ES2240162T3

ES2240162T3 - Transformacion mejorada de celulas vegetales mediante la adicion de genes huesped implicados en la integracion del t-adn.

Info

Publication number: ES2240162T3
Application number: ES00963474T
Authority: ES
Inventors: Stanton B. Gelvin; Kirankumar S. Mysore
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: EP1212442B1; ATE295893T1; CA2383391C; DE60020248T2; AU7488500A; EP1212442A2; JP2003509058A; WO2001020012A3; DE60020248D1; AU782896B2; WO2001020012A9; WO2001020012A2; CA2383391A1

Abstract

Método para aumentar las frecuencias de transformación en una planta huésped, comprendiendo dicho método: a) adición de por lo menos una copia del gen de histona vegetal a la planta huésped, y b) expresión de las copias del gen de la histona vegetal para incrementar las frecuencias de transformación.

Description

Transformación mejorada de células vegetales mediante la adición de genes huésped implicados en la integración del T-ADN.

Antecedentes

La invención se refiere a unas frecuencias de transformación de plantas con Agrobacterium mejoradas debidas a la sobreexpresión del gen de la histona H2A codificado por el gen RAT5 de Arabidopsis. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram negativa del suelo que ha sido explotada por los biólogos vegetales para introducir un ADN extraño en las plantas. Sin embargo, existen algunas limitaciones en la utilización de dicho vector de transformación, es decir dificultades en la transformación de monocotiledóneas, y las frecuencias de transformación pueden ser demasiado bajas para ser útiles. A pesar del conocimiento de dicha técnica práctica, el mecanismo actual de la transferencia de ADN de una bacteria a las plantas no se entiende completamente.

Agrobacterium tumefaciens transforma genéticamente las células vegetales mediante la transferencia de la porción del plásmido Ti bacteriano, designado como el T-ADN, a la planta, y la integración del T-ADN en el genoma de la planta. Se sabe poco sobre el procedimiento de integración del T-ADN, y no se han identificado genes de la planta implicados en la integración. El ADN que se transfiere de Agrobacterium a la célula vegetal es un segmento del plásmido Ti, o inductor de tumor, denominado T-ADN (ADN transferido). Los genes de virulencia (vir) responsable del procesamiento y la transferencia de T-ADN se describen por unirse en cualquier lugar del plásmido Ti. Se describe el papel de los genes vir en el procesamiento del T-ADN, la formación de los canales bacterianos para exportar el T-ADN, y la unión de la bacteria a la célula vegetal (Sheng and Citovsky, 1996; Zupan and Zambryski, 1997). Por el contrario, se sabe poco sobre el papel de los factores vegetales en la transferencia e integración T-ADN. Se ha descrito recientemente el aislamiento del putativo factor vegetal. Ballas y Citovsky han demostrado que la carioferina \alpha vegetal (AtKAP \alpha) puede interaccionar con las secuencias VirD2 de localización nuclear en un sistema de interacción doble híbrido en levaduras, y está presuntamente implicado en la translocación nuclear del complejo T. Utilizando un enfoque similar, se identificó una proteína del tomate una fosfatasa de tipo 2C, que puede interactuar con NLS VirD2. De forma diferente de AtKAP \alpha, DIG 3 juega un papel negativo en el transporte nuclear. Después de que el complejo T-ADN /complejo T entre en el núcleo, debe integrarse en el cromosoma de la planta. El ADN cromosomial de la planta se empaqueta en los nucleosomas que constan principalmente de proteínas histonas. El ADN entrante debe interactuar con la estructura de nucleosoma durante el proceso de integración. Sin embargo, el T-ADN se puede integrar preferentemente en las regiones transcritas del genoma. Se cree que dichas regiones están temporalmente libres de histonas. Se desconoce de que modo tiene lugar exactamente la integración del T-ADN. Informes recientes han demostrado la implicación de la proteína VirD2 en el procedimiento de integración de T-ADN. Las proteínas vegetales están asimismo probablemente implicados en dicho procedimiento (Deng et al., 1998; Ballas y Citovsky, 1997; Tao et al.) . Otra evidencia de la implicación de los factores vegetales en la transferencia e integración de T-ADN deriva de la identificación de diferentes ecotipos de Arabidopsis que son resistentes a la transformación con Agrobacterium.

Para identificar los genes vegetales implicados en la transformación mediada por Agrobacterium, se seleccionó una librería de T-ADN marcada de Arabidopsis para los mutantes que son resistentes a la transformación por Agrobacterium (mutantes rat).Se dan varias etapas en las que los genes vegetales están probablemente implicados en el procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium. Primero, los factores que codifican para plantas pueden estar implicados en la etapa inicial de unión bacteriana a la superficie de la célula vegetal. Los mutantes y ecotipos que son deficientes en la unión bacteriana han sido identificados y los genes implicados en la unión bacteriana se están caracterizando actualmente. La etapa siguiente en la que puede estar implicado un factor(es) vegetal (es) es la transferencia de hebras T de la bacteria a las células vegetales a través de la pared de la célula vegetal y de la membrana. Después de que el T-ADN /Complejo T entre en el citoplasma de la célula vegetal, se necesitan los factores vegetales para transportar el complejo T al núcleo.

El documento WO 9712046 describe un método para la consecución de una integración estable de un fragmento de ADN exógeno de una forma intacta en el genoma de la célula eucariota, particularmente en una célula vegetal. El método utiliza unos constructos que comprenden los genes Vir para mejorar la frecuencia de transformación de las plantas mediante la mejora de la integración de T-ADN.

