ES2236962T3 - Analogos antitumorales de uridina. - Google Patents

Abstract

Un método de selección de un análogo de uridina adecuado para reducir o inhibir la replicación o propagación de células tumorales, consistente en las siguientes etapas: proporcionar un análogo de uridina que esté sin substituir en la posición 5 y que tenga un fosfoazúcar o análogo de azúcar unido a la base; estudiar dicho análogo de uridina en cuanto a activación por la timidilato sintasa, según se mide por la metilación en la posición 5, y seleccionar dicho análogo de uridina cuando se ve que es activado por la timidilato sintasa.

Description

Análogos antitumorales de uridina.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos, compuestos y composiciones para diagnosticar y/o tratar células tumorales con agentes antitumorales activados por la timidilato sintasa (TS). Además, la presente invención se relaciona con la preparación y utilización de análogos de nucleósidos emisores de positrones para uso en aplicaciones de imagen. Más concretamente, la presente invención se relaciona con métodos para el diagnóstico y/o tratamiento de células tumorales por administración de compuestos tales como profármacos de análogos de nucleósidos y compuestos relacionados o composiciones que los contienen en una cantidad efectiva para identificar tumores susceptibles en especímenes de biopsias o por imagen externa y procediendo luego a reducir o inhibir la replicación o propagación de las células tumorales.

2. Revisión de la tecnología

La timidilato sintasa (TS) es una enzima esencial para la síntesis de ADN. Es, sin embargo, más abundante en células tumorales que en tejidos normales. Durante décadas, la investigación y los estudios clínicos se han dirigido hacia la inhibición de la TS para encoger los tumores. En algunos casos, esta estrategia ha tenido un éxito modesto; por ejemplo, se utilizan el fluorouracilo y la floxuridina en el tratamiento de los carcinomas de mama, de colon, páncreas, de estómago, de ovario y de cabeza/cuello, según describen Chu E. y Takimoto C.H., "Antimetabolites", en: DeVita V.T. Jr., Hellman S. y Rosenberg S.A., editores, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Vol. 1, 4ª ed., Philadelphia: Lippincott, 1993: 358-374.

Desafortunadamente, la mayoría de los tumores son inherentemente resistentes a esta estrategia e incluso aquellos tumores que son inicialmente sensibles desarrollan resistencia en el curso del tratamietno, según describen Swain, S.M., Lippman M.E., Egan E.F., Drake, J.C., Steinberg S.M. y Allegra C.J., en "Fluorouracil and High-Dose Leucovorin in Previously Treated Patients with Metastatic Breast Cancer", J. Clin. Oncol. 1989, 7: 890-9. Recientes aplicaciones de sondas moleculares para TS han demostrado una relación consistente entre resistencia y alta expresión de TS, según se indica en los siguientes artículos: Johnston P.G., Mick R., Recant W., Behan K.A., Dolan M.E., Ratain M.J. y col., "Thymidylate Synthase Expression and Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Patients with Advanced Head and Neck Cancer", J. Natl. Cancer Inst. 1987, 89: 308-13; Lenz H.J., Leichman C.G., Danenberg K.D., Danenberg P.V., Groshen S., Cohen H., Laine L., Crookes P., Silberman H., Baranda J., García Y., Li J. y Leichman L., "Thymidylate Synthase mRNA Level in Adenocarcinoma of The Stomach: A Predictor for Primary Tumor Response and Overall Survival", J. Clin. Oncol. 1996; 14: 176-82; Johnston P.G., Lenz H.J., Leichman C.G., Danenberg K.D., Allegra C.J., Danenberg P.V. y Leichman L., "Thymidylate Synthase Gene and Protein Expression Correlate and Are Associated with Response to 5-Fluorouracil in Human Colorectal and Gastric Tumors", Cancer Res. 1995, 55: 1407-12; Leichman L., Lenz H.J., Leichman C.G., Groshen S., Danenberg K., Baranda J. y col., "Quantitation of Intratumoral Thymidylate Synthase Expression Predicts for Resistance to Protracted Infusion of 5-Fluorouracil and Weekly Leucovorin in Disseminated Colorectal Cancers: Preliminary Report from An Ongoing Trial", Eur. J. Cancer 1995, 31A: 1305-10; Kornmann M., Link K.H., Staib L. y Danenberg P.V., "Quantitation of Intratumoral Thymidylate Synthase Predicts Response and Resistance to Hepatic Artery Infusion with Fluoropyrimidines in Patients with Colorectal Metastases", Proc. AACR 38: 614, 1997.

Touroutoglou N. y Pazdur R., en "Thymidylate Synthase Inhibitors", Clin. Cancer Res. 1996, 2: 227-43, describen una nueva generación de fármacos diseñados para inhibir la TS actualmente en las fases finales de pruebas clínicas. A pesar de los enormes recursos que se están invirtiendo en mejorar la efectividad de los inhibidores de la TS de primera generación, ni los fármacos existentes, ni este nuevo grupo de compuestos son efectivos en tumores que tienen un alto nivel de actividad TS. Actualmente , una vez un tumor se ha hecho resistente debido a altos niveles de TS, no existe terapia específica disponible.

En Cancer Chemother. Pharmacol. (1992) 29: 433-460, Chandrasekoran y col. describen que el tratamiento de células de leucemia murina L1210 en cultivo experimental con ara-U (arabinosiluracilo) (200-1.000 \muM) durante 48 h causaba una acumulación dosis-dependiente de células en la fase S. En Leukemia Research, Vol. II, Nº II, pp. 1031-1039, 1987, Xiang-Bin Kong y col. describen la inducción de diferenciación en células HL-60 por FAH (2'-fluoro-ara-H); sin embargo, FAC y Ara-C muestran ser \sim10^{5} y \sim10^{6} veces más efectivos, respectivamente, en base a los valores de la DE_{50}.

En Cancer Chemother. Pharmacol. (1984) 13: 195-199, Novotny y col. describen la dUrd (desoxiuridina) como uno de los muchos nucleósidos de pirimidina cancerostáticos potenciales. El artículo detalla los procesos tanto de transporte como de biotransformación de diversas composiciones, incluyendo la dUrd.

En lugar de inhibir la TS, los presentes inventores lanzaron la hipótesis de que era posible usar esta enzima para activar profármacos de análogos de uridina en análogos de timidina más tóxicos. Los presentes inventores han demostrado previamente en Molecular Pharmacology, 46: 1204-1209 (1994), en un artículo titulado "Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair and Lactate Production for 1-(2'-Fluoro-2'deoxy-\beta-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil (FIAU) in U-937 and MOLT-4 Cells", que el 1-(2'-fluoro-2'-desoxi-\beta-D-arabi-nofuranosil)uracilo (FAU) se fosforilaba intracelularmente por las células U-937 y MOLT-4 intactas a monofosfato de FAU (FAUMP), se convertía en su forma metilada, el 5-metil-FAUMP (FMAUMP) y se incorporaba al ADN. Estas observaciones previas sugerían que el FAU sería un prototipo apropiado para estudiar el potencial citotóxico de profármacos activados por TS. Hay que entender que el primer estudio produjo datos con diferentes fines y no se dirige directamente al presente descubrimiento. Para demostrar la validez del presente concepto, los inventores: (1) determinaron que la TS es la enzima que catalizaba la metilación, (2) examinaron las velocidades netas de formación de especies metiladas en una variedad de células y (3) correlacionaron las velocidades netas de formación de especies metiladas con los efectos citotóxicos.

Entre los nucleósidos de pirimidina, los análogos de 2'-desoxiuridina (dUrd) son menos tóxicos que sus correspondientes análogos de timidina (dThd), según indican Kong X.B., Andreeff M., Fanucchi M.P., Fox J.J., Watanabe K.A., Vidal P. y Chou T.C., en "Cell Differenciation Effects of 2'-Fluoro-1-beta-D-arabinofuranosyl Pyrimidines in HL-60 Cells", Leuk. Res., 1987, 11: 1031-9. Los presentes inventores lanzaron la teoría de que, después de la entrada en la célula y de la fosforilación, un análogo de dUrd serviría como profármaco selectivo si la TS puede metilarlo para generar el correspondiente análogo de dThd. Así, tumores que son resistentes a los inhibidores de la TS, debido a altos niveles de TS, serían particularmente sensibles a estos análogos de desoxiuridina (dUrd), ya que serían más eficaces en la producción de la especie tóxica de timidina (dThd). Esta estrategia es completamente novedosa, ya que es totalmente diferente de todas las aproximaciones previas hacia la TS como blanco antitumoral. Contrariamente a la investigación y a los estudios clínicos previos que se dirigen hacia la inhibición de la TS para encoger tumores, la presente invención utiliza TS para activar profármacos de análogos de uridina a los análogos de timidina más tóxicos para reducir o inhibir células tumorales, especialmente células tumorales que son inherentemente resistentes o que desarrollan resistencia a las terapias existentes. La presente invención es adicionalmente altamente complementaria de todas las aproximaciones previas hacia la inhibición de la TS como blanco antitumoral.

