ES2238694T5 - Vegf-c ligando de receptor. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN LIGANDOS POLIPEPTIDICOS PARA EL RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA, FLT4. TAMBIEN SE DESCRIBEN ADN Y VECTORES QUE CODIFICAN LOS LIGANDOS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y REACTIVOS DE DIAGNOSTICO QUE INCLUYEN LOS LIGANDOS, Y PROCEDIMIENTOS PARA LA FABRICACION Y LA UTILIZACION DE LOS LIGANDOS.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general al campo de la ingeniería genética y más particularmente a factores del crecimiento para células endoteliales y genes de factores del crecimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

El crecimiento durante el desarrollo, la remodelización y regeneración de los teji-dos adultos, así como el crecimiento de los tumores sólidos, pueden producirse úni-camente cuando van acompañados por formación de vasos sanguíneos. Los angioblastos y las células precursoras hematopoyéticas se diferencian a partir del me-sodermo y forman las islas de sangre del saco vitelino y el sistema vascular primario 10 del embrión. El desarrollo de vasos sanguíneos a partir de estas células endoteliales diferenciadoras precoces (in situ) se denomina vasculogénesis. Se cree que los vasos sanguíneos principales del embrión se producen por vasculogénesis, mientras que la formación del resto del árbol vascular se cree que ocurre como resultado de la forma-ción de brotes vasculares a partir de vasos pre-existentes, proceso que se denomina 15 angiogénesis, Risau et al., Devel. Biol., 125: 441-450 (1988).

Las células endoteliales dan lugar a varios tipos de vasos funcional y morfológi-camente distintos. Cuando los órganos se diferencian y comienzan a realizar sus fun-ciones específicas, la heterogeneidad fenotípica de las células endoteliales aumenta. Después de estimulación angiogénica, las células endoteliales pueden entrar de nuevo 20 en el ciclo celular, migrar, salirse del ciclo celular y diferenciarse de nuevo posterior-mente para formar nuevos vasos que están adaptados funcionalmente para su entorno tisular. Las células endoteliales que sufren angiogénesis degradan la membrana basal subyacente y migran, formando brotes capilares que se proyectan hacia el interior del estroma perivascular. Ausprunk et al., Microvasc. Rev. 14: 51-65 (1977). La angiogé-25 nesis durante el desarrollo y la regeneración de los tejidos depende de procesos rigu-rosamente controlados de proliferación, migración, diferenciación, y supervivencia de las células endoteliales. La disfunción del sistema regulador de las células endoteliales es una característica clave de muchas enfermedades. Es muy significativo que, según se ha demostrado, el crecimiento y la metástasis de los tumores son dependientes de 30 la angiogénesis. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992).

Las señales clave que regulan el crecimiento y la diferenciación celular están mediadas por factores de crecimiento polipeptídicos y sus receptores transmembrana-les, muchos de los cuales son tirosina-quinasas. Los péptidos autofosforilados dentro de la inserción de tirosina-quinasa y secuencias carboxil-terminales de receptores acti-35

vados son reconocidos comúnmente por sustratos de quinasa implicados en la trans-ducción de señales para el reajuste de la expresión génica en las células sensibles. Se han caracterizado varias familias de tirosina-quinasas receptoras. Van der Geer et al., Ann. Rev. Cell Biol., 10: 251-337 (1994). Los factores de crecimiento principales y re-ceptores que transducen estímulos angiogénicos se muestran esquemáticamente en 5 Fig. 1.

Se sabe también que los factores del crecimiento de los fibroblastos están impli-cados en la regulación de la angiogénesis. Se ha demostrado que aquéllos son mitó-genos y quimiotácticos para las células endoteliales cultivadas. Los factores de crecimiento de los fibroblastos estimulan también la producción de proteasas, tales 10 como colagenasas y activadores del plasminógeno, e inducen la formación de tubos por las células endoteliales. Saksela et al., Ann. Rev. Cell Biol., 4: 93-126 (1988). Exis-ten dos clases generales de factores de crecimiento de los fibroblastos, FGF-1 y FGF-2, los cuales carecen ambos de péptidos de señal convencionales. Ambos tipos tienen afinidad para la heparina, y FGF-2 está unido a los proteoglicanos de sulfato de hepa-15 rina en la matriz subendotelial extracelular, de la cual puede liberarse después de una lesión. La heparina potencia la estimulación de la proliferación de células endoteliales por los FGFs angiogénicos, a la vez por protección contra la desnaturalización y la degradación y por dimerización de los FGFs. Las células endoteliales cultivadas ex-presan el receptor FGF-1, pero no niveles significativos de otros receptores de factores 20 de crecimiento de los fibroblastos de afinidad alta.

Entre otros ligandos para las tirosina-quinasas receptoras, se ha demostrado que el factor del crecimiento derivado de las plaquetas, PDGF-BB, es débilmente angiogé-nico en la membrana corioalantoica del pollo. Risau et al., Grotsh Factors, 7: 261-266 (1992). El factor del crecimiento transformante α (TGFα) es un factor angiogénico se-25 cretado por varios tipos de células tumorales y por los macrófagos. El factor de creci-miento de los hepatocitos (HGF), el ligando del receptor codificado por el proto-oncogén c-met, es también fuertemente angiogénico.

Pruebas recientes demuestran que existen factores de crecimiento y receptores específicos de las células endoteliales que pueden ser fundamentalmente responsa-30 bles de la estimulación del crecimiento, la diferenciación y ciertas funciones diferencia-das de las células endoteliales. El mejor estudiado de éstos es el factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF), un miembro de la familia PDGF. El factor del crecimiento endotelial vascular es una glicoproteína dímera de subunidades de 23 kD enlazadas por disulfuro. Otros efectos consignados de VEGF incluyen la movilización del calcio 35

intracelular, la inducción del activador del plasminógeno y la síntesis del inhibidor-1 del activador del plasminógeno, la estimulación del transporte de hexosas en las células endoteliales, y la promoción de la migración de los monocitos in vitro. Cuatro isoformas de VEGF, codificados por variantes distintas de corte y empalme del mRNA parecen ser igualmente capaces de estimular la mitogénesis en las células endoteliales. Sin 5 embargo, cada isoforma tiene una afinidad diferente para los proteoglicanos de la su-perficie celular, que se comportan como receptores de baja afinidad para VEGF. Las isoformas de 121 y 165 aminoácidos de VEGF (VEGF121 y VEGF165) se secretan en una forma soluble, mientras que las isoformas de 189 y 206 residuos de aminoácidos se mantienen asociadas a la superficie celular y tienen una afinidad fuerte para la 10 heparina. El VEGF se purificó originalmente a partir de varias fuentes sobre la base de su actividad mitógena hacia las células endoteliales, y también por su capacidad para inducir la permeabilidad microvascular, por lo que se conoce también como factor de permeabilidad vascular (VPF).

El patrón de expresión de VEGF sugiere su implicación en el desarrollo y el man-15 tenimiento del sistema vascular normal y en la angiogénesis de los tumores. Durante el desarrollo de los murinos, el endodermo entero de 7,5 días post-coito (p.c.) expre-sa VEGF y el neuroectodermo ventricular produce VEGF en la etapa de endocreci-miento capilar. Véase Breier et al., Development, 114: 521-523 (1992). El día dos del desarrollo de la codorniz, el área vascularizada del saco vitelino así como el embrión 20 total exhiben expresión de VEGF. Adicionalmente, las células epiteliales próximas a los endotelios de las fenestras en los ratones adultos exhiben expresión persistente de VEGF, lo que sugiere un papel en el mantenimiento de este(a) fenotipo y función en-doteliales específicos.

Se han caracterizado dos receptores de afinidad alta para VEGF. Estos son 25 VEGFR-1/Flt-1 (tirosina-quinasa-1 afín a fms) y VEGFR-2/Kdr/Flk-1 (receptor que con-tiene el dominio de inserción de quinasa/quinasa-1 de hígado fetal). Dichos receptores se clasifican en la familia de receptores PDGF, pero tienen siete bucles afines a inmu-noglobulinas en lugar de cinco en su dominio extracelular (véase Fig. 1) y poseen una inserción de quinasa más larga que la observada normalmente en esta familia. La ex-30 presión de receptores VEGF ocurre principalmente en las células endoteliales vascula-res, aunque pueden estar presentes algunos en las células progenitoras hematopoyéticas, monocitos, y células de melanoma. Únicamente se ha consignado la proliferación de células endoteliales en respuesta a VEGF, y las células endoteliales de diferentes fuentes exhiben respuestas diferentes. Así, las señales mediadas por 35

VEGFR-1 y VEGFR-2 parecen ser específicas del tipo celular. Se ha demostrado re-cientemente que El factor de crecimiento placentario relacionado con VEGF (PlGF) se fija a VEGFR-1 con afinidad alta. PlGF era capaz de aumentar la actividad de VEGF como factor de crecimiento, pero no estimulaba las células endoteliales por sí mismo. Los heterodímeros VEGF/PlGF existentes naturalmente eran mitógenos casi tan po-5 tentes como los homodímeros VEGF para las células endoteliales. Cao et al., J. Biol. Chem., 271: 3154-62 (1996).

La tirosina-quinasa receptora Flt4 (VEGFR-3) está estrechamente relacionada en estructura con los productos de los genes VEGFR-1 y VEGFR-2. A pesar de esta se-mejanza, la forma madura de Flt4 difiere de los receptores VEGF en que la misma se 10 escindía proteolíticamente en el dominio extracelular en dos polipéptidos enlazados por disulfuro. Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738-5743 (1992). Los mRNAs de 4,5 y 5,8 kb de Flt4 codifican polipéptidos que difieren en sus términos C debido al uso de exones 3' alternativos. Las isoformas de VEGF o PlGF no exhiben fijación específica a Flt4 o inducen su autofosforilación. 15

La expresión de Flt4 parece ser más restringida que la expresión de VEGFR-1 o VEGFR-2. La expresión de Flt4 se hace detectable primeramente por hibridación in situ en los angioblastos del mesénquima craneal, la vena cardinal, y extraembrional-mente en el alantoides de los embriones de ratón de 8,5 días p.c. En los embriones de 12,5 días p.c., se observa la señal de Flt4 en los endotelios venosos y presumiblemen-20 te linfáticos en desarrollo, pero los endotelios arteriales aparecen negativos. Durante las etapas de desarrollo posteriores, el mRNA de Flt4 se restringe a los vasos linfáti-cos en desarrollo. Los endotelios linfáticos y algunas vénulas endoteliales altas expre-san mRNA de Flt4 en los tejidos humanos adultos y se produce una expresión incrementada en los senos linfáticos en los ganglios linfáticos metastásicos y en el 25 linfangioma. Estos resultados soportan la teoría del origen venoso de los vasos linfáti-cos.

Se han descrito hasta ahora cinco tirosina-quinasas receptoras específicas de las células endoteliales, Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt4 (VEGFR-3), Tie, y Tek/Tie-2, que poseen la actividad intrínseca de tirosina-quinasa esencial para la 30 transducción de señales. Mutaciones direccionadas que desactivan Flt-1, Flk-1, Tie, y Tek en embriones de ratón han indicado sus papeles esenciales y específicos en la vasculogénesis y angiogénesis al nivel molecular. VEGFR-1 y VEGFR-2 fijan VEGF con afinidad alta (Kd 16 pM y 760 pM, respectivamente) y VEGFR-1 fija también el fac-

tor de crecimiento placentario afín (PlGF; Kd aproximadamente 200 pM). Un ligando para Tek se consigna en la publicación de patente PCT WO 96/11269.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un ligando, designado VEGF-C, para la tirosi-na-quinasa receptora Flt4 (VEGFR-3). Así, la invención proporciona un polipéptido 5 purificado y aislado que es capaz de fijarse a la tirosina-quinasa receptora Flt4. La invención proporciona un polipéptido purificado y aislado que es capaz de fijarse a la tirosina-quinasa receptora Flt4 (Flt4), con una secuencia de aminoácidos que com-prende los aminoácidos 103-282 de SEQ ID NO: 33, en el cual dicho polipéptido no incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 94-419 de 10 SEQ ID NO: 33 en la cual se ha incluido un residuo Gln en sustitución del residuo Lys en la posición 414 en SEQ ID NO: 33.

En otra realización, un polipéptido ligando de Flt4 que puede purificarse a partir de medios acondicionados de una línea de células de adenocarcinoma prostático PC-3, teniendo la línea de células el No. Acc. a ATCC CRL 1435. La secuenciación de 15 aminoácidos de este polipéptido ligando derivado de células PC-3 reveló que el po-lipéptido ligando comprende una secuencia de aminoácidos amino-terminal represen-tada en SEQ ID NO: 13. También se describe un medio acondicionado que comprende un ligando de Flt4. La presente invención proporciona también un nuevo uso para la línea de células de adenocarcinoma prostático PC-3 que produce un ligando de Flt4. 20 En una realización preferida, el ligando puede purificarse y aislarse directamente a partir del medio de cultivo de las células PC-3.

Un supuesto precursor o variante de corte y empalme de VEGF-C, constituido por polipéptidos con pesos moleculares de aproximadamente 29 y 32 kD, se considera también como un aspecto de la invención. 25

Un precursor de polipéptido ligando de Flt4 expresado se escinde proteolítica-mente después de la expresión para producir un polipéptido VEGF-C de aproximada-mente 21 kD. El análisis de la secuencia ha indicado que una forma observada de 21 kD tiene un término amino de aproximadamente 9 aminoácidos aguas abajo del térmi-no amino de la forma de 23 kD, lo que sugiere que existen sitios de escisión alternati-30 vos.

Por lo que antecede, será obvio que un aspecto de la invención incluye un frag-mento del polipéptido purificado y aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 103 a 419 mostrados en SEQ ID NO: 33, siendo el fragmento capaz de fijarse específicamente a la tirosina-quinasa receptora Flt4. Realizaciones preferidas 35

incluyen fragmentos que tienen un peso molecular aparente de aproximadamente 29-32 kD como se determina por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

La evidencia sugiere que los aminoácidos esenciales para la retención de la ac-tividad como ligando de Flt4 están contenidos dentro de aproximadamente los ami-noácidos 103/112-226/227 de SEQ ID NO: 33, y que una escisión proteolítica carboxi-5 terminal para producir un ligando de Flt4 maduro, existente naturalmente, ocurre en la posición aproximada de los aminoácidos 226-227 de SEQ ID NO: 33.

El análisis de mutaciones de VEGF-C descrito en esta memoria indica que un polipéptido VEGF-C existente naturalmente que abarca los aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO: 33, producido por una escisión de procesamiento natural que define el 10 término C, existe y es biológicamente activo como ligando de Flt4. Se ha demostrado que un fragmento polipeptídico constituido por los residuos 104-213 de SEQ ID NO: 33 retiene actividad biológica de VEGF-C. Análisis de mutaciones adicionales indican que un polipéptido que abarca sólo los aminoácidos 113-213 de SEQ ID NO: 33 retiene actividad de ligando de Flt4. 15

Además, las comparaciones de secuencias de miembros de la familia de po-lipéptidos VEGF proporcionan una indicación de que fragmentos todavía más peque-ños retendrán actividad biológica. En particular, ocho residuos cisteína muy conservados de la familia de polipéptidos VEGF definen una región desde el residuo 131 al residuo 211 de SEQ ID NO: 33 (véanse las Figuras 10 y 31); por esta razón, un 20 polipéptido que abarca desde aproximadamente el residuo 131 a aproximadamente el residuo 211 se espera que retenga la actividad biológica de VEGF-C. De hecho, se postula que un polipéptido que comprende aproximadamente los residuos 161-211, que retiene un motivo RCXXCC evolutivamente conservado, retiene actividad de VEGF-C. Algunos de los residuos cisteína conservados en VEGF-C participan en la 25 unión intercatenaria por enlaces disulfuro para producir homo- y heterodímeros de los diversos polipéptidos VEGF-C existentes naturalmente. Aparte de las consideraciones que anteceden, existen pruebas de que polipéptidos VEGF-C que carecen de enlaces disulfuro intercatenarios retienen actividad biológica de VEGF-C.

La invención incluye también multímeros (con inclusión de dímeros) que com-30 prenden tales fragmentos enlazados unos con otros o a otros polipéptidos. La unión de los fragmentos puede ser por la vía de enlace covalente (v.g., enlace disulfuro) o enla-ce no covalente de cadenas polipeptídicas (v.g., enlaces de hidrógeno, enlaces debi-dos a interacciones dipolo-dipolo estables o inducidas, enlaces debidos a

interacciones hidrófobas o hidrófilas, combinaciones de estos mecanismos de enlace, etcétera).

La presente invención proporciona también polinucleótidos purificados y aislados (es decir, ácidos nucleicos) que codifican polipéptidos de las invención, por ejemplo un cDNA o DNA genómico correspondiente que codifica un precursor de VEGF-C, VEGF-5 C, o fragmentos o variantes biológicamente activos del mismo, en los cuales la molé-cula de ácido nucleico no es una molécula de cDNA con la secuencia de DNA expues-ta en la entrada HS991157, número de acceso H07991.1 en la base de datos EMBL.

Aspectos adicionales de la invención incluyen vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención; y células hospedadoras transformadas o transfectadas con 10 ácidos nucleicos o vectores de la invención. Vectores preferidos de la invención son vectores de expresión en los cuales los ácidos nucleicos de la invención están conec-tados operativamente a promotores apropiados y otras secuencias de control, de tal modo que células hospedadoras apropiadas transformadas o transfectadas con los vectores son capaces de expresar el ligando de Flt4. Dichos vectores y células hospe-15 dadoras son útiles para producir recombinantemente polipéptidos VEGF-C.

La invención incluye adicionalmente un método de producción de los polipépti-dos de la invención. En un método preferido, un ácido nucleico o vector de la invención se expresa en una célula hospedadora, y un polipéptido de la invención se purifica a partir de la célula hospedadora o el medio de cultivo de la célula hospedadora. 20

En una realización afín, la invención incluye un método de producción de un po-lipéptido capaz de fijarse específicamente a la tirosina-quinasa receptora Flt4, que comprende los pasos de: (a) transformar o transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la célula hospedadora para expresar el áci-do nucleico; y (c) purificar un polipéptido capaz de fijarse específicamente a la tirosina-25 quinasa receptora Flt4 a partir de la célula hospedadora o del medio de cultivo de la célula hospedadora.

En una realización preferida, la invención incluye un polipéptido VEGF-C huma-na o un fragmento biológicamente activo del mismo que está sustancialmente exento de otros polipéptidos humanos. 30

Anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, pueden producirse contra un polipéptido de la invención de acuerdo con métodos estándar en la técnica. Dichos anticuerpos pueden utilizarse en aplicaciones de diagnóstico para monitorizar la an-giogénesis, la vascularización, los vasos linfáticos y sus estados de enfermedad, la curación de las heridas, o ciertas células tumorales, hematopoyéticas, o leucémicas. 35

Los anticuerpos pueden utilizarse también para bloquear el ligando contra la activación del receptor Flt4.

Los ligandos de acuerdo con la invención pueden marcarse con un marcador detectable y utilizarse para identificar sus receptores correspondientes in situ. El ligan-do de Flt4 marcado y los anticuerpos del ligando anti-Flt4 pueden utilizarse como 5 agentes de formación de imágenes en la detección de vasos linfáticos, vénulas endo-teliales altas y sus estados de enfermedad, así como receptores Flt4 expresados en secciones de tejido histoquímicas. El ligando o anticuerpo puede acoplarse covalente o no covalentemente a un agente adecuado supermagnético, paramagnético, de alta densidad electrónica, ecogénico, o radiactivo para la producción de imágenes. Pueden 10 utilizarse también otros marcadores no radiactivos, tales como biotina y avidina.

Un aspecto análogo de la invención es un método para la detección de células específicas, v.g., células endoteliales. Estas células pueden encontrarse in vivo, o en muestras ex vivo de tejidos biológicos. El método de detección comprende los pasos de exponer un tejido biológico que comprende, v.g., células endoteliales, a un polipép-15 tido de acuerdo con la invención que es capaz de fijarse a la tirosina-quinasa receptora Flt4, en condiciones en las cuales el polipéptido se fija a las células, lavar opcional-mente el tejido biológico, y detectar el polipéptido fijado a las células en el tejido bio-lógico, detectando con ello las células.

La presente invención proporciona también aplicaciones diagnósticas y clínicas 20 para los ligandos reivindicados. En una realización preferida, se utilizan ligandos o precursores de Flt4 para acelerar la angiogénesis, v.g., durante la curación de las heridas. Una utilidad para VEGF-C se sugiere como inductor de la angiogénesis asi-mismo en el transplante de tejidos, en enfermedades oftálmicas, en la formación de vasos colaterales alrededor de estenosis arteriales y en tejidos lesionados después de 25 infarto. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden administrarse de cual-quier manera adecuada utilizando un vehículo farmacéuticamente aceptable apropia-do, v.g., un diluyente, adyuvante, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos VEGF-C pueden utilizarse también para cuantificar el riesgo metastá-sico futuro por ensayo de material de biopsia en cuanto a la presencia de receptores o 30 ligandos activos en un ensayo o kit de fijación utilizando VEGF-C marcado detecta-blemente. Un ligando de Flt4 puede utilizarse también para promover el re-crecimiento o la permeabilidad de los vasos linfáticos en, por ejemplo, pacientes de transplante de órganos. Adicionalmente, puede utilizarse un ligando de Flt4 para mitigar la pérdida de vasos linfáticos axilares después de intervenciones quirúrgicas en el tratamiento del 35

cáncer (v.g., cáncer de mama). Los ligandos de acuerdo con la invención pueden utili-zarse también para tratar o prevenir inflamación, edema, aplasia de los vasos linfáti-cos, obstrucción linfática, elefantiasis, y enfermedad de Milroy. Por último, los ligandos de Flt4 pueden utilizarse para estimular la producción y maduración de los linfocitos, y para promover o inhibir el tráfico de leucocitos entre tejidos y vasos linfáticos, o para 5 afectar a la migración de entrada y salida del timo.

Los inhibidores del ligando de Flt4 pueden utilizarse para controlar la prolifera-ción de células endoteliales, linfangiomas, y cáncer metastásico. Por ejemplo, tales inhibidores pueden utilizarse para detener el crecimiento o la propagación de metásta-sis, o para controlar otros aspectos de la expresión y crecimiento de las células endo-10 teliales. Los inhibidores incluyen anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, y polipéptidos que bloquean el receptor Flt4.

En otra realización, la invención proporciona un método para modular el creci-miento de las células endoteliales en un mamífero que comprende los pasos de expo-ner las células endoteliales del mamífero a un polipéptido de acuerdo con la invención 15 en una cantidad eficaz para modular el crecimiento de las células endoteliales del mamífero. En una realización, la modulación del crecimiento se efectúa utilizando un polipéptido capaz de estimular la fosforilación de la tirosina de la tirosina-quinasa del receptor Flt4 en una célula hospedadora que expresa la tirosina-quinasa del receptor Flt4. En la modulación del crecimiento de las células endoteliales, la invención descri-20 be la modulación de trastornos relacionados con las células endoteliales. Trastornos de las células endoteliales descritos incluyen, pero sin carácter limitante, la pérdida física de vasos linfáticos (v.g., eliminación quirúrgica de tejido linfático axilar), oclusión de vasos linfáticos (v.g., elefantiasis), y linfangiomas. En una realización preferida, el individuo, y las células endoteliales, son humanos. Las células endoteliales pueden 25 proporcionarse in vitro o in vivo, y pueden estar contenidas en un injerto de tejido. Una cantidad eficaz de un polipéptido se define en esta memoria como aquella cantidad de polipéptido determinada empíricamente como necesaria para conseguir un cambio reproducible en la tasa de crecimiento celular (como se determina por visualización microscópica o macroscópica y estimación del tiempo de duplicación celular, o ensa-30 yos de síntesis de ácido nucleico), como sería comprendido por una persona con ex-periencia ordinaria en la técnica.

También se describen polinucleótidos purificados y aislados que codifican otras formas de VEGF-C no humanas, como lo son los polipéptidos codificados por ellos, y anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con las variantes de VEGF-C 35

no humanas. Formas no humanas preferidas de VEGF-C son formas derivadas de otras especies de vertebrados, con inclusión de especies de aves y mamíferos. Son muy preferidas las formas de mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa esquemáticamente tirosina-quinasas receptoras principa-5 les de células endoteliales y factores de crecimiento implicados en la vasculogénesis y la angiogénesis. Se representan los dominios estructurales mayores, con inclusión de dominios afines a inmunoglobulinas (IGH) dominios de homología de factores del cre-cimiento epidérmico (EGFH), dominios de fibronectina tipo III (FNIII), dominios trans-membranales (TM) y yuxtamembranales (JM), dominios de tirosina-quinasa (TK1, 10 TK2), dominios de inserción de quinasa (KI), y dominios carboxi-terminales (CT).

La Figura 2 representa esquemáticamente la construcción del vector de expre-sión pLTRFlt4l.

La Figura 3 representa esquemáticamente la construcción del vector de baculovi-rus que codifica un dominio extracelular Flt4 soluble secretado (Flt4EC). 15

La Figura 4 muestra los resultados de la estimulación de la autofosforilación de Flt4 por medio acondicionado a partir de cultivos de células PC-3.

Las Figuras 5A, 5B, y 5C muestran que el polipéptido tirosil-fosforilado mayor de células transfectadas por Flt4 estimuladas con medio acondicionado PC-3 es el po-lipéptido Flt4 de 125 kD (VEGFR-3), y también que la actividad de estimulación de Flt4 20 no se adsorbe a heparina-Sepharose.

La Figura 6 muestra el análisis por inmunotransferencia Western de la actividad de ligando de Flt4 aislada de medio acondicionado PC-3.

La Figura 7 muestra los resultados de la electroforesis en gel de fracciones cro-matográficas procedentes de la purificación por afinidad de ligando de Flt4 (VEGF-C) 25 aislado de medio acondicionado PC-3 concentrado.

La Figura 8 muestra las secuencias de aminoácidos de polipéptidos VEGF-C humanas, murinos y de codorniz, alineados para mostrar la semejanza. Los residuos conservados en las tres especies se representan en negrita.

La Figura 9 representa esquemáticamente la clonación y estructura del ligando 30 de Flt4, VEGF-C. La región homóloga de VEGF (recuadro sombreado oscuro) y los polipéptidos amino- y carboxil-terminales (recuadros sombreados claros y no som-breados, respectivamente) así como la secuencia de señal supuesta (ss) se represen-tan entre las regiones de ácido nucleico 5' y 3' no traducidas (nt). Los sitios de escisión

para la secuencia de señal y los propéptidos amino- y carboxil-terminales se indican con triángulos.

La Figura 10 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos dedu-cidas de PDGF-A, -B, PlGF-1, VEGF-B167, VEGF165, y ligando de Flt4 (VEGF-C).

