ES2236706T3 - Procedimiento para reducir las disfunciones de los sistemas inmunitario y hemostatico durante la circulacion extracorporal. - Google Patents

Abstract

USO DE ANTICUERPOS ANTI-C5 PARA DISMINUIR LA DISFUNCIONALIDAD DEL SISTEMA HEMOSTATICO E INMUNOLOGICO ASOCIADA A LOS PROCESOS DE CIRCULACION EXTRACORPOREA COMO ES EL CASO DE LOS PROCEDIMIENTOS DE BYPASS CARDIOPULMONAR. SE HA DESCUBIERTO QUE ESTOS ANTICUERPOS REDUCEN SIGNIFICATIVAMENTE LA ACTIVACION COMPLEMENTARIA, PLAQUETARIA, LEUCOCITARIA Y LA ADHESION PLAQUETOLEUCOCITARIA ASOCIADA A TALES PROCEDIMIENTOS.

Description

Procedimiento para reducir las disfunciones de los sistemas inmunitario y hemostático durante la circulación extracorporal.

El gobierno de los Estados Unidos ha pagado licencia por la presente invención y el derecho, en circunstacias limitadas, a exigir del titular de la patente que la licencie a otros en términos razonables tal como se indica en los términos de la subvención nº HL47193 otorgada por el National Institutes of Health, Bethesda, de Maryland.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la reducción de la disfunción del sistema inmunitario y hemostático en asociación con la circulación extracorporal. En particular, la presente invención se refiere a la utilización de anticuerpos específicos al componente C5 del complemento humano para producir la inhibición del brazo del complemento del sistema inmunitario para lograr dicha profilaxia terapéutica.

Antecedentes de la invención I. Circulación extracorporal

La circulación extracorporal (ECC) de la sangre es una tecnología médica importante que se utiliza en diversos procedimientos médicos que salvan vidas. Dichos procedimientos incluyen la hemodiálisis, plasmaféresis, plaquetaféresis, leucoaféresis, oxigenación mediante membrana extracorporal (ECMO), precipitación extracorporal de LDL inducida por heparina (HELP) y "bypass" cardiopulmonar (CPB). Como tal, la ECC es ampliamente utilizada en la práctica médica moderna.

Una de las utilizaciones más comunes de la ECC es en el CPB. En los Estados Unidos se realizan cada año más de 400.000 procesos de CPB [Rinn, A., N. Engl. J. Med. 312:119 (1985)]. La principal aplicación médica del CPB consiste en facilitar el injerto de "bypass" de arteria coronaria, pero también se utiliza durante otros tipos de cirugía a corazón abierto, que incluyen los procesos para corregir los defectos congénitos de corazón, la enfermedad de las válvulas cardíacas u otros defectos cardíacos. Debido a las mejoras en los procedimientos quirúrgicos y a la oxigenación extracorporal, en general la mortalidad de dicho proceso es baja (1% a 4%) [Allen C. M., Br. Med. J. 297:1485 (1988)].

Debido a que hasta la fecha las más extensas investigaciones sobre los efectos de la ECC sobre el sistema inmunitario y el hemostático han sido en el campo del CPB, la mayor parte de la discusión sobre los efectos concretos de la ECC en la presente solicitud está relacionada con el CPB. Sin embargo, no se pretende que dicha exposición sea o se interprete como limitativa de la presente invención al CPB.

II. Problemas médicos causados por la circulación extracorporal

Aunque la muerte durante los procesos de ECC es rara, diversas complicaciones, agudas y crónicas, durante y a continuación de dichos procesos generan problemas médicos que amenazan la vida y producen costes significativos al sistema sanitario. Muchas de tales complicaciones se han asociado a la activación del sistema inmunitario, teniendo un papel particularmente importante el brazo del complemento del sistema inmunitario en el desarrollo de inflamación, disfunción plaquetaria, trombocitopenia y otras complicaciones de la ECC. Los problemas hemostáticos durante y después de la ECC se pueden atribuir a una multiplicidad de factores, que incluyen la disfunción plaquetaria mediada por el complemento y pueden producir una trombosis excesiva y un exceso de hemorragia cuando las plaquetas primero se activan y a continuación se gastan, se hacen no funcionales y son eliminadas de la circulación. La gestión de la hemorragia anormal asociada al CPB necesita frecuentemente la reoperación y está frecuentemente asociada a la excesiva y ocasionalmente inapropiada administración de productos de la sangre, que ocasionalmente excede la disponibilidad de sangre. En algunos hospitales, la cirugía a corazón abierto da cuenta de más del 25% del total de los productos de la sangre utilizados [Woodman and Harker, Blood 76:1690 (1990)].

La activación de sistema del complemento tiene lugar cuando el plasma sanguíneo se pone en contacto con superficies extrañas durante la ECC. Los componentes activados del complemento pueden iniciar respuestas inflamatorias asociadas a vasoconstricción, perdidas capilares y activación de las plaquetas. Más adelante, bajo el encabezamiento "Antecedentes fisiológicos", se presenta una discusión de los diversos mecanismos fisiológicos implicados en las disfunciones hemostáticas e inmunitarias asociadas a la ECC.

III. Estrategias anteriores para la modulación del complemento durante la ECC

Las múltiples estrategias anteriormente utilizadas para controlar la activación del sistema del complemento y los problemas asociados originados durante la ECC ilustran la percepción de la importancia que tiene para la comunidad de investigadores médicos el logro de dichos objetivos. Dichas estrategias han incluido intentos para alterar los componentes mecánicos de los circuitos de CPB, que incluyen la utilización de oxigenadores de membrana (en contraposición a los de burbujas) y de circuitos de "bypass" recubiertos de heparina, así como también de diversas estrategias para la modulación farmacológica de la activación del complemento. Desgraciadamente, dichos esfuerzos no han eliminado los problemas con el sistema inmunitario y el hemostático asociados a la ECC y, en muchos casos, han sido de por sí responsables de efectos adversos adicionales.

Tal como se mencionó anteriormente, las superficies extrañas de los circuitos de ECC causan la activación del complemento. En el CPB, el oxigenador constituye la principal superficie que activa al complemento. Aunque algunos estudios han demostrado que los oxigenadores de membrana están asociados con una menor activación de ciertos componentes del complemento que los oxigenadores de burbujas, no existe un consenso sobre si causan en general menos activación del complemento durante el CPB. Más bien, la activación del complemento oscila entre dos diferentes oxigenadores individuales, ya sean de burbujas o de membrana [Videm, et al., Ann. Torac. Surg. 50:387 (1990)].

Recientemente, se ha demostrado que los circuitos de paso recubiertos de heparina reducen la activación del complemento durante el CPB. Desgraciadamente, esta estrategia solamente inhibe parcialmente la activación del complemento [(Nilsson, et al., Artif. Organs 14:46 (1990)). Ninguna de las estrategias farmacológicas anteriores para reducir específicamente la activación del complemento durante el CPB ha dado resultados satisfactorios.

Los fármacos de esteroides antiinflamatorios son agentes inmunosupresores que pueden modular la función del complemento. Aunque en algunos estudios se ha asociado la utilización de esteroides a un moderado descenso en la activación del complemento [Cavarocchi, et al., J. Torac. Cardiovasc. Surg., 91:252 (1986)] otros no han encontrado efectos beneficiosos (Miyamoto, et al., ASAIO J., 31:508 (1985)] y la supresión inmunitaria general producida por los esteroides y otros efectos secundarios asociados a la administración de esteroides, limitan todavía más su utilidad en el tratamiento de los pacientes de ECC.

