ES2240192T3 - Diagnostico y terapia de cancer usando moleculas relacionadas con sgp28. - Google Patents

Diagnostico y terapia de cancer usando moleculas relacionadas con sgp28.

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ES2240192T3 ES00973927T ES00973927T ES2240192T3 ES 2240192 T3 ES2240192 T3 ES 2240192T3 ES 00973927 T ES00973927 T ES 00973927T ES 00973927 T ES00973927 T ES 00973927T ES 2240192 T3 ES2240192 T3 ES 2240192T3
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Abstract

Un método para la detección de la presencia de una proteína SGP28 de expresión en cáncer que comprenda la determinación del nivel de proteína SGP28 expresado por las células en una muestra de prueba de tejido procedente de un individuo y comparando el nivel determinado de SGP28 con el correspondiente a una muestra normal, la presencia de niveles elevados de proteína SGP28 en la muestra de prueba respecto a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de este cáncer en el individuo.

Description

Diagnóstico y terapia de cáncer usando moléculas relacionadas con SGP28.
Campo de la invención
La invención aquí descrita se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer, incluyendo cáncer de próstata, utilizando polinucleótidos aislados, polipéptidos, anticuerpos, y moléculas relacionadas que corresponden a, o son reactivas con SGP28/CRISP-3 humana.
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana después de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en Estados Unidos, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas anualmente, con unos 1,4 millones de casos nuevos diagnosticados por año. Mientras las muertes por enfermedades cardíacas han estado disminuyendo significativamente, aquellas que resultan del cáncer generalmente están en alza. En la primera parte del próximo siglo, está previsto que el cáncer sea la causa principal de muerte.
En todo el mundo, varios cánceres se mantienen como los más mortíferos. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas, y ovario representan las causas primarias de muerte por cáncer. Éstos y virtualmente todos los otros carcinomas comparten una característica letal en común. Con muy pocas excepciones, las enfermedades metastásicas a partir de un carcinoma son mortales. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que inicialmente sobreviven sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas están dramáticamente alteradas. Muchos pacientes con cáncer sufren una fuerte ansiedad conducida por la conciencia del potencial de reincidencia o fallo de tratamiento. Muchos pacientes con cáncer sufren debilidad física después del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer sufren una reincidencia.
En todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en hombres. En Norte América y en el norte de Europa, es el cáncer masculino más común y la segunda causa de muerte por cáncer en hombres. Sólo en Estados Unidos, más de 40.000 hombres mueren anualmente por esta enfermedad - sólo segunda al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, aún no hay un tratamiento efectivo para el cáncer de próstata con metástasis. Prostatectomía quirúrgica, terapia de radiación, terapia de ablación hormonal, y quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son inefectivos para muchos y a menudo se asocian a consecuencias indeseables.
En el ámbito del diagnóstico, la falta de un marcador tumoral de próstata que pueda detectar cuidadosamente tumores localizados en estadios tempranos, permanece como una limitación significante en la gestión de esta enfermedad. Aunque el ensayo del suero PSA también ha sido una herramienta muy útil, su especificidad y utilidad general está ampliamente estimada como deficiente en muchos aspectos importantes.
El progreso en la identificación de marcadores adicionales específicos para el cáncer de próstata ha sido mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes estudios de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAPC (Cáncer de próstata de Los Ángeles) son xenoinjertos de cánceres de próstata que han sobrevivido el pasaje en varios ratones combinados inmunodeficientes (SCID) y han exhibido la capacidad de imitar la progresión de la enfermedad, incluyendo la transición desde dependencia de andrógenos a independencia de andrógenos y el desarrollo de lesiones metastásicas (Klein et al., 1997, Nat. Med.3:402). Más recientemente se identificaron marcadores del cáncer de próstata incluido PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 93: 7252), el antígeno de células madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735), y STEAP (Hubert et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14523).
Mientras que los marcadores previamente identificados como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, hay necesidad de identificar marcadores adicionales y dianas terapéuticas para el cáncer de próstata y cánceres relacionados para mejorar además el diagnóstico y la terapia.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer de próstata. Los métodos de la invención utilizan polinucleótidos aislados correspondientes a la SGP28 humana, proteínas codificadas por el gen de SGP28 y fragmentos del mismo, y anticuerpos capaces de reconocer y unirse específicamente a proteínas SGP28. Los métodos de la invención están basados, en parte, en la clonación molecular de un gen que es idéntico a SGP28 y que es altamente sobreexpresado en cánceres de próstata humanos. La invención además está basada en el descubrimiento que, como se determinó por inmunohistoquímica, niveles muy altos de proteína SGP28 se expresan y se secretan en el lumen de la glándula prostática cancerosa así como en PIN, una lesión de la próstata precancerosa no invasora, y en metástasis de hueso y nódulo linfático. El perfil de expresión de SGP28 anunciado aquí indica que SGP28 proporciona un marcador de diagnóstico útil y/o objetivo terapéutico para el cáncer de próstata. Además, la expresión de SGP28 en PIN sugiere que puede ser un marcador para el diagnóstico temprano de cáncer de próstata, una mejora muy necesitada sobre lo que está disponible actualmente usando PSA. La expresión patrón de SGP28 en muestras clínicas individuales sugiere que SGP28 puede ser usada para identificar pacientes que serán más sensibles a una modalidad de tratamiento que a otra. Además, SGP28 puede servir como un marcador sustitutorio para monitorizar la eficacia de un régimen terapéutico de cáncer de próstata. Las moléculas SGP28 proporcionan un marcador particularmente atractivo para el uso de métodos parecidos in vivo debido a su expresión en metástasis del nódulo linfático y hueso.
La expresión del mRNA de la SGP28 está restringida a la próstata y al ovario, y está marcadamente regulada en los tumores de próstata. La expresión de la SGP28 en muestras coincidentes de próstata normal/tumores de pacientes con cáncer de próstata avanzado, usando ambos métodos de detección de proteínas y mRNA, muestra un alto grado de regulación de la expresión en el tejido tumoral, sugiriendo que SGP28 es un marcador útil para la detección del cáncer de próstata.
SGP28 es una proteína soluble extracelular que tiene un peso molecular previsto de 29 kDa y un pI de 8,08. SGP28 tiene un péptido señal que se adhiere entre los residuos aminoacídicos 32 y 33, e incluye dos motivos de la proteína SCP extracelular (dominio prosite PD0000772), uno en los aminoácidos 150-160 y otro en los aminoácidos 170-182, ambos de la ID DE SEC NO: 3. La proteína tiene una fuerte homología a las proteínas defensina, particularmente con las beta-defensinas, que son productos secretados producidos principalmente por las células epiteliales (O-Neil et al., 1999, J. Immunol. 163:6718-24; Schroder et al., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol., 31:645-51). Como una defensina, la proteína SGP28 puede tener la capacidad de inducir la muerte celular del tumor y/o puede servir como un quimioatrayente. SGP28 también puede tener un papel en la unión celular y/o en la inducción del crecimiento celular.
Un número de aproximaciones potenciales para el tratamiento del cáncer de próstata y otros cánceres que expresen SGP28 se describen aquí. La naturaleza extracelular y soluble de esta proteína presenta un número de estrategias terapéuticas utilizando moléculas que tengan como diana la SGP28 y la función de ésta, así como moléculas que tienen como diana otras proteínas, factores y ligandos que interaccionan con SGP28. Estas estrategias terapéuticas incluyen terapia de anticuerpos con anticuerpos anti-SGP28, terapias con moléculas pequeñas, y terapias con vacunas. Además, dada su expresión sobre-regulada en cáncer de próstata, SGP28 es útil como un marcador de diagnóstico, del estadio y/o pronóstico del cáncer de próstata y, similarmente, puede ser un marcador para otros cánceres que expresan esta proteína.
La invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte del gen SGP28 como se describe aquí, mRNA, y/o secuencias codificantes, preferiblemente en la forma aislada, incluyendo polipéptidos codificantes de proteínas SGP28 y fragmentos de éstas, DNA, RNA, híbridos DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios al gen SGP28 o secuencias mRNA o partes de éstas, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan al gen SGP28, mRNA, o polinucleótidos codificantes de SGP28. También se proporcionan medios para aislar los cDNA y los genes codificantes de SGP28. Moléculas de DNA recombinante que contienen polinucleótidos SGP28, células transformadas o transducidas con estas moléculas y también se proporcionan sistemas de vector huésped para la expresión de productos génicos de SGP28.
La invención además proporciona proteínas SGP28 y fragmentos polipeptídicos de éstas, así como anticuerpos que se unen a proteínas SGP28 y fragmentos polipeptídicos de éstas. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, anticuerpos marcados con un marcador detectable, y anticuerpos conjugados a radionúclidos, toxinas u otras composiciones terapéuticas.
La invención además proporciona métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas SGP28 en varias muestras biológicas, así como métodos para identificar células que expresan SGP28. La invención además proporciona varias composiciones y estrategias terapéuticas, incluyendo, particularmente, terapia de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas, para tratar cánceres de próstata.
Breve descripción de las figuras
Figs. 1 A-C. Análisis Northern blot de la expresión del mRNA de la SGP28 en tejidos normales (Figs. 1 A y 113) y de la expresión sobre-regulada de alto nivel en xenoinjertos de cáncer de próstata (Panel C). La señal de bajo peso molecular en testículos normales probablemente se debe a la hibridación cruzada de la sonda (fragmento SSH) al mensaje CRISP2/TPX-1. Un tránscrito idéntico se observa para CRIP2 en este panel normal utilizando una sonda oligonucleótida específica de gen como es descrita por Kratzschmar et al., 1996, Eur J Biochem 236(3):827-36. En la Fig. 1 A, carril 1 es corazón, carril 2 es cerebro, carril 3 es placenta, carril 4 es pulmón, carril 5 es hígado, carril 6 es músculo esquelético, carril 7 es riñón, y carril 8 es páncreas. En la Fig. 1 B, el carril 1 es bazo, carril 2 es timo, carril 3 es próstata, carril 4 testículo, carril 5 ovario, carril 6 intestino delgado, carril 7 es colon, y carril 8 es leucocitos. En la Fig. 1 C, carril 1 es próstata, carril 2 es LAPC-4 AD, carril 3 es LAPC-4 Al, carril 4 es LAPC-9 AD, y carril 5 es LAPC-9 Al.
Fig. 2 Análisis Northern blot de la expresión de mRNA SGP28/36P1G3 en un panel de 3 tumores de próstata (carriles 2, 4, 6) y parejas de tejidos adyacentes normales (carriles 1, 3, 5), mostrando up-regulación en 3 de las 3 muestras de tumor.
Fig. 3. Western blot que demuestra que el anticuerpo policlonal anti-SGP28 identifica la proteína SGP28 en lisados de xenoinjerto LAPC4 y LAPC9 y en los sobrenadantes de la línea celular LAPC4 y línea celular 293T transfectada. Lisados de células enteras (WCL) y sobrenadantes de células LAPC4 y células 239T transfectadas y temporalmente MYC/HIS SGP28 y lisados de xenoinjertos LAPC4 y LAPC9 fueron sujetas a Western blot utilizando pAb purificado por afinidad anti-SGP28 de conejo (1 \mug/ml). Bandas inmunoreactivas SGP28 se visualizaron por incubación de los blots con un anticuerpo secundario anti-conejo HRP-conjugado, seguido por detección de la quimioluminiscencia aumentada.
Fig. 4. Análisis Western blot que muestra que el anticuerpo monoclonal anti-SGP28/CRISP-3 detecta específicamente la proteína SGP28/CRISP-3 en líneas celulares de cáncer de próstata y sobrenadantes, xenoinjertos de cáncer de próstata, y tejido de cáncer de próstata clínico. El lisado celular y el medio acondicionado de la línea celular de cáncer de próstata LAPC4 y lisados de los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC4 y LAPC9 y de una muestra clínica adecuada de próstata normal y cancerosa, se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El blot se sometió luego a análisis western con una dilución 1:2 de sobrenadante de anticuerpo monoclonal de 4G6 anti-SGP28/CRISP-3. Bandas específicas inmunoreactivas se visualizaron luego por incubación con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a IgG-HRP y desarrollo con quimioluminiscencia aumentada y exposición a una película autoradiográfica.
Fig. 5A. Análisis Western blot mostrando el nivel alto de expresión de SGP28 en muestras clínicas de cáncer de próstata y xenoinjertos LAPC. Lisados de tejidos clínicos adecuados de cáncer de próstata (Pca) y tejido adyacente normal (NAT) y de xenoinjerto de LAPC4 se sometieron a western blotting con 1 \mug/ml de pAb purificado por afinidad anti-SGP28 de conejo. Bandas SGP28 immunoreactivas se visualizaron por incubación con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a IgG-HRP y desarrollo con quimioluminiscencia aumentada. Se indica con flechas el doblete de proteína inmunoreactivo SGP28/CRISP-3.
Fig. 5B. Análisis Western blot que muestra un nivel alto de expresión de SGP28 en xenoinjertos LAPC y un bajo nivel de expresión en testículo normal y pulmón. Lisados normales de tejido de bazo, testículo, riñón, pulmón, y línea celular LAPC4 y xenoinjerto se sometieron a Western blot como se describe para Fig. 5A. Se indica con flechas el doblete de proteínas inmunoreactivas SGP28/CRISP-3.
Fig. 6A-B. Análisis immunohistoquímico de la proteína SGP28 en un cáncer de próstata con una puntuación de Gleason 7 (Fig. 6A) y alto grado PIN (Fig. 6B), mostrando nivel alto de expresión y secreción de SGP28 en el lumen de la glándula prostática, utilizando anticuerpo policlonal purificado de afinidad. Se observó una fuerte tinción en las células epiteliales de la glándula prostática, especialmente en los bordes del lumen. También se observó tinción dentro del lumen, indicando alto nivel de expresión y secreción de SGP28 en cáncer de próstata y PIN.
Figs. 7A-B. Análisis inmunohistoquímico demostrando la expresión de la proteína SGP28 en metástasis de cáncer de próstata en el hueso (Fig. 7A) y nódulo linfático (Fig. 7B).
Fig. 8A-D. Análisis inmunohistoquímico de la proteína SGP28 en cáncer de próstata y PIN. Fig. 8A muestra la detección inmunohistoquímica de SGP28 en cáncer de próstata en una magnificación de 200X; Fig. 8B muestra lo mismo a 800X. La expresión de SGP28 en PIN se muestra en Fig. 8C a 200X, y en la Fig.8D a 800x.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer de próstata que utilizan polinucleótidos aislados correspondientes al gen humano SGP28, proteínas codificadas por el gen SGP28 y fragmentos de éstas, y anticuerpos capaces de reconocer específicamente y unirse a proteínas SGP28. La invención se basa, en parte, en el aislamiento del fragmento de cDNA correspondiente al gen SGP28 por clonación de hibridación de substracción de supresión. Este cDNA, designado 36P1G3, se secuenció y analizó por homología con genes conocidos y EST en las principales bases de datos públicas. El cDNA 36P1 G3 mostró identidad a parte de la secuencia descrita del gen humano SGP28. Cebadores diseñados para amplificar específicamente el gen correspondiente a 36P1 G3 se utilizaron luego para caracterizar la expresión de SGP28 en xenoinjertos de cáncer de próstata, próstata normal, y una variedad de otros tejidos normales. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SGP28 se han reportado (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246-250; Kratzschmar et al., 1996, Eur J Biochem 236(3):827-36).
El perfil de expresión de SGP28 sugiere que ésta puede representar un marcador diagnóstico y terapéutico ideal para el cáncer de próstata. Como se determinó por análisis de expresión Northern blot, la expresión de mRNA SGP28 en tejido normal está altamente restringida a próstata, testículo y ovario (Fig. 1 A-B). Se detecta una expresión muy baja en páncreas (Fig. 1 A). Interesantemente, la próstata y el ovario presentan un tránscrito de 2,4 kb, mientras que el testículo expresa un mensaje de 1,6 kb (el mensaje 1,6 kb podría representar otro miembro de la familia SGP28). Además, la expresión de mRNA SGP28 es altamente up-regulada en xenoinjertos de cáncer de próstata derivados de enfermedades en estadios metastáticos avanzados (Fig. 1C). Además, la proteína SGP28 es expresada a altos niveles en estos mismos xenoinjertos de cáncer de próstata así como en los especímenes clínicos de cáncer de próstata (Fig. 2). En especímenes clínicos coincidentes normal/cáncer de próstata, se detecta una sobre expresión de alto nivel de proteína SGP28 relativa a la normal, indicando que la SGP28 proporciona un excelente marcador diagnóstico y/o diana terapéutica para el cáncer de próstata. El análisis inmunohistoquímico establece que la proteína SGP28 es expresada y secretada en niveles altos en el lumen de las glándulas prostáticas cancerosas y precancerosas, así como en la enfermedad metastásica. Como la PSA, la SGP28 es secretada en el lumen y entra el suero en los tejidos en donde la arquitectura normal está destruida.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos del campo, notaciones y otra terminología científica usada aquí pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en el campo a la que pertenezca esta invención. En algunos casos, los términos con significados comunes se definen aquí para más claridad y/o para una referencia rápida, y la inclusión de tales definiciones no serían necesariamente construidas para representar una diferencia sustancial sobre la que generalmente se entiende en el campo. Las técnicas y procedimientos descritos o a los que hacen referencia en general son bien entendidos y comúnmente empleados usando una metodología convencional por aquellos expertos en el campo, tales como, por ejemplo las metodologías moleculares ampliamente descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Apropiadamente, los procedimientos involucrados en el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles generalmente se tratan de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se diga lo contrario.
Como se usa aquí, los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula prostática, y dan a entender que incluyen el estadio C de la enfermedad bajo el sistema de la American Urological Association (AUA), estadios C1-C2 de la enfermedad bajo el sistema de Whitmore-Jewett, y los estadios T3-T4 y N+ de la enfermedad bajo el sistema de TNM, (tumor, nódulo, metástasis). En general, la cirugía no se recomienda a pacientes con la enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen menos consecuencias sustancialmente favorables comparado con pacientes que tienen el cáncer de próstata clínicamente localizado (órgano-limitado). La enfermedad localmente avanzada cínicamente se identifica por la evidencia palpable del endurecimiento más allá del borde lateral de la próstata, o asimetría o endurecimiento encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado actualmente se diagnostica patológicamente siguiendo una prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico, o invade las vesículas seminales.
Como se usa aquí, el término "cáncer de próstata metastásico" y "enfermedad metastásica" significa cánceres de próstata que se han esparcido a la región de los nódulos linfáticos o a sitios distantes, y se refieren al estadio D de la enfermedad bajo el sistema AUA y el estadio TxNxM+ bajo el sistema TNM. Como es el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía generalmente no está indicada para pacientes con la enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es la modalidad de tratamiento preferido. Los pacientes con cáncer de próstata metastático eventualmente desarrollan un estado refractario a los andrógenos al cabo de 12 a 18 meses del inicio del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren 6 meses después. El sitio más común para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis ósea del cáncer de próstata son, en balance, característicamente osteoblásticas más que osteolíticas (p.ej., resultando en una formación neta del hueso). Las metástasis óseas se encuentran con más frecuencia en la columna vertebral, seguida del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen los nódulos linfáticos, el pulmón, el hígado y el cerebro. El cáncer de próstata metastático típicamente se diagnostica abriendo o realizando una linfadenoctomía laparoscópica pélvica, exploraciones de los radionúcleos del cuerpo entero, radiología esquelética, y/o biopsia de lesión del hueso.
Como se usa aquí, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases en longitud, cualquier ribonucleótido o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretenden incluir formas de DNA de cadena simple y doble.
Como se usa aquí, el término "polipéptido" significa un polímero de al menos 10 aminoácidos. A lo largo de la especificación, se usan tres letras estándares letras de designación simple para aminoácidos.
Como se usan aquí, los términos "hibridar", "hibridado", "hibrida" y similares, usado en el contexto de polinucleótidos, pretenden referirse a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente tales como hibridación en 50% formamida/6XSSC/0,1% SDS/100 \mug/ml ssDNA, en que las temperaturas para la hibridación estén sobre los 37ºC y temperaturas para el lavado en 0,1XSSC/0,1% SDS estén sobre 55ºC, y más preferible en condiciones de hibridación astringentes.
