ES2237913T3 - Medicamento para prevenir o tratar tumores especificos del virus del papiloma. - Google Patents

Abstract

Uso de al menos una proteína de fusión de al menos una proteína L1 de uno o más papilomavirus y al menos una proteína E7 delecionada en el extremo C terminal de uno o más papilomavirus, estando delecionados los aminoácidos 38 a 43 y sin que la proteína de fusión contenga epítopos no específicos de papilomavirus, con o sin aditivos y/o materiales excipientes adecuados, para la producción de un medicamento para uso en humanos para inducir una respuesta específica de células T citotóxicas (CTL) tanto para prevenir los tumores específicos de HPV como para hacer que entren en regresión los tumores específicos de HPV ya existentes.

Description

Medicamento para prevenir o tratar tumores específicos del virus del papiloma.

La presente invención se refiere al uso de al menos una proteína de fusión de al menos una proteína L1 de uno o más papilomavirus y al menos una proteína E7 con el extremo C-terminal delecionado de uno o más papilomavirus, estando delecionados de 38 a 43 aminoácidos y sin que la proteína de fusión contenga epítopos no específicos de papilomavirus, con o sin aditivos y/o materiales excipientes adecuados, para la producción de un medicamento para uso en humanos para inducir una respuesta de células T citotóxicas (CTL) específicas tanto para prevenir tumores específicos de HPV como para hacer que entren en regresión tumores específicos de HPV ya existentes.

Los papilomavirus, también llamados virus de las verrugas, son virus de ADN de doble cadena que tienen un tamaño de genoma de aproximadamente 8000 pares de bases y una cápsida de tipo icosaédrico que tiene un diámetro de aproximadamente 55 nm. Hasta la fecha, se conocen más de 100 tipos diferentes de papilomavirus humanos, de los que algunos, por ejemplo HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 o HPV-58, pueden causar tumores malignos y otros, por ejemplo HPV-6, HPV-11 o HPV-42, pueden causar tumores benignos.

El análisis por microscopía electrónica de BPV-1 y HPV-1 demuestra que los virus están construidos por 72 capsómeros pentaméricos que, a su vez, constan de cinco moléculas L1 (Baker, T. et al. (1991) Biophys. J., 60, 1445).

El genoma de los papilomavirus puede subdividirse en tres áreas: la primera área corresponde a una región no codificante que contiene elementos de regulación para la transcripción y replicación del virus. La segunda región, la denominada región E (temprana), contiene varias secciones codificantes de proteínas E1-E7, de las que, por ejemplo, la proteína E6 y la proteína E7 son responsables de la transformación de las células epiteliales y la proteína E1 controla el número de copias de ADN. La región E6 y la región E7 también se denominan oncogenes, que también se expresan en células malignamente degeneradas. La tercera región, también denominada la región L (tardía), contiene dos secciones que codifican las proteínas L1 y L2, que codifican componentes estructurales de la cápsida del virus. La proteína L1 está presente en más del 90% de la cápsida viral, siendo la proporción de L1:L2 en general de 30:1.

HPV-6 y HPV-11 se han considerado responsables, entre otras cosas, de las verrugas genitales; algunos tipos de papilomavirus tales como HVP-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 y HPV-58 se asocian con tumores malignos del tracto anogenital. En más del 50% de los casos, HPV-16 está relacionado con el cáncer cervical (carcinoma del cervix). Por lo tanto, HPV-16 es el principal factor de riesgo para la formación de neoplasias cervicales. Adicionalmente, el sistema inmune juega un papel importante en el progreso de la enfermedad. De esta manera, las respuestas inmunes celulares y, en particular, los linfocitos T específicos de antígeno supuestamente son importantes para los mecanismos de defensa. Además, se ha descubierto que en las neoplasias intraepiteliales cervicales de alto grado (CIN II/III) y en los tumores cervicales, el gen E7 se expresa constitutivamente en todas las capas del epitelio infectado. Por lo tanto, la proteína E7 se considera un antígeno tumoral potencial y una molécula diana para las células T activadas (véase, por ejemplo, el documento WO 93/20844). Sin embargo, la respuesta inmune celular inducida por E7 en el paciente aparentemente no es suficientemente fuerte como para influir sobre el desarrollo de la enfermedad. La respuesta inmune posiblemente puede amplificarse con vacunas adecuadas.

Ahora ha sido posible demostrar que la expresión del gen L1 o la coexpresión de los genes L1 y L2 forma partículas similares a virus (VLP). Fue posible usar las VLP para la formación de anticuerpos neutralizadores en varios sistemas animales. La formación de anticuerpos neutralizadores de virus, sin embargo, tiene una importancia clínica relativamente baja cuando la infección del virus ya ha tenido lugar, ya que para la eliminación de las células infectadas por el virus parece ser necesaria una respuesta de células T citotóxicas (CTL) específicas del virus. Por lo tanto, se desarrollaron las denominadas partículas quiméricas similares a papilomavirus (CVLP) que constan de una proteína quimérica L1-E7 (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93): algunas CVLP inducen una respuesta de CTL específicos de E7 en ratones, aunque los experimentos no pudieron inducir anticuerpos inmunizando ratones con CVLP contra E7 (Müller, M. et al. (1997), supra). Además, parece ser que los anticuerpos neutralizadores de trastornos asociados a HPV en pacientes limitan la respuesta inmune contra la proteína L1 administrada (Müller, M. et al. (1997), supra). Sin embargo, las CVLP siguen siendo interesantes para el desarrollo de una vacuna, ya que las proteínas E7 de las células tumorales presentadas por medio de moléculas del MHC de clase I representarían moléculas diana de CTL.

Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 describen ahora CVLP compuestas por L1 truncada en el extremo C-terminal del papilomavirus bovino (BPV) y HPV-16E7_{49-57}, que inducen células T citotóxicas específicas de E7 tras la inoculación de ratones C57B1/6 y protegen contra el crecimiento de tumores que expresan E7. Greeenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 95, 1800 describen CVLP compuestas por HPV-16L1 más HPV-16L2 fusionadas a la proteína de longitud completa HPV-16E7, que protegen contra el crecimiento de células tumorales epiteliales que expresan E7 tras la inmunización de ratones C57B1/6, sin embargo, no se detectan células T citotóxicas y, de esta forma, la inducción de respuesta inmune parece ser menos eficaz.

En general, las VLP y CVLP se preparan por medio de ingeniería genética expresando los genes correspondientes que codifican una o más proteínas L o proteínas L y E en sistemas de expresión adecuados. Los genes correspondientes se describen, por ejemplo, en Kirnbaum, R. et al. (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 o se obtienen por medio del banco de datos del EMBL. Los números de acceso son, por ejemplo, para HPV18: PAPHPV18; para HPV31: PAPPPH31; para HPV33: PAPPPH33 o para HPV58: PAPPPH58.

Son sistemas de expresión adecuados, por ejemplo, levaduras modificadas por ingeniería genética, por ejemplo Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyveromyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) o Hansenula (polymorpha) (Carter, J.J. et al. (1991), Virology, 182, 513), células de insecto tales como, por ejemplo, Trichoplusia ni High Five (véase, por ejemplo, Müller et al. (1997), supra) o células procariotas (véase, por ejemplo, el documento WO 96/11272). En el caso de la producción de las partículas en células procariotas, éstas en general se depositan en la célula y forman los denominados cuerpos de inclusión, que después tienen que renaturalizarse y llevarse a la solución. Para usar las partículas o cápsidas producidas por ingeniería genética o sus precursores, los denominados capsómeros, se necesitan etapas posteriores de purificación después de la expresión.

Sin embargo, un inconveniente crucial de los compuestos activos contra HPV descritos en la bibliografía es que, por un lado, presentan sólo una ligera acción y por otro lado no ha sido posible hasta la fecha mostrar ninguna inmunoterapia eficaz de tumor específico de papilomavirus.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un medicamento con el que pueda evitarse o tratarse de forma eficaz un tumor específico de papilomavirus humano, que pueda producirse de manera sencilla y que parezca ser adecuado para autorizarse como un medicamento.

Ha sido sorprendente descubrir ahora que el medicamento descrito es eficaz contra tumores específicos de HPV.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es el uso de al menos una proteína de fusión de al menos una proteína L1 de uno o más papilomavirus y al menos una proteína E7 delecionada en el extremo C de uno o más papilomavirus, estando delecionados de 38 a 43 aminoácidos y sin que la proteína de fusión contenga epítopos no específicos de papilomavirus, con o sin aditivos adecuados y/o materiales excipientes para la producción de un medicamento para uso en humanos para inducir una respuesta específica de células T citotóxicas (CTL) tanto para prevenir tumores específicos de HPV como para que entren en regresión tumores específicos de HPV ya existentes.

Dentro del significado de la presente invención, en general se entiende que los epítopos no específicos de papilomavirus significan epítopos presentes en la proteína de fusión que se producen por una fracción de una proteína extraña, por modificaciones postraduccionales o por plegamiento defectuoso de proteínas específicas de papilomavirus.

Los epítopos no específicos de papilomavirus son, por ejemplo, una razón del hecho de que aunque se induzcan anticuerpos neutralizadores o respuestas inmunes CTL, no pueda evitarse o controlarse de forma eficaz el tumor específico de papilomavirus, ya que la acción inmunológica está debilitada por anticuerpos no específicos o CTL, o ciertos efectos secundarios inmunológicos interfieren con la acción del compuesto activo real.

El medicamento descrito preferiblemente es eficaz para evitar o tratar tumores benignos o malignos, en particular carcinoma de la laringe, cervix, pene, vulva o ano, incluyendo sus fases preliminares, tales como, por ejemplo, CIN de alto grado (neoplasia intraepitelial cervical).

En otra realización posterior preferida, el medicamento descrito no contiene adyuvantes, es decir, no contiene ninguna substancia que amplifique la inmunidad de la proteína específica de papilomavirus, ya que la presencia de una proteína L en particular, especialmente de L1, ya amplifica de forma adecuada la inmunidad. Esta propiedad es particularmente ventajosa para la autorización como un medicamento o como diagnóstico, ya que los únicos materiales inmunoestimuladores autorizados por las autoridades en el momento actual son sales de aluminio. Además, se evitan efectos secundarios no deseados por la omisión de adyuvantes y/u otros excipientes y aditivos.

Como ya se ha mencionado anteriormente, un problema adicional significativo en el uso de cápsidas y capsómeros como medicamentos es su escasa solubilidad. De ese modo, las cápsidas o capsómeros de HPV-16, por ejemplo, tienden a agregarse, por lo que la solubilidad se reduce significativamente. La solubilidad de las cápsidas o capsómeros, que en algunos casos es baja, no sólo conduce a una pérdida de rendimiento, sino que también complica el uso como un medicamento.

En una realización preferida adicional, por lo tanto, el medicamento descrito contiene como aditivo o excipiente adecuado una concentración de 0,3 a 4 M, preferiblemente de 0,4 a 3 M, en particular de 0,5 a 2 M, y especialmente de 1 a 2 M, de una sal que tiene un pH de 7,3 a 7,45, preferiblemente de 7,4.

La ventaja de esta solución salina es que la proteína de fusión permanece en solución o se presenta finamente dividida en una suspensión, es decir, en general, más de aproximadamente el 90%, especialmente más de aproximadamente el 95% de la proteína de fusión permanece en solución y además no se deposita durante un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 12 horas. Además, la proteína de fusión no es significativamente sedimentable por centrifugación a un máximo de 5000 g.

