ES2239529B1 - Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones.Info
- Publication number
- ES2239529B1 ES2239529B1 ES200400107A ES200400107A ES2239529B1 ES 2239529 B1 ES2239529 B1 ES 2239529B1 ES 200400107 A ES200400107 A ES 200400107A ES 200400107 A ES200400107 A ES 200400107A ES 2239529 B1 ES2239529 B1 ES 2239529B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hdac6
- cells
- tubulin
- cell
- lymphocytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102100022537 Histone deacetylase 6 Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 101000899330 Homo sapiens Histone deacetylase 6 Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- WWGBHDIHIVGYLZ-UHFFFAOYSA-N N-[4-[3-[[[7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl]amino]-oxomethyl]-5-isoxazolyl]phenyl]carbamic acid tert-butyl ester Chemical compound C1=CC(NC(=O)OC(C)(C)C)=CC=C1C1=CC(C(=O)NCCCCCCC(=O)NO)=NO1 WWGBHDIHIVGYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 89
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 160
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 45
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 41
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 33
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 210000003879 microtubule-organizing center Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 14
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims description 11
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 11
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 3
- 101100386910 Caenorhabditis elegans laf-1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100230661 Homo sapiens HDAC6 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 108010023925 Histone Deacetylase 6 Proteins 0.000 description 108
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 35
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 35
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 35
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 27
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 22
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 22
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 21
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 18
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 18
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 18
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 11
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- LLOKIGWPNVSDGJ-AFBVCZJXSA-N (3s,6s,9s,12r)-3,6-dibenzyl-9-[6-[(2s)-oxiran-2-yl]-6-oxohexyl]-1,4,7,10-tetrazabicyclo[10.3.0]pentadecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N1)=O)CCCCCC(=O)[C@H]1OC1)C1=CC=CC=C1 LLOKIGWPNVSDGJ-AFBVCZJXSA-N 0.000 description 10
- LLOKIGWPNVSDGJ-UHFFFAOYSA-N Trapoxin B Natural products C1OC1C(=O)CCCCCC(C(NC(CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1)=O)NC(=O)C2CCCN2C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 LLOKIGWPNVSDGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108010060596 trapoxin B Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 210000000428 immunological synapse Anatomy 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000013967 tubulin deacetylation Effects 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101150094745 Ptk2b gene Proteins 0.000 description 4
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010091820 Focal Adhesion Kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- BHUZLJOUHMBZQY-YXQOSMAKSA-N N-[4-[(2R,4R,6S)-4-[[(4,5-diphenyl-2-oxazolyl)thio]methyl]-6-[4-(hydroxymethyl)phenyl]-1,3-dioxan-2-yl]phenyl]-N'-hydroxyoctanediamide Chemical compound C1=CC(CO)=CC=C1[C@H]1O[C@@H](C=2C=CC(NC(=O)CCCCCCC(=O)NO)=CC=2)O[C@@H](CSC=2OC(=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C1 BHUZLJOUHMBZQY-YXQOSMAKSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102100037787 Protein-tyrosine kinase 2-beta Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N (3S,6S,9S,12R)-3-[(2S)-Butan-2-yl]-6-[(1-methoxyindol-3-yl)methyl]-9-(6-oxooctyl)-1,4,7,10-tetrazabicyclo[10.4.0]hexadecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCCCC(=O)CC)NC(=O)[C@H]2CCCCN2C(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical class O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- DLVJMFOLJOOWFS-UHFFFAOYSA-N Depudecin Natural products CC(O)C1OC1C=CC1C(C(O)C=C)O1 DLVJMFOLJOOWFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100020903 Ezrin Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101710160287 Heterochromatin protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 1
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100027869 Moesin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 241001147662 Neospora caninum Species 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N OT-Key 11219 Natural products N1C(=O)C(CCCCCC(=O)CC)NC(=O)C2CCCCN2C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000027190 Peripheral T-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 208000031672 T-Cell Peripheral Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 229930189037 Trapoxin Natural products 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- -1 alkylene butyrates Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000030113 alpha-tubulin acetylation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010082820 apicidin Proteins 0.000 description 1
- 229930186608 apicidin Natural products 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- DLVJMFOLJOOWFS-INMLLLKOSA-N depudecin Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1\C=C\[C@H]1[C@H]([C@H](O)C=C)O1 DLVJMFOLJOOWFS-INMLLLKOSA-N 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010055671 ezrin Proteins 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 1
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 description 1
- 102000054908 human HDAC6 Human genes 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000017156 mRNA modification Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000020968 mature T-cell and NK-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 108010071525 moesin Proteins 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000004540 process dynamic Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229940065721 systemic for obstructive airway disease xanthines Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000013076 thyroid tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010060597 trapoxin A Proteins 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010865 video microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000237 vorinostat Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
- A61K31/52—Purines, e.g. adenine
- A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento de identificación de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de HDAC6, y sus aplicaciones. El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6, y uso de dichos compuestos reguladores en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones de la activación de los linfocitos T.
Description
Procedimiento de identificación de los compuestos
reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de HDAC6, y sus
aplicaciones.
El objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación de compuestos reguladores de la
actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6, y uso de
dichos compuestos reguladores en la elaboración de medicamentos o
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades que
cursan con alteraciones de la activación de los linfocitos T.
La actuación sobre las actividades funcionales de
la tubulina desacetilasa HDAC6 u otras enzimas que regulan el
estado de acetilación/desacetilación de la tubulina como
reguladores inmunes puede impulsar el desarrollo de nuevos
tratamientos para el reajuste de la respuesta inmunitaria,
incluyendo regulación negativa en el caso de enfermedades
autoinmunes y alergias, o positiva en el caso de terapias frente a
inmunodeficiencias. El desarrollo de estos métodos se fundamenta en
la regulación de los niveles de acetilación de tubulina empleando
la tubulina desacetilasa HDAC6 como diana terapeútica. Por lo tanto,
debe adscribirse al sector farmacológico y biomédico para su
aplicación en el sector sanitario. Y, más concretamente al campo de
los procedimientos de identificación de nuevos compuestos
terapéuticos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de
enfermedades o desórdenes que cursen con alteraciones del sistema
inmunológico.
El tratamiento farmacológico de las enfermedades
con componente patogénico inmune es un campo de intenso estudio,
incluyéndose en esta categoría las enfermedades autoinmunes, que
afectan aproximadamente al 5% de la población mundial (O'Shea,
J.J., Ma, A., and Lipsky, P. (2002). Cytokines and autoimmunity.
Nat. Rev. Immunol. 2, 37-45), alergia, enfermedades
inflamatorias crónicas e infecciosas y procesos tumorales que son
una causa mayoritaria de mortalidad en países industrializados. Por
tanto, la regulación de la respuesta inmune es crucial en el
tratamiento de las causas más importantes de morbimortalidad en
nuestra sociedad.
La activación de las células T requiere la unión
del antígeno debidamente presentado por moléculas del complejo
principal de histocompatibilidad en las células presentadoras de
antígeno. Esta unión intercelular ha sido denominada la sinapsis
inmunológica (Bromley, S.K., Burack, W.R., Johnson, K.G., Somersalo,
K., Sims, T.N., Sumen C., Davis, M.M., Shaw, A.S., Allen, P.M., and
Dustin, M.L. (2001). The immunological synapse. Annu. Rev. Immunol.
19, 375-396) y se caracteriza por estar
organizada en dos agrupaciones supramoleculares de receptores de
activación: i) una agrupación central donde se concentran el
complejo TcR y moléculas coestimuladoras como CD4, CD2 y CD28
(Monks, C.R., Friberg, B.A., Kupfer, H., Sciaky, N., and Kupfer, A.
(1998). Three-dimensional seggregation of
supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395,
82-86; Grakoui, A., Bromley, S.K., Sumen, C., Davis,
M.M., Shaw, A.S., Allen, P.M., and Dustin, M.L. (1999). The
immunological synapse: a molecular machine controlling T cell
activation. Science 285, 221-227) y ii) un
anillo periférico de receptores de adhesión , que contiene entre
otros la integrina leucocitaria LFA-1 (Monks, C.R.,
Friberg, B.A., Kupfer, H., Sciaky, N., and Kupfer, A. (1998).
Three-dimensional seggregation of supramolecular
activation clusters in T cells. Nature 395,
82-86). La activación de las células T por el
antígeno también implica la translocación del centro organizador de
microtúbulos (MTOC) y el aparato de Golgi hacia el sitio de contacto
con la célula presentadora de antígeno así como la producción de
IL-2 (Geiger, B., Rosen, D., and Berke, G. (1982).
Spatial relationships of microtubule-organizing
centers and the contact area of cytotoxic T lymphocytes and target
cells. J. Cell Biol. 95, 137-143; Ryser, J.,
Rungger-Brändle, E., Chaponier, C., Gabbiani, J.,
and Vassalli, P. (1982). The area of attachment of cytotoxic T
lymphocytes to their target cells shows high motility and
polarization of actin, but not myosin. J. Immunol. 128,
1159-1162; Kupfer, A., Swain, S.L., Janeway, C.A.,
and Singer, S.J. (1986). The specific direct interaction of helper
T cells and antigen-presenting B cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA.83, 6080-6083).
Se sabe que los filamentos de actina y proteínas
asociadas juegan un papel importante en la formación de la sinapsis
inmune, organizando la disposición de los receptores para el
antígeno+ y de las moléculas de adhesión (Monks, C.R., Friberg,
B.A., Kupfer, H., Sciaky, N., and Kupfer, A. (1998).