Hasta la fecha, la mayoría de los esfuerzos para modular la activación del complemento durante la ECC se han concentraron sobre el componente C3 del complemento. Un estudio reciente valoró el potencial de una forma recombinante soluble del receptor tipo 1 del complemento (sCR1, designada BRL55730 por SmithKline Beecham) para reducir la activación del complemento asociada con el CPB [Gillinov, et al., Ann. Torac. Surg., 55:619 (1993)]. El sCR1 actúa bloqueando la conversión del componente C3 del complemento en los componentes activados C3a y C3b. Desgraciadamente, en dicho estudio no se evaluaron las mediciones clave de la activación del complemento y de las plaquetas y los resultados de los neutrófilos y otros puntos finales fisiológicos reportados fueron decepcionantes. Además, el sCR1 bloquea al C3 y, tal como se discute en detalle más adelante, el bloqueo de la activación del C3 interrumpe las acciones antimicrobianas más importantes del sistema del complemento, exponiendo a los pacientes a un creciente riesgo de infección.

Mientras que la ECC claramente causa la activación del complemento, también está asociada a otros problemas, que incluyen la generación de quinina, la pérdida de factores de coagulación por hemodiálisis, la fibrinolisis, la liberación de tromboxano A_{2} y la activación de las plaquetas y de los neutrófilos. Muchos de estos fenómenos son, por lo menos en parte, consecuencias secundarias de la activación del complemento. Las terapias actuales utilizadas para resolver estos fenómenos específicos han, hasta la fecha, dependido de agentes antifibrinolíticos y hemostáticos de amplia base, más bien inefectivos, ejemplos de los cuales son los siguientes.

La aprotinina, un inhibidor de las serina proteasas de base amplia (TRASYLOL, Bayer AG), ha sido estudiada recientemente debido sus efectos sobre la patología asociada con el CPB. La aprotinina inhibe a la kallikreina, un enzima proteolítico que atenúa la liberación de la elastasa de los neutrófilos, otra proteinasa, y reduce la producción del componente C3a del complemento. En ausencia de prueba directa alguna, se ha sugerido que la aprotinina también podría inhibir parcialmente la actividad C3 convertasa [Wachtfogel, et al., Blood, 69:329 (1989)]. Aunque, tal como se mencionó anteriormente, existe un consenso en la técnica sobre el hecho de que el C3a juega un papel fundamental en la generación de las disfunciones de los sistemas inmunitario y hemostático asociadas a la ECC, la activación de las plaquetas inducida por el CPB, que es (por lo menos en parte) secundaria a la activación del complemento, no esta afectada por la terapia con aprotinina (Bidstcrup, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 973:364 1989], y está claro que la disfunción plaquetaria está directamente implicada en la patogénesis de los problemas hemostáticos asociados a la ECC. Los efectos beneficiosos de la administración de aprotinina están probablemente relacionados a su capacidad para inhibir a la kallicreina, disminuyendo de esta forma la conversión proteolítica del plasminógeno en plasmina, una etapa clave en la coagulación de la sangre. La eficacia de la aprotinina para reducir la pérdida de sangre durante el CPB se ha demostrado cuando la aprotinina se administra mediante infusión continua. Sin embargo, la administración de bolos de aprotinina de dosis única, ha demostrado ser ineficaz.

El entusiasmo por la utilización de la aprotinina durante el CPB ha sido atenuado por recientes resultados clínicos que indican una creciente incidencia de los infartos de miocardio perioperatorios (16,9% contra 8,9% para el placebo) y por una incidencia significativa de la disfunción renal postoperatoria asociada a la administración de aprotinina durante el CPB [Cosgrove, et al., Ann. Thorac. Surg., 54:1031 (1992)]. En dicho estudio, los hallazgos postmorten en algunos pacientes que murieron después de operaciones coronarias electivas utilizando aprotinina, incluyeron oclusiones agudas de los injertos de vena así como también trombosis generalizada en los riñones, los vasos coronarios nativos y los vasos cerebrales. A pesar de los riesgos asociados con tales eventos clínicos perjudiciales, los beneficios de la modulación farmacéutica de tales efectos adversos asociados al CPB han conducido recientemente a la aprobación por la FDA de la aprotinina para el tratamiento de los pacientes que reciben CPB.

El análogo sintético de la lisina EACA (AMICAR, Lederle Laboratories) ha sido utilizado con frecuencia como agente antifibrinolítico durante el CPB. Aunque la EACA es efectiva para reducir la hemorragia en diversas circunstancias clínicas, su utilización en el CPB ha sido controvertida en lo que respecta a su potencial para reducir la pérdida de sangre postoperatoria [Copeland et al., Ann. Thorac. Surg., 47:88 (1989)]. Además, tanto la trombosis venosa como la trombosis arterial han complicado la terapia con EACA en una multiplicidad de ensayos clínicos y en general han desalentado su utilización clínica [Sonntag and Stein, J. Neurosurg., 40:480 (1974)]. También se ha utilizado el ácido tranexeámico por su efecto antifibrinolítico, pero también ha sido asociado con complicaciones trombóticas excesivas [Orum, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 105:78 (1993)].

Las propiedades hemostáticas relativamente inespecíficas del análogo sintético de la vasopresina, el acetato de desmopresina, la han convertido en un agente farmacéutico candidato para el tratamiento de las alteraciones hemodinámicas asociadas con el CPB. Sin embargo, los estudios de doble ciegos al azar en 150 pacientes consecutivos que recibieron CPB electivo no encontraron una diferencia significativa en la pérdida de sangre o en las necesidades post operatorias de transfusiones en los pacientes que recibieron desmopresina [Hackmann, et al., N. England. J. Med., 321:1437, 1989; Rocha, et al., Circulation, 77:1319 (1988)].

Klos et al., Chemical Abstracts describe los anticuerpos monoclonales contra C3a y C5a y su utilización en ELISAs. Además, se dan a conocer los niveles de los componentes del complemento en las muestras de plasma de los pacientes que están experimentando cirugía cardiopulmonar. Además, el documento US-A-4 686 100 describe la utilización de un anticuerpo anti-C5a en el tratamiento del síndrome de aflicción respiratoria adulta. Además, la utilización de anticuerpos en general para la purificación por afinidad de sangre extracorporal se apreció antes de la fecha de prioridad de la presente invención (WO 921730).

El documento WO 92 10096 da a conocer que la activación excesiva del complemento tiene un papel en la disfunción hemostática durante la circulación extracorporal de la sangre. Además, describe compuestos sintéticos capaces de reprimir el sistema inmunitario e inhibir el complemento. El documento US-A-5 135 916 describe la utilización de anticuerpos contra los componentes C7 y C9 del complemento para inhibir la respuesta inflamatoria mediada por el complemento y su utilización para incrementar la vida media de las plaquetas almacenadas.

Wurzner et al., Complement and Inflammation, 8:328-340 (1991), describe la utilización de anticuerpos monoclonales para inhibir la formación del complejo terminal de ataque a la membrana (MAC).

Sumario de la invención

En vista del estado de la técnica anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar la utilización de un anticuerpo anti-C5 para la preparación de un medicamento destinado a reducir la disfunción de los sistemas inmunitario y/o hemostático durante la circulación extracorporal de la sangre.

La utilización de la presente invención implica la utilización de anticuerpos contra el componente C5 del complemento como agentes farmacéuticos. Más particularmente, la invención proporciona la utilización de una preparación de anticuerpo anti-C5 que se une al C5 nativo del plasma, y de este modo bloquea la generación de los componentes activos del complemento C5a y C5b a partir de C5. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En ciertas formas de realización preferidas, la invención se utiliza durante el CPB. En otra forma de realización preferida adicional, la inhibición de la disfunción se logra mediante la administración de una dosis única de dicha preparación de anticuerpo anti-C5.