En general, la sal es una sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo, preferiblemente un haluro o fosfato, en particular un haluro de metal alcalino, especialmente NaCl y/o KCl. El uso de NaCl es particularmente preferido para la producción de una formulación farmacéutica.

El pH del medicamento, en general, se ajusta usando un tampón orgánico o inorgánico adecuado, tal como, por ejemplo, preferiblemente usando un tampón fosfato, tampón tris (tris(hidroximetil)aminometano), tampón HEPES (ácido [4-(2-hidroxietil)piperazino]etanosulfónico) o tampón MOPS (ácido 3-morfolino-1-propanosulfónico). La elección de tampón respectivo en general depende de la molaridad del tampón deseada. El tampón fosfato es adecuado, por ejemplo, para soluciones de inyección e infusión.

Son otros aditivos y/o excipientes adecuados que sirven, por ejemplo, para la estabilización posterior de la proteína específica de papilomavirus en el medicamento de acuerdo la invención, por ejemplo, detergentes, tales como, por ejemplo, Tritón X-100 o desoxicolato sódico, pero también polioles, tales como, por ejemplo, polietilenglicol o glicerol, azúcares tales como, por ejemplo, sacarosa o glucosa, compuestos zwiteriónicos, tales como, por ejemplo, aminoácidos tales como glicina o en particular taurina o betaína, y/o una proteína, tal como, por ejemplo, albúmina de suero bovino o humano. Se prefieren detergentes, polioles y/o compuestos zwiteriónicos. Otros aditivos y/o excipientes son inhibidores de proteasa, tales como, por ejemplo, aprotinina, ácido \varepsilon-aminocaproico o pepstatina A. Se prefieren los aditivos que no inducen efectos secundarios inmunológicos. Dentro del significado de la presente invención, se entiende que las expresiones proteína L1/L2 y proteína E se refieren tanto a las proteínas de longitud completa como a sus mutantes, tales como, por ejemplo, mutantes de deleción.

En una realización adicional preferida, la proteína de fusión descrita contiene una proteína L1 delecionada. La deleción tiene la ventaja de que proteínas diferentes particularmente activas, por ejemplo secuencias de la proteína E específica de papilomavirus, pueden insertarse dentro del área delecionada, ampliándose de esta manera el área de aplicación de la composición de acuerdo con la invención. Particularmente se prefiere una proteína L que tiene una deleción C terminal y en particular una proteína L1 delecionada en el extremo C terminal. La deleción C terminal tiene la ventaja de que puede aumentar la eficacia de la formación de partículas similares a virus, ya que se deleciona la señal de localización nuclear localizada en el extremo C terminal. Por lo tanto, la deleción en el extremo C terminal es preferiblemente de hasta 35 aminoácidos, en particular de 25 a aproximadamente 35 aminoácidos, especialmente de 32 a 34 aminoácidos. Por ejemplo, una deleción C terminal de la proteína HPV-16L1 de 32 aminoácidos de longitud es adecuada para poder aumentar la formación de partículas similares a virus al menos aproximadamente 10 veces.

En la realización de acuerdo con la invención, la proteína E7 también está delecionada, ya que estas construcciones preferiblemente pueden formar capsómeros y/o cápsidas en combinación con la proteína L delecionada.

Una construcción particularmente preferida es, por ejemplo, E7 que tiene los aminoácidos 1 a 60 del extremo N-terminal, ya que esta construcción contiene un epítopo de ratón para la activación de linfocitos T citotóxicos, que está localizado en el área de los aminoácidos 49-57. Otra construcción preferida es E7 que tiene los aminoácidos 1 a 55 del extremo N-terminal, que preferiblemente forma capsómeros y cápsidas en combinación con la proteína L delecionada, ya que esta construcción no contiene secuencias específicas de E7 en el área de los aminoácidos 56-70, que pueden interferir con la formación de cápsidas. Particularmente se prefiere una proteína L1 de HPV-16 que tiene una deleción de 32 aminoácidos en el extremo C terminal y que está unida a una proteína E7 de HPV-16 que tiene los aminoácidos 1-55 o 1-60. Estas construcciones no sólo inducen anticuerpos neutralizadores o una respuesta de CTL específica, sino que por un otro lado previenen la formación de tumores y por otro lado causan la regresión de tumores ya existentes en experimentos animales. Especialmente la E7 que tiene los aminoácidos 1-60, muestra una marcada acción profiláctica y terapéutica en tumores. Por lo tanto, una realización particularmente preferida de la presente invención es una proteína de fusión L1\DeltaCE7_{1-x}, preferiblemente en forma de una CVLP, en particular de HPV16, siendo x un número entero de 55 a 60 inclusive, y en particular una proteína de fusión L1\DeltaCE7_{1-55} o L1\DeltaCE7_{1-60}.

Para la producción de un medicamento que sea activo tanto profiláctica como terapéuticamente, se prefiere que la proteína de fusión específica de papilomavirus descrita esté presente en forma de una cápsida y/o capsómero, ya que la reacción inmune puede aumentarse adicionalmente de forma notable por las cápsidas y/o capsómeros y, en particular, por la fracción de la proteína L. Por lo tanto, son proteínas de fusión preferidas adecuadas para la formación de cápsidas y/o capsómeros, por ejemplo, proteínas de fusión de L1 y E7 delecionadas.

Las cápsidas que están dentro del significado de la presente invención son estructuras virales o similares a virus en forma generalmente icosaédrica, que en general están construidas con 72 capsómeros.