Three-dimensional seggregation of supramolecular
activation clusters in T cells. Nature 395,
82-86; Allenspach, E.J., Cullinan, P., Tong, J.,
Tang, Q., Tesciuba, A.G., Cannon, J.L., Takahashi, S.M., Morgan,
R., Burkhardt, J.K., and Sperling, A.I.
ERM-dependent movement of CD43 defines a novel
protein complex distal to the immunological synapse. Immunity. 2001
Nov;15 (5):739-50.; Delon, J., Kaibuchi, K., and
Germain, R. (2001). Exclusion of CD43 from the immunological synapse
is mediated by phosphorylation-regulated relocation
of the cytoskeletal adaptor moesin. Immunity 15,
691-701; Roumier, A., Olivo-Marin,
J.C., Arpin, M., Michel, F., Martin, M., Mangeat, P., Acuto, O.,
Dautry-Varsat, A., and Alcover, A. (2001). The
membrane-microfilament linker ezrin is involved in
the formation of the immunological synapse and in T cell
activation. Immunity 15, 715-728). Sin
embargo, hasta la fecha, poco se sabía del papel desempeñado por
los microtúbulos en el desarrollo de la respuesta inmune (Nogales,
E. (2001). Structural insights into microtubule function. Annu. Rev.
Biophys. Biomol. Struct. 30, 397-420).
En la presente invención se demuestra que la
acetilación de los grupos \varepsilon-amino de la
lisina 40 de la subunidad \alpha de tubulina en los microtubulos
(Thompson, W.C., Asai, D.J., and Carney, D.H. (1984). Heterogeneity
among microtubules of the cytoplasmic microtubule complex detected
by a monoclonal antibody to alpha tubulin. J. Cell Biol.,
98, 1017-1025; L'Hernault, S.W., and
Rosenbaum, J.L. (1983). Chlamydomonas
\alpha-tubulin is
post-translationally modified by acetylation on the
\varepsilon-amino group of a lysin. Biochemistry
24, 473-478; Piperno, G., LeDizet, M., and
Chang, X. (1987). Microtubules containing acetylated
\alpha-tubulin in mammalian cells in culture. J.
Cell Biol. 104, 289-302) juega un papel
importante en la activación dependiente de antígeno de las células
T.
Recientemente, se ha identificado la actividad
desacetiladora de microtúbulos de la histona desacetilasa (HDAC6)
(Hubbert, C., Guardiola, A., Shao, R., Kawaguchi, Y., Ito, A.,
Nixon, A., Yoshida, M., Wang, X., and Yao, T. (2002). HDAC6 is a
microtubule-associated deacetylase. Nature
417, 455-458; Matsuyama, A., Shimazu, T.,
Sumida, Y., Saito, A., Seigneurin-Berny, D., Osada,
H., Komatsu, Y., Nishino, N., Khochbin, S., Horinouchi, S., and
Yoshida, M. (2002). In vivo destabilization of dynamic
microtubules by HDAC6-mediated deacetylation. EMBO
J. 21, 6820-6831). HDAC6 es el único miembro
conocido perteneciente a la familia de historia desacetilasas de
clase II que es capaz de desacetilar histonas y tubulina
(Grozinger, C., Hassing, C., and Schreiber, S.L. (1999). Three
proteins define a class of human
histone-deacetylases related to yeast Hdalp; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873; Haggarty,
S.J., Koeller, K.M., Wong, J.C., Grozinger, C., and Schreiber, S.L.
(2003). Domain selective small-molecule inhibitor
of histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin
deacetylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,
4389-4394). Esta enzima desacetila tubulina en las
células y su actividad puede ser inhibida por los agentes
farmacológicos tricostatina A y tubacina (Hubbert, C., Guardiola,
A., Shao, R., Kawaguchi, Y., Ito, A., Nixon, A., Yoshida, M., Wang,
X., and Yao, T. (2002). HDAC6 is a
microtubule-associated deacetylase. Nature
417, 455-458; Haggarty, S.J., Koeller, K.M.,
Wong, J.C., Grozinger, C., and Schreiber, S.L. (2003). Domain
selective small-molecule inhibitor of histone
deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin
deacetylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,
4389-4394).
Por otro lado, hay que destacar el amplio abanico
de actividades celulares en las que intervienen las HDACs que van
apareciendo en el estado de la técnica y que han permitido el
establecimiento de nuevas aproximaciones terapéuticas a múltiples
patologías humanas, mediante el uso de inhibidores y agonistas de
HDACs, y el desarrollo de nuevos métodos de identificación y
evaluación de nuevos compuestos terapéuticos. Así, se han descrito
las siguientes aplicaciones como proteína diana terapéutica
derivadas de las actividades funcionales en las que participan:
- -
- proteína diana para el tratamiento del cáncer por la capacidad de estos inhibidores de inducir la apoptosis de las células tumorales, por su capacidad de promover la diferenciación de dichas células, o por la capacidad de inducir la expresión en dichas células de antígenos que promueven una mayor respuesta inmune (Marks, PA, Fichan, VM, Breslow R, and Rifkind RA. (2001). Histone deacetylase as new cancer drugs. Curr. Opin. Oncol. 13:477-489; patente US 6.262.116, Transcription therapy for cancers; patente US 6.387.673, Compounds useful for the modulation of processes mediated by nuclear hormone receptors, methods for the identification and use of such compounds; patente US 6.399.568, Cyclic tetrapeptide derivatives and medicinal use thereof; patente WO 02/15921, Methods of treating cutaneous T-cell lymphoma and peripheral T-cell lymphoma (unspecified) by administering a histone deacetylase inhibitor; patente WO 02/055688, Histone deacetylase inhibitors in-diagnosis and treatment of thyroid neoplasms; patente US 6.071.923, Retinoyloxy aryl-substituted alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases), y de otras enfermedades proliferativas (solicitud PCT de patente US 20020161045, Novel actyloxymethil esters and methods for using the same),
- -
- proteína diana para el tratamiento de enfermedades provocadas por protozoos (Kwon HJ, Kim JH, Kim M, Lee JK, Hwang WS, Kim DY. (2003) Anti-parasitic activity of depudecin on Neospora caninum via the inhibition of histone deacetylase Vet. Parasitol. 112, 269-276; US 6.428.983, Histone deacetylase as target for antiprotoozoal agents; solicitud PCT de patente US 20030078369, Apicidin-derived cyclic tetrapeptides),
- -
- proteína diana para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca (van Zonneveld AJ. (2003) Molecular biology and genetics in cardiovascular research: highlights of 2002. Neth J Med. 61, 28-34; solicitud PCT de patente US 20030114340, Inhibition of histone deacetylase as a treatment for cardiac hypertophy; US 6.632.628, Methods and compositions relating to HDAC 4 and 5 regulation of cardiac gene expresión),
- -
- proteína diana para el tratamiento de enfermedades o desórdenes que afectan al tejido conectivo (Xu RH, Peng Y, Fan J, Yan D, Yamagoe S, Princler G, Sredni D, Ozato K, Kung HF. (2000). Histone acetylation is a checkpoint in FGF-stimulated mesoderm induction. Dev Dyn. 218, 628-35; solicitud PCT de patente US 20030206946, Methods for therapy of connective tissue disease),
- -
- proteína diana para el tratamiento de la atrofia muscular espinal (US 6.376.508, Treatments for spinal muscular atrophy),
- -
- proteína diana para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica (Hoshino M, Tagawa K, Okuda T, Murata M, Oyanagi K, Arai N, Mizutani T, Kanazawa I, Wanker EE, Okazawa H. (2003) Histone deacetylase activity is retained in primary neurons expressing mutant huntingtin protein. J Neurochem. 87,257-267; Hockly E, Richon-VM; Wondman B; Smith DL, Zhou X, Rosa E, Sathasivam K, Ghazi-Noori S, Mahal A, Lowden PA, Steffan JS, Marsh JL, Thompson LM, Lewis CM, Marks PA, Bates GP (2003) Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2041-6; WO 03/083067, Histone deacetylse inhibitors for the treatment of multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer diseases; WO 03/080864, Histone deacetylase: novel molecular target of neurotoxicity; WO03032921, Treatment of neurodegenerative diseases and cancer of the brain),
- -
- proteína diana clave en los procesos de regeneración y diferenciación de múltiples tipos celulares (Zhang CL, McKinsey TA, Olson EN. (2002) Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, 7302-7312; WO 03/033678, Methods of using deacetylase inhibitors to promote cell differentation and regeneration; WO 0023567, Promotion of self-renewal and improved gene transduction of hematopoietic stem cells by histone deacetylase inhibitors), y
- -
- proteína diana para la regulación de la transmisión de señales a través de receptores, en concreto como potenciador del efecto broncodilatador de los corticoides en el tratamiento del asma, en este caso mediante agonistas de las proteínas HDACs. (Ito K, Caramori G, Lim S, Oates T, Chung KF, Barnes PJ, Adcock IM. (2002) Expression and activity of histone deacetylases in human asthmatic airways. Am J Respir Crit Care Med. 166, 392-396; solicitud PCT de patente US 20030134865).
Los microfilamentos de actina son considerados
los componentes del citoesqueleto más importantes para la
activación de las células T (Valitutti, S.M., Dessing, M.,
Aktories, K, Gallati, H., and Lanzavecchia, A. (1995). Sustained
signaling leading to T cell activation results from prolonged T cell
receptor occupancy, J. Exp. Med. 181,
577-584; Serrador, J.M , Nieto, M., and
Sánchez-Madrid, F. (1999). Cytoskeletal
rearrangement during migration and activation of T lymphocytes.