Tal como se muestra en los ejemplos presentados más adelante, los anticuerpos anti-C5 pueden bloquear completamente aspectos importantes de la actividad del complemento humano, a la vez que mantiene importantes funciones antiinfecciosas del sistema del complemento. En particular, los anticuerpos bloquean completamente la generación del ensamblaje citolítico de componentes activados del complemento conocido como el complejo de ataque a la membrana. Además, los anticuerpos inhiben la activación de las plaquetas, inhiben la activación de los leucocitos, inhiben las interacciones plaqueta-linfocito, específicamente, las interacciones plaqueta-monocito y plaqueta-célula polimorfonucleada e inhiben la eliminación de glicoproteínas clave de la superficie de las plaquetas durante la circulación extracorporal de la sangre.

Como consecuencia de dichas actividades, los anticuerpos ayudan a mantener el sistema inmunitario y hemostático en su estado normal durante la ECC.

En ciertas formas de realización, la presente invención comprende la utilización de un anticuerpo que se une específicamente al componente C5 del complemento en la preparación de un medicamento para reducir la disfunción de los sistemas inmunitario y/o hemostático durante la circulación extracorporal de la sangre mediante la reducción de por lo menos una de entre activación del complemento, activación de las plaquetas, activación de los leucocitos o la adhesión entre plaquetas y leucocitos resultantes del paso de la sangre circulante a través de un conducto con una superficie de lumen que comprende un material capaz de producir por lo menos una de entre activación del complemento, activación de los leucocitos, adhesión de plaquetas y leucocitos en la sangre de un paciente.

Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen parte de la memoria, ilustran ciertos aspectos de la invención, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la presente invención. Se debe entender, desde luego, que tanto las figuras como la descripción son solamente explicativas y no limitan la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1- Ensayo hemolítico que demuestra la inhibición por un anticuerpo monoclonal anti-C5 de la actividad del complemento asociada con la sangre humana circulada a través de un circuito extracorpóreo. Los ensayos se realizaron antes de la adición del anticuerpo o del inicio del circuito de CPB ("Pre Tx") utilizando sangre sin diluir ("undil") y sangre diluida ("dil") tal como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de sangre diluida a las que se ha añadido el anticuerpo ("Post Tx") se ensayaron en los tiempos indicados una vez iniciado el circuito de CPB.

Figura 2- Ensayo de los niveles del componente C3a del complemento que demuestra que la generación del componente C3a del complemento en la sangre humana entera circulada a través de un circuito extracorpóreo no es inhibida por la adición de un anticuerpo monoclonal anti-C5 a dicha sangre entera. Los ensayos se realizaron antes de la adición del anticuerpo o el inicio del circuito de CPB ("Pre Tx") utilizando sangre no diluida ("undil") y sangre diluida ("dil") tal como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de sangre diluida a las que se había añadido anticuerpo ("Post Tx") se ensayaron en los tiempos indicados una vez iniciado el circuito de CPB.

Figura 3- Ensayo de los niveles de C5b-9 soluble en la sangre humana circulada a través de un circuito extracorpóreo que demuestra que la adición de un anticuerpo monoclonal anti-C5 a dicha sangre entera inhibe la formación del ensamblaje terminal del complemento C5b-9. Los ensayos se realizaron antes de la adición del anticuerpo o el inicio del circuito de CPB ("Pre Tx") utilizando sangre sin diluir ("undil") y sangre diluida ("dil") según se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de sangre diluida a las que se había añadido anticuerpo ("Post Tx") se ensayaron en los tiempos indicados después de iniciarse el circuito de CPB.

Figura 4- Análisis por FACS de los niveles de GPIb ("GP1b") en todas las plaquetas, GPIIb-IIIa en todas las plaquetas (independientemente de la expresión de P-selectina, "GPIIb-IIIa"), P-selectina en todas las plaquetas ("%PLT activ") GPIIb-IIIa en las plaquetas positivas para P-selectina ("IIb-IIIa-act"), GPIIb-IIIa en las plaquetas negativas para P-selectina ("IIb-IIIa-inact"), enlace plaqueta neutrófilo ("PLT/PMN"), enlace plaqueta-monocito ("PLT/MONO"), niveles de CD11b en neutrófilos ("PMN CD11b") y niveles de CD11b en monocitos ("MONO CD11b"), demostrando la inhibición de todos excepto los dos últimos de tales parámetros mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-C5 a la sangre humana entera durante la ECC.

Antecedentes de fisiología I. Introducción

Tal como se describió anteriormente, la presente invención se refiere a la inhibición de las disfunciones del sistema inmunitario y hemostático durante la ECC. Para proporcionar antecedentes para la descripción de las formas de realización preferidas y a los ejemplos que se presentan más adelante, se hará referencia en primer lugar a discusiones generales en el contexto de la ECC de los aspectos relevantes de los sistemas inmunitario y hemostático, en particular de ciertos aspectos del brazo del complemento del sistema inmunitario, el brazo celular del sistema inmunitario y la fisiología de las plaquetas.

II. Patofisiología asociada a la ECC

Un cambio patofisiológico clave en la sangre asociado con la ECC es la rápida activación de la cascada del complemento. La activación de los componentes del complemento que median en la inflamación e inciden sobre las propiedades hemostáticas de la sangre tiene lugar cuando las sangre se pone en contacto directo con diversos componentes no biológicos del circuito de ECC [Videm, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97:764-770 (1989)] y se puede inhibir hasta cierto punto con ciertos fármacos, en particular la heparina y la protamina, que se administran a los pacientes durante los procesos de ECC [Jones, et al., Anaesthesia, 37:629-633 (1982)].

Tanto en el sistema inmunitario como en el sistema hemostático se observan perturbaciones interdependientes durante el CPB y otros tipos de ECC. Muchos de dichos cambios se cruzan al nivel de la función de las plaquetas, ya que las acciones del brazo del complemento del sistema inmunitario pueden producir la activación de las plaquetas.

Además de sus efectos sobre las plaquetas y el brazo del complemento del sistema inmunitario, la ECC también afecta al brazo celular del sistema inmunitario tanto a través de efectos sobre los leucocitos como a través de efectos sobre las interacciones plaqueta-leucocito.

(a) Efectos de la ECC sobre las plaquetas

Las plaquetas son elementos celulares de la sangre sin núcleo, vitalmente importantes para la formación de coágulos sanguíneos y evitar el exceso de hemorragia. Un número de plaquetas anormalmente bajo en la sangre, un síndrome conocido como trombocitopenia, generalmente produce contusiones graves, hemorragia en las membranas mucosas y una considerable pérdida de sangre después de la cirugía y otras heridas.

La disfunción plaquetaria ha sido asociada al contacto de las plaquetas con la superficie no biológica del oxigenador extracorpóreo y a la hipotermia asociada con el CPB. También se han implicado diversos otros mecanismos, solos o en combinación, como contribuyentes a la disfunción plaquetaria. Por ejemplo, el trauma mecánico debido al esfuerzo de cizalla, la adherencia a las superficies y la turbulencia en el oxigenador extracorpóreo puede producir la fragmentación de la membrana de las plaquetas. Los componentes activados del complemento, sin embargo, son argumentablemente los factores más importantes que contribuyen a la disfunción de las plaquetas asociada a la ECC.

El CPB afecta a adversamente al número y a la función de las plaquetas. La hemodilución durante el CPB causa el rápido descenso del número de plaquetas poco después del inicio del CPB, que disminuye hasta aproximadamente el 50% del nivel preoperatorio. Dicho nivel de plaquetas circulantes, si ocurriese en el contexto del funcionamiento de las plaquetas de un individuo normal, es poco probable que contribuyese a hemorragia clínica. De mayor significado para el desarrollo de la morbidez asociada al CPB es, sin embargo, la pérdida progresiva de la función de las plaquetas observada durante y después del CPB. En minutos después del inicio del CPB, se prolonga significativamente el tiempo de hemorragia y se deteriora la agregación de las plaquetas. Dichos cambios en el tiempo de hemorragia son independientes del número de plaquetas y empeoran a la vez que progresa el CPB. Los tiempos de hemorragia, normalmente inferiores a 10 minutos, se pueden acercar a los 30 minutos después de 2 horas de CPB.