Los capsómeros dentro del significado de la presente invención son proteínas ensambladas que comprenden al menos una proteína estructural de papilomavirus, preferiblemente L1 o deleciones de L1. Por ejemplo, 5 proteínas de fusión de acuerdo con la invención pueden ensamblarse para dar un capsómero que a su vez puede ensamblarse para dar una cápsida.

Para la producción de un medicamento humano, son adecuadas para las construcciones descritas proteínas o péptidos del papilomavirus humano (HPV) y preferiblemente de HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 y/o HPV-58, en particular HPV-16, HPV-18, HPV-31 y/o HPV- 45. Especialmente para la producción de una vacuna de combinación, es ventajoso combinar proteínas o péptidos de varios tipos de HPV, por ejemplo una combinación de HPV-16 y HPV-18 o HPV-18, HPV-31, HPV-45 y HPV-58, en el caso de, por ejemplo, carcinoma de cervix, o HPV-6 y HPV-11 en el caso de, por ejemplo, condilomas.

En el proceso de producción de un medicamento de acuerdo con la invención, se cultiva una célula adecuada que comprende un vector de expresión adecuado que codifica la proteína de fusión mencionada en condiciones adecuadas, se aísla el producto de expresión y, si fuera conveniente, se añaden aditivos y/o excipientes adecuados.

Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de expresión procarióticos o eucarióticos. Son ejemplos de vectores de expresión procarióticos, para expresión en E. coli, por ejemplo, derivados de los vectores pEGM o pUC (véase, por ejemplo, el documento WO 96/11272). Son ejemplos de vectores de expresión eucarióticos, para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, los vectores p426Met25 o p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids. Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) y, para la expresión en células de insecto, por ejemplo, vectores de Baculovirus, en particular el virus de Autographa californica, tales como los descritos en el documento EP-B1-0 127 839 o EP-B1-0 549 721 (véase también, por ejemplo, el documento WO 94/20137), y, para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, los vectores Rc/CMV y Rc/RSV o vectores de SV40, estando disponibles en general todos ellos. Sin embargo también son adecuados sistemas de expresión de Baculovirus disponibles en el mercado, tales como, por ejemplo, el kit de transfección Baculo Gold^{TM} de Pharmingen o el sistema de expresión de Baculovirus Bac-to-Bac^{TM} de Gibco BRL. Son otros sistemas de expresión apropiados vaccinia virus recombinantes (véase, por ejemplo, el documento WO 93/02184).

En general, los vectores de expresión también contienen promotores apropiados para las respectivas células hospedadoras, tales como, por ejemplo, el promotor trp para la expresión en E. coli (véase, por ejemplo, el documento EP-B1-0 154 133), el promotor ADH2 para la expresión en levaduras (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), el promotor de la poliedrina de Baculovirus para la expresión en células de insecto (véanse, por ejemplo, los documentos EP-B1-0 127 839 o U.S. 5.004.687) o el promotor temprano de SV40 o promotores de LTR, por ejemplo de MMTV (virus del tumor mamario de ratón; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).

Son células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, las cepas de E. coli DH5, HB101 o BL21, las cepas de levadura Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces o Hansenula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), las líneas celulares de insectos lepidópteros, por ejemplo, de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou o Galleria mellonela o las células animales COS, C127, Vero, 293 y HeLa, estando disponibles generalmente todas ellas (véase, por ejemplo, el documento WO 94/00152).

Los ácidos nucleicos codificantes para las proteínas individuales específicas de papilomavirus pueden aislarse y clonarse, por ejemplo, a partir de un banco de genes por medio de una amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Por ejemplo, el genoma de BPV-1 generalmente se puede obtener con el Nº de Acceso del GenBank X02346 o HPV-16 con el Nº de Acceso del GenBank K02718. También se describe una secuencia de L1 de HPV-16, por ejemplo, en el documento WO 94/05792. La secuencia de la proteína E7 de HPV16 de 98 aminoácidos de longitud se describe, por ejemplo, en Seedorf et al. (1985) Virology, 145, 181-185. Otro método de obtención de los ácidos nucleicos deseados es aislar los genes específicos de papilomavirus directamente a partir de verrugas o tumores por medio de PCR. En el documento WO 93/21958, por ejemplo, se describen cebadores apropiados para los genes E6 y E7 de HPV-16 y HPV-18. Son otras referencias adicionales para los ácidos nucleicos deseados, por ejemplo, Kirnbaum, R. et al. (1994), supra o los clones depositados en el banco de datos del EMBL ya mencionado anteriormente.

En otra realización preferida, el vector de expresión se construye de modo que la proteína de fusión expresada no tenga ninguna extensión de aminoácidos adicional debida al vector. Esto se consigue, por ejemplo, eliminando nucleótidos no deseados que codifican aminoácidos adicionales por mutagénesis en una reacción de PCR por medio de cebadores oligonucleotídicos adecuados (Ho et al. (1989) Gene, 77, 51-59). De esta forma, se obtiene una proteína de fusión que carece de aminoácidos adicionales y, por lo tanto, de posibles epítopos extraños adicionales que puedan causar reacciones inmunológicas secundarias.

Tras la expresión de la proteína de fusión descrita, se prefiere purificarla adicionalmente o renaturalizarla. Pueden encontrarse ejemplos de procesos de purificación cromatográfica en Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth. 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen.Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R.C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936; Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206, 126 o en el documento WO 95/31532.

En general, el medicamento puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, tal como, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o a través de la membrana mucosa, en forma líquida o en suspensión, en forma de un elixir o de cápsulas, preferiblemente como una solución inyectable o de infusión. En el caso de las formulaciones descritas, pueden prepararse con un adyuvante, lo cual es particularmente ventajoso.

Por lo tanto, un objeto adicional de la presente invención se refiere al uso de la formulación descrita como una solución inyectable o de infusión.