Además, como el éxito de la terapia con fármacos tales como el FAU o sus análogos se relaciona con el grado de incorporación al ADN, el análisis del ADN puede proporcionar información diagnóstica concerniente a la terapia óptima para un tumor. Así, examinando un espécimen de biopsia de un tumor, o mediante imagen externa de tumores, se puede predecir si sería eficaz la terapia con FAU o compuestos relacionados o si se tendría que usar una terapia alternativa.

Además de valorar la terapia del tumor, hay una variedad de otras circunstancias médicas en las que es importante determinar la velocidad de proliferación (crecimiento) de las células en un tejido particular en el organismo. Éstas incluyen: valoración de la función de la médula ósea (por ejemplo, después de un trasplante y/o de estimulación con factores de crecimiento), regeneración del hígado tras cirugía o lesión y expresión de la función enzimática tras terapia génica.

Las aproximaciones tradicionales para determinar la velocidad de crecimiento han sido invasivas, es decir, han requerido la obtención de una biopsia del paciente. Además de la incomodidad y de los riesgos asociados a los procedimientos de biopsia, sólo se obtiene una pequeña muestra de tejido. Así, las biopsias llevan el riesgo inherente de error de diagnóstico, ya que la pequeña muestra puede no ser representativa de toda la región. Así, se necesitan en la técnica otras metodologías para determinar la velocidad de crecimiento de los tejidos.

Los métodos no invasivos de imagen externa evitan la necesidad de biopsias y tienen también la capacidad de barrer grandes áreas del cuerpo, ciertamente todo el cuerpo, si es necesario. Como el crecimiento (proliferación) requiere la síntesis de ADN a partir de nucleósidos, la administración de nucleósidos que han sido radiomarcados con un emisor de positrones proporciona la capacidad de monitorizar externamente sucesos que se producen dentro del organismo mediante el uso de tecnologías de imagen, tales como un escáner PET (tomógrafo de emisión de positrones) u otros dispositivos de detección de fotones, tales como el SPECT (tomógrafo computerizado de emisión de un solo fotón) o cámaras gamma.

Estas tecnologías de imagen están sólo limitadas por la disponibilidad de sondas cuyos destinos biológicos proporcionen información en cuanto al estado proliferativo del tejido examinado. La timidina es una sonda particularmente útil para monitorizar el crecimiento/síntesis de ADN, ya que es el único nucleósido para el que es común la incorporación directa de un nucleósido exógenamente aplicado al ADN por rutas "salvajes". No hay dependencia de las rutas ribonucleotídicas para la incorporación de timidina. La propia timidina es inadecuada como sonda en estas tecnologías de imagen, ya que la molécula se degrada rápidamente en el organismo. Análogos de timidina tales como FMAU y FIAU son sondas de imagen excelentes, ya que: 1) siguen completamente las rutas de la timidina para incorporación al ADN, 2) no se degradan por enzimas catabólicas y 3) pueden ser mercados con ^{18}F, el átomo más deseable para la imagen de positrones.

Se han usado en la técnica anterior sondas de imagen que incorporan otros restos emisores de positrones. Por ejemplo, se ha descrito una síntesis para ^{11}C-FMAU. Sin embargo, hay una serie de limitaciones prácticas dictadas por la vida media de 20 minutos del ^{11}C. Las moléculas sonda que contienen ^{11}C deben ser literalmente preparadas in situ y usadas en el plazo de una hora. Este requerimiento hace inviable disponer de un centro de preparación regional y enviar las moléculas a instalaciones médicas cercanas. Así, cada instalación que desee realizar estudios de imagen usando una sonda marcada con ^{11}C debe tener in situ las instalaciones ciclotrónicas para preparar el isótopo. Una limitación adicional de los marcajes que contienen ^{11}C surge cuando el fenómeno biológico requiere más de una hora para la expresión completa. La corta vida media del ^{11}C significa que quedaría insuficiente ^{11}C para la imagen en estas situaciones.

Además de sondas que contienen ^{11}C, se conocen en la técnica anterior sondas marcadas con ^{18}F. La ^{18}F-fluorodesoxiglucosa (FDG), una sonda de imagen actualmente empleada, es sintetizada y distribuida desde una instalación regional, lo que la hace más fácilmente disponible para fines de imagen. Además, se han descrito análogos de nucleósidos que incorporan ^{18}F en posiciones distintas de las de la presente invención, por ejemplo ^{18}F en la posición 5 del uracilo.

A pesar de la existencia de las moléculas sonda antes discutidas, existe una necesidad en la técnica de moléculas sonda para uso en tecnologías de imagen externa. Además, siguen necesitándose en la técnica modalidades terapéuticas adicionales para el tratamiento de trastornos de la proliferación celular. Estas y otras necesidades han sido satisfechas por la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con métodos de diagnóstico y/o tratamiento de tumores. Los compuestos usados en la presente invención son análogos de uridina, que son activados por la timidilato sintasa, en una cantidad efectiva para el diagnóstico o para reducir o inhibir la replicación o propagación de células tumorales. Estos compuestos y las composiciones que contienen estos compuestos son fácilmente administrados por diferentes modos conocidos en la técnica y se pueden dar en dosificaciones que son seguras y que proporcionan inhibición tumoral en los sitios relevantes. En consecuencia, la presente invención proporciona un método de selección de un análogo de uridina adecuado para reducir o inhibir la replicación por propagación de células tumorales, consistente en:

aportar un análogo de uridina que está sin substituir en la posición 5 y que tiene un fosfoazúcar o análogo de azúcar unido a la base;

estudiar dicho análogo de uridina en cuanto a la activación por la timidilato sintasa, según se mide por metilación en la posición 5, y

seleccionar dicho análogo de uridina cuando se ve que está activado por la timidilato sintasa.

En este método, la etapa de estudio consiste típicamente en:

medir la citotoxicidad de dicho análogo de uridina con respecto a al menos una línea celular con una alta expresión de la enzima timidilato sintasa y al menos una línea celular con una baja expresión de la enzima timidilato sintasa;

y la etapa de selección consiste en:

seleccionar dicho análogo de uridina cuando la citotoxicidad medida con respecto a la al menos una línea celular con una alta expresión de enzima timidilato sintasa es mayor que la citotoxicidad medida con respecto a la al menos una línea celular con una baja expresión de enzima timidilato sintasa.

Preferiblemente, la línea celular con alta expresión de la enzima timidilato sintasa es una línea celular U937 o una línea celular CEM. La línea celular con baja expresión de la enzima timidilato sintasa es preferiblemente una línea celular L1210 o una línea celular Raji.

En el método de la invención según se ha definido anteriormente, el análogo de uridina puede contener un radioisótopo. El radioisótopo es, por ejemplo, ^{18}F o ^{11}C.

En otras realizaciones, los análogos pueden ser usados para aplicaciones de imagen incluso aunque no estén incorporados a ADN.

En consecuencia, es un objeto de la presente invención aportar compuestos, composiciones y métodos para identificar tumores susceptibles en especímenes de biopsias o por imagen externa y/o inhibir o reducir la replicación o propagación de células tumorales.

La presente invención proporciona, por lo tanto, el uso de un análogo de uridina seleccionable según un método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para uso en un método de diagnóstico de tumores en el cuerpo humano o animal.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un tratamiento para tumores y otras enfermedades caracterizadas por proliferación anormal de las células. La invención proporciona además, por lo tanto, el uso de un análogo de uridina seleccionable según el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento de tumores o del cáncer o de alivio de los efectos citopáticos asociados a los tumores o al cáncer, cuyo método consiste en administrar el medicamento en una cantidad efectiva para reducir o inhibir la replicación o propagación de las células tumorales o cancerosas, o para aliviar dichos efectos citopáticos. En este aspecto de la invención, el análogo de uridina es típicamente FAU, d-Urd o ara-U.

En sus otros aspectos, la invención proporciona:

-

El uso de un análogo de uridina seleccionable de acuerdo con el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un agente diagnóstico para uso en el diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa.

-

El uso de un análogo de uridina seleccionable de acuerdo con el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un agente diagnóstico para uso en la valoración de la adecuación del tratamiento de un tumor con un inhibidor de la timidilato sintasa.

-

El uso de un análogo de uridina seleccionable de acuerdo con el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un agente para uso en un método de diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método consiste en las etapas de:

(a)

administrar a dichos tumores dicho análogo de uridina, donde dicho análogo está marcado con un emisor de positrones, y

(b)

medir la incorporación de ADN por imagen externa.

-

El uso de un análogo de uridina seleccionable de acuerdo con el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un agente para uso en un método para valorar la adecuación del tratamiento de tumores con inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método consiste en las etapas de:

(a)

administrar dicho análogo de uridina, donde dicho análogo está marcado con un emisor de positrones, y

(b)

determinar el grado de inhibición máxima de la timidilato sintasa y la persistencia de inhibición de la timidilato sintasa a lo largo del tiempo entre dosis por imagen externa.