Un mutante marcado de T-ADN de Arabidopsis, rat 5, se ha caracterizado porque es deficiente en la integración de T-ADN y es resistente a la transformación de la raíz mediada por Agrobacterium. Tanto el análisis genético como el análisis por transferencia de ADN indicaron que existen dos copias de T-ADN integradas como una repetición tándem en un locus único en rat5. No se dan reajustes mayores en el ADN vegetal de rat5 que rodea inmediatamente el sitio de inserción T-ADN. Dichos resultados sugieren claramente que en rat5 el T-ADN se insertó en un gen necesario para la transformación mediada por Agrobacterium. La secuencia del T-ADN del extremo izquierdo de la unión de la planta indicó que el T-ADN se insertó en la región 3' no traducida del gen de la histona H2A. Dicha inserción se encuentra antes del señal consenso de poliadenilación. Mediante la selección en una librería de cADN de ecotipo Ws de Arabidopsis y mediante la secuenciación de 20 clones de cDNA de diferentes de histonas H2A, y mediante la realización de una búsqueda en una base de datos por ordenador, se mostraron por lo menos seis genes de histonas H2A diferentes. Dichos genes codifican para proteínas que son más del 90% idénticas a nivel de la secuencia de aminoácidos. De este modo, los genes de las histonas H2A comprenden una pequeña familia de multigenes en Arabidopsis.

La integración de T-ADN no parece producirse por recombinación homóloga, considerada con el método más común para la integración de un ADN extraño en los procariotas y eucariotas inferiores, debido a que no se ha encontrado gran homología entre el T-ADN y las secuencias diana. Se ha descrito que el T-ADN integra mediante una recombinación ilegítima (Matsumoto et al., 1990; Gheysen et al., 1991; Mayerhofer et al., 1991; Ohba et al., 1995). La recombinación ilegítima es el mecanismo predominante de integración de ADN en el genoma de plantas superiores (Britt, 1996; Offringa et al., 1990; Paszkowski et al., 1988).

Se necesita información de factores que afecten a las frecuencias de transformación por Agrobacterium en plantas para mejorar la realización del presente método.

Sumario de la invención

La invención se refiere a unas frecuencias de transformación con Agrobacterium en plantas incrementadas debido a la adición de por lo menos un gen implicado en la integración de T-ADN del huésped, en el huésped vegetal. En una forma de realización, la adición de por lo menos un gen de una histona H2A codificada por el gen RAT5 de Arabidopsis potencia las frecuencias de transformación, más probablemente debido a la sobreexpresión de la histona como un compuesto de los niveles de expresión naturales del huésped. El gen puede ser o bien en plantas transgénicas o llevado a cabo mediante el agente transformante, T-ADN para la realización de la invención.

La sobreexpresión de los genes de histonas de la presente invención supera el bajo rendimiento que limita el uso de Agrobacterium como vector transformante. Muchas plantas pueden transformarse de forma transitoria mediante Agrobacterium por lo que pueden expresar el gen transformante durante un periodo de tiempo, pero no se transforman establemente debido a los problemas integración de T-ADN. Por lo tanto, no se producen en las plantas transgénicas. El gen de H2A (RAT5) juega un papel importante en la recombinación ilegítima de T-ADN en el genoma de la planta y la sobreexpresión del gen aumenta la transformación.

Los datos de expresión de GUS (\beta-glucuronidasa) transitaria y estable y la valoración de la cantidad del T-ADN integrado en los genomas de un tipo salvaje y las plantas rat5 de Arabidopsis indicaron que los mutantes rat5 es deficiente en la integración de T-ADN requerida para la transformación. La complementación de la mutación rat5 se consiguió mediante la expresión de RAT5 de tipo salvaje del gen de la histona H2A en la planta mutante. Sorprendentemente, la sobreexpresión de RAT5 en unas plantas de tipo salvaje incrementó la eficacia de transformación de Agrobacterium. Además, la expresión transitoria de un gen RAT5 a partir del T-ADN entrante fue suficiente para complementar el mutante rat5 y para incrementar la eficacia de transformación de las plantas Arabidopsis de tipo salvaje. La presente invención proporciona métodos y composiciones para incrementar la eficacia de transformación estable en plantas utilizando una implicación directa del gen de histona vegetal en la integración de T-ADN.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra las características del mutante rat5: (A) transformación estable de un ecotipo de tipo salvaje Ws de Arabidopsis, el mutante rat5, y la progenie F1; (B) secuencia de la región de unión rat5/T-ADN; (C) patrón de integración del T-ADN en rat5; LB, extremo izquierdo de T-ADN; RB, extremo derecho de T-ADN, pBR322, secuencias pBR322 que contienen el gen \beta-lactamasa y el origen de replicación ColE1; Tn903, gen de resistencia a la kanamicina para la selección de E.coli; Tn5, gen de resistencia a la kanamicina para la selección de las plantas.

La Fig. 2 muestra la complementación del mutante rat5 y la sobreexpresión de RAT5 en las plantas de tipo salvaje de Arabidopsis; mapas de los vectores binarios pKM4 (A) y pKM5 (B) RB; extremo derecho de T-ADN; LB, extremo izquierdo de T-ADN, pAnos, secuencia señal de poliadenilación de nopalina sintasa; histona H2A; secuencia que codifica para el gen de la histona H2A de RAT5; pH2A, secuencia promotora del gen de la histona H2A de RAT5; Pnos, promotor de nopalina sintasa, hpt, gen de resistencia a la higromicina; pAg7; secuencia señal de poliadenilación de agropina sintasa; uidA, gen de gusA sin promotor; las flechas sobre la histona H2A, uidA, y los genes hpt indican la dirección de transcripción; (C) la complementación del mutante rat5; (D) ensayo de tumorogénesis de las plantas transgénicas Ws que sobreexpresan el gen de la histona H2A de RAT5.