Las plaquetas sufren alteraciones bioquímicas y morfológicas profundas cuando son activadas por ciertos estímulos. Cuando son producidas por estímulos asociados a condiciones que requieren una hemostasis rápida, dichas alteraciones están asociadas a la función normal de las plaquetas. Cuando son producidas por la ECC, tienen consecuencias patofisiológicas. Las alteraciones de las características de las plaquetas asociadas a su activación incluyen la desgranulación exocítica con liberación del contenido de diversos orgánulos de almacenamiento, los cambios de forma y la inducción de la adhesividad, agregación y producción de tromboxano.

Una proteína específica integral de la membrana, la P-selectina (también conocida como CD62, CD62P, GMP-140 y PADGEM), que también se localiza en la superficie interna de los gránulos \alpha de las plaquetas, se desplaza a la superficie de las plaquetas cuando dichos orgánulos se invierten durante la exocitosis. Por consiguiente, la aparición de P-selectina en la superficie de las plaquetas sirve como un marcador de la activación de las plaquetas.

Una multiplicidad de pruebas sugiere que la expresión de P-selectina y el agotamiento temporal o la modificación de alguno de los componentes funcionales de la membrana de las plaquetas son indicios clave de la funcionalidad de las plaquetas. Múltiples estudios han reportado un descenso significativo en la cantidad de las glicoproteínas antígenos de membrana GPIb (CD45b), GPIIb y GPIIIa en las plaquetas circulantes a continuación del CPB. En particular la perdida de GPIIIa de las plaquetas está asociada a una reducción en el número total de lugares de unión al fibrinógeno. Tales plaquetas con superficie alterada muestran de tal modo una pobre capacidad hemostática.

La eliminación de las glicoproteínas de membrana de las plaquetas puede estar mediada por la actividad de enzimas proteolíticos tales como la plasmina y la elastasa. La capacidad del inhibidor de las proteinazas, la aprotinina (discutido anteriormente) para minimizar la perdida de glicoproteínas (específicamente, GPIb) después del CPB proporciona pruebas que implican directamente a la proteolisis de las glicoproteínas de la membrana de las plaquetas en el desarrollo de la disfunción plaquetaria [Wenger, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97:235 (1989)].

Los efectos de la ECC sobre las plaquetas son particularmente significativos porque las plaquetas solamente se pueden activar una vez, es decir, la activación de las plaquetas disminuye el número de plaquetas funcionales disponible cuando a continuación se necesitan las funciones de las plaquetas. La importancia de los efectos de la ECC sobre las plaquetas la demuestra el descubrimiento de que la disfunción hemostática observada después de las operaciones cardíacas es principalmente atribuible a la disfunción de las plaquetas [Mohr, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 96:530 (1968)].

(b) Interacciones plaqueta-leucocito asociadas a la ECC

La molécula P-selectina, que aparece en la superficie de la membrana de las plaquetas activadas, se conoce que media en la unión de las plaquetas con diversos tipos de células blancas sanguíneas (WBCs, leucocitos) sin que se necesite la activación de las WBCs para que tenga lugar dicha unión. Dichas WBCs incluyen los leucocitos polimorfonucleados (PMNs, neutrófilos, granulocitos) y los monocitos y la unión mediada por la P-selectina resulta en la formación de conjugados de plaqueta-PMN y plaqueta-monocito [Larsen, et al., J. Biol. Chem. 267:11104-11110 (1992), Corral, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 172:1349-1353 (1990)]. Una consecuencia de la formación de tales conjugados es la eliminación de las plaquetas de la circulación, un fenómeno que puede contribuir al desarrollo de trombocitopenia [Rinde, et al., Transfusion, 31:408-414 (1991)].

Dicha adhesión leucocito-plaqueta también se cree que tiene importancia fisiológica en la dirección de los leucocitos hacia los lugares adecuados de inflamación y/o hemorragia y en la modulación de la función de los leucocitos. La relevancia de dicho direccionamiento ha sido demostrada recientemente in vivo en un modelo de babuino en el que el bloqueo de la P-selectina con un anticuerpo monoclonal produjo una disminución en la acumulación de monocitos en un injerto vascular artificial y una actividad procoagulante disminuida [Palabrica et al., Nature, 359:848-851 (1992)]. Dicha adhesión leucocito-plaqueta causada por la P-selectina se ha descubierto que es inducida por el CPB [Rinder, et al., Blood, 79:1201-1205 (1992)].

La modulación de la función de los leucocitos mediada por la unión plaqueta-leucocito asociada a la ECC incluye la regulación positiva de la principal molécula procoagulante de los monocitos conocida como el "factor tisular" (TF). Los datos reportados por Catalett, et al., Blood, 78(supl 1):279a (1991), sugieren que la P-selectina induce la regulación positiva del TF en los monocitos durante un período de cuatro horas. Dicha regulación positiva del TF incrementa los efectos procoagulantes de los leucocitos [Altieri, Blood, 81:569-579 (1993)]. En un modelo simulado de CPB de ciclo cerrado, Kappelmayer, et al., Circ. Res., 72:1075-1081 (1993), han demostrado recientemente la regulación positiva asociada al CPB de tanto la cantidad como la actividad del TF en los monocitos circulantes. La expresión del TF de los monocitos varias horas después de la conclusión del proceso de CPB, en combinación con otros eventos pro coagulantes que tienen lugar durante el CPB [Evangelista, et al., Blood, 77:2379-2388 (1991); Higuchi, et al., Blood, 79:1712-1719 (1992); Weitz, et al, J. Exp. Med., 166:1836-1850 (1987)] se cree que predispone al paciente a los eventos trombóticos tardíos, tales como la reoclusión de los injertos vasculares.

(c) Otros efectos de la ECC en los leucocitos

Además de la regulación positiva del TF en los monocitos, la regulación positiva asociada al CPB de los ligandos de adhesión celular, que contienen la \beta_{2} integrina CD18, en particular, el ligando adhesivo heterodimérico que contiene CD18 y CD11b (conocido como CD11b/CD18 o MAC-1) , ha sido descrita en los monocitos y en los neutrófilos [Rinder, et al., Blood, 79:1201-1205 (1992)]. Dicha regulación positiva es particularmente relevante en el daño inducido por el CPB ya que el CD11b/CD18 es responsable de la adhesión y penetración a través del endotelio de los leucocitos (diapédesis) mediada por la unión a las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 e ICAM-3 en los endotelios "activados" [Staunton, et al., Cell, 52:925-933 (1988); Staunton, et al., Nature, 339:61-64 (1989); Purie, et al., J. Immunol., 148:2395-2404 (1992)].

En los sistemas experimentales, la administración de anticuerpos monoclonales que bloquean la actividad del CD11b/CD18 a demostrado evitar el daño por reperfusión [Simpson, et al., J. Clin. Invest., 81:624-629 (1988); Arnaout, Blood, 75:1037-1050 (1990); Dreyer, et al., Circ., 84:400-411 (1991)]. Además, el incremento en la expresión de CD11b/CD18 en los leucocitos ha sido relacionado a las complicaciones asociadas con la hemodiálisis [Arnaout, et al., N. Engl. J. Med., 312:457 (1985)]. Por consiguiente, el CD11b/CD18 puede contribuir a los problemas médicos asociados con la ECC.

