ES2237204T3 - Ensayo de neutralizacion usando particulas similares al virus de papilomavirus humano. - Google Patents
Ensayo de neutralizacion usando particulas similares al virus de papilomavirus humano.Info
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Abstract
Esta invención se refiere a un ¿pseudovirión¿ de papilomavirus que comprende una partícula similar al virus (VLP) que está covalentemente unida a un constructo de ADN del gen indicador. En formas de realización preferidas, las VLP son VLP de papilomavirus humano (HPV). Esta invención también incluye ensayos para determinar si un anticuerpo anti-VLP está presente en una muestra, que comprende las etapas de: combinar un cultivo celular susceptible de infección por los pseudoviriones, la muestra, y pseudoviriones; y medir la cantidad captada de pseudoviriones por la célula. La captación puede compararse con un control en el que no hay muestra o la muestra es una muestra preinmune, en la que una disminución de la captación celular de pseudoviriones indica la presencia de anticuerpos neutralizantes en la muestra. Otro aspecto de esta invención es un procedimiento de preparar el constructo del pseudovirión, que comprende generar VLP relativamente puras y unir el constructo del gen indicador con un reticulante heterobifuncional. Otro aspecto más de esta invención es un procedimiento de liberación de un gen indicador en una célula que comprende infectar una célula con un pseudovirión.
Description
Ensayo de neutralización usando partículas
similares al virus del papilomavirus humano.
Esta invención trata de un procedimiento nuevo
para la detección de anticuerpos neutralizantes del papilomavirus
humano (HPV) en suero o plasma.
Los papilomavirus humanos (HPV) infectan el
tracto genital y se han asociado con varias displasias, cánceres y
otras enfermedades. En la actualidad, estas enfermedades son los
objetivos de los desarrollos de vacunas y actualmente se están
llevando a cabo estudios con vacunas basadas en partículas similares
a virus (VLP) que contienen sólo proteínas de la cápside L1 o
L1+L2.
Para probar las vacunas candidatas sería deseable
la realización de ensayos de neutralización. Aunque en la
actualidad se han descrito alrededor de 100 tipos de HPV, sólo hay
algunos tipos de HPV para los que existen ensayos de
neutralización. Dado que el HPV no crece en cultivo tisular, el
desarrollo de ensayos de neutralización para HPV ha sido
difícil.
Para facilitar el desarrollo de vacunas, sería
deseable desarrollar un ensayo básico de neutralización que pudiera
modificarse con facilidad de forma que se disponga un ensayo de
neutralización para cualquier tipo de HPV.
Roden y col., J. Virol., 1996,
5875-5883 y Kawana y col., J. Virol., 1998,
10298-10300 describen un ensayo para determinar si
en la muestra hay anticuerpos neutralizantes
anti-HPV.
En el documento
US-A-5795754 (Merck y Co., Inc.) se
describen VLP sintéticas y ensayos que las usan para validar las
VLP fabricadas mediante tecnologías de ADN recombinante.
Esta invención se refiere a un
"pseudovirión" de papilomavirus que comprende una partícula
similar al virus (VLP) que está covalentemente unida a un constructo
de ADN del gen indicador. En formas de realización preferidas, las
VLP son VLP de papilomavirus humano (HPV).
Esta invención también incluye ensayos para
determinar si un anticuerpo anti-VLP está presente
en una muestra, que comprende las etapas de: combinar un cultivo
celular susceptible de infección por los pseudoviriones, la muestra,
y pseudoviriones; y medir la cantidad captada de pseudoviriones por
la célula. La captación puede compararse con un control en el que
no hay muestra o la muestra es una muestra preinmune, en la que una
disminución de la captación celular de pseudoviriones indica la
presencia de anticuerpos neutralizantes en la muestra.
Otro aspecto de esta invención es un
procedimiento de preparar el constructo del pseudovirión, que
comprende generar VLP relativamente puras y unir el constructo del
gen indicador con un reticulante heterobifuncional.
Otro aspecto más de esta invención es un
procedimiento de liberación de un gen indicador en una célula que
comprende infectar una célula con un pseudovirión.
La figura 1 es un esquema que muestra un
constructo de gen indicador sobre la base de un gen de
beta-lactamasa (BLAM).
La figura 2 muestra la inhibición de la captación
del pseudovirión HPV16 hacia el interior de las células por el
anticuerpo monoclonal neutralizante del HPV16 H16.V5.
La figura 3 muestra la inhibición de la captación
del pseudovirión HPV16 hacia el interior de las células por el
anticuerpo neutralizante en los sueros de individuos inmunizados
con VLP de HPV16.
Como se usa en la memoria descriptiva y las
reivindicaciones, se aplican las siguientes definiciones:
"Pseudovirión" quiere decir una partícula
similar al virus del papilomavirus que está químicamente ligada o
unida a un constructo del gen indicador, bien directamente o a
través de un grupo de unión.
