ES2236743T3 - Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolitica de polipeptidos con actividad de proteasa hcv ns3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento. - Google Patents

Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolitica de polipeptidos con actividad de proteasa hcv ns3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento.

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ES2236743T3 ES96926574T ES96926574T ES2236743T3 ES 2236743 T3 ES2236743 T3 ES 2236743T3 ES 96926574 T ES96926574 T ES 96926574T ES 96926574 T ES96926574 T ES 96926574T ES 2236743 T3 ES2236743 T3 ES 2236743T3
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Antonello Pessi
Elisabetta Bianchi
Marina Taliani
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Andrea Urbani
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Frank Narjes
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Abstract

EL PROCESO DE CONFORMIDAD CON LA PRESENTE INVENCION PERMITE LA EXPRESION Y AISLAMIENTO DE POLIPEPTIDOS CON LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA PROTEASA NS3 DE HCV EN UNA FORMA PURA Y CATALITICAMENTE ACTIVA, Y EN CANTIDADES QUE SON SUFICIENTES PARA EL DESCUBRIMIENTO DE INHIBIDORES DE LA PROTEASA NS3 Y PARA LA DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA PROTEASA NS3. UN OBJETO ADICIONAL DE LA PRESENTE INVENCION ES UN PROCEDIMIENTO QUE DEFINE LAS CONDICIONES FISICAS Y QUIMICAS NECESARIAS PARA LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE DICHOS POLIPEPTIDOS. LA INVENCION SE REFIERE ADICIONALMENTE A NUEVAS COMPOSICIONES DE MATERIA (VECTORES DE EXPRESION) QUE CONTIENEN SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS CAPACES DE EXPRESAR LOS POLIPEPTIDOS MENCIONADOS EN CELULAS EN CULTIVO. FINALMENTE, SE DEFINEN NUEVAS COMPOSICIONES DE MATERIA, ADECUADAS PARA MEDIR LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA MENCIONADA, Y UTILES PARA DESARROLLAR INHIBIDORES DE LA PROTEASA NS3 Y EN CONSECUENCIA AGENTES TERAPEUTICOS PARA SU USO CONTRA HCV. LA FIGURA MUESTRA LOS PARAMETROS CINETICOS DE LA PROTEASA NS3 DE HCV EMPLEANDO EL SUSTRATO DEPSIPEPTIDOS S3 (SEQ ID NUM. 45).

Description

Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolítica de polipéptidos con actividad de proteasa HCV NS3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento.
La presente invención se refiere a la biología molecular y a la virología del virus de la hepatitis C (VHC). Más específicamente, la invención tiene como su sujeto un ensayo enzimático capaz de seleccionar, para propósitos terapéuticos, los compuestos que inhiben la actividad enzimática asociada a la NS3.
Como se sabe, el virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de la hepatitis no-A, no-B (NANB). Se estima que el VHC ocasiona al menos el 90% de hepatitis vírica NANB post-transfusional y el 50% de hepatitis vírica NANB esporádica. Aunque se ha hecho gran progreso en la selección de donantes de sangre y la caracterización inmunológica de sangre usada para transfusiones, todavía existe un gran número de infecciones de VHC entre receptores de transfusiones de sangre (un millón o más infecciones cada año en todo el mundo). Aproximadamente el 50% de individuos infectados por VHC desarrolla cirrosis hepática en un período que puede variar entre 5 y 40 años. Además, estudios clínicos recientes sugieren que existe una correlación entre infección por VHC crónica y el desarrollo de carcinoma hepatocelular.
El VHC es un virus envuelto que contiene un genoma positivo de ARN de aproximadamente 9,4 kb. Este virus es un miembro de la familia Flaviviridae, los otros miembros de los cuales son los flavivirus y pestivirus.
El genoma de ARN del VHC se ha mapeado recientemente. La comparación de secuencias entre los genomas de VHC aislados en diversas partes del mundo ha mostrado que estas secuencias pueden ser extremadamente heterogéneas. La mayoría del genoma del VHC está ocupado por una fase abierta de lectura (ORF) que puede variar entre 9030 y 9099 nucleótidos. Esta ORF codifica una proteína viral individual, la longitud de la cual puede variar entre 3010 y 3033 aminoácidos. Durante el ciclo de infección viral, la poliproteína se procesa proteolíticamente en los productos génicos individuales necesarios para la replicación del virus.
Los genes que codifican las proteínas estructurales del VHC se localizan en el extremo 5' de la ORF, mientras que la región que codifica las proteínas no estructurales ocupa es resto de la ORF.
Las proteínas estructurales constan de C (núcleo, 21 kDa), E1 (envuelta, gp37) y E2 (NS1, gp61). C es una proteína no glicosilada de 21 kDa que probablemente forma el nucleocápsido viral. La proteína E1 es una glicoproteína de aproximadamente 37 kDa, que se cree que es una proteína estructural para la otra envuelta viral. E2, otra glicoproteína de membrana de 61 kDa, es probablemente una segunda proteína estructural en la envuelta externa del virus.
La región no estructural comienza con NS2 (p24), una proteína hidrófoba de 24 kDa cuya función se desconoce.
La NS3, una proteína de 68 kDa que sigue a NS2 en la poliproteína, se predice que tiene dos dominios funcionales: un dominio serina proteasa dentro de los primeros 200 aminoácidos amino terminal, y un dominio ATPasa dependiente de ARN en el extremo carboxi.
La región génica NS4 codifica NS4A y NS4B (p26), dos proteínas hidrófobas de 6 y 26 kDa, respectivamente, cuyas funciones no se han clarificado todavía completamente.
La región génica de NS5 también codifica dos proteínas, NS5A (p56) y NS5B), de 56 y 65 kDa, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos presentes en todas las ARN polimerasas dependientes de ARN se pueden reconocer dentro de la región NS5. Esto sugiere que la región NS5 contiene componentes de la maquinaria de replicación viral.
Diversos estudios biológicos moleculares indican que la peptidasa señal, una proteasa asociada con el retículo endoplásmico de la célula hospedadora, es responsable del procesamiento proteolítico en la región no estructural, que se dice que está en los sitios C/E1, E1/E2, y E2/NS2.
La serina proteasa en NS3 es responsable de la escisión en las conexiones entre NS3 y NS4A, entre NS4A y NS4B, entre NS4B y NS5A y entre NS5A y NS5B. En particular se ha encontrado que la escisión realizada por esta serina proteasa deja una cisteína o un residuo treonina en el lado amino terminal (posición P1) y un residuo alanina o serina en el lado carboxi-terminal (Posición P'1) del sitio de escisión. Se ha mostrado que la proteasa contenida en NS3 es una proteína heterodimérica in vivo, que forma un complejo con la proteína NS4A. La formación de este complejo incrementa la actividad proteolítica en los sitios NS4A/NS4B y NS5A/NS5B, y es un requisito necesario para el procesamiento proteolítico del sitio NS4B/NS5A.
Una segunda actividad proteasa del VHC parece que es responsable de la escisión entre NS2 y NS3. Esta actividad proteasa está contenida en una región que comprende tanto la parte de NS2 como la porción de NS3 que contiene el dominio serina proteasa, pero no usa el mismo mecanismo catalítico que el último.
Una sustancia capaz de interferir con la actividad proteolítica asociada a la proteína NS3 podría constituir un nuevo agente terapéutico. En efecto, la inhibición de esta actividad proteasa implicaría la detención del procesamiento proteolítico de la región no estructural y, por consiguiente, evitaría la replicación viral de las células infectadas.
Esta secuencia de casos se ha verificado para el flavivirus homólogo, que, a diferencia del VHC, infecta cultivos de líneas celulares. En este caso, se ha mostrado que las manipulaciones genéticas que implican la generación de una proteasa no es más capaz de llevar a cabo su actividad catalítica, suprime la capacidad del virus de repicarse (1).