Además de lo anterior, la parte CD11b funciona como receptor para el componente del complemento iC3b y para los elementos del sistema de coagulación soluble dependiente del contacto, que incluyen el fibrinógeno, la fibronectina y el Factor X [Altieri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7462-7465 (1988); Nathan, et al., J. Cell Biol., 109:1341-1399 (1989)]. Las interacciones del CD11b con el fibrinógeno podrían ser de particular importancia en la patología asociada con la ECC, ya que, tal como se discutió anteriormente, el complejo de glicoproteínas de la superficie de las plaquetas GPIIb-IIIa también está asociado a la unión del fibrinógeno, proporcionando así un mecanismo potencial para la adhesión plaqueta-leucocito, es decir, mediante una unión CD11b-fibrinógeno-GPIIb-IIIa [Altieri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7462-7465 (1988)]. La inducción de una explosión respiratoria asociada a la inflamación en los granulocitos como respuesta a diversas citocinas también parece necesitar CD11b/CD18 en el microambiente adherente local.

Por consiguiente dicho complejo de integrina \beta_{2} ejerce sus efectos en las intersecciones críticas del sistema del complemento, el sistema inmunitario celular y la senda de coagulación celular soluble. La expresión de CD11b/CD18 en la superficie de los leucocitos se puede por consiguiente ensayar como indicador pronóstico relacionado a la probabilidad de ocurrencia de eventos asociados al complemento, la inmunidad y la coagulación.

(d) El sistema del complemento

El sistema del complemento actúa en conjunción con otros sistemas inmunológicos del cuerpo para defenderlo contra la intrusión de patógenos celulares y víricos. Existen por lo menos 25 proteínas del complemento, que se encuentra como una compleja colección de proteínas del plasma y cofactores de membrana. Las proteínas del plasma constituyen aproximadamente el 10% de las globulinas en el suero de los vertebrados. Los componentes del complemento logran sus funciones de defensa inmunitaria interactuando en una intrincada pero precisa serie de eventos de corte enzimático y enlace a la membrana. La resultante cascada de complemento conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunoreguladoras y líticas.

La cascada del complemento progresa a través de la senda clásica o a través de la senda alternativa. Dichas sendas comparten muchos componentes y aunque difieren en las etapas iniciales, convergen y comparten los mismos componentes del "complemento terminal" responsables de la activación, ataque y destrucción de las células diana.

Típicamente, la senda clásica del complemento se inicia por el reconocimiento de y la unión a un lugar antigénico por un anticuerpo en una célula diana. La senda alternativa es generalmente independiente de los anticuerpos y puede ser iniciada por ciertas moléculas en la superficie de los patógenos. Las dos sendas convergen en el punto en el que el componente C3 del complemento es cortado por una proteinasa activa (que es diferente en cada una de las sendas) para producir C3a y C3b. Otras sendas que activan el ataque del complemento pueden actuar más adelante en la secuencia de eventos que conduce a los diversos aspectos de la función del complemento.

El C3a es una anafilotoxina (ver más adelante). El C3b se une a las bacterias y a otras células y las marca para que sean eliminadas de la circulación. En este papel el C3b es conocido como opsonina. Se considera que la función de opsonina del C3b es la acción antiinfecciosa más importante del sistema del complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función del C3b son propensos a las infecciones por una multiplicidad de organismos patógenos, mientras que los pacientes con lesiones más adelante en la secuencia de la cascada del complemento, es decir, los pacientes con lesiones que bloquean las funciones del C5, se observa que son más propensos solamente a las infecciones por Neisseria, y solamente algo más propensos [Fearon, en Intensive Review of Internal Medicine, 2ª Ed., Fanta and Minaker, eds. Brigham and Women's and Beth Israel Hospital, 1983].

El C3b también forma parte de un complejo con otros componentes únicos de cada una de las sendas para formar la convertasa clásica o alternativa del C5, que corta el C5 en C5a y C5b. El C3 es por consiguiente considerado como la proteína central en la secuencia de reacciones del complemento ya que es esencial tanto para la senda alternativa como para la clásica [Wurzner, et al., Complement Inflamm., 8:328-340 (1991)]. Esta propiedad del C3b está regulada por la proteinasa del suero Factor I, que actúa sobre el C3b para producir iC3b. Aunque todavía funcional como opsonina, el iC3b no puede constituir una convertasa C5 activa.

El C5a es otra anafilotoxina (ver más adelante). El C5b se combina con el C6, el C7 y el C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula diana. Cuando se unen múltiples moléculas de C9 se forma el complejo de ataque a la membrana (MAC, C5b-9, complejo terminal del complemento-TCC). Cuando se inserta en la membrana de la célula diana un número suficiente de MACs las aperturas que estos crean (poros MAC) inducen la rápida lisis osmótica de la célula diana. Las concentraciones inferiores, no líticas, de MACs pueden producir otros efectos. En particular, la inserción en la membrana de las células endoteliales y de las plaquetas de un número pequeño de complejos C5b-9 puede producir una activación celular perjudicial. En algunos casos la activación puede preceder la lisis celular.

Ciertos aspectos del mecanismo de activación de las plaquetas mediado por el C5b-9 han sido descritos [Sims, et al., J. Biol. Chem., 264:19228 (1989)]. Las concentraciones inferiores a las líticas de poros MAC en la superficie de las plaquetas permiten la entrada de iones de calcio extracelular en las plaquetas. Los niveles elevados de iones de calcio intraplaquetario resultantes actúan como una señal de activación e inducen la expresión en la superficie de P-selectina que es característica de las plaquetas activadas. Ya que, tal como se describió anteriormente, la P-selectian media en la unión plaqueta-monocito y dicha unión dispara la liberación del factor tisular de los monocitos, la formación de poros MAC en la membrana de la superficie de las plaquetas puede tener efectos nocivos en el paciente. Por ejemplo, la activación de las plaquetas por los poros MAC puede predisponer a un paciente de CPB a eventos trombóticos tardíos, tales como la reoclusión de los injertos vasculares.

Tal como se mencionó anteriormente, C3a y C5a son anafilotoxinas. Tales componentes del complemento activado pueden disparar la desgranulación de las células mast, que liberan histamina y otros mediadores de la inflamación, produciendo la contracción de la musculatura lisa, el incremento de la permeabilidad capilar, la activación de los linfocitos y otros fenómenos inflamatorios. El C5a también actúa como un péptido quimotáctico que sirve para atraer a los granulocitos pro-inflamatorios a los lugares de activación del complemento. Además, la activación directa de las células endoteliales por el C5a induce la liberación de la glicoproteína inhibidora de la coagulación sulfato de heparano. La liberación de sulfato de heparano puede tener como efecto la disminución del nivel de dicha molécula inhibidora de la coagulación en la superficie de las células endoteliales, con la consecuencia de aumentar el potencial trombogénico de la superficie celular endotelial [Platt, et al., J. Exp. Med., 171:1363 (1990)].

(e) La función del complemento y las plaquetas y la ECC

La activación y el consumo de los componentes del complemento durante la ECC, específicamente durante el CPB, es puesta en evidencia por niveles de actividad del complemento hemolítico muy inferiores, al final del CPB, a los que se podrían explicar por hemodilución solamente. Un rápido efecto sobre los componentes del complemento acompaña el comienzo de la circulación extracorporea; los indicios de una senda alternativa de activación se observan minutos después del inicio del CPB. La activación de la senda clásica también se ha observado durante el CPB [Haslam, et al., Anaesthesia, 35:22 (1980)].