Trends Cell Biol. 9, 228-232; Dustin, M.L.,
and Cooper, J.A. (2000). The immunological synapse and the actin
cytoskeleton: molecular hardware for T cell signaling. Nat.
Immunol. 1, 23-29). Sin embargo, se
encuentran cada vez más evidencias de que otras proteínas del
citoesqueleto participan en este proceso, aunque hasta la fecha, no
se ha relacionado la acetilación de los microtúbulos con patología
inmune alguna. Por lo tanto, la regulación de la actividad
desacetiladora de tubulina mediada por HDAC6 y sus implicaciones en
la modulación de la activación de los linfocitos T, descrita en
este documento por primera vez, puede resultar un tratamiento
eficaz en enfermedades que cursan con una respuesta inmune
exacerbada y también en aquellas que cursan con una respuesta
inmune deficiente.
El objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de
compuestos reguladores de la proteína HDAC6, sobre la activación de
linfocitos T, que comprende los siguientes pasos:
- i)
- contacto de linfocitos T, preferentemente humanos, con el potencial compuesto objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
- ii)
- determinación de un parámetro indicativo de los niveles de acetilación de la tubulina de los linfocitos T de i) o de cualquier otro relacionado con el proceso de activación de los linfocitos T en el que participe la proteína HDAC6, e
- iii)
- identificación de un compuesto inhibidor o agonista de la actividad de la proteína HDAC6 cuando se observa un incremento de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la activación de linfocitos T o cuando se observa una disminución de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la inactivación de linfocitos T, respectivamente.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de dichos compuestos reguladores en la
elaboración de una composición farmacéutica o medicamento para el
tratamiento de enfermedades; desórdenes o patologías que cursan con
alteraciones del sistema inmunológico, preferentemente con la
activación de los linfocitos T alterada.
Los resultados de la presente invención
demuestran que los microtúbulos también juegan un papel relevante
en la activación temprana y tardía de las células T. La unión del
antígeno al receptor de la célula T modifica la acetilación de los
microtúbulos de una forma dinámica en la que inicialmente resultan
desacetilados, para que transcurridos unos 15 minutos se reacetilen
progresivamente. La etapa inicial de desacetilación coincide en el
tiempo con la activación del receptor de la célula T reforzando la
hipótesis de que la etapa inicial de desacetilación se induce a
través del receptor de la célula T. El hecho de que la inhibición
de la desacetilación inicial mediante el tratamiento con
tricostatina A, un inhibidor de la actividad tubulina desacetilasa
de HDAC6 (Ejemplo 3), favorezca los eventos de activación tempranos
y por el contrario la activación de la actividad tubulina
desacetilasa de HDAC6 los dificulte (Ejemplo 3), demuestra que el
proceso dinámico de acetilación/desacetilación de los microtúbulos
se requiere para la correcta organización de receptores de membrana
en la sinapsis inmunológica y la consiguiente activación de las
células T. En los conjugados celulares entre células T cooperadoras
que dirigen la respuesta inmune y células presentadoras de antígeno
los microtúbulos resultan acetilados en el sitio de contacto de la
célula T con la célula presentadora, en la sinapsis inmunológica,
que tiene lugar en la activación de los linfocitos T. En esta
patente también se demuestra que la tubulina desacetilasa HDAC6 se
concentra en la sinapsis inmunológica y que su sobreexpresión
produce su desorganización. Además, la activación descontrolada de
HDAC6 inhibe la translocación del aparato secretor hacia la célula
presentadora de antígeno y disminuye la producción de
IL-2, que son dos eventos de activación temprano y
tardío, respectivamente. De esta manera, los datos sugieren el
empleo del equilibro acetilación/desacetilación de los
micro-
túbulos (por ejemplo: a través de HDAC6) como nueva diana terapéutica en enfermedades con participación inmune.
túbulos (por ejemplo: a través de HDAC6) como nueva diana terapéutica en enfermedades con participación inmune.
En resumen, la presente invención se basa en el
descubrimiento de que la acetilación de los microtúbulos es
importante para modular la activación de las células T y que está
regulada por la proteína HDAC6, lo que permite definir nuevas
aproximaciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades que
cursen con alteraciones del sistema inmunológico. Estas
aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos o
agentes reguladores, inhibidores y activadores, de la actividad de
dicha proteína HDAC6.
Los compuestos inhibidores o antagonistas de
HDAC6, que consiguientemente producen una acetilación neta de
tubulina, son útiles para restaurar una respuesta inmune
deficiente. Así, el pretratamiento de células T con el inhibidor de
HDAC6 tricostatina A revierte la desorganización de la sinapsis
inmune así como la inhibición de la translocación del MTOC que tenía
lugar por la sobreexpresión de HDAC6 (Figura 5-6 y
7, respectivamente). Por otra parte, compuestos activadores o
agonistas de HDAC6 podrían desempeñar un papel en reducir daños
asociados con una respuesta inmune exacerbada tales como los que
tienen lugar en una enfermedad de origen autoinmune. En este
sentido, la tecnología de transferencia génica podría, mediante
vectores virales, ser de utilidad en terapia génica para expresar
de forma tejido-específica el enzima HDAC6 en los
linfocitos T de pacientes que sufren este tipo de enfermedades.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente regulador, inhibidor o
activador, de la actividad de la proteína HDAC6, en adelante uso de
un compuesto de la presente invención, en la elaboración de
medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de
enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos, preferentemente
humanas, que cursan con alteraciones del sistema inmunológico,
preferentemente con la activación de los linfocitos T alterada.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere
a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína HDAC6
(SEQ ID NO. 2), o con fragmentos funcionales de la misma, disminuye
o elimina la intensidad o la duración de la actividad biológica de
dicha proteína. En esta definición se incluye además aquellos
compuestos que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante
de la proteína HDAC6, es decir, que impiden o diminuyen la
transcripción del gen, la maduración del RNAm, la traducción del
RNAm y la modificación post-traduccional. Un agente
inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un
ácido nucléico (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido del UNAM
codificante de la proteína HDAC6 o un ribozima que destruya dicho
RNAm), un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o
cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimina el efecto
y/o la función tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6.
Hasta la fecha en el estado de la técnica tan
sólo hay descritos unos pocos compuestos modificadores de la
actividad tubulina desacetilasa de la proteína HDAC6 que pueden ser
utilizados en el ámbito de la presente invención, y que se indican
a continuación a título ilustrativo y sin que eso signifique una
limitación al alcance de la presente invención sobre los actuales y
futuros inhibidores de HDAC6: el derivado del ácido hidroxámico
(tricostatina A (TSA) (Richon VM et al, 2001 Blood Cells Mol
dis 27 (1): 260-4), tubacina (Haggarty, S.J.,
Koeller, K.M., Wong, J.C., Grozinger, C., and Schreiber, S.L.
(2003). Domain selective small-molecule inhibitor of
histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin
deacetylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,
4389-4394), y oligonucleótidos antisentido de los
RNAm de las proteínas HDACs (WO03006652, Inhibition of specific
histone deacetylase isoforms). En el marco de la presente invención
hay que destacar el papel preferente de aquellos compuestos
inhibidores de la proteína HDAC6, y más en concreto aquellos
compuestos, que como la tubacina y sus derivados, sean capaces de
unirse y bloquear su único dominio catalítico que desacetila
tubulina de forma específica (Haggarty, S.J., Koeller, K.M., Wong,
J.C., Grozinger, C., and Schreiber, S.L. (2003). Domain selective
small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6
(HDAC6)-mediated tubulin deacetylation. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100, 4389-4394).
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente activador o agonista" se refiere a
una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína HDAC6,
o con fragmentos funcionales de la misma, incrementa la intensidad
o prolonga la duración de la actividad biológicade dicha proteína.
En esta definición se incluye además aquellos compuestos o
moléculas que permiten incrementar la expresión del gen codificante
de la proteína HDAC6. Un agente activador puede estar constituido
por un péptido, una proteína, un ácido nucleico, carbohidratos, un
anticuerpo, un compuesto químico, o cualquier otro tipo de molécula
que incremente el efecto y/o la duración de la actividad de la
proteína HDAC6. En el estado de la técnica existen descritos
compuestos agonistas de la actividad de las proteínas HDACs, que
pueden ser utilizados en el ámbito de la presente invención como
agonistas de la proteína HADC6, y que se indican a continuación a
título ilustrativo sin que eso signifique una limitación al alcance
de la presente invención: xantinas (patente US 20030134865).
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto agonista en la
elaboración de un medicamento o composición terapéutica para el
tratamiento de una enfermedad que cursa con una exacerbación del
sistema inmunológico basado en que el compuesto está constituido
por una construcción genética que permite la expresión de la
proteína HDAC6 humana (SEQ ID NO. 2), en el interior de células
humanas, preferentemente en linfocitos T, de forma similar a las
construcciones genéticas elaboradas en la presente invención
(ejemplos 3, 4 y 5).