"Constructo del gen indicador" quiere decir
cualquier ácido nucleico que codifica una proteína cuya actividad
transcripcional, traduccional o postraduccional se puede detectar
de un modo conveniente, junto con elementos necesarios conocidos
requeridos para el control de su transcripción y traducción
(incluidos, por ejemplo, promotores, intensificadores, secuencias de
terminación de la transcripción y similares). Entre los ejemplos de
constructos de genes indicadores se incluyen genes para la
beta-galactosidasa, la luciferasa y la proteína
verde-fluorescente, y similares.
Los pseudoviriones y los procedimientos para
usarlos no dependen de cualquier cepa de papilomavirus o de
cualquier otra cápside viral. En las formas de realización
preferidas, el papilomavirus es un papilomavirus humano (HPV), y
particularmente se prefiere que el HPV sea una de las cepas
asociadas con las verrugas genitales y/o los cánceres genitales, y
se pueden seleccionar del grupo constituido por: HPV6a, HPV6b,
HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44,
HPV45, HPV51, HPV52 y HPV56.
Se puede preparar un pseudovirión a partir de
prácticamente cualquier VLP de papilomavirus. En general una VLP de
tipo salvaje está formada por, predominantemente, L1 y una cantidad
pequeña de la proteína L2. Sin embargo, se sabe que las VLP pueden
contener sólo proteína L1, Además, se han descrito VLP que
contienen proteína L1 modificada, proteínas L2 modificadas,
proteínas (naturales o no, tales como proteínas HPV E) que se han
condensado a al menos una porción de las proteínas L1 o L2, y/o una
proteína adicional no natural. Para los propósitos de esta
invención, se pueden usar cualquiera de los anteriores como
materiales de partida para la construcción de pseudoviriones. En
general, las VLP preferidas contienen L1 o la combinación de
proteínas L1 y L2 ("L1 + L2").
Las VLP que contienen proteína L1 o L1+L2 se
pueden preparar mediante la transformación de una células huésped
seleccionada con genes que codifican las proteínas L1 o L1 + L2. En
la técnica se conocen, y pueden usarse, técnicas generales, los
genes para varios tipos de L1 y L2 y procedimientos para la
expresión recombinante de las proteínas L1 y L2. Entre las células
huésped preferidas se incluyen levaduras, células de insectos,
células de mamíferos y E. coli.
En una forma de realización preferida de esta
invención, las levaduras se transforman con ADN plasmídico que
contiene los genes que codifican la proteína L1 bajo el control de
promotores de levadura conocidos, tales como los promotores de
levadura Gal 1 y Gal 10. La expresión del producto génico se induce
mediante la adición de galactosa al medio de crecimiento y las VLP
se aíslan de los lisados de células inducidas.
Prácticamente cualquier constructo de gen
indicador se puede acoplar a las VLP para formar un pseudovirión.
Un constructo de gen indicador preferido usado es el gen de beta
lactamasa ("BLAM"), aunque también se pueden usar otros
constructos indicadores que codifican enzimas o proteínas similares
a la beta galactosidasa, la luciferasa, y la proteína
verde-fluorescente o genes que codifican
tránscritos de corte y empalme.
El constructo indicador puede acoplarse a la VLP
usando reacciones de acoplamiento conocidas. En una forma de
realización preferida, el constructo del gen indicador se une a un
ligador disponible comercialmente y el ligador se une a la VLP. Un
reactivo de reticulación preferido es
(succinimidil-maleimidometil-ciclohexano-carboxilato
"SMCC"). Otros reactivos de sobrecruzamiento potencialmente
útiles además del SMCC tendrían las siguientes propiedades: 1)
agentes reticulantes heterobifuncionales o activados secuencial
mente que eliminarían las interferencias oligo-oligo
o la reticulación VLP-VLP, 2) reacciones estables
con oligonucleótidos modificados 5'-amino o
5'-tiol, 3) reacciones estables con amina primaria,
sulfhidrilo libre o restos carbohidrato en la proteína VLP. Estos
reactivos incluirían, aunque no se limitan a ellos, los siguientes
y sus derivados sulfatados: SMPB
(succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato),
SIAB (succinimidil(4-yodoacetil)amino
benzoato), GMBS
(n-(4-maleimido-butiriloxi)-succinimida),
MBS (éster de m-maleimidobenzoil sulfosuccinimida)
y MPBH ( clorhidrato de hidrazida de ácido
4-(4-N-maleimidofenil)
butírico).
Al construir tal ligador, la proporción molar
entre los constructos del gen indicador y la VLP puede variar. De
acuerdo con esta invención, la proporción entre el constructo del
gen indicador y la VLP debería ser de aproximadamente 0,1 a 50,
preferentemente de aproximadamente 1 a 5 y más preferentemente de
sustancialmente aproximadamente 1 a 1.
Una de las ventajas de esta invención es que los
pseudoviriones pueden producirse con facilidad para una variedad de
HPV usando el mismo indicador y sistemas de prueba. Otra ventaja es
que, si se desea, los sistemas indicadores se pueden modificar con
facilidad.