En general, las soluciones inyectables se usan cuando se van a administrar al cuerpo sólo cantidades relativamente pequeñas de una solución o suspensión, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 ml. En general, las soluciones de infusión se usan si se va a administrar una cantidad mayor de una solución o suspensión, por ejemplo uno o más litros. Como, a diferencia de lo que ocurre con la solución de infusión, en el caso de las soluciones inyectables sólo se administran unos pocos mililitros, no son perceptibles las pequeñas diferencias con el pH y la presión osmótica de la sangre o el fluido de la inyección en el tejido o sólo son perceptibles en una medida insignificante en relación con la sensación de dolor. Por lo tanto, en general no es necesaria la dilución de la formulación de acuerdo con la invención antes de su uso. Sin embargo, en el caso de la administración de cantidades relativamente grandes, la formulación de acuerdo con la invención debe diluirse poco antes de la administración hasta el punto de obtener al menos una solución aproximadamente isotónica. Un ejemplo de una solución isotónica es una solución de cloruro sódico a una concentración del 0,9%. En el caso de las infusiones, la dilución puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando agua estéril mientras que la administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de un denominado by-pass.

Las figuras y los ejemplos siguientes pretenden ilustrar la invención con mayor detalle sin restringirla.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una respuesta de CTL específica de E7 que se produjo tras la inmunización con 1 \mug de CVLP L1E7_{1-60}. Las células esplénicas aisladas de ratones inmunizados con CVLP L1E7_{1-60} (símbolos rellenos) y tampón HBS (símbolos vacíos) se estimularon una vez in vitro con células RMA-E7 irradiadas y se ensayaron después de cinco días en un ensayo de citotoxicidad de liberación de ^{51}Cr estándar durante 4 horas con las siguientes células diana: células RMA-E7 (cuadrados), células RMA cargadas con el péptido E7_{49-57} (triángulos) y células RMA (círculos). Los resultados se expresan como % de lisis específica.

La figura 2 muestra el resultado de un ensayo de titulación, realizado usando una línea CTL específica para E7 que se obtuvo después de la vacunación de un ratón C57BL/6 con 20 \mug de CVLP L1E7_{1-60} y tres estimulaciones in vitro con transfectantes RAM-E7. La concentración del péptido estuvo entre 100 pg y 1 \mug/ml. Las células diana usadas fueron células RMA cargadas con el péptido de E7 49-57 marcado con ^{51}Cr. La proporción entre células y células diana era de 30:1.

La figura 3 muestra la protección de ratones C57BL/6 contra el crecimiento de células tumorales TC-1. Los ratones (5 por grupo) se inmunizaron s.c. con 10 \mug de CVLP L1E7_{1-60} (triángulos), con 10 \mug de las VLP L1\DeltaC (círculos) o con tampón HBS (cuadrados). Dos semanas después, se inocularon 6 x 10^{4} células tumorales TC-1 por ratón en costado derecho de los ratones s.c. Los ratones se controlaron dos veces a la semana.

La figura 4 muestra la prevención del crecimiento del tumor TC-1 por CVLP L1E7_{1-60}. Se inocularon 6 x 10^{4} células tumorales TC-1 por ratón en el costado izquierdo de ratones C57BL/6 (5 por grupo). Dos semanas después, los ratones se inmunizaron con una inyección s.c. de 10 \mug de CVLP L1E7_{1-60} (triángulos), 10 \mug de LI\DeltaCVLP (círculos) o tampón HBS (cuadrados).

Ejemplos 1. Preparación de genes quiméricos que codifican las proteínas de fusión HPV16L1E7

La fase de lectura abierta (ORF) de HPV-16L1 se escindió del plásmido HPV-16-114/k-L1/L2-pSynxtVI^{-} (Kirnbauer, R. et al. (1994) J. Virol. 67, 6929) usando la endonucleasa de restricción BglII y se clonó dentro del sitio BamHI en el vector pUC18 (New England Biolabs).

Para la preparación de HPV-16L1\DeltaC, se construyeron dos cebadores que eran complementarios con la ORF de HPV-16L1. El primer cebador tenía la secuencia

AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC

y el segundo cebador

AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG.

Los dos cebadores codifican un sitio de escisión 5' del enzima de restricción EcoRV. En los cebadores situados secuencia abajo, un codón de terminación de la traducción TAA sigue al sitio EcoRV para la deleción de los últimos 34 aminoácidos de la ORF de HPV16L1. La reacción de PCR se llevó a cabo para amplificar la región ORF de L1 completa y el vector completo. El producto lineal se escindió con EcoRV, se circularizó con la ligasa de ADN de T4 y se transformó con células DH5\alpha de E. coli. Se analizó la presencia de un sitio EcoRV en los clones. Se usó la construcción obtenida pUCHPV16L1\DeltaC para clonar la ORF de HPV16E7 1-50 dentro del sitio EcoRV.

Para la clonación del fragmento, se usaron cebadores que tenían un sitio de escisión para el enzima de restricción EcoRV en posición 5'. Se usó el siguiente par de cebadores:

AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGA

y

TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC.

Los productos de PCR se escindieron con EcoRV y se insertaron en el sitio EcoRV del gen L1 modificado.

Para la eliminación de los sitios EcoRV, se llevaron a cabo dos reacciones de PCR para amplificar dos fragmentos solapantes del clon pUC-HPV16L1\DeltaCE71-50. El fragmento de ADN resultante solapaba en la posición límite entre L1/E7 (Four Primer PCR, Ho, S.N. et al (1989) Gene 77, 51). Sin embargo, los cebadores no contenían los dos sitios de escisión de la enzima de restricción EcoRV. El fragmento 1 se preparó usando los cebadores P1 y P2 y el fragmento 2 usando los cebadores P3 y P4.