La Fig. 3 muestra los ensayos de integración de T-ADN de las plantas rat5 y Ws; (A) expresión transitoria y estable de GUS en Ws y rat5; (B) integración de T-ADN en rat5 y Ws.

Descripción de la invención

Se han identificado diversos mutantes T-ADN marcada [plantas cuyos genes han sido interrumpidos de forma aleatoria mediante la integración de un T-ADN] que son recalcitrantes para la transformación de la raíz con Agrobacterium. Dichos mutantes se denominan mutantes rat (resistentes a la transformación por Agrobacterium). En la mayoría de dichos mutantes la transformación con Agrobacterium se bloquea en una etapa muy temprana, o bien durante la unión bacteriana a la célula vegetal o antes de la entrada nuclear de T-ADN. En algunos de los mutantes, sin embargo, la etapa de integración de T-ADN está más probablemente bloqueada. Debido a que se han identificado anteriormente los factores vegetales implicados en la recombinación ilegítima de T-ADN en el genoma de la planta, la caracterización del T-ADN marcado del mutante de Arabidopsis, rat5, que es deficiente en la integración de T-ADN, es un aspecto de la presente invención.

La caracterización del mutante de rat5, rat5, un mutante de T-ADN marcado de Arabidopsis, se ha identificado anteriormente como resistente a la transformación de raíz con Agrobacterium. Se llevó a cabo una inoculación de raíz in vitro utilizando una cepa de Agrobacterium de tipo salvaje A208 (At10). Después de un mes, se calculó el porcentaje de los haces de la raíz que había formado tumores. Más del 90% de los haces de raíz de las plantas de tipo salvaje (ecotipo Ws) formaron unos grandes teratomas verdes. Por el contrario, menos del 10% de los haces de la raíz de las plantas rat5 respondió a la infección, formando unos pequeños callos amarillos (FIG. 1A). Una planta homocigoto rat5 (donante de polen) se cruzó con una planta de tipo salvaje (donante de huevos) y la progenie resultante F1 se ensayó para la susceptibilidad a la transformación con Agrobacterium. Dicho análisis indicó que rat5 es una mutación dominante (7; Fig. 1A). Análisis adicionales de la progenie F2 demostraron que la resistencia a la kanamicina segregó 3:1, indicando que se ha interrumpido en un locus único por la mutagénesis del T-ADN. La resistencia a kanamicina se co-segregó con el fenotipo rat5, indicando que el gen implicado en la transformación con Agrobacterium es más probable que se haya mutado mediante la inserción de T-ADN.

Recuperación de una unión de T-ADN - planta de rat5. El patrón de integración de T-ADN en el mutante rat5 se determinó mediante unos análisis de transferencia de ADN. Los resultados indicaron que sólo había dos copias del T-ADN mutagenizado integradas en el genoma del mutante rat5. Análisis adicionales indicaron que dichas dos copias de T-ADN están presentes a modo de una repetición tándem directa, tal como se muestra en la Fig. 1C.

Un extemo izquierdo (LB) de la unión T-ADN -planta se recuperó a partir del rat5 utilizando una técnica de rescate de plásmido (ver Materiales y Métodos) y se construyó un mapa de restricción por endonucleasa de dicha unión T-ADN-planta. Se subclonó en el pBluescript un fragmento de aproximadamente 1,7 kbp EcoRI que contiene tanto el ADN de planta como el de LB y se secuenció a continuación en el centro de secuenciación de la Universidad de Purdue. La secuencia de dicho fragmento se muestra en la Fig. 1B. El análisis de la secuencia de ADN de dicha región de unión indicó que el T-ADN se insertó en la región no traducida 3' (UTR) del gen de la histona H2A (FIG. 1B). Los genes de la histona H2A de Arabidopsis se caracterizaron adicionalmente mediante el aislamiento y la secuenciación de numerosos cADNs y clones genómicos. Se identificaron seis variantes de genes diferentes de la histona H2A, indicando que los genes de la histona H2A de Arabidopsis comprenden una pequeña familia de multi-genes. En una librería de ADN genómico lambda, se identificó un clon que contiene el gen de tipo salvaje de la histona H2A que corresponde a RAT5. El análisis de la secuencia de ADN de dicho clon genómico indicó que en rat5 el ADN se insertó antes de la señal consenso de poliadenilación (AATAA). El análisis de transferencia de ADN de los ADN de Ws y rat5 indicó que la inserción de T-ADN en rat5 no causó ningún reajuste mayor en el ADN de la planta inmediatamente próximo al sitio de inserción. La disrupción de los 3' UTR del gen de la histona H2A de RAT5 es probablemente la única causa para el fenotipo rat en el mutante rat5.

La Fig. 1 muestra la caracterización del mutante rat 5. (A) transformación estable del ecotipo de tipo salvaje Ws de Arabidopsis, el mutante rat5, y la progenie F1. Unos segmentos de raíz estériles se infectaron con A. tumefaciens A208. Dos días después del co-cultivo, se transfirieron las raíces a un medio MS que no presenta fitohormonas y que contiene timentin como antibiótico. Los tumores se midieron después de cuatro semanas. (B) Secuencia de la región de la unión rat5/T-ADN. (C) El patrón de integración de T-ADN en rat5. LB, extremo izquierdo de T-ADN; RB, extremo derecho de T-ADN, pBR322, secuencias pBR322 que contienen el gen \beta-lactamasa y el origen de replicación ColE1; Tn903, gen de resistencia a la kanamicina para la selección de E.coli; Tn5, gen de resistencia a la kanamicina para la selección de la planta. Se digirieron cinco \mug de ADN genómico del mutante rat5 con o bien EcoRI o SAlI y se transfirieron a una membrana de nilón. Se utilizó un fragmento EcoRI y SalI de pBR322 como sonda de hibridación. Los tamaños del fragmento de restricción mostradas por encima del T-ADN se detectaron mediante la digestión con EcoRI y los tamaños mostrados por debajo del T-ADN se detectaron mediante la digestión con SalI.

