando estas etapas llevadas a cabo utilizando un cavidad mecanizada de célula óptica (36) hecha de un medio absorbedor de luz, proporcionando la citada cavidad de célula óptica (36) un primer pasaje mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene una zona de posicionamiento del espécimen (40) para la citada solución, un segundo pasaje mecanizado (46, 47) mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene un camino receptor de luz (64) dispuesto entre los citados medios de radiación (14) y la citada zona de posicionamiento del espécimen (40), y un tercer pasaje mecanizado en el medio absorbedor de luz que contiene un pasaje de emisión de luz (68) dispuesto entre la citada zona de posicionamiento del espécimen (40) y el citado primer fotodiodo (17);
- caracterizado por
- la orientación del citado pulso de luz para irradiar también en un detector fotodiodo de referencia en estado sólido (21) que produce una señal de luz de referencia proporcional al citado pulso de luz de los citados medios de radiación (14) haciendo pasar la citada luz irradiada por los citados medios de radiación (14) al citado detector de referencia (21), proporcionando además la citada cavidad de célula óptica (36) una cuarta abertura mecanizada (48) en el medio absorbedor de luz para permitir la citada transmisión directa de la luz generada por la fuente de luz instantánea de Xenón al detector de referencia (21) a lo largo de un camino de referencia de luz de la citada cavidad de célula óptica (36) dispuesta entre los citados medios de radiación (14) y el citado fotodiodo de referencia (21).
36. Método según la reivindicación 35 en el que
el citado paso de crear una solución utiliza bromuro de etidio como
el fluoróforo citado.
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