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Una décima parte de los productos purificados se mezcló y se usó como matriz en la reacción de PCR con los cebadores P1 y P4 exclusivamente. El producto resultante se escindió usando EcoNI (L1) y HindIII (secuencia abajo del codón de terminación en el cebador P4) y se usó para substituir un fragmento EcoNI/HindIII de la ORF de HPV16L1 clonado. Por lo tanto, el clon resultante difiere del clon HPV16L1\DeltaCE7 1-50 en la pérdida de los dos sitios de escisión internos del enzima de restricción EcoRV y los aminoácidos que no son de HPV correspondientes Asp e Ile entre la ORF de L1 y E7 y secuencia abajo de E7. El primer sitio EcoRV se substituyó por la secuencia de aminoácidos original de L1 en esta posición (AlaGly). El segundo sitio EcoRV se substituyó por una señal de terminación de la traducción. Este clon (HPV16L1\DeltaC*E7 1-52) adicionalmente contiene los primeros 52 aminoácidos de HPV16E7. El clon HPV16L1\DeltaC*E7 1-52 se usó para la preparación de los clones HPV16L1\DeltaC*E7 1-55, 1-60 y 1-65 con la ayuda del cebador P1 en combinación con P5, P6 y P7.

102

HPV16L1\DeltaC*E7 1-70 se preparó usando el clon HVP16L1\DeltaC*E7 1-65 y los cebadores P1 y P8.

103

En todos los casos, se usaron EcoNI e HindIII para la substitución de los fragmentos correspondientes. Los clones se analizaron por secuenciación de ADN.

2. Preparación de baculovirus recombinantes

Se usaron células de Spodoptora frugiperda (Sf9) en monocapa o en cultivo en suspensión en medio para insectos TNM-FH (Sigma, Deisenhofen) con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM. Se transfectaron Baculovirus recombinantes HPV16L1\DeltaCE7 1-x por cotransfección de 10 \mug de los plásmidos recombinantes y 2 \mug de ADN Baculo-Gold linealizado (Pharmingen, San Diego, CA) en células Sf9. Los virus recombinantes se purificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para ensayar la expresión, se infectaron 10^{6} células Sf9 con Baculovirus recombinante y una m.o.i. (multiplicidad de infección) de 5 a 10. Tras la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con PBS (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}PO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, pH 7,2). Las células después se lisaron en tampón de muestra con SDS y se ensayaron por cromatografía en gel de SDS y por ensayo de inmunotransferencia.

3. Purificación de las partículas similares a virus

Para la preparación de CVLP, se cultivaron células de Trichoplusia ni (TN) High Five a 27ºC hasta una densidad de 1-1,5 x 10^{6} células por ml en medio sin suero Ex-Cell 405 (JRH, Biosciences, Lennexa, KS). Se recogió un cultivo de 400 ml y se infectó con una m.o.i. de 2 a 5 con baculovirus recombinantes durante una hora con inversiones periódicas. Se añadieron hasta 240 ml de medio y las células se dejaron crecer durante un periodo de 3 a 4 días. Después, las células se sedimentaron y resuspendieron en 10 ml de tampón de extracción (MgCl_{2} 10 mM, CaCl_{2} 1-50 mM, NaCl 150 mM, Hepes 20 mM, Tritón al 0,01% (opcional), pH 7,4) y se sonicaron durante 45 segundos a 60 vatios. Tras la centrifugación a 10.000 rpm en un rotor Sorvall SS34, el sedimento se disolvió en 6 ml de tampón de extracción, se sonicó durante 30 segundos a 60 vatios y se centrifugó de nuevo. Se combinaron los sobrenadantes y se aplicaron en un gradiente con dos fases de sacarosa al 40% (p/v) y CsCl al 57,5% (p/v). Tras la centrifugación en un rotor SW-28 a 27.000 rpm durante 2 horas, se recogieron la interfase y la capa de CsCl, se ajustó la densidad de CsCl a 1,38 g/ml y se centrifugó a 45.000 rpm durante 16 horas. Los gradientes se fraccionaron y cada fracción se ensayó por transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-HHPV16L1 Camvir1 (Pharmingen, San Diego, CA). Las fracciones reactivas se combinaron y dializaron por medio de ultrafiltración usando un microconcentrador Centricon 30 (Amicon Corp. Beverly, MA) contra tampón Hepes (Hepes 1 mM, NaCl 149 mM, KCl 0,5 mM, pH 7,2) y se confirmó la presencia de CVLP por medio de microscopía electrónica de transmisión. La concentración de proteína L1E7 se determinó de forma aproximada, en un gel de SDS que se tiñó con azul de Coomassie, comparando con estándares de BSA.

4. Cultivo de células de ratón

Las células TC-1 derivadas de ratones C57BL/6 son células epiteliales pulmonares primarias de ratones C57BL/6, que se han transformado por transfección con los oncogenes E6 y E7 de HPV-16 y c-Ha-ras (Lin, K.-Y. (1996), supra). RMA (Ljungrenn & Karre (1985) J. Exp. Med., 162, 1745-1757) y la línea celular RMA-S defectuosa en el procesamiento son células de timoma de C57BL/6. RMA-E7 transfectada con E7 de HPV-16 se describe en Speidel, K. et al. (1997) Eur. J. Immunol., 27(9), 2391-2399. Todas las células se cultivaron en RPMI-1640, suplementado con FCS al 10%, 2-ME, L-glutamina y antibióticos. Se añadieron 0,8 mg/ml de G418 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para el cultivo de los transfectantes RMA-E7. Las células TC-1 crecieron adicionalmente en presencia de 0,4 mg/ml de G418, 0,2 mg/ml de higromicina y piruvato sódico 1 mM.