La complementación del mutante de rat5 con un gen de histona H2A de tipo salvaje (RAT5). Se han preparado dos construcciones diferentes para realizar el análisis de complementación del mutante rat5. Primero, se fusionó un terminador de nopalina sintasa (3' NOS) a la región 3' del fragmento de unión de 1,7 kbp (la secuencia de dicho fragmento de 1,7 kbp se muestra en la Fig. 1B). Dicha construcción contiene el gen de la histona H2A de RAT5 con su propio promotor y un 3' NOS. Dicho fragmento (RAT5 más 3' NOS) se clonó en el vector binario pGTV-HPT de un recipiente que contiene un gen de resistencia a la higromicina entre los extremos izquierdo y derecho del T-ADN, dando como resultado un vector binario pKM4 (FIG. 2 A). Para la segunda construcción, se clonó un fragmento genómico SacI de 9,0 kbp de un ADN Ws de tipo salvaje que contiene un gen de histona H2A (RAT5) más por lo menos unas secuencias de 2,0 kbp anterior y posterior a RAT5 en el vector binario pGTV-HPT, dando como resultado el vector binario pKM5 (FIG. 2B). pKM4 y pKM5 se transfirieron separadamente a la cepa no tumorogénica de Agrobacterium GV3101, dando como resultado unas cepas A. tumefaciens At1012 y At1062, respectivamente.

Ambas cepas At1012 y At1062 se utilizaron separadamente para transformar las plantas rat5 utilizando un método de transformación de la línea germinal (Bent et al., 1998) y se seleccionaron unas plantas rat 5 transgénicas para la resistencia a la higromicina (20 \mug/ml). Se obtuvieron diversas plantas transgénicas (T1). Dichas plantas transgénicas se dejaron auto-fertilizar y se recogieron las semillas T1. Se seleccionaron al azar seis líneas transgénicas mediante la transformación con At1012 (la histona de tipo salvaje H2A con 3' NOS) y se germinaron sus semillas en presencia de higromicina. Los ensayos de tumorogénesis se realizaron tal como se ha descrito en Nam et al. (1999) utilizando A.tumefaciens At10 y un protocolo de inoculación de raíz estéril, en por lo menos cinco plantas diferentes a partir de cada una de las seis líneas transgénicas. Los resultados indicaron que en cinco de las seis líneas transgénicas rat5 ensayadas, se recuperó el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis (Fig. 2C, Tabla 1). Los teratomas provocados en las raíces de dichas plantas tenían un aspecto similar a los tumores generados en las plantas de tipo salvaje. Una de las plantas transgénicas ensayadas no recuperó el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis, probablemente debido a un transgen inactivo. Las plantas transgénicas T1 de rat5 obtenidas mediante la transformación con At1062 (que contienen un genómico que codifica para RAT5 de la planta de tipo salvaje) se ensayaron también para la recuperación del fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis. Algunas de dichas plantas también fueron capaces de recuperar el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis, indicando la complementación de la mutación rat5. Las plantas transgénicas higromicina resistentes generadas mediante la transformación del mutante rat5 con pGPTV-HPT únicamente no formaron tumores tras la infección con A.tumefaciens A208.

Para confirmar las bases genéticas del experimento de la complementación, se realizó un experimento de co-segregación en una de las líneas transgénicas rat5 (rat5 At1012-6) obtenida mediante la transformación del mutante rat5 con A.tumefaciens At1012. Con el fin de examinar la co-segregación del T-DNA complementario que contiene el gen RAT5 de tipo salvaje con el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis, se germinaron semillas de la planta T2 homocigoto para la mutación rat5 pero heterocigoto para la resistencia a la higromicina y se hicieron crecer en un medio B5 sin selección. Seguidamente se ensayaron las raíces de dichas plantas para la resistencia a la higromicina y la susceptibilidad a la tumorogénesis en forma de corona. Todas las plantas que eran sensibles a la higromicina también eran resistentes a la formación de tumores de un modo similar al del mutante rat5. De las 25 plantas higromicina resistentes, por lo menos 8 fueron susceptibles a la tumorogénesis. Sin embargo, 17 plantas higromicina resistentes permanecieron recalcitrantes a la transformación mediada por Agrobacterium. Resulta probable que dichas plantas sean heterocigotos con respecto al gen complementario RAT5 y no expresen dicho gen a un nivel lo suficientemente elevado para recuperar la susceptibilidad a la tumorogénesis. Dicha posibilidad corresponde al hallazgo que la mutación rat5 es dominante, y que por lo tanto una copia activa de RAT5 no es suficiente para permitir la transformación mediada por Agrobacterium. En conjunto, los datos moleculares y genéticos indican claramente que en el mutante rat5 la disrupción del gen de la histona H2A es responsable del fenotipo de la deficiencia de tumorogénesis (rat).