-

El uso de un análogo de uridina seleccionable de acuerdo con el método de la invención según se ha definido anteriormente en la fabricación de un agente para uso en un método de diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método consiste en las etapas de:

(a)

administrar dicho agente antes de obtener los especímenes de biopsia,

(b)

obtener especímenes de biopsia y

(c)

analizar el ADN de los especímenes de biopsia en cuanto al grado de incorporación del análogo.

En estos aspectos de la invención, el emisor de positrones es típicamente ^{18}F o ^{11}C. La imagen externa es típicamente conseguida usando tomografía de emisión de positrones.

Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes gracias a la siguiente descripción de realizaciones preferidas. Éstos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes tras una revisión de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la estructura general para muchos substratos de TS. Para el nucleósido endógeno, dUrd, W=X=Y=H y Z=OH. El FAU tiene una sola substitución, W=F. También se requiere un grupo fosfato unido al azúcar en la posición 5'. Los correspondientes análogos de timidina tienen un grupo metilo (-CH_{3}) en la posición 5 de la base uracilo.

La Figura 2 representa gráficamente el efecto sobre el crecimiento celular de una exposición continua de 72 h a: (A) FAU o (B) FMAU.

Designaciones celulares:

CEM = \bullet; MOLT-4 = O; RAJI = \blacktriangledown; U-937 = \nabla; K-562 = \blacksquare; L1210 = \Box.

La Figura 3 representa gráficamente la asociación de la incorporación al ADN con el efecto sobre el crecimiento celular. (A) FAU o (B) FMAU.

CEM = \bullet; MOLT-4 = O; RAJI = \blacktriangledown; U-937 = \nabla; K-562 = \blacksquare; L1210 = \Box.

La Figura 4 representa gráficamente la sensibilidad relativa de las líneas celulares a la inhibición del crecimiento por FAU en comparación con el potencial de activación para TS, medida independientemente como deshalogenación de IdUrd. Las líneas celulares más sensibles (U-937, CEM, MOLT-4) tienen un 50% o más de deshalogenación. Las líneas menos sensibles (Raji, L1210) tienen un 15% o menos.

CEM = \bullet; MOLT-4 = O; RAJI = \blacktriangledown; U-937 = \nabla; K-562 = \blacksquare; L1210 = \Box.

La Figura 5 representa gráficamente la conversión de FAUMP en FMAUMP por TS en extractos celulares U-937, según se demuestra por la acumulación de agua tritiada. La velocidad de conversión a FMAUMP era aproximadamente un 1% de la velocidad de formación de dTMP a partir de dUMP. Se obtuvieron resultados similares para las otras líneas celulares, con un rango de 0,97-1,5%.

La Figura 6 representa gráficamente el efecto sobre el crecimiento celular de una exposición continua de 72 h a: (A) ara-U o (B) ara-T.

Designaciones celulares:

CEM = \bullet; MOLT-4 = O; RAJI = \blacktriangledown; U-937 = \nabla; K-562 = \blacksquare; L1210 = \Box.

La Figura 7 representa gráficamente el efecto sobre el crecimiento celular de una exposición continua de 72 h a: (A) dUrd o (B) dThd.

Designaciones celulares:

CEM = \bullet; MOLT-4 = O; RAJI = \blacktriangledown; U-937 = \nabla; K-562 = \blacksquare; L1210 = \Box.

Descripción detallada de la invención

Las células tumorales con altos niveles de timidilato sintasa (TS) representan un desafío terapéutico común para el que no se dispone actualmente de ninguna estrategia de tratamiento. Un aspecto de la presente invención es que el crecimiento de células tumorales con elevada TS puede ser preferencialmente inhibido con un análogo de uridina y/o de desoxiuridina (dUrd). Tal como se usa a continuación, se ve que el análogo incluye uridina y desoxiuridina y derivados de ambos. Además, como los tumores pueden variar ampliamente, la identificación de células tumorales con altos niveles de TS proporciona información diagnóstica para seleccionar la terapia apropiada para tumores individuales. Utilizando FAU como prototipo, se ha demostrado este concepto con éxito.

El siguiente ESQUEMA 1 ilustra la estructura generalizada para análogos de dUrd y sus rutas de activación intracelulares. Para el nucleósido endógeno, dUrd, W=H. El FAU tiene la substitución, W=F. Un grupo fosfato se une al azúcar en la posición 5' por la timidina kinasa (TK) para formar dUMP o su análogo, FAUMP. A continuación, la TS une un grupo metilo en la posición 5 de la base para generar timidilato, dTMP, o su análogo, FMAUMP.

Esquema 1

1

Los presentes inventores demostraron que FAU se convertía en nucleótidos FMAU y se incorporaba como FMAU al ADN celular. En particular, el monofosfato de FAU, FAUMP, se convertía por la TS en extractos celulares en la correspondiente forma dThd, FMAUMP. La incubación de FAU con líneas de células tumorales en cultivo inhibía su crecimiento en un grado variable, dependiendo de la eficacia de activación a través de la TS. Ésta es la primera demostración de que las células con altos niveles de actividad TS pueden ser más vulnerables a la terapia que las células con baja actividad TS.

Se observó una amplia variación entre las líneas celulares en la inhibición del crecimiento y también pendientes relativamente llanas para las curvas de respuesta frente a concentración extracelular (Fig. 2A, 2B). En consecuencia, la concentración extracelular de FMAU o especialmente de FAU era un predictor débil de citotoxicidad. Por el contrario, la variación entre líneas celulares en la CI_{50} relacionada con el % de substitución de dThd en el ADN por FMAU era bastante pequeña (Fig. 3). Además, había curvas de respuesta muy pronunciadas para la inhibición del crecimiento frente a la incorporación de fármaco (como FMAU) en el ADN. Además, había similitud entre las líneas celulares en cuanto a la toxicidad a valores similares para el % de substitución de dThd en el ADN por FMAU. Así, para igual exposición al profármaco, se pudo relacionar la toxicidad selectiva con las diferencias en la velocidad de conversión a análogos de dThd por la TS. Sin embargo, aunque la conversión por la TS es una condición necesaria para la toxicidad, no es suficiente. La utilización oportunista de una elevada actividad de la TS también se basa en otras etapas, especialmente kinasas y polimerasas, así como en la competición con la síntesis endógena. La inhibición del crecimiento depende en último lugar de la acción neta de todas las rutas de las pirimidinas.

Estos datos de la Figura 3 también demuestran un uso de los análogos de desoxiuridina para aplicaciones diagnósticas. Los tumores con alta captación de FAU e incorporación al ADN tras metilación mediante la timidilato sintasa podrían ser visualizados por imagen externa, por ejemplo, mediante el uso de FAU marcado con ^{18}F con tomografía de emisión de positrones (PET). Alternativamente, se podría administrar una dosis de FAU antes de una biopsia tumoral y determinar la incorporación al ADN con las mismas técnicas usadas para las muestras de cultivo celular de la Figura 3. Por cualquiera de las modalidades, los tumores con alta incorporación de ADN serían excelentes candidatos para terapia con FAU o análogos relacionados y los tumores con baja incorporación de ADN tendrían que ser tratados con alguna otra terapia.

Es posible que el FAU tenga efectos biológicos autónomos separados de los nucleótidos de FMAU. Sin embargo, hay varias indicaciones de que la formación de FMAU por la TS era suficiente para explicar la mayoría de los efectos observados. En la presente invención, la comparación con el uso directo de FMAU demostró que los efectos tóxicos estaban dominados por los nucleótidos de FMAU, especialmente la similitud en las relaciones del ADN. Además, se comparó la sensibilidad relativa de las líneas celulares a la inhibición del crecimiento por el FAU con el potencial de activación para la TS, medida independientemente como deshalogenación relativa de IdUrd (Fig. 4). Las líneas celulares más sensibles (U-937, CEM, MOLT-4) tienen un 50% o más de deshalogenación. Las líneas menos sensibles (Raji, L1210) tienen un 15% o menos de deshalogenación.

No obstante, en otras condiciones experimentales, si hay diferencias entre las células en el transporte, la fosforilación o rutas relacionadas, entonces estos factores pueden también influir en la respuesta además de la actividad TS. Una ventaja mayor de la imagen de tumores con FAU marcado es que detecta el producto final de todos estos procesos, lo que se debe traducir en un valor pronóstico.

Además, se sugiere una aproximación alternativa o adicional al diagnóstico por interpretación de los datos de la Figura 4. Antes de la biopsia, se puede dar a un paciente una dosis de IdUrd marcada, ya sea radiomarcada o más preferiblemente marcada con isótopos estables. Se puede determinar la deshalogenación a partir del ADN en la biopsia tumoral y utilizarla para guiar la terapia.

La presente invención proporciona una vía prometedora de ataque para tumores humanos comunes que han sido previamente resistentes a las aproximaciones terapéuticas. Aunque se usó el FAU para demostrar el principio, el FAU no era muy potente y puede no ser necesariamente el compuesto óptimo en esta clase. La velocidad de metilación por la TS era más bien lenta, sólo de un 1% en comparación con el substrato endógeno, dUMP. A pesar de esta baja velocidad, se incorporaron cantidades substanciales de FMAU al ADN y se observó la toxicidad.