Un aspecto importante de esta invención es el uso
de pseudoviriones para detectar la presencia de anticuerpos
neutralizantes. Aunque se conoce algo de información acerca de la
biología del HPV y de otros papilomavirus, todavía no se ha logrado
cultivarlos in vitro. Además, aunque un gran número de
especies animales es susceptible a la infección por papilomavirus,
cada especie sólo es susceptible a sus propias cepas de
papilomavirus. Por tanto, por ejemplo, aunque el papilomavirus del
conejo de cola de algodón (CRPV) se puede estudiar con éxito en el
conejo de cola de algodón y usarse como modelo para la enfermedad
humana, el papilomavirus humano no puede estudiarse directamente en
el conejo. En la actualidad se están desarrollando varias vacunas
con base de VLP de HPV, pero hasta la fecha no se dispone de
ensayos de neutralización para todas las cepas de HPV.
En el ensayo de esta invención se ponen en
contacto un pseudovirión de la invención, una muestra de la que se
sospecha que contiene anticuerpos neutralizantes y un cultivo
celular. Las células usadas en este ensayo pueden ser cualquier
célula de la que se sabe que es susceptible a la infección por
papilomavirus. Para los pseudoviriones de HPV, las células pueden
ser células de carcinoma humano, tales como C33A (disponibles en la
ATCC), células HeLa y similares. Si la muestra (que en formas de
realización preferidas puede ser suero de un paciente) contiene
anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos neutralizantes
interaccionarán con los pseudoviriones e interferirán con la
captación de los pseudoviriones por la célula. Opcionalmente se
puede realizar un ensayo control, en el que se usan los mismos
pseudoviriones y células, pero la muestra se elimina o se sustituye
una muestra de la que se sabe que contiene anticuerpos
neutralizantes. Otros ejemplo de una muestra control es una
procedente de una fuente preinmunitaria.
En el ensayo, la menor captación de
pseudoviriones en la célula se correlaciona con la cantidad de
anticuerpo neutralizante presente en la muestra. En función del
constructo del gen indicador empleado, la cantidad se puede
cuantificar. La cuantificación del número de células que expresan
el gen indicador, y la extensión de la expresión, se puede llevar a
cabo con citometría de flujo. La medición simultánea de la
proporción 520 nm/450 nm de longitudes de onda de emisión estará
directamente relacionada con la proporción del sustrato CCF2
escindido en las células individuales y es independiente de la
concentración de sustrato o de las dimensiones de la célula, lo que
tiene como resultado una señal mejor al ruido de la que se puede
obtener con la longitud de onda sola.
Además, las subpoblaciones de células que
responden a la infección podrían enriquecerse mediante selección
celular activada por fluorescencia y cultivarse para expandir la
población de células respondedoras usando, por ejemplo, un ensayo
de RT PCR cuantitativo de una variante de corte y empalme del
indicador. Estos ensayos de esta invención pueden miniaturizarse
y/o automatizarse y usarse en un formato de 96 pocillos para las
selecciones de alto rendimiento.
La invención también permite el marcaje de los
pseudoviriones con distintos marcadores para probar sueros
neutralizantes multivalentes en una mezcla de estos pseudoviriones.
Esto se puede usar para seguir una respuesta multivalente a la
vacuna en un sujeto.
Otro aspecto de esta invención es el uso de
pseudoviriones para transportar diferentes materiales genéticos al
interior de una variedad de células diana. Para construir el
pseudovirión se usa sustancialmente el mismo sistema de unión,
aunque el constructo del gen indicador se sustituye con un
constructo del gen que expresa un gen de elección.
Los siguientes ejemplos no limitantes se
presentan para ilustrar mejor la invención.
Se preparan VLP del HPV 16 esencialmente como se
ha descrito en el documento WO95/31532.
Se extrajo ADN genómico total de células Caski
(ATCC nº CRL 1550) mediante técnicas estándar. El ADN se digirió
con las endonucleasas Bst11071 y Sph1 y se sometió a electroforesis
en un gel preparativo de agarosa a una temperatura de punto de
ebullición bajo al 0,8%. Una región correspondiente a ADN de
aproximadamente 3,5 kpb se escindió del gel y la agarosa se digirió
con la enzima Gelasa™ (Epicentre Technologies, Inc.). El ADN
purificado en gel se enromó con ADN polimerasa T4 y se ligó
oligodesoxinucleótidos ligadores fosforilados de extremos romos que
contiene un sitio HindIII escondido. La mezcla de ligación se
digirió hasta su finalización con HindIII y los aproximadamente 3,5
kpb de ADN se fraccionaron por tamaño mediante un gel de agarosa
como se ha descrito antes. El ADN purificado mediante gel se ligó
con ADN plasmídico pUC18 que se había digerido con HindIII y se
había desfosforilado. Después de las transformación de células CH5
de E. coli competentes (BRL), la biblioteca de plásmidos se
sometió a detección selectiva para detectar clones positivos para
HPV16 mediante hibridación de colonias usando un
oligodesoxinucleótido antisentido marcado con ^{32}P
complementario al extremo 3' del gen de L1 del HPV16
(5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA
GC-3') (ID SEC Nº 1). Se aisló y caracterizó un
plásmido pUC18 con un fragmento genómico de HPV16 de 3,3 kpb
mediante enzimas de restricción y análisis por transferencia
Southern. Este plásmido se denominó pUC18-HPV16
L1/L2 y contiene todas las secuencias de ADN codificadoras de L1 y
L2. El ADN plasmídico se preparó usando el kit Qiagen™ Plasmid Maxi
(Qiagen, Inc.).