"Astringencia" de reacciones de hibridación se determina fácilmente por cualquier experto en el campo, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado, y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren de temperaturas más elevadas para una correcta hibridación, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del DNA desnaturalizado para rehibridar cuando las cadenas complementarias están presentes en un ambiente debajo de sus temperaturas de fusión. Cuanto más alto sea el grado homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, las temperaturas relativas más altas tienden a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas más bajas menos. Para más detalles y la explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones de alta astringencia", como se definen aquí, pueden ser identificadas por aquellos que: (1) empleen una fuerza iónica baja y temperatura alta para lavar, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M /dodecilsulfato sódico 0,1% a 50ºC; (2) empleen durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50% (v/v) con albúmina sérica bovina 0,1% /Ficoll 0,1% /polivinilpirrolidona 0.1% /tampón fosfato sódico 50mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) empleen formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M ), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1%, solución de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 ttg/ml), 0,1% SDS, y sulfato de dextrano 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) formamida 50% a 55ºC, seguidos por un lavado de alta astringencia de 0,1 x SSC conteniendo EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente astringentes" pueden ser identificadas como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (p.ej., temperatura, fuerza iónica y %SDS) menos astringente que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es incubación toda la noche a 37ºC en una solución que comprenda: 20% formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10%, y 20 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por un lavado de los filtros en 1 x SSC a alrededor de 37-50ºC. El experto reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. necesarios para adecuar factores tales como la longitud de la sonda y simila-
res.
En el contexto de comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se usa para expresar el porcentaje de residuos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que es igual. También en este contexto, el término "homología" se usa para expresar el porcentaje de residuos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son casi idénticas o similares, usando el criterio de conservación de los aminoácidos del análisis BLAST, como se entiende generalmente en el campo. Por ejemplo, los valores de identidad pueden ser generados por WU-BLAST 2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996): http: //blast.wustl/edu/blast/README.html). Más detalles relativos a las sustituciones de aminoácidos, que son considerados conservadores bajo tal criterio, se proporcionan más adelante.
Definiciones adicionales se proporcionan a través de las siguientes subsecciones.
Polinucleótidos SGP28
Un aspecto de la invención proporciona los polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte del gen SGP28, mRNA, y/o secuencias codificadas, preferiblemente de forma aislada, incluyendo polinucleótidos que incluyen una proteína SGP28 y fragmentos de la misma, DNA, RNA, híbrido DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen SGP28 o secuencia del mRNA o una parte del mismo, y polinucleótidos u oligonucleótidos que híbridas al gen SGP28, mRNA, o a un SGP28 que codifica polinucleótidos (colectivamente, "polinucleótidos SGP28"). Como se usa aquí, el gen y proteína SGP28 propone incluir los genes SGP28 y proteínas específicamente descritas aquí y los genes y proteínas correspondientes a otras proteínas SGP28 y variantes estructuralmente similares a los anteriores. Estas otras proteínas SGP28 y variantes generalmente tendrán secuencias codificantes que son altamente homólogas a la secuencia codificante de SGP28, y preferiblemente compartirán al menos alrededor de un 50% de identidad en los aminoácidos y al menos alrededor del 60% de homología en los aminoácidos (usando el criterio BLAST), más preferiblemente compartiendo el 70% o más homología (usando el criterio BLAST).
Una realización de un polinucleótido SGP28 es un polinucleótido SGP28 que tiene la secuencia mostrada en la Tabla 1 (ID DE SEC NO: 2). Un polinucleótido SGP28 puede comprender un polinucleótido que tenga la secuencia de nucleótidos SGP28 humana como se muestra en la Tabla 1 (ID DE SEC NO: 2), en donde T también puede ser U; un polinucleótido que codifica toda o una parte de la proteína SGP28; una secuencia complementaria al anterior; o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otra realización comprende un polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra en la Tabla 1 (ID DE SEC NO: 2), a partir del residuo de nucleótido número 3 a través del residuo de nucleótido número 776, en donde T también puede ser U.
Realizaciones típicas de la invención revelada incluyen polinucleótidos SGP28 que codifican porciones específicas de secuencias del mRNA de SGP28 tales como aquellas que codifican la proteína y fragmentos de la misma. Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención revelada aquí incluyen: polinucleótidos que codifican alrededor del aminoácido 1 a alrededor del aminoácido 10 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican alrededor del aminoácido 20 a alrededor del aminoácido 30 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucléotidos que codifican alrededor del aminoácido 30ª a alrededor del aminoácido 40 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican alrededor del aminoácido 40 a alrededor del aminoácido 50 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican a alrededor del aminoácido 50 a alrededor del aminoácido 60 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican alrededor del aminoácido 60 a alrededor del aminoácido 70 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican a alrededor del aminoácido 70 a alrededor del aminoácido 80 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polinucleótidos que codifican a alrededor del aminoácido 80 a alrededor del aminoácido 90 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) and polinucleótidos que codifican a alrededor del aminoácido 90 a alrededor del aminoácido 100 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), etc. Siguiendo este esquema, polinucleótidos (de al menos 10 aminoácidos) que codifican porciones de la secuencia de aminoácidos 100-258 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) son realizaciones típicas de la invención. Polinucleótidos que codifican grandes porciones de la proteína SGP28 también se contemplan. Por ejemplo, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40 etc.) a alrededor del aminoácido 20, (o 30, o 40 o 50 etc.) de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) puede ser generada por una variedad de técnicas bien conocidas en el campo.
Realizaciones ilustrativas adicionales de la invención aquí revelada incluyen fragmentos de polinucleótidos SGP28 que codifican uno o más de los motivos biológicos que contienen la secuencia de la proteína SGP28. En una realización, fragmentos de polinucleótidos típicos de la invención pueden codificar una o más de las regiones de SGP28 que presentan homología a las beta-defensinas. En otra realización de la invención, típicos fragmentos de polinucleótido pueden codificar una o más secuencias de proteínas extracelulares de signatura SCP/Tpx-1/Ag5/PR-1/Sc7. No obstante en otra realización de la invención, fragmentos típicos de polinucleótidos pueden codificar secuencias que son únicas para una o más variantes de empalme alternativas SGP28.
Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen un número de diferentes usos específicos. Como SGP28 se expresa para ser sobreexpresada en el cáncer de próstata, estos polinucleótidos se pueden usar en métodos de ensayo del estado de los productos del gen en tejidos normales frente a tejidos cancerosos. Típicamente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína SGP28 se puede usar para ensayar la presencia de perturbaciones (tales como delecciones, inserciones, punto de mutaciones etc.) en regiones específicas de productos del gen SGP28. Ensayos ejemplares incluyen ambos ensayos RT-PCR así como el análisis del polimorfismo de la conformación del enlace simple (SSCP) (ver p.ej. Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones en la proteína. Ensayos y métodos para analizar secuencias para detectar polimorfismos simples de nucleótidos también están disponibles (Irizarry, et al., 2000, Nature Genetics 26(2):223-236.
Otras realizaciones específicamente contempladas de la invención revelada aquí con DNA genómico, cDNAs, ribozimas, y moléculas antisentido, incluyendo moléculas antisentido de morfolina, así como moléculas de ácido nucleico basadas en una estructura alternativa o incluyendo bases alternativas, si son derivados de fuentes naturales o sintetizados. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNAs o otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) o moléculas ácidas no nucleótidas como derivados fosforotioatos, que unan específicamente DNA o RNA en una forma dependiente de pares de bases. Un experto fácilmente puede obtener estas clases de moléculas de ácido nucleico usando los polinucleótidos SGP28 y secuencias de polinucleótidos reveladas aquí.
La tecnología antisentido conlleva la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana localizado en las células. El término "antisentido" se refiere al hecho que tales oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, p.ej., SGP28. Ver por ejemplo, Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; and Synthesis 1:1 -5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido SGP28 de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados fosforotioatos o S-oligos, ver, Jack Cohen, supra), que muestran la acción inhibitoria incrementada del crecimiento de células cancerosas. S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en las que un átomo de oxígeno no del puente del grupo fosfato es reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden ser preparados por el tratamiento de los correspondientes o-oligos con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de un sulfuro. ver Iyer, R. P. et al, J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990), las divulgaciones de las cuales están completamente incorporadas por referencia aquí. Oligonucleótidos antisentido adicionales SGP28 de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en el campo (ver p.ej. Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Los oligonucleótidos antisentido SGP28 de la presente invención típicamente pueden ser RNA o DNA que son complementarios e hibridan de forma estable con los primeros 100 codones N-terminales o los últimos 100 codones C-terminal, o se sobreponen con el lugar de inicio ATG, del genoma de SGP28 o el correspondiente mRNA. Mientras que la absoluta complementariedad no se requiere, se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región sigue para la hibridación selectiva al mRNA de SGP28 y no al mRNA especificando otras subunidades regulatorias de la proteína quinasa. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido SGP28 de la presente invención son un fragmento de 15 30-mero de moléculas de DNA antisentido que tiene una secuencia que hibride al mRNA de SGP28. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido SGP28 es un oligonucleótido de 30-mero que es complementario a una región en los primeros 10 codones N-terminal y los últimos 10 codones C-terminal de SGP28. Alternativamente, las moléculas antisentido son modificadas para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de SGP28. L. A. Couture & D. T Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
Más realizaciones específicas de este aspecto de la invención incluye cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y aprueben que selectivamente o específicamente hibridan a moléculas de ácidos nucleicos de la invención o a cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcar con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante de metales o enzima. Tales sondas y cebadores pueden ser usados para detectar la presencia de un polinucleótido SGP28 en una muestra y como manera para detectar una célula expresando una proteína SGP28. Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de cDNA de SGP28 humano mostrada en la Tabla 1 (ID DE SEC NO: 2). Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente mRNAs de SGP28 también están descritos en los ejemplos que siguen. Un ejemplo de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente mRNAs de SGP28 es:
5'-AGT TGC CTT TCC TAG CTC CAC TCT-3' (ID DE SEC NO:4)
5'-TCC CTT TCC ATA CTC CAC TCT TTG-3' (SEQ ID NO:5)
Como será entendido por los expertos, se pueden preparar multitud de diferentes cebadores y sondas basados en las secuencias proporcionadas aquí y usados efectivamente para amplificar y/o detectar un mRNA de SGP28.
Como se usa aquí, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando se separa sustancialmente de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes otros que el gen SGP28 o que codifiquen polipéptidos diferentes del producto del gen SGP28 o fragmentos del mismo. Un experto fácilmente puede emplear procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido SGP28 aislado.
Los polinucleótidos SGP28 de la presente invención son útiles para una variedad de propuestas, incluyendo pero no limitándose a su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o la detección del/de los gen(es), mRNA(s)
de SGP28, o fragmentos del mismo; como reactivos para el diagnóstico y/o prognosis de cáncer de próstata y otros cánceres; como herramientas para identificar moléculas que inhiben específicamente la entrada de calcio en células prostáticas; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de SGP28; como herramientas para la modulación o inhibición de la expresión del/ de los gen(es) de SGP28 y/o traducción de los transcritos de SGP28; y como agentes terapéuticos.
Características moleculares y bioquímicas de SGP28
El gránulo específico de la proteína 28 (SGP28) es una molécula secretada identificada de y expresada en gránulos específicos de neutrófilos humanos (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246-250). SGP28 es idéntica a la proteína conocida como proteína 3 secretora rica en cisteína (CRISP-3) (Kratzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236:827-36). SGP28/CRISP-3 (de aquí en adelante referida como SGP28) es una proteína de 29 kD de 258 aminoácidos que contiene una secuencia C-terminal rica en cisteína que contiene 16 residuos de cisteína conservados entre varias proteínas de la familia. SGP28 pertenece a la familia de proteínas secretoras ricas en cisteína presentes en humanos, roedores, y equinos, que comprende CRISP-1 (Brooks et al., 1986, Eur. J. Biochem. 161:13-18; Haendler et al., 1993, Endocrinology 133:192-198; Kratzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236:827-36), CRISP-2/TPX-1 (Kasahara et al., 1989, Genomics 5:527-534; Mizuki et al., 1992, Mamm. Genome 3:274-280) y CRISP-3/SGP28 (Haendler et al., 1993, Endocrinology 133:192-198; Schambony et al., 1998. Biochimica et Biophysica Acta 1387:206-216; Schwidctzky et al., 1995, Biochem. J. 309:831-836).
La SGP28 humana ha sido identificada en gránulos de neutrófilos y la expresión de SGP28 ha sido detectada en las glándulas salivares, páncreas, próstata, epidídimo, ovario y colon (Kratzschmar et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236: 827-36). La expresión de proteínas de la familia CRISP murinas ha sido detectada en células B, glándulas salivares y lacrimales, epidídimo, testículo y células de mucosa (Pfisterer et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:6160-6168; Haendler et al., 1999 J. Cell. Physiology 178:371-378, Haendler et al., 1997, Eur. J. Biochem. 250:440-446), y la CRISP-2 murina y la CRISP-3 murina son reguladas por andrógenos (Haendler et al., 1999 J. Cell. Physiology 178:371-378, Haendler et al., 1997, Eur. J. Biochem. 250:440-446). Se ha sugerido que SGP28 y otros miembros de la familia CRISP pueden tener un papel en la inmunidad innata no específica (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380: 246-250; Pfisterer et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:6160-6168, Haendler et al., 1999 J. Cell Physiology 178:371-378).
Como se describe además en los Ejemplos siguientes, el gen y proteína SGP28 han sido caracterizados de varias maneras. Por ejemplo, se hicieron análisis de la codificación de nucleótidos y secuencias de aminoácidos para identificar elementos estructurales conservados en la secuencia SGP28, características topológicas, modificaciones post-traduccionales, y moléculas potencialmente relacionadas. Se hicieron análisis Northern blot de la expresión de mRNA de SGP28 para establecer el rango de tejidos normales y cancerosos que expresan los diferentes mensajes de SGP28. Se hicieron análisis Western blot e inmunohistoquímicos de la expresión de la proteína SGP28 en células y tejidos experimentalmente transfectados y cancerosos para determinar los patrones de expresión y secreción. SGP28 tiene un pI de 8,08 y un peso molecular calculado de 29,0 kDa.
Varias proteínas secretadas han sido descritas en cáncer de próstata, un número de las cuales ha sido mostrado para participar en el proceso de la formación y progresión del tumor (Inoue K., 2000; Clin. Cancer Res. 6:2104-19; Dow JK et al., 2000, Urology 55:800-6). Como SGP28 es una proteína secretada, una de sus potenciales funciones es regular el micro-ambiente del cáncer de próstata y de la enfermedad metastásica. Para probar esta posibilidad, SGP28 puede ser expresada y purificada como una GST-SGP28 recombinante o formar SGP28-Myc/His. Se incuba entonces SGP28 purificada recombinante (tal como GST-SGP28 o SGP28-Myc/His) con una variedad de tipos celulares que recapitulan el ambiente de la próstata, incluyendo las células epiteliales de la próstata, líneas celulares de tumor de próstata, células del tejido adherente de la próstata, células endoteliales de la próstata y células neuroendocrinas de la próstata. Además, SGP28 recombinante también se incuba con células encontradas en sitios metastásicos, tales como células de la medula espinal y células del sistema inmunitario. La unión de SGP28 a células intactas se detecta por análisis FACS y por ensayo calorimétrico. Este análisis es valioso ya que identifica una población celular que une y puede responder a SGP28. Además, la identificación de una población celular diana puede proporcionar una manera de aislar e identificar receptores de SGP28.
SGP28 tiene una fuerte homología con las proteínas defensinas, en particular con \beta-defensinas. Las Beta-defensinas se secretan como productos principalmente producidos por las células epiteliales (O'Neil DA et al, 1999, J. Immunol. 163:6718-24; Schroder JM, Harder J., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:645-51). Las defensinas juegan un papel importante en la prevención de infecciones y protegen la inmunidad de los tejidos epiteliales. Además, la defensina humana HNP1 se ha mostrado para inducir la muerte de células tumorales in vitro. Investigando el papel de la SGP28 en células muertas, SGP28 purificada recombinante se incuba con una variedad de tipos celulares listados más adelante y se analiza la actividad apoptótica usando análisis FACS de células teñidas de Anexina V. SGP28 también puede funcionar como un quimioatrayente, como se ha mostrado para otras moléculas defensina (Yang D et al. Leukoc Biol. 2000,68:9-14, Yang D et al. Science. 1999, 286(5439):525-8.). Usando un ensayo quimiotáctico, uno puede evaluar el efecto de SGP28 en la migración de varios tipos celulares, incluyendo células epiteliales, adherentes, endoteliales así como monocitos, linfocitos y células dendríticas.
Aislamiento de SGP28-que codifica moléculas de ácido nucleico
Las secuencias de cDNA de SGP28 aquí descritas permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican producto(s) del gen SGP28, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican productos homólogos del gen SGP28, alternativamente isoformas empalmadas, variantes alélicas, y formas mutantes del producto del gen SGP28. Son bien conocidos varios métodos de clonaje molecular que pueden ser empleados para aislar la cDNAs enteros que codifican un gen SGP28 (ver, por ejemplo, Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d edition., Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 995). Por ejemplo, las metodologías de clonaje del fago lambda pueden ser convenientemente empleadas, usando sistemas de clonaje comercialmente disponibles (p.ej., Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fagos que contienen cDNAs del gen SGP28 pueden ser identificados probando con cDNA de SGP28 marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el cDNA de SGP28 (Tabla 1; ID DE SEC NO: 2) o una porción del mismo puede ser sintetizado y usado como una sonda para recuperar los cDNAs superpuestos y enteros correspondientes a un gen SGP28. El gen SGP28 por si mismo puede ser aislado por una exploración de librerías genómicas de DNA, librerías de cromosomas de bacterias artificiales (BACs), librerías de cromosomas artificiales de hongos (YACs), y similares, con sondas o cebadores del DNA de SGP28.
Moléculas de DNA recombinante y sistemas huésped-vector
La invención también proporciona moléculas de DNA o RNA recombinantes que contienen un polinucleótido SGP28, incluyendo pero no limitado a fagos, plásmidos, fagómidos, cósmidos, YACs, BACs, así como varios vectores virales y o no virales bien conocidos en el campo, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de DNA o RNA recombinantes. Como se usa aquí, una molécula de DNA o RNA recombinante es una molécula de DNA o RNA que ha sido sujeta a manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidas (ver, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, supra).
La invención además proporciona un sistema huésped-vector que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido SGP28 con una célula huésped adecuada procariota o eucariota. Ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una levadura, una célula vegetal, o una célula animal, tales como una células de mamífero o una célula de insecto (p.ej., una célula de baculovirus capaz de ser infectada como una célula Sf9). Ejemplos de células de mamíferos adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata como LNCaP, PC-3, DU 145, LAPC-4, Tsu Pr1, otras líneas celulares de cáncer de próstata transducibles o transfectables, así como un número de células de mamíferos usadas de manera rutinaria para la expresión de proteínas recombinantes (p.ej., células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de una SGP28 puede ser usado para generar proteínas SGP28 o fragmentos de la misma usando cualquier número de sistemas huésped-vector de forma rutinaria usados y ampliamente conocidos en el campo.
Un amplio rango de sistemas huésped vector adecuados para la expresión de proteínas SGP28 o fragmentos de la misma están disponibles, ver por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology,1995, supra). Vectores preferidos para la expresión de mamíferos incluyen pero no se limitan a pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión, SGP28 pueden ser expresadas preferiblemente en el cáncer de próstata y líneas celulares no prostáticas, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuP.rl. Los sistemas huésped vector de la invención son útiles para la producción de una proteína SGP28 o fragmento de la misma. Tales sistemas huésped vector pueden ser empleados para estudiar las propiedades funcionales de SGP28 y las mutaciones de SGP28.
Las proteínas codificadas por los genes de SGP28, o por fragmentos de la misma, tendrán una variedad de usos, incluyendo pero no limitados a generar anticuerpos y métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto del gen de SGP28. Anticuerpos obtenidos contra una proteína SGP28 o fragmento de la misma puede ser útil en los ensayos de diagnóstico o prognosis, siendo metodologías parecidas (incluyendo, particularmente, cánceres parecidos), y métodos terapéuticos en la dirección de cánceres humano caracterizados por la expresión de una proteína SGP28, incluyendo pero no se limita al cáncer de próstata. Varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas SGP28 son contemplados, incluyendo pero no limitados a varios tipos de inmunoensayos, ensayos inmunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos, y similares. Tales anticuerpos pueden ser marcados y usados como reactivos inmunológicos capaces de detectar las células de la próstata (p.ej., en métodos gráficos radiocentigráficos. Las proteínas SGP28 también pueden ser particularmente útiles en generar vacunas del cáncer, como se describe adelante.