La sobreexpresión de un gen de la histona H2A (RAT5) en unas plantas de tipo salvaje mejora la eficacia de la transformación con Agrobacterium. Para determinar con mayor detalle si el gen RAT5 juega un papel directo en la transformación mediada por Agrobacterium, se utilizó A.tumefaciens At1012 para generar diversas plantas Arabidopsis transgéncias (ecotipo Ws) que contienen unas copias adicionales del gen histona H2A de RAT5. Dichas plantas transgénicas se dejaron auto-polinizar, se recogieron semillas T1, y se germinaron las plantas T2 en presencia de higromicina. Los ensayos de tumorogénesis se realizaron tal como se describe en la presente memoria en por lo menos cinco plantas de cada una de las cuatro líneas transgénicas. Debido a que normalmente el ecotipo Ws resulta altamente susceptible a la transformación con Agrobacterium, el ensayo de tumorogénesis se alteró para detectar cualquier diferencia sutil entre la planta de tipo salvaje susceptible de transformación y las plantas transgénicas de tipo salvaje que sobreexpresan RAT5. Dichas alteraciones incluyen la inoculación de segmentos de raíces con una concentración 100 veces inferior (2x10^{7} ufc/ml) de bacteria de la que se utiliza normalmente (2x10^{9} ufc/ml), y expandiendo los segmentos individuales de raíz en lugar de los haces de los segmentos de raíz en un medio MS para observar la producción de tumores. Los resultados, mostrados en la Tabla 1 y Fig. 2D, indican que las plantas transgénicas que sobreexpresan RAT5 son aproximadamente el doble de susceptibles a la transformación de la raíz que las plantas de tipo salvaje Ws. Dichos resultados indican que el gen histona H2A de RAT5 juega un papel directo en la transformación de T-ADN, y la sobreexpresión de RAT5 puede incrementar la susceptibilidad a la transformación.

La expresión transitoria de la histona H2A es suficiente para permitir la transformación de rat5 y para incrementar la eficacia de transformación de las plantas de tipo salvaje Ws. La expresión del gen de histona H2A de RAT5 del T-ADN entrante complementa el mutante rat5. A pesar de que la transformación de dicho mutante con una cepa de Agrobacterium que alberga pGTP-HYG (le falta el gen de la histona H2A) dio como resultado sólo en algunas, crecimiento lento en un medio de selección con higromicina, cepas de Agrobacterium que albergan pKM4 o pKM5 provocaron un crecimiento rápido de callos higromicina resistentes en el 60 \pm 21% y 54 \pm 22% de los haces de segmentos de raíz rat5, respectivamente. Además, cuando se infectaron plantas de tipo salvaje (a una baja densidad bacteriana) con una cepa tumorogénica de Agrobacterium (A208) que alberga pKM4, el 78 \pm 8% de los segmentos de raíz desarrolló tumores, comparado con el 36 \pm 9% de los segmentos de raíz infectados con una cepa bacteriana tumorogénica que alberga pGPTV-HYG. Dichos experimentos de transformación indican que las cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios pKM4 o pKM5 son capaces de transformar las plantas mutantes rat5 a una eficacia relativamente alta, y en las plantas de tipo salvaje son dos veces más tumorogénicas, y están más capacitadas para provocar callos higromicina resistentes, que las cepas de Agrobacterium que contienen el vector binario pGPTV-HYG "vacío". La histona H2A producida transitoriamente puede mejorar la eficacia de transformación estable de las plantas mediante Agrobacterium.

El mutante rat5 es deficiente en integración de T-ADN. La transformación mediada por Agrobacterium de los mutantes rat5 de Arabidopsis da como resultado una gran eficacia de transformación transitoria pero una baja eficacia de transformación estable, cuando se determina mediante la expresión del gen gusA codificado por T-ADN. Dicho resultado sugiere que rat5 es muy probablemente deficiente en la integración de T-ADN. Para ensayar dicha hipótesis, se infectaron directamente segmentos de raíz de plantas Ws y rat5 con A.tumefaciens GV3101 que albergan el vector T-ADN binario pBISN1. pBISN1 contiene un intrón del gen gusA bajo en control de un "super-promotor" (Ni et al., Narasimhulu et al., 1996). Dos días después del co-cultivo, se transfirieron los segmentos de raíz a un medio inductor de callos que contiene timentin (100 \mug/ml) para matar la bacteria. Tres días después de la infección, se tiñeron algunos segmentos para medir la actividad GUS utilizando el tinte cromogénico X-Gluc. Tanto el tipo salvaje como el mutante rat5 mostraron unos niveles de expresión GUS elevados (aproximadamente el 90% de los segmentos de raíz se tiñeron de azul; Fig. 3A). Los segmentos de raíz restantes se dejaron hasta formar callos en el medio inductor de callos que contiene timentin para matar el Agrobacterium, pero sin ningún antibiótico para la selección de la transformación de la planta. Después de cuatro semanas se tiñeron con X-Gluc numerosos callos derivados de por los menos cinco plantas diferentes Ws y rat5. De los callos WS ensayados, el 92 \pm 12% mostró unas áreas ampliamente teñidas de azul, mientras que sólo el 26 \pm 10% de los callos rat5 mostró actividad GUS, y la mayoría de dichas regiones teñidas de azul fueron pequeñas (FIG. 3A). Dichos datos indican que a pesar de que el mutante rat5 puede expresar de forma transitoria el gen gusA a unos niveles elevados, falla al estabilizar la expresión gusA.