La Figura 11 representa la organización exones-intrones del gen de VEGF-C 5 humana. Se representan siete exones como recuadros abiertos, con el tamaño de exón representado en pares de bases. Los intrones se representan como líneas, re-presentándose el tamaño de intrón (pares de bases) sobre las líneas. Las secuencias 5' y 3' no traducidas de un mRNA maduro de 2,4 kb supuesto se representan como recuadros sombreados. La localización de los clones genómicos utilizados para carac-10 terizar el gen de VEGF-C se representa bajo el mapa del gen.

La Figura 12 muestra análisis por transferencia Northern de los genes codifican-tes de VEGF, VEGF-B, y VEGF-C (indicado por "FLT4-L") en dos líneas de células de tumores humanos y en tejido cerebral.

La Figura 13A es una autorradiografía que muestra VEGF-C recombinante aisla-15 do después de un experimento de pulso y caza y sometido a electroforesis por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

La Figura 13B es una fotografía de un gel de poliacril-amida que muestra que las formas recombinantes de VEGF-C están enlazadas por disulfuro en condiciones no reductoras. 20

Las Figuras 14A y 14B representan transferencias Western que muestran que VEGF-C estimula la autofosforilación de VEGFR-2 (KDR), pero no tiene efecto alguno sobre la fosforilación de PDGFR-β.

La Figura 15A muestra que VEGF-C estimula la migración de las células endote-liales en un ensayo tridimensional en gel de colágeno. 25

La Figura 16A muestra la expresión de mRNA de VEGF-C en tejidos humanos adultos.

La Figura 16B muestra la expresión de VEGF, VEGF-B, y VEGF-C en tejidos fetales humanos seleccionados.

La Figura 17 representa la estructura genómica de los genes VEGF-C humana y 30 murino. Se representan secuencias de uniones exón-intrón junto con las longitudes de exones e intrones. Las secuencias de intrones se representan en letras minúsculas. Los nucleótidos del marco de lectura abierto observados en cDNAs de VEGF-C se indican como letras mayúsculas en tripletes (correspondientes a los codones codifica-dos en las uniones). 35

La Figura 18 presenta una ilustración esquemática del procesamiento de VEGF-C, con inclusión de las formas principales de VEGF-C.

La Figura 19 representa autorradiogramas de un experimento de inmunoprecipi-tación por pulso y caza en el cual las células transfectadas con un vector de expresión de VEGF-C (VEGF-C) y falsamente transfectadas (M) se marcaron mediante pulsos 5 con aminoácidos radiactivos y se sometieron a caza durante períodos de tiempo varia-bles.

La Figura 20 es un mapa esquemático de la construcción del vector K14-VEGF-C.

Las Figuras 21A-C representan fraccionamientos por electroforesis de las diver-10 sas formas de VEGF-C recombinante producidas por células 293 EBNA transfectadas. La Figura 21B representa el fraccionamiento electroforético, en condiciones no reduc-toras, de polipéptidos producidos a partir de células falsamente (M) transfectadas, células transfectadas con cDNA de VEGF-C de tipo salvaje (ts), y células transfecta-das con una variante de cDNA que codifica VEGF-C-R102S. Cada una de las bandas 15 identificadas en la Figura 21B se cortó y se fraccionó por electroforesis en una pista separada en condiciones reductoras. El fraccionamiento de las bandas correspondien-tes a VEGF-C ts se representa en la Figura 21A; el fraccionamiento de las bandas correspondientes a la variante R102S se representa en la Figura 21C.

Las Figuras 22A-B representan las formas y los tamaños de VEGF-Cs recombi-20 nante de tipo salvaje y mutantes, como se revelan por electroforesis en gel en condi-ciones no reductoras. La Figura 22A muestra las formas de VEGF-C secretadas a los medios; la Figura 22B muestra las formas de VEGF-C retenidas por las células. Como control se utilizaron células falsamente (M) transfectadas.

Las Figuras 23A-B presentan una comparación del patrón de formas de VEGF-25 C inmunoprecipitadas y marcadas utilizando antisueros 882 y antisueros 905. Las pis-tas adyacentes contienen inmunoprecipitados que se sometieron (pistas marcadas +) o no se sometieron (pistas marcadas -) a reducción y alquilación.

Las Figuras 24A-B presentan transferencias Northern de RNA total aislado de células cultivadas en presencia o ausencia de interleuquina-1 (IL-1) y/o dexametasona 30 (DEX) durante los tiempos indicados. Para la Figura 24B, la transferencia Northern se sondó con DNA radiomarcado procedente de un cDNA de VEGF de 581 pb que abar-caba los pares de bases 57-638 (GenBank Acc. No. X15997), y un fragmento de cDNA de VEGF-B167 humano (nucleótidos 1/382, GenBank Acc. No. U48800). Para la Figura 24A, la transferencia Northern se sondó con DNA radiomarcado procedente de un 35

cDNA de VEGF-C humana de longitud total (GenBank Acc. No. X94216). Marcadores de rRNA 18S y 28S.

La Figura 25 muestra la expresión de VEGF-C en cultivos de P. pastoris trans-fectados con un cDNA de VEGF-C, con vector sólo, o falsamente transfectados (M), después de inducción con metanol durante períodos de tiempo variables como se indi-5 ca. Se analizaron aproximadamente 10 µl de medio por electroforesis en gel seguida por transferencia Western y detección con antisuero anti-VEGF-C.

La Figura 26 representa los resultados de una transferencia Western en la cual se estimularon células NIH 3T3 que expresaban VEGFR-3 (Flt4), y células PAE que expresaban VEGFR-2 (KDR), con 5x de medio concentrado a partir de la levadura 10 Pichia transfectada con un vector que contenía cDNA de VEGF-C (+), con un vector que carecía de inserción (-), o se estimularon con el vanadato de control positivo. Las células estimuladas se lisaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos VEGFR-específicos, y los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia y se sondaron con anticuerpos anti-fosfotirosina. 15

Las Figuras 27A-B presentan electroforetogramas en gel de VEGF-C humana (ts) y variantes de VEGF-C secretadas (Figura 27A) o retenidas (Figura 27B) por las células hospedadoras 293 EBNA. Como control sirvieron células falsamente transfec-tadas (M). Los marcadores de peso molecular se indican a la izquierda en kilodaltons (kD). 20

Las Figuras 28A-B muestran transferencias Western de VEGFRs que se estimu-laron para autofosforilación por VEGF-C de tipo salvaje (ts), así como tres variantes polipeptídicas de VEGF-C. Los lisados de células (NIH 3T3 para VEGFR-3 y PAE para VEGFR-2) se sometieron a antisueros específicos de receptor y se inmunoprecipitaron los receptores. Los inmunoprecipitados se fraccionaron luego en gel y se sometieron a 25 transferencia para análisis Western. Las transferencias Western se sondaron con anti-cuerpos anti-fosfotirosina.

Las Figuras 29A-D son fotomicrografías de secciones teñidas con hematoxilina-eosina de tejidos de hermanos de camada de ratón transgénicos K14-VEGF-C y de control. Las áreas mostradas son de la piel dorsal y del hocico, como se indica. Las 30 flechas blancas muestran el margen revestido de endotelio de las lagunas desprovis-tas de glóbulos rojos.

La Figura 30 presenta una transferencia Northern de RNA poliadenilado de los tejidos indicados, hibridado con una agrupación de sondas VEGF, VEGF-B167, y

VEGF-C. Los tamaños estimados de los transcritos se muestran a la derecha en kilo-bases (kb).

La Figura 31 presenta una comparación de las secuencias de aminoácidos de VEGF-C humana y de ratón. La secuencia de aminoácidos de VEGF-C de ratón se presenta en la línea superior y las diferencias en la secuencia humana se señalan bajo 5 ella. Las secuencias se han marcado para representar las regiones que se muestran en la Figura 9. La flecha indica el sitio de escisión supuesto para la peptidasa de señal; los restos BR3P, así como un resto CR/SC, están encerrados en recuadros; y los res-tos cisteína conservados están marcados en negrita encima de la secuencia. El resi-duo arginina 158 está marcado también en negrita. La numeración se refiere a los 10 residuos VEGF-C de ratón.

La Figura 32 presenta muestras fraccionadas por SDS-PAGE inmunoprecipita-das o purificadas por afinidad a partir de diversos medios marcados con 35S. En el pa-nel izquierdo, medio de control de células Bosc23 que contenían solamente vector, medio de células que expresaban VEGF-C humana, y medio de células que expresa-15 ban VEGF-C de ratón se precipitaron independientemente con Dominio Extracelular de VEGFR-3 humano acoplado a Sepharose. En el panel derecho, se sometieron medios acondicionados similares a precipitación con anticuerpos anti-VEGF-C. mpm: marca-dores de peso molecular; m- ratón; h- humano; α- anti.

La Figura 33 muestra transferencias Western de inmunoprecipitados fracciona-20 dos en gel procedentes de lisados producidos a partir de células NIH 3T3 que expre-saban VEGFR-3 o VEGFR-2, como se indica, que se habían estimulado por contacto con lisados que contenían VEGF-C (o un vector de control), como medida de la auto-fosforilación del receptor inducida por VEGF-C. Las transferencias Western se sonda-ron con anti-fosfotirosina (α-PTyr) o antisueros anti-receptor (anti-VEGFR-3 y anti-25 VEGFR-2), como se indica. Como control, se indujo la autofosforilación del receptor por tratamiento con pervanadato (VO4). Las flechas y números se refieren a los pesos moleculares aparentes de las bandas polipeptídicas de los receptores tirosil-fosforilados. bVEGF: proteína VEGF-C de baculovirus humano; C-FGEVm: lisado de células que albergaban un cDNA de VEGF-C de ratón clonado en el vector en orienta-30 ción antisentido.

Las Figuras 34A-D representan fotomicrografías de hibridaciones in situ que re-velan la expresión de mRNAs de VEGF-C y VEGF-B en una sección parasagital de un embrión de ratón de 12,5 días. Figura 34A: sonda de VEGF-C; j- venas yugulares, mn- metanefros, m- mesenterio (puntas de flecha), vc- vasos intervertebrales, lu- pulmón 35

(puntas de flecha). Figura 34B: sonda de VEGF-B; h- corazón, área nasofaríngea (puntas de flecha). Figura 34C: sonda de la cadena de sentido de VEGF-C que sirve como control. Figura 34D: fotomicrografía en campo brillante del mismo campo mos-trado en la Figura 34C.

Las Figuras 35A-H representan secciones de embriones de ratón que proporcio-5 nan comparaciones de la expresión de VEGF-C y VEGFR-3 en los vasos yugulares y el área mesentérica. Las Figuras 35A y 35C muestran la expresión de transcritos de VEGF-C en el mesénquima alrededor de las grandes estructuras semejantes a sacos en el área yugular (puntas de flecha). Las Figuras 35B y 35D muestran la expresión de transcritos de VEGFR-3 en los sacos venosos yugulares. Las Figuras 35E y 35G 10 muestran la distribución de mRNA de VEGF-C en la región mesentérica de un embrión de 14,5 días p.c., así como alrededor del intestino. Las Figuras 35F y 35H muestran mRNA de VEGFR-3 en la región mesentérica de un embrión de 14,5 días, así como el área intestinal, vasos linfáticos en desarrollo, y vénulas.

Las Figuras 36A-D representan fotomicrografías que muestran la hibridación de 15 Flt4 y VEGF-C in situ de la región cefálica de un embrión de ratón de 16 días p.c. Una sección de la región cefálica hibridada con la sonda Flt4 (Figura 36A), muestra el hoci-co, las estructuras nasales y los ojos en desarrollo. Una sección localizada en posición más caudal muestra la hibridación con la sonda VEGF-C (Figura 36B). Las estructuras redondas a ambos lados en la parte superior representan los molares en desarrollo. 20 En la parte superior (dorsal) a ambos lados de la línea media, se ven las porciones caudales de los cornetes en desarrollo.

Estas estructuras se muestran también en microscopía de campo oscuro (Figura 36C) y campo claro (Figura 36D) con mayor aumento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 25

Se describe en esta memoria el aislamiento de un nuevo factor de crecimiento vascular endotelial y la clonación de un DNA que codifica este nuevo factor de creci-miento a partir de una genoteca de cDNA preparada a partir de la línea de células de adenocarcinoma prostático humano PC-3. El cDNA aislado codifica una proteína que se procesa proteolíticamente y se secreta al medio de cultivo celular. La proteína se-30 cretada, designada VEGF-C, se fija al dominio extracelular de Flt4 e induce la autofos-forilación de la tirosina de Flt4 y VEGFR-2. La VEGF-C estimula también la migración de las células endoteliales en gel de colágeno.

Los datos consignados en esta memoria indican que VEGF-C se expresa como un precursor mayor que se escinde para producir el ligando. Una región co-expresada 35

en algunos casos es resultado del corte y empalme alternativos de RNA del gen del ligando. Dicha región co-expresada puede ser función del sistema de expresión parti-cular utilizado para obtener el ligando. El profesional experto entenderá que, en la pro-ducción recombinante de proteínas, una secuencia adicional puede expresarse junto con un polipéptido funcional dependiendo de la construcción recombinante particular 5 utilizada para expresar la proteína, y eliminarse subsiguientemente para obtener el ligando deseado. En algunos casos, el ligando recombinante puede producirse de mo-do que carezca de ciertos residuos del ligando endógeno/natural. Además, es bien sabido que pueden producirse reemplazamientos conservadores en una proteína que no alteran la función de la proteína. 10

Además, se anticipa que uno o más precursores de VEGF-C (teniendo el precur-sor de VEGF-C secretado nativo mayor supuesto la secuencia de aminoácidos com-pleta desde el residuo 32 al residuo 419 de SEQ ID NO: 33) es o son capaces de estimular el ligando de Flt4 sin procesamiento adicional alguno, de una manera similar a aquélla en la cual VEGF estimula su receptor en su forma no procesada después de 15 la secreción y liberación concomitante de la secuencia de señal.

Los resultados consignados en esta memoria demuestran que Flt4 (VEGFR-3) transmite señales para VEGF-C. Esta conclusión está basada en la fijación específica de VEGF-C a la proteína recombinante Flt4EC (dominio extracelular de Flt4) y la in-ducción de la autofosforilación de VEGFR-3 por el medio a partir de células transfecta-20 das por VEGF-C. En contraste, ni VEGF ni PlGF mostraban fijación específica a VEGFR-3 o inducían su autofosforilación.

Como se expone con mayor detalle más adelante, el prepro-VEGF-C supuesto tiene un peso molecular deducido de 46.883; un compuesto intermedio de procesa-miento de prepro-VEGF-C supuesto tiene un peso molecular observado de aproxima-25 damente 32 kD; y el VEGF-C maduro aislado de medios acondicionados tiene un peso molecular de aproximadamente 23 kD como se determina por SDS-PAGE en condi-ciones reductoras. Una mayor parte de la diferencia en la masa molecular observada del VEGF-C purificado y recombinante y la masa molecular deducida del prepro-VEGF-C codificado por el marco de lectura abierto (ORF) de VEGF-C es atribuible a la 30 eliminación proteolítica de secuencias en las regiones amino-terminal y carboxil-terminal del polipéptido prepro-VEGF-C. Sin embargo, la escisión proteolítica de la secuencia conductora de 102 aminoácidos supuesta no se cree que explique la dife-rencia total entre la masa molecular deducida de 46.883 y la masa observada de aproximadamente 23 kD, debido a que el peso molecular deducido de un polipéptido 35

constituido por los aminoácidos 103-419 de SEQ ID NO: 33 es 35.881 kD. La eviden-cia indica que una porción de la diferencia observada en los pesos moleculares es atribuible a la eliminación proteolítica de residuos de aminoácidos en ambas regiones amino- y carboxil-terminales del precursor de VEGF-C. La extrapolación de estudios de la estructura de PDGF (Heldin et al., Grotsh Factors, 8: 245-52 (1993)) sugiere que 5 la región crítica para la fijación y activación del receptor por VEGF-C está contenida dentro de los residuos de aminoácidos 104-213, que se encuentran en la forma secre-tada de la proteína VEGF-C (es decir, la forma que carece de la secuencia conductora prepro- supuesta y algunas secuencias carboxi-terminales). El VEGFR-3 de fijación del polipéptido de 23 kD representa probablemente el dominio homólogo de VEGF. Des-10 pués de la biosíntesis, el polipéptido VEGF-C naciente puede glicosilarse en tres sitios de glicosilación supuestos unidos a N, identificados en la secuencia de aminoácidos de VEGF-C deducida. Polipéptidos que contienen modificaciones, tales como glicosi-laciones unidas a N, se consideran como aspectos de la invención.

Las secuencias de aminoácidos del terminal carboxilo, que aumentan la longitud 15 del polipéptido VEGF-C en comparación con otros ligandos de esta familia, exhiben un patrón de separación de los residuos cisteína reminiscente de la secuencia de la pro-teína Balbiani ring 3 (BR3P) (Dignam et al., Gene, 88: 133-40 (990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211: 331-49 (1990)). Este nuevo motivo estructural C-terminal de VEGF-C semejante a la proteína de seda puede plegarse en un dominio independiente, que, 20 sobre la base de las consideraciones anteriores, se escinde al menos parcialmente después de la biosíntesis. Resulta interesante que al menos un motivo cisteína del tipo BR3P se encuentra también en el término carboxilo de VEGF. En los experimentos realizados por los autores de la invención, tanto el precursor supuesto como el ligando escindido se detectaron en el medio de cultivo de las células, lo que sugiere escisión 25 por proteasas celulares. La determinación de las secuencias amino-terminales y car-boxi-terminales de aislados de VEGF-C permite la identificación de los sitios de proce-samiento proteolíticos. La generación de anticuerpos contra diferentes partes de la molécula pro-VEGF-C permite la determinación exacta de la relación y proporción pre-cursor-producto, su distribución celular, y la cinética de procesamiento y secreción. 30

VEGF-C tiene un patrón conservado de ocho residuos cisteína, que pueden par-ticipar en la formación de enlaces disulfuro intra- e intercatenarios, creando una molé-cula biológicamente activa dímera antiparalela, similar a PDGF. El análisis mutacional de los residuos cisteína implicados en los puentes disulfuro intercatenarios ha demos-trado que en contraste con PDGF, los dímeros de VEGF precisan mantenerse juntos 35

por estas interacciones covalentes a fin de mantener la actividad biológica. El enlace por disulfuro de las cadenas polipeptídicas de VEGF-C era evidente en el análisis de VEGF-C en condiciones no reductoras, aunque la proteína recombinante contenía también formas de VEGF-C activas como ligando que carecían de enlaces disulfuro entre los polipéptidos. 5

VEGFR-3, que diferencia entre VEGF y VEGF-C, es estrechamente afín en es-tructura a VEGFR-1 y VEGFR-2. Finnerty et al., Oncogene, 8: 2993-89 (1993); Galland et al., Oncogene, 8: 1233-40 (1993); Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738-43 (1992). Además de VEGFR-3, la tirosina-quinasa VEGFR-2 se activa también en respuesta a VEGF-C. Las señales mediadas por VEGFR-2 causan cambios notables en la morfo-10 logía, reorganización de la actina y arrugamiento de la membrana de las células endo-teliales aórticas de porcino que sobreexpresan este receptor. En estas células, VEGFR-2 mediaba también la quimiotaxis y la mitogenicidad inducidas por ligandos. Waltenberger et al., J. Biol. Chem., 269: 26988-95 (1994). Análogamente, la quimera receptora CSF-1R/VEGFR-3 era mitógena cuando se expresaba ectópicamente en las 15 células fibroblásticas NIH 3T3, pero no en células endoteliales aórticas de porcino (Pa-jusola et al., 1994). Consistentemente con tales resultados, las células endoteliales capilares de bovino (BCE), que expresan mRNA de VEGFR-2 pero muy poco o nada de mRNAs de VEGFR-1 o VEGFR-3, demostraban migración incrementada cuando se estimulaban con VEGF-C. La microscopía óptica de los cultivos de células BCE en gel 20 de colágeno sugería también que VEGF-C estimulaba la proliferación de estas células. Los datos indican por tanto que los ligandos y receptores de VEGF exhiben una gran especificidad en su señalización, la cual puede ser dependiente del tipo de célula.

El patrón de expresión de la VEGFR-3 (Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92: 3566-70 (1995)) sugiere que VEGF-C puede intervenir en la formación de 25 los sistemas vasculares venoso y linfático durante la embriogénesis. La expresión constitutiva de VEGF-C en los tejidos adultos mostrados en esta memoria sugiere adi-cionalmente que este producto génico está implicado también en el mantenimiento de las funciones diferenciadas del endotelio linfático y ciertos endotelios venosos en los cuales se expresa VEGFR-3 (Kaipainen et al., 1995). Los capilares linfáticos no tienen 30 láminas basales bien formadas y existe una posibilidad interesante que el motivo BR3P semejante a seda esté implicado en la producción de una estructura supramole-cular que podría regular la disponibilidad de VEGF-C en los tejidos. Sin embargo, co-mo se demuestra aquí, VEGF-C activa también VEGFR-2, que es abundante en las células endoteliales proliferantes de los brotes vasculares y vasos ramificantes de los 35

tejidos embrionarios, pero no tan abundante en los tejidos adultos. Millauer et al., Na-ture, 367: 576-78 (1993). Estos datos han sugerido que VEGFR-2 es un regulador principal de la vasculogénesis y la angiogénesis. VEGF-C puede tener así un efecto único en el endotelio linfático y una función más redundante, compartida con VEGF, en la angiogénesis y posiblemente en la regulación de la permeabilidad de varios tipos de 5 endotelios. Dado que VEGF-C estimula VEGFR-2 y promueve la migración endotelial, VEGF-C puede ser útil como inductor de la angiogénesis de vasos sanguíneos y linfá-ticos en la curación de las heridas, en el transplante de tejidos, en enfermedades oftálmicas, y en la formación de vasos colaterales alrededor de estenosis arteriales y en tejidos lesionados después de un infarto. 10

Considerados en conjunto, estos resultados demuestran una complejidad incre-mentada de la señalización en el endotelio vascular. Los mismos refuerzan el concep-to de que, cuando los órganos se diferencian y comienzan a realizar sus funciones específicas, la heterogeneidad fenotípica de las células endoteliales aumenta en varios tipos de vasos funcional y morfológicamente distintos. Sin embargo, después de esti-15 mulación mediante estímulos angiogénicos adecuados, las células endoteliales pue-den entrar de nuevo en el ciclo celular, migrar, salir del ciclo celular y diferenciarse de nuevo posteriormente para formar nuevos vasos que se adaptan funcionalmente a su entorno tisular. Este proceso de angiogénesis, concurrente con el desarrollo y la rege-neración de los tejidos, depende del balance rigurosamente controlado entre señales 20 positivas y negativas para la proliferación, migración, diferenciación y supervivencia de las células endoteliales.

Factores de crecimiento que promueven la angiogénesis identificados previa-mente incluyen los factores de crecimiento de los fibroblastos, el factor de crecimien-to/factor de dispersión de los hepatocitos, PDGF y TGF-α. (Véase v.g., Folkman, 25 Nature Med., 1: 27-31 (1995); Friesel et al., FASEB J., 9: 919-25 (1995); Mustonen et al., J. Cell Biol., 129: 895-98 (1995). Sin embargo, VEGF ha sido el único factor de crecimiento relativamente específico para las células endoteliales. Los factores recién identificados VEGF-B [Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 2578-81 (1996)] y VEGF-C aumentan por tanto la comprensión actual de la complejidad de las señales 30 positivas específicas y redundantes para las células endoteliales implicadas en la vas-culogénesis, la angiogénesis, la permeabilidad, y quizás también otras funciones endo-teliales. Estudios de expresión con utilización de transferencia Northern demuestran la expresión abundante de VEGF-C en el músculo cardíaco y esquelético; otros tejidos, tales como placenta, ovario, intestino delgado, glándula tiroides, riñón, próstata, bazo, 35

testículos e intestino grueso expresan también este gen. En tanto que PlGF se expre-sa predominantemente en la placenta, los patrones de expresión de VEGF, VEGF-B y VEGF-C se solapan en muchos tejidos, lo que sugiere que los miembros de la familia VEGF pueden formar heterodímeros e interaccionar para ejercer sus funciones fisioló-gicas. 5

La mutagénesis direccionada que conduce a la desactivación de los loci recepto-res de VEGF en el genoma del ratón ha demostrado que VEGFR-1 es necesario para la organización adecuada de las células endoteliales que forman el endotelio vascular, mientras que VEGFR-2 es necesario para la generación tanto de las células endotelia-les como de las hematopoyéticas. Esto sugiere que los cuatro genes de la familia 10 VEGF pueden ser dianas para mutaciones conducentes a malformaciones vasculares o enfermedades cardiovasculares.

Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones preferidas de la invención, en las cuales se muestran el aislamiento, la caracterización y la función de los ligandos y ácidos nucleicos codificantes de ligandos de Flt4 de acuerdo con la invención. 15

EJEMPLO 1

Producción del vector de expresión pLTRFlt4l

La construcción del vector LTR-Flt4l, codificante de la forma larga de la tirosina-quinasa receptora Flt4, se muestra esquemáticamente en Fig. 2. El cDNA de Flt4s de longitud total (forma corta de Flt4) (No. de Acceso a GenBank X68203, SEQ ID NO: 20 36) se ensambló subclonando primeramente el fragmento S2.5, consignado en Paju-sola et al., Cancer Res., 52: 5738-5743 (1992), incorporado por referencia en esta memoria, que contenía los pares de bases 56-2534 del Flt4s en el sitio EcoRI del vec-tor pSP73 (Promega, Madison, WI).

Dado que las genotecas de cDNA utilizadas para el escrutinio de cDNAs de Flt4 25 no contenían las secuencias codificantes de proteína del extremo 5', se utilizó PCR inversa para la amplificación del extremo 5' de Flt4 correspondiente a los 12 primeros residuos de aminoácidos (MQRGAALCLRLW). Se aisló RNA poli(A)+ a partir de célu-las de la eritroleucemia humana HEL y se sintetizó cDNA bicatenario utilizando un kit Amersham cDNA Synthesis System Plus (Amersham Corp., Buckinghamshire, Reino 30 Unido) y un iniciador específico del gen: 5'-TGTCCTCGCTGTCCTTGTCT-3' (SEQ ID NO: 1), que estaba localizado 195 pb aguas abajo del extremo 5' del clon S2.5. El cDNA bicatenario se trató con DNA-polimerasa T4 para hacer romos los extremos y el cDNA se purificó por filtración con filtros Centricon 100 (Amicon Inc., Beverly, MA). La circularización del cDNA de extremos romos se realizó por ligación en un volumen total 35

de 150 microlitros. La mezcla de reacción contenía un tampón de ligación estándar, 5% de PEG-8000, DTT 1M y 8 U de DNA-ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). La ligación se llevó a cabo a 16ºC durante 16 horas. Se utilizaron 15 microlitros de esta mezcla de reacción en una reacción PCR estándar (volumen total 100 µl) que contenía 100 ng de iniciadores específicos de Flt4 introduciendo sitios de restricción 5 SacI y PstI, y 1 unidad de DNA-polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus). Se realizaron dos tandas de PCR utilizando 33 ciclos por tanda (desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, reasociación a 55ºC durante 2 minutos, y elongación a 72ºC durante 4 minu-tos). La mezcla de la PCR se trató secuencialmente con las enzimas de restricción SacI y PstI y, después de purificación con MagicPCR Preps (Promega), los fragmentos 10 de DNA se subclonaron en el vector pGEM3Zf(+) para secuenciación (Promega). La secuencia correspondía al extremo 5' del clon de cDNA Flt4s depositado en la Base de Datos GenBank como No. de Acceso X68203.