Proteínas SGP28
Otro aspecto de la presente invención proporciona proteínas SGP28 y fragmentos de polipéptidos de la misma. Las proteínas SGP28 de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas aquí, así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa y homólogos a la extensión que tales variantes y homólogos pueden ser aislados/generados y caracterizados sin una indebida experimentación siguiendo los métodos esquematizados más adelante. La fusión de proteínas que combinan partes de diferentes proteínas SGP28 o fragmentos de las mismas, así como la fusión de proteínas de una proteína SGP28 y un polipéptido heterólogo, también se incluyen. Tales proteínas SGP28 serán colectivamente referidas como las proteínas SGP28, las proteínas de la invención, o SGP28. Como se usa aquí, el término "polipéptido SGP28" se refiere a un fragmento de polipéptido o una proteína SGP28 de al menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 15 aminoácidos.
Una realización específica de una proteína SGP28 comprende un polipéptido que tiene la secuencia humana de aminoácidos SGP28 como se muestra en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), desde el residuo aminoacídico número 1 hasta el residuo aminoacídico 258 como se muestra ahí. Otra realización específica de una proteína SGP28 comprende un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica de la SGP28 humana como se muestra en la tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), desde el residuo aminoacídico número 33 hasta el residuo aminoacídico número 258 como se muestra ahí. Una realización preferida de un fragmento de SGP28 comprende un péptido seleccionado del grupo que comprende los aminoácidos 1-32 de la secuencia de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), o uno o ambos motivos de las proteínas SCP extracelulares a los residuos aminoacídicos 150-160 (WGHYTQWWY; ID DE SEC NO: 6) y 170-182 (YYVCQYCPAGNW; ID DE SEC NO:7).
En general, naturalmente las variantes alélicas de SGP28 humana naturales compartirán un alto grado de identidad estructural y homología (p.ej., 90% o más de identidad). Típicamente, las variantes alélicas de las proteínas SGP28 contendrán sustituciones aminoacídicas conservativas en las secuencias de SGP28 descritas aquí o contendrán una sustitución de un aminoácido desde una posición correspondiente en un homólogo de SGP28. Una clase de variantes alélicas de SGP28 serán proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia de aminoácidos particular de la SGP28, pero aún contendrá un radical diferente de la secuencia, tal como una sustitución conservativa, inserción de truncación o cambio de marco.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden estar hechas de manera frecuente en una proteína sin alteración de la conformación ni de la función de la proteína. Tales cambios incluyen sustituir cualquier isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) para cualquier otro de esos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) para ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) para asparagina (N) y viceversa; y serina (S) para treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden ser consideradas conservativas, dependiendo del ambiente del aminoácido en particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser intercambiadas con frecuencia, como pueden la alanina (A) y valina (V). Metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, puede ser intercambiada frecuentemente con leucina e isoleucina, y a veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son intercambiables frecuentemente en localizaciones en las que la característica significativa del residuo aminoacídico es su carga y los pK's que difieren de esos dos residuos aminoacídicos no son significativos. Incluso otros cambios pueden ser considerados "conservativos" en ambientes particulares.
Las proteínas SGP28, incluyendo variantes, comprenden al menos un epítopo en común con una proteína SGP28 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), de manera que un anticuerpo que se una específicamente a la proteína SGP28 o variante también se unirá a la proteína SGP28 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3). Una clase de variantes de proteína SGP28 comparten el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3). Una clase más específica de variantes de la proteína SGP28 comprende un motivo SCP extracelular de la proteína como se describió anteriormente. Variantes de proteína SGP28 preferidas son capaces de mostrar una o más de las funciones de la defensina descrita aquí, incluyendo, por ejemplo, la capacidad de inducir la muerte del tumor o quimioatraccionar y/o inducir la migración de células.
Las proteínas SGP28 pueden ser realizadas de varias formas, preferiblemente de forma aislada. Como se usa aquí, se dice que una proteína para ser "aislada" cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para extraer la proteína SGP28 de los constituyentes celulares que están normalmente asociados a esta proteína. Un experto puede emplear fácilmente métodos de purificación estándar para obtener una proteína SGP28 aislada. Una molécula de la proteína SGP28 purificada será sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que impiden la unión de SGP28 al anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y la purificación dependen del uso propuesto. Realizaciones de una proteína SGP28 incluyen una proteína SGP28 purificada y una proteína SGP28 funcional y soluble. De alguna forma, tales proteínas SGP28 funcionales, solubles o fragmentos de las mismas retienen la capacidad de unirse al anticuerpo u otro ligando.
La invención también proporciona los polipéptidos SGP28 que comprenden biológicamente fragmentos activos de la secuencia de aminoácidos de SGP28, tales como un polipéptido que corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos para SGP28 como se muestra en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3). Tales polipéptidos de la invención muestran propiedades de la proteína SGP28, así como la capacidad de elicitar la generación de anticuerpos que específicamente unen un epítopo asociado con la proteína SGP28.
Realizaciones de la invención que aquí se revela incluye una amplia variedad de variantes aceptadas del campo de las proteínas SGP28 como polipéptidos que tienen inserciones de aminoácidos, delecciones y sustituciones. Variantes de SGP28 pueden estar hechas usando métodos conocidos en el campo como mutagénesis dirigida, exploración de alanina, y mutagénesis dirigida por PCR [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis en casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas se pueden llevar a cabo en el DNA clonado para producir el DNA variante de SGP28. También se pueden emplear un análisis de cribaje de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos entre secuencias contiguas. Entre los aminoácidos explorados preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños, neutros. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La alanina típicamente es un aminoácidos preferido de cribaje entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que se altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en ambas posiciones ocultas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de la alanina no produce cantidades adecuadas de la variante, un aminoácido isostérico puede ser usado.
Como se discutió anteriormente, realizaciones de la invención reivindicada incluyen polipéptidos que contienen menos que la secuencia de 258 aminoácidos de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2(SEC ID NO: 3). Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención aquí revelada incluyen polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 1 a alrededor del aminoácido 10 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2(SEC ID NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 20 a alrededor del aminoácido 30 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 30 a alrededor del aminoácido 40 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 40 a alrededor del aminoácido 50 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 50 a alrededor del aminoácido 60 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 60 a alrededor del aminoácido 70 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 70 a alrededor del aminoácido 80 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 80 a alrededor del aminoácido 90 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) y polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 90 a alrededor del aminoácido 100 de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), etc. Siguiendo este esquema, polipéptidos que consisten en porciones de secuencia de aminoácido de los aminoácidos 100-258 de la proteína SGP28 son típicas realizaciones de la invención. Polipéptidos que consisten en porciones grandes de la proteína SGP28 también son contemplados. Por ejemplo polipéptidos que consisten en alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40 etc.) a alrededor del aminoácido 20, (o 30, o 40 o 50 etc.) de la proteína SGP28 mostrados en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) pueden ser generados por una variedad de técnicas bien conocidas en el campo.
Realizaciones ilustrativas adicionales de la invención revelada aquí incluyen polipéptidos de SGP28 que contienen residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos en la secuencia del polipéptido SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3). Los polipéptidos SGP28 que contienen uno o más de esos motives u otras regiones seleccionadas de interés descritas aquí típicamente incluirán una secuencia adyacente de 5 a 25 o más residuos de aminoácidos de la proteína SGP28 en uno o ambos lados del/de los motivo(s) seleccionados. En una realización, los polipéptidos típicos de la invención que contienen una o más de las regiones de SGP28 que muestran homología con la defensinas. En otra realización, polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los sitios de N-glicosilación de la SGP28 tales como NCSN (ID DE SEC NO:8) en los residuos 252-255 (numerado desde el primer residuo de aminoácido mostrado en la ID DE SEC NO: 3). En otra realización, los típicos polipéptidos de la invención pueden contener uno o más sitios de fosforilación de quinasa c de la SGP28 tales como en los residuos 106-108 y/o 231-233. En otra realización, polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más sitios de fosforilación de caseín quinasa II de la SGP28 tales como SWFD en los residuos 128-131 (ID DE SEC NO: 9) y/o SCPD en los residuos 206-209 (ID DE SEC NO: 10). En otra realización, polipéptidos típicos de la invención pueden contener un o más sitios de fosforilación tirosín quinasa tales como KCGENLY en los residuos 108-114 (ID DE SEC NO: 11). En otra realización, polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los sitios de N-miristoilación tales como GLLPSF en los residuos 26-31 (ID DE SEC NO: 12), GCGNAY en los residuos 164-169 (ID DE SEC NO: 13), GNWANR en los residuos 188-193 (ID DE SEC NO: 14), GAPCAS en los residuos 201-206 (ID DE SEC NO: 15) y/o GLCTNG en los residuos 214-219 (ID DE SEC NO: 16). En otra realización, polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de las secuencias firmadas de la proteína extracelular SCP, tales como residuos de aminoácido 150-160 de la SEQ ID NO: 3, y/o residuos de aminoácidos 179-190 de la ID DE SEC NO: 3. En otra realización, típicos polipéptidos de la invención que contienen uno o más péptidos de unión previstos HLA-A2 tales como los aminoácidos 2-10 (TLFPVLLFL; ID DE SEC NO: 17), los aminoácidos 6-14 (VLLFLVAGL; ID DE SEC NO: 18), los aminoácidos 30-38 (ALLTTQTQV; ID DE SEC NO: 19), los aminoácidos 142-150 (VVWYSSYLV; ID DE SEC NO: 20), los aminoácidos 222-230 (TLTCKHQLV; ID DE SEC NO: 21), los aminoácidos 175-183 (GNWANRLYV; ID DE SEC NO: 22), los aminoácidos 7-15 (LLFLVAGLL; ID DE SEC NO: 23), aminoácidos 141-149 (QVVWYSSYL; ID DE SEC NO: 24), aminoácidos 134-142 (AVVGHYTQV; ID DE SEC NO: 25), y aminoácidos 211-219 (DLYSNCKSL; ID DE SEC NO: 26) de SGP28. Realizaciones relacionadas de estas invenciones incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos discutidos anteriormente siendo las realizaciones preferidas aquellas que no contienen inserciones, delecciones, o sustituciones ni en los motivos ni en las secuencias que intervienen en esos polipéptidos.
Los polipéptidos SGP28 pueden ser generados usando tecnología estándar de síntesis de péptidos o usando métodos de escisión química bien conocidos en el campo basado en las secuencias de aminoácidos de las proteínas SGP28 reveladas aquí. Alternativamente, métodos recombinantes pueden ser usados para generar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un fragmento de polipéptido de una proteína SGP28. En esta consideración, las moléculas de ácidos nucleico que codifican SGP28 descritas aquí proporcionan maneras de generar fragmentos definidos de proteínas SGP28. Los polipéptidos SGP28 son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos de dominio específico (p.ej., anticuerpos que reconocen un epítopo extra o intracelular de una proteína SGP28), en agentes de identificación o factores celulares que unen a SGP28 o un dominio estructural articular de la misma, y en varios contextos terapéuticos, incluyendo pero no limitado a vacunas de cáncer. Los polipéptidos SGP28 que contiene particularmente estructuras interesantes pueden ser previstas y/o identificadas usando varias técnicas analíticas bien conocidas en el campo, incluyendo, por ejemplo, los métodos de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o análisis Jameson-Wolf, o en la base de inmunogenicidad. Fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en generar subunidades específicas de anticuerpos anti-SGP28 o en identificar factores celulares que unen a SGP28.
En una realización específica descrita en los ejemplos que siguen, una forma de SGP28 secretada puede ser expresada convenientemente en células 293T transfectadas con un vector de expresión conductor de CMV codificando SGP28 con un 6XHis C-terminal y tag de MYC (pcDNA3.1 /mycHIS, Invitrogen). La SGP28 marcada con HIS en el medio de cultivo puede ser purificado usando una columna de níquel y técnicas estándar. Alternativamente, se puede usar un sistema AP-tag. Varios constructos de expresión de SGP28 están descritos en los ejemplos siguientes.
Modificaciones de SGP28 tales como modificaciones covalentes están incluidas en el propósito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye residuos de aminoácidos diana reactivos de un polipéptido con un agente orgánico derivado que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos N o C- terminales del SGP28. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido SGP28 se incluía en el propósito de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se propone con el propósito de que se suprima la mitad o más de los carbohidratos encontrados en la secuencia nativa de SGP28 (tanto por eliminación del sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación de manera química y/o enzimática), y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en la secuencia nativa de SGP28. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de proteínas nativas, involucrando un cambio en la naturaleza y las proporciones de varios de los carbohidratos presentes. Otro tipo de modificación covalente de SGP28 comprende conectar el polipéptido SGP28 a una variedad de polímeros no-proteínaceos, p.ej., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera publicada en los Nos de la Patente Estadounidense 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.
El SGP28 de la presente invención también puede ser modificado de alguna manera para formar una molécula quimérica que comprenda SGP28 fusionado a otro, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del SGP28 con una marca de epítopo de polihistidina que proporciona un epítopo que el níquel inmovilizado puede enlazar selectivamente. La marca de epítopo generalmente se coloca en el amino- o carboxilo- terminal del SGP28. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del SGP28 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina"), tal fusión podría ser a la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido SGP28 en lugar de al menos una región variable en una molécula Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la junta de unión, CH_{2} y CH_{3}, o las regiones de la junta de unión, CH_{1}, CH_{2} y CH_{3} de una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas ver también No. de Patente Estadounidense 5,428,130 publicado el 27 de Junio de 1995.
Anticuerpos SGP28
Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a proteínas y polipéptidos SGP28. Los anticuerpos más preferidos unirán selectivamente a una proteína SGP28 y no unirán (o unirán débilmente) a proteínas y polipétidos no SGP28. Los anticuerpos Anti-SGP28 que son particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de esos anticuerpos. Como se usa aquí, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión del antígeno.
Para algunas aplicaciones, sería deseable generar anticuerpos que reaccionen específicamente con una proteína particular SGP28 y/o un epítopo con un dominio estructural particular. Por ejemplo, anticuerpos preferidos útiles para la terapia de cáncer y propósitos de diagnóstico por imágenes son aquellos que reaccionan con un epítopo en una región extracelular de la proteína SGP28 como se expresa en las células cancerosas. Tales anticuerpos pueden ser generados usando las proteínas SGP28 descritas aquí, o usando péptidos derivados de dominios previstos de las mismas, como un inmunógeno. En esta consideración, con referencia a la secuencia de la proteína SGP28 mostrada en la Fig 1, regiones en la secuencia amino-terminal al domino transmembrana pueden ser seleccionadas y usadas para diseñar inmunógenos apropiados y explorar reactivos para incrementar y seleccionar anticuerpos específicos de SGP28.
Anticuerpos SGP28 de la invención pueden ser particularmente útiles en estrategias terapéuticas del cáncer de próstata, ensayos de diagnóstico y pronóstico, y metodologías parecidas. Similarmente, tales anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento, diagnosis, y/o prognosis de otros cánceres, la extensión de SGP28 también se expresa o sobreexpresa en otros tipos de cáncer. La invención proporciona varios ensayos útiles para la detección y calificación de SGP28 y proteínas y polipéptidos mutantes de SGP28. Tales ensayos generalmente comprenden uno o más anticuerpos SGP28 capaces de reconocer y unir un SGP28 o proteína SGP28 mutante, como es apropiado, y puede ser ejecutado con varios formatos de ensayos inmunológicos bien conocidos en el campo, incluyendo pero no limitado a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), y similares. Además, métodos inmunológicos parecidos capaces de detectar cáncer de próstata taimen son proporcionados por la invención, incluyendo pero no limitado a métodos parecidos a la radioscintigrafía usando anticuerpos marcados SGP28. Tales ensayos se pueden usar clínicamente en la detección, monitorización, y prognosis o del cáncer de próstata, particularmente cáncer de próstata avanzado.
Anticuerpos SGP28 se pueden usar en métodos para purificar SGP28 y proteínas y polipéptidos SGP28 mutantes y para aislar SGP28 homólogos y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una realización, el método para purificar una proteína SGP28 comprende la incubación de un anticuerpo SGP28, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contenga SGP28 bajo condiciones que permitan al anticuerpo SGP28 unirse al SGP28; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir el SGP28 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos SGP28 de la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que imitan la proteína SGP28.
Los anticuerpos SGP28 también se pueden usar terapéuticamente para, por ejemplo, modular o inhibir la actividad biológica de una proteína SGP28 o apuntar y destruir células cancerosas que expresan una proteína SGP28. La terapia anticuerpos de cáncer de próstata y otros cánceres está más específicamente descrita en una subsección separada más adelante.
Varios métodos para la preparación de anticuerpos son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser preparados para inmunizar un mamífero huésped adecuado usando una proteína SGP28, péptido, o fragmento, de forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Ejemplos de proteínas inmunógenos incluyen SGP28 recombinante (expresada en un sistema de baculovirus, sistema de mamíferos, etc.), el dominio extracelular SGP28, SGP28 marcada con AP, etc. Además, la fusión de proteínas de SGP28 también puede ser usada, tal como la fusión de SGP28 con GST, proteína de unión a la maltosa (MBP), proteína fluorescente verde (GFP), HisMax-TOPO o MycHis (ver ejemplos más adelante).
En una realización particular, una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto de la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) se puede producir y usar como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. Células que expresan o sobreexpresan SGP28 también pueden ser usadas para inmunizaciones. Similarmente, cualquier célula diseñada para expresar SGP28 puede ser usada. Tales estrategias pueden resultar en la producción de anticuerpos monoclonales con capacidades mejoradas para reconocer SGP28 endógenos. Otro inmunógeno útil comprende péptidos SGP28 unidos a la membrana plasmática de células rojas de ovejas.
La secuencia de aminoácidos de SGP28 como se muestra en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3) se puede usar para seleccionar regiones específicas de la proteína SGP28 para generar anticuerpos. Por ejemplo, análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de SGP28 pueden ser usados para identificar regiones hidrofílicas en la estructura de SGP28. Regiones de la proteína SGP28 que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden ser identificadas rápidamente usando otros varios métodos conocidos en el campo, tales como los análisis Chou-Fasman, Gamier Robson, hyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Tales péptidos de SGP28 previstos para enlazar HLA-A2 pueden ser seleccionados para la generación de anticuerpos. Tales péptidos de unión a HLA-A2 previstos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos 2-10 (TLFPVLLFL; ID DE SEC NO: 17), aminoácidos 6-14 (VLLFLVAGL; ID DE SEC NO: 18), aminoácidos 30-38 (ALLTTQTQV; ID DE SEC NO: 19), aminoácidos 142-150 (VVWYSSYLV; ID DE SEC NO: 20), aminoácidos 222-230 (TLTCKHQLV; ID DE SEC NO: 21), aminoácidos 175-183 (GNWANRLYV; ID DE SEC NO: 22), aminoácidos 7-15 (LLFLVAGLL; ID DE SEC NO: 23), aminoácidos 141-149 (QVVWYSSYL; ID DE SEC NO: 24), aminoácidos 134-142 (AVVGHYTQV; ID DE SEC NO: 25), Y aminoácidos 211-219 (DLYSNCKSL; ID DE SEC NO: 26) de SGP28. Como se discute en los ejemplos de más adelante, se ha demostrado la inmunogenicidad con SGP28, que se usó para generar anticuerpos policlonales y monoclonales usando conejos y ratones, respectivamente. Esta respuesta de la célula B (producción de anticuerpos) es el resultado de una respuesta suprimida de célula T por las porciones inmunogénicas de SGP28.
Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para el uso como un inmunógeno y para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo tal como BSA, KLH, u otras proteínas vehículo son bien conocidas en el campo. En algunas circunstancias, la conjugación directa se puede usar, por ejemplo, con reactivos de carbodiimida; en otras ocasiones reactivos de unión tales como aquellos proporcionados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, pueden ser efectivos. La administración de un inmunógeno SGP28 es dirigida generalmente por inyección sobre un periodo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende generalmente en el campo. Durante el programa de inmunización, la cantidad necesaria de anticuerpos se puede tomar para determinar adecuación de la formación de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales SGP28 se prefieren y pueden ser producidos de varias maneras bien conocidas en el campo. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden ser preparadas usando la tecnología estándar de hibridación de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan la producción de células B, a es generalmente conocido. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son explorados por inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína SGP28 o fragmento SGP28. Cuando el cultivo celular inmortalizado adecuado que secreta el anticuerpo deseado se identifica, las células pueden ser expandidas y los anticuerpos producidos tanto por cultivos in vitro como del fluido de ascites.