Las líneas celulares en suspensión se generaron a partir de dichos callos Ws y rat5 y después de otro mes adicional se ensayó la cantidad de T-ADN (utilizando como sonda de hibridación el intrón del gen gusA localizado en el T-ADN de pBISN1) integrado en un ADN vegetal de alto peso molecular de los callos Ws y rat5 (Nam et al., 1997; Mysore et al., 1998). La Fig. 3B muestra que a pesar de que el T-ADN integrado en el genoma de las plantas de tipo salvaje Ws es fácilmente detectable, el T-ADN integrado en el genoma de rat5 no lo es. Dichos datos indican claramente que rat5 es deficiente en la intregración de T-ADN. Para demostrar una carga igual de ADN vegetal en cada una de las vías, la sonda gusA se eliminó de la transferencia y se rehidridó la transferencia con una sonda del gen de fenilalanina amonio-ligasa (PAL) de Arabidopsis.

La Fig. 2 muestra la complementación del mutante rat5 y la sobreexpresión de RAT5 en las plantas de Arabidopsis de tipo salvaje. Los mapas de los vectores binarios pKM4 (A) y pKM5 (B). RB; extremo derecho de T-ADN; LB, extremo izquierdo de T-ADN, pAnos, secuencia señal de poliadenilación de nopalina sintasa; histona H2A; secuencia que codifica para el gen de la histona H2A de RAT5; pH2A, secuencia promotora del gen de la histona H2A de RAT5; Pnos, promotor de nopalina sintasa, hpt, gen de resistencia a la higromicina; secuencia señal de poliadenilación de agropina sintasa; uidA, gen de gusA sin promotor. Las flechas sobre la histona H2A, uidA, y los genes hpt indican la dirección de transcripción; (C) la complementación del mutante rat5. Las plantas mutantes rat5 se transformaron con una cepa de Agrobacterium que contiene el vector binario pKM4 (At1012). Se obtuvieron las plantas trangénicas higromicina resistentes y se auto-polinizaron para obtener plantas T2. Los segmentos de raíz estériles de las plantas T2 que expresan RAT5, plantas Ws de tipo salvaje, y plantas mutantes rat5 se infectaron con una cepa tumorogénica de A.tumefaciens A208. Dos días después del co-cultivo, se pusieron las raíces en un medio MS sin fitohormonas y que contiene timentin. Los tumores se contaron después de cuatro semanas. (D) ensayo de mutagénesis de las plantas transgénicas Ws que sobreexpresan el gen de la histona H2A de RAT5. Las plantas Ws se transformaron con una cepa de A.tumefaciens At1012 que contiene el vector binario pKM4. Se obtuvieron las plantas trangénicas higromicina resistentes y se auto-polinizaron para obtener plantas T2. Los segmentos de raíz estériles de las plantas T2 que expresan RAT5 y plantas de tipo salvaje Ws se infectaron a una baja densidad con A.tumefaciens A208. Dos días después del co-cultivo, se pusieron las raíces en un medio MS sin fitohormonas y que contiene timentin. Los tumores se contaron después de cuatro semanas.

Los teratomas provocados en las raíces de dichas plantas tenían un aspecto similar a los tumores generados en las plantas de tipo salvaje. Una de las plantas transgénicas ensayadas no recuperó el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis, probablemente debido a un transgen inactivo. Las plantas transgénicas T1 de rat5 obtenidas mediante la transformación con At1062 (que contienen un genómico que codifica para RAT5 de la planta de tipo salvaje) se ensayaron también para la recuperación del fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis. Algunas de dichas plantas también fueron capaces de recuperar el fenotipo de susceptibilidad a la tumorogénesis, indicando la complementación de la mutación rat5. Las plantas transgénicas higromicina resistentes generadas mediante la transformación del mutante rat5 con pGPTV-HPT únicamente no formaron tumores tras la infección con A.tumefaciens A208.

La Fig. 3 muestra los ensayos de integración de T-ADN de las plantas rat5 y Ws; (A) expresión transitoria y estable de GUS en Ws y rat5; segmentos de raíz estériles se infectaron con una cepa no tumorogénica de Agrobacterium GV3101 que contiene el vector binario pBISN1. Dos días después del co-cultivo, se transfirieron las raíces a un medio inductor de callos (CIM) que contiene timentin. Tres días después de la infección, se tiñó la mitad de los segmentos con X-Gluc para determinar la eficacia de la expresión transitoria GUS. El otro grupo de segmentos se dejó hasta formar callos en el CIM. Después de cuatro semanas dichos callos se tiñeron con X-Gluc para determinar la eficacia de la expresión estable de GUS. (B) integración de T-ADN en plantas rat5 y Ws. Se obtuvieron unas células en suspensión derivadas de los callos generados a partir de segmentos de raíz Ws y rat5 infectados con la cepa no tumorogénica de Agrobacterium GV1301 que contiene el vector binario pBISN1. Las líneas celulares en suspensión crecieron durante tres semanas (sin agente de selección para la transformación) en presencia de timentin o cefotaxima para matar el Agrobacterium. Se aisló el ADN genómico de dichas células, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,6%, se transfirió en una membrana de nylon, y se hibridó con una sonda del gen gusA. Después de la auto-radiografia, se eliminó la membrana y se rehibridó con una sonda del gen de fenilalanina amonio-ligasa (PAL) para determinar la carga igual de ADN en cada línea.

Materiales y métodos

Manipulación de ácido nucleico. Se aisló el ADN genómico total de la planta según el método de Dellaporta et al. (1983). Se llevaron a cabo digestiones con endonuleasas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, aislamiento de plásmido, y análisis de transferencia de ADN tal como se ha descrito (Sambrook et al., 1982).