Además, se ha mostrado de manera amplia, tanto in vitro como en estudios clínicos, que los compuestos capaces de interferir con la actividad proteasa del VIH son capaces de inhibir la replicación de este virus (2).
Los procedimientos usados para generar moléculas con potencial terapéutico los conocen los que operan en este campo. Hablando en términos generales, las colecciones de compuestos que contienen un gran número de entidades químicas individuales con una alta diversidad molecular se hacen para someterse a un ensayo automático con el fin de identificar agentes activos individuales, que después se someten a posteriores modificaciones químicas con el fin de mejorar su potencial terapéutico. Otros planteamientos pueden incluir modificación racional de sustratos o ligandos de proteína específica diana, con el propósito de desarrollar compuestos de alta afinidad de unión capaces de alterar o suprimir la actividad biológica de la proteína bajo examen. La determinación de la estructura tridimensional de una proteína diana, por medio de procedimientos conocidos en el sector como cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN) permite el diseño racional de moléculas capaces de unirse específicamente a la proteína y que, como resultado de esto, tienen la capacidad de interferir con las propiedades biológicas de esa proteína.
La investigación sobre compuestos capaces de interferir con la actividad biológica de la proteasa contenida en la proteína NS3 del virus de la hepatitis C está dificultada por la dificultad en la producción de cantidades suficientes de proteína purificada con propiedades catalíticas no alteradas, y por la necesidad de usar co-factores que potencian la actividad de la enzima in vitro.
Por lo tanto existe una necesidad en el campo específico de un procedimiento para producir NS3, o productos similares, en grandes cantidades que ha sido posible en el pasado, y con una actividad in vitro suficiente para seleccionar inhibidores.
La presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados y purificados, con la actividad proteolítica de la proteína NS3 del VHC, caracterizada por el hecho de que tienen una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5.
También se describen los vectores de expresión que producen los polipéptidos representados por las secuencias SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5 que tienen la actividad proteolítica de la NS3 del VHC que comprende:
-
un polinucleótido que codifica uno de dichos polipéptidos;
-
secuencias de regulación, transcripción y traducción funcional en dicha célula hospedadora, unida operativamente a dicho polinucleótido que codifica uno de dichos polipéptidos; y
-
opcionalmente un marcador seleccionable.
También se describe una célula hospedadora, bien eucariótica o procariótica, transformada usando un vector de expresión que contiende una secuencia de ADN que codifica las SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5 de tal forma que permite que dicha célula hospedadora exprese el polipéptido codificado específico en al secuencia elegida. También se describe un procedimiento para la preparación de polipéptidos con una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5, caracterizadas por el hecho de que comprende, en combinación, las siguientes operaciones:
-
transformación de una célula hospedadora, bien eucariótica o procariótica, usando uno de los vectores de expresión mencionados anteriormente; y
-
expresión de la secuencia de nucleótidos deseada para producir el polipéptido elegido; y
-
purificación del polipéptido así obtenido, evitando protocolos de resolubilización.
También se describe un procedimiento de reproducción in vitro de la actividad proteolítica de la proteasa NS3 del VHC, caracterizada por el hecho de que la actividad de polipéptidos purificados, con secuencias elegidas entre el grupo que comprende las SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5, similar a NS3, se reproduce en una solución que contiene Tris 30-70 mM pH 6,5-8,5, ditiotreitol 3-30 mM (DTT), 3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato (CHAPS) al 0,5-3% y glicerol al 30-70% a temperaturas de entre 20 y 25ºC y por el hecho de que en estas condiciones la actividad de los polipéptidos anteriormente mencionados se pueden determinar y cuantificar cinéticamente sobre sustratos peptídicos incluso en la ausencia de co-factores.
La presente invención tiene como objeto un ensayo de la actividad proteasa de los polipéptidos de las SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5. El ensayo se puede realizar escindiendo un sustrato que proporciona productos detectables. La escisión preferiblemente se detecta usando procedimientos basados en señales radiactivas, colorimétricas o frluorimétricas. Son también adecuados los procedimientos tales como HPLC y similares. De acuerdo a la presente invención, los sustratos usados son péptidos sintéticos correspondientes a la unión NS4A/4B de la poliproteína de VHC. Si es necesario, los péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID. Nº 6, o partes de la misma, se pueden usar como co-factor de la proteasa NS3.
Los péptidos adecuados para uso como sustratos son los péptidos representados por la secuencia SEC ID. Nº 7 y los derivados de la misma con supresiones N y/o C-terminal (SEC ID números 8-12, 14, 18-20) y el péptido representado por la secuencia ID Nº: 47. Particularmente adecuados son los decapéptidos representados por las secuencias SEC ID números 18-20, específicamente las SEC ID Nº: 18 y las secuencias derivadas de la misma SEC ID Números 29-32, 35.
Estos péptidos se pueden usar para un ensayo de alto rendimiento de la actividad de la proteasa NS3 a una concentración de esta última de entre 100-200 nM.
De acuerdo a la invención los sustratos de depsipéptidos (péptidos con al menos un enlace éster en las secuencias) también se pueden usar de manera ventajosa durante un ensayo de alto rendimiento de la actividad de la proteasa NS3. De hecho, se sabe que es deseable llevar a cabo el ensayo a la concentración de enzima más baja posible compatible con conversión de sustrato suficiente. Esto maximiza la sensibilidad a la inhibición y permite seleccionar los inhibidores que están presentes a concentraciones muy bajas en mezclas de compuestos o genotecas combinatorias. Los sustratos para la NS3 con una amida patrón en el enlace escindible entre los residuos P1 y P1' tienen valores de K_{cat}/K_{m} entre 30-100 M^{-1} s^{-1}. Esto establece un intervalo práctico de concentración de enzima para un ensayo de alto rendimiento de 100-200 nM. Para reducir esta concentración es necesario usar sustratos con valores de K_{cat}/K_{m} más altos. Los sustratos que contiene un enlace éster entre P1 y P1' son idealmente adecuados para esto, ya que al formación del intermedio acilo-enzima se lleva a cabo mucho más fácilmente debido a la reacción de transesterificación más termodinámicamente favorable (8). Los sustratos de depsipéptido según la invención tienen valores muchos más altos de K_{cat}/K_{m},y esto lleva el intervalo útil de concentración de NS3 en el ensayo de alto rendimiento hasta 0,5-2 nM. Estos sustratos se pueden sintetizar con alto rendimiento en fase sólida mediante metodología química
habitual.
Son adecuados ensayos convencionales para rastreo de alto rendimiento, pero requieren hidrólisis de al menos 10% del sustrato antes de que el producto se pueda detectar de manera conveniente. Esto impide la determinación de las verdaderas velocidades iniciales, que son importantes para estudios cinéticos exactos. Para superar estas dificultades, se ha desarrollado un ensayo que permite el control continuo de la actividad proteasa. El ensayo se basa en sustratos sintéticos especialmente confeccionados, que son capaces de dirigir, la generación de señal continua que es directamente proporcional al grado de hidrólisis de sustrato, evitando así la necesidad de separación del sustrato del producto de reacción. Los depsipéptidos usados (SEC ID números 45 y 46), las fórmulas químicas de las cuales se proporcionan en la figura 12, son sustratos fluorogénicos inactivados internamente basándose en transferencia de energía de resonancia (RET). Contienen un dador fluorescente, ácido 5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico (EDANS), cerca de un extremo del péptido, y un grupo aceptor, ácido 4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico (DABCYL) cerca del otro extremo. La fluorescencia de este tipo de sustrato se inactiva inicialmente mediante RET intramolecular entre el dador y aceptor, pero a medida de que la enzima escinde el sustrato la fluorescencia aumenta. EDANS y DABCYL se seleccionaron como un par dador/aceptor debido la superposición espectral excelente entre la emisión fluorescente del anterior y la absorción de este último (13-17). La eficacia de RET depende de la distancia entre el dador y el aceptor, es decir, cuanto más cerca de los dos, más alta es la inactivación. Para la pareja EDANS/DABCYL, la distancia Förster para la transferencia de energía al 50% (R_{0}) es de 33 \ring{A}. La distancia máxima entre EDANS/DABCYL reseñada en un sustrato es 11 aminoácidos (19) que, asumiendo una conformación extendida para el péptido, corresponde a R = 39,8 \ring{A}, con una eficacia de RET calculada de 24,5%. Esto corresponde a un incremento de 10 veces en fluorescencia tras la escisión del sustrato.