Se ha encontrado que los niveles de la anafilotoxina C3a aumentan dramáticamente durante el CPB y existe una fuerte asociación estadística entre los niveles elevados de C3a y la disfunción postoperatoria de los sistemas de órganos manifiesta por el deterioro y/o fallo cardíaco, renal y pulmonar, diatesis hemorrágica y la necesidad de ventilación artificial [Kirklin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 86:845-847 [1983)]. Dicha asociación ha llevado a la creencia de que el C3a es un mediador clave de los efectos nocivos asociados a la activación del complemento durante el CPB.

Está bien establecido que las plaquetas pueden activarse mediante el ensamblaje de componentes C5b-9 del complemento terminal en su superficie. El ensamblaje de dichos componentes del complemento en la superficie de las plaquetas se conoce que ocurre durante la ECC [Finn, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 105:234 (1993)]. La activación de las plaquetas mediada por el complemento, por otra parte, conduce a la liberación de gránulos alfa, el incremento en la expresión de P-selectina y la pérdida de GPIb. La generación de los productos de activación del complemento, tales como el C3a, C5a y C5b-9, produce, además, la formación de vesículas en la membrana de las plaquetas y la consecuente formación de micropartículas.

Otros efectos nocivos de la activación del complemento durante el CPB pueden incluir la activación de los granulocitos, que conduce a la desgranulación parcial y a la regulación positiva del CD11b/CD18 y el daño a los órganos. Dichos efectos nocivos son en gran parte debidos a la acción de ciertos productos de la activación del complemento, especialmente a las anafilotoxinas C3a y C5a, que, a su vez, se pueden convertir en las formas desArg, con niveles de actividad alterados, mediante la carboxipeptidasa plasmática. Estos componentes del complemento activado producen la activación y la agregación de los neutrófilos. Tales células activadas, a su vez, se acumulan en los vasos pulmonares y los lechos vasculares, tal como se ha demostrado mediante biopsias seriadas del tejido pulmonar antes y después del CPB [Howard, et al., Arch. Surg., 123:1496-1501 (1998)]. El hígado, el cerebro y los pulmones también sufren dichos daños, que pueden producir disfunciones postoperatorias en tales órganos.

Aunque los datos circunstanciales indican que los componentes del complemento activado C3a, C5a y C5b-9 tienen un papel crítico en la patofisiología del CPB, hasta la fecha no hay pruebas definitivas. Además, la contribución relativa de dichos componentes individuales del complemento a la generación de los procesos inflamatorios asociados con el CPB ha permanecido indefinida.

Descripción de las formas de realización preferidas

Tal como se discutió anteriormente, la presente invención se refiere a la utilización de anticuerpos anti-C5 en la ECC. Más generalmente, la presente invención se refiere a la utilización de anticuerpos anti-C5 en cualquier proceso que implique la circulación de la sangre de un paciente desde un vaso sanguíneo del paciente, a través de un conducto y de vuelta al vaso sanguíneo del paciente, teniendo el conducto una superficie de lumen que comprende un material capaz de producir por lo menos una de entre activación del complemento, activación de las plaquetas, activación de los leucocitos, o la adhesión plaqueta-leucocito. Dichos procesos incluyen, sin quedar limitadas, todas las formas de ECC, así como también los procesos que implican la introducción de un órgano artificial o extraño, tejido, o vaso en el circuito de la sangre de un paciente.

Los materiales de los conductos que tienen los anteriores efectos en la sangre incluyen aquellos actualmente conocidos en la técnica así como aquellos que se puedan desarrollar en el futuro. Dichos materiales incluyen los materiales sintéticos tales como los diversos tipos de plásticos y polímeros sintéticos utilizados en los circuitos de CPB, circuitos de hemodiálisis, injertos vasculares y órganos artificiales, así como también los materiales biológicos de origen xenogénico.

El anticuerpo anti-C5 se utiliza para reducir por lo menos una de entre la activación del complemento, activación de las plaquetas, activación de los leucocitos o adhesión plaqueta-leucocito producidas por la circulación de la sangre del paciente a través de tal conducto. La reducción de la activación del complemento se puede medir mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el procedimiento de hemolisis de heritrocitos de pollo descrito más adelante en el Ejemplo 1. Preferiblemente, se utiliza la cantidad suficiente de anticuerpo para reducir en por lo menos el 50% el incremento de la actividad hemolítica del plasma que resulta de la activación del complemento causada por el contacto con el conducto.

La reducción de la activación de las plaquetas se puede medir mediante diversos procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el análisis por inmunofluorescencia de la expresión de los marcadores de activación de las plaquetas GPIIb-IIIa o P-selectina mediante los procedimientos descritos más adelante en los Ejemplos 1 y 4. Es preferible utilizar una cantidad suficiente de anticuerpo para lograr por lo menos una reducción del 50% en el incremento de expresión de por lo menos uno de los marcadores de activación de las plaquetas que resulta del contacto con el conducto.

La reducción de la activación de los leucocitos se puede medir mediante múltiples procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el análisis por inmunofluorescencia de la expresión del marcador de la activación de los leucocitos CD11b/CD18. Tal como se describe en el Ejemplo 4, la expresión de dicho marcador se puede determinar mediante la medición de la expresión de CD11b. Otra vez, es preferible utilizar una cantidad suficiente de anticuerpo para lograr por lo menos una reducción del 50% en el incremento de la expresión del marcador de activación de los leucocitos en por lo menos un tipo de leucocito, p. ej. PMNs, que resulta del contacto con el conduc-
to.

La reducción de los niveles de adhesión plaqueta-leucocito, específicamente la adhesión plaqueta-monocito y la adhesión plaqueta-neutrófilo, se puede medir mediante los procedimientos de análisis de fluorescencia descritos más adelante en el Ejemplo 4, p. ej., como el incremento porcentual de los leucocitos que se leen como GPIb o GPIIb/IIIa positivos. De nuevo, es preferible utilizar una cantidad de anticuerpo suficiente para lograr por lo menos un 50% de reducción en el incremento del porcentaje de monocitos y neutrófilos GPIb o GPIIb/IIIa positivos que resulta del contacto con el conducto.

Para lograr las deseadas reducciones, los anticuerpos anti-C5 se pueden administra en una multiplicidad de formas de dosis unitarias. La dosis oscilará según, por ejemplo, el anticuerpo en particular, la forma de administración, el proceso en particular que se realiza y su duración, la naturaleza del conducto o conductos utilizados para el proceso, la salud en general, la afección, el tamaño y la edad del paciente y el juicio del médico que receta. Los niveles de dosis para sujetos humanos oscilan generalmente entre aproximadamente 1 mg por kg y aproximadamente 100 mg por kg por paciente por tratamiento y preferiblemente entre aproximadamente 5 mg por kg y aproximadamente 50 mg por kg por paciente por tratamiento. En algunos casos, solamente se puede administrar una dosis única de anticuerpo anti-C5 a un paciente para lograr un efecto terapéutico.

El anticuerpo anti-C5 se administra preferiblemente antes del contacto de la sangre con el conducto. Además, se puede continuar la administración mientras la sangre esté en contacto con el conducto e incluso después de ese tiempo, si se desea. En el caso de administración previa, se puede utilizar una sola dosis. Para la administración continua durante el proceso y/o a continuación, se pueden utilizar dosis periódicas del anticuerpo anti-C5 o una infusión continua.

Un proceso típico, según la presente invención, incluye por consiguiente las siguientes etapas. Se prepara al paciente para la cirugía según la práctica estándar y en la hora anterior al inicio de la cirugía, pero generalmente antes del inicio de la cirugía, se administra la primera dosis de la preparación farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-C5. Generalmente, tal como juzgue el médico, también se puede administrar una serie de dosis durante y a continuación del proceso. Por el contrario, durante y una vez concluido el proceso, los niveles de actividad del complemento en el suero del paciente se siguen mediante la utilización de los procedimientos descritos más adelante en el Ejemplo 1 para determinar si se necesitan dosis adicionales, siendo dichas dosis administradas según sea necesario para mantener una reducción de por lo menos el 50% y preferiblemente una reducción de aproximadamente el 95% en la actividad del complemento en el suero.