Por otro lado, el origen de estos compuestos
reguladores, inhibidores o agonistas, de la actividad de las
proteínas HDACs puede ser variado, de tal forma que pueden ser
origen natural (por ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico,
animales o microorganismos eucariotas) o sintético.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de
compuestos reguladores de la proteína HDAC6, sobre la activación de
linfocitos T, en adelante procedimiento de identificación de
compuestos de la presente invención, que comprende los siguientes
pasos:
- i)
- contacto de linfocitos T, preferentemente humanos, con el potencial compuesto objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
- ii)
- determinación de un parámetro indicativo de los niveles de acetilación de la tubulina de los linfocitos T de i) o de cualquier otro relacionado con el proceso de activación de los linfocitos T en el que participe la proteína HDAC6; e
- iii)
- identificación de un compuesto inhibidor o agonista de la actividad de la proteína HDAC6 cuando se observa un incremento de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la activación de linfocitos T o cuando se observa una disminución de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la inactivación de linfocitos T, respectivamente.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un procedimiento de identificación de potenciales
compuestos inhibidores de la invención donde los linfocitos T del
punto i) pueden ser estimulados o preparados mediante
procedimientos conocidos en el estado del arte (ver Ejemplo
1-5; estimulación con células presentadoras de
antígeno (células Raji) más SEE y transformación de los cultivos
celulares de linfocitos T con una construcción genética que permita
la expresión del gen HDAC6) que permiten una mejor evaluación del
efecto de dichos potenciales compuestos inhibidores.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el procedimiento de identificación de compuestos de la
invención en el que la determinación de los niveles de acetilación
de la tubulina ii) se puede realizar mediante técnicas de
inmunoblot o western blot con anticuerpos adecuados (ver Ejemplo 2 y
Figura 2). La determinación del efecto de compuestos sobre enzimas
que regulan la acetilación/desacetilación de la tubulina, HDAC6 o
acetiltransferasas, puede realizarse de distintas formas y se
encuentra ampliamente descrita en el estado del arte: (LeDizet M,
Piperno G.(1991) Detection of acetylated
alpha-tubulin by specific antibodies. Methods
Enzymol. 196, 264-274; WO 03/048774, Use of
alpha-tubulin acetylation levels as a biomarker for
protein deacetylase inhibitors; WO 03/066885, Method for screening
for compounds having HDAC inhibitory activity; EP 1243658, Method
of measuring deacetylase activity and method of screening inhibitor
or promotor of these enzymes; EP 1050581, Method for detecting
acetyltransferase and deacetylase activities and method for
screening inhibitors or accelerators of these enzymes; Solicitud PCT
de patente US-20030082668, Method for measuring the
activity of deacetylase and method of screening for inhibitors and
accelerators of the enzyme). Estos procedimientos pueden ser
aplicados para la identificación de compuestos reguladores,
inhibidores y agonistas, de la proteína HDAC6 como proteína
desacetilasa, y la posterior valoración de la capacidad reguladora
de dichos compuestos sobre la activación de linfocitos T.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de identificación de compuestos de
la invención en el que la determinación de un parámetro relacionado
con el proceso de activación de los linfocitos T se puede realizar,
a título ilustrativo y sin limitar el alcance de la presente
invención, mediante una técnica perteneciente al siguiente
grupo:
- a)
- determinación del agrupamiento o concentración de CD3 en la sinapsis inmune (c-SMAC) (ver Ejemplo 4, Figura 5),
- b)
- determinación de la desorganización de LAF-1 en el anillo periférico de la sinapsis inmune (ver Ejemplo 4, Figura 6),
- c)
- determinación de la translocación del centro organizador de microtúbulos (MTOC) (ver Ejemplo 5, Figura 7), y
- d)
- determinación de la secreción de IL-2 y de la expresión de CD69 (ver Ejemplo 5, Figura 7).
Tal como se utiliza en la presente invención los
linfocitos T, preferentemente humanos, utilizados en el
procedimiento de identificación de compuestos, incluyen cultivos de
células tipo CD4+, entre las que se encuentran, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención las
siguientes células: linfocitos de sangre periférica, linfoblastos T
y células Jurkat (J77).
Por otro lado, el origen de estos compuestos
candidatos para el procedimiento de identificación de la invención
puede ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por
ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o
microorganismos eucariotas) o sintético.
\newpage
Igualmente, a partir de los resultados de la
presente invención se constata la importancia de las proteínas
acetil-transferasas, que actuarían incrementando
los niveles de acetilación de la tubulina que se observa durante el
proceso de activación de los linfocitos T, y que permitirían:
- a)
- el desarrollo y el de procedimientos para la identificación de nuevos compuestos reguladores, inhibidores y agonistas, de dicha activación de los linfocitos T (ver por ejemplo, EP 1050581, Method for detecting acetyltransferase and deacetylase activities and method for screening inhibitors or accelerators of these enzymes; EP 1243658, Method of measuring deacetylase activity and method of screening inhibitor or promotor of these enzymes),
- b)
- el uso de estos compuestos reguladores en la elaboración nuevas de composiciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades que presentan alteraciones de la activación de los linfocitos T, y
- c)
- el uso de dichas composiciones terapéuticas en métodos de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología caracterizada por una respuesta inmune no deseada, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que modifica el estado de acetilación de la tubulina y que actúa como inmunomoduladora.
Figura
1
Las células Raji se pusieron en contacto con
células J77 sobre cubreobjetos recubiertos de fibronectina. A
continuación, las células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con
los anticuerpos que se indican. A) Los conjugados celulares
formados en ausencia (panel superior) o presencia de SEE a 1
\mug/ml (panel inferior) se tiñeron doblemente para tubulina y
tubulina acetilada y se analizaron por microscopía confocal. Las
imágenes superpuestas y las de contraste de fases se muestran a la
derecha. Los asteriscos indican la localización de las células Raji
en los conjugados celulares. B) Los conjugados de células J77/Raji
en presencia de SEE se tiñeron para tubulina acetilada y CD3 (panel
superior) o LFA-1 (panel inferior). En los paneles
de la derecha se muestra la tinción de las células Raji, tubulina
acetilada y CD3 o LFA-1 superpuestas sobre las
imágenes en Nomarski.
Figura
2
A) Las células Raji (1.5 x 10^{6}) fueron
marcadas o no con SEB o SEE a 1 \mug/ml y puestas en contacto con
4.5 x 10^{6} células J77 durante 40 min a 37ºC. A continuación,
se detectaron por inmunoblot los niveles de tubulina acetilada,
tubulina y vimentina en lisados celulares en condiciones no
reductoras tal como se describe en Métodos. B) Las células J77 (5 x
10^{6}) se estimularon con los anticuerpos indicados durante 40
min a 37ºC. A continuación, los niveles de tubulina y tubulina
acetilada se detectaron por inmunoblot en condiciones no
reductoras. C) Estudio cinético de la acetilación de tubulina y de
la fosforilación de CD3\zeta en conjugados entre células J77 y
Raji. Las células J77 y Raji se pusieron en contacto en presencia
de SEE o SEB durante los tiempos indicados, y a continuación se
detectaron los niveles de tubulina y tubulina acetilada por
inmunoblot en condiciones no reductoras. Los valores
densitométricos se muestran entre los paneles. Para detectar la
fosforilación de CD3\zeta, los lisados celulares se precipitaron
con el anticuerpo 488, los inmunoprecipitados se separaron en
SDS-PAGE en condiciones reductoras y se detectó por
inmunoblot el grado de fosforilación en tirosina utilizando el
anticuerpo 4G10.
Figura
3
A) El enzima HDAC6 se concentra en los sitios de
contacto de las células T con las células presentadoras de
antígeno. Las células Raji marcadas con CMAC se pusieron en
contacto con linfocitos de sangre periférica CD4+ (PBLCD4+) o
células J77 en presencia o ausencia de SEE. A continuación, las
células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para HDAC6 y tubulina
acetilada. Las flechas señalan los centros organizadores de
microtúbulos. B) Los linfocitos de sangre periférica CD4+ y células
J77 se pretrataron durante 30 min con TSA 3 \muM o butirato
sódico 5 mM y se pusieron en contacto con células Raji pulsadas con
SEE. Los microtúbulos acetilados se tiñeron en conjugados entre
células T y células presentadoras de antígeno. Las flechas apuntan
hacia los microtúbulos acetilados de las células T. C) Los lisados
procedentes de células J77 o células J77 transfectadas con GFP,
HDAC6-GFP o su mutante inactivo se procesaron por
inmunoblot con un anticuerpo anti-GFP. Los
marcadores de peso molecular se indican a la izquierda. D) Niveles
de tubulina acetilada en células J77 transfectadas con HDAC6. Las
células J77 se transfectaron con GFP, HDAC6-GFP o
su mutante inactivo. Tras 24 horas, las células se trataron o no con
TSA 3 \muM o butirato sódico 5 mM, y los niveles de tubulina
acetilada se determinaron por citometría de flujo como se describe
en Métodos. Se muestra un experimento representativo de tres. E) La
HDAC6 exógena se concentra en el sitio de contacto de las células
J77 con las células Raji. Las células Raji marcadas con SEE se
pusieron en contacto con células J77 transfectadas con HDAC6 o un
mutante inactivo de HDAC6. A continuación los conjugados celulares
se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para tubulina acetilada. Las
puntas de flecha se dirigen hacia el sitio de contacto de las
células T con las células presentadoras de antígeno.
Figura
4
Las células Raji fueron pulsadas con SEE a 1
\mug/ml y adheridas sobre cubreobjetos recubiertos de
fibronectina. A continuación, se añadieron células J77
transfectadas con HDAC6 y se filmaron imágenes a intervalos de 30
segundos. Las células Raji se marcaron con la sonda azul CMAC. Cada
punto muestra la imagen de contraste de fases superpuesta a la
imagen fluorescente de HDAC6-GFP. El tiempo
transcurrido desde el contacto inicial en minutos se indica en la
esquina superior izquierda de cada imagen. Los asteriscos señalan
las células Raji.