El clon, pUC18-HPV16L1/L2 se usó
como molde para la PCR. El gen de HPV16 L1 se amplificó mediante
PCR usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.), 10
ciclos de amplificación (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 s)
y los siguientes cebadores oligodesoxinucleótidos que contienen
sitios adyacentes BgIII (subrayados):
Cebador sentido:
5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC
CTA TGT AGG CC-3'
(ID SEC Nº 2)
(ID SEC Nº 2)
Cebador antisentido: 5' GAG AGA TCT
TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3' (ID SEC Nº
3)
El cebador sentido introduce una secuencia líder
sin traducir de la levadura en dirección 5' al codón de iniciación
de metionina de la HPV16L1 (resaltado en negrita). El producto de
la PCR de 1,5 kpb de L1 se digirió con BgIII, se purificó con gel y
se ligó con el vector pC1/1-GAL digerido con BamHI.
Se aisló un plásmido pC1/1-GAL que contenía el gen
de HPV16L1 y se denominó
p14049-37-1. El gen L1 en
p14049-37-1 se secuenció usando el
kit PRISM™ (ABI, Inc.) y un secuenciados ABI modelo 373a según las
instrucciones del fabricante. Se mostró que el gen L1 en este
aislamiento contenía 3 cambios nucleotídicos con respecto a la
secuencia prototipo publicada, corregida (Kimbauer, R. y col. (1993)
J. Virol. 67: 6929-6936), que tenía como resultado
dos cambios de aminoácidos: His de la posición 202 a Asp; Thr de la
posición 266 a Ala. El análisis de la secuencia del ADN molde
original confirmó que estos cambios también se encontraban
presentes en el clon genómico pUC18-HPV16L1/L2 y que
no habían sido introducidos por la PCR.
El plásmido
p14049-37-1
(pC1/1-GAL + HPV16L1) se digirió con SmaI, que corta
entre el promotor GAL10 y el terminador de la transcripción
ADH1.El gen de HPV16L2 de 1,4 kpb se amplificó mediante PCR
usando el ADN de pUC18-HPV16L1/L2 como molde, la
polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 ciclos de
amplificación por PCR (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 s) y
los siguientes oligodesoxinucleótidos cebadores que contienen
sitios adyacentes SmaI (subrayados):
Cebador sentido: 5' -TCC CCC
GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA
AAC-3'
(ID SEC Nº 4)
(ID SEC Nº 4)
Cebador antisentido:
5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC
TGA-3' (ID SEC Nº
5).
El cebador sentido introduce una secuencia líder
sin traducir de levadura en dirección 5' al codón de iniciación de
metionina de la HPV16L2 (resaltado en negrita). El producto de la
PCR de 1,4 kpb de L2 se digirió con SmaI, se purificó con gel y se
ligó con el vector p14049-37-1
digerido con SmaI. Se aisló un plásmido pC1/1-GAL
que contenía los dos genes, de HPV16L1 y L2, y se denominó
p14049-42-2. El gen L2 en
p14049-42-2 se secuenció usando el
kit PRISM™ (ABI, Inc.) y un secuenciador ABI modelo 373A según las
instrucciones del fabricante. Se mostró que el gen L2 en este
aislamiento contenía 5 cambios nucleotídicos con respecto a la
secuencia prototipo publicada, corregida (Kimbauer, R. y col.
(1993) ant.), que tenía como resultado un cambio de
aminoácidos: Ser de la posición 269 a Pr. El análisis de la
secuencia del clon genómico pUC18-HPV16L1/L2
confirmó que este cambio también estaba presente en el ADN molde
original y que no había sido introducido por la PCR.
Los plásmidos
p14049-37-1
(pC1/1-GAL + HPV16 L1) y
p14049-42-2
(pC1/1-GAL + HPV16 L1 y L2) se usaron para
transformar la cepa 1558 de S. cerevisiae. Las cepas
recombinantes resultantes fueron las números 1678 (HPV16 L1) y 1679
(HPV16 L2), como se muestra en la tabla. Se indujo el crecimiento
de los aislamientos clonales a 30ºC en medio YEHD con 2% de
galactosa durante 68-78 horas. Después de
recolectar las células, los sedimentos celulares se fragmentaron con
perlas de vidrio y los lisados celulares se analizaron para
detectar la expresión de la proteína HPV16L1 o HPV16L2 mediante
análisis de inmunotransferencia. Las muestras que contenían 40 mcg
de proteína celular total se sometieron a electroforesis en geles
de Tris-Glicina al 10% en condiciones reductoras y
de desnaturalización y se sometieron a electrotransferencia en
filtros de nitrocelulosa. La proteína HPV16 L1 se inmunodetectó
usando antisuero policlonal de conejo producido contra una proteína
de fusión trpE-HPV11 L1 (D. Brown y col.,
Virology 201: 46-54) como anticuerpo
principal y unido a HRP, anticuerpo IgG antiratón de burro
(Amersham, Inc.) como anticuerpo secundario. Los filtros se
procesaron usando el kit de detección quimioluminiscente ECL
(Amersham, Inc.). Se detectó una banda de proteína L1 de
50-55 kDa en todas las muestras excepto en el
control negativo (pC1/1 sin gen de L1 o L2). La proteína L2 se
detectó mediante inmunotransferencia como una banda de proteína de
70 kDa usando suero antiHPV16 L2 de ratón producido contra
proteínas de fusión trpE-L2 expresadas en E.