La secuencia codificante de los 12 primeros residuos de aminoácidos se añadió a la construcción de expresión por ligación de un fragmento PCR digerido con SphI 15 amplificado utilizando PCR de transcripción inversa de RNA poli(A)+ aislado a partir de las células HEL. El iniciador directo tenía la secuencia siguiente: 5'-ACATCGATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 2) (el sitio SphI está subrayado, y el codón de co-mienzo de la traducción marcado en negrita). El codón de comienzo de la traducción 20 se encuentra inmediatamente aguas abajo de una secuencia de consenso Kozak op-timizada. (Kozak, Nucl. Acids Res. 15: 8125-8248 (1987).) El iniciador inverso, 5'-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3' (SEQ ID NO: 3) (sitio SphI subrayado), has-ta el extremo 5' del fragmento S2.5, reemplazando así el fragmento único SphI del plásmido S2.5. El vector resultante se digirió con EcoRI y ClaI y se ligó a un fragmento 25 PCR de 138 pb amplificado a partir del fragmento EcoRI de 0,6 kb (pares de bases 3789 a 4416 en la secuencia GenBank X68203) que codifica el extremo 3' de Flt4s mostrado en la Figura 1 de Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738-5743 (1992), utili-zando los oligonucleótidos 5'-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3' (SEQ ID NO: 4) (iniciador directo, sitio EcoRI subrayado) y 5'-CCATCGATGG ATCCTACCTG 30 AAGCCGCTTT CTT-3' (SEQ ID NO: 5) (iniciador inverso, sitio ClaI subrayado). El do-minio codificante se completó por ligación del fragmento EcoRI de 1,2 kb (pares de bases 2535-3789 de la secuencia encontrada en el No. de Acceso a GenBank X68203) en la construcción anterior. El cDNA completo se subclonó como un fragmen-to HindIII-ClaI (romo) (este sitio ClaI se incluyó también en el iniciador 3' utilizado para 35

construir el extremo 3' de la secuencia codificante) hasta el vector de expresión pLTRpoli consignado en Mäkelä et al., Gene, 118: 293-294 (1992) (número de acceso a GenBank X60280, SEQ ID NO: 37), incorporado por referencia en esta memoria, utilizando sus sitios de restricción HindIII-AccI (romo).

La forma larga de Flt4 (Flt4l) se produjo por reemplazamiento del extremo 3' de 5 la forma corta como sigue: la región 3' del cDNA de Flt4l se amplificó por PCR utilizan-do un oligonucleótido específico del gen (SEQ ID NO: 7, véase más adelante) y un oligonucleótido específico del vector pGEM 3Z (promotor SP6) 5'-ATTTAGGTGACACTATA-3' (SEQ ID NO: 6) como iniciadores inverso y directo, res-pectivamente. El molde para la PCR era un clon de cDNA de Flt4l que contenía un 10 fragmento EcoRI de 495 pb que se extendía aguas abajo del sitio EcoRI en el nucleó-tido 3789 de la secuencia GenBank X68203 (la secuencia situada aguas abajo de este sitio EcoRI está depositada como la secuencia 3' de la forma larga de Flt4 que tiene el número de acceso GenBank S66407 (SEQ ID NO: 38)). El oligonucleótido específico del gen contiene un sitio de restricción BamHI localizado inmediatamente después del 15 final de la región codificante y tiene la secuencia siguiente: 5'-

CCATCGATGGATCCCGATGCTGCTTAGTAGCTGT-3' (SEQ ID NO: 7) (el sitio BamHI está subrayado). El producto PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se transfirió en marco al fragmento del vector LTRFlt4s del que se habían eliminado las secuencias codificantes aguas abajo del sitio EcoRI en el par de bases 2535 (véase la secuencia 20 X68203) por digestión con EcoRI- BamHI. El clon resultante se designó pLTRFlt4l. Una vez más, el dominio codificante se completó por ligación del fragmento EcoRI de 1,2 kb (pares de bases 2535-3789 de la secuencia X68203) de nuevo a la construc-ción resultante.

EJEMPLO 2 25

Producción y análisis de células transfectadas con Flt4l

Células NIH 3T3 (confluentes en un 60%) se cotransfectaron con 5 microgramos de la construcción pLTRFlt4l y 0,25 microgramos del vector pSV2neo que contenía el gen de neomicin-fosfotransferasa (Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), utilizando los reactivos de transfección basados en liposomas DOTAP (Boehringer-30 Mannheim, Mannheim, Alemania). Un día después de la transfección, se transfirieron las células a medios de selección que contenían 0,5 mg/ml de geneticina (GIBCO, Grand Island, N.Y.). Se aislaron colonias de células resistentes a la geneticina y se analizaron respecto a la expresión de las proteínas Flt4. Las células se lisaron en tampón de lisis hirviente que contenía 3,3% de SDS, Tris 125 mM, de pH 6,8. Las con-35

centraciones de proteínas de las muestras se midieron por el método BCA (Pierce, Rockford, IL). Se analizaron aproximadamente 50 microgramos de proteína de cada lisado respecto a la presencia de Flt4 por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 6% e inmunotransferencia utilizando antisueros contra el término car-boxilo de Flt4. Las señales en las transferencias Western se revelaron utilizando el 5 método ECL (Amersham).

Para la producción de antisuero anti-Flt4, el fragmento de cDNA de Flt4 que co-dificaba los 40 residuos de aminoácidos carboxi-terminales de la forma corta: NH2-PMTPPTYKG SVDNQTDSGM VLASEEFEQI ESRHRQESGFR-COOH (SEQ ID NO: 8) se clonó como un fragmento EcoRI de 657 pb en el vector de expresión bacteriano 10 pGEX-1λT (Pharmacia-LKB, Inc., Uppsala, Suecia) en marco con la región codificante de la glutatión-S-transferasa. La proteína de fusión GST-Flt4s resultante se produjo en E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad utilizando una columna 4B de gluta-tión-Sepharose. La proteína purificada se liofilizó, se disolvió en solución salina tam-ponada con fosfato (PBS), se mezcló con adyuvante de Freund y se utilizó para 15 inmunización de conejos a intervalos bisemanales utilizando métodos estándar en la técnica (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)). Los antisueros se utilizaron, después de la cuarta inmunización de re-fuerzo, para inmunoprecipitación de Flt4 a partir de las células transfectadas. Se utili-zaron también clones de células que expresaban Flt4 para análisis de estimulación de 20 ligandos.

EJEMPLO 3

Construcción de un vector de baculovirus Flt4 EC

y expresión y purificación de su producto

La construcción de un vector de baculovirus con dominio extracelular (EC) de 25 Flt4 se representa esquemáticamente en Fig. 3. Se preparó el cDNA codificante de Flt4 en una forma larga y una forma corta, incorporándose cada una en un vector bajo control del promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney. La secuencia nucleotídica de la forma corta del receptor Flt4 está disponible de la base de datos de GenBank como No. de Acceso X68203 y el segmento 3' específico del cDNA de la 30 forma larga está disponible bajo el No. de Acceso a GenBank S66407.

Los extremos de un segmento de cDNA codificante del dominio extracelular (EC) de Flt4 se modificaron como sigue: el extremo 3' de la secuencia del dominio extrace-lular de cDNA de Flt4 (Número de Acceso a GenBank X68203) se amplificó utilizando el iniciador 1116 (5'- 35

CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'; SEQ ID NO: 9, sitio SalI subrayado) y el iniciador 1315 (5'-CGCGGATCCCTAGTGATGGTG-ATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCPC-3'; SEQ ID NO: 10, sitio BamHI subrayado). La secuencia en el extremo 5' del iniciador 1315 no es comple-mentaria a la región codificante de Flt4. La inspección de la secuencia que es com-5 plementaria a esta región del iniciador 1315 revela, en el orden de 5' a 3', un codón de parada, seis codones histidina contiguos (para purificación cromatográfica subsiguien-te del polipéptido codificado utilizando una columna Ni-NTA; Qiagen, Hilden, Alema-nia), y un sitio BamHI añadido. El fragmento amplificado se digirió con SalI y BamHI y se utilizó para reemplazar un fragmento único SalI-BamHI en el vector LTRFlt4 mos-10 trado en Fig. 3. El fragmento SalI-BamHI que se reemplazó codifica los dominios transmembranal y citoplásmico de Flt4. El resultado fue un vector LTRFlt4 modificado.

El extremo 5' sin la región codificante de la secuencia de señal de Flt4 se ampli-ficó por PCR utilizando el iniciador 1335 (5'-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3'; (SEQ ID NO: 11) el iniciador 15 contiene sitios de restricción añadidos HindIII (AAGCTT) y BamHI (GGATCC), que están subrayados). El segundo iniciador utilizado para amplificar la región codificante de la secuencia de señal Flt4 era el iniciador 1332 (5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'; SEQ ID NO: 12). El fragmento amplificado se digirió con HindIII y SphI (el sitio Hin-dIII (AAGCTT) está subrayado en el iniciador 1335 y el sitio SphI se encuentra dentro 20 de la región amplificada del cDNA de Flt4). El fragmento HindIII-SphI resultante se utilizó para reemplazar un fragmento HindIII-SphI en el vector LTRFlt4 modificado des-crito inmediatamente arriba (el sitio HindIII se encuentra en la unión 5' de la inserción de Flt4 con la porción pLTRpoli del vector, y el sitio SphI se encuentra en el cDNA de Flt4). La inserción Flt4EC resultante se ligó luego como un fragmento BamHI al sitio 25 BamHI en el plásmido pVTBac descrito en Tessier et al., Gene 98: 177-183 (1991), incorporado en esta memoria por referencia. La orientación relativa de la inserción se confirmó por secuenciación parcial de tal manera que el marco de lectura abierto de la porción codificante de la secuencia de señal del vector era adyacente a, y estaba en marco con, la secuencia de la región codificante de Flt4. La construcción Flt4EC se 30 transfectó junto con DNA genómico de baculovirus en células SF-9 por lipofección. El virus recombinante se purificó, amplificó y utilizó para infección de células High-Five (Invitrogen, San Diego, CA) utilizando métodos estándar en la técnica. El dominio ex-tracelular de Flt4 (Flt4EC) se purificó a partir del medio de cultivo de las células High-Five infectadas utilizando cromatografía de afinidad Ni-NTA de acuerdo con las ins-35

trucciones del fabricante (Qiagen) para fijación y elución de la etiqueta 6xHis codifica-da en el término COOH del dominio extracelular de Flt4 recombinante.

EJEMPLO 4

Aislamiento de un Ligando de Flt4 a partir

de Medio Acondicionado 5

Se aisló un ligando de Flt4 humano de acuerdo con la invención a partir de un medio acondicionado por una línea de células de adenocarcinoma prostático PC-3 (ATCC CRL 1435) en mezcla Nutriente F-12 de Ham (GIBCO) que contenía suero de ternero fetal (FCS) al 7%. Las células se dejaron crecer de acuerdo con las instruccio-nes del suministrador. Con objeto de preparar el medio acondicionado, se cultivaron 10 durante 7 días células PC-3 confluentes en mezcla Nutriente F-12 de Ham (GIBCO) en ausencia de suero de bovino fetal (FBS). Se aclaró luego el medio por centrifugación a 10.000 g durante 20 minutos. Se escrutó luego el medio para determinar su capacidad para inducir la fosforilación de la tirosina de Flt4 por exposición a células NIH 3T3 que se habían transfectado con cDNA codificante de Flt4 utilizando el vector pLTRFlt4l. 15 Para los experimentos de estimulación de receptores, células NIH 3T3 subconfluentes se mantuvieron privadas de alimento durante una noche en medio DMEM exento de suero (GIBCO) que contenía 0,2% de seroalbúmina bovina (BSA). Las células se es-timularon con el medio acondicionado durante 5 minutos, se lavaron dos veces con PBS fría que contenía vanadato 100 micromolar, y se lisaron en tampón RIPA (Tris 10 20 mM de pH 7,5, NaCl 50 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, Nonidet P40 al 0,5% (BDH, Poole, Inglaterra), SDS al 0,1%, 0,1 U/ml de Aprotinina (Boehringer Mannheim), vanadato 1 mM) para análisis de inmunoprecipitación de receptores. Los lisados se centrifugaron durante 20 minutos a 15000 x g. Los sobrenadantes se incubaron duran-te 2 horas en hielo con 3 microlitros del antisuero contra el término C de Flt4 descrito 25 en el Ejemplo 2. Véase también Pajusola et al., Oncogene, 8: 2931-2937 (1993), in-corporado por referencia en esta memoria.

Después de dos horas de incubación en presencia de antisuero anti-Flt4, se añadió proteína A-Sepharose (Pharmacia) y se continuó la incubación durante 45 mi-nutos con rotación. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con el tampón de 30 inmunoprecipitación y dos veces con Tris 10 mM, pH 7,5, antes del análisis por SDS-PAGE. Los polipéptidos se transfirieron a nitrocelulosa y se analizaron por transferen-cia Western utilizando antisueros específicos de Flt4 o de fosfotirosina y el método ECL (Amersham Corp.). Los anticuerpos monoclonales anti-fosfotirosina (anti-PTyr; PY20) se adquirieron de Transduction Laboratories (Lexington, Kentucky). En algunos 35

casos, los filtros se tiñeron de nuevo con un segundo anticuerpo después del despren-dimiento. El desprendimiento de los filtros se realizó durante 30 minutos a 50ºC en 2-mercaptoetanol 100 mM, SDS al 2%, Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,7, con agitación ocasio-nal.

Como se muestra en Fig. 4, el medio acondicionado de PC-3 (PC-3CM), estimu-5 laba la fosforilación de la tirosina de un polipéptido de 125 kD cuando células NIH 3T3 que expresaban Flt4 se trataron con las preparaciones indicadas de medio, se lisaron, y los lisados se inmunoprecipitaron con antisuero anti-Flt4 seguido por SDS-PAGE, transferencia Western, y tinción utilizando anticuerpos anti-PTyr. La banda resultante se fosforiló débilmente después de estimulación con medio acondicionado de PC-3 no 10 concentrado (pista 2). La banda de 125 kD migraba juntamente con la forma procesa-da de la Flt4 madura fosforilada en la tirosina a partir de las células tratadas con per-vanadato (compárese las pistas 2 y 7 de Fig. 4, y véase también la Fig. 5A). La comigración se confirmó después de nueva tinción con anticuerpos anti-Flt4 como se muestra también en Fig. 5A (panel de la derecha). A fin de demostrar que el polipépti-15 do de 125 kD no es un componente inespecífico del medio acondicionado reactivo con los anticuerpos anti-fosfotirosina, se separaron 15 microlitros de medio acondicionado por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia sobre nitrocelulosa, y la mancha se tiñó con anticuerpos anti-PTyr. No se obtuvo señal alguna (Fig. 5B). Asimismo, el medio no acondicionado no estimulaba la fosforilación de Flt4, como se muestra en Fig. 4, pista 20 1.

La Fig. 5C muestra una comparación de los efectos de la estimulación con PC-3 CM (+) sobre células NIH 3T3 no transfectadas (pistas 4 y 5), transfectadas con FGFR-4 (pistas 8 y 9) y transfectadas con Flt4 (pistas 1-3, 6 y 7). Estos resultados indican que ni las células NIH 3T3 no transfectadas ni las células NIH 3T3 transfecta-25 das con FGFR-4 exhibían fosforilación de la tirosina de una proteína de aproximada-mente 125 kD después de estimulación con el medio acondicionado de células PC-3. El análisis de la estimulación por PC-3 CM pretratado con Heparina-Sepharose CL-6B (Pharmacia) durante 2 horas a la temperatura ambiente (pista 3) demostró que el li-gando de Flt4 no se fija a la heparina. 30

Como se muestra en Fig. 4, pista 3, la actividad de estimulación se incrementaba considerablemente cuando el medio acondicionado de PC-3 se concentró 4 veces utilizando un concentrador Centricon-10 (Amicon). Fig. 4, pista 4, muestra que el pre-tratamiento del medio acondicionado PC-3 concentrado con 50 microlitros del dominio extracelular de Flt4 acoplado a Sepharose CL-4B activada con CNBr (Pharmacia; 35

aproximadamente 1 mg de dominio de Flt4EC/ml de resina Sepharose) anulaba por completo la fosforilación de la tirosina de Flt4. Un pretratamiento similar del medio acondicionado con Sepharose CL-4B no sustituida no afectaba a la actividad estimu-lante, como se muestra en Fig. 4, pista 5. Asimismo, el flujo directo obtenido después de concentración, que contenía proteínas de peso molecular menor que 10.000, no 5 estimulaba la fosforilación de Flt4, como se muestra en Fig. 4, pista 6.

En otro experimento, se realizó una comparación de la autofosforilación de Flt4 en células NIH 3T3 transformadas que expresaban LTRFlt4l, utilizando medio no acondicionado, medio procedente de células PC-3 que expresaban el ligando de Flt4, o medio no acondicionado que contenía 50 ng/ml de VEGF165 o 50 ng/ml de PlGF-1. 10 Las células se lisaron, se inmunoprecipitaron utilizando antisuero anti-Flt4 y se analiza-ron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina. Únicamente el medio acondicionado de PC-3 que expresaba el ligando de Flt4 (pista Flt-4L) estimula-ba la autofosforilación de Flt4.

Los datos que anteceden demuestran que las células PC-3 producen un ligando 15 que se fija al dominio extracelular de Flt4 y activa este receptor.

EJEMPLO 5

Purificación del ligando de Flt4

El ligando expresado por las células humanas PC-3 tal como se caracterizó en el Ejemplo 4, se purificó y se aisló utilizando un dominio extracelular de Flt4 producido 20 recombinantemente (Flt4EC) en cromatografía de afinidad.

Se recogieron dos cosechas de medio acondicionado exento de suero, que comprendían un total de 8 litros, a partir de 500 cápsulas de cultivo confluentes de 15 cm de diámetro que contenían capas confluentes de células PC-3. El medio acondi-cionado se clarificó por centrifugación a 10.000 x g y se concentró 80 veces utilizando 25 un Dispositivo de Flujo Tangencial Ultrasette (Filtron, Northborough, MA) con una membrana de Ultrafiltración Omega de corte a 10 kD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El dominio extracelular de Flt4 recombinante se expresó en un sistema recombinante de células de baculovirus y se purificó por cromatografía de afinidad sobre Ni-agarosa (columna de afinidad Ni-NTA obtenida de Qiagen). El dominio extra-30 celular purificado se acopló a Sepharose CL-4B activada con CNBr a una concentra-ción de 5 mg/ml y se utilizó como matriz de afinidad para cromatografía de afinidad de ligandos.

El medio acondicionado concentrado se incubó con 2 ml de la matriz de afinidad de Sepharose del dominio extracelular Flt4 recombinante en un tubo de balanceo a la 35

temperatura ambiente durante 3 horas. Todos los pasos de purificación subsiguientes se realizaron a +4ºC. La matriz de afinidad se transfirió luego a una columna con un diámetro interior de 15 mm y se lavó sucesivamente con 100 ml de PBS y 50 ml de tampón de fosfato de Na 10 mM (pH 6,8). El material fijado se eluyó gradualmente con glicina-HCl 100 mM, con eluciones sucesivas de 6 ml que tenían valores de pH de 4,0, 5 2,4, y 1,9. Se recogieron varias fracciones de 2 ml del material eluido en tubos que contenían 0,5 ml de fosfato de Na 1M (pH 8,0). Las fracciones se mezclaron inmedia-tamente y se dializaron en Tris-HCl 1 mM (pH 7,5). Se analizaron partes alícuotas de 75 µl cada una respecto a su capacidad para estimular la fosforilación de la tirosina de Flt4. El ultrafiltrado, partes alícuotas de 100 µl del medio acondicionado concentrado 10 antes y después de la cromatografía de afinidad de ligandos, así como fracciones con-centradas 15 veces de material liberado de la matriz de Sepharose del dominio extra-celular de Flt4 durante los lavados se analizaron también respecto a su capacidad para estimular la fosforilación de la tirosina de Flt4.

Como se muestra en Fig. 6, pista 3, el medio acondicionado concentrado inducía 15 una fosforilación notable de la tirosina de Flt4 en las células NIH 3T3 transfectadas que sobreexpresaban Flt4. Esta actividad no se observaba en medio acondicionado tomado después de la exposición del medio a la matriz de afinidad de Sepharose de Flt4 arriba descrita (Fig. 6, pista 4). El material estimulante de Flt4 fijado específica-mente se retuvo en la matriz de afinidad después del lavado en PBS, tampón de fosfa-20 to de Na 10 mM (pH 6,8), y a pH 4,0 (Fig. 6, pistas 5-7, respectivamente), y se eluyó en las dos primeras partes alícuotas de 2 ml a pH 2,4 (pistas 8 y 9). Una disminución ulterior del pH del tampón de elución no causaba la liberación de material estimulante de Flt4 adicional (Fig. 6, pista 11). La Fig. 6, pista 1, representa un control en el cual se trataron células que expresaban de Flt4 con medio no acondicionado; la pista 2 repre-25 senta los resultados después del tratamiento de las células que expresaban de Flt4 con la fracción de ultrafiltrado de medio acondicionado que contenía polipéptidos de peso molecular menor que 10 kD.

Pequeñas partes alícuotas de las fracciones cromatográficas se concentraron en un concentrador SpeedVac (Savant, Farmingdale, N.Y.) y se sometieron a SDS-PAGE 30 en condiciones reductoras con tinción subsiguiente del gel con plata, un método estándar en la técnica. Como se muestra en Fig. 7, el polipéptido principal, que tenía un peso molecular de aproximadamente 23 kD (condiciones reductoras), se detectó en las fracciones que contenían actividad estimulante de Flt4 (correspondientes a las pis-tas 8 y 9 en Fig. 6). Dicho polipéptido no se encontraba en las otras fracciones croma-35

tográficas. Por otra parte, además de estas bandas y de una banda muy tenue que tenía una movilidad de 32 kD, todos los restantes componentes detectados en las dos fracciones activas se distribuían también en el material de partida y en pequeñas can-tidades en los otros pasos de lavado y elución después de su concentración. Se obtu-vieron resultados similares en 3 purificaciones por afinidad independientes, lo que 5 indicaba que el polipéptido de 23 kD se fija específicamente a Flt4 e induce la fosfori-lación de la tirosina de Flt4.

Las fracciones que contenían el polipéptido de 23 kD se combinaron, se secaron en un concentrador SpeedVac y se sometieron a SDS-PAGE en un gel al 12,5%. Las proteínas procedentes del gel se pasaron luego por electrotransferencia a una mem-10 brana de transferencia Immobilon-P (PVDF) (Millipore, Marlborough, MA) y se visuali-zaron por tinción de la transferencia con Azul Coomassie R-250. La región que contenía únicamente la banda teñida de 23 kD se cortó de la transferencia y se some-tió a análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal en un Sistema de Secuencia-ción de Proteínas Prosite (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos se 15 analizaron utilizando un Sistema de Análisis de Datos 610A (Applied Biosystems). El análisis reveló una sola secuencia N-terminal de NH2-XEETIKFAAAHYNTEILK-COOH (SEQ ID NO: 13).

EJEMPLO 6

Construcción de una genoteca de cDNA de células PC-3 en un vector de expre-20 sión eucariota

Se aisló RNA poli(A)+ humano a partir de 5 cápsulas de 15 cm de diámetro de células PC-3 confluentes por un método de un solo paso utilizando cromatografía de afinidad de oligo(dT)-celulosa (Tipo III, Collaborative Biomedical Products, Becton-Dickinson Labware Bedford, MA) (Sambrook et al., 1989). El rendimiento fue 70 micro-25 gramos. Se utilizaron 6 microgramos del RNA poli(A)+ para preparar una genoteca de cDNA cebada con oligo(dT) en el vector de expresión de mamífero pcDNA I y el kit Librarian de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones incluidas en el kit. Se estimó que la genoteca contenía aproximadamente 106 recombinantes independientes con un tamaño medio de inserción de aproximadamente 1,8 kb. 30

EJEMPLO 7

Amplificación de una secuencia única de oligonucleótidos codificante del térmi-no amino del ligando de Flt4

Se diseñaron oligonucleótidos degenerados basados en la secuencia de ami-noácidos N-terminal del ligando de Flt4 humano aislado y se utilizaron como iniciado-35

res en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar el cDNA codifi-cante del ligando de Flt4 a partir de la genoteca de cDNA de PC-3. La estrategia global descrita en los Ejemplos 7 y 8 se representa esquemáticamente en Fig. 9, donde se han marcado con flechas los diferentes iniciadores.

La PCR se llevó a cabo utilizando 1 microgramo de DNA a partir de la genoteca 5 de cDNA de PC-3 amplificada y una mezcla de 48 iniciadores de la cadena de sentido presentes en iguales proporciones, comprendiendo colectivamente las secuencias iniciadoras la secuencia 5'-GCAGARGARACNATHAA-3' (SEQ ID NO: 14) (en la cual R es A o G, N es A, G, C o T y H es A, C o T), codificante de los residuos de aminoá-cidos 2-6 (EETIK, SEQ ID NO: 15) y 384 iniciadores de la cadena antisentido presen-10 tes en iguales proporciones, comprendiendo colectivamente los iniciadores de la cadena anti-sentido la secuencia 5'-GCAYTTNARDATYTCNGT-3' (SEQ ID NO: 16) (en la cual Y es C o T y D es A, G o T), correspondientes a los residuos de aminoáci-dos 14-18 (TEILK, SEQ ID NO: 17). Se añadieron 3 nucleótidos adicionales (GCA) al término 5' de cada iniciador para aumentar la estabilidad de reasociación. Se llevaron 15 a cabo 2 operaciones PCR sucesivas utilizando 1 U por reacción de DynaZyme (F-500L; Finnzymes, Espoo, Finlandia), una DNA-polimerasa termoestable, en un tampón suministrado por el fabricante (Tris-HCl 10 mM, pH 8,8 25ºC, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, Triton-X100 al 0,1%), a una temperatura de extensión de 72ºC. La primera opera-ción PCR se llevó a cabo durante 43 ciclos. Los 3 primeros ciclos se realizaron a una 20 temperatura de reasociación de 33ºC durante 2 minutos, y los ciclos restantes se reali-zaron a 42ºC durante 1 minuto.