5. Producción de líneas de células T citotóxicas (CTL)

Las células esplénicas se prepararon de 10-14 días después de la inmunización; 2-4 x 10^{7} células esplénicas se cultivaron conjuntamente con 10^{5} transfectantes RMA-E7 singénicos irradiados (200 Gy) por mililitro. Después de 5 días, se llevó a cabo el primer ensayo de citotoxicidad por liberación de ^{51}Cr. Para la producción de líneas CTL, las células esplénicas se reestimularon semanalmente en placas de 24 pocillos con 2 x 10^{5} transfectantes RMA-E7 irradiados por pocillo como células estimuladoras y 5 x 10^{6} células esplénicas de C57BL/6 irradiadas (33 Gy) por pocillo como células nodriza.

6. Ensayo de citotoxicidad por liberación de ^{51}Cr

Para el ensayo de citotoxicidad por liberación de ^{51}Cr, se añadieron células T efectoras a 1 x 10^{4} células diana marcadas con ^{51}Cr por pocillo en una placa de 96 pocillos que tenía una proporción diferente entre célula efectora y célula diana (E:T). Las células diana se marcaron con Na_{2}^{51}CrO_{4} (100 \muCi por 2 x 10^{6} células) durante una hora a 37ºC. El péptido de secuencia RAHYNIVTF (aminoácidos 49-57 de E7 de HPV-16; Feltkamp, M.C.W. et al. (1993), Eur. J. Immunol., 23, 2242-2249) se añadió durante esta incubación a una concentración de 50 \muM. En el ensayo de titulación del péptido con una proporción constante E:T, las células diana marcadas con ^{51}Cr se cultivaron con concentraciones decrecientes de péptido (1 \mug - 100 pg por ml) durante una hora a 37ºC antes de que se añadieran las células efectoras. Tras la incubación a 37ºC durante 4 horas, se transfirieron 50 \mul de sobrenadante por pocillo a una placa Luma (Packard) y se secaron. La radiactividad se midió en un contador \beta (Trilux Microbeta, Wallac). La lisis específica media se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: % de lisis específica = (liberación experimental -
liberación espontánea)/(liberación completa - liberación espontánea) x 100.

7. Inducción de linfocitos T citotóxicos específicos de E7 por CVLP

Once ratones hembra C57BL/6 de seis a dieciséis semanas de edad se inmunizaron con 1-20 \mug de CVLP sin adyuvante por medio de una sola inyección s.c. Dos semanas después, se prepararon las células esplénicas y se estimularon in vitro con transfectantes que expresaban E7 de HPV-16 de la línea RMA de células tumorales derivada de C57BL/6 (RMA-E7) como células estimuladoras. Tras el cultivo durante 5 días, se llevó a cabo el primer ensayo de citotoxicidad.

La estimulación de las células esplénicas se repitió a intervalos semanales. Como se muestra en la figura 1, la inmunización con 1 \mug de CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, es decir los 34 aminoácidos carboxi-terminales de la proteína L1 de HPV-16 se habían reemplazado por los aminoácidos 1-60 de E7 de HPV-16, lleva a una fuerte respuesta CTL específica de E7.

En total, después de cinco días se observó una lisis específica de transfectantes RMA-E7 comprendida entre el 7,7% y el 54,7% (valor promedio 33,6%; proporción E:T 8:1-33:1). El promedio de lisis tras la segunda estimulación estuvo comprendido entre el 35,8% y el 57,8% (valor promedio 45,3%; proporción E:T 8:1-44:1). Si los ratones se inmunizaban sólo con 1 \mug de CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, por término medio, después de un tiempo de cultivo de 5 días, se observaba en las CTL específicas de E7 una reactividad menor (7,7-49,5%; valor promedio 28,5%) que tras la inmunización con 5 \mug (17,2-44,7%; valor promedio 33,9%) o 20 \mug (26,0-54,7%; valor promedio 38,5). Las células esplénicas de los ratones control (vacunados con tampón HBS) no mostraron reactividad específica de E7 tras 5 días (0,3 - 8,9%, valor promedio 3,4%, proporción E:T 4:1-9:1).

Las CVLP L1\DeltaCE7_{1-60} contienen un epítopo de células T H2-D^{b} conocido de la proteína E7 (E7_{49-57}, Feltkamp, M.C.W. et al. (1993), supra). Para confirmar la especificidad de E7 obtenida de las CTL, se ensayaron contra las células RMA cargadas con el péptido E7_{49-57}. Las CTL que reconocían los transfectantes RMA-E7 mostraban una actividad citotóxica específica contra las células diana RMA E7_{49-57} o RMA-S. La lisis específica medida variaba entre el 21,2 y el 25% después de cinco días (proporción E:T 8:1-15:1, véase la figura 1). En el ensayo de titulación de péptidos llevado a cabo, tras la tercera estimulación las células RMA-S se lisaban al 70,5% o 71,4% (se ensayaron dos líneas CR) tras la carga con E7_{49-57} a una concentración de 1 \mug/ml (proporción E:T 40:1, véase la figura 2). Aunque a las células RMA-S se les proporcionó una cantidad tan pequeña como de 100 pg por ml del péptido E7_{49-57}, se obtenía una lisis específica del 36,2% y 47,2%. Las CTL cargadas con un péptido de control, es decir el péptido derivado de la nucleoproteína del virus de la influenza que contiene los aminoácidos 366-374, que representa un epítopo D^{b}-CTL, no eran reconocidas. Las células esplénicas aisladas de los ratones C57BL/6 tras del tratamiento con CVLP L1\DeltaCE7_{1-55} (secuencia de E7 truncada en cinco aminoácidos), no reconocían a las células RMA-E7, aunque los ratones se hubieran vacunados con una dosis aumentada de hasta 250 \mug.

A partir de estos datos, se concluye que las CTL se indujeron por CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, son específicas de E7 y reconocen el péptido E7_{49-57} con alta afinidad. En un análisis FACS de las líneas CTL representativas, las CTL se identificaron como CD8-positivas.