coli como anticuerpo principal. Como anticuerpo secundario se
usó IgG de cabra antiratón unido a HRP (Amersham, Inc.) y los
filtros se procesaron como se ha descrito antes.
La purificación se realizó esencialmente como se
describe en el documento WO 00/09671.
Se recolectaron las células de levadura
transformadas para expresar VLP y se congelaron para almacenar a
70ºC. La suspensión de células de levadura congeladas se sacó del
almacenamiento y se descongeló durante aproximadamente 3 horas a
temperatura ambiente, seguido por aproximadamente 18n horas a 4ºC. A
la suspensión celular se añadió BENZONASE® (Nycomed Pharma A/S,
Copenhague, Dinamarca) (2,8 x 10^{5} unidades/ml y 0,21 mg
proteína/ml) hasta una concentración final de 750 unidades por
gramo de peso celular húmedo, y en un experimento se redujo hasta
335 unidades por gramo de peso celular húmedo. Las células se
agitaron durante 15 minutos, se fragmentaron mediante dos pases a
través de un homogeneizador desinfectado APV Gaulin 30CD a presiones
de cámara de 99977,5 kPa a 110320 kPa, lo que tuvo como resultado
una alteración celular del 95%. El lisado restante se agitó
suavemente durante 18 horas a 4ºC.
Aclaración por microfiltración. El lisado
celular se aclaró mediante microfiltración de flujo transversal en
modo de diafiltración de la siguiente manera. El lisado se
transfirió a un tanque de procesamiento estéril con puertos de
entrada y de salida de un diámetro de 2,54 cm. El microfiltro es un
cartucho de filtro de fibra hueca con un tamaño de poro de 0,65
micrómetros con una superficie de 0,4645 metros cuadrados (A/G
Technologies
CFP-6-D-8A, Needham,
MA) introducido en un sistema FlexStand® Benchtop Pilt Hollow Fiber
de A/G Technologies. El producto retenido se diafiltró con 3
volúmenes de tampón de diafiltración (a continuación) para producir
el lisado aclarado. El tampón de diafiltración era 0,2M (Na+) MOPS,
pH 7,0 + NaCl 0,4M.
Cromatografía del lisado aclarado. El
lisado aclarado se fraccionó mediante cromatografía en columna
usando una resina de cromatografía de intercambio de cationes
POROS® 50HS (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) empaquetada en
una columna de cromatografía. La columna se sanitizó con NaOH 0,5N
antes de usar. La columna se equilibró con Tampón de diafiltración
de HPV [MOPS (Na+) 0,2M, pH 7,0 + NaCl 0,4M] a temperatura
ambiente. El lisado aclarado frío (4ºC) se bombeó en la columna a
125 ml/minuto y la columna se lavó con 8 volúmenes de columna de
tampón A de la columna de HPV a temperatura ambiente [MOPS (Na+)
0,05M, pH 7,0 + NaCl 0,5M] a 125 ml/minuto con un gradiente lineal
entre el Tampón A de Columna de HPV al 100% y el Tampón B de
Columna de HPV al 100% [MOPS (Na+) 0,05M, pH 7,0 + NaCl 1,5M]. El
gradiente lineal total fue de 10 volúmenes de columna y se recogió
en 10 fracciones de igual volumen. Tras el gradiente, la columna se
lavó con dos volúmenes de columna de Tampón B de Columna de HPV a
125 ml/minuto a temperatura ambiente que se recogieron en dos
fracciones adicionales. Las fracciones se recolectaron en botellas
de plástico estériles de 2 litros y se almacenaron a 4ºC. Las
fracciones que contenían el último pico de absorción en UV (A 280
nm y A 230 nm) en el gradiente se agruparon, se filtraron usando una
unidad de filtro desechable MILLIPAK-200
(Millipore, Bedford, MA) y se almacenaron a 4ºC.