La región del gel que contenía una banda débil del tamaño esperado (57 pb) se cortó del gel y se eluyó. El material eluido se reamplificó durante 30 ciclos utilizando los mismos pares de iniciadores arriba descritos a 42ºC durante 1 minuto. El fragmen-25 to amplificado se clonó a un vector pCR II (Invitrogen) utilizando el kit de clonación TA (Invitrogen) y se secuenció utilizando el método radiactivo de secuenciación de de-soxinucleótidos de Sanger. Se analizaron 6 clones y todos ellos contenían la secuen-cia codificante del péptido esperado (residuos de aminoácidos 104-120 del precursor del ligando de Flt4). La secuencia de nucleótidos que abarcaba la región desde el ter-30 cer nucleótido del codón 6 al tercer nucleótido del codón 13 (la región de extensión) era idéntica en la totalidad de los 6 clones: 5'-ATTCGCTGCAGCACACTACAAC-3' (SEQ ID NO: 18) y representaba por tanto un producto amplificado de la parte codifi-cante de la secuencia única del término amino del ligando de Flt4.

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EJEMPLO 8

Amplificación del extremo 5' del cDNA codificante

del ligando de Flt4

Sobre la base de la secuencia de nucleótidos única codificante del término N del ligando de Flt4 humano aislado, se diseñaron dos pares de iniciadores anidados para 5 amplificar, en dos reacciones PCR anidadas, el extremo 5' completo de los cDNAs correspondientes a partir de 1 microgramo de DNA de la genoteca de cDNA de PC-3 arriba descrita. En primer lugar, la amplificación se realizó con una mezcla igual de 4 iniciadores que definían colectivamente la secuencia 5'-TCNGTGTTGTAGTGTGCTG-3' (SEQ ID NO: 19), que es el iniciador de la cadena antisentido correspondiente a los 10 residuos de aminoácidos 9-15 (AAHYNTE, SEQ ID NO: 20), y el iniciador de la cadena de sentido 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 21), correspondiente al promotor de RNA T7 del vector pcDNAI utilizado para la construcción de la genoteca. Se utilizó PCR "touchdown" como se describe en Don et al., Nucl. Acids Res., 19: 4008 (1991), incorporado por referencia en esta memoria. La temperatura de reaso-15 ciación de los dos primeros ciclos era 62ºC y subsiguientemente la temperatura de reasociación se redujo en 1ºC cada dos ciclos subsiguientes hasta que se alcanzó una temperatura final de 53ºC, a cuya temperatura se realizaron 16 ciclos adicionales. El tiempo de reasociación era de 1 minuto y la extensión en cada ciclo se condujo a 72ºC durante 1 minuto. Se obtuvieron en la primera reacción fragmentos de DNA amplifica-20 dos múltiples. Los productos de la primera amplificación (1 µl de una dilución 1:100 en agua) se utilizaron en la segunda reacción de amplificación empleando un par de ini-ciadores anidados que comprendían un iniciador de la cadena antisentido 5'-GTTGTAGTGTGCTGCAGCGAATTT-3'; (SEQ ID NO: 22) que codificaba los residuos de aminoácidos 6-13 (KFAAAHYN, SEQ ID NO: 23) del ligando de Flt4, y un iniciador 25 de la cadena de sentido (5'-TCACTATAGGGAGACCCAAGC-3'; SEQ ID NO: 24), co-rrespondiente a los nucleótidos 2179-2199 del vector pcDNAI. Las secuencias de es-tos iniciadores de sentido y antisentido se solapaban con los extremos 3' de los iniciadores correspondientes utilizados en la primera PCR. Se llevó a cabo la PCR "touchdown" por disminución de la temperatura de reasociación desde 72ºC a 66ºC y 30 continuando con 18 ciclos adicionales a 66ºC. El tiempo de reasociación era de 1 mi-nuto y la extensión en cada ciclo se llevó a cabo a 72ºC durante 2 minutos. Se obtuvie-ron un producto principal de aproximadamente 220 pb y tres productos menores de aproximadamente 270 pb, 150 pb y 100 pb.

imagen1

El fragmento amplificado de aproximadamente 220 pb se cortó de un gel de agaro-sa, se clonó en un vector pCRII utilizando el kit de clonación TA (Invitrogen), y se secuen-ció. Se analizaron 3 clones recombinantes y los mismos contenían la secuencia 5'-

5

ID NO: 25). El comienzo de la secuencia representa el vector pcDNAI y la secuencia subrayada representa el producto amplificado del extremo 5' de la inserción de cDNA.

10

EJEMPLO 9

Amplificación del extremo 3' de cDNA codificante

del ligando de Flt4

Sobre la base de la secuencia 5' amplificada de los clones codificantes del término amino del ligando de Flt4 humano de 23 kD, se diseñaron dos pares de inicia-15 dores anidados no solapantes para amplificar la porción 3' de los clones de cDNA co-dificantes del ligando de Flt4. El iniciador de la cadena de sentido 5'-ACAGAGAACAGGCCAACC-3' (SEQ ID NO: 26), correspondiente a los nucleótidos 152-169 de las secuencias 5' amplificadas del ligando de Flt4 (SEQ ID NO: 25), y el iniciador de la cadena antisentido 5'-TCTAGCATTTAGGTGACAC-3' (SEQ ID NO: 27) 20 correspondiente a los nucleótidos 2311-2329 del vector pcDNAI se utilizaron en una primera PCR "touchdown". La temperatura de reasociación de la reacción se redujo en 1ºC cada dos ciclos desde 72ºC a 52ºC, a cuya temperatura se realizaron 15 ciclos adicionales. El tiempo de reasociación era de 1 minuto y la extensión en cada ciclo se llevó a cabo a 72ºC durante 3 minutos. En la primera amplificación se obtuvieron frag-25 mentos de DNA de varios tamaños. Dichos productos se diluyeron en agua en relación 1:200 y se reamplificaron en PCR utilizando el segundo par de iniciadores: 5'-AAGAGACTATAAAATTCGCTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 28) y 5'-CCCTCTAGATGCATGCTCGA-3' (SEQ ID NO: 29) (iniciador de la cadena antisentido correspondiente a los nucleótidos 2279-2298 del vector pcDNAI). Se obtuvieron dos 30 fragmentos de DNA, que tenían tamaños de 1350 pb y 570 pb. Dichos fragmentos se clonaron en un vector pCRII y se secuenciaron las inserciones de los clones. Se en-contró que ambos fragmentos contenían secuencias que codificaban una secuencia de aminoácidos homóloga a la secuencia de VEGF.

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EJEMPLO 10

Escrutinio de la genoteca de cDNA de células PC-3 utilizando el fragmento 5' PCR de cDNA del ligando de Flt4

Un fragmento 5'-terminal de 219 pb de cDNA del ligando de Flt4 humano se am-plificó por PCR utilizando el fragmento 5' PCR arriba descrito y los iniciadores 5'-5 GTTGTAGTGTGCTGCAGCGAATTT-3' (iniciador de la cadena antisentido, SEQ ID NO: 30) y 5'-TCACTATAGGGAGACCCAAGC-3' (SEQ ID NO: 31) (iniciador de sentido correspondiente a los nucleótidos 2179-2199 del vector pcDNAI). El producto amplifi-cado se sometió a digestión con EcoRI (Boehringer-Mannheim) para eliminar la por-ción de la secuencia de DNA amplificada del vector pcDNAI, y el fragmento de 153 pb 10 resultante que codificaba el extremo 5' del ligando de Flt4 se marcó con [32P]-dCTP utilizando el fragmento Klenow de DNA polimerasa I de E. coli (Boehringer-Mannheim). Dicho fragmento se utilizó como sonda para escrutinio por hibridación de la genoteca de cDNA de células PC-3 amplificada.

Réplicas en filtro de la genoteca se hibridaron con la sonda marcada radiactiva-15 mente a 42ºC durante 20 horas en una solución que contenía 50% de formamida, 5x SSPE, 5x solución de Denhardt, 0,1% de SDS y 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se lavaron dos veces en 1x SSC, 0,1% SDS duran-te 30 minutos a la temperatura ambiente, a continuación dos veces durante 30 minutos a 65ºC y se dejaron expuestos durante una noche. 20

Sobre la base de autorradiografía, se seleccionaron de la genoteca 10 colonias bacterianas recombinantes positivas que se hibridaban con la sonda. El DNA plasmí-dico se purificó a partir de estas colonias y se analizó por digestión con EcoRI y NotI y electroforesis en gel de agarosa seguido por tinción con bromuro de etidio. Los diez clones plasmídicos se dividieron en 3 grupos sobre la base de la presencia de tama-25 ños de inserción de aproximadamente 1,7, 1,9 y 2,1 kb, respectivamente. Las inser-ciones de plásmidos de cada grupo se secuenciaron utilizando el oligonucleótido T7 como iniciador e iniciadores de recorrido para las reacciones de secuenciación subsi-guientes.

El análisis de la secuencia demostró que todos los clones contenían el marco de 30 lectura abierto que codificaba la secuencia NH2-terminal del ligando de Flt4 humano de 23 kD. Se continuó la secuenciación didesoxi utilizando iniciadores de recorrido en la dirección aguas abajo. Una secuencia de cDNA humano completa y la secuencia de aminoácidos deducida de un clon de 2 kb se expone en SEQ ID NOs: 32 y 33, respec-tivamente. Un sitio de escisión supuesto de una secuencia conductora "prepro" está 35

localizado entre los residuos 102 y 103 de SEQ ID NO: 33. Cuando se compara con las secuencias en la Base de Datos GenBank, se encontró que el producto proteínico predicho de este marco de lectura era homólogo con las secuencias de aminoácidos predichas de la familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento, como se muestra en Fig. 10. 5

El plásmido pFLT4-L, que contiene el clon de cDNA humano de 2,1 kb en el vec-tor pcDNAI, ha sido depositado con la American Type Culture Collection, 12301 Par-klawn Drive, Rockville, MD 20752 como número de acceso 97231.

EJEMPLO 11

Estimulación de la autofosforilación de Flt4 por el producto proteínico del vector 10 del ligando de Flt4

La inserción de cDNA humano de 2,1 kb del plásmido pFlt4-L, que contiene el marco de lectura abierto que codifica la secuencia que se muestra en SEQ ID NOs: 32 y 33; VEGF-C humana, véase más adelante), se cortó del vector pcDNAI utilizando las enzimas de restricción HindIII y NotI, se aisló a partir de un gel de agarosa preparati-15 vo, y se ligó a los sitios correspondientes en el vector de expresión pREP7 (Invitro-gen). El vector pREP7 que contenía la inserción de pFlt4-L se transfectó a células 293-EBNA (Invitrogen) utilizando el método de transfección con fosfato de calcio (Sambro-ok et al., 1989). Aproximadamente 48 horas después de la transfección, el medio de las células transfectadas se cambió a medio DMEM que carecía de suero de ternero 20 fetal y se incubó durante 36 h. Se recogió luego el medio acondicionado, se centrifugó a 5000 x g durante 20 minutos, se concentró 5 veces el sobrenadante utilizando Cen-triprep 10 (Amicon) y se utilizó para estimular células NIH 3T3 que expresaban LTRFlt4l (el receptor Flt4), como en el Ejemplo 4. Las células se lisaron, se inmuno-precipitaron utilizando antisuero anti-Flt4 y se analizaron por transferencia Western 25 utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina.

El medio acondicionado de dos cápsulas diferentes de las células transfectadas estimulaba la autofosforilación de Flt4 en comparación con el medio de células trans-fectadas falsamente, que daban únicamente niveles de ruido de fosforilación del re-ceptor Flt4. Cuando el medio concentrado acondicionado se pre-absorbió con 20 30 microlitros de una suspensión del dominio Flt4EC acoplado a Sepharose (véase Ejem-plo 4), no se obtuvo fosforilación alguna, lo que demostraba que la actividad respon-sable para la autofosforilación de Flt4 era de hecho el ligando de Flt4. Así pues, estos resultados demuestran que un vector de expresión que tiene una inserción de aproxi-madamente 2,1 kb y que contiene un marco de lectura abierto como se muestra en 35

SEQ ID NO: 32 se expresa como un ligando de Flt4 biológicamente activo (VEGF-C) en células transfectadas. La secuencia codificada por dicho marco de lectura abierto se muestra en SEQ ID NO: 33.

El peso molecular deducido de un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos completa en SEQ ID NO: 33 (residuos 1 a 419) es 46.883. El peso mole-5 cular deducido de un polipéptido constituido por los residuos de aminoácidos 103 a 419 de SEQ ID NO: 33 es 35.881. El ligando de Flt4 purificado a partir de cultivos de PC-3 tenía un peso molecular observado de aproximadamente 23 kD como se deter-minó por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Así pues, parece ser que el mRNA del ligando de Flt4 se traduce en un polipéptido precursor, del cual se deriva el ligando 10 maduro por escisión proteolítica. Asimismo, el ligando de Flt4 puede glicosilarse en 3 sitios de glicosilación supuestos enlazados a N conforme al consenso que pueden identificarse en la secuencia de aminoácidos deducida del ligando de Flt4 (con los re-siduos N subrayados en Fig. 10).

Las secuencias de aminoácidos del terminal carboxilo, que aumentan el peso 15 molecular predicho de la subunidad del ligando de Flt4 en comparación con otros li-gandos de esta familia, muestran un patrón de separación de los residuos cisteína reminiscente de la secuencia de la proteína Balbiani ring 3 (BR3P) (Dignam et al., Ge-ne, 88: 133-140 (1990)), como se representa esquemáticamente en Fig. 9. Dicha se-cuencia puede codificar un dominio plegado independientemente presente en un 20 precursor del ligando de Flt4 y puede estar implicada, por ejemplo, en la regulación de la secreción, solubilidad, estabilidad, localización en la superficie celular o actividad del ligando de Flt4. Es interesante que al menos un motivo cisteína del tipo BR3P se en-cuentra también en la secuencia de aminoácidos del terminal carboxi de VEGF.

Así, el mRNA del ligando de Flt4 parece traducirse primeramente en un precur-25 sor del mRNA correspondiente a la inserción de cDNA del plásmido FLT4-L, a partir del cual se deriva el ligando maduro por escisión proteolítica. Para definir el polipéptido del ligando de Flt4 maduro, se expresa primeramente el clon de cDNA (que está depo-sitado en el vector de expresión pcDNAI) en células, tales como células COS. Se utili-zan anticuerpos generados contra los polipéptidos codificados, fragmentos de los 30 mismos, o proteínas de fusión bacteriana de Flt4, tales como una proteína de fusión GST, para generar los anticuerpos contra el dominio homólogo de VEGF y los propép-tidos amino- y carboxil-terminales del ligando de Flt4. Se sigue luego la biosíntesis y el procesamiento del ligando de Flt4 en las células transfectadas por análisis de pulso-caza utilizando cisteína radiactiva para marcación de las células, inmunoprecipitación y 35

electroforesis en gel. Utilizando anticuerpos contra los 3 dominios del producto codifi-cado por la inserción de cDNA del plásmido Flt4-L, se aísla material para análisis de la secuencia amino-terminal radiactiva o no radiactiva. La determinación de la secuencia amino-terminal del polipéptido VEGF-C maduro permite la identificación del sitio de procesamiento proteolítico amino-terminal. La determinación de la secuencia amino-5 terminal del propéptido del terminal carboxilo proporcionará el sitio de procesamiento del terminal carboxilo. Esto se confirma por mutagénesis orientada de los residuos de aminoácidos adyacentes a los sitios de escisión, lo que podría prevenir la escisión.

El ligando de Flt4 puede caracterizarse ulteriormente por deleciones 3' progresi-vas en las secuencias codificantes 3' del clon precursor del ligando de Flt4, introdu-10 ciendo un codón de parada que da como resultado truncaciones en el terminal carboxi de su producto proteínico. Las actividades de dichas formas truncadas se ensayan, por ejemplo, por estudio de la autofosforilación de Flt4 inducida por las proteínas trun-cadas cuando se aplica a cultivos de células, tales como células NIH 3T3 que expre-san LTRFlt4. Por extrapolación de estudios de la estructura del factor de crecimiento 15 afín derivado de las plaquetas (PDGF, Heldin et al., Grotsh Factors, 8: 245-252 (1993)) se determina que la región crítica para la activación de receptor por el ligando de Flt4 está contenida dentro de los aproximadamente 180 primeros residuos de aminoácidos de la proteína secretada VEGF-C que carecen del conductor prepro de 102 aminoáci-dos supuesto (SEQ ID NO: 33, residuos 103-282), y aparentemente dentro de los 20 aproximadamente 120 primeros residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 33, residuos 103-223).

Por otra parte, la diferencia entre los pesos moleculares observados para el li-gando purificado y deducidos del marco de lectura abierto del clon del ligando de Flt4 puede ser debida al hecho de que el ligando soluble se produjo a partir de un mRNA 25 sometido alternativamente a corte y empalme que podría estar presente también en las células PC-3, de las que se derivaba el ligando aislado. Para aislar dichos clones de cDNA alternativos se utilizan fragmentos de cDNA del clon depositado e iniciadores PCR construidos de acuerdo con la secuencia proporcionada así como métodos estándar en la técnica para aislar o amplificar cDNAs alternativos a partir de la genote-30 ca de cDNA de células PC-3. Puede realizarse también la amplificación utilizando PCR de transcripción inversa (RT) directamente a partir del mRNA de PC-3 utilizando los iniciadores proporcionados en la secuencia de la inserción de cDNA del plásmido FLT4-L. Secuencias de cDNA alternativas se determinan a partir de los clones de cDNA resultantes. Pueden aislarse también clones genómicos correspondientes al 35

transcrito de mRNA del ligando de Flt4 a partir de una genoteca de DNA genómico humano utilizando métodos estándar en la técnica y secuenciar dichos clones o sus fragmentos subclonados para revelar los exones correspondientes. Pueden identificar-se luego exones alternativos por numerosos métodos estándar en la técnica, tales como el análisis de heterodúplex de cDNA y DNA genómico, que se caracterizan sub-5 siguientemente.

EJEMPLO 12

Expresión del Gen que Codifica VEGF-C en

Líneas de Células de Tumores Humanos

La expresión de transcritos correspondientes al ligando de Flt4 (VEGF-C) se 10 analizó por hibridación de transferencias Northern que contenían RNA poli(A)+ aislado a partir de líneas de células de tumores humanos HT-1080 y PC-3. La sonda era la inserción marcada radiactivamente del clon de cDNA de 2,1 kb (pFlt4-L/VEGF-C, acti-vidad específica de 108-109 cpm/mg de DNA). La transferencia se hibridó durante una noche a 42ºC utilizando 50% formamida, tampón 5x SSPE, 2% SDS, 10x solución de 15 Denhardt, 100 mg/ml de DNA de esperma de salmón y 1 x 106 cpm de la sonda mar-cada/ml. La transferencia se lavó a la temperatura ambiente durante 2 x 30 minutos en 2x SSC que contenía 0,05% de SDS, y luego durante 2 x 20 minutos a 52ºC en 0,1x SSC que contenía 0,1% de SDS. La transferencia se expuso luego a -70ºC durante 3 días utilizando escrutinios intensificadores y película Kodak XAR. Ambas líneas de 20 células expresaban un mRNA del ligando de Flt4 de aproximadamente 2,4 kb, así co-mo mRNAs de VEGF y VEGF-B (Fig. 12).

EJEMPLO 13

Las Cadenas de VEGF-C se Procesan Proteolíticamente

después de la Biosíntesis y se Enlazan con Disulfuro 25

La masa molecular predicha de un polipéptido de VEGF-C humana secretado, tal como se deduce del marco de lectura abierto de VEGF-C, es 46.883 kD, lo que sugie-re que el mRNA de VEGF-C puede traducirse primeramente en un precursor, del cual se derivan los ligandos de 21/23 kD y 29/32 kD por escisión proteolítica.

Esta posibilidad se exploró por marcación metabólica de células 293 EBNA que 30 expresaban VEGF-C. Inicialmente, las células 293 EBNA se transfectaron con la cons-trucción de VEGF-C. Los productos de expresión se marcaron por la adición de 100 µCi/ml de mezcla de marcación de células Pro-Mix™ L-[35S] in vitro ((que contenía 35S-metionina y 35S-cisteína) Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) al medio de cultivo desprovisto de cisteína y metionina. Después de 2 horas, las capas de células se lava-35

ron dos veces con PBS y el medio se reemplazó luego con DMEM-0,2% BSA. Des-pués de 1, 3, 6, 12 y 24 horas de incubación subsiguiente, el medio de cultivo se reco-gió, se clarificó por centrifugación, y se concentró, y la VEGF-C humana se unió a 30 µl de una suspensión de Flt4EC-Sepharose durante una noche a +4ºC, seguido por 3 lavados en PBS, 2 lavados en Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), alquilación, SDS-PAGE y au-5 torradiografía. La alquilación se llevó a cabo por tratamiento de las muestras con 1,4-ditiotreitol 10 mM (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania) durante una hora a 25ºC, y subsiguientemente con yodoacetamida 30 mM (Fluka, Buchs, Suiza).

Estos experimentos demostraron que un polipéptido precursor supuesto de masa molecular aparente 32 kD estaba unido a la matriz de afinidad de Flt4EC del medio 10 acondicionado de células marcadas metabólicamente transfectadas con el vector de expresión de VEGF-C humana (Fig. 13A), pero no de las células transfectadas falsa-mente (M). Cantidades incrementadas de un polipéptido de fijación al receptor de 23 kD se acumulaban en el medio de cultivo de las células transfectadas con VEGF-C durante un período de caza subsiguiente de 3 horas, pero no después de ello (pistas 15 2-4 y datos no presentados), lo que sugiere que la forma de 23 kD se produce por pro-cesamiento proteolítico, que es incompleto, al menos en las células transfectadas transitoriamente. Las flechas en Fig. 13A indican los polipéptidos de 32 kD y 23 kD de VEGF-C secretada. Experimentos subsiguientes demostraron que la forma de VEGF-C de 32 kD contiene 2 componentes que migran en ausencia de alquilación como po-20 lipéptidos de 29 y 32 kD (Figs. 21-23).

En un experimento afín, la VEGF-C humana aislada utilizando Flt4EC-Sepharose después de una marcación metabólica continua durante 4 h se analizó por electrofore-sis en gel de poliacrilamida en condiciones no reductoras (Fig. 13B). Se observaron formas de masa molecular más alta en condiciones no reductoras, lo que sugiere que 25 los polipéptidos de VEGF-C pueden formar dímeros y/o multímeros enlazados con disulfuro (flechas en Fig. 13B).

EJEMPLO 14

Estimulación de la Autofosforilación de VEGFR-2 por VEGF-C

El medio acondicionado (CM) de células 223 EBNA transfectadas con el vector 30 de VEGF-C humana se utilizó también para estimular células endoteliales aórticas de porcino (PAE) que expresaban VEGFR-2 (Kdr). Pajusola et al., Oncogene, 9: 3545-55 (1994); Waltenberger et al., J. Biol. Chem., 269: 26988-26995 (1994). Las células se lisaron y se inmunoprecipitaron utilizando antisuero específico de VEGFR-2 (Walten-berger et al., 1994). 35

Las células PAE-KDR (Waltenberger et al., 1994), se cultivaron en medio F12 de Ham-10% suero de ternero fetal (FCS). Las células NIH 3T3-Flt4 confluentes o células PAE-KDR se privaron de alimento durante una noche en DMEM o medio F12 de Ham, respectivamente, complementado con seroalbúmina bovina (BSA) al 0,2%, y se incu-baron luego durante 5 minutos con los medios analizados. Se utilizaron como contro-5 les VEGF humana recombinante (R&C Systems) y PDGF-BB, funcionales como agentes estimulantes. Las células se lavaron dos veces con Solución Salina Tampo-nada con Tris (TBS) enfriada en hielo, que contenía ortovanadato de sodio 100 mM y se lisaron en tampón RIPA que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 0,1 U/ml de aprotinina y ortovanadato de sodio 1 mM. Los lisados se trataron por ultra-10 sonidos, se clarificaron por centrifugación a 16.000 x g durante 20 minutos y se incu-baron durante 3-6 horas en hielo con 3-5 µl de antisueros específicos para Flt4 (Pajusola et al., 1993), VEGFR-2 o PDGFR-β (Claesson-Welsh et al., J. Biol. Chem., 264: 1742-1747 (1989); Waltenberger et al., 1994). Los inmunoprecipitados se unieron a proteína A-Sepharose, se lavaron 3 veces con tampón RIPA que contenía PMSF 1 15 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, se lavaron 2 veces con Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), y se sometieron a SDS-PAGE utilizando un gel al 7%. Los polipéptidos se transfirieron a nitrocelulosa por transferencia Western y se analizaron utilizando anticuerpos mono-clonales específicos de fosfotirosina PY20 (Transduction Laboratories) o antisuero específico del receptor y el método de detección ECL (Amersham Corp.). 20

Los resultados del experimento se presentan en Figs. 14A y 14B. Como se muestra en Fig. 14A, las células PAE que expresaban VEGFR-2 se estimularon con medio concentrado 10 ó 2 veces a partir de las células 293-EBNA transfectadas fal-samente (pistas 1 y 2), o con medio concentrado 2, 5 ó 10 veces a partir de los cultivos de células 293-EBNA que expresaban la VEGF-C recombinante (pistas 3-6). Se inmu-25 noprecipitó VEGFR-2 con anticuerpos específicos y se analizó por SDS-PAGE y trans-ferencia Western utilizando anticuerpos de fosfotirosina. Para comparación, las estimulaciones se llevaron a cabo con medio no acondicionado que contenía 50 ng/ml de VEGF purificada recombinante (pistas 7 y 8). Las pistas 6 y 7 muestran la estimula-ción con medios que contenían VEGF-C o VEGF, pretratados con Flt4EC. Como se 30 representa en Fig. 14B, las células NIH 3T3 que expresaban PDGFR-β se estimulaban con medio no acondicionado (pista 1), CM concentrado 5 veces a partir de células transfectadas falsamente (pista 2) o transfectadas con VEGF-C (pistas 3 y 4), o con medio no acondicionado que contenía 50 ng/ml de PDGF-BB humana recombinante (pista 5). El medio que contenía VEGF-C se pretrató también con Flt4EC recombinante 35

(pista 4). Se inmunoprecipitó PDGFR-β con anticuerpos específicos y se analizó por SDS-PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpos de fosfotirosina con des-prendimiento y re-exploración subsiguiente de la membrana con anticuerpos específi-cos para PDGFR-β.