Hasta este punto se ha proporcionado una descripción general en la presente invención. Con la ayuda de los siguientes ejemplos, una descripción más detallada de las realizaciones específicas de las mismas se proporcionarán ahora, con el fin de proporcionar un mejor entendimiento de los objetivos, características, ventajas y procedimientos operativos de la invención.
La figura 1 muestra el vector del plásmido usado para transferencia y expresión del polipéptido representado por la SEC ID Nº: 1 en células 9 del clon de Spodoptera frugiperda.
Las figuras 2A y 2B muestran los vectores de plásmido para transferencia y expresión en E. coli de los polipéptidos representados por las secuencias SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5 respectivamente.
La figura 3 muestra la actividad de la NS3 en función de la concentración de glicerol.
La figura 4 muestra la actividad de la NS3 en función de la concentración de CHAPS, 3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato.
La figura 5 muestra la actividad de la NS3 en función del pH.
La figura 6 muestra la actividad de la NS3 en función de resistencia iónica.
La figura 7 muestra un diagrama de ensayo enzimático para medir la actividad de la NS3 que usa como sustrato un péptido Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala – Ser - His - Leu - Pro Tyr - Lys - \epsilon - (3^{H}) - Ac (SEC ID Nº 47.
La figura 8 muestra el diagrama de reacción para la síntesis del sustrato del depsipéptido S1 representado por la secuencia SEC ID Nº: 42.
La figura 9 muestra el diagrama de reacción para la síntesis del sustrato del depsipéptido S2 representado por la secuencia SEC ID Nº: 43.
La figura 10 muestra el diagrama de reacción para la síntesis del sustrato de depsipéptido radiactivo S1 representado por la secuencia SEC ID Nº: 44.
La figura 11 muestra un ensayo de alto rendimiento, basado en señales radiactivas, para determinar la actividad de la proteasa NS3.
La figura 12 muestra la fórmula química de los sustratos depsipeptídicos (SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 46) para un ensayo continuo de la actividad de NS3 basada en la inactivación de la fluorescencia intramolecular de RET.
La figura 13 muestra el diagrama de reacción para la síntesis del sustrato depsipeptídico S3 (SEC ID Nº: 45).
Las figuras 14A y 14B muestran, respectivamente los parámetros cinéticos para la proteasa NS3 con el sustrato S3 (SEC ID Nº: 45) y fluorescencia en función del tiempo en el ensayo relevante.
Ejemplo 1 Procedimiento de expresión de la proteasa NS3 del VHC en células cultivadas 9 del clon de Spodoptera frugiperda
Los sistemas para la expresión para genes foráneos en células cultivadas de insecto, tales como células 9 del clon de Spodoptera frugiperda infectadas con vectores de baculovirus se muestran en la técnica (3). Genes heterólogos se colocan usualmente bajo el control del promotor fuerte de polihedrina del virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica o virus de polihedrosis nuclear de Bombix mori. Los procedimientos para la introducción de ADN heterólogo en el sitio deseado en los vectores baculovirales mediante recombinación homóloga se conocen también en la técnica (4).
El vector del plásmido pBacNS3 (1039-1226) es un derivado de pBlueBacIII (Invitrogen) y se construyó para la transferencia de un gen que codifica un polipéptido con la actividad de NS3 (1039-1226). Para este propósito, la secuencia de nucleótidos que codifica este polipéptido descrito en la SEC ID Nº: 1 se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos que insertan un codón ATG en 5' y un codón de parada TAG en 3' en la secuencia. El fragmento obtenido de esta forma en el sitio BamH1 del vector pBueBacIII, después del tratamiento con el fragmento de polimerasa de ADN Klenow. El plásmido se ilustra en al figura 1.
Células 9 (Sf9) del clon de Spodoptera frugiperda y kits de recombinación de baculovirus se compraron en Invitrogen. Las células se desarrollaron en placas o en una suspensión a 27ºC en medio de insecto completo de Grace (Gibco) conteniendo suero bovino fetal al 10% (Gibco). La transfección, recombinación, y selección de construcciones de baculovirus se realizaron según recomendó el fabricante.
Para la expresión de proteínas, las células Sf9 se infectaron con el baculovirus recombinante a una densidad de 2 x 10^{6} células por ml en una relación de aproximadamente 5 partículas de virus por célula. Las células se cultivaron en suspensión durante 72 horas a 23ºC. Reduciendo la temperatura desde 27ºC, que se corresponde normalmente a la temperatura de crecimiento óptima, hasta 23ºC es crucial con el fin de obtener una proteína activa y soluble.
Después de recoger las células mediante centrifugación y lavándolas con PBS (fosfato sódico 20 mM pH 7,4, NaCl 140 mM) el sedimento se resuspendió en fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 20%, 3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato (CHAPS) al 0,5%, ditiotreitol 10 mM (DTT), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. Las células se destruyeron a 4ºC mediante cuatro ciclos de sonicación a 10 W con una duración de 30 segundos cada uno, usando un instrumento Branson 250. El homogenato obtenido de esta forma se centrifugó mediante centrifugación a 120.000 x g durante una hora y el sobrenadante se cargó en una columna de S-Sefarosa HR26/10 equilibrada con fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 10%, DTT 2 mN, EDTA 1 mM, CHAPS al 0,1% a un caudal de 2 ml/min. Después de lavar con dos volúmenes de columna la proteasa se eluyó con un gradiente de NaCl entre 0 y 1 M. Las fracciones que contenían la proteasa se identificaron usando metodología de transferencia de Western con anticuerpos policlonales específicos de NS3, se concentraron hasta 3 ml usando una célula de ultrafiltración de Amicon equipada con una membrana Ym10 y se cromatografió en una columna Superdex 75 HR26/60 (Pharmacia) equilibrada con fosfato sódico 50 mM pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 2 mM, CHAPS al, 0,1%, ESTA 1 mM y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que contenían la proteasa se reunieron y se sometieron adicionalmente a cromatografía sobre una columna Mono-S HR5/5 (Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón usado en la columna anterior. La proteasa se eluyó en forma pura de esta columna, aplicando un gradiente de NaCl lineal entre 0 y 0,5 M. La proteasa se almacenó a -80ºC en glicerol al 50%, CHAPS al 0,5%, DTT 10 mM y fosfato sódico 50 mM pH 7,5. El rendimiento del procedimiento es 0,5 mg/l de células. La proteían purificada tiene una actividad catalítica K_{cat}/K_{m} = 120-200 M^{-1} s^{-1} medida en Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 2%, DTT 30 mM a 23ºC usando el sustrato del péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7), derivada del sitio de escisión de poliproteína entre NS4A y NS4B. Los productos de escisión que derivan de esta reacción se separaron usando HPLC, se aislaron y se identificaron mediante espectrometría de masa, confirmando que la escisión proteolítica tuvo lugar entre cisteína y alanina. La concentración de proteasa necesaria para determinar la actividad estaba entre 100 nM y 1,6 \muM.