Cromatografía en hidroxiapatita. Todas las
etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Una columna de
cromatografía (13 mm ID x 36 mm) se empaquetó con hidroxiapatita
cerámica del tipo II (BioRad, cat. nº 7320081, Hercules, CA), se
equilibró previamente en MOPS 50 mM, pH 7,0 + NaCl 1,25 M. La
solución de HPV parcialmente purificada de la etapa anterior se
aplicó a la columna a un caudal lineal de 90 cm/hora. Después de
completar la aplicación de la muestra, la columna se lavó con ocho
volúmenes de columna de tampón pre-equilibrio hasta
que la densidad óptica del efluente de la columna era casi cero. El
producto de HPV se eluyó con un gradiente lineal de 0% a 100% de
tampón de elución (fosfato sódico 0,2M, pH 7,0 + NaCl 1,25M),
también a un caudal lineal de 90 cm/hora. El volumen total del
gradiente fue de cuatro volúmenes de columna. Las fracciones que
contenían el producto vacunal se identificaron mediante RIA y el
ensayo de proteínas de Bradford. La concentración proteica del
producto fue de 100 \mug/ml.
Ensayos: los ensayos de proteína de
Bradford se llevaron a cabo usando reactivo de ensayo Coomassie
Plus (Pierce, Rockford, IL) con seroalbúmina bovina (BSA) como
patrón. Los ensayos de proteína de Lowry se llevaron a cabo de
acuerdo con el procedimiento de Lowry y col. 1951 J. Biol. Chem.
193: 265-270 con BSA como patrón de calibración. El
antígeno se analizó mediante un ELISA de multicapas usando un
anticuerpo monoclonal que reconocía un epítopo conformacional de la
VLP. Placas de microtitulación se recubrieron con anticuerpos
policlonales frente a VLP antiHPV de cabra.
Las muestras estándar y de prueba se diluyeron
con PBS con BSA al 1% p/v, TWEEN-20 al 0,1% y azida
sódica al 0,1% y se añadieron a los pocillos donde los anticuerpos
unidos a la placa capturaban el antígeno. El anticuerpo monoclonal
antiHPVL1 (Chemicon, Temecula, CA) se añadió a los pocillos para
ligar el antígeno capturado por los anticuerpos unidos a la placa.
Los anticuerpos monoclonales antiHPV frente a VLP se detectaron
mediante anticuerpos IgG antiratón conjugados con la peroxidasa de
rábano. Se añadió un sustrato cromogénico para la peroxidasa de
rábano, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Pierce) y la
absorbancia a 450 nm fue proporcional a la concentración de VLP L1
de la muestra.
El gen indicador de beta lactamasa se construyó
del siguiente modo: se diseñaron oligos 5'-amina
modificados, se sintetizaron (Midland Certified Reagents; Midland,
TX) y se usaron para amplificar la sección del vector Aurora
pcDNA3-BLAM (Zlokarnik y col., 1998 Science 279:
84-88) que contiene el promotor CMV + BLAM + cola
de poliA (Figura 1). Se pueden usar cebadores para ambas
orientaciones de acoplamiento (es decir, amina en el extremo 5' de
la hebra sentido o amina en el extremo 5' de la hebra antisentido).
Los cebadores en 3' se biotinilaron en 5' con el fin de reducir la
degradación por la ADN exonucleasa en el ensayo final y para
proporcionar la capacidad para detectar ADN. Para las secuencias
del cebador véase la Tabla 1.
Los cebadores A y B se usaron inicialmente para
amplificar una secuencia de 1798 pares de bases (pb) que codifica
el promotor CMV humano de 591 pb, la beta lactamasa de 809 pb y la
secuencia de terminación poliA de la hormona de crecimiento bovina
de 135 pb. Los productos de la PCR se purificaron usando filtración
en gel (columnas de espín con una membrana de gel de sílice, QIAGEN,
Inc.), se cuantificaron mediante espectrometría UV a DO de 260 nm y
se conjugaron con el éster NHS del reticulante heterobifuncional
SMCC
(succinimidil-maleimidometil-ciclohexano-carboxilato)
(Pierce) según las instrucciones del fabricante durante 1 hora a
20ºC.
El gen indicador conjugado se purificó mediante
filtración en gel (Microspin G-25, Pharmacia),
después reaccionó con sulfhidrilos libres en VLP de HPV16
concentradas (0,97 mg/ml) a través del grupo maleimida (aprox. 1
sulfhidrilo libre por monómero de L1).
Los pseudoviriones se filtraron después en
esterilidad para usarse en el ensayo de neutralización. Los
experimentos iniciales indicaron que esta proporción de
acoplamiento baja entre el indicador y la VLP era beneficiosa (los
datos no se muestran). La reacción tuvo lugar a 4ºC durante 12
horas.
Se cultivaron 2000 células C33 A (ATCC nº HTB 31)
durante 3 días a 37ºC en DMEM completo (Medio Eagle modificado de
Dulbecco (GIBCO BRL) que contenía penicilina y estreptomicina (100
U/ml y 100 mcg/ml, respectivamente) y 10% de suero bovino fetal.
Antes de la infección se extrajo el medio que contenía el suero y se
añadieron 200 ng de pseudoviriones de HPV en 50 mcl de
opti-MEM (GIBCO BRL). Veinticuatro horas después de
la infección las células se alimentaron con 100 mcl de medio DMEM
completo. Dos días después de la infección se detectó expresión del
gen indicador de beta lactamasa en células CA33A infectadas usando
CCF2 (Aurora), un sustrato para la beta lactamasa (Zlokarnik,
ant.)