En general se realizará la administración de anticuerpos anti-C5 por vía intra vascular, p. ej., mediante infusión intravenosa mediante inyección. Si se desea se pueden utilizar otras vías. Las formulaciones adecuadas para la inyección se encuentran en Remingont's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) por Remington. Dichas formulaciones deberán ser estériles y no pirógenas y generalmente incluirán un vehículo farmacéutico efectivo, tal como disolución salina, disolución salina tamponada (p. ej. tamponada con fosfato), disolución de Hank. Disolución de Ringer, disolución salina/dextrosa, disoluciones de glucosa y semejantes. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario, tales como agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, preservantes, estabilizadores y semejantes.

Las formulaciones (agentes farmacéuticos) de la invención se pueden distribuir como artículos de fabricación que comprenden un material de empaquetamiento y el anticuerpo anti-C5. El material de empaquetamiento incluirá una etiqueta que indique que la formulación es para una utilización asociada a un proceso de circulación extracorporal, p. ej., un proceso de "bypass" cardiopulmonar.

Preferiblemente el anticuerpo anti-C5 es un anticuerpo monoclonal, aunque, si se desea también se pueden utilizar anticuerpos policlonales ensayados por procedimientos convencionales. Preferiblemente, los anticuerpos anti-C5 son inmunoreactivos contra los epitopos de la cadena beta del componente C5 del complemento humano purificado (es decir, la parte de la molécula C5 que se convierte en C5b) y son capaces de bloquear la conversión de C5 en C5a y C5b por la C5 convertasa. Dicha capacidad se puede medir utilizando el procedimiento descrito en Wurzner, et al., Complement Inflamm., 8:328-340 (1991). La cantidad de reducción de la actividad C5 convertasa es preferiblemente de por lo menos el 50% del incremento en actividad convertasa resultante del contacto con el conducto.

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que reaccionan con el componente C5 del complemento se pueden obtener según lo publicado por Sims, et al., en la patente US nº 5.135.916. Tal como se discute en esta publicación, los anticuerpos se preparan utilizando como inmunógenos los componentes purificados del complejo de ataque a la membrana del complemento. Según la presente invención, se utiliza preferiblemente como inmunógeno el componente C5 ó C5b del complemento. Según la presente invención, los anticuerpos preferiblemente deben evitar el corte de C5 para generar C5a y C5b, evitando así la generación de la actividad anafilotóxica asociada a C5a y evitando el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana asociado a C5b. En una forma de realización particularmente preferida, estos anticuerpos anti-C5 no impedirán la función de opsonización asociada a la activación del componente C3 del complemento por una C3 convertasa. La actividad C3 convertasa del plasma se puede medir mediante el ensayo de la presencia de C3a en el plasma tal como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Preferiblemente, el anticuerpo anti-C5 no produce una reducción esencial de los niveles de C3a del plasma.

Los procedimientos generales para la inmunización de animales (en este caso con C5 o C5b), el aislamiento de células productoras de anticuerpo, la fusión de tales células con células inmortales (p. ej., células de mieloma) para generar los hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, el ensayo de los sobrenadantes de los hibridomas para determinar la reactividad de los anticuerpos monoclonales con los antígenos deseados (en el presente caso C5 ó C5b), la preparación de cantidades de tales anticuerpos en los sobrenadantes de los hibridomas o de los fluidos ascíticos y para la purificación y almacenamiento de tales anticuerpos monoclonales, se pueden encontrar en numerosas publicaciones. Estas incluyen: Coligan, et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, New York, 1992; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell and Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies., John Wiley and Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991; Montz, et al., Cellular Immunol., 127:337-351 (1990); Wurzner, et al., Complement Inflamm., 8:328-340 (1991) y Mollnes, et al., Scand. J. Immunol., 28:307-312 (1988).

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "anticuerpos monoclonales" se refiere a las inmunoglobulinas producidas por un hibridoma y a los fragmentos que se unen a los antígenos (p. ej. las preparaciones de Fab') de tales inmunoglobulinas, así como también a las proteínas expresadas de forma recombinante que se unen a antígenos, que incluyen inmunoglobulinas, inmunoglobulinas quiméricas, inmunoglobulinas "humanizadas", los fragmentos que se unen a los antígenos de tales inmunoglobulinas, los anticuerpos de cadena única y otras proteínas recombinantes que contienen dominios que se unen a los antígenos derivados de las inmunoglobulinas. Las publicaciones que describen procedimientos para la preparación de dichos anticuerpos monoclonales, además de las descritas anteriormente, incluyen: Reichmann, et al., Nature, 332:323-327 (1988); Winter and Milstein, Nature, 349:293-299 (1991); Clackson, et al., Nature, 352:624-628 (1991); Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10:239-265 (1992); Haber, Immunol. Rev., 130:189-212 (1992) y Rodrigues, et al., J. Immunol., 151:6952-6961 (1993).

Sin pretender limitarla en forma alguna, la presente invención se describirá más ampliamente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Inhibición mediante anticuerpos monoclonales anti-C5 de la actividad del complemento durante la circulación extracorporal

Los efectos de un anticuerpo monoclonal generado contra el C5 humano sobre la activación del complemento se evaluaron utilizando un modelo de CPB de bucle cerrado para la circulación extracorporal de la sangre humana. El anticuerpo monoclonal C5 se produjo en ratones contra la proteína C5 humana (Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991); N19-8 mAb) y se propagó, recuperó y purificó como la fracción IgG de un fluido ascítico de ratón (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, New York, 1992.

Para realizar estos experimentos, 300 ml de sangre humana entera se extrajeron de un donante humano saludable y adicionalmente se extrajo una muestra de 1 ml como muestra control para analizar más adelante. La sangre se diluyó a 600 ml añadiendo solución de lactato de Ringer con 10 U/ml de heparina. El mAb bloqueante anti-C5 (30 mg en PBS estéril) se añadió a la sangre diluida hasta obtener una concentración final de 50 \mug/ml. En un experimento control, se añadió un volumen igual de PBS estéril a la sangre diluida. La sangre se utilizó a continuación para cebar el circuito extracorpóreo de una máquina de CPB con oxigenador de membrana COBE CML EXCEL (Cobe BCT, Inc., Lakewood, CO) y se inició el circuito. El circuito se enfrió a 28ºC y se hizo circular durante 60 minutos. El circuito se calentó a continuación a 37ºC y se hizo circular durante 30 minutos adicionales. A continuación se terminó el experimento. Se extrajeron muestras a múltiples tiempos y se evaluó la actividad del complemento (Figura 1).

A cada punto de tiempo se tomo una alícuota de sangre entera, se dividió en tres muestras y A) se diluyo 1:1 en 2% paraformaldehido en PBS para valorar los parámetros de activación de las plaquetas y las células sanguíneas (Ejemplo 4); B) se centrifugó para eliminar todas las células y el plasma se diluyó 1:1 en disolución conservante para muestras Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA) y se almacenó a -80ºC para valorar la generación de C3a y C5b-9 (Ejemplos 2 y 3, respectivamente) y C) se centrífugó para eliminar todas las células y el plasma se congeló a -80ºC para ensayos de hemolisis para valorar la actividad del complemento (Ejemplo 1).