Si el FAU no es ideal, existen otras muchas modificaciones sintéticas de la dUrd que pueden servir también como substratos de la TS. Por ejemplo, se obtuvieron datos de cultivo celulares para el arabinósido de uracilo (ara-U) y su análogo metilado, el arabinósido de timina (ara-T). Como se muestra en la Figura 6, los patrones de toxicidad para ara-U y ara-T son muy similares a los de FAU y FMAU en la Figura 2, lo que sugiere un mecanismo similar, es decir, metilación. Además, los compuestos endógenos, desoxiuridina (dUr) y timidina (dThd) también exhiben el mismo patrón de toxicidad de cultivo celular (Figura 7).

Por consiguiente, la presente invención incluye compuestos, composiciones y un método de diagnóstico y tratamiento de tumores. Una realización de la presente invención consiste en el uso de análogos de uridina o compuestos relacionados según se describe aquí para inhibir la formación de tumores. La presente invención también incluye compuestos que tienen actividad antitumoral. La presente invención también consiste en un método de tratamiento de la formación de tumores en humanos o animales, consistente en las etapas de administrar al humano o animal que tiene tumores una composición que contiene una cantidad efectiva de un análogo de uridina capaz de inhibir el crecimiento tumoral.

Es práctica común tratar los tumores empíricamente sin información diagnóstica en cuanto a la sensibilidad del tumor específico a un fármaco particular. Así, el FAU o compuestos relacionados podrían ser usados directamente para tratar tumores de una clase que se sabe tiene altos niveles de TS. Alternativamente, la terapia con FAU o compuestos relacionados podría comenzar tras la incapacidad de los inhibidores convencionales de la TS, con la conclusión de que los niveles de TS están elevados. Una aproximación preferida usaría biopsia o información de imagen externa como guía en la selección de terapia, diagnosticando qué tumores serían susceptibles al FAU o compuestos relacionados y cuáles deberían usar aproximaciones alternativas.

Los compuestos para inhibición y/o diagnóstico de tumores que pueden ser usados según la presente invención incluyen los de la fórmula general (I):

2

donde:

A

\;

=

N o CH;

B

\;

=

H, hidroxi, halógeno, acilo (C_{1}-C_{6}), alquilo (C_{1}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6});

D

\;

=

O, S o NH, y

G

\;

=

azúcar cíclico substituido o no substituido, azúcar acíclico substituido o no substituido, azúcar mono-, di- o trifosfocíclico fosfato substituido o no substituido, azúcar mono-, di- o trifosfo-acíclico fosfato substituido o no substituido, análogos de azúcares mono-, di- o trifosfocíclicos substituidos o no substituidos y análogos de azúcares mono-, di- o trifosfoacíclicos substituidos o no substituidos, donde los substituyentes son alquilo (C_{1} a C_{6}), alcoxi (C_{1} a C_{6}) o halógeno.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) son análogos de uridina de fórmula (II):

3

donde:

A

\;

=

N o CH;

B

\;

=

H, hidroxi, halógeno, acilo (C_{1}-C_{6}), alquilo (C_{1}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6});

D

\;

=

O, S o NH;

\quad

W, X, Y, Z = H, hidroxi, halógeno, alquilo (C_{1}-C_{6}), alcoxi (C_{1}-C_{6}), un resto que contiene un marcaje o un {}\hskip1,9cm marcaje;

J

\;

=

C o S, y

K

\;

=

O o CH_{2}.

En una realización preferida de fórmula (I) o (II), W es halógeno. En una realización más preferida, W es flúor. Sin embargo, otras realizaciones entran dentro del alcance de la presente invención.

Hay que entender que los compuestos de la presente invención pueden existir como enantiómeros y que la mezcla racémica de los enantiómeros o los enantiómeros aislados son todos ellos considerados como dentro del alcance de la presente invención.

Los compuestos usados en la presente invención pueden ser presentados como composiciones o formulaciones farmacéuticamente aceptables usando métodos de formulación conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Estas composiciones o formulaciones pueden ser administradas por vías estándar. En general, cuando se usan para tratar trastornos proliferativos de las células, la dosificación de los compuestos dependerá del tipo de tumor, de la condición que se esté tratando, del compuesto particular que se esté utilizando y de otros factores clínicos tales como el peso, la condición del humano o animal y la vía de administración. Hay que entender que la presente invención tiene aplicación para uso tanto humano como veterinario.

Cualquiera de estos compuestos puede ser también usado para obtener información diagnóstica concerniente a los tumores. Por ejemplo, si se está tomando una biopsia del tumor de un/una paciente, se puede administrar una dosis de FAU o de un compuesto relacionado, con o sin el uso de un átomo radiomarcado, o más preferiblemente de un isótopo estable del átomo natural, y tratar el ADN de las biopsias como en los experimentos de cultivo celular.

Se puede utilizar cualquier radioisótopo conocido en general y aceptable o isótopos estables de un átomo natural en la presente invención. Sin embargo, el ^{14}C y el ^{3}H son radioisótopos preferidos y se prefieren más marcajes isotópicos estables tales como ^{13}C, ^{2}H o ^{15}N.

De forma similar, se puede usar la imagen externa, por ejemplo, por tomografía de emisión de positrones ("PET"), en particular, para detectar FAU o compuestos relacionados marcados con ^{11}C y/o ^{18}F. Por extensión del trabajo mostrado en el cultivo de tejidos, altos niveles de incorporación de FAU al ADN predicen una terapia eficaz con FAU o con compuestos relacionados. Bajos niveles de FAU en el ADN sugieren que habría que usar una terapia alternativa. Así, la presente invención proporciona un método de valoración de la adecuación del tratamiento de tumores con diversas modalidades, incluyendo inhibidores de la timidilato sintasa, que consiste en administrar un análogo de uridina que está marcado con un emisor de positrones, tal como ^{11}C o más preferiblemente ^{18}F, y determinar el grado de inhibición máxima de la TS y la persistencia de la inhibición de la TS a lo largo del tiempo entre dosis por imagen externa, preferiblemente por tomografía de emisión de positrones. Estos parámetros se pueden usar para guiar el calendario de las dosis posteriores o para determinar cuándo ya no es eficaz la terapia actual y es necesario cambiar a una terapia alternativa.

En realizaciones preferidas para aplicaciones de imagen, W puede ser un resto que contenga un marcaje o un marcaje. El marcaje puede ser cualquier resto que permita la detección del análogo de nucleósido. En realizaciones preferidas, el marcaje incluye un átomo emisor de positrones y en una realización más preferida, W es ^{18}F. En una realización preferida para imagen, W es ^{18}F. Sin embargo, otras realizaciones quedan dentro del alcance de la presente invención.

En realizaciones preferidas, el nucleósido puede servir como substrato para las enzimas requeridas para incorporación del nucleósido al ADN y, por lo tanto, el nucleósido tendrá un grupo 5'-hidroxilo que pueda fosforilarse al trifosfato de nucleósido y el trifosfato resultante puede servir como substrato para las enzimas ADN polimerasas celulares.

Además, en el caso de especímenes de biopsias, se puede administrar IdUrd marcada e interpretarla en términos de los datos del cultivo celular: altos niveles de deshalogenación predicen una terapia eficaz con FAU o compuestos relacionados; una baja deshalogenación sugiere que habría que usar terapia alternativa. Así, la presente invención proporciona también un método de diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa administrando IdUrd que ha sido marcada con un radioisótopo tal como ^{14}C o ^{3}H o, más preferiblemente, con un marcaje isotópico estable tal como ^{13}C, ^{2}H o ^{15}N; preparando especímenes de biopsia del tumor, y determinando el grado de deshalogenación de la IdUrd por las enzimas timidilato sintasas por examen del ADN de los especímenes tumorales. En base a estos resultados, se puede sugerir un régimen de terapia.

Para administración oral, es generalmente suficiente una dosificación de entre aproximadamente 0,1 y 300 mg/kg/ día y preferiblemente de entre aproximadamente 0,5 y 50 mg/kg/día. La formulación puede presentarse en forma de dosificación unitaria y puede ser preparada por técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociación del componente activo y del(de los) vehículo(s) o excipiente(s). En general, se preparan las formulaciones asociando uniforme e íntimamente el componente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, eventualmente con uno o más ingredientes accesorios, y dando luego, si es necesario, forma al producto.

Son formulaciones de dosificación unitaria preferidas las que contienen una dosis o unidad diaria, una sub-dosis diaria o una fracción apropiada de la misma del componente administrado. Habría que entender que, además de los ingredientes particularmente mencionados aquí, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica. También habría que entender que los compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser también administrados por vía tópica, transdérmica, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular) o pueden ser incorporados a polímeros biodegradables que permitan la liberación mantenida del compuesto, siendo implantados los polímeros en la vecindad del tumor o donde se desee la administración del fármaco.