Ejemplo 2 Procedimiento de expresión de la proteasa NS3 del VHC en E. coli
Los plásmidos pT7-7 (NS3 1039-1226), pT-7 (NS3 1039-1206), pT7-7 (NS3 1027-1206) y pT7-7 (NS3 1033-1206), descritos en las figuras 2A y 2B, se construyeron con el fin de permitir la expresión en E. coli de los polipéptidos indicados en las SEC ID. Nº: 2 y SEC ID. Nº: 3, y SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº 5, respectivamente. Los fragmentos proteicos contienen variantes del dominio de proteasa de la proteína NS3 del VHC. Los fragmentos respectivos del ADNc del VHC se clonaron cadena abajo del promotor \varnothing10 del bacteriófago T7 y en un marco con el primer codón ATG de la proteína del gen 10 del fago 7, usando procedimientos que se conocen en la práctica. Los plásmidos pT7-7 que contienen las secuencias de NS3 también contienen el gen para la enzima \beta-lactamasa que se puede usar como marcador de una selección de células de E. coli transformadas con estos plásmidos.
Después los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli BL21 (DE53), que se emplea normalmente para la expresión a alto nivel de los genes clonados en vectores de expresión que contienen el promotor de T7. En esta cepa de E. coli, el gen de la polimerasa de T7 se lleva a cabo sobre el bacteriófago \lambda DE53, que se integra en el cromosoma de las células BL21 (5). La expresión a partir del gen de interés se induce mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) al medio de crecimiento según un procedimiento que se ha descrito previamente (5). Sobre el 90% de las proteínas expresadas usando uno de los plásmidos mencionados anteriormente se encuentra en una forma insoluble en los cuerpos de inclusión, a partir de los cual es posible obtener una proteína soluble y activa siguiendo los procedimientos de replegamiento conocidos en el campo (véase por ejemplo (6)). Los protocolos de replegamiento tienen a menudo rendimientos variables de proteína catalíticamente activa, y requieren condiciones extremadamente controladas, o producen modificaciones irreversibles de la proteína (tal como carbamilación en presencia de urea), o requieren procedimientos no prácticos, tales como el uso de soluciones de proteínas extreamademnet diluidas, o diálisis de volúmenes de muestras excesivamente grandes.
Para evitar estos problemas, se ha desarrollado un problema, que se describe más adelante, para la producción de la proteasa del VHC en una forma soluble y activa, evitando así protocolos de resolubilización: E. coli BL21 (DE53) transformado usando uno de los plásmidos mencionados anteriormente se desarrollaron a 37ºC hasta que alcanza una densidad celular que produce absorción de 0,8 de DO (DO significa densidad óptica) a 600 nm. En este punto la temperatura se redujo hasta 30ºC en 15-20 minutos y se añadió IPTG 400 \muM para inducir la expresión de al proteína. Después la temperatura se redujo posteriormente hasta 22-24ºC entre un período de 20-30 minutos. Las células se agitaron durante 4 horas adicionales a esta temperatura. En este punto las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron usando PBS.
Procedimiento de purificación
Los sedimentos resultantes a partir de las operaciones descritas anteriormente se incubaron en hielo durante 5 minutos y se resuspendieron en fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 50%, CHAPS al 0,5%, DTT 10 mM, EDTA 1 mM (tampón A) preenfriado hasta 4ºC. Se usaron 10 ml de este tampón para cada litro de cultivo bacteriano. Después de 5-10 minutos de incubación en hielo la suspensión de células se homogeneizó usando una prensa Francesa. El homogenato resultante se centrifugó a 120.000 x g. Los sobrenadantes de esta centrifugación se preservaron en hielo, mientras que los sedimentos se volvieron a suspender en tampón A (1 ml a cada litro de cultivo bacteriano). Después de la adición de MgCl_{2} 1 mM y ADNasa I, la suspensión se incubó durante 10 minutos a 20ºC y se volvieron a centrifugar durante 1 hora a 120.000 x g. El sobrenadante se esta segunda centrifugación se reunió con el primer sobrenadante y la solución de proteínas resultante se adsorbió sobre resina S-Sefarosa (o SP-Sefarosa) (Pharmacia) equilibrada con fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 10%, CHAPS al 0,5%, DTT 3 mM, EDTA 1 mM (tampón B). 10 ml de resina suspendida en 5 ml de tampón B se usaron para cada litro de cultivo bacteriano. La resina se agitó durante 1 hora a 4ºC, se recogió mediante filtración, se lavó con tampón B y se vertió en una columna de cromatografía apropiada. La proteasa se eluyó con gradiente de NaCl entre 0 y 1 M. Las fracciones que contenían la proteasa se identificaron usando transferencia de Western, se reunieron y se concentraron usando concentradores Centriprep 10 (Amicon) hasta que alcanzaron una concentración de 6-10 mg/ml de proteína, se determinaron usando el procedimiento BIORAD. Hasta 3 ml de esta solución se cargó en una columna Superdex 75 HR 26/60 o hasta 20 ml se cargaron en una Superdex 75 HR 26/600 (ambas de Pharmacia) equilibradas con fosfato sódico 50 mM pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 3 mM, CHAPS al 0,5% (tampón C) y se llevó a cabo una cromatografía a 1 ml/min (HR26/60) o 5 ml/min (HR60/600). Las fracciones que contenían la proteasa se reunieron y se purificaron posteriormente mediante cromatografía sobre HR 5/5 Mono S (Pharmacia) equilibrada con tampón C. La proteasa se eluyó de esta columna con un gradiente de NaCl entre 0 y 0,5 M. La purificación hasta homogeneidad también fue posible con la siguiente modificación: después de cada elución de S-Sefarosa las fracciones que contenían la proteasa se diluyeron 1:4 en tampón C y se cargaron sobre Heparina-Sefarosa. La elución de esta resina se obtuvo con un gradiente de NaCl entre 0 y 0,5 M. Después la proteína se cromatografió sobre hidroxiapatita o Superdex 75 como se ha descrito anteriormente. La producción es 1-2 mg de proteína purificada por litro de cultivo bacteriano.
Caracterización de la proteína purificada
La proteína purificada se caracterizó mediante filtración de gel, HPLC de fase inversa, espectrometría de masas y análisis de secuencia N-terminal.
Los experimentos de filtración sobre gel analíticos mostraban que la proteína es monomérica. La proteína expresada usando pT7-7 (NS3 1027-1206) muestra tres picos después de cromatografía de HPLC de fase inversa. El análisis de espectrometría de masas y determinación de la secuencia N - terminal mostró heterogeneidad de la porción N-terminal de la molécula. Se encontraron tres formas, que tienen las siguientes secuencias N-terminal:
1
Para evitar este problema, se adoptaron dos estrategias experimentales:
1.
Homogeneización en presencia de 100 \mug/ml del inhibidor de la proteína quimoestatina. Este inhibidor no inhibe la actividad de la proteasa del VHC, pero inhibe las proteasas de tipo quimotripsina, específicas de residuos aromáticos similares a fenilalanina y tirosina. De esta forma era posible purificar una especie molecular individual con más de 95% de la forma 2.
2.
Producción de una proteasa correspondiente a la forma 3 mediante el plásmido pT7-7 (NS3 1033-1206). De esta forma se purificó una proteína con más de 95% de la forma 3.
Ejemplo 3 Procedimiento para reproducir in vitro la actividad de la proteasa NS3 del VHC Definición de las condiciones químicas y físicas para la reproducción de la actividad
La capacidad de la proteasa purificada para catalizar la escisión del péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7) se ha usado para definir las condiciones óptimas para actividad. La escisión se detectó separando el sustrato de los productos de hidrólisis mediante HPLC de fase inversa. Para este propósito la mezcla que contenía el tampón y el péptido incubado con la proteasa se inyectó en una columna Lichospher RP-18 de fase inversa (Merck) y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético al 0,1%. Los productos de escisión se identificaron mediante co-inyección de patrones apropiados, y mediante espectrometría de masas. Para estos experimentos, se usaron las proteínas producidas por uno de los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 2.