Figura
5
A) Las células J77 se transfectaron con GFP,
HDAC6-GFP o su mutante inactivo y se incubaron con
células Raji marcadas con SEE durante 30 min a 37ºC, tras lo cual
se llevó a cabo una tinción de CD3\zeta. A la derecha se
representan las proyecciones XZ correspondientes al área de
contacto de cada conjugado. También se muestran las imágenes de
contraste de fase superpuestas a la tinción de CD3\zeta y
HDAC6-GFP. Los asteriscos indican la localización de
las células presentadoras de antígeno en los conjugados celulares.
B) El porcentaje de linfocitos de sangre periférica CD4+/V\beta8+
(PBLs) y células J77 transfectadas con GFP, HDAC6 o el mutante
inactivo de HDAC6, tratadas o no con TSA, trapoxina B o butirato
sódico que presentan acumulación de CD3 en el sitio de contacto con
las células Raji. C) Las células J77 pretratadas con TSA
(\boxempty), trapoxina B (\medcirc) o butirato sódico (\Delta)
se pusieron en contacto con células Raji marcadas con SÉE a 1
\mug/ml y se analizó a distintos tiempos el agrupamiento de CD3.
Se muestra un experimento representativo de tres.
Figura
6
Las células Raji marcadas con SEE se incubaron
durante 30 min a 37ºC con células J77 transfectadas con
HDAC6-GFP o su mutante inactivo. A continuación, las
células se tiñeron para LFA-1 y se analizaron por
microscopía confocal. Se muestran secciones confocales y
reconstrucciones tridimensionales representativas de conjugados
entre células T y células presentadoras de antígeno en los cuales
las células J77 sobreexpresaban HDAC6-GFP (panel
superior) o su mutante inactivo (panel inferior). Se analizaron
veinte conjugados celulares correspondientes a tres experimentos
independientes de cada transfectante. LFA-1 se
detectó en el anillo periférico de 9 (GFP), 2
(HDAC6-GFP), y 11 (H216A/H611 A-GFP)
células. A la derecha se muestran las proyecciones XZ
correspondientes a la zona de unión de cada transfectante con la
célula presentadora de antígeno. También se muestra la imagen de
contraste de fase superpuesta a la tinción de LFA-1
en células transfectadas con HDAC6-GFP o su mutante
inactivo. Los asteriscos señalan las células presentadoras de
antígeno.
Figura
7
A) Las células J77 transfectadas con HDAC6 o el
mutante inactivo de HDAC6 se incubaron con células Raji pulsadas
con SEE a 37ºC durante 30 min. A continuación, las células se
fijaron, permeabilizaron y se tiñeron para tubulina. Se muestran
imágenes rrepresentativas de conjugados celulares que expresan
HDAC6-GFP en ausencia y presencia de TSA 3 \muM
(paneles superior y medio respectivamente) y de células que
expresan el mutante inactivo de HDAC6. También se muestran las
imágenes de contraste de fase superpuestas a la tinción de HDAC6 y
tubulina. B) Las células Raji pulsadas con SEE se pusieron en
contacto con linfocitos de sangre periférica CD4+/V\beta8+ en
presencia o ausencia de TSA, trapoxina B o butirato sódico y la
reorientación del centro organizador de microtúbulos se registró
por visualización directa de las células T con el centro
organizador de microtúbulos en estrecha proximidad a la membrana
plasmática entre el núcleo y el sitio de contacto con la célula
Raji. Los datos corresponden a la media aritmética \pm el error
standard de cuatro experimentos independientes. Se contaron al
menos 200 conjugados por experimento. C) Células J77 fueron
pretratadas con TSA (\boxempty), trapoxina B (\medcirc) o
butirato sódico (\Delta) y puestas en contacto con células Raji
pulsadas con SEE. La translocación del centro organizador de
microtúbulos se determinó a distintos tiempos. Se muestra un
experimento representativo de tres. D) Se determinó la
concentración de IL-2 en el sobrenadante de
conjugados entre células Raji y células J77 transfectadas
establemente con GFP, HDAC6-GFP o su mutante
inactivo en presencia (+SEE) o ausencia (-SEE) de 0.5 \mug/ml de
SEE. Los resultados muestran la media aritmética \pm la
desviación típica de la producción de IL-2 en pg/ml
correspondientes a tres experimentos independientes. E) Como en D,
se determinó el número de células positivas para CD69 entre las
células J77 V\beta8 positivas en conjugados. Los resultados se
expresan como la media aritmética \pm la desviación standard del
porcentaje de células CD69+ en la subpoblación V\beta8+ de tres
experimentos independientes.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance
de la misma.
Los conjugados celulares entre células T y
células presentadoras de antígeno en presencia de superantígeno
enterotóxico de Staphylococcus presentaban una concentración
de microtubulos acetilados en la zona de contacto con la célula
presentadora de antígeno (Fig. 1A). La cantidad de microtúbulos
acetilados era mayor en conjugados específicos de superantígeno que
en conjugados entre células del mismo tipo o conjugados celulares
establecidos en ausencia de superantígeno E (Fig. 1A). Además, los
microtúbulos acetilados de las células T se encontraban rodeando
los marcadores típicos central y periférico de la sinapsis inmune
como son CD3 y la molécula de adhesión LFA-1
respectivamente (Fig. 1B).
El análisis por inmunoblot mostraba que los
niveles de acetilación de tubulina aumentaban significativamente en
los conjugados entre células T y células presentadoras en presencia
de superantígeno E pero no de superantígeno B (Fig. 2A).
Para confirmar que el aumento en la acetilación
de los microtúbulos tenía lugar en las células T, se examinó el
efecto que tenía sobre la acetilación de los microtúbulos el
entrecruzamiento de CD3 mediante anticuerpos monoclonales dirigidos
hacia esta molécula. Los niveles basales de acetilación de tubulina
en las células T aumentaban por el tratamiento con dichos
anticuerpos (Fig. 2B). Por el contrario, los niveles de acetilación
de tubulina no se modificaban en presencia de anticuerpos
anti-CD4,
anti-ICAM-3 u otras inmunoglobulinas
irrelevantes (Fig. 2B). Se determinó la cinética de acetilación de
tubulina durante la formación de sinapsis inmunes entre células T y
células presentadoras de antígeno en presencia de superantígeno E.
A tiempos tempranos (2-5 min) se observaba una
desacetilación transitoria de tubulina, recuperando los niveles
basales a los 15 primeros minutos. A partir de este momento, la
acetilación de tubulina aumentaba progresivamente alcanzado un
nivel máximo tras dos horas de estimulación (Fig. 2C). Por el
contrario, los niveles de acetilación no variaban en presencia de
superantígeno B (Fig. 2C). Estos datos mostraban claramente que
durante la acetilación de tubulina mediada por superantígeno podían
distinguirse dos fases. La cinética de desacetilación de tubulina
coincidía claramente con la de fosforilación en tirosina de la
cadena de \zeta CD3 (Rozdzial, M.M., Malissen, B., and Finkel,
T.H. (1995). Tyrosine-phosphorylated T cell receptor
zeta chain associates with the actin cytoskeleton upon activation
of mature T lymphocytes. Immunity 3,
623-633) desencadenada por la unión del
superantígeno E al receptor de la célula T (Fig. 2C).
Mediante ensayos de doble inmunofluorescencia se
observó que HDAC6 se localizaba en el citoplasma de células Jurkat
o linfocitos CD4+ de sangre periférica conjugados con células Raji
marcadas con superantígeno E. HDAC6 co-localizaba
parcialmente con los microtúbulos acetilados de ambos tipos
celulares, concentrándose en el sitio de contacto con la célula
presentadora de antígeno (Fig. 3A). Por el contrario, HDAC6 se
localizaba de forma dispersa en conjugados entre células T y
presentadoras en ausencia de superantígeno E (Fig. 3A). Para
determinar si la actividad desacetiladora de tubulina tenía lugar en
el sitio de contacto entre la célula T y la célula presentadora, se
detectó la acetilación de tubulina en presencia de TSA, un
inhibidor específico de la actividad desacetilasa de tubulina de
HDAC6, butirato sódico y trapoxina B, dos potentes inhibidores de
la actividad histona desacetilasa incapaces de inactivar HDAC6
(Hubbert, C., Guardiola, A., Shao, R., Kawaguchi, Y., Ito, A.,
Nixon, A., Yoshida, M., Wang, X., and Yao, T. (2002). HDAC6 is a
microtubule-associated deacetylase. Nature
417, 455-458; Furumai, R., Komatsu, Y.,
Nishino, N., Khochbin, S., and Yoshida, M. (2001). Potent histone
deacetylase inhibitors built from trichostatin A and cyclic
tetrapeptide antibiotics including trapoxin. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 98, 87-92). Los linfocitos T CD4+ y las
células J77 pretratadas con TSA mostraban una fuerte tinción de
tubulina acetilada en el sitio de contacto con las células
presentadoras de antígeno. Sin embargo, la tinción era débil tanto
en células sin tratar como en células tratadas con butirato o con
trapoxinaB (Fig. 3B y datos no mostrados), indicando que HDAC6 se
encontraba activa en esa localización celular.
Para analizar más en detalle el papel de HDAC6 en
conjugados celulares específicos de superantígeno, se generaron
proteínas de fusión de HDAC6 acopladas a la proteína fluorescente
verde (GFP) por el extremo carboxilo (HDAC6-GFP) y
también se generó otra construcción GFP de un mutante inactivo de
la proteína HDAC6 cuyas histidinas en posición 216 y 611 fueron
cambiadas por alaninas (H216A/H611A-GFP) (proteína
de SEQ ID NO. 2, con las modificaciones de las histidinas en
posición 216 y 611) (Fig. 3C). Estas proteínas se expresaron de
forma transitoria en el clon J77 de las células Jurkat, las cuales
mostraban una moderada expresión de HDAC6 endógena. Por citometría
de flujo se determinaron los niveles de acetilación de tubulina en
presencia de TSA o butirato sódico. Se encontró que la acetilación
de tubulina en las células aumentaba por la acción de la TSA (Fig.