Brevemente, las células se lavaron con medio
opti-MEM antes de añadir a cada pocillo de una
placa de 96 pocillos (FLACON, Becton-Dickinson) 50
mcl de tampón de carga con CCF2. La concentración final de CCF2 fue
de 5 microM. Las placas se incubaron durante 3 h a temperatura
ambiente. La conversión de CCF2 en células que expresan beta
lactamasa se siguió mediante monitorización del cambio en la
longitud de onda de la emisión de la fluorescencia hasta azul a 460
nm con un microscopio de fluorescencia (Olympus, mod, IX70). De
media se pudieron detectar 204 \pm 55 (n = 12) células azules dos
días después de la infección.
En placas de 96 pocillos se cultivaron 2000
células C33A/pocillo (ATCC nº HTB 31) (FALCON, Becton
Dickinson) durante 3 días a 37ºC en DMEM completo (GIBCO BRL). A los pocillos se añadieron 25 mcl de diluciones 1:40 de (i) suero humano preinmunitario, (ii) suero inmunitario de individuos inmunizados con VLP de HPV16, (iii) suero inmunitario de individuos inmunizados con otras VLP de HPV o (iv) varias diluciones de anticuerpos monoclonales específicos de VLP de HPV, seguido por 25 mcl de medio con 200 ng de pseudoviriones. Las placas se incubaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2} (5% de CO_{2}) y después se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 3. El porcentaje de neutralización se determinó calculando el porcentaje de reducción de las células azules en los pocillos con los anticuerpos monoclonales neutralizantes de HPV16 o suero inmunitario humano frente a pocillos con anticuerpos monoclonales no específicos o suero preinmunitario. La figura 2 muestra en porcentaje de neutralización de los pseudoviriones de HPV16 mediante diluciones seriadas de ascitis que contenían el anticuerpo monoclinal neutralizante conocido de HPV16, H16. V5. Una dilución de ascitis de 1:10.000, con el anticuerpo monoclonal inespecífico H18.14 no fue neutralizante. Usando el ensayo descrito, se probó un panel de 52 sueros de individuos inmunizados con VLP de HPV16 a una dilución sérica final de 1:80. La mayoría de los sueros inmunes de este ensayo eran neutralizantes (Figura 6). Además, se observó una buena correlación entre los títulos de anticuerpos específicos de las VLP del HPV16 determinados mediante un ensayo RIA de anticuerpos de HPV16 y el % de neutralización (Figura 3).
Dickinson) durante 3 días a 37ºC en DMEM completo (GIBCO BRL). A los pocillos se añadieron 25 mcl de diluciones 1:40 de (i) suero humano preinmunitario, (ii) suero inmunitario de individuos inmunizados con VLP de HPV16, (iii) suero inmunitario de individuos inmunizados con otras VLP de HPV o (iv) varias diluciones de anticuerpos monoclonales específicos de VLP de HPV, seguido por 25 mcl de medio con 200 ng de pseudoviriones. Las placas se incubaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2} (5% de CO_{2}) y después se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 3. El porcentaje de neutralización se determinó calculando el porcentaje de reducción de las células azules en los pocillos con los anticuerpos monoclonales neutralizantes de HPV16 o suero inmunitario humano frente a pocillos con anticuerpos monoclonales no específicos o suero preinmunitario. La figura 2 muestra en porcentaje de neutralización de los pseudoviriones de HPV16 mediante diluciones seriadas de ascitis que contenían el anticuerpo monoclinal neutralizante conocido de HPV16, H16. V5. Una dilución de ascitis de 1:10.000, con el anticuerpo monoclonal inespecífico H18.14 no fue neutralizante. Usando el ensayo descrito, se probó un panel de 52 sueros de individuos inmunizados con VLP de HPV16 a una dilución sérica final de 1:80. La mayoría de los sueros inmunes de este ensayo eran neutralizantes (Figura 6). Además, se observó una buena correlación entre los títulos de anticuerpos específicos de las VLP del HPV16 determinados mediante un ensayo RIA de anticuerpos de HPV16 y el % de neutralización (Figura 3).
Se recubrieron previamente perlas de poliestireno
(0,635 cm con terminado especular) con suero normal de cabra a una
dilución de 1:1000 en suero salino tamponado con fosfato (PBS). Se
incubaron lotes de 3000 perlas, 7,5 perlas/ml, durante la noche a
4ºC. Después las perlas se lavaron en 5 volúmenes de agua
desionizada, se secaron sobre toallitas de papel y se dejaron secar
al aires en una bandeja de acero inoxidable. Las perlas previamente
recubiertas se recubrieron con VLP de HPV16 L1 usando tampón MOPS
(MOPS 50 mM + NaCl 0,5M, pH 7,0) que contenía 50 ng de VLP por ml
(5 perlas por ml). Los antígenos y el tampón se mezclaron primero
en una botella con medio Corning® y después se añadieron las
perlas. La botella que contenía el antígeno de recubrimiento y las
perlas se aseguraron en un rotador Cole Palmer, el recubrimiento se
llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente a 5 rpm. Las
perlas se lavaron en 5 volúmenes de tampón MOPS y se añadió tampón
suficiente como para mantener las perlas sumergidas, a continuación
se guardaron hasta que fueron necesarias a 4ºC durante un máximo de
4 meses.