Los anticuerpos o fragmentos también pueden ser producidos, usando tecnología actual, por métodos de recombinación. Regiones que unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína SGP28 también pueden ser producidas en el contexto de anticuerpos quiméricos o injertados por CDR originado de muchas especies. Los anticuerpos humanizados o humanos SGP28 también pueden ser producidos y son producidos para el uso en contextos terapéuticos. Los métodos humanizar anticuerpos de ratón y otros anticuerpos no humanos por sustitución de uno o más de los CDRs de anticuerpos no humanos para las correspondientes secuencias humanas del anticuerpo que son bien conocidas (ver por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). Ver también, Carter et al., 1993, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 4285 and Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296. Los métodos para producir anticuerpos completamente humanos clonales incluyen presentación de fagos y tecnología de animales transgénicos (para revisar, ver Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).
Anticuerpos completamente humanos monoclonales de SGP28 pueden ser generados usando tecnología de clonaje en grandes librerías de clonación empleando genes combinatorios del gen Ig humano (es decir, presentación de fago) (Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). Anticuerpos completamente humanos monoclonales de SGP28 también pueden ser producidos usando ratones transgénicos diseñados para contener el locus del gen de la inmunoglobulina humana como se describe en la Solicitud de Patente PCT W098/24893, Kucherlapati and Jakobovits et al., publicado el 3 de diciembre, 1997 (ver también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614). Este método evita la manipulación in vitro requerida con la tecnología de presentación del fago y eficientemente produce auténticos anticuerpos humanos de alta afini-
dad.
La reactividad de los anticuerpos SGP28 con una proteína SGP28 puede ser establecida por un número de maneras bien conocidas, incluyendo Western blot, inmunoprecipitación, ELISA, y análisis de FACS usando, como es apropiado, proteínas SGP28, péptidos SGP28 expresando células o extractos de las mismas.
Un anticuerpo SGP28 o fragmento del mismo de la invención puede ser marcado con un marcador detectable o conjugado a una segunda molécula, tal como una citotoxina u otro agente terapéutico, y se usa para apuntar la segunda molécula a una célula positiva SGP28 (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, in DeVita, Jr., V.T. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina, toxina difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de saponaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos como ^{212}Bi, ^{131}1, ^{131}1n, ^{90}Y, y ^{186}Re. Marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un metal quelante o una enzima. Los anticuerpos también pueden ser conjugados a un enzima profármaco de actividad anticancerosa capaz de convertir el profármaco en su forma activa. Ver, por ejemplo, No. de Patente Estadounidense 4,975,287.
Además, anticuerpos bioespecíficos específicos para dos o más epítopos SGP28 pueden ser generados usando métodos generalmente conocidos en el campo. Además, las funciones efectoras del anticuerpo pueden ser modificadas para mejorar el efecto terapéutico de los anticuerpos SGP28 en células cancerosas. Por ejemplo, residuos de cisteína pueden ser diseñados en la región Fc, permitiendo la formación de los puentes disulfuro intercatenarios y la generación de homodímeros que pueden haber mejorado las capacidades de internalización, ADCC y/o complemento mediador de la muerte celular (ver, por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shapes, 1992, J. Immunol. 148: 2918-2922). Anticuerpos homodiméricos también pueden ser generados por técnicas de entrecruzamiento bien conocidas en el campo (p.ej., Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
Animales transgénicos SGP28
Los ácidos nucleicos que codifican SGP28 o sus formas modificadas también pueden ser usadas para generar cualquier animal transgénico o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y exploración de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (p.ej., un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, que se introdujo en el animal o un antepasado del animal en un prenatal, p.ej., en estadio embrionario. Un transgén es un DNA que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual el animal transgénico se desarrolla. En una realización, el cDNA que codifica SGP28 puede ser usado para clonar DNA genómico que codifica SGP28 de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan DNA que codifica SGP28.
Métodos para la generación de animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en el campo y están descritos, por ejemplo, en los Nos. De Patente Estadounidense 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, células particulares serían dianas para la incorporación del transgén SGP28 con potenciadores específicos de tejidos. Animales transgénicos que incluyan una copia de un transgén que codifica SGP28 introducido en la línea del germen del animal en estadio embrionario puede ser usado para examinar el efecto de expresión incrementada de DNA que codifica SGP28. Tales animales pueden ser usados como animales de ensayo para reactivos pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobre expresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, comparado con animales transgénicos no tratados, indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica.
Alternativamente, homólogos no-humanos de SGP28 pueden ser usados para construir un animal "knock out" de SGP28 que tenga una codificación defectiva o alterada del gen SGP28 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica SGP28 y el DNA genómico que codifica SGP28 introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica SGP28 se puede usar para clonar DNA genómico que codifique SGP28 de acuerdo con las técnicas establecidas. Una porción del DNA que codifica SGP28 puede ser suprimido o reemplazado con otro gen, tal como un gen que codifique un marcador seleccionable que puede ser usado para la integración del monitor.
Típicamente, se incluyen varias quilobases inalteradas que flanquean el DNA (ambas a los extremos 5' y 3') en el vector (ver p.ej., Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homóloga. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (p.ej., por electroporación) y se seleccionan células en las que el DNA introducido está homologamante recombinado con el DNA endógeno (ver p.ej., Li et al., 1992, Cell 69:915). Las células seleccionada luego se inyectan en un blastocisto de un animal (p.ej., un ratón o una rata) para formar la agregación de quimeras (ver p.ej., Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152).
Puede implantarse entonces un embrión quimérico en una hembra adoptiva pseudoembarazada y desarrollar el embrión para crear un animal "knock out". Los progenitores que albergan el DNA homólogamente recombinado en sus células germinales pueden ser identificados por técnicas estándar y usados para reproducir animales en los que todas las células del animal contienen el DNA homólogamente recombinado. Los animales "Knock out" pueden estar caracterizados por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por el desarrollo de condiciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido SGP28.
Ensayos para SGP28 circulante y excretada
Basados en la evidencia inmunohistoquímica de los solicitantes del alto nivel de la expresión lumenal de SGP28 en las glándulas de la próstata cancerosas y precancerosas, se espera que los tumores de la próstata secretarían SGP28 en la vasculatura y/o excretarían SGP28 en la orina o semen, donde la proteína puede ser detectada y cuantificada usando ensayos y técnicas bien conocidas en el campo de diagnóstico molecular. Detectando y cuantificando los niveles de SGP28 circulante o secretada se espera que haya un número de usos en la diagnosis, seguimiento, y prognosis del cáncer de próstata. Un número de aproximaciones técnicas para la detección y cuantificación de proteínas en el suero, orina o semen son bien conocidas en el campo. Debido a que SGP28 es una proteína de secreción expresada en cánceres de próstata y colon, y posiblemente otros cánceres, se espera que ensayos para detectar y cuantificar SGP28 en sangre o suero sean útiles para la detección, diagnosis, prognosis, y/o seguimiento de un tumor con expresión de SGP28 en un individuo. Por ejemplo, la expresión de SGP28 del mRNA en tejidos normales se encuentra predominantemente en próstata y ovario. Sin embargo, el alto nivel de expresión de proteínas se detecta en cáncer de próstata así como PIN. Consecuentemente, la detección de la proteína SGP28 en suero puede proporcionar una indicación de la presencia de un tumor prostático.
El diagnóstico de cáncer puede estar hecho en base a esta información y/u otra información. Con respecto al cáncer de próstata, por ejemplo, cualquier otra información puede incluir medidas del PSA en suero, DRE y/o ultrasonografía. Además, el nivel de SGP28 detectado en el suero puede proporcionar información útil en el seguimiento o prognosis. Por ejemplo, niveles muy altos de la proteína SGP28 en suero puede sugerir un tumor más grande y/o más agresivo.
Además, la sangre periférica puede ser convenientemente ensayada por la presencia de la proteína SGP28 y/o SGP28 expresando células cancerosas, incluyendo pero no limitado al cáncer de próstata, usando RT-PCR para detectar la expresión de SGP28. La presencia de mRNA de SGP28 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia del cáncer. Los ensayos de detección RT-PCR para células tumorales en sangre periférica actualmente están siendo evaluados para el uso en la diagnosis y gestión de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, éstos incluyen ensayos RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossclin et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Ensayos RT-PCR son bien conocidos en el campo.
En una realización, un ELISA de captura se usa para detectar y cuantificar SGP28 en suero, orina o semen. Un ELISA de captura para SGP28 comprende, generalmente, al menos dos anticuerpos de diferentes isótopos que reconocen epítopos distintivos de la proteína SGP28, o un anticuerpo monoclonal anti-SGP28 y un suero específico monoclonal derivado de una especie diferente (p.ej., conejo, cabra, oveja, hámster, etc.). En este ensayo, un reactivo sirve de anticuerpo de captura (o cobertura) y el otro como anticuerpo de detección.
Como se discute en detalle más adelante, los niveles de SGP28 que incluyen niveles de SGP28 en suero pueden ser usados para proporcionar una indicación de la presencia, extensión y agresividad de un SGP28 expresando un tumor. Como se puede notar, tal SGP28 comparte un número de características con el PSA el cual es el marcador bioquímico más importante, exacto, y clínicamente útil en la próstata. Cualquier proceso que interrumpe la arquitectura normal de la próstata permite la difusión de PSA en el estroma y la microvasculatura. Consecuentemente, los incrementos clínicamente importantes en suero de los niveles de antígeno específico de próstata se ven como cánceres prostáticos. En particular, el gran número de células malignas y la interrupción del estroma asociado con cáncer da cuenta del incremento del nivel de antígeno específico de la próstata. En este contexto, los niveles en suero del antígeno específico de la próstata correlacionan positivamente con el estadio clínico, volumen del tumor, grado histológico, y la presencia de perforación capsular e invasión de la vesícula seminal. Ver p.ej. Bostwick, D.G., 1994, Am. J. Clin. Pathol. 102(4 Suppl 1): S31-S37.
Usar PSA como la mejor molécula análoga, es probable porque SGP28-también es una molécula de secreción que muestra un patrón restringido de la expresión de tejidos (incluyendo la próstata), el incremento de la carga de células malignas y la interrupción del estroma que ocurre con el cáncer hará que los niveles del antígeno SGP28 en suero correlacionen positivamente con uno o más factores clínicamente relevantes tales como el estadio clínico, el volumen de tumor, el grado histológico, y la presencia de perforación capsular y la invasión de la vesícula seminal. Las medidas de SGP28 en suero fuera de tiempo serían de esperar para proporcionar más información, mientras que un incremento de SGP28 sería de esperar que reflejara la progresión y la tasa de incremento sería de esperar que correlacionara con la agresividad. Similarmente, un descenso en SGP28 en suero sería de esperar que reflejara un crecimiento más lento o la regresión del tumor. La identificación de SGP28 en suero puede ser útil para detectar la iniciación del tumor y estadios tempranos de la enfermedad. En pacientes que tengan que hacerse una operación o terapia, los niveles de SGP28 en suero serían útiles para monitorizar la respuesta del tratamiento y la recurrencia potencial.
Monitorización del estado de SGP28 y su producto
Ensayos que evalúan el estado del gen SGP28 y los productos del gen SGP28 en un individuo pueden proporcionar información en el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica de ese individuo. Por ejemplo, debido a que el mRNA de SGP28 se expresa tan altamente en cánceres de próstata, y no en la mayoría de tejidos normales, se pueden usar ensayos que evalúen los niveles relativos de los transcritos del mRNA de SGP28 o proteínas en una muestra biológica para diagnosticar la enfermedad asociada con la irregularización de SGP28, tal como el cáncer, y puede proporcionar información de pronóstico útil para definir opciones terapéuticas apropiadas. Similarmente, los ensayos que evalúan la integridad del nucleótido SGP28 y secuencias de aminoácidos en una muestra biológica, también se puede usar en este contexto.
El descubrimiento de que el mRNA de SGP28 tan altamente expresado en cánceres de próstata y no en la mayoría de tejidos normales, proporciona evidencias de que este gen se asocia con el crecimiento celular irregular y por lo tanto identifica este gen y sus productos como dianas que el experto puede usar para evaluar muestras biológicas de individuos que se sospecha que tengan una enfermedad asociada con desregulación de SGP28. En otro ejemplo, ya que la expresión de SGP28 está restringida normalmente a la próstata y al ovario, uno puede evaluar muestras biológicas tomadas de otros tejidos para detectar la expresión de SGP28 como indicación de metástasis. En este contexto, la evaluación del estado de expresión del gen SGP28 y sus productos pueden ser usados para ganar información en el potencial de la enfermedad de una muestra de tejido. Los términos "estado de expresión" en este contexto se usa para referirse ampliamente a la variedad de factores involucrados en la expresión, función y regulación de un gen y sus productos tales como el nivel de la expresión del mRNA, la integridad de los productos del gen expresado (tales como las secuencias nucleicas y aminoacídicas) y modificaciones transcripcionales y traduccionales de esas molécu-
las.
El estado de expresión de SGP28 puede proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a estados particulares de la enfermedad, progresión, y/o agresividad de los tumores. La invención proporciona métodos y ensayos para la determinación del estado de expresión de SGP28 y diagnosticar cánceres que expresan SGP28, tales como cánceres de próstata. El estado de expresión de SGP28 en muestras de paciente pueden ser analizadas por un número de maneras bien conocidas en el campo, incluyendo sin limitación, análisis inmunohistoquímicos, hibridación in situ, análisis RT-PCR en captura de láser de muestras microdiseccionadas, análisis Western blot de muestras clínicas y líneas celulares, y análisis de colección de tejidos (array). Protocolos típicos para evaluar el estado de expresión para el gen SGP28 y productos del gen pueden ser encontrados, por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 [Northern Blotting), 4 [Southern Blotting], 15 [Immunoblotting] y 18 [PCR Analysis], Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para monitorizar productos del gen SGP28 para determinar el estado de los productos del gen SGP28 expresado por células en una muestra de tejido de prueba de un individuo que se sospecha que tenga una enfermedad asociada con el crecimiento celular irregular (tal como hiperplasia o cáncer) y luego comparando el estado tan determinado en el estado de los productos del gen SGP28 en una muestra correspondiente normal, la presencia del estado de los productos del gen SGP28 aberrante o alterado en la muestra de prueba relativa a la presencia de crecimiento celular irregular con las células del individuo.
Adicionalmente la invención proporciona métodos para examinar una muestra biológica para dar evidencia del crecimiento irregular celular. En una realización, el método comprende la comparación del estado de SGP8 en la muestra biológica con el estado de SGP28 en una muestra correspondiente normal, donde alteraciones en el estado de SGP28 en la muestra biológica están asociadas con el crecimiento celular irregular. El estado de SGP28 en la muestra biológica puede ser evaluado mediante, por ejemplo, examinando niveles de expresión de mRNA de SGP28 o niveles de expresión de la proteína SGP28. En una realización, una alteración en el estado de SGP28 se identifica por la presencia de SGP28 que expresan células en una muestra biológica de un tejido en el que las células que expresan SGP28 normalmente están ausentes.
En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles en determinar la presencia de cáncer en un individuo, comprendiendo la detección de un incremento significativo en la expresión del mRNA de SGP28 o de la proteína en una prueba en una célula de prueba o una muestra de tejido relativa a los niveles de expresión en el tejido o célula normal correspondiente. La presencia de mRNA de SGP28 puede, por ejemplo, ser evaluada en muestras de tejido que incluyen pero no se limitan a colon, pulmón, próstata, páncreas, vejiga, mama, ovario, cuello del útero, testículo, cabeza y cuello, cerebro, estómago, hueso, etc. La presencia de expresión significativa de SGP28 en cualquiera de esos tejidos puede ser útil para indicar las emergencia, presencia y/o la severidad de estos cánceres o una metástasis de cáncer originado en otro tejido, desde los correspondientes tejidos normales que no expresan mRNA de SGP28 mRNA o lo expresan a niveles más bajos.
En una realización relacionada, el estado de la expresión de SGP28 puede ser determinado en el nivel de proteína más que en el nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, tal método o ensayo comprendería la determinación del nivel de la proteína SGP28 expresada por células en una muestra de tejido de prueba y comparando el nivel así determinado con el nivel de SGP28 expresado en una muestra correspondiente normal. En una realización, la presencia de la proteína SGP28 se evalúa, por ejemplo, usando métodos de inmunohistoquímica. Se pueden usar anticuerpos SGP28 o coadyuvantes de unión capaces de detectar la expresión de la proteína SGP28 en una variedad de formatos de ensayo bien conocidos en el campo para este propósito.
En otras realizaciones relacionadas, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SGP28 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de esos modelos moleculares tales como inserciones, delecciones, sustituciones y similares. Tales realizaciones son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son observadas en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo de crecimiento irregular (ver p.ej. Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)). En este contexto, una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y son bien conocidas en el campo. Por ejemplo, el tamaño y estructura de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de productos del gen SGP28 pueden observarse por el Northern, Southern, Western, PCR y protocolos de secuenciación de DNA discutidos aquí. Además, otros métodos para observar la perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos tales como análisis del polimorfismo de la conformación de la hebra simple son bien conocidos en el campo (ver p.ej. Nos de Patente Estadounidense 5,382,510 y 5,952,170).
En otra realización, se puede examinar el estado de metilación del gen SGP28 en una muestra biológica. Desmetilación aberrante y/o hipermetilación de islas CpG en regiones 5' de regulación del gen frecuentemente ocurre en células inmortalizadas y transformadas y pueden resultar en la expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, el promotor de la hipermetilación de la S-glutationtransferasa de la clase pi (una proteína expresada en la próstata normal pero no expresada en >90% de carcinomas de próstata) aparece para silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada más frecuentemente en carcinomas de próstata (De Marzo et al., 1999, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia prostática intraepitelial (PIN) de alto grado (Brooks et al., 1998, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 7:531-
536).
En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-I (el cual no se expresa en la próstata normal pero se expresa en el 25-50% de cáncer de próstata) se induce por desoxiazacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debido a la desmetilación (Lethe et al., 1998, Int. J. Cancer 76(6): 903-908). En este contexto, una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, se pueden utilizar en aproximaciones de hibridación Southern enzimas de restricción sensibles a la metilación que no cortan secuencias que contienen sitios CpG metilados con el fin de evaluar el estado de metilación global de las islas CpG.
Además, MSP (PCR específica metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en las islas CpG de un gen dado. Este procedimiento involucra modificación inicial de DNA por bisulfito sódico (que convertirán todas las citosinas desmetiladas a uracilo) seguido por amplificación usando cebadores específicos para DNA metilados versus desmetilados. Protocolos que involucran interferencia de metilación también se pueden encontrar por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Units 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995.
En otra realización relacionada, la invención proporciona ensayos útiles en determinar la presencia de cáncer en un individuo, comprendiendo la detección de un cambio significativo en las variantes alternativas de corte y empalme de SGP28 expresadas en una célula de prueba o muestra de tejido relativa a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La monitorización de variantes de corte y empalme de SGP28 alternativas es útil porque los cambios en el empalme alternativo de proteínas se sugiere como uno de los pasos en una serie de eventos que llevan a la progresión de cánceres (ver p.ej. Carstens et al., Oncogene 15(250: 3059-3065 (1997)).
La amplificación de genes proporciona un método adicional de evaluación del estado de SGP28. La amplificación de genes puede ser medida en una muestra directamente, por ejemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para cuantificar la trascripción del mRNA [Thomas, Proc. Nat/. Acad Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], Dot blotting (análisis de DNA), o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser empleados de manera que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, e híbridos dúplex de DNA-RNA o dúplex de proteína DNA. Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el ensayo puede ser llevado a cabo cuando el dúplex se une a la superficie, a fin de que sobre la formación del dúplex en la superficie, la presencia del enlace del anticuerpo al dúplex pueda ser detectado.
Además de los tejidos discutidos anteriormente, la sangre periférica puede ser convencionalmente ensayada por la presencia de células cancerosas, incluyendo pero no limitado a los cánceres de próstata, usando RT-PCR para detectar la expresión de SGP28. La presencia de mRNA de SGP28 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. La detección de ensayos RT-PCR para células tumorales en sangre periférica está siendo actualmente evaluadas para el uso en el diagnostico y gestión de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al:, 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Ensayos RT-PCR son bien conocidos en el campo.
Un aspecto relacionado de la invención está dirigido a predecir la susceptibilidad a desarrollar cáncer en un individuo. En una realización, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende la detección del mRNA de SGP28 o la proteína de SGP28 en una muestra de un tejido, su presencia indicando susceptibilidad al cáncer, en donde el grado de la expresión del mRNA de SGP287 presente es proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, la presencia de SGP28 en tejido prostático se examina, con la presencia de SGP28 en la muestra proporcionando una indicación de susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor prostático). En una realización más relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de esas moléculas tales como inserciones, delecciones, sustituciones y similares, con la presencia de una o más perturbaciones y los productos del gen SGP28 en la muestra proporcionando una indicación de susceptibilidad al cáncer (o emergencia o existencia de un tumor).