La Figura 1 muestra la estructura general de muchos análogos de uridina. La base consiste en uracilo o diversas modificaciones. La interacción con la TS se produce en la posición 5, donde el átomo de hidrógeno está substituido por un grupo metilo. El substrato endógeno para la TS, el 5'-monofosfato de 2'-desoxiuridina (dUMP), se transforma en monofosfato de timidina (dTMP). La clase original de inhibidores de la TS, el 5-fluorouracilo (FUra) y la 5-fluorodesoxiuridina (floxuridina, FdUrd), tras conversión intracelular en FdUMP, forman un complejo ternario con la TS y bloquean la conversión endógena de dUMP a dTMP. Más que intentar bloquear la posición 5, como con FUra y FdUrd, la presente invención conserva el hidrógeno en la posición 5, estimulando la aceptación de la donación del metilo. Así, para aquellos análogos de desoxiuridina que sean menos tóxicos que los correspondientes análogos de timidina, la TS puede aumentar la citotoxicidad. Los análogos pueden consistir en modificaciones de la base, del azúcar o de ambos. El grupo fosfato en la posición 5' del azúcar normalmente añadido intracelularmente (por ejemplo, mediante la timidina kinasa), pero se pueden preformar grupos fosfato modificados y pueden entrar en la célula intacta (por ejemplo, fosforotiatos o HPMPC).

Son factibles varias modificaciones de las bases. El hidrógeno en la posición 5 y el doble enlace que conecta los carbonos 5 y 6 son los requerimientos más esenciales en la base para el substrato más preferido de la TS. El nitrógeno en posición 1 es también una realización preferida; sin embargo, podría ser substituido por un carbono, por ejemplo, en un intento por conseguir una unión más estable con el azúcar. El hidrógeno unido a N3 puede estar también substituido con varios grupos funcionales, incluyendo un substituyente hidroxilo, halógeno, acilo (C_{1}-C_{6}), alquilo (C_{1}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6}). El carboxilo en C2 o C4 puede estar substituido con un azufre, como en 4-tiodesoxiuridina, o un grupo NH.

Se puede unir un fosfoazúcar (o análogo de azúcar) a la base para interaccionar con la TS. Son posibles muchos cambios en el azúcar, quedando aún un substrato para la TS. En nuestro compuesto prototípico, F substituye al átomo de hidrógeno en la posición 2' "por encima" del plano del azúcar (2'-F-arabino), es decir, W=F. El compuesto resultante, FAU, ha demostrado fosforilarse y convertirse en su forma metilada, FMAUMP. F puede también colocarse por debajo del anillo en la posición 2', X=F. Son sintéticamente posibles substituyentes más voluminosos en la posición 2', por ejemplo, según describen Verheyden J.P.H., Wagner D. y Moffatt J.G. en "Synthesis of Some Pyrimidine 2'-Amino-2'-deoxynucleosides", en J. Org. Chem. Vol. 36, páginas 250-254, 1971. W=OH da arabinósido de uracilo, el principal metabolito circulante de ara-C. Se han sintetizado compuestos substituidos en la posición 3' por encima del anillo, Y, por ejemplo, como describen Watanabe K.A., Reichman U., Chu C.K., Hollenberg D.H. y Fox J.J. en "Nucleosides. 116. 1-(beta-D-Xylofuranosyl)-5-fluorocytosines with a leaving group on the 3' position. Potential double-barreled masked precursors of anticancer nucleosides", en J. Med. Chem. Oct. de 1980, 23(10): 1088-1094. Por debajo del anillo en la posición 3', Z=F produce un análogo de fluorotimidina, un agente antirretrovírico. Un fármaco antivírico eficaz, la 3'-tiacitidina (3TC), se basa en la substitución del carbono 3' con un átomo de azufre, sin substituyentes unidos por encima o por debajo del anillo. Otro cambio descrito en el azúcar es la substitución del átomo de oxígeno con carbono para formar una estructura carbocíclica, por ejemplo, Lin T.S., Zhang X.H., Wang Z.H. y Prusoff W.H., "Synthesis and Antiviral Evaluation of Carbocyclic Analogues of 2'-Azido- and 2'-Amino-2'-desoxyuridine", J. Med. Chem. 31: 484-6, 1988.

Además del grupo de substituciones simples, se incluirían también substituciones múltiples en el alcance de la presente invención. Si se substituyen ambos átomos de hidrógeno en la posición 2' con F, la molécula resultante es 2',2'-difluorodesoxiuridina, que es el principal metabolito circulante de la gemcitabina, 2,2'-difluorodesoxicitidina.

Después de la metilación por la TS, los análogos con modificaciones en el azúcar en la posición 2' pueden ser reconocidos por ADN polimerasas y competir con el trifosfato de timidina (dTTP) por la incorporación al ADN. Si se conserva el OH 3' (Z=OH), se pueden añadir bases adicionales subsiguientemente. Sin embargo, si Z no es -OH, entonces el análogo servirá como finalizador del crecimiento de la cadena. Ambos finalizadores (por ejemplo, AZT) y no finalizadores (por ejemplo, IdUrd) de la cadena tienen actividad biológica, pero el espectro de efectos puede ser bastante diferente.

Los análogos de azúcar acíclicos, tales como el aciclovir o el cidofovir (HPMPC) tienen actividad biológica. En el caso del aciclovir y de moléculas relacionadas (tales como el ganciclovir), una forma vírica de timidina kinasa es capaz de fosforilar el fármaco a pesar de la geometría alterada. Para el HPMPC, el grupo fosfato ya está presente.

Ejemplos Materiales y métodos

A menos que se definan de forma diferente, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica a la que esta invención pertenece. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o en las pruebas de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos.

Agentes químicos

Se obtuvieron FAU, FMAU, FAUMP y dUMP no marcados y marcados de Moravek Biochemicals, Brea, CA. El [2-^{14}C]FAU, el [^{3}H-CH_{3}]FMAU, el [5-^{3}H]FAUMP y el [5-^{3}H]dUMP radiomarcados tenían actividades específicas de 0,056, 0,33, 11 y 2 Ci/mmol, respectivamente. La desoxirribonucleasa I (ADNasa I) de páncreas bovino, Tipo II, y la fosfodiesterasa I de Crotalus atrox, Tipo VI, el formaldehído, el tetrahidrofolato, la 2'-desoxiuridina (dUrd), la timidina (dThd), el arabinósido de uracilo (ara-U) y el arabinósido de timina (ara-T) fueron obtenidos de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Todos los demás reactivos eran de grado analítico.

Células

Las líneas de células derivadas de humanos CEM, MOLT-4, RAJI, U-937 y K-562 y la L1210 derivada de ratón fueron compradas a la American Type Culture Collection, Rockville, MD. Se cultivaron y mantuvieron las células como cultivo en suspensión en medio RPMI 1640 que contenía L-glutamina y un 10% (v/v) de suero de ternera fetal inactivado por calor (BRL-GIBCO, Rockville, MD). Se añadió una solución de penicilina-estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para conseguir una concentración final de 100 unidades/ml y 100 \mug/ml, respectivamente.

Metilación de FAUMP por timidilato sintasa en extractos celulares

Cuando la TS añade un grupo metilo en la posición 5 del dUMP para generar dTMP, se libera el protón en esa localización. Cuando el substrato es [5-^{3}H]dUMP, la actividad TS en los extractos celulares puede ser valorada monitorizando la velocidad de acumulación de agua tritiada. Aquí, se usó [5-^{3}H]FAUMP como substrato para la metilación por la TS y se determinó la generación de FMAUMP a partir de la liberación de agua tritiada. Se prepararon los extractos celulares a partir de cada línea celular por sonicación de células intactas. (Véanse: Armstrong R.D. y Diasio R.B., "Improved Measurement of Thymidylate Synthetase Activity by A Modified Tritium-Release Assay", J. Biochem. Biophys. Methods, 1982, 6: 141-7, y Speth P.A.J., Kinsella T.J., Chang A.E., Klecker R.W., Belanger K. y Collins J.M., "Incorporation of Iododeoxyuridine into DNA of Hepatic Metastases versus Normal Human Liver", Clin. Pharmacol. Ther., 1988, 44: 369-75). El donador de metilo fue aportado por el 5,10-metilenotetrahidrofolato, que fue generado in situ por adición de formaldehído a tetrahidrofolato. A diversos tiempos tras la adición de substrato (20 \muM de [5-^{3}H]dUMP o de [5-^{3}H]FAUMP), se detuvo la reacción por adición de HCl. Se separó el substrato no reaccionado del agua tritiada por adsorción sobre carbón activo. Tras la centrifugación, se contó una alícuota del sobrenadante en cuanto al agua tritiada. Como se muestra en la Figura 5, la TS en extractos celulares es capaz de metilar el FAUMP y de liberar agua tritiada, aunque a una velocidad menor que para el dUMP.