La dependencia de la actividad de la concentración de glicerol se determinó en un tampón que contenía Tris 50 mM pH 7,5, CHAPS al 2%, DTT 30 mM. Se añadieron concentraciones crecientes de glicerol a este tampón, y se determinó la actividad de la proteasa relativa. La figura 3 muestra los resultados de este experimento, indicando que glicerol al 50% (v/v) es el nivel óptimo. En un experimento posterior esta concentración se mantuvo constante a 50% y se varió la concentración de CHAPS (figura 4). De esta forma se encontró que un nivel de CHAPS al 2% (v/p) era la concentración óptima. Es posible reemplazar CHAPS con otros detergentes compatibles con la necesidad de mantener actividad catalítica en los polipéptidos según la invención. Algunos de estos detergentes son: heptil-\beta-D-glucopiranósido, decil-\beta-D-glucopiranósido, decil-\beta-D-glucomaltósido, nonil-\beta-D-glucopiranósido, N-hexil-\beta-D-glucopiranósido, octil-\beta-D-glucopiranósido, octil-\beta-D-tioglucopiranósido, Nonidet P-40, Tween-20.
A concentraciones de CHAPS y glicerol óptimas la proteasa muestra actividad óptima a pH 8,5 (figura 5). A este pH la estabilidad durante el tiempo es, sin embargo, menor que la observada a pH 7,5. Para determinar el efecto de resistencia iónica sobre la actividad, se realizó una valoración usando HCl. Este experimento mostró que la actividad de la proteasa se inhibe a una alta resistencia iónica (figura 9). El análisis cinético de los datos mostró que los iones cloruro son inhibidores competitivos a concentraciones de hasta 100 mM.
Así pues era posible definir las siguientes condiciones óptimas para el ensayo in vitro o purificado de la actividad de la proteasa del VHC: Tris 50 mM 7,5, DTT 3-30 mM, CHAPS al 2%, glicerol al 50%. La dependencia de la actividad sobre la temperatura se analizó mediante una representación gráfica Arrhenius en la que el logaritmo de la constante cinética K_{cat} se proporciona como una función inversa de temperatura. Este gráfico muestra discontinuidad a temperaturas superiores a 25ºC, indicando cambios en conformación simultáneamente con la disminución en actividad. Así pues se determinó la temperatura óptima estaba entre aproximadamente 22-23ºC.
Como se ha mencionado anteriormente, la proteína Ns4A es un cofactor de la proteasa del VHC. Los experimentos de supresión N y C-terminal han definido el péptido Pep4A con la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 6, como el dominio mínimo capaz todavía de inducir activación óptima. En experimentos de transfección o traducción in vitro la adición de polipéptidos que contienen la secuencia mínima de NS4A es esencial para proporcionar escisión eficaz. La adición de Pep4A es capaz de inducir un incremento significativo en la actividad de proteasa purificada en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. Las características cinéticas de esta activación se describen más adelante. Usando un experimento de valoración se determinó una estequiometría de 1:1 para esta interacción a una concentración de 300 nM de proteasa, indicando una Kd < 300 nM.
Definición del sustrato óptimo para ensayo de actividad
Para definir el sustrato mínimo cuya escisión se puede todavía detectar usando el procedimiento de HPLC descrito anteriormente, se sintetizaron derivados del péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7) descrita anteriormente, con supresiones N - y C - terminal. Estos péptidos se incubaron en las condiciones definidas en el capítulo anterior en presencia de proteasa 100 nM - 1,6 \muM. La nomenclatura para los residuos de aminoácidos de los péptidos usados como sustratos que se adopta en lo siguiente es la establecida por Schechter y Berger en (7). Los residuos se definen como Pn . . . . P3, P2, P1, P1', P2', P3 . . . . Pn', donde el enlace hidrolizado es P1-P1' (enlace entre Cys y Ala). La tabal 1 muestra los datos cinéticos para este experimento, definiendo P6 y P3' o P4' como los límites extremos de un sustrato que todavía se escinde eficazmente. Las supresiones más allá de P6 o P3' producen un descenso drástico en eficacia, medida como K_{cat}/K_{m}, con las que el péptido respectivo puede todavía actuar como un sustrato. La supresión de P4' produce un descenso menos marcado de K_{cat}/K_{m}, sin embargo la separación de sustrato y producto de escisión mediante HPLC es significativamente mejor para un decapéptido P6-P4' que para un nonapéptido P6-P3', de esta manera el decapéptido P6-P4' se ha definido el sustrato óptimo.
TABLA 1 Caracterización de sustrato
2
Los parámetros cinéticos, K_{m}, k_{cat} y k_{cat}/K_{m} se determinaron para los decapéptidos P6-P4' correspondiente a los otros sitios de escisión intermolecular NS4B/5A y NS5A/5B y estos datos se compararon con los datos obtenidos usando el péptido P6-P4' correspondiente al sitio NS4A/4B (tabla 2). Estas cinéticas se obtuvieron tanto en ausencia como en presencia de concentraciones estequiométricas de Pep4A. El análisis de los datos cinéticos obtenidos de esta forma indica que el péptido Pep4A afecta preferentemente a k_{cat}. Cuando los valores de k_{cat} para los sustratos individuales se comparan se hace evidente que la presencia de dos cargas negativas en P5 y en P6 determinaban la unión eficaz de un sustrato peptídico. De hecho los decapéptidos correspondientes a los sitios NS4A/4B y NS5A/5B con residuos Asp o Glu en la posición P6 y P5 tiene valores de k_{m} similares y significativamente menores que el péptido correspondiente al sitio NS4B/5A con una carga individual en la posición P6.
TABLA 2 Actividad sobre los péptidos correspondientes para los sitios de escisión en trans
3
Se llevó a cabo una investigación adicional sobre la importancia relativa de residuos individuales en la secuencia P6-P4', correspondiente al sitio de escisión NS4A/4B, mediante mutación de cada aminoácido individualmente a alanina y después determinando los parámetros cinéticos para los péptidos mutantes obtenidos de esta forma. Los resultados se describen en la tabla 3. Este experimento identifica la siguiente escala de importancia de residuos individuales para la escisión eficaz: P1 >> P3 = P5 = P6 > P2 = P4. La modificación de la parte P' no tiene un efecto significativo sobre la velocidad de escisión. Esta información se usó para desarrollar procedimientos de ensayo de actividad de proteasa, útiles para la identificación de inhibidores. Estos procedimientos se describirán más adelante.
TABLA 3 Reemplazo con alanina de los residuos P6-P4' del sustrato peptídico
4 
\vskip1.000000\baselineskip
Para una determinación más detallada de la importancia de los residuos en P6 y P1', se sintetizaron una serie de péptidos P6-P4' en los que se introdujeron modificaciones en estas posiciones. Los resultados de estos experimentos se describen en la tabla 4. Los resultados de estos experimentos subrayan la importancia de una carga negativa en posición P6. De hecho, Asp o Glu en esta posición se aceptan con K_{m} indistinguible. La neutralización de la carga mediante introducción de Asn produce un incremento significativo en K_{m}, mientras la inversión de la carga mediante introducción de un residuo Lys produce un incremento extremadamente marcado en K_{m}.
TABLA 4 Sustitución de los residuos P6 y P4' en el sustrato peptídico
5
La sustitución de Ala en la posición P1' con Ser no tiene efecto significativo, mientras la sustitución con Phe produce una reducción en el sitio de escisión del sustrato resultante, medido como k_{cat}/K_{m}.