Aún otro aspecto relacionado con la invención está dirigido a métodos para medir la agresividad del tumor. En una realización, un método para medir la agresividad de un tumor comprende la determinación del nivel de mRNA de SGP28 o proteína SGP28 expresado en un tejido correspondiente normal tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de un tejido normal, en donde el grado de expresión del mRNA de SGP28 o de la proteína SGP28 en la muestra tumoral relativa a la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de los tumores de próstata se evalúa para determinar la extensión a la que SGP28 se expresa en las células tumorales, con los niveles de expresión más altos indicando tumores más agresivos. En una realización más relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de esas moléculas tales como inserciones, delecciones, sustituciones y similares, con la presencia de una o más perturbaciones indicando tumores más agresivos.
Aun otro aspecto relacionado de la invención está dirigido a métodos para observar la progresión de la malignidad en un individuo en el tiempo. En una realización, métodos para observar la progresión de la malignidad en un individuo en el tiempo comprende determinar el nivel de mRNA SGP28 y proteína SGP28 expresada por células en una muestra del tumor, comparando el nivel determinado con el nivel de mRNA de SGP28 y proteína SGP28 expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un tiempo diferente, en donde el grado de expresión mRNA de SGP28 o proteína SGP28 en la muestra de tumor en el tiempo proporciona información de la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión de un cáncer se evalúa determinando la extensión en la que la expresión de SGP28 en las células tumorales alterna en el tiempo, con niveles de expresión más altos indicando una progresión del cáncer. En una realización más relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SGP28 en una muestra biológica a fin de identificar perturbaciones en la estructura de esas moléculas tales como inserciones, delecciones, sustituciones y similares, con la presencia de una o más perturbaciones indicando una progresión del cáncer.
Las aproximaciones de diagnóstico anteriormente citadas pueden ser combinadas con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y diagnóstico conocidos en el campo. Por ejemplo, otra realización de la invención revelada aquí está dirigida a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen SGP28 y los productos del gen SGP28 (o perturbaciones en el gen SGP28 y productos del gen SGP28) y un factor que se asocia con malignidad como una forma de diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido. En este contexto, una amplia variedad de factores asociados a la malignidad pueden ser utilizados como la expresión de genes a no ser que estén asociados con la malignidad (incluyendo la expresión de PSA, PSCA y PSM) así como observaciones citológicas vulgares (ver p.ej. Backing et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 1995 Feb;26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Métodos para observar una coincidencia entre la expresión del genSGP28 y los productos del gen SGP28 (o perturbaciones en el gen SGP28 y productos del gen SGP28) y un factor adicional que se asocia con la malignidad son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto o constelación de factores específicos que coincidan proporciona información crucial para el diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido.
En una realización típica, métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen SGP28 y los productos del gen SGP28 (o perturbaciones en el gen SGP28 y productos del gen SGP28) y un factor que se asocia con la malignidad conlleva a detectar la sobreexpresión del mRNA de SGP28 o la proteína SGP28 en un tejido simple, detectando la sobreexpresión del mRNA de PSA o proteína y una muestra de tejido, y observando una coincidencia del mRNA o proteína de SGP28 y mRNA o proteína de PSA de sobreexpresión. En una realización específica, la expresión de SGP28 y mRNA de PSA es examinada. En una realización preferida, la coincidencia de la sobreexpresión de SGP28 y mRNA de PSA en una muestra proporciona una indicación de cáncer de próstata, susceptibilidad de cáncer de próstata o la emergencia o existencia de un tumor prostático.
Métodos para detectar y cuantificar la expresión del mRNA o proteína de SGP28 se describen aquí y usan tecnologías de detección y cuantificación estándar de ácidos nucleicos y proteínas bien conocidas en el campo. Métodos estándar para la detección y cuantificación del mRNA de SGP28 incluye la hibridación in situ usando ribosondas marcadas de SGP28, técnicas Northern blot relacionadas usando sondas del polinucleótido SGP28, análisis RT-PCR usando cebadores específicos para SGP28, y otros tipos de métodos de detección, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, RT-PCR semicuantitativa se puede usar para detectar y cuantificar la expresión del mRNA de SGP28 como se describe en los Ejemplos que siguen. Cualquier número de cebadores capaces de amplificar SGP28 pueden ser usados para este propósito, incluyendo pero no limitándose a los conjuntos de varios cebadores específicamente descritos aquí. Métodos estándar para la detección y cuantificación de proteína pueden ser usados para este propósito. En una realización específica, anticuerpos monoclonales o policlonales específicamente reactivos con la proteína de tipo salvaje SGP28 pueden ser usados en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado. Anticuerpos dirigidos contra proteínas SGP28 se pueden usar para detectar SGP28 en una muestra del paciente (p.ej., sangre, orina, semen, u otra muestra) usando técnicas convencionales tales como la clasificación de células activadas fluorescentemente (FACS) y/o ELISA.
Identificación de moléculas que interaccionan con SGP28
Las secuencias de la proteína SGP28 reveladas aquí permiten al experto identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interaccionan con SGP28 y rutas activadas por SGP28 mediante cualquiera de una variedad de protocolos aceptados de la materia. Por ejemplo se puede utilizar una de las variedades de los llamados sistemas trampa de interacción (también referidos como el "ensayo de los dos híbridos"). En éstos sistemas, moléculas que interaccionan reconstituyen un factor de transcripción la expresión directa de un gen marcador, la expresión del cual luego se ensaya. Los sistemas típicos identifican interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico y se revelan por ejemplo en los Nos. De Patente Estadounidense 5,955,280, 5,925,523, 5,846,722 and 6,004,746.
Alternativamente se pueden identificar moléculas que interaccionen con secuencias de la proteína SGP28 por exploración de librerías de péptidos. En estos métodos, los péptidos que se unen a moléculas receptor seleccionadas tales como SGP28 se identifican por exploración de librerías que codifican una colección al azar o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las librerías se expresan como proteínas de fusión de las proteínas de la cubierta de bacteriófagos, y partículas de bacteriófagos se filtran contra los receptores de interés. Los péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, pueden así ser identificados sin ninguna información previa en la estructura del ligando esperado o molécula receptora. Las librerías típicas de péptidos y métodos de cribaje que pueden ser usados para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de la proteína SGP28 están reveladas por ejemplo en los Nos. De la Patente Estadounidense 5,723,286 y
5,733,731.
Alternativamente, líneas celulares que expresan SGP28 pueden ser usadas para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por SGP28. Esta posibilidad puede ser examinada usando técnicas de inmunoprecipitación como se muestran por otros (Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). Típicamente la proteína SGP28 puede ser inmunoprecipitada a partir de SGP28 que expresan líneas celulares de cáncer de próstata usando anticuerpos anti-SGP28. Alternativamente, anticuerpos contra His-tag se pueden usar en una línea celular diseñada para expresar SGP28 (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede ser examinado por asociación de proteína por procedimientos tales como western blotting, marcando ^{35}S-metionina de proteínas, microsecuenciando proteínas, impregnación argéntica y electroforesis en gel de dos dimensiones.
Moléculas pequeñas que interaccionan con SGP28 pueden ser identificadas a través de realizaciones relacionadas con tales ensayos de cribado. Por ejemplo, se puede identificar que las moléculas pequeñas que interfieren con la función SGP28, incluyendo moléculas que interfieren con la capacidad de SGP28 para unirse a células y/o modular la formación del tumor, progresión, migración y/o apoptosis. Se discuten métodos típicos por ejemplo en el No. de Patente Estadounidense 5,928,868 e incluyen métodos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, el ligando híbrido se introduce en las células que a su vez contienen un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye DNA para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína diana conectada a una secuencia codificada por un módulo transcripcional. Las células además contienen un gen marcador, la expresión de las cuales está condicionada en la proximidad a cada una de la primera y segunda proteína híbrida, un evento que ocurre solamente si el ligando del híbrido se une a sitios diana en ambas proteínas híbridas. Esas células que expresan el gen marcador se seleccionan y la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida se identifican.
Una realización típica de esta invención consiste en un método de cribado para una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3), comprendiendo los pasos para contactar una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de SGP28, permitiendo la interacción bajo condiciones que faciliten la interacción de la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de SGP28, determinando la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de SGP28 y luego separando moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de SGP28 a partir de moléculas que interaccionan con la secuencia de aminoácidos de la SGP28. En una realización específica, el método además incluye la purificación de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de SGP28. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de SGP28 se contacta con una librería de péptidos. Ensayos adicionales para identificar moléculas que modulen la función de SGP28 están descritos en los Ejemplos que siguen.
Métodos y composiciones terapéuticas
La identificación de SGP28 como una proteína del cáncer de próstata abre un número de aproximaciones terapéuticas al tratamiento de cánceres de próstata. Como se discutió anteriormente, SGP28 es una proteína de secreción, y su interacción con otras células y moléculas suelen jugar un papel en la regulación del ambiente de la próstata y la iniciación, desarrollo y/o progresión del cáncer. SGP28 puede ser una diana para terapia mediante aproximaciones con la finalidad de inhibir la actividad de la proteína SGP28, inhibiendo la unión o asociación de la proteína SGP28 con otras células y moléculas, inhibiendo la trascripción o traducción de SGP28, y/o mediante el uso de vacunas del cáncer basadas en SGP28. La estrategia terapéutica puede así ser diseñada a inhibir la función de la molécula o que la molécula SGP28 sea una diana en sí.
El perfil de expresión de SGP28 es reminiscente de los MAGEs, PSA y PMSA, que son genes específicos de tejidos que están sobreregulados en melanomas y otros cánceres (Van den Eynde and Boon, Int J Clin Lab Res. 27:81-86, 1997). Debido a su expresión específica de tejidos y niveles de expresión altos en cáncer, estas moléculas actualmente están siendo investigadas como dianas para vacunas de cáncer (Durrant, Anticancer Drugs 8:727-733, 1997; Reynolds et al., Int J Cancer 72:972-976, 1997). El patrón de expresión de SGP28 proporciona la evidencia que es asimismo una diana ideal para una aproximación de vacuna del cáncer para el cáncer de próstata, ya que su expresión no se detecta en la mayoría de tejidos.
Consecuentemente, aproximaciones terapéuticas apuntando a motivos particulares de SGP28, o apuntado a inhibir la actividad de la proteína SGP28, se espera que sean útiles para pacientes que sufren cáncer de próstata y otros cánceres que expresan SGP28. Las aproximaciones terapéuticas apuntaron a inhibir la actividad de la proteína SGP28 generalmente caída entre dos clases. Una clase comprende varios métodos de inhibición de la unión o asociación de la proteína SGP28 con su asociado o con otras proteínas. La otra clase comprende una variedad de métodos para inhibir la trascripción del gen SGP28 o la traducción del mRNA de SGP28.
SGP28 como diana para la terapia basada en anticuerpos
La molécula SGP28 es una diana atractiva para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Ya que SGP28 se expresa en células cancerosas y no en la mayoría de tejidos normales, la administración sistémica de composiciones inmunoefectivas de SGP28 sería de esperar que presentara excelente sensibilidad sin toxicidad, efectos no específicos y/o no-diana causados por la unión de la molécula inmunoterapéutica a órganos y tejidos no diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con SGP28 pueden ser útiles para tratar cánceres que sistemáticamente expresan SGP28, tanto con conjugados con una toxina o agente terapéutico, o con anticuerpos desnudos capaces de inhibir la interacción de SGP28 son sus coadyuvantes de unión.
Los anticuerpos de SGP28 pueden ser introducidos en un paciente de manera que el anticuerpo se une a SGP28 y elimina la función de SGP28 en el tumor primario, en micrometástasis circulante, y/o en metástasis establecida. El grado de vascularización de tumor pude proporcionar una guía en la que se recomienda un reparto aproximado. Similarmente, el grado y/ o estado de la enfermedad se espera que proporcione información útil en su consideración. Por ejemplo, un grado más alto, un tumor más avanzado puede ser más probable que sufra metástasis, sugiriendo administración sistémica a fin de tratar o prevenir la emergencia de metástasis.
La inmunoterapia de cáncer usando anticuerpos anti-SGP28 pueden permitir la enseñanza generada a partir de varias aproximaciones que han sido empleadas con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo pero no limitándose al cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunas aproximaciones terapéuticas involucran la conjugación de anticuerpos desnudos para una toxina, tal como la conjugación de ^{131}I con anticuerpos anti-CD20 (p.ej., Bexxar, Coulter Pharmaceutical), mientras otros implican la co-administración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin^{TM} (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para el tratamiento del cáncer de próstata, por ejemplo, los anticuerpos SGP28 pueden ser administrados en conjunción con la radiación, quimioterapia o ablación hormonal.
Aunque la terapia de anticuerpos SGP28 pueda ser útil para todos los estados del cáncer, la terapia de anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres metastásicos o avanzados. El tratamiento con la terapia de anticuerpos de la invención puede ser indicada para pacientes que han recibido previamente una o más quimioterapias, mientras se combina la terapia de anticuerpos de la invención con un régimen de quimioterapia o de radiación puede ser preferido para pacientes que no han recibido tratamiento de quimioterapia. Adicionalmente, la terapia de anticuerpo puede incapacitar el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran la toxicidad del agente terapéutico muy bien.
Se puede desear para algunos pacientes de cáncer que sean evaluados por la presencia y niveles de expresión de SGP28, preferiblemente usando valoraciones inmunohistoquímicas de tejidos tumorales, técnicas de imagen cuantitativas de SGP28, u otras técnicas capaces de indicar con confianza la presencia y grado de expresión de SGP28. Análisis inmunohistoquímicos de las biopsias de los tumores o muestras quirúrgicas pueden ser preferidos para este propósito. Métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en el campo.
Anticuerpos Anti-SGP28 monoclonales útiles enpara tratar el cáncer de próstata y otros cánceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una potente respuesta inmune contra el tumor y aquellos que son capaces de inducir citotoxicidad. En esta consideración, anticuerpos anti-SGP28 monoclonales (mAbs) pueden suprimir la lisis de células tumorales por cualquier complemento mediado o mecanismos de toxicidad celular dependientes de anticuerpos (ADCC), requiriendo ambos una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con sitios receptores Fc de la célula efectora o proteínas complementarias. Además, mAbs anti-SGP28 que ejercen un efecto biológico en el crecimiento del tumor son útiles en la práctica de la invención. Mecanismos potenciales por los que estos mAbs citotóxicos pueden actuar incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de perfiles del factor de angiogénesis del tumor, y la inducción de apoptosis. El mecanismo por el que un mAb anti-SGP28 particular ejerce un efecto antitumoral puede ser evaluado usando cualquier número de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento, y hacia adelante, como es generalmente conocido en el campo.
El uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros anticuerpos no-humanos, o mAbs quiméricos humano/ratón puede inducir de moderadas a fuertes respuestas inmunes en algunos pacientes. En algunos casos, esto resultará en el aclaramiento del anticuerpo de la circulación y eficacia reducida. En la mayoría de los casos, como una respuesta inmune que pueda llevar a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar fallo renal. Consecuentemente, anticuerpos monoclonales preferidos usados en la práctica de los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son completamente humanos o están humanizados y que se unen específicamente a la diana del antígeno SGP28 con alta afinidad pero muestra bajo antigenicidad baja o inexistente en el paciente.
Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAbs anti-SGP28 simples así como combinaciones, o cócteles, de diferentes mAbs. Estos cócteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en vista que contienen mAbs que apuntan diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAbs citotóxicos con mAbs que se atienen a la funcionalidad de efectores inmunes. Estos mAbs en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos. Además, la administración de mAbs anti-SGP28 puede estar combinada con otros agentes terapéuticos, incluyendo pero no limitándose a varios agentes quimioterapéuticos, bloqueantes de andrógenos, e inmunomoduladores (p.ej., IL-2, GM-CSF). Los mAbs anti-SGP28 pueden ser administrados en sus formas "desnudas" o conjugadas, o pueden tener agentes terapéuticos conjugados a ellos.
Las formulaciones de anticuerpos anti-SGP28 pueden ser administrados mediante cualquier vía capaz de liberar los anticuerpos al sitio del tumor. Vías potencialmente efectivas de administración incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradermal, y similares. El tratamiento generalmente implica la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-SGP28 mediante una vía de administración como la inyección intravenosa (IV), típicamente a una dosis en el rango de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Una dosis en el rango de 10-500 mg de mAb por semana puede ser efectiva y bien tolerada.
Basado en la experiencia clínica con el mAb Herceptina en el tratamiento de cáncer de mama metastático, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV seguida por dosis semanales de alrededor de 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-SGP28 puede representar un régimen de dosis aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más larga. La dosis de mantenimiento periódica puede ser como una infusión de 30 minutos o más larga, siempre que la dosis inicial sea bien tolerada. Sin embargo, como entenderá un experto en la materia, varios factores influenciarán el régimen de dosis ideal en un caso particular. Estos factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media del Ab o mAbs usado, el grado de expresión de SGP28 en el paciente, la extensión del cobertijo circulante del antígeno SGP28, el nivel de concentración deseado del anticuerpo, frecuencia del tratamiento, y la influencia de agentes quimioterapéuticos usados en combinación con el método de tratamiento de la invención.
Óptimamente, los pacientes deberían ser evaluados por el nivel del cobertizo del antígeno circulante del antígeno SGP28 en suero a fin de ayudar en la determinación del régimen de dosis más apropiado y factores relacionados. Estas evaluaciones también pueden ser usadas para monitorizar propósitos mediante terapia, y puede ser útil para medir el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (así como niveles de PSA en suero en la terapia del cáncer de próstata).
Inhibición de la función de la proteína SGP28
La invención incluye varios métodos y composiciones para inhibir la unión de SGP28 a su adyuvante de unión o ligando, o su asociación con otra(s) proteína(s) así como métodos para inhibir la función de SGP28.
Inhibición de SGP28 con Proteínas Recombinantes
En una aproximación, moléculas recombinantes que son capaces de unirse a SGP28 previniendo así SGp28 de acceder/unirse a su(s) adyuvante(s) de unión o asociarse con otra(s) proteína(s) son usadas para inhibir la función de SGP28. Estas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la(s) parte(s) reactiva(s) de una molécula anticuerpo específica de SGP28. En una realización particular, el dominio de unión de SGP28 de un adyuvante de unión de SGP28 puede ser diseñado en una proteína de fusión dimérica comprendiendo dos dominios de ligando de unión de SGP28 conectadas a la porción de Fc de una IgG humana, tales como una IgG1 humana. Esta porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH_{2} y CH_{3} y la región vinculada, pero no el dominio CH_{1}. Estas proteínas de fusión diméricas pueden ser administradas de forma soluble a pacientes que sufren un cáncer asociado a la expresión de SGP28, incluyendo pero no limitándose al cáncer de próstata, donde la proteína de fusión dimérica une específicamente a SGP28 bloqueando así la interacción de SGP28 con un adyuvante de unión. Estas proteínas de fusión pueden ser además combinadas en proteínas multiméricas usando tecnologías de unión de anticuerpos conocidas.
Inhibición de SGP28 con Anticuerpos Intracelulares
En otra aproximación, vectores recombinantes que codifican anticuerpos de cadena simple que específicamente se unen a SGP28 pueden ser introducidos en células que expresan el SGP28 mediante tecnologías de transferencia de genes, en donde el anticuerpo anti-SGP28 de cadena simple codificado se expresa intracelularmente, se une a la proteína SGP28, y así inhibe su función. Métodos para diseñar estos anticuerpos intracelulares de cadena simple son bien conocidos. Estos anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", pueden ser dirigidos específicamente a un comportamiento particular con la célula, proporcionando control sobre donde se focaliza la actividad inhibitoria del tratamiento será enfocada. Esta tecnología ha sido aplicada con éxito en este campo (para revisar, ver Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Los intracuerpos han mostrado eliminar virtualmente la expresión de otra manera abundantes receptores en la superficie celular. Ver, por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289:23931-23936; Deshane et al., 1994, GeneTher. 1: 332-337.