3D). Sin embargo, las células que expresaban
HDAC6-GFP presentaba niveles de tubulina más bajos
que las células transfectadas con el mutante inactivo o GFP (Fig.
3D). Por otra parte, cuando las células J77 que expresaban
HDAC6-GFP se ponían en contacto con células Raji en
presencia de superantígeno E, HDAC6 se encontraba excluido del
núcleo y concentrado en el área de contacto de la célula T con la
célula presentadora de antígeno. Este área de contacto presentaba
menor cantidad de microtúbulos acetilados en células que expresaban
HDAC6-GFP que en células sin transfectar (Fig. 3E,
puntas de flecha del panel superior). En el caso de las células que
expresaban el mutante inactivo de HDAC6, la acetilación de tubulina
no disminuía en el sitio de contacto a pesar de observarse una
localización similar para HDAC6-GFP o su forma
deficiente en actividad tubulina desacetilasa (Fig. 3E, puntas de
flecha, panel inferior). En su conjunto estos resultados demuestran
que HDAC6 se polariza hacia la zona de contacto con la célula
presentadora de antígeno donde tiene lugar su actividad
enzimática.
Para estudiar la localización de HDAC6 en el área
de contacto de la célula T con la célula presentadora de antígeno,
se llevó a cabo videomicroscopía de fluorescencia confocal de
células T transfectadas con HDAC6-GFP y puestas en
contacto con células presentadoras de antígeno en presencia de
superantígeno E. Justo en el inicio del contacto,
HDAC6-GFP se localizaba en las regiones de la
membrana orientadas hacia la célula presentadora de antígeno
concentrándose en la zona central del contacto celular (Fig. 4).
Después de seis minutos de contacto, HDAC6-GFP se
redistribuía hacia la periferia (Fig. 4). Finalmente, después de 11
min, HDAC6-GFP se excluía de la Logia central
concentrándose en un anillo periférico similar al característico de
la sinapsis inmunológica (Fig. 4). En el caso de analizar el
mutante inactivo de HDAC6 se observó una localización similar,
indicando que el posicionamiento de la enzima era independiente de
su actividad enzimática.
La maduración de la sinapsis inmune se
correlaciona con el agrupamiento de CD3 en una pequeña área central
y LFA-1 en un anillo periférico (Monks, C.R.,
Friberg, B.A., Kupfer, H., Sciaky, N., and Kupfer, A. (1998).
Three-dimensional seggregation of supramolecular
activation clusters in T cells. Nature 395,
82-86; Grakoui, A., Bromley, S.K., Sumen, C., Davis,
M.M., Shaw, A.S., Allen, P.M., and Dustin, M.L. (1999). The
immunological synapse: a molecular machine controlling T cell
activation. Science 285, 221-227). Para
determinar si HDAC6 juega un papel en la organización de la
sinapsis inmune, se determinó la localización de CD3 y
LFA-1 en la sinapsis de células T transfectadas con
HDAC6- GFP y formando conjugados con células presentadoras en
presencia de superantígeno E. La presencia de
HDAC6-GFP, pero no de su mutante inactivo, prevenía
la agrupación de CD3 en la región central de la sinapsis inmune
(Fig. 5A). Este efecto se revertía por el tratamiento con TSA pero
no con butirato sódico o trapoxina B (Fig. 5A y B). Además, las
células pretratadas con TSA siempre mostraban un ligero aumento en
el agrupamiento de CD3 (Fig. 5B). El porcentaje de sinapsis maduras
en células J77 transfectadas con HDAC6 era 2 veces menor que en
células transfectadas con el mutante deficiente en desacetilación o
que en linfocitos tratados con TSA y ni la trapoxina B, ni el
butirato sódico lo modificaba de forma significativa (Fig. 5B).
Finalmente, los estudios cinéticos de conjugados entre células T y
células presentadoras de antígeno en presencia de superantígeno E
mostraban que el pretratamiento con TSA de las células T aceleraba
el agrupamiento de CD3 en la región central de la sinapsis inmune
(Fig. 5C).
Por otra parte, la expresión exógena de
HDAC6-GFP impedía la normal localización de
LFA-1 en el anillo periférico de la sinapsis inmune
(Fig. 6, panel superior), a pesar de que LFA-1 se
concentraba en la zona de contacto de los conjugados celulares
(dato no mostrado). LFA-1 estaba bien organizado en
el anillo periférico de la sinapsis inmune de células tratadas con
TSA o transfectadas con el mutante de HDAC6 deficiente en actividad
desacetilasa (Fig. 6, panel inferior y datos no mostrados). Estos
datos sugieren que HDAC6 regula la organización de CD3 y
LFA-1 en la sinapsis inmune mediante la
desacetilación de los microtúbulos que la rodean.
Tras reconocer el antígeno, la célula T reorienta
el centro organizador de microtúbulos (MTOC) hacia la célula
presentadora de antígeno como consecuencia de la organización y
maduración de la sinapsis inmune (Podack, E.R., and Kupfer, A.
(1991). T-cell effector functions: mechanisms for
delivery of cytotoxicity and help. Annu. Rev. Cell Biol. 7,
479-504; Sancho, D., Montoya, M.C., Monjas, A.,
Gordón-Alonso, M., Katagiri, T., Gil, D., Tejedor,
R., Alarcón, B., and Sánchez-Madrid, F. (2002). TCR
engagement induces proline-rich tyrosine
kinase-2 (Pyk2) translocation to the T
cell-APC interface independently of Pyk2 activity
and in an immunoreceptor tyrosine-based activation
motif-mediated fashion. J. Immunol. 169,
292-300). Por tanto, investigamos si HDAC6 jugaba
algún papel en la translocación del MTOC. Las células transfectadas
con HDAC6-GFP no reorientaban su MTOC hacia las
células presentadoras de antígeno (Fig. 7A, y B), mientras el
tratamiento con TSA, pero no con butirato sódico o trapoxina B,
restauraban la translocación normal (Fig. 7A y B). Por otra parte,
el mutante de HDAC6 deficiente en actividad desacetilasa no
modificaba la reorientación del MTOC (Fig. 7A y B). El análisis
cuantitativo de estos experimentos mostraba que el porcentaje de
células con el MTOC translocado era la mitad en células
transfectadas con HDAC6 que en células tratadas con TSA o
transfectadas con el mutante de HDAC6 deficiente en actividad
desacetilasa (Fig. 7B). En estos mismos experimentos, el
tratamiento con butirato o trapoxina B no afectaba a la
translocación del MTOC (Fig. 7B). Como se describió para el
agrupamiento de CD3, el tratamiento con TSA aumenta la translocación
del MTOC en linfocitos CD4+ de sangre periférica y la acelera en
conjugados celulares entre células J77 y células Raji (Fig. 7 B y
C). También se estudió el efecto de la sobreexpresión de HDAC6 en
otros eventos de activación, concretamente en la producción de
IL-2 y en la expresión del marcador de activación
CD69 (Fig. 7 D y E). Después de 6 horas de la formación de
conjugados en presencia de superantígeno E, la producción de
IL-2 disminuía drásticamente en células
transfectadas con HDAC6-GFP, mientras esta respuesta
funcional no se veía afectada en las células que habían sido
transfectadas con el mutante de HDAC6 deficiente en actividad
desacetilasa (Fig. 7D). Por el contrario, la expresión de CD69 era
estimulada por igual en todas las células estudiadas sin verse
afectada por ningún tratamiento (Fig. 7E).
Estos datos demuestran que HDAC6 juega un papel
dual en la reorientación del MTOC regulando la organización
espacial de los receptores de membrana de la sinapsis inmune y
controlando la reorganización de la red de microtúbulos que tiene
lugar durante la formación de conjugados entre células T y células
presentadoras de antígeno.
A continuación se describen en detalle los
Materiales y Métodos utilizados para la realización de los ejemplos
de la presente invención.
Los anticuerpos anti-CD3 T3b,
anti-LFA-1 TP1/40,
anti-ICAM-3 TP1/24 y
anti-CD4 HP2/6 han sido descritos previamente
(Campanero, M.R., del Pozo, M.A., Arroyo, A.G.,
Sánchez-Mateos, P., Hernández, T., Craig, A.,
Pulido, R., and Sánchez-Madrid, F. (1993).
ICAM-3 interacts with LFA-1 and
regulates the LFA-1/ICAM-1 cell
adhesion pathway. J. Cell Biol. 123: 1007-1016). El
anticuerpo policlonal 488 fue cedido generosamente por el Dr. B.
Alarcón (Centro de Biología Molecular, Madrid), y el anticuerpo
policlonal de conejo purificado por afinidad
anti-HDAC6 se adquirió a través de MBL (Watertown,
MO). Los anticuerpos
B-5-1-2
anti-tubulina-\alpha,
6-11B-1
anti-tubulina-\alpha acetilada y
anti-vimentina así como el anticuerpo policlonal de
conejo frente a IgGs de ratón se adquirió a través de Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO). El anticuerpo 290
anti-GFP procedía de Abcam (Cambridge, UK), y los
anticuerpos anti-CD3 y
anti-\alpha-tubulina marcados con
FITC se adquirieron de Becton Dickinson (San José, CA) y Sigma,
respectivamente.