Se llevó a cabo un análisis sobre una serie de mutaciones de la posición P1, descrito en la tabla 5. Se acepta la sustitución de cisteína en esta posición con treonina, alilglicina, ácido \alpha-aminobutírico, norvalina y valina, incluso aunque los sustratos resultantes se escinden con una eficacia, expresada como k_{cat}/K_{m}, que es significativamente menor que la del sustrato no modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Sustitución del residuo del sustrato peptídico P1
6
\hskip1,4cm Alg, aliglicina; Abu, ácido \alpha-aminobutírico; Nva, norvalina
La información relativa a la especificidad del sustrato se puede usar tanto para el desarrollo de ensayos enzimáticos como para la síntesis de inhibidores basándose en las secuencias del sustrato modificado. Por ejemplo, los péptidos del sustrato con residuos P1 modificados son inhibidores competitivos de la proteasa con constantes de inhibición Ki de entre 350 y 90 \muM (tabla 6). Estos péptidos se pueden además modificar para incrementar su poder inhibidor mediante la introducción de grupos aldehído, trifluorometilcetona, difluorometilencetona, dicetona, cetoéster, cetoamida o \alpha-cetoheterocíclico, ácido bórico y monoalometilcetona. La información sobre la especificidad puede también permitir la síntesis de inhibidores que no se basan en péptidos, tales como: halo-enolactonas, isocumarinas, \beta-lactamas, succinimidas, pironas, bezoxiazinonas, bezoisotiazolinas o isocianatos latentes.
TABLA 6 Acción inhibidora de los decapéptidos P6-P4' modificados en la posición P1
7
\hskip1,6cm Abu, ácido \alpha-aminobutírico; Alg, alilglicina; Cha, ciclohexilalanina.
Ejemplo 4 Procedimiento de uso de la actividad proteasa in vitro para investigación de inhibidores Ensayo automático usando un sustrato de amida
El péptido Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - \epsilon - (^{3}H) - Ac (SEC ID Nº 47) derivada del sitio de escisión NS4A/NS4B, se escinde mediante la proteasa NS3 con los siguientes parámetros cinéticos: K_{m} = 79 \muM, k_{cat} = 0,49 min^{-1} y k_{cat}/K_{m} = 103 M^{-1} s ^{-1}. 400.000 cpm del péptido marcado con la actividad específica de 2 - 10 Ci/mmol se incubaron durante 3 horas a 23ºC junto con 40 \muM (K_{m} /2) del péptido no marcado en presencia de proteasa 200 nm y 1 \muM de Pep4A en Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 3%, DTT 10 mM. Durante este período se escindió el 20% del sustrato peptídico. El producto de escisión se puede cuantificar siguiendo el procedimiento descrito más adelante y resumido en la figura 7. Como se puede observar a partir de la figura, la mezcla se pone en contacto con un intercambiador iónico TSK-DEAE. La fracción que se produce del intercambiador se filtra, se deja que sedimente o se centrifuga. Se mide la radiactividad sobre la fracción transparente, la cantidad de la cual está exclusivamente relacionada con el fragmento derecho (terminal-C), dado que el sustrato amida y el fragmento a la izquierda permanecen unidos al intercambiador aniónico. La adición de inhibidores produce un descenso en la velocidad relativa del fragmento escindido marcado. Cuando más eficaz es el inhibidor, menor será la radiactividad medida en la fracción que se produce del intercambiador aniónico.
Ejemplo 5 Síntesis del sustrato depsipeptídico S1
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu -\Psi -[COO]- Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2} (SEC
ID Nº 42)
La síntesis se realizó completamente en fase sólida usando el procedimiento de flujo continuo Fmoc-poliamida (9). La combinación de grupos protectores era base-lábil N\alpha-Fmoc para el grupo \alpha-amidno y protección ácido-lábil para las cadenas laterales: Asp (Ot-Bu), Glu (Ot-Bu), Tyr (T-Bu) e His (trt). El polímero usado era compuesto Kieselguhr-poliamida (9) derivatizado con un engarce amida Rink modificado (10), ácido p-[(R,S)-a-[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]fenoxiacético (11) (NovaSyn® KR 125, 0,1 mmoles/g). La resina, derivados de aminoácidos, agentes de activación y todos los otros reactivos eran de la calidad más alta disponible de fuentes comerciales. La síntesis se llevó a cabo según los esquemas proporcionados en la figura 8. Los acoplamientos se llevaron a cabo con un exceso 5 veces de aminoácido activado sobre los grupos amino exentos de resina, usando activación por Fmoc-aminoácido/PyBOP/HOBt/DIEA (1:1:1:1:2) excepto para ácido L-(+)-láctico cuando se usó la activación por Fmoc-aminoácido/DIPC/HOBt (1:1:1:1). La esterificación de Abu al grupo hidroxilo libre de ácido láctico se realizó usando el anhídrido simétrico (Fmoc-Abu) 2O en presencia de una cantidad catalítica (0,1 equiv.) de DMAP, durante 30 minutos a temperatura ambiente (12): la reacción se repartió dos veces para lograr un rendimiento de 90%; en la ausencia de catalizador, los hidroxilos libre restantes son no reactivos en las operaciones sintéticas posteriores. Al final del ensamblaje, la resina se lavó con DMF metanol y CH_{2}Cl_{2}, después se secó a vacío durante 16 horas. El péptido-resina seco se trató con TFA/agua/triisopropilsilano (92,5:5:2,5) durante 1,5 horas a temperatura ambiente; la resina se filtró y el péptido precipitó con metil t-Bu éter frío; el precipitado se volvió a disolver en agua al 50%/acetonitrilo conteniendo TFA al 0,1% y se liofilizó.
La purificación hasta > 98% de homogeneidad se logró a través de HPLC preparativa sobre una columna Nucleosyl C-18 (250 x 21 mm, 7 \muM) usando como eluyentes (A) agua y (B) acetonitrilo con TFA al 0,1%, y una etapa de gradiente de 22% B durante 5 minutos, después 22-27% B durante 25 minutos, caudal 12 ml/min. En estas condiciones el péptido eluye a 21,9 minutos. Las fracciones que contienen el material puro se reunieron y se liofilizaron: rendimiento 35%.
Ejemplo 6 Síntesis química del sustrato depsipetídico S2
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Thr - \Psi -[COO]- Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2} (SEC
ID Nº 43)
La síntesis se realizó como se ha descrito en el ejemplo anterior. La esterificación de Thr a ácido láctico requirió tres repeticiones para obtener un rendimiento de 70%, que también se acompañó por 3% de racemización del residuo Thr. El diastereoisómero D-Thr sin embargo se resolvió bien cromatográficamente a partir del isómero L, y se resolvió fácilmente mediante HPLC preparativa. El gradiente usado era 21% B durante 5 minutos, después 21-22% B durante 20 minutos, con el péptido deseado eluyendo a 19,7 minutos: rendimiento: 24%.
Ejemplo 7 Síntesis del sustrato depsipetídico S1 radiactivo
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu - \Psi - [COO] - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} - [^{3}H] - CH_{3}
CO) - NH_{2} (SEC ID Nº 44)
Al péptido S1 marcado selectivamente sobre el grupo N^{\epsilon} - amino de la lisina C-terminal, el precursor protegido Ac - Asp (Ot - Bu) - Glu (Ot - Bu) - Met - Glu (Ot - Bu) - Glu (Ot - Bu) - Abu - \Psi - [COO] - Ala - Ser (t - Bu) - His (Trt) - Leu - Pro - Tyr (t-Bu) - Lys CONH_{2} se ensambló sobre la resina según el esquema de la figura 10. La única variación con respecto a la síntesis de (N^{\epsilon} - Ac) - S1 era el uso de Fmoc - Lys (Alloc) - OH en lugar de Fmoc - Lys (N^{\epsilon} - Ac) - OH. La protección de Alloc es ortogonal con respecto a los grupos de protección basados en Fmoc y t - Bu, que se retiran con un tratamiento de dos horas con (0) PdP [(Ph_{3})_{4}] en una solución de CHCl_{3} que contiene ácido acético al 5% y N-metilmorfolina al 2,5%.
El péptido - resina seca (0,07 mmoles/g, 60 mg) se hizo reaccionar con [^{3}H] anhídrido acético (25 mCi, 5,7 mCi/moles) durante 16 horas a temperatura ambiente. Después se usó un exceso 10 veces de anhídrido acético no radiactivo para completar la reacción. Después la resina se lavó con DMF y se trató como se ha descrito previamente. Después de HPLC preparativa, se obtuvo > 98% de péptido puro Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu -\Psi-[COO] - Ala - Ser - His – Leu - Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} -[^{3}H] - CH_{3}CO) - NH_{2} con una actividad específica de 0,68 mCi/mmol.