Anticuerpos de cadena simple comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unida por un polipéptido conector flexible, y se expresan como un polipéptido simple. Opcionalmente, anticuerpos de cadena simple pueden ser expresados con un fragmento de la región variable de la cadena simple unido a la región constante de la cadena ligera. Señales de tráfico intracelular bien conocidas pueden ser diseñadas en vectores polinucleótidos recombinantes codificando estos anticuerpos de cadena simple a fin de apuntar de forma precisa el intracuerpo expresado en el compartimiento celular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplasmático (RE) pueden ser diseñados para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal del RE de retención en el C-terminal, así como el motivo aminoacídico KDEL. Los intracuerpos con intención de ejercer la actividad en el núcleo pueden ser diseñados para incluir una señal de localización nuclear. Parte de los lípidos pueden ser unidos a los intracuerpos a fin de atar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden ser dirigidos a ejercer funciones en el citosol. Por ejemplo, intracuepos citosólicos pueden ser usados para secuestrar factores en el citosol, así previniéndolos de ser transportados a su destinación celular natural.
En una realización, los intracuerpos SGP28 están diseñados para unirse específicamente a un dominio SGP28 particular. Por ejemplo, intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína SGP28 pueden ser usados para prevenir moléculas relacionadas SGP28 de la adquisición del acceso al núcleo, así previniéndolo de ejercer cualquier actividad biológica en el núcleo.
A fin de dirigir la expresión de estos intracuerpos específicamente a células tumorales particulares, la trascripción del intracuerpo puede ser reemplazado bajo el control regulador de un promotor tumor específico y/o cebador. A fin de apuntar la expresión del intracuerpo específicamente en la próstata, por ejemplo, puede ser utilizado el promotor de PSA y/o promotor/cebador (Ver, por ejemplo, No. De Patente Estadounidense 5,919,652).
Inhibición de la Transcripción o Traducción de SGP28
En otra clase de aproximaciones terapéuticas, la invención proporciona varios métodos y composiciones para inhibir la trascripción del gen SGP28. Similarmente, la invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción del mRNA del SGP28 en la proteína.
En una aproximación, un método para inhibir la traducción del gen SGP28 comprende el contacto del gen SGP28 con el polinucleótido antisentido SGP28. En otra aproximación, un método para inhibir la translación del mRNA de SGP28 comprende el contacto del mRNA de SGP28 con un polinucleótido antisentido. En otra aproximación una ribozima específica de SGP28 puede ser usada para cortar el mensaje de SGP28, inhibiendo así la traducción. Estos métodos basados en el antisentido y la ribozima también pueden dirigirse a las regiones reguladoras del gen SGP28, como el promotor de SGP28 y/o elementos potenciadores. Similarmente, las proteínas capaces de inhibir el factor de trascripción del gen SGP28 pueden ser usadas para inhibir la trascripción del mRNA del SGP28. Los diferentes polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos mencionados anteriormente han sido descritos más arriba. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la trascripción y traducción se conocen bien en el campo.
Otros factores que inhiben la trascripción de SGP28 mediante la interferencia de la activación trascripcional pueden ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan SGP28. Similarmente, los factores que son capaces de interferir con el procesamiento de SGP28 pueden se útiles para el tratamiento de cánceres que expresan SGP28. Métodos para el tratamiento del cáncer que utilizan estos factores también están al alcance de la invención.
Consideraciones generales para estrategias terapéuticas
La transferencia de genes y las tecnologías de terapia génica pueden ser usadas para liberar moléculas de polinucleótidos terapéuticas a células tumorales sintetizando SGP28 (p.ej., antisentido, ribozima, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibitorias de SGP28). Muchas aproximaciones de la terapia génica son bien conocidas en el campo. Vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido SGP28, ribozimas, factores capaces de interferir con la trascripción de SGP28, y así sucesivamente, pueden ser liberados a células tumorales diana usando tales aproximaciones de la terapia génica.
Las anteriores aproximaciones terapéuticas pueden ser combinadas con cualquiera de una amplia variedad de quimioterapia o regímenes de terapia de radiación. Estas aproximaciones terapéuticas también permiten el uso de dosis reducidas de quimioterapia y/o administración menos frecuente, particularmente en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapeutico.
La actividad antitumoral de una composición particular (p.ej., antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de tales composiciones, puede ser utilizada usando varios sistemas in vitro y sistemas de ensayo in vivo. Ensayos in vitro para evaluar potenciales terapéuticos incluyen ensayos de crecimiento de tumor, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de actividad promotora de tumor, ensayos de enlace capaces de determinar la extensión a la que una composición terapéutica inhibirá la unión de SGP28 a un adyuvante de unión, etc.
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de SGP28 puede ser evaluado en un modelo de animal adecuado. Por ejemplo, modelos de cáncer de próstata xenogénicos en donde los explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjertos pasados se introducen en animales inmunes comprometidos, así como ratones desnudos o SCID, son apropiados en relación al cáncer de próstata y han sido descritos (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3:402-408). Por ejemplo, PCT Solicitud de Patente W098/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de Abril, 1998, describe varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaz de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis, y la formación de metástasis osteoblástica característica de estadios tardíos de la enfermedad. La eficacia puede ser precisa usando ensayos que midan la inhibición de la formación del tumor, la regresión del tumor o metástasis, y similares. Ver, también, los ejemplos siguientes.
Ensayos in vivo que cualifican la promoción de apoptosis también pueden ser útiles en evaluar las composiciones terapéuticas potenciales. En una realización, los xenoinjertos de ratones portadores tratados con la composición terapéutica pueden ser examinados por la presencia de un foco apoptótico y comparado con el xenoinjerto del ratón portador control no tratado. La extensión en la que el foco apoptótico se encuentra en los tumores del ratón tratado proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas, incluyendo composiciones de vacuna, comprendiendo un vehículo adecuado para el método de liberación adecuado. Vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y no es reactiva con el sistema inmune de los pacientes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de un número de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones estériles salinas tamponadas con fosfato, agua bacteriostática, y similares (ver, generalmente, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980).
Formulaciones terapéuticas pueden ser solubilizadas y administradas mediante una vía capaz de liberar la composición terapéutica al sitio del tumor. Vías de administración potencialmente efectivas incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradermal, intraorgánica, orto tópica, y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua conservada bacteriostática, agua estéril no conservada, y/o diluida en polivinilcloruro o bolsas de polietileno conteniendo cloruro sódico estéril 0,9% para inyección, USP. Preparaciones terapéuticas de la proteína pueden ser liofilizadas y almacenadas como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y luego reconstituidas en agua bacteriostática conteniendo, por ejemplo, benzilalcohol conservante, o en agua estéril previa a la inyección.
Protocolos de dosis y administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos anteriores variarán con el método y el cáncer diana y generalmente dependerá de un número de otros factores apreciados en el campo.
Vacunas del cáncer
La invención además proporciona vacunas del cáncer comprendiendo una proteína SGP28 o fragmento de la misma, así como vacunas basadas en el DNA. En vista de la expresión de SGP28 restringida a la próstata -y tumor-, se espera que sean efectivas vacunas de SGP28 contra el cáncer en la prevención específica y/o tratamiento de cánceres que expresan la SGP28 sin crear efectos inespecíficos en los tejidos que no son diana. El uso de un antígeno de tumor en una vacuna par la generación humoral e inmunidad de células mediadas para el uso en la terapia anti-cáncer se conoce bien en el campo y ha sido empleado en el cáncer de próstata usando PSMA humano e inmunógenos PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117). Estos métodos pueden ser rápidamente practicados usando la proteína SGP28, o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica SGP28 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el inmunógeno SGP28.
Por ejemplo, sistemas de liberación de genes virales pueden ser usados para liberar una molécula de ácido nucleico que codifica SGP28. Varios sistemas de liberación de genes virales que pueden ser usados en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, vaccinia, fowlpox, canarypox, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus, y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). Sistemas de liberación no vitales también pueden ser empleados usando DNA desnudo que codifique una proteína SGP28 o fragmento de la misma introducida en el paciente. (p.ej., intramuscularmente) para inducir una respuesta antitumoral. En una realización, toda la longitud del cDNA humano de SGP28 puede ser empleada.
En una realización, una vacuna de SGP28 delcáncer se basa en la identificación de péptidos inmunogénicos en la secuencia de aminoácidos de SGP28 mostrada en la Tabla 2 (ID DE SEC NO: 3). Como se discute además en los ejemplos siguientes, SGP28 ha sido mostrado para inducir las respuestas de las células T y B. Una proteína recombinante marcada con HIS incluyendo el ORF de SGP28 (Tabla 2; ID DE SEC NO: 3) ha sido usada para generar una respuesta inmune en ratones para la producción de anticuerpos monoclonales. Los aminoácidos 93-107 de SGP28 (CNYRHSNPKDRMTSL; ID DE SEC NO: 27), han sido usados para generar una respuesta inmune en conejos para la producción de anticuerpos policlonales. De esa manera, porciones específicas de SGP28, y polinucleótidos que codifican esas porciones, pueden ser seleccionados para la producción de una vacuna de cáncer.
En otra realización, pueden ser empleadas moléculas de ácidos nucleicos de SGP28 que codifican epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos. Pueden ser determinados epítopos de CTL usando algoritmos específicos (p.ej., Epimer, Brown University) para identificar péptidos en una proteína SGP28 que son capaces de unirse óptimamente a alelos específicos de HLA. Un algoritmo adecuado es el algoritmo Peptide Motif Search de HLA disponible en la web de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/). Este algoritmo se basa en el enlace de secuencias peptídicas específicas en el surco de las moléculas de HLA de clase I y específicamente de HLA-A2 (Falk et al., 1991, Nature 351:290-6; Hunt et al., 1992, Science 255:1261-3; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163-75). El algoritmo de Peptide Motif Search de HLA permite la localización y graduación de péptidos de 8-mero, 9-mero, y 10-mero a partir de una secuencia proteica completa para predecir la unión a HLA-A2 así como a otras moléculas de Clase I. La mayoría de péptidos de unión al HLA-A2 son 9-meros, favorablemente conteniendo una leucina en la posición 2 y una valina o leucina en la posición 9 (Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7). La actual unión de los péptidos al HLA-A2 puede ser evaluada por estabilización de la expresión de HLA-A2 en el antígeno que procesa una línea celular T2 (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36: 129-38). La inmunogenicidad de péptidos específicos pueden ser evaluados in vitro por estimulación de CD8+ CTL en presencia de células dendríticas (Xue et al.; Peshwa et al., supra).
Péptidos específicos de SGP28 previstos para unirse a HLA-A2 y preferidos para el uso en vacunas de cáncer incluyen péptidos correspondientes a los aminoácidos 2-10 (TLFPVLLFL; ID DE SEC NO: 17), los aminoácidos 6-14 (VLLFLVAGL; ID DE SEC NO: 18), los aminoácidos 30-38 (ALLTTQTQV; ID DE SEC NO: 19), los aminoácidos 142-150 (VVXWSSYLV; ID DE SEC NO: 20), los aminoácidos 222-230 (TLTCKHQLV; ID DE SEC NO: 21), los aminoácidos 175-183 (GNWANRLYV; ID DE SEC NO: 22), los aminoácidos 7-15 (LLFLVAGLL; ID DE SEC NO: 23), los aminoácidos 141-149 (QWWYSSYL; ID DE SEC NO: 24), los aminoácidos 134-142 (AVVGHYTQV; ID DE SEC NO: 25), y los aminoácidos 211-219 (DLYSNCKSL; ID DE SEC NO: 26) de la secuencia de la proteína SGP28 mostrada en la Tabla 2.
Varias estrategias ex vivo también pueden ser empleadas. Una aproximación implica el uso de células dendríticas para presentar el antígeno SGP28 al sistema inmune del paciente. Las células dendríticas expresan MHC de clase I y II, coestimulador B7, e IL-12, y son así células presentadoras de antígenos altamente especializadas. En el cáncer de próstata, células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno específico de membrana de la próstata (PSMA) están siendo bien usadas en un ensayo clínico de fase I para estimular el sistema inmune del paciente con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Pueden ser usadas células dendríticas para presentar los péptidos SGP28 a las células T en el contexto de moléculas de MHC de clase I y II. En una realización, las células dendríticas son pulsadas con péptidos SGP28 capaces de unirse a moléculas MHC. En otra realización, las células dendríticas son pulsadas con la proteína SGP28 completa. Aún otra realización implica el diseño de la sobreexpresión del gen SGP28 en células dendríticas usando varios vectores de aplicación conocidos en el campo, así como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección del DNA (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), y transfección de RNA derivada de tumores (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). Células que expresan SGP28 también pueden ser diseñadas para expresar inmunomoduladores, así como GM-CSF, y usadas como agentes inmunizantes.
Anticuerpos anti-idiotípicos anti-SGP28 también pueden ser usados en la terapia anticancerosa como una vacuna para inducir una respuesta inmune en células que expresan una proteína SGP28. específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos se conoce bien en el campo y puede ser rápidamente adaptada a generar anticuerpos anti-idiotípicos anti-SGP28 que imitan un epítopo en una proteína SGP28 (ver, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Este anticuerpo anti-idiotípico puede ser usado en estrategias de vacuna contra el cáncer.
Pueden ser empleados métodos de inmunización genética para generar respuestas profilácticas o humorales terapéuticas e inmunes celulares dirigidas contra células cancerosas que expresan SGP28. Constructos que comprenden DNA que codifica una proteína/inmunógeno de SGP28 y secuencias apropiadas reguladoras pueden ser inyectadas directamente en el músculo o piel de un individuo, tal que las células del músculo o la piel incorporen el constructo y expresen al proteína/inmunógeno codificado. La expresión del inmunógeno de la proteína SGP28 resulta en la generación de una inmunidad profiláctica o humoral terapéutica, contra el cáncer de próstata y otros cánceres que expresan SGP28. Varias técnicas de inmunización terapéuticas, genéticas y profilácticas conocidas en el campo puede ser usadas (para revisar, ver información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).
Composiciones de diagnóstico y kits
Para el uso en el diagnóstico y aplicaciones terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, la invención también proporciona kits. Estos kits pueden comprender un vehículo siendo dividido en compartimentos para recibir en confinamiento uno o más contenedores como viales, tubos, y similares, cada uno de las formas de envase comprende uno de los elementos separados para ser usados en el método. Por ejemplo, una de las formas de envase puede comprender una sonda que es o puede ser detectablemente marcada. Esta sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína SGP28 o un gen SGP28 o mensaje, respectivamente. Donde el conjunto utiliza la hibridación del ácido nucleico para detectar el ácido nucleico diana, el conjunto también puede tener envases que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia diana de ácidos nucleicos y/o un envase que comprenda formas de marcaje, como una proteína de unión a la biotina, así como avidina o estreptavidina, unida a una molécula marcadora, como una marca enzimática, fluorescente, o radioisótopa.
El conjunto de la invención generalmente comprenderá el envase descrito anteriormente y otro u otros envases que comprendan materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y paquetes de insertos con instrucciones de uso. Una marca puede estar presente en el envase para indicar que la composición se usa para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, y también puede indicar direcciones para el uso tanto in vivo como in vitro, tal como se describió anteriormente.
Consecuentemente, la invención también proporciona composiciones de diagnóstico que comprenden moléculas relacionadas con SGP28. Estas moléculas incluyen varios polinucleótidos SGP28, cebadores, sondas, proteínas, fragmentos, anticuerpos descritos aquí. Las moléculas incluidas en la composición de diagnóstico pueden estar opcionalmente marcadas con un marcador detectable. Composiciones de diagnóstico de SGP28 además pueden comprender tampones apropiados, diluyentes, y otros ingredientes como se desee.
Ejemplos
Varios aspectos de la invención están mejor descritos e ilustrados a continuación mediante varios ejemplos que siguen, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Aislamiento generado por SSH de fragmentos de cDNA del gen SGP28 Materiales y Métodos Xenoinjertos LAPC
Los xenoinjertos LAPC se obtuvieron de Dr. Charles Sawyers (UCLA) y generados como se describe (Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Andrógenos dependientes e independientes de xenoinjertos LAPC-4 (LAPC-4 AD y Al, respectivamente) y xenoinjertos LAPC-9 (LAPC-9 AD and Al, respectively) se cultivaron en hembras de ratón intactas SCID o en machos castrados, respectivamente, y entraron como pequeños trozos de tejido en machos receptores. Xenoinjertos LAPC-4 Al se derivaron de tumores LAPC-4 AD y xenoinjertos LAPC-9 Al se derivaron de tumores LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos Al, ratones machos portadores de tumores LAPC AD fueron castrados y mantenidos durante 2-3 meses. Después del recrecimiento de los tumores LAPC, los tumores se cultivaron y se pasaron en los machos castrados o en ratones hembra SLID.
Xenoinjertos LAPC-4 AD aumentaron de tamaño intratibialmente como sigue. El xenoinjerto LAPC-4 AD del tejido tumoral crecido subcutáneamente se partió en secciones de 1-2 mm^{3} mientras que el tejido se bañó en un medio de Iscoves 1X, el tejido troceado luego se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se resuspendió en 10 ml de medio helado de Iscoves 1X y se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos. El pellet entonces se resuspendió en Iscoves 1X con pronasa E 1% y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave seguido por incubación en hielo durante 2-4 minutos. El filtrado se centrifugó a 1,3K rmp durante 4 minutos, y la pronasa se eliminó del pellet aspirado resuspendiéndolo en 10 mL de Iscoves y por recentrifugación. Las aglomeraciones de células se colocaron entonces en placas con medio de PrEGM y crecieron durante la noche. Las células se recogieron, se filtraron, se lavaron con RPMI 2X, y se contaron. Aproximadamente 50.000 células se mezclaron con un volumen igual de Matrigel congelado con hielo, y se inyectaron quirúrgicamente en la metafase de la tibia proximal de ratones SCID mediante una aguja de medida 27. Después de 10-12 semanas, los tumores LAPC-4 que crecieron en la médula espinal se recuperaron.
Líneas celulares
Líneas celulares humanas (p.ej., HeLa) se obtuvieron del ATCC y se mantuvieron en DMEM con suero fetal de ternera 5%.
Aislamiento del RNA
El tejido tumoral y líneas celulares se homogenizaron en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el RNA total. Poly A RNA se purificó del RNA total usando kits Mini y Midi de Qiagen's Oligotex mRNA. El total y el mRNA se cuantificaron por análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizó por electroforesis en gel.
Oligonucleótidos
Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
100
Hibridación de la supresión sustractiva
La supresión de la hibridación sustractiva (SSH) se utilizó para identificar los cDNAs correspondientes a los genes que pueden ser expresados de forma diferencial en el cáncer de próstata. La reacción SSH utilizó cDNA procedente de xenoinjertos LAPC-4 AD que habían crecido en dos entornos diferentes, particularmente entorno de crecimiento subcutáneo ("LAPC-4 AD SQ") y entorno de crecimiento intratibial ("LAPC-4 AD IT"), en donde el xenoinjerto LAPC-4 AD IT fue utilizado como fuente del cDNA probador "tester", mientras que el xenoinjerto LAPC-4 AD SQ fue utilizado como fuente del cDNA "conductor".
Los cDNAs de doble cadena correspondientes a los cDNAs probador y conductor se sintetizaron a partir de 2 \mug de RNA poli(A)^{+} aislado a partir del xenoinjerto de tejido relevante, como se describe más arriba, utilizando el kit CLONTECH's PCR-Select cDNA Subtraction Kit y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. La síntesis de la primera y la segunda cadena fue llevada a cabo como se describe en el protocolo del manual del usuario del Kit (CLONTECH Nº de protocolo PT1117-1, Catálogo Nº. K1804-1). El cDNA resultante fue digerido con Dpn II durante 3h a 37ºC. El cDNA digerido fue extraído con fenol/cloroformo (1:1) y precipitado con etanol.
El cDNA conductor fue generado por combinación en una proporción de 1:1 de cDNA digerido con Dpn II procedente de la fuente relevante de xenoinjerto (ver más arriba) con una mezcla de cDNAs digeridos derivados de hiperplasia benigna de próstata humana (BPH), las líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo205, e hígado de ratón.
El cDNA portador fue generado por medio de la dilución de 1 \mul de cDNA digerido con Dpn II de la fuente relevante de xenoinjerto (ver más arriba) (400 ng) en 5 \mul de agua. El cDNA diluido (2 \mul, 160 ng) fue entonces ligado a 2 \mul de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC toda la noche, utilizando 400 u de DNA ligasa T4 (CLONTECH). La ligación fue terminada con 1 \mu1 de EDTA 0,2 M y calentamiento a 72ºC durante 5 min.
La primera hibridación se realizó por la adición de 1,5\mul (600 ng) de cDNA conductor a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 \mul (20 ng) de Adaptador 1- y Adaptador 2- ligados al cDNA probador. En un volumen final de 4 \mul, las muestras fueron recubiertas con aceite mineral, desnaturalizadas en un termociclador MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y entonces se les permitió hibridar durante 8 h. a 68ºC. Las dos hibridaciones fueron entonces mezcladas junto con 1 \mul adicional de cDNA conductor fresco desnaturalizado y se les permitió la hibridación durante toda la noche a 68ºC. La segunda hibridación fue entonces diluida en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, calentada a 70ºC durante 7 min. y almacenada a -20ºC.