Estudios de inhibición del crecimiento

Todas las líneas celulares, excepto L1210, fueron suspendidas en medio fresco a 30.000 células/ml. Las células L1210 fueron suspendidas a 10.000 células/ml. Se añadieron células, 2 ml, a cada uno de los pocillos de placas de 24 pocillos y se incubaron con 0 a 1.000 \muM de FAU o con 0 a 300 \muM de FMAU. Se realizó la incubación a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2} durante 72 horas. Se valoró la inhibición del crecimiento celular por recuento celular (Elzone 180, Particle Data, Inc., Elmhurst, IL). En estas condiciones, los tiempos de duplicación de los controles para las células CEM, MOLT-4, RAJI, U-937 y K-562 eran de 21-22 horas, mientras que el tiempo de duplicación para L1210 era de 8-10 horas.

Formación intracelular de nucleótidos e incorporación al ADN

Todas las líneas celulares, excepto L1210, fueron resuspendidas en medio fresco a 300.000 células/ml con la cantidad apropiada de fármaco radiactivo. Las células L1210 fueron resuspendidas a 150.000 células/ml. Al cabo de 24 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2}, se recogieron las células para la medición de nucleótidos y la incorporación al ADN. Se determinaron los nucleótidos solubles para cada línea celular tras exposición a 10 \muM de FAU. Se determinó la incorporación de FAU al ADN (como FMAU) en un rango de concentraciones de FAU de desde 1 \muM a 1 mM. Como han descrito previamente Klecker, R.W., Katki A.G. y Collins J.M. en "Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair, and Lactate Production for 1-(2'-Fluoro-2'-deoxy-\beta-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil in U-937 and MOLT-4-cells", Mol. Pharmacol., 1994, 46: 1204-1209, y Speth P.A.J., Kinsella T.J., Chang A.E., Klecker R.W., Belanger K. y Collins J.M., en "Incorporation of Iododeoxyuridine into DNA of Hepatic Metastases versus Normal Human Liver", Clin. Pharmacol. Ther., 1988, 44: 369-75, se usaron ADNasa I y fosfodiesterasa I para liberar las bases del ADN. Se determinaron estas bases y los nucleótidos solubles por los métodos basados en HPLC previamente descritos, según indican Klecker y col. en la referencia antes mencionada, "Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair and Lactate Production for 1-(2'-fluoro-2'deoxy-\beta-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil in U-937 and MOLT-4 Cells". Se determinó la incorporación de fármaco al ADN celular usando la ecuación: porcentaje de incorporación = 100 x ([fármaco]/([dThd]+
[fármaco])).

Deshalogenación como sonda para la actividad timidilato sintasa in situ. Se determinó la actividad relativa de la timidilato sintasa tras incubación de las células con 3 \muM de [^{3}H]-IdUrd durante 24 horas. Se recogió el ADN, se digirió y se cromatografió como se ha descrito anteriormente. Se incorporó algo de IdUrd al ADN, quedando el resto del yodo intacto sobre el anillo de pirimidina. Tras la conversión en IdUMP, se deshalogenó parte de la IdUrd por la TS a dUMP, que se convirtió entonces mediante la TS en dTMP y se incorporó después al ADN y se recuperó en el digesto de ADN como [^{3}H-dThd]. Se definió la actividad TS relativa in situ como la fracción del material derivado de IdUrd en el ADN que estaba deshalogenada, es decir, ([^{3}H]-dThd)/([^{3}H]-dThd + [^{3}H]-IdUrd). Estos métodos podrían ser también utilizados con IdUrd no radiactiva si se usa un marcaje isotópico estable, por ejemplo, ^{13}C, ^{15}N o ^{2}H. Un detector espectrométrico de masas substituiría al detector de radiactividad en el análisis de HPLC. No se puede usar IdUrd sin marcar, ya que su deshalogenación produciría dThd no marcada, que sería indistinguible del pool endógeno de dThd en el ADN.

Ejemplo 1

Se convirtió FAUMP en FMAUMP por TS en extractos celulares, según demuestra la acumulación de agua tritiada. La velocidad de conversión en FMAUMP era aproximadamente el 1% de la velocidad de formación de dTMP a partir de dUMP (Figura 5). La incubación continua de las células durante 72 horas con el análogo de dUrd, FAU, produjo grados variables de inhibición del crecimiento (Fig. 2A). A 100 \muM, las células CEM y U-937 resultaban inhibidas en más de un 50%, MOLT-4 y K-562 resultaban algo menos inhibidas , pero las células Raji y L1210 estaban completamente sin inhibir.

Ejemplo 2

La incubación continua de las células durante 72 horas con el análogo de timidina, FMAU, era más potente y consistentemente tóxica. FMAU producía una inhibición dependiente de concentración del crecimiento para todas las líneas celulares (Fig. 2B). A la concentración más baja usada (0,3 \muM), hubo un efecto substancial sobre el crecimiento celular de CEM y K-562. A 100 \muM, todas las líneas celulares estudiadas resultaron completamente inhibidas (>80%). El correspondiente análogo de desoxiuridina, FAU, era menos tóxico en todas las líneas celulares y tenía valores de CI_{50} que eran 10 veces mayores que con FMAU (Figura 2A). Fue de lo más sorprendente que el crecimiento de las células L1210, que eran muy sensibles a FMAU, no resultó inhibido por FAU, incluso a 1 mM.

Tanto FMAU como FAU se convirtieron intracelularmente en nucleótidos FMAU y se incorporaron posteriormente al ADN celular como FMAU(MP). Tal como se describe en la siguiente Tabla I, las líneas celulares CEM y U-937 eran las líneas celulares más eficientes en la formación de FMAUTP a partir de FAU y, por ello, FMAU se incorporó en mayor grado al ADN de estas líneas celulares.

TABLA I Nucleótidos intracelulares formados e incorporación al ADN por incubación de cada línea celular con 10 \muM de FAU durante 24 horas

4

n.d. = no detectable.

Esta mayor incorporación al ADN fue reflejada como una mayor toxicidad observada para CEM y U-937 en la Figura 2A. Por el contrario, FAU produjo menos incorporación de FMAU al ADN celular de la línea celular L1210. Esto quedó reflejado como menos de un 10% de reducción en la velocidad de crecimiento, incluso a 1 mM. Las células K-562 tenían un pool de FAUMP intracelular notablemente mayor. Sólo se encontraron cantidades traza de FMAUMP o FMAUDP.

Cuando se representó el crecimiento celular frente al % de incorporación de FMAU en el ADN (Figura 3), a la misma escala usada para la concentración extracelular, la curva de respuesta era mucho más escarpada. Además, la variación entre líneas celulares en la CI_{50} para la inhibición del crecimiento en la toxicidad haciendo referencia al % de incorporación al ADN mostró una variación mucho menor que cuando se hace referencia a la concentración extracelular. Se obtuvieron curvas completas para FMAU en la totalidad de las 6 líneas celulares. Para FAU, debido a las mayores cantidades de fármaco requeridas, se construyeron curvas completas en sólo 2 líneas celulares y se obtuvieron puntos simples para las otras líneas celulares.

Ejemplo 3

La Figura 4 presenta la sensibilidad relativa de las líneas celulares a la inhibición del crecimiento por FAU en comparación con el potencial de activación para TS, medida independientemente como deshalogenación relativa de IdUrd. Las líneas celulares más sensibles (U-937, CEM, MOLT-4) tienen un 50% o más de deshalogenación. Las líneas menos sensibles (RAJI, L1210), tienen un 15% o menos de deshalogenación.

Se evaluó la toxicidad de los compuestos de la presente invención en un sistema modelo animal. Se administró FAU por sondaje oral a ratones a una dosis de 5 g/kg una vez al día durante 14 días consecutivos. Después de 14 días adicionales de observación después de este período de dosificación, se sacrificaron los animales. El examen histopatológico de los tejidos murinos no halló toxicidad atribuible al tratamiento con el fármaco. Se obtuvieron muestras de sangre a diversos tiempos durante este tratamiento para confirmar que el fármaco se absorbía adecuadamente. El análisis de HPLC de estas muestras indicó que las concentraciones de FAU en plasma alcanzaron niveles máximos de 750 micromolar y niveles mínimos de 50 micromolar.

Ejemplo 4

La presente invención incluye nuevos análogos de nucleósidos útiles en tecnologías de imagen, así como métodos de sintetización de dichos análogos. En realizaciones preferidas, el análogo de nucleósido contendrá un resto emisor de positrones. Dicho resto puede ser un solo átomo o una pequeña molécula que contenga un átomo emisor de positrones. En una realización más preferida, el resto emisor de positrones será un átomo de ^{18}F.

Los nuevos análogos de nucleósidos de la presente invención pueden ser preparados por una modificación del procedimiento descrito por Tann C.H. y col., "Fluorocarbohydrates in synthesis. An efficient synthesis of 1-(2-deoxy-2-fluoro-alpha-D-arabinofuranosyl)-5-yodo-uracil (beta-FIAU) and 1-(2-deoxy-2-fluoro-alpha-D-arabi-nofuranosyl)thymine (beta-FMAU)", J. Org. Chem. 50: 3644-47, 1985, y por el mismo grupo en la patente EE.UU. 4.879.377, concedida a Brundidge y col.