Usando el ensayo basado en HPLC, se obtuvieron los siguientes parámetros cinéticos para el sustrato depsipéptidico radiactivo S1 (SEC ID Nº: 44):
K_{cat} (min^{-1}) = 9
K_{m} (\muM) = 11
K_{cat}/K_{m} (M^{-1} s^{-1}) = 13,636
Usando el mismo ensayo, los parámetros cinéticos para el sustrato radiactivo S2 son
K_{cat} (min^{-1}) = 16
K_{m} (\muM) = 96
K_{cat}/K_{m} (M^{-1} s^{-1}) = 2,780
La síntesis de los sustratos depsipeptídicos radiactivos permite el establecimiento de un ensayo de alto rendimiento para la determinación de la actividad de la proteasa NS3 como se ilustra esquemáticamente en la figura 11. El principio es el siguiente: tanto el sustrato intacto como el fragmento N-terminal que se origina a partir de la escisión enzimática (Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu - OH) son extremadamente ácidas, mientras que el fragmento C-terminal [HO - CH (CH_{3})CO - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys (N^{\epsilon} -[^{3}H] - CH_{3}CO) - NH_{2}] es, según el pH, neutro o básico. Por lo tanto es posible capturar las dos especies ácidas obre una resina de intercambio aniónica, dejando el fragmento C-terminal en solución. Si el fragmento C-terminal contiene un marcador radiactivo (en este caso el acetato tritiado unido covalentemente al grupo \epsilon-amino de la lisina C-terminal), la resina será capaz de discriminar el sustrato procesado a partir de sustrato no procesado, así haciendo posible cuantificar la actividad proteolítica midiendo al cantidad de radiactividad restante en solución después de incubación con la enzima y tratamiento con el intercambiados iónico. El proceso completo es esencialmente el mismo usado en el ensayo de alto rendimiento basándose en el sustrato de amida del ejemplo 4, pero el pH usado en este caso es 7,0 en lugar de 7,5 para minimizar la hidrólisis espontánea del enlace éster (0,6%/hora a 23ºC).
Ejemplo 8 Síntesis de los sustratos depsipeptídicos S3 y S4
Ac - Asp - Glu - Asp - (EDANS) - Glu - Glu - Abu -\Psi - [COO] - Ala - Ser – Lys - (DABCYL) NH_{2} (SEC ID Nº 45) y Ac - Asp - Asp - (EDANS) - Met - Glu - Glu - Abu - \Psi - [COO] - Ala - Ser - Lys - (DABCYL) NH_{2} (SEC ID Nº 46)
La fórmula química de los dos sustratos S3 y S4 se muestra en la figura 12.
La síntesis se realizó en fase sólida como se detalla en el esquema de la figura 13 para S3 (SEC ID Nº: 45), haciendo uso de dos derivados especiales, Fmoc - Asp (EDANS) - OH y Fmoc - Lys (DABCYL) - OH, preparado según los procedimientos conocidos (16-17). Todos los acoplamientos, incluyendo Asp (EDANS) y Lys (DABCYL), se realizaron con 5 veces de exceso de aminoácido activado sobre los grupos amino exentos de resina, usando activación por Fmoc-aminácido/PyBOP/HOBt/DIEA (1:1:1:2), con la excepción del ácido L-(+)-láctico cuando se usó la activación por Fmoc-aminoácido/DIPC/HOBt (1:1:1:1). La esterificación de Abu al grupo hidroxilo libre de ácido láctico se realizó usando el anhídrido simétrico (Fmoc-Abu)_{2}O en presencia de una cantidad catalítica (0,1 equiv.) de DMAP, durante 30 minutos a temperatura ambiente (12): la reacción se repartió dos veces para lograr un rendimiento de 92%. Al final del ensamblaje, el péptido-resina se lavó y el péptido se escindió como se ha descrito para el sustrato S1.
La purificación hasta > 98% de homogeneidad se logró a través de HPLC preparativa sobre una columna Nucleosyl C-18 (250 x 21 mm, 7 \muM) usando como eluyentes (A) acetato amónico 50 mM, pH 6 y (B) acetonitrilo. El gradiente usado para tanto S3 como S4 era 20% B durante 5 minutos, después 20-40% B durante 20 minutos, caudal 20 ml/min; las fracciones que contenían el material puro se reunieron y se liofilizaron: rendimiento 45% y 35% para S3 y S4, respectivamente. Los parámetros cinéticos para este sustrato, se evaluaron a través del ensayo basado en HPLC (véase la figura 14A), eran los siguientes:
K_{cat} (min^{-1}) = 3,51
K_{m} (\muM) = 10,95
K_{cat}/K_{m} )M^{-1} s^{-1}) = 5342
El tampón usado para el ensayo es el siguiente: DTT 33 mM, Tris 50 mM, pH 7, glicerol al 50%, CHAPS al 2%. La incubación se lleva a cabo a pH 7,0 para minimizar la hidrólisis espontánea del enlace éster. El ensayo se puede llevar a cabo en una cubeta o en una placa de microtitulación (96 pocillos), controlando la fluorescencia en función del tiempo (longitud de onda de excitación 355 nM, longitud de onda de emisión 495 nM). El incremento en fluorescencia tras la escisión del sustrato es 13 veces. La reacción es lineal como se muestra en la figura 14B (concentración de sustrato fija = 2 \muM). El límite de detección se estableció como 1 nM para el ensayo en microplacas de alto rendimiento y 520 pM para el ensayo basado en HPLC. Si se realiza un ensayo continuo (cubeta) para establecer las velocidades iniciales para la reacción enzimática, el límite inferior para la concentración enzimática es 80 nM, debido a que la inactivación de fluorescencia del sustrato escindido a las concentraciones de sustrato más altas que 10
\muM.
Depósitos
Cepas de E. coli DH1 transformadas usando los plásmidos pBac (1039-1226), pT7-7 (1039-1226), pT7-7 (1039-1206), pT7-7 (1027-1206) y pT7-7 (1033-1206), que codifican, respectivamente, los polipéptidos con las secuencias SEC ID Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº 5, se depositaron el 14 de agosto de 1995 con The National Collections of Industrial and Marine Bacterial Ltd (NCIMB), Aberdeen, Escocia, Reino Unido, con números de acceso NCIMB 40761, NCIMB 40762, NCIMB 40763, NCIMB 40764 y NCIMB 40765.
Referencias
1. Chambers, T. J: et al 1990, Evidence that the N-terminal domain of non structural protein NS3 from yellow fever virus is serine protease responsible for site specific cleavages in the viral polyprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8898-8902.
2. Lam, P.Y. S. et al, 1994, Rational design of potent, bioavailable, nonpeptide cyclic ureas as HIV protease inhibitors, Science 263, 380-384.
3. Luckow, V.A., Baculovirus systems for the expression of human gene products, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4, 564-572.
4. O'Reilly, D.R., Miller, L.K., Luckow, V.A., (1992), Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York.
5. Studier and Moffatt, Use of Bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high level expression of cloned genes, (1986), J. Mol. Biol. 189, 113-130.
6. Thatcher and Hitchcock, Protein folding in Biotechnology, in: Mechanism of protein folding (edited by R.H. Pain), 226-263, IRL Press Oxford, New York, Tokyo, (1994).
7. Schechter and Berger, 1968, On the size of the active site in proteases I papain, Biochem. Biophys, Res. Communs. 27, 127-162.