Haciendo referencia nuevamente a Fig. 14A, se detectó un nivel basal de fosfori-5 lación de la tirosina de VEGFR-2 en células estimuladas por CM a partir de las células falsamente transfectadas. Una concentración adicional de este medio dio como resul-tado solamente un ligero aumento de la fosforilación de VEGFR-2 (pistas 1 y 2). CM que contenía VEGF-C recombinante estimulaba la autofosforilación de la tirosina de VEGFR-2 y la intensidad de la banda polipeptídica autofosforilada se incrementaba 10 después de concentración del CM de VEGF-C (pistas 3-5). Adicionalmente, el efecto de estimulación se anulaba después de pretratamiento del medio con la matriz de afi-nidad de Flt4EC (compárense las pistas 1, 5 y 6). El efecto máximo de VEGF-C en este ensayo era comparable al efecto de VEGF recombinante añadida a medio no acondicionado a una concentración de 50 ng/ml (pista 8). El pretratamiento del medio 15 que contenía VEGF con Flt4EC no anulaba su efecto estimulante sobre VEGFR-2 (compárense las pistas 7 y 8). Estos resultados sugieren que el vector de expresión de VEGF-C codifica un ligando no sólo para Flt4 (VEGFR-3), sino también para VEGFR-2 (Kdr).

Para confirmar ulteriormente que el efecto de estimulación de VEGF-C sobre la 20 fosforilación de la tirosina de VEGFR-3 y VEGFR-2 era específico del receptor, se ana-lizó el efecto de VEGF-C sobre la fosforilación de la tirosina del receptor β de PDGF (PDGFR-β) que se expresa abundantemente en las células fibroblásticas. Como se puede ver por la Fig. 14B, se detectó una fosforilación débil de la tirosina de PDGFR-β por estimulación de células NIH 3T3 que expresaban Flt4 con CM procedente de las 25 células transfectadas falsamente (compárense las pistas 1 y 2). Un nivel bajo similar de fosforilación de PDGFR-β se observó cuando las células se incubaron con CM pro-cedente de las células transfectadas con VEGF-C, con o sin tratamiento previo con Flt4EC (pistas 3 y 4). En contraste, la adición de 50 ng/ml de PDGF-BB inducía una autofosforilación prominente de la tirosina de PDGFR-β (pista 5). 30

EJEMPLO 15

VEGF-C Estimula la Migración de las Células

Endoteliales en Gel de Colágeno

Medio acondicionado (CM) de cultivos de células transfectadas con el vector de expresión de VEGF-C se puso en un pocillo preparado en gel de colágeno y se utilizó 35

para estimular la migración de las células endoteliales capilares de bovino (BCE) en el gel tridimensional de colágeno como sigue.

Células BCE (Folkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), 76: 5217-5221 (1979) se cultivaron como se describe en Pertovaara et al., J. Biol. Chem. 269: 6271-74 (1994). Los geles de colágeno se prepararon por mezcla de solución stock de coláge-5 no tipo I (5 mg/ml en HCl 1 mM) con un volumen igual de 2x MEM y 2 volúmenes de MEM que contenía 10% de suero de ternero recién nacido para dar una concentración final de colágeno de 1,25 mg/ml. Las placas de cultivo de tejidos (de 5 cm de diámetro) se recubrieron con una capa de la solución de aproximadamente 1 mm de espesor, que se dejó polimerizar a 37ºC. Se sembraron células BCE encima de esta capa. Para 10 los ensayos de migración, se dejó que las células se fijaran dentro de un anillo de plástico (1 cm de diámetro) colocado encima de la primera capa de colágeno. Después de 30 minutos, se retiró el anillo y las células no fijadas se eliminaron por enjuagado. Se añadieron una segunda capa de colágeno y una capa de medio de proliferación (5% de suero de ternero recién nacido (NCS)), solidificada por agar de punto de fusión 15 bajo al 0,75% (FMC BioProducts, Rockland, ME). Un pocillo (3 mm de diámetro) se punzonó a través de todas las capas a ambos lados de la mancha de células a una distancia de 4 mm, y la muestra o el medio de control se pipetearon diariamente en los pocillos. Se tomaron fotomicrografías de las células que migraban desde el borde de la mancha al cabo de 6 días por medio de un microscopio Olympus CK 2 invertido, equi-20 pado con óptica de contraste de fases. Las células migratorias se sometieron a re-cuento después de tinción nuclear con el tinte fluorescente bisbencimida (1 mg/ml, Hoechst 33258, Sigma).

La Fig. 15 representa una comparación del número de células que migraban a distancias diferentes desde el área original de fijación hacia los pocillos que contenían 25 medio acondicionado por las células no transfectadas (control) o transfectadas (falsa-mente; VEGF-C; VEGF), 6 días después de la adición del medio. El número de células que migraban desde el anillo original de fijación se sometió a recuento en cinco cua-drados adyacentes de 0,5 mm x 0,5 mm utilizando una rejilla de lente ocular de mi-croscopio y aumento 10x con un microscopio de fluorescencia. Las células que 30 migraban más de 0,5 mm se sometieron a recuento de manera similar desplazando la rejilla en pasos de 0,5 mm. Los experimentos se realizaron dos veces con resultados similares, y se presentan los valores medios procedentes de uno de los experimentos con las barras de error estándar. Como se puede ver por las columnas, el CM que contenía VEGF-C estimulaba la migración de las células más que el medio acondicio-35

nado por las células no transfectadas o falsamente transfectadas, pero menos que el medio de células transfectadas con un vector de expresión de VEGF. La adición diaria de 1 ng de VEGF2 a los pocillos daba como resultado la migración de aproximada-mente un número doble de células en comparación con la estimulación por CM proce-dente de células transfectadas con VEGF. 5

EJEMPLO 16

VEGF-C se Expresa en Tejidos Múltiples

Transferencias Northern que contenían 2 microgramos de RNA poli(A)+ aislado de tejidos humanos múltiples (transferencia de Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) se sondaron con una inserción marcada radiactivamente del clon de cDNA de 10 VEGF-C de 2,1 kb. El análisis por transferencia Northern e hibridación demostró que el RNA de 2,4 kb y cantidades más pequeñas de un mRNA de 2,0 kb se expresan en tejidos humanos múltiples, más abundantemente en corazón, placenta, músculo, ova-rio e intestino delgado (Fig. 16A). Se observó muy poco RNA de VEGF-C en el cere-bro, hígado o timo, y los leucocitos de sangre periférica (PBL) aparecían negativos. Un 15 análisis similar de RNA a partir de tejidos fetales humanos (Fig. 16B) muestra que VEGF-C se expresa fuertemente en el riñón y el pulmón y en menor grado en el híga-do, en tanto que no se detecta esencialmente expresión alguna en el cerebro. Resulta interesante que la expresión de VEGF está correlacionada con la expresión de VEGF-C en estos tejidos, en tanto que VEGF-B se expresa fuertemente en todos los tejidos 20 analizados.

EJEMPLO 17

El Gen de VEGF-C está Localizado en el Cromosoma 4q34

Un panel de DNA de 24 híbridos de células somáticas interespecies, que habían retenido uno o dos cromosomas humanos, se utilizó para la localización cromosómica 25 del gen de VEGF-C (Bios Laboratories, Inc., New Haven, CT). Se diseñaron iniciado-res para amplificar un fragmento de aproximadamente 250 pb del gen de VEGF-C a partir de DNA híbrido de células somáticas. Los iniciadores y las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron 5'-TGAGTGATTTGTAGCTGCTGTG-3' (directo) [SEQ ID NO: 34] y 5'-30 TATTGCAGCAACCCCCACATCT-3' (inverso) [SEQ ID NO: 35] para VEGF-C (94ºC, 60s/62ºC, 45s/72ºC, 60s). Los productos PCR se prepararon por electroforesis en ge-les de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio en luz ultravio-leta. Se utilizaron inserciones de cDNA marcado con [α-32P]-dCTP de un plásmido que representaba el dominio codificante de VEGF-C completo como sonda en análisis por 35

transferencia Southern e hibridación de los DNAs híbridos de células somáticas de acuerdo con las instrucciones del suministrador (Bios Laboratories).

Las líneas de células para hibridación con fluorescencia in situ (FISH) se obtuvie-ron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). El DNA purificado a partir de los clones 7660 y 7661 de P1 (VEGF-C) (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO) se 5 confirmaron positivos por transferencia Southern de DNA digerido con EcoRI seguida por hibridación con el cDNA de VEGF-C. Los clones de P1 se marcaron luego por tras-lación de la mella con biotina-11-dUTP, biotina-14-ATP (Sigma Chemical Co., St. Lou-is, MO) o digoxigenina-11-dUTP (Boehringer-Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con protocolos estándar. Cultivos de linfocitos de sangre periférica estimu-10 lados con PHA se trataron con 5-bromodesoxiuridina (BrdU) en una fase de replicación precoz para inducir la formación de bandas G. véase Takahashi et al., Human Genet., 86: 14-16 (1995); Lemieux et al., Cytogenet. Cell Genet., 59: 311-12 (1992). El proce-dimiento FISH se llevó a cabo en formamida al 50%, 10% de sulfato de dextrano en 2x SSC utilizando procedimientos bien conocidos. Véase v.g., Rytkönnen et al., Cytoge-15 net. Cell Genet., 68: 61-63 (1995); Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85: 9664-68 (1988). Las secuencias repetitivas se suprimieron con un exceso de 50 veces de DNA de Cot-1 (BRL, Gaithersburg, MD) comparado con la sonda marcada. Las señales de hibridación específicas se detectaron por incubación de los portaobjetos hibridados en anticuerpos antidigoxigenina marcados, seguido por contratinción con 20 0,1 mmol/l de 4,6-diamino-2-fenilindol. La detección de la sonda para experimentos en dos colores se realizó por incubación de los portaobjetos en anticuerpos fluoresceína-isotiocianato (FITC)-anti-digoxigenina (Sigma Chemical Co.) y rojo Texas-avidina (Vec-tor Laboratories, Burlingame, CA) o rodamina-anti-digoxigenina y FITC-avidina.

Se utilizó el análisis de digital imágenes multicolor para la adquisición, presenta-25 ción y cuantificación de las señales de hibridación de los cromosomas en metafase. El sistema contiene una cámara PXL (Photometrics Inc., Tucson, AZ) unida a una esta-ción de trabajo PowerMac 7100/Av. Un soporte lógico IPLab controla la operación de la cámara, la adquisición de las imágenes y la rueda Ludl Filter. Se registraron al me-nos 50 núcleos. Se ignoraron los núcleos solapantes y las agrupaciones de células. Se 30 incluyó en cada experimento un portaobjetos que contenía extensiones en metafase de linfocitos normales y núcleos en interfase para controlar la eficiencia y especificidad de la hibridación.

A fin de determinar la localización cromosómica del gen de VEGF-C humana, DNAs de híbridos de células somáticas humano-roedor que contenían series definidas 35

de cromosomas humanos se analizaron por transferencia Southern e hibridación con la sonda de cDNA de VEGF-C. Entre 24 muestras de DNA en el panel de híbridos, que representaban diferentes cromosomas humanos, se observaron señales humano-específicas únicamente en los híbridos que contenían el cromosoma humano 4. Los resultados se confirmaron por PCR de los DNAs híbridos de células somáticas utili-5 zando iniciadores específicos de VEGF-C, obteniéndose bandas amplificadas única-mente a partir de los DNAs que contenían el cromosoma humano 4.

Se aisló un plásmido P1 genómico para VEGF-C utilizando iniciadores específi-cos y PCR y se comprobó por transferencia Southern e hibridación utilizando una son-da de cDNA específica de VEGF-C. La localización cromosómica de VEGF-C se 10 estudió ulteriormente utilizando FISH en metafase. Utilizando la sonda P1 para VEGF-C en FISH, se detectó una hibridación específica a la banda cromosómica 4q34 en 40 de 44 metafases. La hibridación con fluorocromo doble utilizando una sonda de cósmi-do específica para el gen de aspartilglucosaminidasa (AGA) demostró que VEGF-C está localizada inmediatamente próxima al gen AGA mapeado previamente a la banda 15 cromosómica 4q34-35.

Sondas de VEGF-C P1 marcadas con biotina y de cósmido AGA marcadas con digoxigenina se hibridaron simultáneamente a cromosomas en metafase. Este experi-mento demostró que el gen de AGA está localizado más teloméricamente que el gen de VEGF-C. El ejemplo que antecede demuestra la utilidad de los polinucleótidos de la 20 invención como marcadores cromosómicos y en cuanto a la presencia o ausencia de la región del gen de VEGF-C en células normales o enfermas. El locus de VEGF-C en 4q34 es una diana candidato para mutaciones conducentes a malformaciones vascula-res o enfermedades cardiovasculares.

EJEMPLO 18 25

Efecto de la Concentración de Glucosa e Hipoxia sobre los Niveles de mRNA de VEGF, VEGF-B y VEGF-C en Células de Glioblastoma C6

Cultivos confluentes de células C6 (ATCC CCL 107) se dejaron proliferar en pla-cas de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro que contenían 2,5 ml de DMEM y 5% de suero de ternero fetal más antibióticos. Los cultivos se expusieron durante 16 horas 30 a normoxia en una incubadora normal de cultivo de células que contenía 5% de CO2 o hipoxia por cierre de las placas de cultivo en una cámara de vidrio hermética al aire y combustión de un trozo de madera en el interior hasta que la llama se extinguió debido a la falta de oxígeno. Se aisló RNA poliadenilado (como en los otros ejemplos), y 8 microgramos del RNA se sometieron a electroforesis y se hibridaron por transferencia 35

con una mezcla de las sondas de VEGF, VEGF-B y VEGF-C (véase Fig. 12). Los re-sultados muestran que la hipoxia induce fuertemente la expresión de mRNA de VEGF, tanto en concentración baja como en concentración alta de glucosa, pero no tiene efecto significativo alguno sobre los niveles de mRNA de VEGF-B. El mRNA de VEGF-C aislado de células hipóxicas avanza de modo ligeramente más rápido en la electro-5 foresis en gel y puede verse una banda extra de movilidad más rápida bajo la banda de mRNA superior. Esta observación sugiere que la hipoxia afecta al procesamiento del RNA de VEGF-C. Una explicación para esta observación es que se altera el corte y empalme del mRNA de VEGF-C, afectando al marco de lectura abierto de VEGF-C y dando como resultado la producción de una proteína alternativa VEGF-C por las célu-10 las hipóxicas. Dichas formas alternativas de VEGF-C y polinucleótidos codificantes de VEGF-C se contemplan como un aspecto de la invención. Estos datos indican utilida-des de escrutinio y diagnóstico para los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, tales como métodos por los cuales una muestra biológica se escruta con respecto a la forma inducida por hipoxia de VEGF-C y/o mRNA de VEGF-C. Los datos sugieren 15 adicionalmente una indicación terapéutica para anticuerpos y/u otros inhibidores de la forma de VEGF-C inducida por hipoxia o la forma normal de VEGF-C.

EJEMPLO 19

Marcación Pulso-Caza e Inmunoprecipitación de Polipéptidos de VEGF-C a partir de Células 293 EBNA Transfectadas con el Vector de Expresión de VEGF-C 20

Se sintetizó el péptido amino-terminal ramificado de VEGF-C siguiente, designa-do PAM126, para producción de antisuero anti-VEGF-C:

NH2-E-E-T-I-K-F-A-A-A-H-Y-N-T-E-I-L-K-COOH (SEQ ID NO: 39).

En particular, se sintetizó PAM126 como una estructura de polilisina ramificada K3PA4 que tenía cuatro cadenas de ácido peptídico (PA) unidas a dos residuos lisina 25 (K) disponibles. La síntesis se realizó en un Sintetizador de Péptidos 433A (Applied Biosystems) utilizando química de Fmoc y mezcla de resina TentaGel S MAP RAM10 (RAPP Polymere GmbH, Tubingen, Alemania), obteniéndose tanto péptidos escindi-bles como péptidos fijados a la resina. El péptido escindible se purificó por HPLC en fase inversa y se utilizó en inmunizaciones junto con el péptido fijado a la resina. La 30 exactitud de los productos de la síntesis se confirmó utilizando espectroscopia de ma-sas (Lasermatt).

El péptido PAM126 se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mezcló con adyuvante de Freund, y se utilizó para inmunización de conejos a inter-valos bisemanales utilizando métodos estándar en la técnica (Harlow y Lane, Antibo-35

dies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). El antisuero obtenido después de la cuarta inmunización de refuerzo se utilizó para inmunoprecipi-tación de VEGF-C en experimentos de pulso-caza, como se describe más adelante.

Para el análisis pulso-caza, células 293 EBNA transfectadas con un vector de expresión de VEGF-C (es decir, el cDNA de FLT4-L insertado en el vector de expre-5 sión pREP7 como se describe arriba) se incubaron durante 30 minutos en medio de cultivo DMEM exento de metionina, exento de cisteína, y exento de suero, a 37ºC. Se cambió luego el medio, y se añadieron 200 µCi de Pro-mix™ (Amersham). Las capas de células se incubaron en este medio de marcación durante 2 horas, se lavaron con PBS, y se incubaron durante 0, 15, 30, 60, 90, 120, ó 180 minutos en DMEM exento 10 de suero (caza). Después de los diversos periodos de caza, se recogió el medio, se lavaron de nuevo las células dos veces en PBS, y se lisaron en tampón de inmunopre-cipitación. Los polipéptidos de VEGF-C se analizaron a partir tanto del medio de cultivo como de los lisados de células por inmunoprecipitación, utilizando el antisuero especí-fico de VEGF-C generado contra el péptido NH2-terminal (PAM126) de la forma de 15 VEGF-C de 23 kD. Los polipéptidos inmunoprecipitados se analizaron por SDS-PAGE seguido por autorradiografía.

Haciendo referencia a Fig. 19, los autorradiogramas resultantes demuestran que inmediatamente después de una marcación de 2 horas (tiempo de caza 0), las células transfectadas con el vector de VEGF-C contenían una banda polipeptídica radiactiva 20 de 55 kD, que no se observa en las células falsamente transfectadas (M). Esta banda polipeptídica de 55 kD disminuye gradualmente en intensidad con los periodos de caza crecientes, y ya no se detecta en las células al cabo de 180 minutos de caza. Se ob-serva también una banda polipeptídica de 32 kD en las células transfectadas con VEGF-C (y no en las células transfectadas falsamente). Esta banda de 32 kD desapa-25 rece con una cinética similar a la de la banda de 55 kD. Simultáneamente, cantidades crecientes de polipéptidos de 32 kD (flecha) y subsiguientemente 23 kD (flecha) y 14 kD aparecen en el medio.

Colectivamente, los datos procedentes de los experimentos pulso-caza indican que el polipéptido intracelular de 55 kD representa un polipéptido pro-VEGF-C, que no 30 es secretado por las células, sino que en lugar de ello se escinde proteolíticamente en primer lugar en la forma de 32 kD. La forma de 32 kD se secreta y se procesa adicio-nalmente al mismo tiempo por proteólisis en las formas de 23 kD y 14 kD. Sin preten-der limitarse a una teoría particular, se cree que el procesamiento del precursor de VEGF-C ocurre como eliminación de una secuencia de señal, eliminación del dominio 35

COOH-terminal (BR3P), y eliminación de un polipéptido amino-terminal, dando como resultado un polipéptido de VEGF-C que tiene el término amino TEE... .

A resolución elevada, la banda polipeptídica de 23 kD aparece como un doblete polipeptídico muy compacto, lo que sugiere heterogeneidad en la escisión o glicosila-ción. 5

EJEMPLO 20

Aislamiento de Clones de cDNA de Ratón y codorniz

Codificantes de VEGF-C

Para clonar una variante de ratón de VEGF-C, aproximadamente 1 x 106 clones de bacteriófago lambda de una genoteca de cDNA de embrión de ratón de 12 días 10 disponible comercialmente (genoteca lambda EXlox, Novagen, número de catálogo 69632-1) se escrutaron con un fragmento radiomarcado de cDNA de VEGF-C humana que contenían los nucleótidos 495 a 1661 de SEQ ID No: 32. Se aisló un solo clon positivo.

Un fragmento EcoRI/HindIII de 1323 pb de la inserción del clon de cDNA de 15 ratón aislado se subclonó en los sitios correspondientes del vector pBluescript SK+ (Stratagene) y se secuenció. La secuencia de cDNA de este clon era homóloga a la secuencia de VEGF-C humana consignada en esta memoria, excepto que aproxima-damente 710 pb de la secuencia del extremo 5' presente en el clon humano no esta-ban presentes en el clon de ratón. 20

Para escrutinio adicional de genotecas de cDNA de ratón, un fragmento HindIII-BstXI (el sitio HindIII procede del polienlazador pBluescript SK+) de 881 pb de la re-gión codificante del clon de cDNA de ratón se sometió a radiomarcación y se utilizó como sonda para escrutar dos genotecas de cDNA de ratón adicionales. Se identifica-ron dos clones de cDNA adicionales de una genoteca de cDNA ZAP II de corazón de 25 ratón adulto (Stratagene, número de catálogo 936306). Se aislaron también 3 clones adicionales a partir de una genoteca de cDNA de corazón de ratón 5'-stretch-plus en λgt11 (Clontech Laboratories, Inc., número de catálogo ML5002b). De los tres últimos clones, se encontró que uno contenía una inserción de aproximadamente 1,9 kb. La inserción de este clon de cDNA se subclonó en sitios EcoRI del vector pBluescript SK+ 30 y se secuenciaron completamente ambas cadenas de este clon, dando como resultado las secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida que se muestran en SEQ ID NOs: 40 y 41.

Se contempla que el polipéptido correspondiente a SEQ ID No: 41 se procesa en una proteína VEGF-C madura de ratón, de una manera análoga al procesamiento del 35

prepropéptido de VEGF-C humana. Los sitios de escisión supuestos para la proteína de ratón se identifican utilizando procedimientos reseñados anteriormente para identi-ficación de los sitios de escisión para el polipéptido VEGF-C humana.

Los resultados que anteceden demuestran la utilidad de los polinucleótidos de la invención para identificar y aislar polinucleótidos que codifican otras variantes de 5 mamífero no humanas de VEGF-C. Tales polinucleótidos identificados y aislados, a su vez, pueden expresarse (utilizando procedimientos similares a los descritos en los ejemplos anteriores) para producir polipéptidos recombinantes correspondientes a variantes de mamífero no humanas de VEGF-C.

Las secuencias de VEGF-C de ratón y humana se utilizaron para diseñar sondas 10 para aislamiento de un cDNA de VEGF-C de codorniz a partir de una genoteca de cDNA de codorniz. Un fragmento del cDNA de VEGF-C humana que comprendía los nucleótidos 495-1670 de SEQ ID No: 32 se obtuvo por amplificación PCR, se clonó en el vector pCRII (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se ampli-ficó. La inserción se aisló por digestión con Eco RI y electroforesis en gel preparativa y 15 se marcó luego utilizando dCTP radiactivo y cebado aleatorio. Una genoteca de cDNA construida a partir de embriones de codorniz en la etapa E-4 en el vector pcDNA-1 (Invitrogen) se escrutó luego utilizando esta sonda. Aproximadamente 200.000 colo-nias de extendieron en placas y se hibridaron réplicas en filtro con la sonda radiactiva. Se identificaron nueve clones positivos y se extendieron en placas secundariamente. 20 Dos de los nueve clones se hibridaron en un escrutinio secundario. Los clones purifi-cados (clones 1 y 14) tenían inserciones Eco RI de aproximadamente 2,7 kb. Ambos clones se amplificaron y se secuenciaron luego utilizando los iniciadores T7 y SP6 (reasociación al vector). Adicionalmente, se identificó un sitio de escisión por la endo-nucleasa de restricción interna Sph I a aproximadamente 1,9 kb del lado del iniciador 25 T7 del vector y se utilizó para subclonar fragmentos Sph I 5' y 3', seguido por secuen-ciación desde el extremo Sph I de los subclones. Las secuencias obtenidas eran idén-ticas para ambos clones y exhibían un alto grado de semejanza con la región codificante de VEGF-C humana. Subsiguientemente, se construyeron iniciadores de recorrido en ambas direcciones y se completó la secuenciación de ambas cadenas 30 para 1743 pares de bases, incluyendo el marco de lectura abierto de longitud total.

La secuencia de cDNA obtenida incluye un marco de lectura abierto largo y una región 5' no traducida. Las secuencias de DNA y de aminoácidos deducida para el cDNA de codorniz se presentan en SEQ ID NOs: 52 y 53, respectivamente. Como se muestra en Fig. 8, las secuencias de aminoácidos precursoras de VEGF-C humana, 35

murina, y de ave (codorniz) comparten un grado significativo de conservación. Este alto grado de homología permite el aislamiento de secuencias codificantes de VEGF-C de otras especies, especialmente especies de vertebrados, y más particularmente es-pecies de mamíferos y aves, utilizando los polinucleótidos de la presente invención como sondas y utilizando técnicas estándar de biología molecular tales como las des-5 critas en esta memoria.

EJEMPLO 21

Análisis de la Secuencia del Péptido N-Terminal

de VEGF-C Recombinante

Las células (293 EBNA) transfectadas con cDNA de VEGF-C (véase el Ejemplo 10 13) secretan varias formas de VEGF-C recombinante (Fig. 21A, pista IP). En ausencia de alquilación, las tres formas mayores, procesadas proteolíticamente, de VEGF-C migran en la SDS-PAGE como proteínas con masas moleculares aparentes de 32/29 kD (doblete), 21 kD y 15 kD. Dos polipéptidos menores exhiben masas moleculares aproximadas de 63 y 52 kD, respectivamente. Uno de estos polipéptidos es presumi-15 blemente una forma glicosilada y no procesada. El otro polipéptido está presumible-mente glicosilado y parcialmente procesado.

Para determinar los sitios de escisión proteolítica del precursor de VEGF-C, se utilizó una columna de inmunoafinidad para purificar los polipéptidos VEGF-C a partir del medio acondicionado de células 293 EBNA transfectadas con cDNA de VEGF-C. 20 Para preparar la columna de inmunoafinidad, se inmunizó un conejo con un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 104-120 de SEQ ID No: 33: H2N-EETIKFAAAHYNTEILK (véase PAM126 en el Ejemplo 19). La fracción IgG se aisló a partir del suero del conejo inmunizado utilizando proteína A-Sepharose (Pharmacia). La fracción IgG aislada se unió covalentemente a Sepharose CL-4B activada con 25 CNBr (Pharmacia) utilizando técnicas estándar a una concentración de 5 mg de IgG/ml de Sepharose. Esta matriz de inmunoafinidad se utilizó para aislar VEGF-C procesada a partir de 1,2 litros del medio acondicionado (CM).

El material purificado eluido de la columna se analizó por electroforesis en gel y transferencia Western. Las fracciones que contenían polipéptidos VEGF-C se combi-30 naron, dializaron contra Tris HCl 10 mM, se secaron a vacío, se pasaron por electro-transferencia a membrana de transferencia Immobilon-P (poli(difluoruro de vinilideno) o PVDF) (Millipore, Marlborough, MA) y se sometieron a análisis de la secuencia de aminoácidos del terminal N.

La banda polipeptídica de 32 kD produjo dos secuencias distintas: NH2-FESGLDLSDA... y NH2-AVVMTQTPAS... (SEQ ID No: 51), correspondiendo la primera a la parte N-terminal de VEGF-C después de la escisión del péptido de señal, a partir del aminoácido 32 (SEQ ID No: 33), y correspondiendo la última a la cadena kappa de IgG, que estaba presente en el material purificado debido a "fuga" de la matriz de afi-5 nidad durante el procedimiento de elución.