Rescate del plásmido. El ADN genómico (5\mug) de rat5 se digirió por completo con SalI. Se extrajo el ADN digerido con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El ADN se auto-ligó en un volumen final de 500 \mul en un tampón de ligación 1x (Promega) con 3 unidades de ADN ligasa T4 a una temperatura de 16ºC durante 16 horas. La mezcla de ligación se precipitó con etanol, se transformó en células E.coli DH10B electrocompetentes (mcrBC, Life Technologies, Inc. Gaithesburg, MD) mediante electroporación (25 \muF, 200 \Omega y 2,5 kV) y se puso en una placa de medio LB que contiene ampicilina (100 \mug/ml). Las colonias ampicilina resistentes se recogieron en una membrana de nylon, se lisó la bacteria, y se desnaturalizó el ADN in situ (Sambrook et al., 1982).Se utilizó una secuencia del extremo izquierdo (LB) radiomarcada (fragmento EcoRI de 3,0 kbp de pE1461) como sonda de hibridación para identificar el plásmido que contiene el LB. Se picaron las colonias positivas y se aisló el plásmido de ADN. Mediante análisis de fragmentos por restricción se identificó un plásmido que contenía tanto el LB con el ADN de unión de la planta. El fragmento de unión de la planta se confirmó mediante la hibridación del fragmento de unión con el ADN de una planta de tipo salvaje. Se preparó un mapa de restricción de dicho plásmido, que contiene el LB-ADN de unión de la planta. Se subclonó en pBluescript un fragmento EcoRI de 1,7 kbp que contenía el ADN de la planta más 75 pares de bases de la secuencia LB, dando con resultado pE1509. Dicho fragmento se secuenció seguidamente en el centro de secuenciación de la Universidad de Purdue.

Crecimiento de Agrobacterium e inoculación in vitro de raíces de Arabidopsis Thaliana . Dichos experimentos se han realizado tal como se ha descrito anteriormente por Nam et al. (1997)

Condiciones de crecimiento de las plantas. Se obtuvieron semillas de varios ecotipos de Arabidopsis Thaliana de S. Leisner y E. Ashworth (originariamente del Arabidopsis Stock Center, Nottimgham, UK y el Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Columbus, respectivamente). Las semillas se esterilizaron en la superficie con una solución compuesta por el 50% de lejía comercial y SDS al 0,1% durante 10 min y después se lavó cinco veces con agua destilada estéril. Las semillas se hicieron germinar en unas placas de Petri que contienen medio Gamborg's B5 (GIBCO) solidificado con el 0,75% de bactoagar (Difco). Inicialmente se incubaron las placas a una temperatura de 4ºC durante 2 días y hasta 7 días bajo un ciclo de luz de 16 horas de luz/ 8hr de oscuridad a una temperatura de 25ºC. Las semillas se transfirieron individualmente a unos tarros de comida infantil que contenían medio B5 solidificado y crecieron durante 7 a 10 días para el cultivo de la raíz. Alternativamente, las semillas se transfirieron al suelo para la inoculación completa.

Crecimiento de Agrobacterium tumefaciens . Todas las cepas de Agrobacterium crecieron en un medio YEP (Lichtenstein y Draper, 1986) enriquecido con los antibióticos adecuados (rifampicina, 10 \mug/ml, kanamicina 100 \mug/ml) a una temperatura de 30ºC. El cultivo bacteriano durante la noche se lavó con NaCl 0,9% y se resuspendió en NaCl 0,9% a 2x10^{9} unidades formadoras de colonias por ml para la inoculación in vitro de la raíz o a 2x10^{11} unidades formadoras de colonias por ml para la inoculación total.

Inoculación in vitro de la raíz y ensayos de transformación. Se cortaron las raíces que crecieron en la superficie del agar, se cortaron en segmentos pequeños (\sim 0,5 cm) en una pequeña cantidad de agua estéril, y se transfirieron a un filtro de papel estéril para eliminar el exceso de agua. Para algunos experimentos, se preincubaron las raíces cortadas en un medio inductor de callos (CIM; 4,32 g/l Murashige y Skoog [MS] sales mínimas [GIBCO], 0,5 g/l Mes, pH 5,7, 1 ml/L solución de vitaminas [0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina, y 0,5 mg/ml de tiamina HCl], 100 mg/ml de mioinositol, 20 g/l de glucosa, 0,5 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 0,3 de mg/l kinetina, 5 mg/l de ácido indolacético, y 0,75% de bactoagar) durante 1 día antes de cortarlas en segmentos. Los haces de los segmentos de raíz secos se transfirieron a un medio basal MS (4,32 g/l de MS sales míminas, 0,5 g/l de Mes, pH 5,7, 1 ml/L de solución de vitaminas, 100 mg/l de mioinositol, 10 g/l de sacarosa, y 0,75% de bactoagar), y se añadieron 2 ó 3 gotas de suspensión bacteriana. Después de 10 minutos, se eliminó la mayor parte de la solución bacteriana, y se co-cultivaron la bacteria y los segmentos de raíz a una temperatura de 25ºC durante 2 días.

Para los ensayos de transformación transitoria, se infectaron los haces de raíz con Agrobacterium, se utilizó una cepa GV3101 (Koncz y Schell, 1986) que contiene el vector binario pBISN1 (Narasimhulu et al., 1996). Después de varios periodos de tiempo, se lavaron las raíces con agua, se transfirieron a un papel de filtro, y se tiñeron con la solución de tinción X-Gluc (50 mM NaH_{2}HPO_{4}, 10 mM Na_{2}, EDTA, 300 mM manitol, y 2 mM X-Gluc, pH 7,0) durante 1 día a una temperatura de 37ºC. Para las mediciones cuantitativas de la actividad \beta-glucuronidasa (GUS), se molieron las raíces en un tubo de microcentrífuga que contiene el tampón de extracción GUS (50 mM Na_{2}HPO_{4}, 5 mN DTT, 1 mM Na_{2}, EDTA, 0,1% sarcosil y 0,1% Tritón X-100, pH 7,0) y se midió la actividad específica GUS según Jefferson et al. (1987).