Amplificación por PCR. Clonación y secuenciación de los Fragmentos Génicos Generados por SSH
Para la amplificación de los fragmentos génicos que resultan de las reacciones SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la primera reacción de PCR 1 \mul de la mezcla final de hibridación diluida fue añadida a 1 \mul de cebador de PCR 1 (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul de tampón de reacción 10x (CLONTECH) y 0,5 \mul de mezcla 50x de cDNA polimerasa Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 fue realizada utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 sec., entonces 27 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 min. Cinco reacciones de PCR primarias fueron realizadas por separado durante cada experimento. Los productos fueron reservados y diluidos 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, 1 \mul procedente de la reacción de PCR primaria que había sido reservada y diluida se añadió a la misma mezcla de reacción utilizada durante la PCR 1, a excepción de que los cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) fueron usados en lugar del cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizó utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Los productos de PCR fueron insertados en el pCR2.1 utilizando el kit del vector de clonación T/A(Invitrogen). Las E. coli transformadas fueron sometidas a selección azul/blanco por ampicilina. Las colonias de color blanco fueron recogidas y colocadas en placas de 96 pozos y se sometieron a crecimiento en medio de cultivo líquido durante toda la noche. Para la identificación de los insertos, la amplificación por PCR se realizó en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de la PCR1 y con NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR fueron analizados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Los clones bacterianos se almacenaron en glicerol al 20% bajo el formato de 96 pozos. El DNA del plásmido fue preparado, secuenciado, y sometido a búsquedas de homología con otros ácidos nucleicos en las bases de datos GenBank, dBest, y NCI-CGAP.
Resultados
El experimento de SSH que se ha descrito en Materiales y Métodos, más arriba, lleva al aislamiento de numerosos clones de fragmentos génicos candidatos (clones SSH). Todos los clones candidatos fueron secuenciados y sometidos al análisis de homología en comparación con otras secuencias en las principales bases de datos génicas y de EST con la finalidad de proporcionar información acerca de la identidad del correspondiente gen y ayudar a guiar la decisión de analizar un gen en particular durante la expresión diferencial. En general, los fragmentos génicos que no tenían homología con ninguna de las secuencias conocidas en cualquiera de las bases de datos consultadas, y por lo tanto consideradas como representantes de genes novedosos, así como los fragmentos que mostraron homología con secuencias expresadas previamente secuenciadas (ESTs), fueron sometidas a análisis de expresión diferencial por RT-PCR y/o análisis Northern.
Uno de los clones SSH fue idéntico a la secuencia correspondiente a una molécula secretada conocida como proteína específica de gránulo 28 (SGP28) (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380,246-250) o proteína de secreción rica en cisteína (CRISP-3) (Kratzschmar et al., 1996, Eur J Biochem 236(3):827-36). La secuencia de este clon (36P1G3) es como sigue:
1
Ejemplo 2 Aislamiento de cDNA de Longitud Completa que Codifica a SGP28
Un cDNA de longitud completa (clon 1; Tabla 1) de 774 pb fue aislado a partir de una librería de próstata, revelando un ORF de 258 aminoácidos (Tabla 2). La secuencia identificada aquí se diferencia de la secuencia de SGP28 publicada (Kjeldsen et al., 1996, FEBS Lett. 380(3):246-50) en dos ácidos nucleicos, uno en la secuencia codificante y uno en la región 5' UTR. Estas diferencias no alteran la secuencia de la proteína.
TABLA 1 cDNA de Longitud Total 36P1G3/SGP28 (ID DE SEC NO: 2)
2
3
TABLA 2 Marco de Lectura Abierto 36P1G3/SGP28 (ID DE SEC No: 3)
4
Ejemplo 3 Análisis de la Expresión Génica en SGP28
La expresión del mRNA SGP28 en tejidos humanos normales fue primeramente analizado por medio del northern blot de dos pruebas de tejido múltiple obtenidas de Clontech (Palo Alto, California), comprendiendo un total de 16 diferentes tejidos humanos normales, utilizando cDNA marcado 36P1G3 como sonda (con secuencia igual a la del Ejemplo 1). Las muestras de RNA fueron normalizadas de forma cuantitativa con una sonda \beta-actina. Los resultados se muestran en las Figs. 1A-B e indican que, en los 16 tejidos sometidos a prueba, el gen SGP28 se expresó de forma exclusiva en próstata, testículos y ovario. De forma interesante, la próstata y el ovario exhibieron un tránscrito de 2,4 kb, mientras que los testículos expresaron un mensaje de 1,6 kb (el mensaje de 1,6 kb podría representar otro miembro de la familia SGP28). La señal de bajo peso molecular en testículos normales se debe probablemente a la hibridación cruzada de la sonda (fragmento SSH) con el mensaje de CRISP2. Un tránscrito idéntico es visto para CRISP2 en este panel normal utilizando una sonda oligonucleotídica específica de gen de la publicación de Kratzschmar, J. et al., 1996, Eur. J. Biochem. 236:827-836.
Adicionalmente, con la finalidad de analizar la expresión de SGP28 en cáncer en tejidos cancerosos y líneas celulares humanas, los RNAs derivados de los xenoinjertos de cáncer de próstata humano LAPC-4 se analizaron por medio de northern blot utilizando la sonda 36P1G3. Todas las muestras de RNA se normalizaron de forma cuantitativa por medio de tinción con bromuro de etidio y posterior análisis con una sonda \beta-actina marcada. Los resultados del análisis se presentan en la Fig. 1 C, y muestra un nivel de expresión muy alto del tránscrito SGP28 de 2,4 kb en todos los xenoinjertos LAPC.
Para analizar la expresión de SGP28 en tejidos cancerosos de próstata, se realizó northern blot de los RNA derivados de las tres muestras de tumor de próstata emparejados con la correspondiente muestra normal de tejido de próstata. Los resultados mostraron que la expresión de mRNA SGP28 era detectable en 3 de las 3 muestras de tumor analizadas, con un nivel de expresión muy elevado en 2 de los 3 muestras (Fig. 2).
Ejemplo 4 Generación de Anticuerpos Policlonales contra SGP28
Para la generación de suero policlonal contra SGP28, se sintetizó un péptido correspondiente con los aminoácidos 93-107 (CNYRHSNPKDRMTSL; ID DE SEC NO: 27) de la proteína SGP28. La secuencia del péptido se emparejó con la de la hemocianina de la lapa de ojo de cerradura (KLH) y se usó para la inmunización de conejo de la manera que sigue. El conejo inicialmente fue inmunizado con 200 \mug del péptido-KLH mezclado en adyuvante incompleto de Freund. El conejo entonces fue inyectado cada dos semanas con 200 \mug del péptido-KLH mezclado en adyuvante incompleto de Freund. Las muestras de sangre se tomaban aproximadamente de 7-10 días después de cada inmunización. Se utilizaron análisis por medio de ELISA y western blot para determinar la especificidad y la concentración del suero de conejo contra el péptido inmunizante y la proteína SGP28 respectivamente. Los anticuerpos policlonales SGP28 purificados por afinidad se separaron y prepararon por medio del paso del suero crudo de conejo inmunizado a través de una matriz de afinidad formada por el péptido SGP28 (CNYRHSNPKDRMTSL; ID DE SEC NO: 27) unida de forma covalente con Affigel 10 (BioRad). Después de un lavado extensivo de la matriz con PBS, los anticuerpos específicos contra el péptido SGP28 fueron eluidos con tampón glicina de bajo pH (0,1 M, pH 2,5), de forma inmediata neutralizados, y dializados de forma extensiva por medio de PBS.
Para probar la reactividad con la proteína SGP28 del suero de conejo, el cDNA de longitud total de SGP28 se clonó en un vector de expresión que proporcionaba una marca de 6His en el extremo carboxiterminal (pCDNA 3.1 myc-his, In Vitrogen). Los constructos MYC/HIS SGP28 resultantes se transfectaron en células 293T. Los lisados celulares completos y los sobrenadantes de las células LAPC4 y de las células 293T transfectadas de forma transitoria con MYC/HIS SGP28 y los lisados de los xenoinjertos LAPC4 y LAPC9 se sometieron a western blot utilizando anti-SGP28 de afinidad purificado de conejo pAb (1 \mug/ml). Las bandas inmunoreactivas SGP28 se visualizaron por incubación de los blots con un anticuerpo secundario HRP-conjugado anti-conejo, seguido de detección por quimioluminiscencia potenciada. Los resultados se muestran en la Fig. 3, y demuestran que el anticuerpo anti-SGP28 policlonal identifica la proteína SGP28 en los lisados de los xenoinjertos LAPC4 y LAPC9 y en LAPC4 y los sobrenadantes de la línea celular 293T transfectada.
Ejemplo 5 Expresión de Proteína Recombinante SGP28 en Células de Mamífero Constructo pcDNA3.1/MycHis
Para la expresión de 36P1G3 en células de mamífero, el marco abierto de lectura de 774 pb (258 aminoácidos) 36P1G3 se clonó en pcDNA3.1/MycHis Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión proteica fue conducida a través del promotor del citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante presenta myc y seis histidinas fusionadas al extremo C-terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción con la finalidad de potenciar la estabilidad del mRNA conjuntamente con el origen de replicación episómica SV40 y simple rescate del vector en líneas celulares que expresen el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
Constructo pAPtag
La proteína 36P1G3/SGP28 sin la secuencia señal(aminoácidos 33 al 258)se clonó en un pAPtag5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Este constructo genera una fosfatasa alcalina de fusión en el extremo C-terminal de la proteína 36P1G3 mientras que fusiona la secuencia de la señal IgGK en el extremo N-terminal. La proteína 3GP1G3 recombinante resultante se optimizó para la secreción al medio por parte de las células transfectadas de mamífero y puede ser utilizada para la identificación de proteínas tales como ligandos o receptores que interaccionen con la proteína 36P1G3. La expresión proteica fue conducida por medio del promotor de CMV y la proteína recombinante también contenía myc y seis histidinas fusionadas en el extremo C-terminal de la fosfatasa alcalina. El gen de resistencia a ceosina permite la selección de las células de mamífero que expresen la proteína y el de gen resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
Constructo ptag5
La proteína 36P1G3 sin su secuencia señal (aminoácidos 33 al 258) se clonó también en pTag-5. Este vector es similar al pAPTag pero sin la fusión con fosfatasa alcalina.
Constructos pSRa
Para generar líneas de células de mamífero que expresen 36P1G3 de forma constitutiva, el marco abierto de lectura de 774 bp (258 aminoácidos) se clonó en constructos pSRa. Retrovirus amfotrópicos y ecotrópicos se generaron por medio de transfección de constructos pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o por medio de cotransfección de pSRa y un plásmido adyuvante (\varphi-) en células 293, respectivamente. Los retrovius se pueden usar para infectar una variedad de líneas celulares de mamífero, dando lugar a la integración del gen clonado, 36P1G3, en las líneas celulares huésped. La expresión de la proteína se llevó a cabo a partir de una repetición larga terminal (LTR). El gen de resistencia a neomicina permite la selección de las células de mamífero que expresen la proteína y el de gen resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Un constructo pSRa adicional se realizó de forma que se fusionara la marca FLAG al extremo C-terminal para permitir la detección utilizando anticuerpos anti-FLAG. La secuencia FLAG 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (ID DE SEC NO. 36) se añadió al cebador de clonación en el extremo 3' del marco de lectura abierto.
Constructos pSRa adicionales pueden ser elaborados para producir proteínas de fusión GFP y myc/6 HIS tanto N-terminales como C-terminales de la proteína de longitud total 36P1G3.
Ejemplo 6 Expresión de Proteína Recombinante SGP28 en Células de Insecto PMelBac A
La proteína 36P1G3 sin la secuencia señal (aminoácidos 33 al 258) fue también clonada en pMelBac (Cat no. V1950-20, In vitrogen, CA) para la expresión y secreción de la proteína en células Sf9 de insecto. El vector pMelBAC A es un vector de transferencia de baculovirus diseñado para dirigir la expresión de proteínas recombinantes a través de las vías de secreción al medio extracelular. La secuencia de señal para la melitina de la abeja de la miel, una proteína de elevada expresión y eficientemente secretada, se utilizó para dirigir la secreción de la proteína recombinante 3GP1G3. La expresión de la proteína fue conducida por el promotor de la polihedrina. Un constructo marcado myc-his en C-terminal fue también realizado en pMelBac A para permitir la detección y purificación de la proteína recombinante 36P1G3.
pIZT/V5His
La proteína 3GP1G3 fue clonada en pIZT/5His (Cat no. v801 0-01, Invitrogen, CA) para expresar la proteína en células de insecto Sf9. El vector de expresión permite la expresión tanto transitoria como estable de la proteína recombinante. La expresión de la proteína fue conducida por el promotor de OplE2 para niveles elevados de expresión constitutiva. El gen de resistencia a zeocina se encuentra bajo el control del promotor OplE1.
Ejemplo 7 Producción de Anticuerpos Monoclonales contra SGP28
Para generar mAbs contra SGP28, se utilizó proteína recombinante SGP28 marcada con HIS purificada a partir de los sobrenadantes del cultivo de tejido 293T para inmunizar 5 ratones Balb C hembra. La inmunización inicial se llevó a cabo con 50 \mug de proteína SGP28 purificada mezclada con adyuvante de Freund completo. Los estímulos fueron administrados en intervalos de 2 semanas con 50 \mug de proteína SGP28 mezclada en adyuvante de Freund incompleto. Se determinó la reactividad y la especificidad de los tests que se hacían sobre las muestras de sangre recogidas cada 7-10 días después de cada inmunización por medio de ELISA y western blot. La titulación específica del inmunógeno de las muestras de sangre sometidas a prueba fue al menos de 2X10^{6}. Tres ratones posteriormente fueron sacrificados y sus bazos se utilizaron para llevar a cabo la generación de fusiones e hibridomas utilizando procedimientos estándar (Harlow y Lane, 1988). Once pocillos positivos entonces fueron sometidos a subclonación para generar hibridomas monoclonales SGP28-específicos. Uno de los hibridomas que había completado la subclonación, denominado 4G6 (isotipo IgG1), reconoce de forma específica la proteína SGP28 presente en lisados celulares y en los sobrenadantes de cáncer de próstata y reacciona de forma marcada con la proteína SGP28 en tejido clínico de cáncer de próstata, pero no en tejido normal adyacente procedente del mismo paciente (Fig.
4).
La Figura 4 muestra que el anticuerpo monoclonal anti-SGP28 detecta de forma específica la proteína SGP28 en sobrenadantes y líneas celulares de cáncer de próstata, xenoinjertos de cáncer de próstata, y tejido clínico de cáncer de próstata. Los lisados celulares y medios condicionados para la línea celular LAPC4 de cáncer de próstata y los lisados procedentes de xinoinjertos LAPC4 y LAPC9 de cáncer de próstata y del procedente de tejido normal asociado y canceroso de un espécimen clínico de próstata se separaron por medio de SDS-PAGE y transferidos a nitrocelulosa. El blot entonces fue sometido a análisis western con una dilución 1:2 de sobrenadante de anticuerpo monoclonal 4G6 anti-SGP28. las bandas inmunoreactivas SGP28 específicas fueron entonces visualizadas por incubación con un conjugado IgG-HRP anti-ratón anticuerpo secundario y por desarrollo de quimioluminiscencia potenciada y exposición a película autorradiográfica. Se indica con flechas el doblete de proteína SGP28 inmunorreactiva.
Ejemplo 9 Análisis por Western de la Expresión Proteica de SGP28
Lisados de tejidos clínicos emparejados cancerosos y normales adyacentes de cáncer de próstata, así como lisados de una línea celular LAPC4 y de xinoinjerto LAPC-4 se sometieron a western blot con 1 \mug/ml de antisuero anti-SGP28 policlonal purificado por afinidad a partir de conejo. Las bandas inmunoreactivas SGP28 fueron visualizadas por incubación de los blots con un anticuerpo anti-conejo HRP-conjugado secundario seguida de detección por potenciación de quimioluminiscencia. Los resultados (Figs. 5A-B) muestran el elevado nivel de expresión de SGP28 en muestra de cáncer de próstata aunque no en tejido adyacente normal y un nivel de expresión elevado en los xinoinjertos LAPC. Niveles bajos de expresión se detectaron en testículos normales y pulmón.
Ejemplo 10 Detección Inmunohistoquímica de SGP28 en Cáncer de Próstata, PIN y Metástasis de Cáncer de Próstata
Un espécimen de cáncer de próstata con puntuación de Gleason 7 así como en un espécimen con un elevado grado PIN fueron sometidos a análisis inmunohistoquímico de la expresión SGP28 tal como sigue. Secciones de tejido de se prepararon a partir de la muestra, se fijaron en formalina al 10%, embebidos en parafina, y seccionados de acuerdo con el protocolo estándar. Las secciones fueron teñidas con anticuerpo policlonal anti-SGP28 (como se ha descrito más arriba). Los resultados se muestran en Figs. 6A-B. Una fuerte tinción se observó en las células epiteliales de la glándula próstata, especialmente en los bordes luminales. La tinción también fue observada en el lumen, indicando un elevado nivel de expresión y secreción de SGP28 en cáncer de próstata y PIN.
De forma similar, el anti-SGP28 policlonal se utilizó para valorar la capacidad para detectar la expresión de SGP28 en metástasis de cáncer de próstata. Figs. 7A-B muestran los resultados del análisis inmunohistoquímico demostrando la expresión de la proteína SGP28 en metástasis de cáncer de próstata hacia hueso (Fig. 7A) y nódulo linfático (Fig. 7B).
La elevada expresión de SGP28 en cáncer de próstata y PIN fue adicionalmente demostrada por medio de inmunohistoquímica, y los resultados se muestran en las Figs. 8A-D. La Fig. 8A muestra la detección inmunohistoquímica de SGP28 en cáncer de próstata con una ampliación de 200X; la Fig. 8B muestra lo mismo a 800X. La expresión de SGP28 en PIN se muestra en la Fig. 8C a 200X, y en la Fig. 8D a 800X. Un resumen de los resultados del análisis por inmunohistoquímica se muestra en la Tabla 3 para el cáncer de próstata y PIN, y en la Tabla 4 para un rango de tejidos más amplio. La ausencia expresión inmunohistoquímicamente detectable en el rango de tejidos más amplio examinado, incluyendo próstata normal, en combinación con una fuerte tinción en cáncer de próstata y PIN, indica que SGP28 es una diana particularmente adecuada para diagnósticos basados en anticuerpo, incluyendo la evaluación de especímenes de biopsia y generación de imágenes in vivo.
TABLA 3
5 
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TABLA 4
6
7
Ejemplo 11 Identificación de las Vías Potenciales de Transducción de Señal
Para determinar si SGP28 activa las vías de transducción de señales conocidas en células ya sea de forma directa como de forma indirecta, se realizaron ensayos de marcadores transcripcionales basados en luciferasa (luc) en células que expresan SGP28. Estos marcadores transcripcionales contienen sitios de unión consenso para factores de trascripción conocidos que se encuentran posteriormente a vías de transducción de señales bien caracterizadas. Los marcadores y ejemplos de los factores de trascripción asociados, vías de transducción de señales, y activación de estímulos se encuentran listados más abajo.
1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-kinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés
2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación
3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés
4. ARE-luc, receptor de andrógenos; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
5. p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés.
Los efectos mediados por SGP28 pueden ser ensayados en células que muestren expresión de mRNA. Los plásmidos marcadores luciferasa pueden ser introducidos por medio de transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad luciferasa, un indicador de actividad transcripcional relativa, se midió por medio de la incubación de extractos celulares con sustrato luciferín y la luminiscencia de la reacción se monitorizó en un luminómetro.
Ejemplo 12 Ensayos In Vitro de la Función SGP28
El perfil de expresión de SGP28 en cáncer de próstata sugiere un papel funcional en la iniciación del tumor, progresión y/o mantenimiento. La función de SGP28 puede ser valorada en células de mamífero utilizando aproximaciones in vitro. Para la expresión en mamífero, SGP28 puede ser clonado en un número de vectores adecuados, incluyendo pcDNA 3.1 myc-His-etiqueta y el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estos vectores de expresión, SGP28 puede ser expresada en varias líneas celulares cancerosas, incluyendo por ejemplo PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de SGP28 se puede monitorizar utilizando anticuerpos anti-SGP28.