El presente método de sintetización de un compuesto según la presente invención conlleva el contacto de una primera molécula de la fórmula

5

donde R_{1}, R_{2} y R_{5} pueden ser iguales o diferentes y son grupos bloqueantes; R_{3} es un grupo saliente y, en realizaciones preferidas, puede ser triflato, mesilato, tosilato o imidazolsulfonilo, y R_{4} es H, con una segunda molécula que contiene un marcaje en condiciones que causan la transferencia del marcaje a la posición ocupada por R_{4}. El compuesto marcado resultante es bromado en la posición 1 y luego condensado con una molécula de la fórmula

6

donde

A

\;

=

N o C;

B

\;

=

H, hidroxi, halógeno, acilo (C_{1}-C_{6}), alquilo (C_{1}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6});

D

\;

=

O, S o NH_{2}, y

E

\;

=

H.

La síntesis puede ser iniciada con 1,3,5-tri-O-benzoil-alfa-D-ribofuranósido, que está comercializado, por ejemplo, por Aldrich Chemical Company. Este material es modificado para generar el precursor para la fluoración por adición de un resto de imidazosulfonilo en la posición 2 en la posición ribo ("inferior").

Se mezclan 187 mg de 1,3,5-tri-O-benzoil-al-fa-D-ribofuranósido con 1,54 ml de cloruro de metileno. Se protege la mezcla de la humedad con un tubo de desecación de cloruro de calcio o de sulfato de calcio mientras se enfría en un baño helado de sal a -20ºC. Se añaden lentamente 70 microlitros (110 mg) de cloruro de sulfurilo a través de un embudo de adición a lo largo de 20 minutos. Se añaden 0,44 ml de cloruro de metileno seco para lavar los sólidos. Se añade imidazol en 5 porciones iguales que totalizan 10 equivalentes (270 mg). Se retira la mezcla de reacción del baño refrigerante y se deja que la reacción continúe durante 2 horas. A medida que procede la reacción, la mezcla se volverá de color amarillo brillante.

Después de lavar con agua y de secar con sulfato de sodio, se cristaliza con hexano a 0-5ºC durante 16 horas. Se recogen los pequeños cristales blancos, se disuelven en acetona hirviendo y se filtran en caliente. Se añade agua hirviendo, se deja luego cristalizar a 4ºC durante 16 horas y se recogen los cristales por centrifugación.

El compuesto resultante ha mostrado ser estable durante al menos varios meses a temperatura ambiente y puede ser enviado al sitio clínico o al centro de radiosíntesis regional, donde puede ser almacenado hasta necesitarlo.

Procedimiento de fluoración

Debido a la corta vida media del ^{18}F (110 minutos), el nucleósido fluorado debe ser preparado el día de su uso clínico. En estas circunstancias, las etapas de reacción son optimizadas durante tiempos cortos, siendo el rendimiento una consideración secundaria.

El día de su uso, se disuelven 10 mg del imidazosulfonilazúcar en 200 microlitros de acetonitrilo. Se prepara ^{18}F a partir de un ciclotrón en forma de KHF_{2} y se disuelven 300 mCi (por ejemplo, combinado con 1,32 mg de KHF_{2} no marcado) en 50 microlitros de una dilución 1:100 de ácido acético. En presencia de diversos solventes orgánicos, tales como dietilenglicol o butanodiol, el ^{18}F del KHF_{2} desplaza el resto imidazosulfonilo del anillo de arabinosa y asume la posición ara ("superior"). El solvente de reacción preferido es 200 microlitros de 2,3-butanodiol. Si se usa un volumen menor de solvente (solución más concentrada de reactivos), no se necesita ácido acético. Las condiciones de incubación preferidas son 15 minutos a 170ºC. Este producto de reacción puede ser verificado con material auténtico, comercializado en la forma no radiactiva por Sigma Chemical Co. Se produce un mínimo de un 8% de rendimiento, en base a la incorporación de ^{18}F.

Aunque el imidazosulfonilo es el grupo intercambiador preferido para la fluoración, otros grupos salientes adecuados son equivalentes para este fin. Como ejemplos de otros grupos adecuados se incluyen, aunque sin limitación, triflato, mesilato y tosilato, que pueden ser usados en lugar del resto imidazolsulfonilo. Las versiones del triflato y del mesilato son fácilmente fluoradas, pero la reacción de la forma tosilato es menos satisfactoria. Los expertos en la técnica apreciarán que otros grupos intercambiadores son equivalentes para los fines de la presente invención. En la medida en que la reacción del grupo intercambiador con el reactivo fluorado sea rápida y eficiente y produzca mínimos productos colaterales, cualquier grupo intercambiador conocido para los técnicos es equivalente. Berridge y col (1986), Int. J. Rad. Appl. Inst. Parte A 37(8): 685-693, describen otros grupos intercambiadores adecuados.

Alternativamente, hemos mostrado que se puede formar 2-fluoro-2-desoxi-1,3,5-tri-O-benzoil-alfa-D-ara-binofuranosa por reacción directa de 1,3,5-tri-O-benzoil-alfa-D-arabinofuranosa no derivatizada con DAST, trifluoruro de dietilaminoazufre, que puede ser fácilmente producido con ^{18}F. La síntesis de ^{18}F DAST está descrita por Straatmann y col. (1977), J. Nucl. Med. 18: 151-158.

Al final del período de reacción, se añaden 2 ml de cloruro de metileno, seguido de 2 ml de agua. Se transfiere la capa del cloruro de metileno a un tubo que contiene 2 ml de agua. Se transfiere entonces la capa del cloruro de metileno a otro tubo y se seca bajo una corriente de aire o de gas inerte. Se añaden luego 400 microlitros de acetonitrilo, 100 microlitros de ácido acético y 30 microlitros de HBr (30% p/p en ácido acético). Se conduce la reacción a 125ºC durante 5 minutos, produciendo un rendimiento mínimo del 50% de 1-Br-2-F-3,5-di-O-benzoil-alfa-D-arabinofura-
nosa.

Al final de esta etapa de reacción, se añaden 1 ml de tolueno y 0,5 ml de agua. Se transfiere la capa toluénica a otro tubo y se seca bajo una corriente de aire o de gas inerte. Se añaden 0,5 ml adicionales de tolueno y se seca. Se "condensa" el bromofluoroazúcar con una base de pirimidina (por ejemplo, uracilo, timina, yodouracilo) en donde las posiciones 2 y 4 han sido sililadas (por ejemplo, con hexametildisilazano), para formar derivados bistrimetilsililo (TMS). El TMS-Ura está comercializado por Aldrich. Se pueden preparar otras bases pirimidínicas protegidas con TMS (por ejemplo, TMS-Thy o TMS-IUra) antes del día de su utilización y enviarlas al sitio, como con el imidazosulfonilazúcar. La preparación de bases protegidas con TMS está descrita por White y col. (1972), J. Org. Chem. 37: 430. Se pueden usar en lugar de TMS otros grupos protectores adecuados que puedan ser eliminados tras la reacción en condiciones que no causen un deterioro substancial del producto. La selección de grupos protectores adecuados y las condiciones para su uso son bien conocidas para los expertos en la técnica.

Se secan 200 microlitros de una solución de TMS-Ura (u otra base) y se añade 1 ml de cloruro de metileno. Se transfiere la mezcla al tubo que contiene el fluorobromoazúcar. Se calienta el tubo a 170ºC durante 15 minutos y se seca después, para producir un rendimiento de al menos un 25% de 2,4-di-TMS-3',5'-di-O-benzoil-2'-arabino-F-2'-desoxiuridina cuando se usa TMS-Ura.

Para eliminar los grupos bloqueantes de las posiciones 3' y 5' del azúcar y de las posiciones 2 y 4 de la base, se añaden 0,3 ml de amoníaco 2M en metanol. Se calienta la mezcla a 130ºC durante 30 minutos. Se purifica el producto final, por ejemplo ^{18}F-FAU (por ejemplo usando un cartucho de extracción de fase sólida o líquida o cromatografía liquida de alto rendimiento), y se prepara para administración en cualquier solvente farmacéuticamente aceptable. Se puede usar cualquier solvente que sea seguro cuando se administra a un sujeto en la medida en que el compuesto sea soluble en él. Se obtiene la verificación de la identidad del producto por comparación con material de referencia no radiactivo auténtico usando cualquier técnica estándar para identificación química. Por ejemplo, se pueden obtener FAU y FIAU de Moravek Biochemicals (Brea, CA). También se puede obtener FMAU de Moravek por pedido especial (no aparece en la lista del catálogo).