Para cuantificar la tumorogénesis, se infectaron los haces de raíces con cepas de Agrobacterium de tipo salvaje. Después de 2 días, se frotaron los haces de raíces en la superficie del agar con el fin de eliminar el exceso de bacteria y después se lavaron con agua estéril que contiene timentin (100 \mug/ml). Los segmentos individuales de raíces (ensayo inicial) o pequeños haces de raíces (5 a 10 segmentos de raíces; ensayo modificado) se transfirieron a un medio basal MS carente de hormonas pero que contiene timentin (100 \mug/ml) y se incubaron durante 4 semanas.

Para la transformación de los segmentos de raíz para la resistencia a la kanamicina, se inocularon los haces de raíces con una cepa GV3101 de Agrobacterium que contiene pBISN1. Después de 2 días, se transfirieron pequeños haces de raíces (o segmentos individuales de raíz) a un medio CIM que contiene timentin (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml). Los callos kanamicina resistentes se contaron después de 4 semanas de incubación a una temperatura de 25ºC.

Para determinar la expresión estable de GUS, se inocularon las raíces tal como se ha descrito anteriormente y se transfirieron los segmentos de raíz después de 2 días en el medio CIM que contiene timentin (100 \mug/ml) sin ningún agente de selección. Después de 4 semanas, se ensayó la actividad GUS bien mediante la tinción con X-Gluc o bien mediante la medición de la actividad específica de GUS mediante la utilización del ensayo fluorimétrico con 4-metilumbeliferil \beta-D galactósido (MUG), tal como se ha descrito anteriormente.

Para determinar la cinética de expresión de GUS, se infectaron los haces de raíces, se transfirieron los segmentos de raíz después de 2 días en un medio CIM que contiene timentin (100 \mug/ml) y los callos crecieron en medio CIM sin ningún agente de selección. Se ensayaron los haces de raíces a varios tiempos, utilizando el ensayo fluorométrico MUG tal como se ha descrito anteriormente, para medir la actividad específica de GUS.

Construcción de los vectores binarios pKM4 y pKM5. El plásmido pE1509 que contiene el fragmento de unión de 1,7kbp clonado en el pBluescript se digirió con EcoRI para liberar el fragmento de unión. Los extremos 5' sobresalientes se rellenaron utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y los trifosfato desoxiribonucleótidos. El vector binario T-ADN (pE1011) pGTV-HPT (Becker et al., 1992) se digirió con los enzimas SacI y SmaI, liberando el gen gusA sin promotor de pGTV-HPT. La secuencia 3' sobresaliente del fragmento mayor que contiene el origen de replicación y el gen de resistencia a la higromicina (hpt) se eliminó utilizando la actividad 3'- 5' exonucleasa del ADN polimerasa Klenow, y el fragmento de extremo protuberante de 1,7 kbp resultante se ligó a los extremos protuberantes del vector binario. Se seleccionó un vector binario plásmido que contiene el fragmento de 1,7 kbp en la orientación correcta (pNos después del gen de la histona H2A) y se denominó pKM4 (cepa E1547).

Se clonó un fragmento SacI de aproximadamente 9,0 kbp de genoma de tipo salvaje que contiene el gen de la histona H2A (RAT5) del clon genómico lambda en el sitio SacI del plásmido pBluescript. Dicho fragmento SacI de 9,0 kbp se liberó posteriormente del pBluescript mediante la digestión con SacI y se clonó en el sitio SacI del vector binario pGTV-HPT, dando como resultado el plásmido pKM5 (cepa E1596). Tanto pKM4 como pKM5 se transfirieron separadamente mediante apareamiento triparental (Ditta et al., 1980) en la cepa no tumorogénica Agrobacterium GV3101, dando como resultado las cepas de A.tumefaciens At1012 y At1062, respectivamente.

Transformación de la línea germina de Arabidopsis . Las transformaciones en la línea germinal se realizaron tal como se ha descrito en (Bent y Clough, 1998). Se seleccionaron las plantas transgénicas en medio B5 que contiene higromicina ( 20 \mug/ml).

Documentos citados

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TABLA 1 Complementación del mutante rat5 y sobreexpresión de RAT5 en plantas Arabidopsis de tipo salvaje (WS)

1

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Sobreexpresión de RAT5 en Ws (Plantas T2) ^{ab}

2

Claims

1. Método para aumentar las frecuencias de transformación en una planta huésped, comprendiendo dicho método:

a) adición de por lo menos una copia del gen de histona vegetal a la planta huésped, y

b) expresión de las copias del gen de la histona vegetal para incrementar las frecuencias de transformación.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gen de la histona es el gen H2A.

3. Planta transgénica que comprende por lo menos una copia adicional de un gen de histona para el incremento de las frecuencias de transformación en una planta huésped mediante la sobreexpresión de la histona como compuesto a los niveles de expresión natural del huésped.

4. Planta transgénica según la reivindicación 3, en la que el gen de la histona es el gen RAT5 de Arabidopsis.

5. Utilización de un constructo genético que comprende por lo menos una copia de un gen de la histona para el incremento de las frecuencias de transformación en una planta huésped mediante la sobreexpresión la histona como compuesto a los niveles de expresión natural del huésped.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el gen de la histona es H2A.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el gen de la histona es un gen RAT5 de Arabidopsis.