Los linfocitos humanos CD4+ procedentes de sangre
periférica se purificaron por selección negativa utilizando el
Human T Cell CD4 Subset Column Kit (R&D systems, MN)
siguiendo las instrucciones del fabricante. La línea celular T
humana J77 y la línea celular linfoblásfoidé B Raji fueron
cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)
suplementado con 10% FCS. SEE se adquirió de Toxin Technology
(Saratosa, FL). SEB, fibronectina humana recombinante y
poli-L-lisina (PLL) se obtuvieron de
Sigma. Tricostatina A (TSA) y butirato sódico se obtuvieron de
Calbiochem (San Diego, CA). Trapoxina B fue generosamente cedida
por el Dr. M. Yoshida (Chemical Genetics Laboratory RIKEN, Saitama,
Japan). El fragmento de fibronectina de 80 kD (FN80) fue
generosamente cedido por la Dr. A. García-Pardo
(CIB, Madrid). La sonda fluorescente derivado clorometílico de
aminocumarina (CMAC) procedía de Molecular Probes (Eugene, OR).
Las células Raji se marcaron con la sonda
fluorescente CMAC, se incubaron durante 15 min en presencia o
ausencia de 1\mug/ml de SEE o SEB, y entonces se pusieron en
contacto con el mismo número de células J77 transfectadas con
HDAC6-GFP (2x10^{5} células). A continuación, las
células se centrifugaron a baja velocidad, y se incubaron durante
15 min a 37ºC. Los conjugados celulares se resuspendieron
suavemente, se plaquearon sobre portaobjetos recubiertos de PLL (80
\mul/cristal), y puestos durante 15 min más a 37ºC en el incubador
de células. Las células se fijaron y se permeabilizaron durante 5
min en PBS conteniendo formaldehído 2%-Tritón X-100
0.5%, y se tiñeron para tubulina-\alpha,
tubulina-\alpha acetilada, CD3,
LFA-1 o HDAC6 utilizando los anticuerpos primarios
apropiados y anticuerpos secundarios marcados con Alexa 488 o
rodamina red X (Molecular Probes). Los conjugados celulares se
visualizaron utilizando un microscopio Leica DMR (Leica, Heidelberg,
Germany) con objetivos de inmersión 100 X y un microscopio confocal
Leica TCS-SP. Las secciones confocales se
distanciaron 0.2 \mum en el eje z. Además, se llevo a cabo un
análisis cuantitativo de conjugados que contenían células J77 con
CD3 agrupado en la región central del contacto intercelular en más
de 200 conjugados correspondientes a tres experimentos
independientes. La inmunoprecipitación se llevó a cabo de forma
similar a como se describió previamente (Sancho, D., Montoya, M.C.,
Monjas, A., Gordón-Alonso, M., Katagiri, T., Gil,
D., Tejedor, R., Alarcón, B., and Sánchez-Madrid,
F. (2002). TCR engagement induces proline-rich
tyrosine kinase-2 (Pyk2) translocation to the T
cell-APC interface independently of Pyk2 activity
and in an immunoreceptor tyrosine-based activation
motif-mediated fashion. J. Immunol. 169,
292-300). Para los experimentos de inmunoblot,
4.5x10^{6} células J77 se pusieron en contacto con 1.5x10^{6}
células Raji en presencia o ausencia de SEE o SEB en un volumen de
500 \mul durante idéntico tiempo bajo continua rotación. A
continuación las células se lavaron una vez en PBS, se
resuspendieron en 60 \mul de tampón MES (10 mM de MES a pH 7.4,
150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl_{2}) en presencia de un cóctel
de inhibidores de proteasas (Roche, Manheim, Alemania), se
sonicaron dos veces a 4ºC durante 30 sec y se hirvieron durante 5
min a 100ºC en tampón de Laemmli que contenía
\beta-mercaptoetanol al 5% o
Iodo-acetamida. A continuación los lisados celulares
se centrifugaron a 10.000 x g durante 20 min y los sobrenadantes se
analizaron mediante SDS-PAGE e inmunoblot
utilizando anticuerpos
anti-tubulina-\alpha y
anti-tubulina-\alpha acetilada tal
como ha sido descrito anteriormente (Pipemo, G., and Fuller, M.T.
(1985). Monoclonal antibody specific for an acetylated form of
\alpha-tubulin recognizes the antigen in cilia and
flagella from a variety of organisms. J. Cell Biol. 101,
2085-2094).
Para la expresión de HDAC6-GFP,
se generó por PCR una construcción de HDAC6 carente del codón de
terminación utilizando como molde el cDNA de HDAC6 (Grozinger et
al., 1998) (SEQ ID NO. 1) y los oligonucleótidos 5' [CGGCGTCGAC
GATGACCTCAACCGGC] (SEQ ID NO. 3) y 3'
[CGGCCACCGGTGGGTGTGGGTGGGG
CATATCCTCCCC] (SEQ ID NO. 4). Una vez digerido con SalI y AgeI, el producto resultante de la amplificación se subclonó en el plásmido pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). La construcción que codificaba para el doble mutante inactivo de HDAC6 H216A/H611A se generó utilizando el kit de mutagenésis dirigida QuickchangeTM (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La substitución del codon CAC por GCC se verificó secuenciando la secuencia de nucleótidos que codifica para los dominios HDAC6. Las células J77 se transfectaron transitoriamente por electroporación, básicamente como se ha descrito previamente (Lowin-Kropf, B., Shapiro, V. S., and Weiss, A. (1998). Cytoskeletal polarization of T cells is regulated by an immunoreceptor tyrosine-based activation motif-dependent mechanism. J. Cell Biol. 140: 861-871). Las células viables tras 24 horas después de ser transfect das, se aislaron por centrifugación en un gradiente de Ficoll y se pusieron en contacto con células Raji para llevar a cabo estudios funcionales.
CATATCCTCCCC] (SEQ ID NO. 4). Una vez digerido con SalI y AgeI, el producto resultante de la amplificación se subclonó en el plásmido pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). La construcción que codificaba para el doble mutante inactivo de HDAC6 H216A/H611A se generó utilizando el kit de mutagenésis dirigida QuickchangeTM (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La substitución del codon CAC por GCC se verificó secuenciando la secuencia de nucleótidos que codifica para los dominios HDAC6. Las células J77 se transfectaron transitoriamente por electroporación, básicamente como se ha descrito previamente (Lowin-Kropf, B., Shapiro, V. S., and Weiss, A. (1998). Cytoskeletal polarization of T cells is regulated by an immunoreceptor tyrosine-based activation motif-dependent mechanism. J. Cell Biol. 140: 861-871). Las células viables tras 24 horas después de ser transfect das, se aislaron por centrifugación en un gradiente de Ficoll y se pusieron en contacto con células Raji para llevar a cabo estudios funcionales.
Para determinar los niveles de acetilación de
tubulina en las células J77 transfectadas con HDAC6, estas
(2x10^{6} células/ml) fueron fijadas y permeabilizadas durante 5
min en PBS que contenía paraformaldehido al 1% y saponina al 0.03%.
A continuación, las células se tiñeron utilizando el anticuerpo
anti-tubulina-\alpha acetilada
6-11B-1 y un anticuerpo de cabra
anti-ratón marcado con APC (PharMingen, Becton
Dickinson). La adquisición de datos y el posterior análisis se
llevó a cabo en un citómetro FACsCalibur utilizando el software
Cellquest (Becton Dickinson).
Los cubreobjetos recubiertos de conjugados
celulares fueron montados sobre cámaras abiertas de Attofluor
(Molecular Probes. Eugene, OR) y situadas sobre la platina del
microscopio. Las células fueron mantenidas a 37ºC en una atmósfera
de CO_{2} al 5% utilizando un sistema de incubación
(La-con (GBr) Pe-con (GMBH)). Las
imágenes confocales fueron adquiridas utilizando un microscopio
confocal TCS-SP de Leica (Leica Microsystems,
Heidelberg, Alemania). Cada 30 segundos se obtuvieron series de
imágenes de fluorescencia y de contraste de interferencia
diferencial de células J77 transfectadas con HDAC6 y contactando
desde el inicio con células Raji pulsadas con SEE. Se necesitaron
seis secciones confocales para capturar toda la señal de
fluorescencia. Las secciones ortogonales de la señal de
fluorescencia verde correspondiente a HDAC6-GFP se
superpusieron a las correspondientes imágenes de contraste de
fase.
Una relación 1:1 de células Raji y células T
transfectadas con HDAC6 fueron puestas en contacto durante 15 min a
37ºC en medio RPMI. A continuación, los conjugados celulares se
resuspendieron suavemente y se plaquearon sobre cubreobjetos
recubiertos de PLL durante 15 min más tal como se describió
previamente (Sancho et al., 2002). A continuación, los
conjugados celulares se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para
tubulina-\alpha con el fin de visualizarse por
microscopía de inmunofluorescencia. Se consideró que había tenido
lugar la reorientación del MTOC cuando este se encontraba en
estrecha proximidad con la membrana plasmática de la célula T,
entre el núcleo celular y el área de contacto con la célula
presentadora de antígeno. En cada experimento se contaron al menos
200 conjugados celulares.
La línea celular J77 y los transfectantes
estables derivados de ella que expresaban GFP,
HDAC6-GFP y H216A/
H611 A-GFP fueron puestos en contacto con células Raji a 37ºC durante 6 horas en presencia o ausencia de SEE (0.5 \mug/ml). A continuación, se determinó la producción de IL-2 en los sobrenadantes y la expresión de CD69 en las células T. Para distinguir las células J77 positivas para V\beta8 de las células B Raji las células fueron teñidas doblemente utilizando un anticuerpo anti CD69 PE (Leu23, Becton Dickinson) y un anticuerpo anti-V\beta8 biotinilado (Becton Dickinson-PharMingen) más Estreptavidina-APC. Para determinar la concentración de IL-2 se utilizó el kit IL-2 Eli-pair (Diaclone, Besancon, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante.