8. Prevención del crecimiento de un tumor singénico que expresa E7 en ratones C57BL/6

Para determinar si la vacunación con CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}induce una inmunidad eficaz contra células tumorales singénicas (TC-1, Lin, K-Y (1996), Cancer Res. 56, 21-26), se llevaron a cabo experimentos de protección tumoral. Ratones C57BL/6 (3-5 por grupo) recibieron 1 inyección s.c. de 10 \mug de CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, 10 \mug de CVLP L1\DeltaCE7_{1-55}, 10 \mug de VLP L1\DeltaC o un volumen equivalente de tampón HBS sin adyuvante. Dos semanas después de la inmunización, se inocularon 6 x 10^{4} células TC-1, suspendidas en 200 \mul de PBS, en el costado izquierdo de los ratones. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana durante dos meses hasta que se sacrificaron los ratones.

Los resultados de todos los experimentos se resumen en la tabla 1. La tasa total de crecimiento tumoral en los ratones vacunados con tampón HBS, VLP L1\DeltaC o CVLP L1\DeltaCE7_{1-55}en promedio era del 80,5%. La vacunación con CVLP L1\DeltaC no protegía contra el tumor, aunque se observó un retraso en el crecimiento tumoral (véase la fig. 3). Sin embargo, la vacunación de los ratones con CVLP L1\DeltaCE7_{1-60} protegía contra el crecimiento tumoral: sólo un ratón (1/13) desarrolló un pequeño tumor de crecimiento lento tras 38 días, que entró en regresión en un periodo de dos meses.

Las células esplénicas de los ratones vacunados con HBS o con VLP L1\DeltaC que desarrollaron tumores TC-1 no mostraron o mostraron sólo niveles muy bajos de respuesta CTL específica de E7, independientemente de si el ratón había desarrollado tumores o no. Tras la segunda estimulación, en los ratones sin tumores se observó una lisis específica de E7 de las células diana RMA-E7 comprendida entre un 0 y un 21% en los ratones portadores de tumor (valor promedio del 14%, proporción E:T 5:1-24:1) y comprendida entre un 0 y un 22,2% (valor promedio 10,4%, proporción E:T 7:1-40:1) en los ratones sin tumores. En contraste con esto, en ratones protegidos contra el crecimiento tumoral tras la inmunización con CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, se encontró tras la segunda estimulación una respuesta CTL específica de E7 comprendida entre un 29,1 y un 49,8% (valor promedio 36,9%, proporción E:T 11:1-24:1).

Además se analizó si la vacunación llevaba a una regresión de tumores ya existentes. Dos semanas después de la inoculación de 6 x 10^{4} células TC-1 (s.c.), los ratones (5 por grupo) recibieron una única inyección de 10 \mug de CVLP L1\DeltaCE7_{1-60}, 10 \mug de VLP L1\DeltaC o tampón HBS sin adyuvante. En este experimento (véase la fig. 4), el desarrollo tumoral de los ratones de control tratados con HBS o inmunizados con VLP L1\DeltaC era sólo del 60% (3 de cada grupo, 6/10). Sin embargo, todos los ratones (5/5) que se vacunaron con CVLP L1\DeltaCE7_{1-60} generaban una respuesta inmune contra los tumores establecidos y se mantenían sin tumores dos meses después de la inyección de las células tumorales.

Claims (14)

1. Uso de al menos una proteína de fusión de al menos una proteína L1 de uno o más papilomavirus y al menos una proteína E7 delecionada en el extremo C terminal de uno o más papilomavirus, estando delecionados los aminoácidos 38 a 43 y sin que la proteína de fusión contenga epítopos no específicos de papilomavirus, con o sin aditivos y/o materiales excipientes adecuados, para la producción de un medicamento para uso en humanos para inducir una respuesta específica de células T citotóxicas (CTL) tanto para prevenir los tumores específicos de HPV como para hacer que entren en regresión los tumores específicos de HPV ya existentes.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un carcinoma de la laringe, cervix, pene, vulva o ano.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el medicamento no contiene adyuvante.

4. Uso de acuerdo con una las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el aditivo o excipiente es una concentración de 0,3 a 4 M, preferiblemente de 0,4 a 3 M, en particular de 0,5 a 2 M, especialmente de 1 a 2 M, de una sal que tiene un pH de 7,3 a 7,45, preferiblemente 7,4.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la sal es una sal de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, preferiblemente un haluro o fosfato, en particular un haluro de metal alcalino, especialmente NaCl y/o KCl.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el pH se ajusta usando un tampón, preferiblemente usando un tampón fosfato, tampón tris, tampón HEPES o tampón MOPS.

7. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la proteína L1 es una proteína L1 delecionada.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína L1 es una proteína L1 delecionada en el extremo C terminal.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque se delecionan hasta 35 aminoácidos de la proteína L, preferiblemente de 25 a 35 aminoácidos, en particular 32-34 aminoácidos.

10. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la proteína de fusión está presente en forma de una cápsida y/o capsómero.

11. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el HPV se selecciona entre HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42, HPV-45, HPV-52 y/o HPV-58.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en forma de una vacuna de combinación, caracterizado porque los papilomavirus se seleccionan entre HPV-16 y HPV-18; o HPV-18, HPV-31, HPV-45 y HPV-58; o HPV-6 y HPV-11.

13. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque la proteína de fusión es una proteína de fusión L1\DeltaCE7_{1-x}, preferiblemente en forma de una CVLP, en particular de HPV16, siendo x un número entero desde 55 hasta 60 inclusive.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la proteína de fusión es una proteína de fusión L1\DeltaCE7_{1-55} o L1\DeltaCE7_{1-60}.