Para valorar la actividad del complemento, las muestras de plasma congeladas se descongelaron y se realizaron análisis de hemolisis tal como sigue. Eritrocitos de poyo se lavaron bien en GVBS [Rollins, et al., J. Immunol. 144:3478-3483 (1990)] y se resuspendieron a una concentración 2x10^{8}/ml en GVBS. Se añadió a las células un anticuerpo contra eritrocitos de poyo (fracción IgG de un antisuero contra RBC de poyo, Intercell Technologies, Hopewell, NJ) a una concentración final de 25 \mug/ml. Las células se incubaron durante 15 minutos a 23ºC. Las células se lavaron 2 veces con GVBS y se suspendieron 5 x 10^{6} células en un volumen final de 130 \mul de GVBS con 5% de plasma. Después de una incubación de 30 minutos a 37ºC, el % de hemolisis se calculó con relación a una muestra control de suero humano (Figura 1). La hemolisis se determinó centrifugando las células y midiendo la hemoglobina liberada en el sobrenadante como la densidad óptica a 415 nm.

Tal como se puede observar en la Figura 1, la adición del anticuerpo anti-C5 al circuito extracorpóreo produjo una reducción del 95% en la actividad del complemento del suero. La actividad del complemento permaneció inhibida durante el transcurso del experimento (90 minutos).

Ejemplo 2 Generación de C3a durante la circulación extracorporal

Las muestras de plasma recién congeladas que anteriormente habían sido diluidas en disolución Quidel para la conservación de muestras (ver Ejemplo 1) se ensayaron para determinar la presencia del componente cortado C3a del complemento mediante la utilización del equipo C3a EIA de Quidel (Quidel Corporation, San Diego CA). Tales mediciones se realizaron según las especificaciones del fabricante. El C3a liberado se expresa en ng/pocillo tal como se determina mediante la comparación con una curva estándar generada a partir de muestras que contienen cantidades conocidas de C3a humano.

Tal como se observa en la Figura 2, la adición del anticuerpo anti-C5 no tuvo efecto en la producción de C3a durante el experimento de CPB. La generación de C3a incrementó dramáticamente durante los 30 minutos finales del experimento y se correlaciona con el calentamiento de la muestra.

Ejemplo 3 Impedimento de la generación de C5b-9 durante la circulación extracorporal

Las muestras de plasma recién congeladas que previamente habían sido diluidas en disolución Quidel para la preservación de muestras (ver el Ejemplo 1) se ensayaron para determinar la presencia del complejo terminal del complemento humano C5b-9 utilizando el equipo C5b-9 de Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA). La cantidad de C5b-9 en cada muestra se determinó utilizando las especificaciones del fabricante y se expresa en unidades arbitrarias de absorbancia (AU).

Tal como se observa en la Figura 3, el anticuerpo anti-C5 inhibió completamente la generación de C5b-9 durante la circulación extracorporal de forma que los niveles de C5b-9 durante el transcurso completo del ensayo fueron equivalentes a los puntos de tiempo control (t_{0}). Los resultados de este experimento y los de los Ejemplos 1 y 2 muestran que la adición de un anticuerpo mAb anti-C5 durante la circulación extracorporal inhibe efectivamente tanto la actividad hemolítica del complemento (Figura 1) como la generación de C5b-9 (Figura 3), pero no la generación de C3a (Figura 2).

Ejemplo 4 Impedimento de la activación y adhesión de las plaquetas y leucocitos durante la circulación extracorporal

Las muestras de sangre entera fijadas en paraformaldehido tomadas a T = 0 y T = 90 minutos durante el experimento de circulación extracorporal (ver Ejemplo 1) se lavaron, marcaron con anticuerpos fluorescentes dirigidos contra diversas moléculas marcadoras de la superficie celular y fueron analizadas por citometría de flujo (FACS). Los anticuerpos primarios utilizados en este experimento fueron anti-GPIIb-IIIa (clon RUUSP2.41, AMAC, Inc., Westbrook, ME); anti-CD11b (Anti-CR3 (leu-15) clon D12, Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA); anti-P-selectina, (1E3 proporcionado por el Dr. Kenneth Ault, Maine Medical Center Research Institute, Portland, ME); anti-GPIb (CD42b), (IOP42b clon SZ2, AMAC, Inc., Westbrook,ME) y anti-CD45 (un marcador tanto de monocitos como de PMNs, que se distinguen mediante las características de dispersión frontal y lateral de los perfiles de FACS de las células positivas a CD45) (Anti-Leucocite (HLe-1; CD45) clon 2D1, Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). El cambio porcentual en la expresión en la superficie celular de diversos receptores de la superficie celular (Plaquetas GPIb, Plaquetas GPIIb-IIIa, P-selectina, CD11b) se calculó mediante la comparación de los valores FL-1 medios obtenidos para cada anticuerpo mediante el siguiente cálculo: T = 90/T = 0 X 100

La unión plaqueta monocito (PLT/MONO) y la unión plaqueta-neutrófilo (PLT/PMN) se determinó calculando el porcentaje de neutrófilos o monocitos que dan lectura positiva para el receptor específico de plaquetas GPIb.

Tal como se puede observar en la Figura 4, la adición de un anticuerpo anti-C5 a la sangre en el circuito de ECC tuvo un efecto dramático sobre diversos aspectos de la activación de las plaquetas y las células sanguíneas. En presencia del anticuerpo anti-C5, las plaquetas retuvieron un 50% más de GPIb en comparación con los controles no tratados. De modo semejante, las plaquetas retuvieron virtualmente la totalidad de su GPIIb-IIIa superficial mientras que las plaquetas no tratadas perdieron el 80% de este receptor. La activación de las plaquetas tal como se determina mediante la expresión de P-selectina fue inhibida por completo por la adición de anticuerpo anti-C5. La formación de conjugados de plaquetas y monocitos y/o plaquetas y neutrófilos fue inhibida mediante la adición de anticuerpo anti-C5. Además, la expresión de CD11b en los neutrófilos fue bloqueada en un 75% por el anti-C5 mientras que la expresión de CD11 en los monocitos no fue afectada.

Estos resultados muestran que el anticuerpo anti-C5 es un potente inhibidor de la activación de las plaquetas inducida por el complemento, de la activación de los leucocitos, específicamente, la activación de los PMN y de la adhesión entre plaquetas y leucocitos durante la circulación extracorporal y que los componentes terminales del complemento, y no el C3a, son mayoritariamente responsables de la inflamación mediada por el complemento y de la disfunción de las plaquetas.

A lo largo de la presente solicitud se hace referencia a diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patente. Las enseñanzas y descripciones de dichas publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en su totalidad a la presente solicitud por referencia para describir más ampliamente el estado de la técnica a la que pertenece la presente solicitud.

Aunque las formas de realización preferidas y otras formas de realización de la presente invención han sido descritas en la presente memoria, los expertos en la materia apreciarán que son posibles otras formas de realización sin apartarse por ello del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

1. Utilización de un anticuerpo anti-C5 para la preparación de un medicamento destinado a reducir las disfunciones de los sistemas inmunitario y/o hemostático durante la circulación extracorporal de la sangre.

2. Utilización de un anticuerpo que se une específicamente al componente C5 del complemento, para la preparación de un medicamento destinado a reducir las disfunciones de los sistemas inmunitario y/o hemostático durante la circulación extracorporal de la sangre mediante la reducción de por lo menos una de entre activación del complemento, activación de las plaquetas, activación de los leucocitos o adhesión entre plaquetas y leucocitos resultantes del paso de la sangre circulante a través de un conducto con una superficie de lumen que comprende un material capaz de producir por lo menos una de entre activación del complemento, activación de los leucocitos y adhesión plaqueta-leucocito en la sangre de un paciente.

3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el anticuerpo reduce la conversión del componente C5 del complemento en los componentes C5a y C5b del complemento.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo se une de forma específica a C5b.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la formación del componente C3b del complemento.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el proceso de circulación extracorporal de la sangre es un proceso de "bypass" cardiopulmonar.