H611 A-GFP fueron puestos en contacto con células Raji a 37ºC durante 6 horas en presencia o ausencia de SEE (0.5 \mug/ml). A continuación, se determinó la producción de IL-2 en los sobrenadantes y la expresión de CD69 en las células T. Para distinguir las células J77 positivas para V\beta8 de las células B Raji las células fueron teñidas doblemente utilizando un anticuerpo anti CD69 PE (Leu23, Becton Dickinson) y un anticuerpo anti-V\beta8 biotinilado (Becton Dickinson-PharMingen) más Estreptavidina-APC. Para determinar la concentración de IL-2 se utilizó el kit IL-2 Eli-pair (Diaclone, Besancon, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante.
<110> UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE LOS COMPUESTOS REGULADORES DE
LA ACTIVIDAD TUBULINA DESACETILASA DE HDAC6 EN LA ELABORACIÓN DE
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE
DICHOS COMPUESTOS REGULADORES, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y
SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HDAC6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3648)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de HDAC6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo HDAC6 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcgtcgac gatgacctca accggc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo HDAC6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggccaccgg tgggtgtggg tggggcatat cctcccc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Procedimiento de identificación y evaluación
de la actividad de compuestos reguladores de la proteína HDAC6
sobre la activación de linfocitos T caracterizado porque
comprende los siguientes pasos:
- i)
- contacto de linfocitos T, preferentemente humanos, con el potencial compuesto objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
- ii)
- determinación de un parámetro indicativo de los niveles de acetilación de la tubulina de los linfocitos T de i) o de cualquier otro relacionado con el proceso de activación de los linfocitos T en el que participe la proteína HDAC6, e
- iii)
- identificación de un compuesto inhibidor o agonista de la actividad de la proteína HDAC6 cuando se observa un incremento de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la activación de linfocitos T o cuando se observa una disminución de la acetilación de la tubulina y/o un parámetro indicativo de la inactivación de linfocitos T, respectivamente.
2. Procedimiento de identificación de potenciales
inhibidores según la reivindicación 1 caracterizado porque
los linfocitos T del punto i) pueden ser estimulados o preparados
mediante procedimientos, entre otros, los pertenecientes al
siguiente grupo: la estimulación con células presentadoras de
antígeno (por ejemplo, células Raji) más SEE y transformación de los
cultivos celulares de linfocitos T con una construcción genética
que permita la expresión del gen HDAC6, y que permiten una mejor
evaluación del efecto de dichos potenciales compuestos
inhibidores.
3. Procedimiento de identificación de compuestos
según la reivindicación 1 caracterizado porque la
determinación de los niveles de acetilación de la tubulina de ii)
se realiza mediante técnicas de inmunoblot o western blot con
anticuerpos adecuados.
4. Procedimiento de identificación de compuestos
según la reivindicación 1 caracterizado porque la
determinación de un parámetro relacionado con el proceso de
activación de los linfocitos T de ii) se realiza, entre otras
posibles, mediante una técnica perteneciente al siguiente grupo:
- i)
- determinación del agrupamiento o concentración de CD3 en la sinapsis inmune (c-SMAC),
- ii)
- determinación de la desorganización de LAF-1 en el anillo periférico de la sinapsis inmune,
- iii)
- determinación de la translocación del centro organizador de microtúbulos (MTOC), y
determinación de la secreción de
IL-2 y de la expresión de CD69.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400107A ES2239529B1 (es) | 2004-01-20 | 2004-01-20 | Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones. |
| EP05701674A EP1707622A1 (en) | 2004-01-20 | 2005-01-17 | Use of compounds that regulate hdac6 tubulin deacetylase activity in the preparation of pharmaceutical compositions, method of identifying the aforementioned regulating compounds, said pharmaceutical compounds and applications thereof |
| PCT/ES2005/000019 WO2005078081A1 (es) | 2004-01-20 | 2005-01-17 | Uso de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 en la elaboración de composiciones farmacéuticas, procedimiento de identificación de dichos compuestos reguladores, dichas composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200400107A ES2239529B1 (es) | 2004-01-20 | 2004-01-20 | Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2239529A1 ES2239529A1 (es) | 2005-09-16 |
| ES2239529B1 true ES2239529B1 (es) | 2006-10-01 |
Family
ID=34854875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200400107A Expired - Fee Related ES2239529B1 (es) | 2004-01-20 | 2004-01-20 | Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1707622A1 (es) |
| ES (1) | ES2239529B1 (es) |
| WO (1) | WO2005078081A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2100879A1 (en) | 2008-03-13 | 2009-09-16 | 4Sc Ag | Novel N-substituted tetrahydroisoquinoline/isoindoline hydroxamic acid compounds |
| WO2014089121A2 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Thomas Ichim | Retrograde delivery of cells and nucleic acids for treatment of cardiovascular diseases |
| WO2021113401A2 (en) * | 2019-12-02 | 2021-06-10 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Histone deacytlase 6 modulation of titin protein mediated cardiac tissue stiffness and method for same |
| CN112852874B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-05-23 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Hdac5基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0005199D0 (en) * | 2000-03-04 | 2000-04-26 | Imp College Innovations Ltd | Modulation of histone deacetylase |
| NO20032183L (no) * | 2002-05-15 | 2003-11-17 | Schering Ag | Histon-deacetylase-inhibitor og anvendelse derav |
-
2004
- 2004-01-20 ES ES200400107A patent/ES2239529B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-17 WO PCT/ES2005/000019 patent/WO2005078081A1/es not_active Ceased
- 2005-01-17 EP EP05701674A patent/EP1707622A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAGGARTY, S. J., KOELLER, K. M., WONG, J. C., et al. Domain- selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. Abril 2003, Vol. 100, Nº8, páginas 4389-4394. \\ A 2 * |
| KUHN, J. R., POENIE, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. Enero 2002, Vol. 16, páginas 111-121. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005078081A1 (es) | 2005-08-25 |
| ES2239529A1 (es) | 2005-09-16 |
| EP1707622A1 (en) | 2006-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Florio et al. | Disruption of nNOS‐PSD95 protein–protein interaction inhibits acute thermal hyperalgesia and chronic mechanical allodynia in rodents | |
| Bentzinger et al. | Wnt7a stimulates myogenic stem cell motility and engraftment resulting in improved muscle strength | |
| Conacci-Sorrell et al. | Stress-induced cleavage of Myc promotes cancer cell survival | |
| Wu et al. | Functional up‐regulation of P2X3 receptors in dorsal root ganglion in a rat model of bone cancer pain | |
| US20100061984A1 (en) | Compositions and methods for modulation of suppressor t cell activation | |
| Aboubakar Nana et al. | Therapeutic potential of focal adhesion kinase inhibition in small cell lung cancer | |
| Srikanth et al. | Nanofiber-mediated inhibition of focal adhesion kinase sensitizes glioma stemlike cells to epidermal growth factor receptor inhibition | |
| López-Ornelas et al. | Neural stem cells producing an inducible and soluble form of Gas1 target and inhibit intracranial glioma growth | |
| Park et al. | Combination treatment with VPA and MSCs-TRAIL could increase anti-tumor effects against intracranial glioma | |
| Chang et al. | The synergistic effects of valproic acid and fluvastatin on apoptosis induction in glioblastoma multiforme cell lines | |
| Lucena et al. | Anti-angiogenic activities of two recombinant disintegrins derived from the Mohave and Prairie rattlesnakes | |
| Ayanlaja et al. | Doublecortin undergo nucleocytoplasmic transport via the RanGTPase signaling to promote glioma progression | |
| Hefferan et al. | Spinal astrocyte glutamate receptor 1 overexpression after ischemic insult facilitates behavioral signs of spasticity and rigidity | |
| IL268129B2 (en) | Preparations and methods for controlling the activation and function of natural killer cells (NK (NATURAL KILLER) cells) | |
| Bianchi et al. | Cell trafficking in multiple myeloma | |
| Loberg et al. | PAR1‐mediated RhoA activation facilitates CCL2‐induced chemotaxis in PC‐3 cells | |
| ES2239529B1 (es) | Procedimiento de identificacion de los compuestos reguladores de la actividad tubulina desacetilasa de hdac6 y sus aplicaciones. | |
| US20240408071A1 (en) | Novel combination of serotonin receptor (5-htr2b) antagonist and an immunomodulator and chemotherapeutic drugs for inhibition of cancer | |
| Fang et al. | Enhanced cell growth and tumorigenicity of rat glioma cells by stable expression of human CD133 through multiple molecular actions | |
| Thomas et al. | Inhibition of nuclear translocation of nuclear factor-κB despite lack of functional IκBα protein overcomes multiple defects in apoptosis signaling in human B-cell malignancies | |
| Ni et al. | Intrathecal injection of selected peptide Myr-RC-13 attenuates bone cancer pain by inhibiting KIF17 and NR2B expression | |
| US10494345B2 (en) | Modulators of cell adhesion, methods and compositions therefor | |
| Samarakoon et al. | UNC119 regulates T-cell receptor signalling in primary T cells and T acute lymphocytic leukaemia | |
| KR100898159B1 (ko) | 도파민 신경세포 상의 ｐ２ｘ７ 수용체의 활성 억제 기작 | |
| Simper et al. | NR4A nuclear receptor expression in human macrophages mediates apoptosis and controls Mycobacterium tuberculosis growth |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20050916 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2239529B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20240126 |