8. Fersht, A. (1985) Enzyme structure and mechanism, W.H. Freeman, New York.
9. Atherton, E., Brown, E., Sheppard, R.C. y Rosevear, A. (1981) J. Chem. Soc., Chem. Con nun., 1151.
10. Rink, H. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 3782.
11. Bernatowicz, M.S., Daniels, S.B. y Koster, H. (1989) Tetrahedron Lett. 30, 4645.
12. Atherton, E. and Sheppard, R.C. (1989) Solid phase peptide synthesis, a practical approach, IRL Press, Oxford.
13. Matayoshi, E.D., Wang, G.T., Krafft, G.A., y Erickson, J., (1990) Science 247, 954.
14. Maggiora, L.L., Smith, C.W. y Zhang, Z.Y. (1992) J. Med. Chem. 35, 3727.
15. Wang, G.T., Chung, G.C., Holzman, T.F. y Kraft, G.A. (1993) Anal. Biochem. 210, 351-359.
16. Andreae, F., Sommergruber, W., Gauss-Muller, V., Schultheis, T. Y Ahorn, H. (1994) Innovations and Perspectives in solid Phase Synthesis, R. Epton, ed., Mayflower Worldwide Ltd., Birmingham, UK, pp. 433-436.
17. Kraft, G.A. y Wang. G.T. (1994) Methods Enzymol. 241, 70.
18. Pennington, M.W. y Thornberry, N.A. (1994) Peptide Res. 7, 72.
19. Holskin, B.P., Bukhtiyarova, M., Dunn, B.M., Baur, P., J. de Chastonay y Pennington, M.W. (1995) Anal. Biochem. 226, 148.
Abreviaturas y símbolos usados en el texto
Abu = ácido 2-aminobutírico; CHAPS 3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato; DBCYL = ácido 4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico; Depsipéptido = un péptido donde al menos un enlace peptídico se reemplaza con el correspondiente enlace éster (el (las) localización (es) del (de los) enlace (s) éster dentro de la molécula se indica usualmente como \Psi[COO]- entre los residuos aminoácidos implicados): DIEA = N,N-disoprpiletilamina; DIPC = N, N'-diisopropilcarbodiimida; DMAP = 4-dimetilaminopiridina; DMF = N,N-diemtilaminoformamida; DTT = ditiotreitol; EDANS = ácido 5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; HOBt = N-hidroxibenzotriazol; HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; PyBOP = hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tyris-pirrolidinofosfonio; RET = transferencia de energía mediante resonancia; T-Bu = terc-butilo; TFA = ácido trifluoroacético; Trt (tritilo) = trifenilmetilo.
INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN DE BIOLOGÍA MOLECULAR. P. ANGELETTI S. p A.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: METODOLOGÍA PARA PRODUCIR, PURIFICAR Y ANALIZAR POLIPÉPTIDOS CON LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA PROETASA NS3 de VHC
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 47
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Societa Italiana Brevetti
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Piazza di Pietra, 39
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Roma
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL: 1-00186
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete 3,5'' 1,44 MBYTES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 6.22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Microsoft Word 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DI CERBO, Mario (Dr).
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA: RM/X88568/PC-DC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 06/6785941
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 06/6794692
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 612287 ROPAT
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 195 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 181 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Fmoc - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr}
\sac{Ile Glu Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His}
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Met
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Fmoc - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Ala
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Ala Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Ala Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Ala Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(28) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Ala Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(29) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ala His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(30) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(31) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(32) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(33) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asn
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(34) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Lys
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(35) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ser Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(36) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Phe Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(37) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Alg (aliglicina)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(38) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido \alpha - aminobutírico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(39) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Thr Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(40) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Nva (norvalina)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(41) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Val Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(42) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido 2 - aminobutírico) éster unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(43) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Thr unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(44) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido 2 - aminobutírico) éster unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - [^{3}H] - CH_{3}CO) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(45) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp (EDANS)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Abu (ácido 2 - aminobutírico) unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Xaa Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(46) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp (EDANS)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Abu (ácido 2 - aminobutírico) unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (DABCYL)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Met Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(47) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys - \epsilon - (^{3}H) Ac
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Xaa}

Claims (14)

1. El péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu - Gln - Gly y sus derivados por supresión N - terminal y/o supresión C-terminal y/o mutación, conteniendo un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) y comprendiendo los residuos de aminoácidos al menos en las posiciones -P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-, en las que el enlace entre el residuo Cys en P1 y el residuo Ala en P1' es el sitio de escisión de la proteasa en el que:
Asp en la posición P6 se puede reemplazar por Asn, Glu o Ala;
Glu en la posición P5, Met en al posición P4, Glu en la posición P3, Glu en la posición P2 se pueden reemplazar cada uno de ellos por Ala;
Cys en al posición P1 se puede reemplazar por Ths, ácido \alpha-aminobutírico, alilglicina, Val o norvalina;
Ala en la posición P1' se puede remplazar por Ser o Phe;
Ser en al posición P2' se puede reemplazar por Ala;
His en al posición P3' se puede reemplazar por Ala con tal que el derivado no sea la secuencia de aminoácidos Asp -
Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu.
2. El péptido según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC ID Nº:
8-11, 14, 18-20, 23-27, 29-33, 35-41 y 47.
3. El péptido Ac - Asp - Cys - Ser - Thr - Pro - Cys - Ser - Gly - Ser - Val (SEC ID Nº: 21) que tiene los residuos dispuestos a lo largo de las posiciones P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4' conteniendo un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) en la que el enlace entre el residuo Cys en P1 y el residuo Ser en P1' es el sitio de escisión de la proteasa.
4. El péptido Ac - Glu - Asp - Val - Val - Cys - Cys - Ser - Met - Ser - Tyr (SEC ID Nº: 22) que tiene los residuos dispuestos a lo largo de las posiciones P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4' conteniendo un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) en la que el enlace entre el residuo Cys en P1 y el residuo Ser en P1' es el sitio de escisión de la proteasa.
5. El derivado del polipéptido según la reivindicaciones 1 a 4 que es un depsipéptido que contiene un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) y que comprende un enlace éster entre las posiciones P1 y P1'.
6. Un depsipéptido según la reivindicación 5 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID números 42, 43, 44.
7. El péptido y derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se proporcionaron un marcador proporcionando una señal radiactiva, colorimétrica o fluorométrica detectable.
8. El péptido y derivado peptídico según la reivindicación 7 que es un depsipéptido, en el que la señal fluorométrica se produce por inactivación fluorogénica interna mediante transferencia de energía por resonancia entre un dador fluorescente, ácido 5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico (EDANS), cerca de un extremo del depsipéptido, y un grupo aceptor, ácido 4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico (DABCYL) cerca del otro extremo del depsipéptido.
9. El depsipéptido de la reivindicación 8 que tiene una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº: 45 y 46.
10. El procedimiento para ensayar in vitro la actividad proteolítica de los polipéptidos que tienen actividad de proteasa NS3 de VHC, que comprende poner en contacto el polipéptido con un sustrato que proporciona productos de escisión detectables en el que el sustrato es un péptido o derivado peptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y controlando los fragmentos escindidos.
11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que el sustrato es un péptido o derivado peptídico según las reivindicaciones 1 a 4, y el procedimiento es un ensayo de alto rendimiento a concentraciones de proteasa NS3 de entre 100 y 200 nM.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que el sustrato es un depsipéptido o derivado peptídico según las reivindicaciones 5 a 9 y el procedimiento es un ensayo de alto rendimiento a concentraciones de proteasa NS3 de entre 0,5 y 2 nM.
13. El procedimiento se la reivindicación 11 ó 12 que comprende además el control continuo de la actividad proteolítica de la proteasa NS3 del VHC con el depsipéptido de la reivindicación 8.
14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que comprende además poner en contacto la proteasa NS3 del VHC con un cofactor que es el péptido que tiene la secuencia Gly - Ser - Val - Val - Ile - Val -
Gly - Arg - Ile - Ile - Leu - Ser - Gly - Arg (SEC ID Nº: 6).
ES96926574T 1995-08-22 1996-08-20 Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolitica de polipeptidos con actividad de proteasa hcv ns3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento. Expired - Lifetime ES2236743T3 (es)

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