A fin de obtener la secuencia del péptido N-terminal de la forma de 29 kD de VEGF-C, se generó una construcción (VEGF-C NHis) que codificaba una variante de VEGF-C. En particular, la construcción codificaba una variante de VEGF-C que fusio-naba una etiqueta 6xHis al término N del precursor secretado (es decir, entre los ami-10 noácidos 31 y 33 en SEQ ID No: 33). La fenilalanina de la posición 32 se separó para evitar la posible escisión de la secuencia identificadora durante la secreción de VEGF-C. La construcción VEGF-C NHis se clonó en pREP7 como un vector; la construcción se describe con mayor detalle más adelante en el Ejemplo 28.

Se utilizó la técnica de co-precipitación con fosfato de calcio para transfectar 15 VEGF-C NHis en células 293 EBNA. Las células se incubaron en DMEM/10% de sue-ro de ternero fetal en cápsulas de cultivo de células de 15 cm (un total de 25 placas). Al día siguiente, las células se sembraron de nuevo en cápsulas de cultivo recientes (75 placas) que contenían el mismo medio y se incubaron durante 48 horas. Las capas de células se lavaron luego una sola vez con PBS y se añadió medio DMEM que ca-20 recía de FCS. Las células se incubaron en este medio durante 48 horas y se recogió el medio, se aclaró por centrifugación a 5000 x g y se concentró 500X utilizando un Dis-positivo de Flujo Tangencial Ultrasette (Filtron, Northborough, MA), como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. Se purificó VEGF-C NHis a partir del medio acondicio-nado concentrado utilizando Resina de Afinidad de Metales TALONTM (Clontech Labo-25 ratories, Inc.) y el protocolo del fabricante para purificación de la proteína nativa utilizando tampones que contenían imidazol. La proteína se eluyó con una solución que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, e imidazol 200 mM. Las fraccio-nes eluidas que contenían VEGF-C NHis purificado se detectaron por inmunotransfe-rencia con Antisuero 882 (antisuero 882 de conejo, inmunizado con el polipéptido 30 PAM-126). Las fracciones que contenían VEGF-C NHis se reunieron, dializaron y se-caron a vacío. Como se puede ver en Fig. 27, debido a la presencia del identificador 6xHis en el término N de esta forma de VEGF-C, el componente superior del doblete mayor del VEGF-C NHis migra de modo ligeramente más lento que la forma de 32 kD de VEGF-C de tipo salvaje, mejorando con ello la separación de la variante VEGF-C 35

NHis de 32 kD de la banda de 29 kD con utilización de SDS-PAGE. Aproximadamente 15 g de la VEGF-C purificada se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reducto-ras, se pasaron por electrotransferencia a membrana de transferencia Immobilon-P (PVDF) (Millipore, Inc. Malborough, MA) y la banda a 29 kD se sometió a análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal. El análisis de esta secuencia reveló 5

una secuencia N-terminal de H2N-SLPAT..., correspondiente a los aminoácidos 228-232 de VEGF-C (SEQ ID No: 33).

La banda del polipéptido de 21 Kd produjo la secuencia H2N-AHYNTEILKS..., correspondiente a un término amino que comenzaba en el aminoácido 112 de SEQ ID No: 33. Así pues, el sitio de procesamiento proteolítico que da como resultado la forma 10 de 21 kD de VEGF-C producida por las células 293 EBNA transfectadas se encuentra aparentemente nueve residuos de aminoácidos aguas abajo del sitio de escisión que da como resultado la forma de 23 kD de VEGF-C secretada por las células PC-3.

El término N de la forma de 15 kD era idéntico al término N de la forma de 32 kD (NH2-FESGLDLSDA...). La forma de 15 kD no se detectaba cuando se produjo VEGF-15 C recombinante por las células COS. Esto sugiere que la producción de esta forma es específica del linaje de células.

Ejemplo 22 Formas dímera y monómera de VEGF-C

La composición de los dímeros de VEGF-C se analizó como sigue. Células (célu-20 las 293 EBNA), transfectadas con el vector pREP7 de VEGF-C como se describe en el Ejemplo 11, se marcaron metabólicamente con la mezcla marcadora Pro-mix L-[35S] (Amersham Corp.) hasta una concentración final de 100 Ci/ml.

En paralelo, se preparó y analizó un mutante de VEGF-C, designado "R102S". Para preparar el DNA codificante de VEGF-C-R102S, el codón de arginina en la posi-25 ción 102 de SEQ ID No: 33 se reemplazó con un codón serina. Este DNA codificante de VEGF-C-R102S, en un vector pREP7, se transfectó en células 293 EBNA y se ex-presó como se ha descrito arriba. Los polipéptidos de VEGF-C se inmunoprecipitaron utilizando antisuero 882 (obtenido por inmunización de un conejo con un polipéptido correspondiente a los residuos 104-120 de SEQ ID No: 33 (véase el ejemplo anterior)) 30 y antisuero 905 (obtenido por inmunización de un conejo con un polipéptido corres-pondiente a una porción del conductor prepro- de VEGF-C: H2N-ESGLDLSDAEPDAGEATAYASK (residuos 33 a 54 de SEQ ID No: 33).

Los inmunoprecipitados de cada cultivo de células se sometieron a SDS-PAGE en condiciones no desnaturalizantes (Fig. 21B). Las bandas 1-6 se cortaron del gel, se 35

impregnaron durante 30 minutos en tampón de carga de gel 1x que contenía -mercaptoetanol 200 mM, y se sometieron individualmente a SDS-PAGE en condicio-nes desnaturalizantes (Figs. 21A y 21C, pistas 1-6).

Como se puede ver por las Figuras 21 A-C, cada forma de peso molecular alto de VEGF-C (Fig. 21B, bandas 1-4) está constituida por al menos dos monómeros en-5 lazados por enlaces disulfuro (compárense las Figs. 21A y 21C, pistas 1-4, en los ge-les reductores). El componente principal de las bandas 1-3 es el doblete de 32-29 kD, en el cual están presentes ambas proteínas en una relación equimolar. La fracción principal de la forma de 21 kD se secreta como un monómero o como un homodímero conectado por medios distintos de enlaces disulfuro (bandas 6 y pistas 6 en Figs. 21A-10 C).

La mutación R102S crea un sitio adicional para glicosilación enlazada a N en VEGF-C en el residuo asparagina en la posición 100 de SEQ ID NO: 33. La glicosila-ción en este sitio de glicosilación adicional aumenta el peso molecular aparente de los polipéptidos que contienen dicho sitio, como se confirma en las Figuras 21A-C y Figu-15 ras 22A-B. La glicosilación adicional disminuye la movilidad de las formas de VEGF-C-R102S que contienen el sitio de glicosilación adicional, en comparación con los po-lipéptidos de estructura primaria similar correspondientes a VEGF-C. Las Figuras 21A-C y las Figuras 22A-B revelan que los polipéptidos VEGF-C-R102S correspondientes a las formas de 32 kD y 15 kD de VEGF-C de tipo salvaje exhiben pesos moleculares 20 aparentes incrementados, lo que indica que cada uno de estos polipéptidos contiene el sitio de glicosilación nuevamente introducido. En particular, El polipéptido VEGF-C-R102S correspondiente al polipéptido de 15 kD de VEGF-C migra en un gel juntamen-te con la forma de 21 kD del VEGF-C de tipo salvaje (ts), reflejando un desplazamiento del gel a una posición correspondiente a un peso molecular aparente mayor. (Compá-25 rense las pistas 4 en las Figuras 21A y 21C).

En un experimento similar, se preparó y analizó otro mutante de VEGF-C, desig-nado "R226,227S". Para preparar un DNA codificante de VEGF-C-R226,227S, los co-dones arginina en las posiciones 226 y 227 de SEQ ID No: 33 se reemplazaron con codones serina por mutagénesis orientada. El DNA resultante se transfectó en células 30 293 EBNA como se ha descrito arriba y se expresó y analizó en las mismas condicio-nes descritas para VEGF-C y VEGF-C-R102S. En el medio acondicionado a partir de las células que expresaban VEGF-C-R226,227S, no se detectó forma alguna de 32 kD de VEGF-C. Estos resultados indican que un sitio de escisión C-terminal de VEGF-C de tipo salvaje es adyacente a los residuos 226 y 227 de SEQ ID No: 33, y se destruye 35

por la mutación de las argininas en serinas. De nuevo, la movilidad del componente de 29 kD del doblete se mantenía inalterada (Figuras 22A-B).

Tomados en su conjunto, estos datos indican que la forma principal de la VEGF-C procesada es un heterodímero constituido por (1) un polipéptido de 32 kD que con-tiene los aminoácidos 32-227 de prepro-VEGF-C (aminoácidos 32 a 227 en SEQ ID 5 No: 33) unido por enlaces disulfuro a (2) un polipéptido de 29 kD que comienza con el aminoácido 228 en SEQ ID No: 33. Estos datos están soportados también por una comparación del patrón de formas de VEGF-C inmunoprecipitadas y marcadas utili-zando el antisuero 882 y el antisuero 905.

Cuando la inmunoprecipitación de VEGF-C se realizó utilizando medio acondi-10 cionado, ambos antisueros (882 y 905) reconocían alguna o la totalidad de las tres formas procesadas principales de VEGF-C (32/29 kD, 21 kD y 15 kD). Cuando el me-dio acondicionado se redujo por incubación en presencia de ditiotreitol 10 mM durante 2 horas a la temperatura ambiente con alquilación subsiguiente por incubación adicio-nal con yodoacetamida 25 mM durante 20 minutos a la temperatura ambiente, ninguno 15 de los anticuerpos precipitaba el componente de 29 kD, aunque el anticuerpo 882 re-conocía todavía los polipéptidos de 32 kD, 21 kD y 15 kD. Estos resultados son consis-tentes con la naturaleza del antígeno oligopeptídico utilizado para provocar los anticuerpos contenidos en el antisuero 882, un oligopéptido que contiene los residuos de aminoácidos 104-120 de SEQ ID No: 33. Por otra parte, el antisuero 905 reconocía 20 solamente los polipéptidos de 32 kD y 15 kD, que incluyen la secuencia del oligopépti-do (aminoácidos 33 a 54 de SEQ ID No: 33) utilizado para inmunización a fin de obte-ner el antisuero 905. Teniendo en cuenta el desplazamiento de movilidad de las formas de 32 kD y 15 kD, los resultados de inmunoprecipitación con el mutante R102S eran similares (Figs. 23A-B). La especificidad del anticuerpo 905 se confirma por el 25 hecho de que el mismo no reconocía una forma variante de VEGF-C N en LA cual los residuos 32-102 del polipéptido no procesado que abarcaban el propéptido N-terminal habían sido delecionados (Fig. 23B).

Los resultados de estos experimentos demuestran también que el polipéptido de 21 kD se encuentra (1) en heterodímeros con otras formas moleculares (véanse Figs. 30 21A-C y Figs. 22A-B), y (2) secretado como un monómero o un homodímero retenido por enlaces distintos de los enlaces disulfuro (Figs. 21A y 21B, pistas 6).

Los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que existen varias for-mas de VEGF-C. Se observaron una diversidad de monómeros de VEGF-C y estos monómeros pueden variar dependiendo del nivel y el patrón de glicosilación. Adicio-35

nalmente, VEGF-C se observó como un multímero, por ejemplo un homodímero o un heterodímero. El procesamiento de VEGF-C se presenta esquemáticamente en Fig. 18 (no se muestran los enlaces disulfuro).

Ejemplo 23

Hibridación in situ de Embriones de Ratón 5

Para analizar la distribución del mRNA de VEGF-C en células y tejidos diferen-tes, se prepararon secciones de 12,5 y 14,5 días post-coito (p.c.) de embriones de ratón y se analizaron por hibridación in situ utilizando sondas de VEGF-C marcadas. La hibridación in situ de las secciones de tejido se realizó como se describe en Västrik et al., J. Cell Biol., 128: 1197-1208 (1995). Se generó una sonda de RNA de VEGF-C 10 antisentido de ratón a partir del plásmido pBluescript II SK+ linealizado (Stratagene Inc., La Jolla, CA), que contenía un fragmento de cDNA correspondiente a los nucleó-tidos 499-979 de un cDNA de VEGF-C de ratón (SEQ ID No: 40). El RNA radiomarca-do se sintetizó utilizando polimerasa T7 y [35S]-UTP (Amersham). Sondas de RNA de VEGF-B antisentido y de sentido de ratón se sintetizaron de manera similar a partir del 15 plásmido pCRII linealizado que contenía la inserción de cDNA de VEGF-B de ratón como ha sido descrito por Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 93: 2576-2581 (1996). El lavado de alta severidad se realizó durante 45 minutos a 65ºC en una solu-ción que contenía ditiotreitol (DTT) 30 mM y 4 x SSC. Los portaobjetos se expusieron durante 28 días, se revelaron y se tiñeron con hematoxilina. Para comparación, se 20 hibridaron secciones similares con una sonda de VEGFR-3 y los embriones de 12,5 días p.c. se sondaron también en cuanto a mRNA de VEGF-B.

Las Figuras 34A-D muestran fotomicrografías en campo oscuro (Figuras 34A-C) y campo claro (Figura 34D) de secciones de embriones de 12,5 días p.c. sondadas con las sondas antisentido (Fig. 34A) y de sentido (Figs. 34C-D) de VEGF-C. La Fig. 25 34A ilustra una sección parasagital, en la cual el mRNA de VEGF-C es particularmente prominente en el mesénquima alrededor de los vasos que rodean el metanefros (mn) en desarrollo. Adicionalmente, se observaron señales de hibridación entre las vérte-bras en desarrollo (vc), en el mesénquima de pulmón (lu) en desarrollo, en la región del cuello y en la frente en desarrollo. La especificidad de estas señales es evidente 30 por la comparación con la expresión de VEGF-B en una sección adyacente (Fig. 34B), en la cual el miocardio proporciona una señal muy fuerte y se detectan niveles más bajos de mRNA de VEGF-B en varios otros tejidos. Ambos genes parecen expresarse entremedias de las vértebras en desarrollo (vc), en el pulmón (lu) en desarrollo y en la

frente. La hibridación de la sonda de sentido de VEGF-C no mostraba expresión es-pecífica alguna en el interior de estas estructuras (Fig. 34C).

Las Figs. 35A-D muestran una comparación de los patrones de expresión de VEGF-C y VEGFR-3 en embriones de ratón de 12,5 días p.c. en la región yugular, en la que se localizan la aorta dorsal y la vena cardinal en desarrollo. Ésta es el área en la 5 que brotan los primeros vasos linfáticos a partir de estructuras venosas semejantes a sacos de acuerdo con la antigua teoría de Sabin, Am. J. Anat., 9: 43-91 (1909). Como puede verse por las Figs. 35A-D, se detecta una intensa señal de VEGF-C en el mesénquima que rodea los sacos venosos en desarrollo (Figs. 35A y 35C) que son positivos para VEGFR-3 (Figs. 35b y 35D). 10

El mesenterio suministra sangre al intestino en desarrollo y contiene vasos linfá-ticos en desarrollo. El mesenterio en desarrollo de 14,5 días p.c. es positivo para mRNA de VEGF-C, con expresión particularmente alta en el tejido conectivo que rodea ciertos vasos (puntas de flecha en las Figs. 35E-H). Esta señal en Fig. 35E debería diferenciarse de la reflexión positiva falsa de la luz por los hematíes en el interior del 15 vaso. Las señales mesentéricas de VEGFR-3 adyacentes mostradas en Fig. 35F son originadas por pequeños capilares del mesenterio (punta de flecha). Por consiguiente, parece existir una relación paracrina entre la producción de los mRNAs para VEGF-C y su receptor. Estos datos indican que VEGF-C se expresa en una diversidad de teji-dos. Además, el patrón de expresión es consistente con un papel para VEGF-C en el 20 desarrollo de vasos venosos y linfáticos. Adicionalmente, los datos revelan que VEGF-C se expresa en animales no humanos.

Ejemplo 24

Análisis de la Expresión de mRNA de VEGF, VEGF-B, y VEGF-C en Tejidos Feta-les y Adultos 25

Una transferencia Northern de tejido fetal humano que contenía 2 g de RNAs poliadenilados de cerebro, pulmón, hígado y riñón (Clontech Inc.) se hibridó con una agrupación de las sondas siguientes: una inserción de cDNA de VEGF-C humana de longitud total (Genbank Acc. No. X94216), un fragmento de cDNA de VEGF-B167 humano (nucleótidos 1-382, Genbank Acc. No. U48800) obtenido por amplificación 30 PCR; y un fragmento de cDNA de 581 pb de VEGF humano que abarcaba los pares de bases 57-638 (Genbank Acc. No. X15997). Las transferencias se lavaron en condi-ciones severas, utilizando métodos estándar en la técnica.

Una transferencia Northern de tejidos múltiples de embrión de ratón (Clontech Inc.) que contenía 2 g de RNAs poliadenilados de embriones de 7, 11, 15 y 17 días 35

post-coito (p.c.) se hibridó con un fragmento de cDNA de VEGF-C de ratón (pares de bases 499-656). Una transferencia Northern de tejido adulto de ratón se hibridó con las sondas para VEGF, VEGF-B167, VEGF-C humana y con un fragmento de cDNA de VEGFR-3 humanos (nucleótidos 1-595; Genbank Acc. No. X68203).

En los tejidos adultos de ratón, se observaron señales de mRNA tanto de 2,4 kb 5 como de 2,0 kb con la sonda VEGF-C, en una relación aproximada de 4:1. Las seña-les más claras se obtuvieron a partir de RNA de pulmón y corazón, mientras que riñón, hígado, cerebro, y músculo esquelético tenían niveles más bajos, y bazo y testículos tenían niveles apenas visibles. Como en el caso de los tejidos humanos, la expresión de mRNA de VEGF en ratones adultos era muy abundante en el RNA de pulmón y 10 corazón, mientras que las otras muestras exhibían una regulación menos coordinada con la expresión de VEGF-C. Los tejidos de músculo esquelético y cardíaco daban los niveles más altos de mRNA de VEGF-B a partir de ratones adultos, como ha sido con-signado previamente por Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 93: 2576-2581 (1996). La comparación con la expresión de VEGFR-3 mostraba que los tejidos en los 15 cuales se expresa VEGF-C contienen también mRNA para su tirosina-quinasa recep-tora cognada, aunque en el hígado adulto era desproporcionadamente abundante el mRNA de VEGFR-3.

Para proporcionar una mejor comprensión en cuanto a la regulación del mRNA de VEGF-C durante el desarrollo del embrión, RNA poliadenilado aislado de embrio-20 nes de ratón de diversas edades de gestación (7, 11, 15, 17 días p.c.) se hibridó con la sonda de VEGF-C de ratón. Estos análisis demostraron que la cantidad de mRNA de VEGF-C de 2,4 kb es relativamente constante a todo lo largo del periodo de gestación.

Ejemplo 25

Regulación de los mRNAs para los Miembros de la Familia de VEGF por Suero, 25 Interleuquina-1 y Dexametasona en Fibroblastos Humanos en Cultivo

Se cultivaron fibroblastos humanos IMR-90 en medio DMEM que contenía 10% de FCS y antibióticos. Las células se dejaron proliferar hasta 80% de la confluencia, después de lo cual se privaron de alimento durante 48 horas en FCS al 0,5% en DMEM. Después de ello, el medio de proliferación se cambió a DMEM que contenía 30 5% de FCS, con o sin 10 ng/ml de interleuquina-1 (IL-1) y con o sin dexametasona 1 mM, como se indica en Figs. 24A-B. Las placas de cultivo se incubaron con estas adi-ciones durante los tiempos indicados, y se aisló el RNA celular total utilizando el kit TRIZOL (GIBCO-BRL). Aproximadamente 20 g de RNA total de cada muestra se sometieron a electroforesis en geles de formaldehído-agarosa al 1,5% como se des-35

cribe en Sambrook et al., supra (1989). El gel se utilizó para transferencia Northern e hibridación con una inserción de DNA radiomarcado del clon de VEGF humano (un cDNA de 581 pb que abarca los pares de bases 57-638, Genbank Acc. No. 15997) y un fragmento de cDNA de VEGF-B167 humano (nucleótidos 1-382, Genbank Acc. No. U48800) (Fig. 25B). Subsiguientemente, las transferencias Northern se sondaron con 5 una inserción radiomarcada del plásmido de cDNA de VEGF-C (Fig. 24A). Se marca-ron iniciadores utilizando una técnica estándar que implica reacciones de extensión enzimáticas de iniciadores aleatorios, como sería comprendido por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Se indican las movilidades de las bandas de RNA ribosómico 28S y 18S, basadas en la fotografía UV de RNA teñido con bromuro de 10 etidio antes de la transferencia.

Como se puede ver en las Figs. 24A-B, niveles muy bajos de VEGF-C y VEGF son expresados por las células IMR-90 privadas de alimento así como células después de 1 hora de estimulación. En contraste, es visible una señal abundante de mRNA de VEGF-B en estas condiciones. Después de 4 horas de estimulación con suero, existe 15 una inducción fuerte de mRNAs de VEGF-C y VEGF, que se incrementan ulteriormen-te en la muestra tratada con IL-1. El efecto de IL-1 parece anularse en presencia de dexametasona. Un patrón de aumento similar se mantiene en la muestra de 8 horas, pero ocurre una regulación gradual decreciente de todas las señales para ambos RNAs en las muestras de 24 horas y 48 horas. En contraste, los niveles de mRNA de 20 VEGF-B se mantienen constantes y exhiben por tanto una estabilidad notable a lo lar-go de todo el periodo de tiempo. Los resultados son útiles en la orientación de los es-fuerzos para utilizar VEGF-C y sus fragmentos, sus antagonistas, y anticuerpos anti-VEGF-C en métodos para tratamiento de una diversidad de trastornos.

Ejemplo 26 25

Expresión y análisis de VEGF-C murino recombinante

El cDNA de VEGF-C de ratón se expresó como una proteína recombinante y la proteína secretada se analizó respecto a sus propiedades de fijación de receptores. La fijación de VEGF-C de ratón al dominio extracelular de VEGFR-3 humano se estudió utilizando medio procedente de células Bosc23 transfectadas con cDNA de VEGF-C 30 de ratón en un vector de expresión retrovírico.

El cDNA de VEGF-C de ratón de 1,8 kb se clonó como un fragmento EcoRI en el vector de expresión retrovírico pBabe-puro que contenía la región promotora inicial de SV40 [Morgenstern et al., Nucl. Acids Res., 18: 3587-3595 (1990)], y se transfectó a la línea de células de empaquetamiento de Bosc23 [Pearet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 35

(USA), 90: 8392-8396 (1994)] por el método de precipitación con fosfato de calcio. Para comparación, las células Bosc23 se transfectaron también con la construcción de VEGF-C humana previamente descrita en el vector de expresión pREP7. Las células transfectadas se cultivaron durante 48 horas antes de la marcación metabólica. Las células se cambiaron a medio DMEM desprovisto de cisteína y metionina, y, después 5 de 45 minutos de preincubación y cambio de medio, se añadió la mezcla de marcación de células in vitro Pro-mixTM L-[35S] (Amersham Corp.), en el mismo medio, hasta una concentración final de aproximadamente 120 Ci/ml. Después de 6 horas de incuba-ción, el medio de cultivo se recogió y se clarificó por centrifugación.

Para la inmunoprecipitación, partes alícuotas de 1 ml del medio procedente de 10 células Bosc23 marcadas metabólicamente transfectadas con vector vacío o VEGF-C recombinante de ratón o humano, respectivamente, se incubaron durante una noche en hielo con 2 l de antisuero policlonal de conejo generado contra un oligopéptido N-terminal de 17 aminoácidos de VEGF-C humana madura (H2N-EETIKFAAAHYNTEILK) (SEQ ID No: 33, residuos 104-120). Después de ello, las 15 muestras se incubaron con proteína A-Sepharose durante 40 minutos a 4ºC con agita-ción moderada. Los gránulos de Sepharose se lavaron luego dos veces con tampón de inmunoprecipitación y cuatro veces con Tris-HCl 20 mM, de pH 7,4. Las muestras se hirvieron en tampón Laemmli y se analizaron por electroforesis en gel de dodecilsul-fato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)al 12,5%. 20

La inmunoprecipitación de VEGF-C a partir de medio de células transfectadas y marcadas metabólicamente reveló bandas de aproximadamente 30-32 x 103 Mr (un doblete) y 22-23 x 103 Mr en SDS-PAGE al 12,5%. Estas bandas no se detectaban en muestras procedentes de células no transfectadas o falsamente transfectadas como se muestra en Fig. 32 (es decir, las pistas marcadas "vector"). Estos resultados de-25 muestran que los anticuerpos generados contra VEGF-C humana reconocen el ligando de ratón correspondiente.

Para los experimentos de fijación de receptores, partes alícuotas de 1 ml de me-dio procedente de células Bosc23 marcadas metabólicamente se incubaron con el dominio extracelular de VEGFR-3 (véase Ejemplo 3), acoplado covalentemente a 30 Sepharose, durante 4 horas a 4ºC con agitación suave. Los glóbulos de Sepharose se lavaron 4 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada en hielo, y las muestras se analizaron por electroforesis en gel como se describe en Joukov et al., EMBO J., 15: 290-298 (1996).

Como puede verse por la Fig. 32, se obtuvieron bandas de doblete similares de 30-32 x 103 Mr y bandas de 22-23 x 103 Mr de polipéptido en el ensayo de fijación de receptores en comparación con el ensayo de inmunoprecipitación. Así, VEGF-C de ratón se fija a VEGFR-3 humana. La movilidad ligeramente más rápida de los polipép-tidos VEGF-C de ratón puede estar causada por la diferencia de 4 residuos de ami-5 noácidos observada en el análisis de la secuencia (residuos H88-E91, Fig. 31).