Las líneas celulares de mamífero que expresen SGP28 pueden ser sometidas a pruebas en varios ensayos in vitro e in vivo, incluyendo la proliferación celular en cultivo de tejidos, activación de señales de apoptosis, formación de tumores primarios y metastáticos en ratones SCID, e invasión in vitro utilizando un sistema de cultivo de invasión de membrana (MICS) (Welch et al. Int. J. Cancer 43: 449-457). El fenotipo celular SGP28 se compara con el fenotipo de células que carecen de expresión de SGP28. Además, las células tratadas con o sin proteína SGP28 añadida de forma exógena pueden ser analizadas para parámetros de crecimiento alterados.
Líneas celulares que expresen SGP28 pueden también ser sometidas a ensayos para la alteración de sus propiedades invasivas y migratorias por medio de la medida del paso de las células a través de una cámara matrigel cubierta por membrana porosa (Becton Dickinson). El paso de las células a través de la membrana del lado opuesto se monitoriza utilizando un ensayo de fluorescencia (Boletín Técnico Becton Dickinson #428) utilizando células cargadas con indicador calceina-Am (Sondas Moleculares). Las líneas celulares analizadas incluyen células parentales y células PC3, 3T3 y LNCaP que sobreexpresen SGP28. Para comprobar si SGP28 presenta propiedades quimiotácticas, células parentales indicadoras son monitorizadas mediante paso a través de membrana porosa hacia un medio condicionado con gradiente de SGP28 en comparación con un medio control. Este ensayo puede también ser utilizado para calificar y cuantificar la neutralización específica del efecto inducido por SGP28 para composiciones terapéuticas candidatas contra el cáncer.
Con la finalidad de establecer si SGP28 se une a las proteínas celulares expresadas en células de cáncer de próstata y otros tipos de células cancerosas o normales, dos tipos de aproximación pueden ser tomadas. En la primera aproximación se usó un ensayo de unión in vitro para SGP28 recombinante HIS-etiquetada en varias líneas celulares. En otra aproximación, una proteína de fusión fosfatasa alcalina-SGP28 recombinante fue generada utilizando el sistema AP-TAG de GenHunter Corporación (Nashville, TN, cat#Q202), y la fusión AP-TAG utilizada para probar la unión de SGP28 a una variedad de células de cáncer de próstata como se ha descrito (Cheng y Flanagan, 1994, Cell 79:157-168). Después de lavar las células y añadiendo el sustrato AP BCIP, que forma un precipitado insoluble de color azul en la defosforilación, la unión de SGP28 es determinada por identificación de células que se tiñan de color azul bajo la luz del microscopio. Varias líneas celulares de cáncer pueden ser examinadas, incluyendo sin limitación, varias líneas celulares de cáncer de próstata (p.ej., LNCaP, PC-3, DU 145, TSUPR, LAPC4). Otras líneas celulares como la línea celular de próstata PREC, 293T, células PIN, y NIH 3T3, etc. pueden también ser examinadas. Adicionalmente, los xinoinjertos LAPC y otros xinoinjertos de cáncer de próstata pueden ser sometidos a prueba. La tasa de disociación de equilibrio puede ser calculada para evaluar la fuerza de la interacción de unión. Además, puede ser determinado el número de receptores de superficie celular por célula. Las líneas celulares o tejidos con la más elevada capacidad de unión a SGP28 serían preferibles para la clonación del receptor de SGP28 o otras parejas de
unión.
En otro ensayo funcional, células NIH-3T3 que expresen SGP28 de forma estable pueden ser analizadas para su capacidad de formar colonias en agar blando. En estos experimentos, las células utilizadas en tales procedimientos (p.ej. células NIH-3T3), pueden ser transfectadas para expresar de forma estable SGP28 o neo o Ras activado (como el gen test, el control negativo y el control positivo, respectivamente) con la finalidad de valorar las capacidades transformantes de SGP28. Los experimentos son realizados típicamente por duplicado y los ensayos son evaluados aproximadamente 4 semanas después del cultivo de la célula. Donde las observaciones experimentales demuestran que SGP28 induce un incremento en la formación de colonias en comparación con un control negativo (p.ej. neo) tales resultados indican que SGP28 presenta capacidades transformantes significativas.
Ejemplo 13 Ensayo In Vivo para la Promoción de Crecimiento de Tumor de SGP28
El efecto de la proteína SGP28 en el crecimiento de células tumorales puede ser evaluado in vivo por medio de sobre expresión génica en ratones portadores de tumor. Por ejemplo, los ratones SLID pueden ser inyectados con SQ en cada costado con 1 x 10^{6} de una línea celular de próstata que contenga el vector vacío tkNeo o SGP28. Como mínimo dos estrategias pueden ser utilizadas: (1) expresión constitutiva de SGP28 bajo la regulación de un promotor LTR, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible, tal como ecdisona, tet, etc. El volumen del tumor es entonces monitorizado en la aparición de tumores palpables y seguido a lo largo del tiempo para determinar si las células que expresen SGP28 crecen a una tasa más rápida. Adicionalmente, los ratones pueden ser implantados ortotípicamente con 1 x 10^{5} de las mismas células para determinar si SGP28 tiene un efecto en el crecimiento local del tejido diana (p.ej., próstata) o en la capacidad de las células de generar metástasis, específicamente en los pulmones, nódulos linfáticos, hígado, medula ósea, etc. El efecto de SGP28 en la formación de tumores óseos y en su crecimiento podría ser valorado por inyección de células de tumor de próstata intratibialmente, como se describe en el Ejemplo 1.
Estos ensayos son también útiles para la determinación del efecto inhibitorio de SGP28 de composiciones terapéuticas candidatas, tales como por ejemplo, anticuerpos SGP28, moléculas antisentido SGP28 y ribozimas.
Ejemplo 14 Ensayos Funcionales para la Unión de SGP28 a Células
Varias proteínas secretadas han sido descritas en el cáncer de próstata, en un número de las cuales se ha demostrado su participación en el proceso de la formación y progresión de los tumores (Inoue K., 2000, Clin. Cancer Res. 6:2104-19, Dow JK, de Vere White RW, 2000, Urology 55:800-6). Dado que SGP28 es una proteína secretada, una de sus funciones potenciales es la de regular el microambiente del cáncer de próstata y de la enfermedad metastática. Con la finalidad de someter a prueba esa posibilidad, SGP28 puede ser expresada y purificada como proteína recombinante, como GST-SGP28 o SGP28-Myc/His. Los recombinantes-SGP28 purificados (ya sean GST-SGP28 o SGP28-Myc/His) son entonces incubados en una variedad de tipos celulares que recapitulan el ambiente de la próstata, incluyendo las células epiteliales de próstata, líneas celulares de tumor de próstata, células del estroma de la próstata, células endoteliales de la próstata y células neuroendocrinas de la próstata. Además, el recombinante-SGP28 es también incubado en células que se encuentran en los lugares metastáticos, como la médula ósea y células del sistema inmune. La unión de SGP28 a células intactas se detecta por análisis FACS y por ensayo calorimétrico. Este análisis es valioso dado que se identifica con una población celular que une y puede responder a SGP28. Además, la identificación de una población celular diana proporciona una manera de aislar e identificar los receptores de SGP28, así proporcionando maneras adicionales de modular eventos mediados por SGP28.
Ejemplo 15 Ensayos para la actividad similar de SGP28 de la Defensina
SGP28 tiene una fuerte homología con las proteínas defensinas, en particular con las beta-defensinas. Las Beta-defensinas son productos de secreción principalmente producidos por células epiteliales (O'Neil DA et al, 1999, J. Immunol. 163:6718-24; Schroder JM, Harder J., 1999, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:645-51). Las defensinas juegan un papel importante en la prevención de infecciones y protección de la inmunidad de los tejidos epiteliales. Además, la defensina humana HNP1 se ha mostrado para inducir la muerte de células tumorales in vitro. Investigando el papel de la SGP28 en la muerte celular, SGP28 recombinante purificada se incuba con una variedad de tipos celulares listados anteriormente y analizados para la actividad apoptótica usando análisis FACS de células teñidas con Annexina V. SGP28 también pueden funcionar como un quimioatrayente, como se ha mostrado para otras moléculas defensina (Yang D et al., 2000, Leukoc. Biol. 68:9-14; Yang D et al., 1999, Science 286(5439):525-8.). Usando un ensayo quimiotáctico, se puede evaluar el efecto de SGP28 en la migración de varios tipos celulares, incluyendo células epiteliales, adherentes, endoteliales así como monocitos, linfocitos y células dendríticas.
Ejemplo 16 Unión prevista de los péptidos SGP28 a HLA-A2
Para identificar péptidos SGP28 previstos para unirse a la molécula humana MHC de clase I HLA-A2, la secuencia completa de aminoácidos de la proteína SGP28 entró en el algoritmo HLA Peptide Motif Search encontrado en el Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) Sitio Web (http://bimas.dcrt.nih.gov/). Los resultados de péptidos de unión de la SGP28 previstos se muestran en la Tabla 5. Los primeros 10 candidatos de la clasificación se muestran a lo largo de su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y una puntuación estimada de unión. La puntuación de unión corresponde al tiempo medio estimado de disociación de complejos que contienen el péptido a 37ºC a pH 6,5. Los péptidos con la mayor puntuación de unión (i.e., 999,9 para el péptido 2 de la SGP28) se predice que sean la unión más fuerte a HLA de Clase I en la superficie celular y así representar las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de las células T. La unión actual de los péptidos a HLA-A2 puede ser evaluada por estabilización de la expresión de HLA-A2 sobre el antígeno de la línea celular T2 defectiva (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede ser evaluada in vitro por estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de células dendríticas (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38).
TABLA 5 Péptidos SGP28 con puntuaciones más altas de unión predichas
8
<110> UroGenesys, Inc.
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<120> DIAGNÓSTICO Y TERAPIA DEL CÁNCER USANDO MOLÉCULAS RELACIONADAS CON SGP28
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<130> 129.23WOU1
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<150> 60/162;610
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<151> 1999-10-28
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<160> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
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<210> 1
<211 > 256
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<212> DNA
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 1
9 
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<210> 2
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<211> 2144
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<212> DNA
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<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
10
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttgccttt cctagctcca ctct 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccctttcca tactccactc tttg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Gly His Tyr Thr Gln Val Val Trp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Val Cys Gln Tyr Cys Pro Ala Gly Asn Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Cys Ser Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Trp Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Cyr Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Cys Gly Glu Asn Leu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Leu Pro Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Cys Cly Asn Ala Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
<211 > 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Trp Ala Asn Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ala Pro Cys Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Cys Thr Asn Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Phe Pro Val Leu Leu Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Leu Phe Leu Val Ala Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Leu Thr Thr Gln Thr Gln Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
<211 > 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Trp Tyr Ser Ser Tyr Leu Val}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Thr Cys Lys His Gln Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Trp Ala Asn Arg Leu Tyr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Phe Leu Val Ala Gly Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
<211 > 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Val Trp Tyr Ser Ser Tyr Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Val Gly His Tyr Thr Gln Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Tyr Ser Asn Cys Lys Ser Ley}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
<211 > 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asn Tyr Arg His Ser Asn Pro Lys Asp Arg Met Thr Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgatcaa gctt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccggc ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcccgtcct ag 
\hfill
12 
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<210> 31
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<211> 40
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 31
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gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag 
\hfill
40 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> DNA
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
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cggctcctag 
\hfill
10 
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<210> 33
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<211> 22
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctaatacgac tcactatagg gc 
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22 
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagcggcc gcccgggcag ga 
\hfill
22 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
\newpage
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<400> 35
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agcgtggtcg cggccgagga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 36
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia FLAG
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<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gattacaagg atgacgacga taag 
\hfill
24

Claims (36)

1. Un método para la detección de la presencia de una proteína SGP28 de expresión en cáncer que comprenda la determinación del nivel de proteína SGP28 expresado por las células en una muestra de prueba de tejido procedente de un individuo y comparando el nivel determinado de SGP28 con el correspondiente a una muestra normal, la presencia de niveles elevados de proteína SGP28 en la muestra de prueba respecto a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de este cáncer en el individuo.
2. El método de la reivindicación 1, donde la determinación del nivel de proteína SGP28 expresada por las células implique el contacto de las células con un anticuerpo que se una de forma específica a la proteína SGP28.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprenda un anticuerpo policlonal.
4. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprenda un anticuerpo monoclonal.
5. Un método de monitorización de los productos génicos SGP28 que comprenda la determinación del estado de los productos génicos SGP28 expresados por las células en una muestra prueba de tejido procedente de un individuo y comparando este estado determinado de los productos génicos SGP28 con el estado de los productos génicos SGP28 correspondiente a una muestra normal, la presencia de un estado alterado de los productos génicos SGP28 en la muestra de prueba respecto al de la muestra normal proporciona una indicación de crecimiento celular no regulado en el individuo.
6. Un método para el examen de una muestra biológica para evidenciar el crecimiento celular no regulado que comprenda la comparación del estado de SGP28 en la muestra biológica al estado de SGP28 en una muestra normal correspondiente, en donde las alteraciones en el estado de SGP28 en la muestra biológica se asocia con el crecimiento celular no regulado.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el estado de SGP28 en la muestra biológica sea evaluado por medio del examen de los niveles de expresión del mRNA de SGP28 o los niveles de expresión de la proteína SGP28.
8. El método de la reivindicación 6, en donde una alteración en el estado de SGP28 sea identificado por la presencia de células que expresen SGP28 en una muestra biológica procedentes de un tejido en el que las células que expresan SGP28 están normalmente ausentes.
9. Un método de diagnóstico de la presencia de cáncer en un individuo que comprenda:
(a) la determinación del nivel de mRNA SGP28 expresado en una muestra prueba obtenida de un individuo; y
(b) comparación del nivel determinado de esta manera con el nivel del mRNA de SGP28 expresado en una muestra de tejido conocida y comparable,
la presencia de una elevada expresión del mRNA de SGP28 en la muestra prueba respecto a la de la muestra de tejido normal proporciona un indicio de la presencia de cáncer.
10. Un método de diagnóstico de la presencia de cáncer en un individuo que comprenda:
(a) la determinación del nivel de proteína SGP28 expresado en una muestra prueba obtenida a partir de un individuo; y
(b) comparación del nivel determinado de esta manera con el nivel de proteína SGP28 expresado en una muestra normal de tejido conocida y comparable,
la presencia de niveles elevados de proteína SGP28 en la muestra prueba respecto a los de la muestra de tejido normal proporciona un indicio de la presencia de cáncer.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el cáncer es un cáncer de próstata o colon, y las muestras de tejido de prueba y normal son seleccionadas del grupo consistente en tejido prostático, tejido de colon, tejido linfático, suero, sangre o semen.
12. El método de la reivindicación 10, en donde la determinación del nivel de proteína SGP28 expresado en la muestra prueba comprenda contactar la muestra con un anticuerpo que se una específicamente a la proteína
SGP28.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal.
14. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
15. El uso de un vector que codifique un anticuerpo monoclonal de cadena simple que comprenda los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se una de forma específica a la proteína SGP28, en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
16. Una composición farmacéutica que comprenda un polinucleótido que codifique un polipéptido SGP28, en donde el polinucleótido es seleccionado a partir del grupo formado por:
(a) un polinucleótido que presente la secuencia ID DE SEC No: 2, en donde T puede ser también U;
(b) un polinucleótido que presente la secuencia ID DE SEC NO: 2, desde el residuo nucleotídico número 3 hasta el residuo nucleotídico número 776, en donde T puede ser también U;
(c) un polinucleótido que codifique una proteína SGP28 que presente una secuencia de aminoácidos ID DE SEC NO: 3;
(d) un polinucleótido que sea un fragmento del polinucleótido de (a), (b) o (c) que sea al menos de 20 bases nucleotídicas de largo;
(e) un polinucleótido que sea totalmente complementario al polinucleótido de cualquiera de los puntos del (a) al (d); o
(f) un polinucleótido que se hibride de forma selectiva bajo condiciones astringentes al polinucleótido de cualquiera de los puntos del (a) al (d).
17. una composición farmacéutica que comprenda un polinucleótido que codifique un polipéptido que sea como mínimo un 90% idéntico con la secuencia de aminoácidos ID DE SEQ NO: 3 a lo largo de toda su longitud.
18. Una composición farmacéutica que comprenda un polinucleótido que codifique un polipéptido SGP28, en donde el polipéptido incluya una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente en ID DE SEC NO: 8; ID DE SEC NO: 9; ID DE SEC NO: 10; ID DE SEC NO: 11; ID DE SEC NO: 12; ID DE SEC NO: 13; ID DE SEC NO: 14; ID DE SEC NO: 15; ID DE SEC NO: 16; aminoácidos 2-10 de ID DE SEC NO: 17, aminoácidos 6-14 de ID DE SEC NO: 18, aminoácidos 30-38 de ID DE SEC NO: 19, aminoácidos 142-150 de ID DE SEC NO: 20, aminoácidos 222-230 de ID DE SEC NO: 21, aminoácidos 175-183 de ID DE SEC NO: 22, aminoácidos 7-15 de ID DE SEC NO: 23, aminoácidos 141-149 de ID DE SEC NO: 24, aminoácidos 134-142 de ID DE SEC NO: 25, y aminoácidos 211-219 de ID DE SEC NO: 26.
19. Una composición farmacéutica de la reivindicación 16, en donde el polinucleótido esté marcado con un marcador detectable.
20. Una composición farmacéutica que comprenda un polipéptido SGP28 codificado por el polinucleótido de la reivindicación 16.
21. Una composición farmacéutica que comprenda un polipéptido que tenga como mínimo 15 aminoácidos contiguos del polipéptido de la reivindicación 20.
22. Una composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo o fragmento del mismo que se una de forma específica al polipéptido SGP28 de la reivindicación 20.
23. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo sea monoclonal.
24. Una composición farmacéutica que comprenda una proteína recombinante que presente la región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23.
25. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo esté marcado con un marcador detectable.
26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en donde el marcador detectable se seleccione del grupo consistente en un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminescente, compuesto quimioluminescente, quelante metálico o enzima.
27. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde el fragmento de anticuerpo comprenda un Fab, F(ab')2, Fv o fragmento sFv.
28. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprenda un anticuerpo humano.
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29. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo esté conjugado con una toxina o un agente terapéutico.
30. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el anticuerpo comprenda residuos de la región de unión al antígeno de ratón y residuos de un anticuerpo humano.
31. Una composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla que presente dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23.
32. Una composición para vacuna para el tratamiento de aquellos cánceres que expresen SGP28 que comprenda una porción inmunogénica de la proteína SGP28 y un portador fisiológicamente aceptable.
33. La composición para vacuna de la reivindicación 32, en donde la porción inmunogénica de la proteína SGP28 sea seleccionada del grupo consistente en los aminoácidos 2-10 de ID DE SEC NO: 17, aminoácidos 6-14 de ID DE SEC NO: 18, aminoácidos 30-38 de ID DE SEC NO: 19, aminoácidos 142-150 de ID DE SEC NO: 20, aminoácidos 222-230 de ID DE SEC NO: 21, aminoácidos 175-183 de ID DE SEC NO: 22, aminoácidos 7-15 de ID DE SEC NO: 23, aminoácidos 141-149 de ID DE SEC NO: 24, aminoácidos 134-142 de ID DE SEC NO: 25, y aminoácidos 211-219 de ID DE SEC NO: 26.
34. Una composición para vacuna para el tratamiento de un cáncer que exprese SGP28 que comprenda un polinucleótido que codifique una porción inmunogénica de la proteína SGP28 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
35. La composición para vacuna de la reivindicación 34, en donde la porción inmunogénica de la proteína SGP28 sea seleccionada del grupo consistente en aminoácidos 2-10 de ID DE SEC NO: 17, aminoácidos 6-14 de ID DE SEC NO: 18, aminoácidos 30-38 de ID DE SEC NO: 19, aminoácidos 142-150 de ID DE SEC NO: 20, aminoácidos 222-230 ID DE SEC NO: 21, aminoácidos 175-183 de ID DE SEC NO: 22, aminoácidos 7-15 de ID DE SEC NO: 23, aminoácidos 141-149 de ID DE SEC NO: 24, aminoácidos 134-142 de ID DE SEC NO: 25, y aminoácidos 211-219 de ID DE SEC NO: 26.
36. Una composición para vacuna para el tratamiento de un cáncer que exprese SGP28 que comprenda un polinucleótido que codifique un anticuerpo monoclonal de cadena simple que comprenda los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se una de forma específica a la proteína SGP28.
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