El RIA con anticuerpos de VLP de HPV16 L1 es un
ensayo de anticuerpos competitivo, donde los anticuerpos compiten
por un número limitado de epítopos con una cantidad limitada del
anticuerpo monoclonal conformacional específico H16.V5. Se usó
ascitis con H16.V5 a una dilución de 1:800.000 en PBS +
seroalbúmina bovina al 1% + 0,05% de Tween 20. En un pocillo de una
placa de ensayo Abbott de 20 pocillos se mezclaron volúmenes
iguales (100 mcl) de suero de muestra y HPV16.V5. Después al
pocillo del ensayo se añadió una única perla recubierta con
antígeno de HPV16. Las muestras se analizaron por duplicado.
Las placas de ensayo se sellaron con láminas
adhesivas y se dejaron incubar a temperatura ambiente de 17 a 24
horas. Las placas se lavaron con agua desionizada usando un lava
placas de Abbott. La cantidad de AcMo de ratón que se unió con
éxito a la perla recubierta con VLP de HPV16 se detectó con
125I[IgG antiratón de cabra] (NEN Life Sciences, Boston,
MA). Las placas se sellaron con láminas recientes adhesivas y se
incubaron a 37ºC durante de 2 a 2,5 horas. Las placas se lavaron de
nuevo con agua desionizada. Después las perlas se transfirieron a
tubos portadores y se leyeron en un contador gamma. La inhibición
relativa de la unión HPV16.V5 se comparó con una curva estándar
usando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. La curva
estándar se derivó usando un suero inmunitario de HPV16 con un
número asignado de forma arbritaria de unidades (mMU/ml).
<110> Merck % Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN USANDO
PARTÍCULAS SIMILARES A VIRUS DEL PAPILOMAVIRUS HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> pct 20342
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/30297
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/113,388
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEC PARA Windows, versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagatctt acagcttacg ttttttgcgt ttagc
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 47
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctcagatctc acaaaacaaa atgtctcttt ggctgcctat gtaggcc
\hfill47
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<210> 3
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgagagatctt acagcttacg ttttttgcgt ttagc
\hfill35
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<210> 4
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 4
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\hfill45
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<210> 5
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 5
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\hfill33
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<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskiptagggttagg cgttttgc
\hfill18
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<210> 7
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipccatagagcc caccgc
\hfill16
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<210> 9
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<211> 16
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 1798
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Gen indicador basado en el gen de la
beta lactamasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un pseudovirión del papilomavirus humano (HPV)
que comprende una partícula similar al virus (VLP) unida de forma
covalente a un constructo de gen indicador.
2. Un pseudovirión según la Reivindicación 1, en
el que el HPV se selecciona del grupo constituido por: HPV6a,
HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43,
HPV44, HPV45, HPV51, HPV52 y HPV56.
3. Un pseudovirión según la Reivindicación 1, en
el que la VLP está compuesta por la proteína L1 o L1 + L2.
4. Un pseudovirión según la Reivindicación 3, en
el que el constructo del gen indicador se selecciona del grupo
constituido por: constructos del gen de la beta lactamasa,
constructos del gen de la beta galactosidasa, constructos del gen
de la luciferasa y constructos del gen de la proteína verde
fluorescente.
5. Un pseudovirión que comprende una VLP del HPV,
un reticulante heterobifuncional y un constructo del gen
indicador.
6. Un pseudovirión según la Reivindicación 5, en
el que la proporción molar entre el constructo del gen indicador y
la VLP es de aproximadamente 0,1 a 50.
7. Un pseudovirión según la Reivindicación 5, en
el que la proporción molar entre el constructo del gen indicador y
la VLP es de aproximadamente 1 a 5.
8. Un pseudovirión según la Reivindicación 5, en
el que la proporción molar entre el constructo del gen indicador y
la VLP es de aproximadamente 1 a 1.
9. Un ensayo para determinar si en una muestra
hay anticuerpos neutralizantes antiHPV, que comprende las etapas
de:
- a)
- poner en contacto pseudoviriones del papilomavirus humano, un cultivo celular susceptible de infección por los pseudoviriones y la muestra, en el que los pseudoviriones comprenden una partícula similar a virus (VLP) covalentemente unida a un constructo del gen indicador; y
- b)
- determinar si se inhibe la captación celular de los pseudoviriones, en el que la inhibición de la captación es indicativa de anticuerpos neutralizantes antiHPV en la muestra.
10. Un ensayo según la Reivindicación 9, en el
que la muestra comprende suero de un ser humano.
11. Un ensayo según la Reivindicación 10, que
además comprende la etapa de comparar los resultados con los
obtenidos usando un ensayo control.
12. Un ensayo según la Reivindicación 9, en el
que los pseudoviriones comprende un constructo del gen de la beta
lactamasa.
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