Ejemplo 5

Se pueden usar los nucleósidos marcados de la presente invención para evaluar el impacto de diversos tratamientos sobre los tumores. Tradicionalmente, la mayoría de las terapias (fármacos y/o radiación) se dirigían a la reducción del crecimiento del tumor de una forma relativamente inespecífica. Más recientemente, se ha puesto énfasis en aproximaciones tales como la diferenciación del tumor en una forma de crecimiento más lento y también en la prevención de las metástasis del tumor. Tanto para la aproximación tradicional como para las nuevas aproximaciones, una consideración clave es la determinación precoz del éxito o del fallo de la modalidad de tratamiento inicial, con posterior modificación del tratamiento según sea necesario. Como todas las terapias tienen efectos colaterales (substanciales), la penalización por una valoración incorrecta es doble: además de la pérdida de un tiempo valioso para encontrar un tratamiento alternativo, se sufre una toxicidad innecesaria.

Las herramientas estándar para la evaluación son con frecuencia inadecuadas para obtener información oportuna. Un tumor puede realmente dejar de crecer y la masa activa encogerse, pero este éxito es enmascarado por la presencia continua de áreas no viables, tales como tejido necrótico o calcificado. Así, el éxito en el tratamiento queda enmascarado porque el tumor no cambia de tamaño por valoraciones de base anatómica, tales como los Rayos X o los barridos CAT. De forma similar, cuando el tumor deja de responder a la terapia y comienza a crecer, el fallo queda enmascarado inicialmente porque el tejido viable representa sólo una minoría de la lesión anatómicamente determinada.

Estos problemas pueden ser resueltos por imagen funcional con los nucleósidos marcados de la presente invención. Los métodos de imagen que utilizan compuestos de este tipo son más informativos, ya que tienen la ventaja de enfocarse sólo en el tejido viable. Esto permite la determinación del éxito o del fallo del tratamiento incluso en presencia del "ruido" procedente del tejido no viable.

Para la imagen de los tumores, se preparan nucleósidos marcados, preferiblemente marcados con ^{18}F, como se ha descrito antes. Los compuestos pueden ser generalmente administrados a un sujeto del que se ha de obtener una imagen a una dosis de desde aproximadamente 1 mCi hasta aproximadamente 60 mCi. En realizaciones preferidas, los compuestos marcados serán administrados en dosis de desde aproximadamente 1 mCi hasta aproximadamente 20 mCi. En una realización más preferida, los compuestos de la presente invención serán administrados en dosis de desde aproximadamente 10 mCi hasta aproximadamente 20 mCi. El límite inferior del rango de dosificación es determinado por la capacidad para obtener imágenes útiles. Dosificaciones inferiores a aproximadamente 1 mCi pueden estar indicadas en ciertos casos. El límite superior del rango de dosificación es determinado sopesando el potencial de daños inducidos por la radiación en el sujeto frente al valor potencial de la información que se obtendrá. En determinados casos, puede ser necesario administrar una dosificación mayor de aproximadamente 60 mCi.

Los compuestos radiomarcados de la presente invención pueden ser administrados en cualquier solvente farmacéuticamente aceptable en el que sean solubles. En realizaciones preferidas, los compuestos serán disueltos en solución salina normal o en solución salina tamponada. Los compuestos de la invención serán administrados por cualquier vía conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la administración puede ser oral, rectal, tópica, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, parenteral, intramuscular o por cualquier otra vía que se calcule administrará el compuesto al tejido cuya imagen se ha de obtener. En realizaciones preferidas, los compuestos serán administrados por bolo intravenoso.

Se pueden adquirir las imágenes desde aproximadamente 5 minutos después de la administración hasta aproximadamente 8 horas después de la administración. El período máximo en el que se pueden adquirir las imágenes es determinado por tres factores: la vida media física de ^{18}F (110 minutos), la sensibilidad de los detectores en la maquinaria de imagen y el tamaño de la dosis administrada. Los expertos en la técnica pueden ajustar estos factores para permitir la adquisición de imágenes en un tiempo apropiado. También se obtienen generalmente muestras de sangre para confirmar la adecuada administración de la dosis administrada.

Los expertos en la técnica pueden utilizar los compuestos marcados de la presente invención para obtener datos útiles de imagen. Los detalles de los procedimientos de imagen son bien conocidos y pueden ser obtenidos en numerosas referencias; por ejemplo, Lowe y col. demuestran el uso de tomografía de emisión de positrones para analizar nódulos pulmonares (J. Clin. Oncology 16: 1075-88, 1998), mientras que Rinne y col. demuestran el uso de una sonda marcada con ^{18}F en protocolos de imagen para analizar la eficacia del tratamiento en pacientes con melanomas de alto riesgo utilizando tomografía de emisión de positrones de ^{18}F-fluorodesoxiglucosa de cuerpo entero (Cancer 82: 1664-71, 1998).

Claims (16)

1. Un método de selección de un análogo de uridina adecuado para reducir o inhibir la replicación o propagación de células tumorales, consistente en las siguientes etapas:

proporcionar un análogo de uridina que esté sin substituir en la posición 5 y que tenga un fosfoazúcar o análogo de azúcar unido a la base;

estudiar dicho análogo de uridina en cuanto a activación por la timidilato sintasa, según se mide por la metilación en la posición 5, y

seleccionar dicho análogo de uridina cuando se ve que es activado por la timidilato sintasa.

2. Un método según la reivindicación 1, donde la etapa de estudio consiste en:

medir la citotoxicidad de dicho análogo de uridina con respecto a al menos una línea celular con una alta expresión de la enzima timidilato sintasa y a al menos una línea celular con una baja expresión de la enzima timidilato sintasa,

y la etapa de selección consiste en:

seleccionar dicho análogo de uridina cuando la citotoxicidad medida con respecto a la al menos una línea celular con alta expresión de la enzima timidilato sintasa es mayor que la citotoxicidad medida con respecto a la al menos una línea celular con baja expresión de la enzima timidilato sintasa.

3. Un método según la reivindicación 2, donde la al menos una línea celular con alta expresión de la enzima timidilato sintasa es una línea celular U937 o una línea celular CEM.

4. Un método según la reivindicación 2 ó 3, donde la al menos una línea celular con una baja expresión de la enzima timidilato sintasa es una línea celular L1210 o una línea celular Raji.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el análogo de uridina contiene un radioisótopo, eventualmente ^{18}F o ^{11}C.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el análogo de uridina es un compuesto de la siguiente fórmula general:

7

donde:

A

\;

=

N o CH;

B

\;

=

H, hidroxi, halógeno, acilo (C_{1}-C_{6}), alquilo (C_{1}-C_{6}) o alcoxi (C_{1}-C_{6});

D

\;

=

O, S o NH, y

G

\;

=

azúcar cíclico substituido o no substituido, azúcar acíclico substituido o no substituido, azúcar mono-, di- o trifosfocíclico fosfato substituido o no substituido, azúcar mono-, di- o trifosfo-acíclico fosfato substituido o no substituido, análogos de azúcares mono-, di- o trifosfocíclicos substituidos o no substituidos y análogos de azúcares mono-, di- o trifosfoacíclicos substituidos o no substituidos, donde los substituyentes son alquilo (C_{1} a C_{6}), alcoxi (C_{1} a C_{6}) o halógeno.

7. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para uso en un método de diagnóstico de tumores en el organismo humano o animal.

8. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento de los tumores o del cáncer o de alivio de los efectos citopáticos asociados a los tumores o al cáncer, cuyo método consiste en administrar el medicamento en una cantidad efectiva para reducir o inhibir la replicación o la propagación de células tumorales o cancerosas o para aliviar dichos efectos citopáticos.

9. Uso según la reivindicación 8, donde el análogo de uridina es FAU, d-Urd o ara-U.

10. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un agente diagnóstico para uso en el diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa.

11. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un agente diagnóstico para uso en la valoración de la adecuación de tratamiento de un tumor con un inhibidor de la timidilato sintasa.

12. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un agente para uso en un método de diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método de diagnóstico de tumores consiste en las siguientes etapas:

(a)

administrar a dichos tumores uno de dichos análogos de uridina, donde dicho análogo está marcado con un emisor de positrones, y

(b)

medir la incorporación al ADN por imagen externa.

13. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un agente para uso en un método de valoración para valorar la adecuación del tratamiento de tumores con inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método de valoración consiste en las siguientes etapas:

(a)

administrar uno de dichos análogos de uridina, donde dicho análogo está marcado con un emisor de positrones, y

(b)

determinar el grado de inhibición máxima de la timidilato sintasa y la persistencia de la inhibición de la timidilato sintasa a lo largo del tiempo entre dosis por imagen externa.

14. Uso según la reivindicación 12 ó 13, donde el emisor de positrones es ^{18}F o ^{11}C.

15. Uso según la reivindicación 12 ó 13, donde se consigue la imagen externa usando tomografía de emisión de positrones.

16. Uso de un análogo de uridina que puede ser seleccionado según un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un agente para uso en un método de diagnóstico de tumores que son resistentes a los inhibidores de la timidilato sintasa, cuyo método de diagnóstico de tumores consiste en las siguientes etapas:

(a)

administrar el agente a un paciente antes de obtener especímenes de biopsia,

(b)

obtener los especímenes de biopsia y

(c)

analizar el ADN de los especímenes de biopsia en cuanto al grado de incorporación del análogo de uridina.