Se investigó también la capacidad de VEGF-C recombinante de ratón para indu-cir la autofosforilación de VEGFR-3. Para los experimentos de estimulación del recep-tor de VEGFR-3, células NIH 3T3-Flt4 subconfluentes, Pajusola et al., Oncogene, 9: 3545-3555 (1994) se privaron de alimento durante una noche en medio exento de sue-10 ro que contenía 0,2% de BSA. En general, las células se estimularon con el medio acondicionado a partir de células transfectadas con vector de VEGF-C durante 5 minu-tos, se lavaron 3 veces con PBS fría que contenía vanadato 200 M, y se lisaron en tampón RIPA para análisis por inmunoprecipitación. Los lisados se centrifugaron du-rante 25 minutos a 16000 x g y los sobrenadantes resultantes se incubaron durante 2 15 horas en hielo con los antisueros específicos, seguido por inmunoprecipitación utili-zando proteína A-Sepharose y análisis en SDS-PAGE al 7%. Los polipéptidos se transfirieron a nitrocelulosa y se analizaron por inmunotransferencia utilizando anti-fosfotirosina (Transduction Laboratories) y anticuerpos anti-receptor, como ha sido descrito por Pajusola et al., Oncogene, 9: 3545-3555 (1994). El desprendimiento del 20 filtro se llevó a cabo a 50ºC durante 30 minutos en 2-mercaptoetanol 100 mM, 2% SDS, Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,7, con agitación ocasional. Los resultados del experi-mento se muestran en Fig. 33. Los resultados demuestran que el medio de cultivo que contiene VEGF-C de ratón estimula la autofosforilación de VEGFR-3 en un grado simi-lar al VEGF-C de baculovirus humano o el inhibidor de tirosil-fosfatasa pervanadato. 25

La estimulación de VEGFR-2 se estudió en células endoteliales aórticas de por-cino (PAE) subconfluentes que expresaban Kdr (VEGFR-2) (PAE-VEGFR-2) [Walten-berger et al., J. Biol. Chem., 269: 26988-26995 (1994)], que se privaron de alimento durante una noche en medio exento de suero que contenía 0,2% de BSA. La estimula-ción se llevó a cabo y se prepararon los lisados como se ha descrito arriba. Para la 30 inmunoprecipitación del receptor, se utilizó el antisuero específico para VEGFR-2 [Wal-tenberger et al., J. Biol. Chem., 269: 26988-26995 (1994)]. Los inmunoprecipitados se analizaron como se ha descrito para VEGFR-3 en SDS-PAGE al 7% seguido por transferencia Western con anticuerpos anti-fosfotirosina, desprendimiento del filtro, y re-exploración del mismo con anticuerpos anti-VEGFR-2 (Santa Cruz). 35

La VEGF-C de ratón parecía ser un inductor potente de autofosforilación de VEGFR-3, fosforilándose el precursor 195 x 103 Mr y los polipéptidos de tirosina-quinasa de 125 x 103 Mr proteolíticamente escindidos del receptor (Pajusola et al., On-cogene, 9: 3545-3555 (1994)). La estimulación de VEGFR-2 se intentó primeramente con medio no concentrado de células que expresaban VEGF-C recombinante, pero el 5 análisis por inmunotransferencia no revelaba autofosforilación alguna del receptor.

Para determinar ulteriormente si la VEGF-C recombinante de ratón puede inducir también la autofosforilación de VEGFR-2 como se observa para VEGF-C humana, células PAE que expresaban VEGFR-2 se estimularon con medio concentrado 10 ve-ces de cultivos transfectados con el vector de expresión de VEGF-C de ratón y se ana-10 lizó la autofosforilación. Para comparación, se utilizaron células tratadas con medio concentrado diez veces que contenía VEGF-C humana recombinante (Joukov et al., (1996)), medio no concentrado de células de insecto infectadas con baculovirus de VEGF-C humana, o pervanadato (un inhibidor de la tirosil-fosfatasa). Como puede verse por la Fig. 33, en respuesta a VEGF-C de baculovirus humano así como al tra-15 tamiento con pervanadato, VEGFR-2 se fosforilaba notablemente, mientras que la VEGF-C recombinante humana y de ratón daba un aumento débil y apenas detectable de autofosforilación, respectivamente. El medio de los cultivos de células transfectados con vector vacío o VEGF-C-clonada en la orientación antisentido no inducía autofosfo-rilación de VEGFR-2. Por consiguiente, la VEGF-C de ratón se fija a VEGFR-3 y activa 20 este receptor a una concentración mucho menor que la necesaria para la activación de VEGFR-2. Sin embargo, la invención abarca métodos para utilización de los materiales de la invención a fin de aprovechar la ventaja de la interacción de VEGF-C con VEGFR-2, además de la interacción entre VEGF-C y VEGFR-3.

Ejemplo 27 25

El fragmento E104-S213 de VEGF-C expresado en la levadura Pichia estimula la autofosforilación de Flt4 (VEGFR-3) y KDR (VEGFR-2)

Se construyó una forma truncada de cDNA de VEGF-C humana en la cual (1) la secuencia codificante de los residuos de un término amino H2N-E(104)ETIK de VEGF-C madura supuesta (SEQ ID No: 33, residuos 104 y siguientes) se fusionó en marco a 30 la secuencia de señal PHO1 de levadura (Kit de Expresión de Pichia Invitrogen, Catá-logo #K1710-01), y (2) se introdujo un codón de parada después del aminoácido 213 (H2N-...RCMS; es decir, después del codón 213 de SEQ ID No: 32). La construcción de cDNA truncada resultante se insertó luego en el vector de expresión pHIL-S1 de

Pichia pastoris (Invitrogen). Para la clonación, un sitio BglII interno en la secuencia codificante de VEGF-C se mutó sin cambio de la secuencia polipeptídica codificada.

Este vector de expresión de VEGF-C se transfectó luego a células Pichia y los clones positivos se identificaron por escrutinio respecto a la expresión de la proteína VEGF-C en el medio de cultivo por transferencia Western. Un clon positivo se dejó 5 proliferar en un cultivo de 50 ml, y se indujo con metanol durante diversos periodos de tiempo desde 0 a 60 horas. Se analizaron aproximadamente 10 l de medio por elec-troforesis en gel, seguido por transferencia Western y detección con antisuero anti-VEGF-C, como se ha descrito arriba. Como se puede ver en la Figura 25, un polipépti-do de aproximadamente 24 kD (obsérvese la extensión de la banda debido a la glicosi-10 lación) se acumula en el medio de cultivo de las células transfectadas con la construcción de VEGF-C recombinante, pero no en el medio de las células transfecta-das falsamente o las células transfectadas con el vector exclusivamente.

El medio que contenía la proteína VEGF-C recombinante se concentró por ul-trafiltración Centricon con punto de corte 30 kD y se utilizó para estimular células NIH 15 3T3 que expresaban Flt4 (VEGFR-3) y células endoteliales aórticas de porcino (PAE) que expresaban KDR (VEGFR-2). Las células estimuladas se lisaron y se inmunopre-cipitaron utilizando antisueros específicos de VEGFR y los inmunoprecipitados se ana-lizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina, quimioluminiscencia, y fluorografía. Como un control positivo para la autofosforilación 20 máxima de los VEGFRs, se utilizó tratamiento con vanadato (VO4) de las células du-rante 10 minutos. Como se puede ver por los resultados que se muestran en Fig. 26, el medio de los cultivos de Pichia que secretan el polipéptido VEGF-C recombinante induce autofosforilación tanto de los polipéptidos Flt4l de 195 kD y 125 kD como del polipéptido KDR de aproximadamente 200 kD. El vanadato, por otra parte, induce una 25 fuerte fosforilación del tirosilo de las bandas receptoras además de otras bandas que coprecipitan probablemente con los receptores.

Estos resultados demuestran que un dominio homólogo de VEGF-C constituido por los residuos de aminoácidos 104E-213S (SEQ ID No: 33, residuos 104-213) puede producirse recombinantemente en levadura y es capaz de estimular la autofosforila-30 ción de Flt4 (VEGFR-3) y KDR (VEGFR-2). Fragmentos recombinantes de VEGF-C tales como el fragmento descrito en esta memoria, que son capaces de estimular la autofosforilación de Flt4 o KDR deben considerarse como aspectos de la invención.

Ejemplo 28

Propiedades de las formas de VEGF-C procesadas diferencialmente

Se utilizaron los oligonucleótidos siguientes para generar una serie de variantes de VEGF-C:

5'-TCTCTTCTGTGCTTGAGTTGAG-3' (SEQ ID No: 42), utilizado para generar 5 VEGF-C R102S (arginina mutada a serina en la posición 102 (SEQ ID No: 33));

5'-TCTCTTCTGTCCCTGAGTTGAG-3' (SEQ ID No: 43), utilizado para generar VEGF-C R102G (arginina mutada a glicina en la posición 102 (SEQ ID No: 33));

5'-TGTGCTGCAGCAAATTTTATAGTCTCTTCTGTGGCGGCGGCGGCGGCG-GGCGCCTCGCGAGGACC-3' (SEQ ID No: 44), utilizado para generar VEGF-C N 10 (deleción del propéptido N-terminal correspondiente a los aminoácidos 33-102 (SEQ ID No: 33));

5'-CTGGCAGGGAACTGCTAATAATGGAATGAA-3' (SEQ ID No: 45), utilizado para generar VEGF-C R226,227S (codones arginina mutados a serinas en las posicio-nes 226 y 227 (SEQ ID No: 33)); 15

5'-GGGCTCCGCGTCCGAGAGGTCGAGTCCGGACTCGTCATGGTGATGGTG-ATGGGCGGCGGCGGCGGCGGGCGCCTCGCGAGGACC-3' (SEQ ID No: 46), utili-zado para generar VEGF-C NHis (esta construcción codifica un polipéptido con un identificador 6xHis fusionado al término N del precursor secretado (aminoácido 32 de SEQ ID No: 33)). 20

Algunas de las construcciones variantes de VEGF-C que anteceden se modifica-ron ulteriormente para obtener construcciones adicionales. Por ejemplo, VEGF-C R102G en pALTER (Promega) y el oligonucleótido 5'-GTATTATAATGTCCTCCACCAAATTTTATAG-3' (SEQ ID No: 47) se utilizaron para generar VEGF-C 4G, que codifica un polipéptido con 4 mutaciones puntuales: R102G, 25 A110G, A111G, y A112G (alaninas mutadas a glicinas en las posiciones 110-112 (SEQ ID NO: 33). Estas cuatro mutaciones son adyacentes a sitios predichos de esci-sión de la VEGF-C expresada en PC-3 y expresada recombinantemente en células 293 EBNA.

Se creó otra construcción utilizando VEGF-C N y el oligonucleótido 5'-30 GTTCGCTGCCTGACACTGTGGTAGTGTTGCTGGCGG-CCGCTAGTGATGGTGATGGTGATGAATAATGGAATGAACTTGTCTGTAAACATCCAG-3' (SEQ ID NO: 48) para generar VEGF-C NCHis. Esta construcción codifica un polipéptido con un propéptido N-terminal delecionado (aminoácidos 32-102); un

propéptido C-terminal delecionado (aminoácidos 226-419 de SEQ ID NO: 33); y un identificador 6xHis añadido en el término C.

Todas las construcciones se digirieron ulteriormente con HindIII y NotI, se sub-clonaron en el vector pREP7 digerido con HindIII/NotI, y se utilizaron para transfectar células 293 EBNA. 5

Aproximadamente 48 horas después de la transfección, las células se marcaron o bien metabólicamente con Pro-mixTM como se ha descrito arriba, o se privaron de alimento en medio exento de suero durante 2 días. Se recogió luego el medio y se utilizó en los experimentos subsiguientes. Como se puede ver por las Figs. 27A-B, VEGF-C de tipo salvaje (ts), VEGF-C NHis y VEGF-C NCHis se expresaban a nive-10 les similares en las células 293 EBNA. Al mismo tiempo, la expresión del polipéptido 4G de VEGF-C era considerablemente menor, debido posiblemente a la conformación modificada y la estabilidad reducida del producto traducido. Sin embargo, todas las variantes de VEGF-C anteriores eran secretadas por las células (compárense Figs. 27A y 27B). Los medios acondicionados de las células transfectadas y privadas de 15 alimento se concentraron al quíntuplo y se utilizaron para evaluar su capacidad para estimular la fosforilación de la tirosina de Flt4 (VEGFR-3) expresada en células NIH 3T3 y KDR (VEGFR-2) expresada en células PAE.

Las Figs. 28A-B muestran que VEGF-C de tipo salvaje (ts), así como la totalidad de los tres polipéptidos mutantes, estimulan la fosforilación de la tirosina de VEGFR-3. 20 La estimulación más destacada tiene lugar por la VEGF-C NCHis corta madura. Este mutante, así como VEGF-C NHis, estimulaba también la fosforilación de la tirosi-na de VEGFR-2. Así pues, a pesar del hecho de que un componente principal de la VEGF-C recombinante secretada es un dímero de 32/29 kD, la parte activa de VEGF-C responsable de su fijación a VEGFR-3 y VEGFR-2 está localizada entre los aminoá-25 cidos 102 y 226 (SEQ ID NO: 33) del precursor de VEGF-C. El análisis y la compara-ción de las propiedades de fijación y actividades biológicas de estas proteínas VEGF-C y variantes, utilizando ensayos tales como los descritos en esta memoria, proporcio-narán datos concernientes a la significación de las formas procesadas 32/29 kD y 21-23 kD de VEGF-C principales observadas. Los datos indican que construcciones que 30 codifican los residuos de aminoácidos 103-225 del precursor de VEGF-C (SEQ ID NO: 33) generan un ligando recombinante que es funcional tanto para VEGFR-3 como para VEGFR-2.

Los datos de este ejemplo y los ejemplos precedentes demuestran que numero-sos fragmentos del polipéptido VEGF-C retienen actividad biológica. Se ha demostra-35

do que un polipéptido VEGF-C existente naturalmente que abarca los aminoácidos 103-226 (o 103-227) de SEQ ID NO: 33, producido por una escisión de procesamiento natural que define el término C, es activo. El Ejemplo 27 demuestra que un fragmento con los residuos 104-213 de SEQ ID NO: 33 retiene actividad biológica.

Adicionalmente, los datos del Ejemplo 21 demuestran que un polipéptido VEGF-5 C que tiene su término amino en la posición 112 de SEQ ID NO: 33 retiene actividad. Experimentos adicionales han demostrado que un fragmento que carece de los resi-duos 1-112 de SEQ ID NO: 33 retiene actividad biológica.

En un experimento afín, se utilizó un codón de parada en sustitución de la lisina en la posición 214 de SEQ ID NO: 33 (SEQ ID NO: 32, nucleótidos 991-993). El po-10 lipéptido recombinante resultante era capaz todavía de inducir la autofosforilación de Flt4, lo que indica que un polipéptido que abarca los residuos de aminoácidos 113-213 de SEQ ID NO: 33 es biológicamente activo.

Comparaciones de secuencia de miembros de la familia de polipéptidos VEGF proporcionan una indicación de que fragmentos todavía más pequeños del polipéptido 15 representado en SEQ ID NO: 33 retendrán actividad biológica. En particular, ocho re-siduos cisteína altamente conservados de la familia de polipéptidos VEGF definen una región de los residuos 131-211 de SEQ ID NO: 33 (véase Figura 31) de importancia evolutiva; por consiguiente, se espera que un polipéptido que abarca desde aproxima-damente el residuo 131 a aproximadamente el residuo 211 retenga actividad biológica 20 de VEGF-C. De hecho, se postula que un polipéptido que retiene el motivo conservado RCXXCC (v.g., un polipéptido que comprende desde aproximadamente el residuo 161 a aproximadamente el residuo 211 de SEQ ID NO: 3 retiene actividad biológica de VEGF-C. Para mantener la conformación nativa de estos fragmentos, puede ser prefe-rible retener aproximadamente 1-2 aminoácidos adicionales en el término carboxi y 1-2 25 o más aminoácidos en el término amino.

Aparte de las consideraciones que anteceden, existen pruebas de que fragmen-tos más pequeños y/o variantes de fragmentos que carecen de las cisteínas conserva-das retendrán sin embargo actividad biológica de VEGF-C.

Ejemplo 29 30

La expresión de VEGF-C humana bajo el promotor K14 de queratina humano en ratones transgénicos induce una

proliferación abundante de vasos linfáticos en la piel

La tirosina-quinasa receptora Flt4 se expresa de modo relativamente específico en los endotelios de los vasos linfáticos. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 35

92: 3566-3570 (1995). Adicionalmente, el factor de crecimiento VEGF-C estimula el receptor Flt4, mostrando menos actividad hacia el receptor KDR de los vasos sanguí-neos (Joukov et al., EMBO J., 15: 290-298 (1996); véase el Ejemplo 26).

Se realizaron experimentos en ratones transgénicos para analizar los efectos específicos de la sobre-expresión de VEGF-C en los tejidos. El promotor K14 de que-5 ratina humano es activo en las células basales de los epitelios escamosos estratifica-dos (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 1563-1567 (1989)) y se utilizó como el elemento de control de la expresión en el transgén VEGF-C recombinante. El vector que contiene el promotor de queratina K14 se describe en Vassar et al., Genes Dev., 5: 714-727 (1991) y Nelson et al., J. Cell Biol. 97: 244-251 (1983). 10

El transgén de VEGF-C recombinante se construyó utilizando el cDNA de VEGF-C humana de longitud total (GenBank Acc. No. X94216). Esta secuencia se cortó de un vector pCI-neo (Promega) con XhoI/NotI, y se aisló el fragmento de 2027 pares de bases resultante que contenía el marco de lectura abierto y el codón de parada (nu-cleótidos 352-1611 de SEQ ID NO: 32). El fragmento aislado se sometió luego a una 15 reacción de relleno de los extremos utilizando el fragmento Klenow de DNA-polimerasa. El fragmento romo se ligó luego a un sitio de restricción BamHI abierto análogamente en el vector K14. La construcción resultante contenía el sitio EcoRI de-rivado del polienlazador del vector pCI-neo. este sitio EcoRI se eliminó utilizando técnicas estándar (una reacción de rellenado mediada por Klenow después de diges-20 tión parcial del compuesto intermedio recombinante con EcoRI) para facilitar la esci-sión subsiguiente del fragmento de DNA para su inyección en oocitos de ratón fertilizados. El clon resultante, designado K14-VEGF-C se ilustra en Fig. 20.

El fragmento EcoRI-HindIII del clon K14-VEGF-C que contenía el promotor K14, cDNA de VEGF-C, y la señal de poliadenilación de K14 se aisló y se inyectó en oocitos 25 fertilizados de la variedad de ratón FVB-NIH. Los cigotos inyectados se transplantaron a oviductos de ratones híbridos pseudopreñados C57BL/6 x DBA/2J. Los ratones fun-dadores resultantes se analizaron en cuanto a la presencia del transgén por la reac-ción en cadena de la polimerasa de DNA de cola utilizando los iniciadores: 5'-CATGTACGAACCGCCAG-3' (SEQ ID NO: 49) y 5'-AATGACCAGAGAGAGGCGAG-3' 30 SEQ ID NO: 50). Adicionalmente, los DNAs de cola se sometieron a digestión con EcoRV y análisis Southern subsiguiente utilizando el fragmento EcoRI-HindIII inyecta-do en los ratones. De 8 crías analizadas a las tres semanas de edad, dos eran positi-vas, teniendo aproximadamente 40-50 copias y 4-6 copias del transgén en sus genomas respectivos. 35

El ratón con el mayor número de copias del transgén era pequeño, se desarro-llaba más lentamente que sus hermanos de camada y tenía dificultad para comer (es decir, succionar). Un examen ulterior demostró un hocico rojo hinchado y pelo deficien-te. Aunque se alimentó con una dieta líquida especial, sufría edema de los tractos res-piratorio superior y digestivo después de la alimentación y tenía dificultades 5 respiratorias. Este ratón murió ocho semanas después del nacimiento y se procesó inmediatamente para histología, inmunohistoquímica, e hibridación in situ.

El examen histológico demostró que en comparación con la piel de los herma-nos de camada, la dermis dorsal de los ratones transgénicos K14-VEGF-C era atrófica y el tejido conectivo estaba reemplazado por grandes lagunas desprovistas de células 10 rojas, y no revestidas con una capa endotelial delgada (flechas blancas en Figs. 29A-D). Estas estructuras distendidas semejantes a vasos se asemejaban a las observa-das en los linfangiomas humanos. El número de órganos anexos a la piel y folículos pilosos era reducido. En la región del hocico, se apreciaba también un número incre-mentado de vasos. Por consiguiente, la sobre-expresión de VEGF-C en la epidermis 15 basal es capaz de promover el crecimiento de una estructura extensa de vasos en la piel subyacente, con inclusión de grandes lagunas vasculares. Las células endoteliales que rodean estas lagunas contenían mRNA de Flt4 abundante en la hibridación in situ (véanse los Ejemplos 23 y 30 para la metodología). La morfología de los vasos indica que VEGF-C estimula el crecimiento de vasos que tienen características de vasos 20 linfáticos. El otro ratón transgénico K14-VEGF-C tenía una histopatología similar de la piel.

Los datos in vivo que anteceden indican utilidades a la vez para (i) polipéptidos VEGF-C y variantes polipeptídicas que tienen actividad biológica de VEGF-C, y (ii) anticuerpos anti-VEGF-C y antagonistas de VEGF-C que inhiben la actividad de 25 VEGF-C (v.g., por fijación de VEGF-C o interferencia con las interacciones VEGF-C/receptor. Por ejemplo, los datos indican una utilidad terapéutica para los polipéptidos VEGF-C en pacientes en los cuales puede ser deseable el crecimiento de tejido linfáti-co (v.g., en pacientes después de cirugía de cáncer de mama u otra cirugía en la cual ha sido eliminado tejido linfático y en la cual el drenaje linfático se ha puesto por con-30 siguiente en compromiso, dando como resultado hinchamiento; o en pacientes que sufren elefantiasis). Los datos indican una utilidad terapéutica para sustancias de anti-cuerpos anti-VEGF-C y antagonistas de VEGF-C para condiciones en las cuales pue-de ser deseable la inhibición del crecimiento de tejido linfático (v.g., el tratamiento de los linfangiomas). 35

Ejemplo 30 Expresión de VEGF-C y Flt4 en el Ratón en Desarrollo

Se prepararon embriones de un ratón preñado de 16 días post-coito y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4%, se embebieron en parafina, y se seccionaron a 6 m. Las secciones se pusieron sobre portaobjetos de microscopio silanados y se tra-5 taron con xileno, se rehidrataron, se fijaron durante 20 minutos en PFA al 4%, se trata-ron con proteinasa K (7 mg/ml; Merck, Darmstadt, Alemania) durante 5 minutos a la temperatura ambiente, se fijaron de nuevo en PFA al 4% y se trataron con anhídrido acético, se deshidrataron en soluciones con concentraciones crecientes de etanol, se secaron y se utilizaron para hibridación in situ. 10

La hibridación in situ de las secciones se realizó como ha sido descrito (Västrik et al., J. Cell Biol., 128: 1197-1208 (1995)). Se generó una sonda de RNA antisentido de VEGF-C de ratón a partir del plásmido pBluescript II SK+ linealizado (Stratagene, Inc.), que contenía un fragmento correspondiente a los nucleótidos 499-979 de cDNA de VEGF-C de ratón, donde la región no codificante y la repetición BR3P se separaron 15 por tratamiento con Exonucleasa III. El fragmento se había clonado en los sitios EcoRI y HindIII de pBluescript II SK+. El RNA radiomarcado se sintetizó utilizando RNA-polimerasa T7 y [35S]-UTP (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido). Se aplicaron aproximadamente 2 millones de cpm de la sonda de VEGF-C por portaobjetos. Des-pués de hibridación durante una noche, los portaobjetos se lavaron primeramente en 20 2x SSC y DTT 20-30 mM durante 1 hora a 50ºC. El tratamiento se continuó con un lavado de alta severidad, 4x SSC y DTT 20 mM y formamida desionizada al 50% du-rante 30 minutos a 65ºC seguido por tratamiento con RNasa A (20 g/ml) durante 30 minutos a 37ºC. El lavado de alta severidad se repitió durante 45 minutos. Por último, los portaobjetos se deshidrataron y se secaron durante 30 minutos a la temperatura 25 ambiente. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión fotográfica y se expusieron durante 4 semanas. Los portaobjetos se revelaron utilizando revelador Kodak D-16, se sometieron a contratinción con hematoxilina y se montaron con Permount (Fisher-Chemical).

Para las hibridaciones in situ de las secuencias Flt4, se utilizó un fragmento de 30 cDNA de Flt4 de ratón que abarcaba los pares de bases 1-192 de la secuencia publi-cada (Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293-2298 (1993)), y se siguió el protocolo arriba descrito, con las excepciones siguientes. Se aplicaron a cada portaobjetos aproxima-damente un millón de cpm de la sonda de Flt4 s. Los lavados severos después de la hibridación se realizaron en 1x SSC y DTT 30 mM durante 105 minutos. 35

La figura muestra fotomicrografías de las secciones hibridadas en microscopía de campo oscuro (Figs. 36A-C) y microscopía de campo claro (Fig. 36D). Los aumen-tos utilizados para la fotografía eran 4x para Figs. 36A-B y 10x para Figs. 36C-D. Las secciones transversales representadas son de la región cefálica y las áreas represen-tadas para VEGF-C y Flt4 están separadas aproximadamente 14 secciones, estando 5 localizada Flt4 más cranealmente en el embrión. En Fig. 36A (sonda de Flt4), la cavi-dad nasofaríngea en desarrollo se encuentra en la línea media en la parte superior posterior; en la parte anterior de Fig. 36A se encuentra el hocico con los folículos fibri-sales emergentes y, en la línea media, la cavidad nasal en formación. A ambos lados, el pigmento retinal da una señal positiva falsa en microscopía de campo oscuro. Las 10 estructuras de hibridación de Flt4 más destacadas parecen corresponder al endotelio linfático y venoso en desarrollo. Obsérvese que una estructura vascular endotelial se-mejante a un plexo rodea la membrana mucos nasofaríngea en desarrollo. En Fig. 36B, la señal más destacada se obtiene de la parte posterior de los cornetes nasales en desarrollo, que con mayor aumento (Figs. 36C-D) muestran el epitelio que rodea el 15 tejido conectivo suelto y el cartílago en formación. Esta estructura proporciona una señal fuerte de hibridación in situ para VEGF-C. Asimismo en Fig. 36B, pueden verse áreas de hibridación más débiles alrededor del hocico, aunque esta señal tiene un aspecto mucho más homogéneo. Así pues, la expresión de VEGF-C es llamativamen-te alta en los cornetes nasales en desarrollo. 20

Los cornetes están rodeados con un plexo vascular rico, importante en fisiología nasal como fuente para el mucus producido por las células epiteliales y para calenta-miento del aire inhalado. Se sugiere que VEGF-C es importante en la formación del plexo venoso de los cornetes en las membranas mucosas, y que el mismo puede re-gular también la permeabilidad de los vasos necesaria para la secreción de moco na-25 sal. Posiblemente, VEGF-C y sus derivados y antagonistas podrían utilizarse en la regulación de la turgencia del tejido de los cornetes y de las membranas mucosas y por consiguiente del diámetro del tracto respiratorio superior, así como de la cantidad y calidad del moco producido. Estos factores tienen una gran importancia clínica en en-fermedades inflamatorias (con inclusión de las alérgicas) e infecciosas del tracto respi-30 ratorio superior. De acuerdo con ello, la invención contempla el uso de los materiales de la invención, en métodos de diagnóstico y tratamiento de afecciones inflamatorias e infecciosas que afectan al tracto respiratorio superior, con inclusión de las estructuras nasales.

Ejemplo 31

Caracterización de la organización exón-intrón

del gen de VEGF-C humana

Dos clones de DNA genómico que abarcaban los exones 1, 2, y 3 del gen de VEGF-C humana se aislaron de una genoteca de DNA genómico humana utilizando 5 fragmentos de cDNA de VEGF-C como sondas. En particular, se escrutó una genoteca genómica humana en el bacteriófago EMBL-3 lambda (Clontech) utilizando un frag-mento generado por PCR correspondiente a los nucleótidos 629-746 del cDNA de VEGF-C humana (SEQ ID NO: 32). Se identificó un clon positivo, designado "lambda 3", , y la inserción se subclonó como un fragmento XhoI de 14 kb en el vector pBSKII 10 (Stratagene). La genoteca genómica se escrutó también con un fragmento NotI-SacI marcado de 130 pares de bases a partir de la región 5' no codificante del cDNA de VEGF-C (el sitio NotI se encuentra en el polienlazador del vector de clonación; el sitio SacI corresponde a los nucleótidos 92-97 de SEQ ID NO: 32). Se obtuvieron dos clo-nes positivos, designados "lambda 5" y "lambda 8". El análisis por mapeado de restric-15 ción demostró que el clon lambda 3 contiene los exones 2 y 3, mientras que el clon lambda 5 contiene el exón 1 y la región promotora supuesta.

Tres fragmentos genómicos que contenían los exones 4, 5, 6, y 7 se subclonaron a partir de un clon plasmídico genómico de VEGF-C P1. En particular, se utilizó DNA purificado procedente de un clon plasmídico genómico de P1 7660 (Paavonen et al., 20 Circulation, 93: 1079-1082 (1996)). Fragmentos EcoRI del DNA de la inserción P1 se ligaron al vector pBSKII. Subclones del clon 7760 que contenían secuencias homólo-gas de cDNA de VEGF-C humana se identificaron por hibridación de colonias, utilizan-do el cDNA de VEGF-C de longitud total como sonda. Se identificaron y aislaron tres fragmentos genómicos diferentes, que contenían los exones 4-7 restantes. 25

Para determinar la organización genómica, los clones se mapearon utilizando escisión con endonucleasas de restricción. Asimismo, se secuenciaron parcialmente las regiones codificantes y las uniones exón-intrón. El resultado de este análisis se representa en las Figuras 11 y 17. Las secuencias de todos los límites intrón-exón (Fig. 17, SEQ ID NOs: 57 y 68) se conformaban a las señales de corte y empalme de 30 consenso (Mount, et al., Nucl. Acids Res., 10: 459-472 (1982). La longitud del intrón entre los exones 5 y 6 se determinó directamente por secuenciación de nucleótidos y se encontró que era 301 pb. La longitud del intrón entre los exones 2 y 3 se determinó por mapeado de restricción e hibridación Southern, y se encontró que era aproxima-damente 1,6 kb. Cada uno de los otros intrones tenía una longitud mayor que 10 kb. 35

Se realizó un análisis similar para el gen de VEGF-C genómico de murino. Las secuencias de los límites intrón-exón de VEGF-C de murino se representan en la Figu-ra 17 (SEQ ID NOs: 69-80).

Los datos de mapeado de restricción y secuenciación indicaban que la secuen-cia de señal y los primeros residuos del propéptido N-terminal son codificados por el 5 exón 1. El segundo exón codifica la porción carboxi-terminal del propéptido N-terminal y el término amino del dominio de homología de VEGF. Las secuencias más conser-vadas del dominio de homología de VEGF están distribuidas en los exones 3 (que con-tiene 6 residuos cisteína conservados) y 4 (que contiene 2 residuos cys). Los exones restantes codifican motivos ricos en cisteína del tipo C-6X-C-10X-CRC (exones 5 y 7) 10 y un motivo repetido 5 veces de tipo C-6X-B-3X-C-C-C, que es típico de una proteína de seda.

Para caracterizar adicionalmente el promotor del gen de VEGF-C, se analizó ulteriormente el clon lambda 5. El mapeado de restricción de este clon utilizando una combinación de digestiones simples y dobles e hibridaciones Southern indicó que el 15 mismo incluye: (1) una región de aproximadamente 5 kb aguas arriba del codón ATG iniciador supuesto, (2) el exón 1, y (3) parte del intrón I del gen de VEGF-C.

Un fragmento XbaI de 3,7 kb del clon lambda 5, que contenía el exón 1 y se-cuencias flanqueantes 5' y 3', se subclonó y se analizó ulteriormente. Como se ha consignado con anterioridad, una banda principal de mRNA de VEGF-C migra a una 20 posición de aproximadamente 2,4 kb. Calculando a partir de la secuencia codificante de VEGF-C de 1257 pb y una secuencia no codificante 3' de 391 pb más una secuen-cia poliA de aproximadamente 50-200 pb, el sitio de iniciación del mRNA debería estar localizado aproximadamente 550-700 pb aguas arriba del codón de iniciación de la traducción. 25

Para caracterizar adicionalmente el promotor del gen de VEGF-C humana, se aisló un clon genómico que abarcaba aproximadamente 1,4 kb aguas arriba del sitio de iniciación de la traducción, y se secuenciaron la secuencia de cDNA 5' no codifican-te y la región promotora supuesta. la secuencia obtenida se expone en SEQ ID NO: 54. Análogamente a lo que se ha observado con el gen de VEGF, el promotor VEGF-C 30 es rico en residuos G y C y carece de las secuencias de consenso TATA y CCAAT. En lugar de ello, posee numerosos sitios de fijación supuestos para Sp1, una proteína nuclear ubicua que puede iniciar la transcripción de genes sin TATA. Véase Pugh y Tjian, Genes and Dev., 5: 105-119 (1991). Adicionalmente, se encontraron secuencias aguas arriba del sitio de comienzo de la traducción de VEGF-C que contenían sitios de 35

fijación de consenso frecuentes para el factor AP-2. Esto sugiere que la proteína-quinasa dependiente de cAMP y la proteína-quinasa C, como activadores del factor de transcripción AP-2 [Curran y Franza, Cell, 55: 395-397 (1988)], median la regulación de la transcripción de VEGF-C.

El gen de VEGF-C se expresa abundantemente en tejidos humanos adultos, 5 tales como corazón, placenta, ovario e intestino delgado, y es inducido por una diver-sidad de factores. De hecho, varios sitios de fijación potenciales para reguladores de la expresión de genes específicos de tejidos, como NFkB y GATA, están localizados en la parte distal del promotor de VEGF-C. Por ejemplo, se sabe que NFkB regula la ex-presión del factor tisular en las células endoteliales. Asimismo, se cree que factores de 10 transcripción de la familia GATA regulan la expresión génica específica del tipo de célula.

Al contrario que VEGF, el gen de VEGF-C no contiene un sitio de fijación para el factor inducible por hipoxia, HIF-1 (Levy et al., J. Biol. Chem., 270: 13333-13340 (1995)). Este descubrimiento sugiere que si el mRNA de VEGF-c está regulado por 15 hipoxia, el mecanismo podría basarse principalmente en la regulación de la estabilidad del mRNA. A este respecto, numerosos estudios han demostrado que el punto de con-trol principal para la inducción hipóxica del gen de VEGF es la regulación del nivel de estado estacionario de mRNA. Véase Levy et al., J. Biol. Chem., 271: 2746-2753 (1996)). Se considera que la tasa relativa de estabilidad y degradación del mRNA de 20 VEGF está determinada por la presencia de motivos de secuencia específicos en su región 3' no traducida (UTR), que se ha demostrado regulan la estabilidad del mRNA (Chen y Shyu, Mol. Cell Biol., 14: 8471-8482 (1994)). La región 3'-UTR del gen de VEGF-C contiene también un motivo supuesto de este tipo (TTATTT), en las posicio-nes 1873-1878 de SEQ ID NO: 32. 25

Ejemplo 32

Identificación de una variante de corte

y empalme de VEGF-C

Como se ha consignado en el Ejemplo 16, pueden observarse un mRNA princi-pal de VEGF-C de 2,4 kb y cantidades menores de un mRNA de 2,0 kb. Para clarificar 30 el origen de estos RNAs, se aislaron y caracterizaron varios cDNAs de VEGF-C adi-cionales. Una genoteca de cDNA de fibrosarcoma humano de células HT1080 en el vector lambda gt11 (Clontech, producto #HL1048b) se escrutó utilizando un fragmento de cDNA de VEGF-C humana de 153 pb como sonda, como se describe en el Ejemplo 10. Véase también Joukov et al., EMBO J., 15: 290-298 (1996). Se seleccionaron nue-35

ve clones positivos y se analizaron por amplificación PCR utilizando los oligonucleóti-dos 5'-CACGGCTTATGCAAGCAAAG-3' (SEQ ID NO: 55) y 5'-AACACAGTTTTCCATAATAG-3' (SEQ ID NO: 56). Estos oligonucleótidos se seleccio-naron para amplificar la porción del cDNA de VEGF-C correspondiente a los nucleóti-dos 495-1661 de SEQ ID NO: 32. La PCR se realizó utilizando una temperatura de 5 reasociación de 55ºC y 25 ciclos.

Los productos PCR resultantes se sometieron a electroforesis en geles de aga-rosa. Cinco clones de los nueve analizados generaban fragmentos PCR de la longitud esperada de 1147 pares de bases, mientras que uno era ligeramente más corto. El fragmento más corto y uno de los fragmentos de la longitud esperada se clonaron al 10 vector pCRTMII (Invitrogen) y se analizaron por secuenciación. La secuencia reveló que el fragmento PCR más corto tenía una deleción de 153 pares de bases, corres-pondiente a los nucleótidos 904 a 1055 de SEQ ID NO: 32. Estas bases delecionadas corresponden al exón 4 de los genes de VEGF-C humana y de ratón, representados esquemáticamente en Fig. 17. La deleción del exón 4 da como resultado un despla-15 zamiento del marco, que conduce a su vez a una truncación C-terminal del precursor de VEGF-C de longitud total, con 15 residuos de aminoácidos traducidos desde el exón 15 en un marco diferente del marco utilizado para expresar la proteína de longi-tud total. Así pues, la secuencia de aminoácidos C-terminal del polipéptido truncado resultante sería --Leu (181)-Ser-Lys-Thr-Val-Ser-Gly-Ser-Glu-Gln-Asp-Leu-Pro-His-20 Glu-Leu-His-Val-Glu (199) (SEQ ID NO: 81). La variante de VEGF-C codificada por esta variante de corte y empalme no contendría el sitio de escisión C-terminal del pre-cursor de VEGF-C. Así, una forma de RNA supuesta obtenida alternativamente por corte y empalme que carecía del exón 4 conservado se identificó en células de fibro-sarcoma HT-1080, y se predice que esta forma codifica una proteína de 199 residuos 25 de aminoácidos, que podría ser un antagonista de VEGF-C.

Ejemplo 33

VEGF-C se procesa análogamente en diferentes

cultivos de células in vitro

Para estudiar si VEGF-C se procesa análogamente en tipos de células diferen-30 tes, células 293 EBNA, células COS-1 y células HT-1080 se transfectaron con cDNA de VEGF-C humana de tipo salvaje y se marcaron con Pro-MixTM como se describe en el Ejemplo 22. Los medios acondicionados de los cultivos se recogieron y se sometie-ron a inmunoprecipitación utilizando antisuero 882 (descrito en el Ejemplo 21, que re-conoce un péptido correspondiente a los aminoácidos 104-120 de SEQ ID NO: 33). 35

Los polipéptidos inmunoprecipitados se separaron por SDS-PAGE, y se detectaron por autorradiografía. La forma principal de VEGF-C recombinante secretada observada de todas las líneas de células ensayadas es un doblete de 29/32 kD. Estos dos polipépti-dos están unidos uno a otro por enlaces disulfuro, como se describe en el Ejemplo 22. Una banda menos destacada de aproximadamente 21 kD se detectó también en el 5 medio de cultivo. Adicionalmente, se observó un precursor de VEGF-C no procesado de 63 kDa. Esta forma era más destacada en las células COS-1, lo que sugiere que el procesamiento proteolítico de VEGF-C en las células COS es menos eficiente que en las células 293 EBNA. El VEGF-C endógeno (en las células no transfectadas) no era detectable en estas condiciones experimentales en las células HT-1080, pero se de-10 tectaba fácilmente en el medio acondicionado de las células PC-3. El análisis de los tamaños y relaciones de los polipéptidos subunitarios en las células PC3 y las células 293 EBNA reveló resultados llamativamente similares: la forma más destacada era un doblete de 29/32 kDa y una forma menos destacada el polipéptido de 21 kD. La forma de 21 kD producida por las células 293 EBNA no era reconocida por el anticuerpo 882 15 en la transferencia Western, aunque es reconocida cuando se utiliza el mismo anti-cuerpo para inmunoprecipitación (véanse los datos en los ejemplos anteriores). Como se ha consignado en el Ejemplo 21, la escisión de la forma de 32 kD en las células 293 EBNA ocurre entre los residuos de aminoácidos 111 y 112 (SEQ ID NO: 33), aguas abajo del sitio de escisión en las células PC-3 (entre los residuos 102 y 103). Por con-20 siguiente, la forma de 21 kD producida en las células 293 EBNA no contiene el péptido N-terminal completo utilizado para generar el antisuero 882.

En un experimento afín, se cultivaron células PC-3 en medio exento de suero durante periodos de tiempo variables (1-8 días) antes del aislamiento del medio acon-dicionado. El medio acondicionado se concentró utilizando un dispositivo Centricon 25 (Amicon, Beverly, EE.UU.) y se sometió a análisis por transferencia Western utilizando el antisuero 882. Después de un día de cultivo, se detectó una banda destacada de 32 kD. Se detectaron cantidades crecientes de una forma de 21-23 kD en el medio acon-dicionado a partir de cultivos de 4 días y de 8 días. La naturaleza difusa de esta banda polipeptídica, que se denomina simplemente el polipéptido de 23 kD en el Ejemplo 5 y 30 en varios ejemplos subsiguientes, se debe muy probablemente a una cantidad hete-rogénea y variable de glicosilación. Estos resultados indican que, inicialmente, las células secretan un polipéptido de 32 kD, que es procesado o escindido ulteriormente en el medio para dar la forma de 21-23 kD. La microheterogeneidad de esta banda polipeptídica se debería por tanto al grado de glicosilación variable, y a la microhetero-35

geneidad de los sitios de escisión del procesamiento, tales como los obtenidos para el término amino en los cultivos de células PC-3 y 293 EBNA. El sitio de escisión del terminal carboxilo podría variar también, y ejemplos de posibles sitios de escisión se encontrarían entre los residuos 225-226, 226-227 y 227-228 así como entre los resi-duos 216-217. Tomados en su conjunto, estos datos sugieren la posibilidad de que 5 una o más proteasas celulares secretadas sean responsables de la generación de la forma de 21-23 kD de VEGF-C a partir del polipéptido de 32 kD. Tales proteasas podr-ían utilizarse in vitro para escindir las proteínas precursoras de VEGF-C en solución durante la producción de VEGF-C, o utilizarse en cultivo de células e in vivo para libe-rar VEGF-C biológicamente activa. 10

Ejemplo 34

Fijación diferencial de las formas de VEGF-C por los

dominios extracelulares de VEGFR-3 y VEGFR-2

En dos experimentos paralelos, se transfectaron células 293 EBNA con una construcción que codificaba VEGF-C recombinante de tipo salvaje o una construcción 15 que codificaba VEGF-C DNDCHis (Ejemplo 28) y aproximadamente 48 horas después de la transfección, se marcaron metabólicamente con Pro-MixTM como se describe en los ejemplos anteriores. Los medios se recogieron a partir de células transfectadas falsamente y transfectadas y se utilizaron para análisis de fijación de receptores.

La fijación de receptores se llevó a cabo en tampón de fijación (PBS, BSA al 20 0,5%, Tween 20 al 0,02%, 1 microgramo/ml de heparina) que contenía aproximada-mente 0,2 microgramos de (a) una proteína de fusión que comprendía un dominio ex-tracelular de VEGFR-3 fusionado a una secuencia de inmunoglobulina (VEGFR-3-Ig) o (b) una proteína de fusión que comprendía el dominio extracelular de VEGFR-2 fusio-nado a una secuencia de fosfatasa alcalina (VEGF-R-2-AP; Cao et al., J. Biol. Chem. 25 271: 3154-62 (1996)). Como control, partes alícuotas similares del medio acondiciona-do de 293 EBNA se mezclaron con 2 l de antisuero anti-VEGF-C (VEGF-C IP).

Después de incubación durante 2 horas a la temperatura ambiente, los anticuer-pos anti-VEGF-C y la proteína VEGFR-3-Ig se adsorbieron en proteína A-Sepharose (PAS) y se inmunoprecipitó VEGFR-2-AP utilizando anticuerpos monoclonales anti-AP 30 (Medix Biotech, Genzyme Diagnostics, San Carlos, CA, EE.UU.) y proteína G-Sepharose. Los complejos que contenían VEGF-C unida a VEGFR-3-Ig o VEGFR-2-AP se lavaron tres veces en tampón de fijación, dos veces en Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) y los inmunoprecipitados de VEGF-C se lavaron tres veces en tampón RIPA y dos veces en Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) y se analizaron por SDS-PAGE en condiciones re-35

ductoras y no reductoras. Como control, se precipitaron los mismos medios con anti-AP y proteína G-Sepharose (PGS) o con PAS para controlar la posible adsorción ines-pecífica.

Estos experimentos revelaron que VEGFR-3 se fijaba tanto a la forma de 32/29 kD como a la forma de 21-23 kD de VEGF-C recombinante, mientras que VEGFR-2 se 5 fijaba preferentemente al componente de 21-23 kD de los medios acondicionados. Adicionalmente, se observó que pequeñas cantidades de formas de 63 kD y 52 kD de VEGF-C se fijaban con VEGFR-3. El análisis ulterior en condiciones no reductoras indica que una gran proporción de la VEGF-C de 21-23 kD fijada a cualquier receptor no contiene enlaces disulfuro intercatenarios. Estos descubrimientos refuerzan los 10 resultados de que VEGF-C se fija a VEGFR-2. Estos datos sugieren una utilidad para formas recombinantes de VEGF-C que son activas para VEGFR-3 únicamente o que son activas tanto para VEGFR-3 como para VEGFR-2. Por otra parte, estos resulta-dos, junto con los resultados del Ejemplo 28, no eliminan la posibilidad de que el díme-ro de 32/29 kD se fije a VEGFR-3 pero no lo active. El fallo del dímero de 32/29 kD en 15 lo que respecta a la activación de VEGFR-3 podría explicar el descubrimiento de que el medio acondicionado de las células transfectadas N-His de VEGF-C inducía una fosforilación de la tirosina de VEGFR-3 menos destacada que el medio obtenido a par-tir de las células transfectadas DNDCHis de VEGF-C, aun cuando la expresión del primer polipéptido era mucho mayor (véanse Figs. 27 y 28). Las variantes estables del 20 polipéptido VEGF-C que se fijan a un receptor de VEGF-C pero fallan en lo que res-pecta a la activación del receptor son útiles como antagonistas de VEGF-C.

Depósito de los Materiales Biológicos: el plásmido FLT4-L ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 2301 Parklawn Dr., Rockville MD 20952 (EE.UU.), conforme a las provisiones del Tratado de Budapest, y le ha sido asignada 25 una fecha de depósito de 24 de julio de 1995 y el número de acceso ATCC 97231.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE: Helsinki University Licensing Ltd. Oy

(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Ligando de Receptores VEGF-C

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 81

(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A) DESTINATARIO: Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab

(B) CALLE: Iso Roobertinkatu 4-6 A

(C) CIUDAD: Helsinki

(E) PAÍS: Finlandia

(F) CÓDIGO POSTAL: 00120

(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version

#1.30

(vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD:

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C) CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/671.573

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 junio 1996

(vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/601.132

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 febrero 1996

(vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/585.895

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 enero 1996

(vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/510.133

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 agosto 1995

(viii) INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

(A) NOMBRE: Karvinen, Leena

(C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 28999

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A) TELÉFONO:+358 0 648 606

(B) TELEFAX: +358 0 640 575

(C) TÉLEX: 123505 JALO FI

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 70 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 33 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 17 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 34 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 40 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 60 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 34 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 17 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 5 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 5 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

imagen1

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 8 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 219 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUECIA: SEQ ID NO:26:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1997 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 352..1608

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

imagen1

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 419 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

imagen1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 4416 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 4273 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

imagen1

imagen1

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 216 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 17 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1836 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 168..1412

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

imagen1

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 415 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 65 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 84 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 93 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 10 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1741 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 453..1706

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 418 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1582 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:61:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:62:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:64:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:65:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:67:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:68:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:70:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 26 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:71:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 71: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:72:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:73:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:74:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 25 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:75:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:76:

imagen1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 26 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:77:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:78:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 16 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:79:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:

imagen1

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:80:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

imagen1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:81:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CLASE DE CADENA: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

imagen1

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:

________________

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES
2. 1.- Un polipéptido purificado y aislado que es capaz de fijarse a la tirosina-quinasa receptora Flt4 (Flt4), con una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 103-282 de SEQ ID NO: 33, en el cual dicho polipéptido no incluye una 5 secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 94-419 de SEQ ID NO: 33 en la cual se ha utilizado un residuo Gln en sustitución del residuo Lys en la posi-ción 414 en SEQ ID NO: 33.
3. 2.- Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 con una secuencia de ami-noácidos que consiste en los residuos de aminoácidos 103-282 de SEQ ID NO: 33. 10
4. 3.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, con una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos 103-419 de SEQ ID NO: 33, o que incluye los residuos de aminoácidos 103-419.
5. 4.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 29-32 kD como se determina 15 por SDS-PAGE en condiciones reductoras.
6. 5.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo capaz dicho polipéptido de fijarse al dominio extra-celular de la tirosina-quinasa receptora Flt4 (Flt4), y que puede purificarse a partir de medio acondicionado de una línea de células de adenocarcinoma prostático PC-3, teniendo dicha línea de células el 20 número de acceso ATCC CRL 1435, utilizando un procedimiento de purificación por afinidad en el cual la matriz de purificación por afinidad comprende un polipéptido que contiene el dominio extra-celular de Flt4.
7. 6.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos amino-terminal como la expuesta en 25 SEQ ID NO: 13.
8. 7.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, capaz de fijarse a e inducir la autofosforilación de la tirosina del receptor VEGFR-2.
9. 8.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho polipéptido es capaz de estimular la fosforilación de la tirosina de Flt4 en 30 una célula hospedadora que expresa Flt4.
10. 9.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho polipéptido es capaz de fijarse al dominio extra-celular de Flt4.
11. 10.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende adicionalmente un marcador detectable. 35
12. 11.- Una proteína purificada que comprende un primer polipéptido enlazado a un segundo polipéptido, en la cual al menos uno de dicho primer polipéptido y dicho se-gundo polipéptido es un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y en la cual dicha proteína es capaz de fijarse a la tirosina-quinasa receptora Flt4 (Flt4). 5
13. 12.- Una proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en la cual dicho primer polipéptido está enlazado covalentemente a dicho segundo polipéptido.
14. 13.- Una proteína que comprende un primer polipéptido enlazado a un segundo polipéptido, en la cual cada uno de dicho primer polipéptido y dicho segundo polipépti-do es un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 10
15. 14.- Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo far-macéuticamente aceptable.
16. 15.- Una molécula de ácido nucleico purificada y aislada que comprende o con-15 siste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha molécula de ácido nucleico no es una molécula de cDNA con la secuencia de DNA expuesta en la entrada HS991157, número de acceso H07991.1, en la base de datos EMBL.
17. 16.- Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la 20 reivindicación 15.
18. 17.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 16, con una inserción codificante que comprende o consiste en una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la rei-vindicación 15.
19. 18.- Una célula hospedadora transfectada o transformada por un vector de 25 acuerdo con las reivindicaciones 16 a 17.
20. 19.- Un método de producción de un polipéptido o proteína capaz de fijarse es-pecíficamente a Flt4, comprendiendo dicho método los pasos de:

    a) expresar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en una 30 célula hospedadora, opcionalmente de acuerdo con la reivindicación 18, y

    b) purificar un polipéptido capaz de fijarse específicamente a Flt4 a partir de di-cha célula hospedadora o a partir de un medio de proliferación de dicha célula hospe-dadora.
21. 20.- Un método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende los pasos de:

    dejar proliferar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que incluye una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 33, en condiciones en las cuales la célula hospedadora expresa y se-5 creta un polipéptido codificado por el polinucleótido, y

    aislar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, a partir del me-dio de proliferación de la célula hospedadora.
22. 21.- Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el polipéptido ais-10 lado a partir del medio de proliferación de la célula hospedadora tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una porción de SEQ ID NO: 33 eficaz para fijar el do-minio extracelular de Flt4.
23. 22.- Un método de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en el cual dicho polinu-cleótido comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleó-15 tidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 33.
24. 23.- Un método de acuerdo con la reivindicación 20, 21 ó 22, en el cual dicha célula hospedadora comprende una célula de adenocarcinoma prostático PC-3 (núme-ro de acceso ATCC CRL 1435).
25. 24.- Un método para la detección de células endoteliales en un tejido biológico, 20 que comprende los pasos de:

    exponer un tejido biológico que comprende células endoteliales a un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en condiciones en las cuales dicho polipépti-do o dicha proteína se fija a las células endoteliales; y 25

    detectar dicho polipéptido o proteína fijado(a) a las células endoteliales en dicho tejido biológico, detectando con ello dichas células endoteliales.
26. 25.- Un método de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende adicional-mente el paso de lavar dicho tejido biológico, realizándose dicho paso de lavado des-pués de dicho paso de exposición y antes de dicho paso de detección. 30
27. 26.- Un método de modulación del crecimiento in vitro de células endoteliales de mamífero, que comprende los pasos de:

    exponer células endoteliales de mamífero a un polipéptido de acuerdo con cual-quiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 11-13, en una cantidad eficaz para modular el crecimiento de las célu-las endoteliales de mamífero.
28. 27.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, o una composi-ción farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, para uso en una aplicación dia-5 gnóstica o clínica.
29. 28.- Un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de acuerdo con la rei-vindicación 27, en donde dicha aplicación diagnóstica o clínica implica aceleración de la angiogénesis, la cuantificación de riesgo metastásico futuro, el tratamiento o la pre-vención de inflamación, edema, aplasia de los vasos linfáticos, obstrucción linfática, 10 elefantiasis y enfermedad de Milroy, estimulación de la producción y maduración de linfocitos, la promoción o inhibición del tráfico de leucocitos entre tejidos y vasos linfá-ticos, o la migración de entrada y salida del timo.
30. 29.- Un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de acuerdo con la rei-vindicación 27 ó 28, en donde el sujeto de la aplicación diagnóstica o clínica es un 15 humano.
31. 30.- Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13 o una com-posición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento para uso en una aplicación diagnóstica o clínica como se define en la 20 reivindicación 28.