ES2240406T3 - Celula progenitora dental y procedimiento para su obtencion. - Google Patents

Abstract

Uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

Description

Célula progenitora dental y procedimiento para su obtención.

Campo de la invención

La invención se relaciona con la producción de una célula progenitora dental. Concretamente, la invención se relaciona con el uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

Antecedentes de la invención

Los dientes son órganos esenciales para la supervivencia de los animales y tienen una importancia clínica y/o cosmética obvia. Existen muchos casos en los que es deseable el reemplazo dental y los tratamientos actuales se restringen a las prótesis o implantes artificiales.

Se pueden cultivar explantes de primordios dentales in vitro, que permiten una variedad de estudios de manipulación, incluyendo la introducción de genes y/o proteínas y las recombinaciones de tejidos. Se pueden transferir los primordios manipulados a cápsulas renales de animales adultos (tales como ratones) para producir condiciones para el desarrollo de dientes adultos. Sin embargo, estas técnicas de cultivo requieren el frecuente sacrificio de los animales. Éste es uno de los problemas asociados a la técnica anterior.

Las aproximaciones de la técnica anterior a la producción de primordios dentales se basaban en la recombinación de tejidos in vitro. Se disecaron independientemente dos tipos de tejidos diferentes del embrión animal y se recombinaron éstos en el laboratorio. Las señales de uno pueden inducir entonces la formación de primordios dentales en el otro. Éste es un procedimiento laborioso llevado a cabo por trabajadores altamente entrenados que implica una gran cantidad de talento quirúrgico.

Según la técnica anterior, los requerimientos tisulares para la progresión del desarrollo de los dientes cambian pronto en el desarrollo. Para la iniciación, se cree que el epitelio oral es esencial y puede formar dientes cuando se recombina con cualquier célula mesenquimatosa, siempre que derive de la cresta neural. Así, según la técnica anterior, las células derivadas de la cresta neural son esenciales para la formación de células progenitoras de los
dientes.

La presente invención busca solucionar al menos algunos de los problemas asociados a la técnica anterior.

Resumen de la invención

Como se ha explicado anteriormente, la producción de primordios dentales ha sido sólo conseguida con anterioridad usando técnicas de recombinación de tejidos. Se muestra aquí sorprendentemente que se puede conseguir la producción de células progenitoras dentales usando células madre cultivadas en el laboratorio, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas. En particular, se pueden producir células progenitoras dentales usando células madre embrionarias (células ME) no humanas cultivadas en el laboratorio.

En consecuencia, la presente invención proporciona el uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana. Preferiblemente, la célula madre cultivada es una célula ME no humana.

La producción de células progenitoras dentales a partir de células madre cultivadas puede ser ventajosamente conseguida induciendo dichas células ME no humanas con epitelio oral.

Una célula progenitora dental es una que expresa determinados marcadores moleculares característicos de las células progenitoras dentales. Por ejemplo, se consideraría que una célula es una célula progenitora dental si expresara uno o más marcadores de células mesenquimatosas dentales. Como ejemplos de dichos marcadores, se incluyen Barx1, Dix2, Dix5, Msx1, Pax9, Activina \betaA, Lhx6, Lhx7 y otros. Estos marcadores pueden ser detectados por cualquier medio adecuado, tal como Western blot-ting, inmunofluorescencia, hibridación radiactiva in situ u otros medios adecuados, que se describen con más detalle a continuación.

El epitelio oral puede proceder de cualquier fuente adecuada, tal como de un ratón. La preparación de epitelio oral es discutida con mayor detalle a continuación.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto, la invención se relaciona con el uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

Según un segundo aspecto, la invención se relaciona con el uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, donde dicha célula madre cultivada puede ser una célula madre neural (CMN) o una célula madre embrionaria (célula ME) no humana. Preferiblemente, dicha célula madre cultivada es una célula madre embrionaria (célula ME) no humana.

Según un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de una célula progenitora a partir de una célula madre cultivada, cuyo método consiste en: disponer de una célula madre cultivada, poner en contacto la célula madre cultivada con una o más células epiteliales orales e incubar durante un tiempo suficiente para producir dicha célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

Según un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de una célula progenitora dental a partir de una célula madre cultivada, donde la célula madre cultivada es una célula ME no humana, cuyo método consiste en: disponer de una célula ME no humana cultivada, poner en contacto la célula ME no humana cultivada con una o más células epiteliales orales e incubar durante un tiempo suficiente para producir dicha célula progenitora dental.

Según un quinto aspecto, la invención se relaciona con una célula progenitora dental producida a partir de una célula madre cultivada, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

Según un sexto aspecto, la invención se relaciona con una célula progenitora dental producida a partir de una célula madre cultivada, donde dicha célula madre cultivada es una célula ME no humana.

Por facilidad de referencia, estos y otros aspectos de la presente invención son discutidos ahora bajo los encabezamientos de sección apropiados. Sin embargo, las enseñanzas que se dan bajo cada sección no se limitan necesariamente a cada sección particular.

Características preferibles

Preferiblemente, la célula madre cultivada es una célula ME no humana.

La incubación de las células ME no humanas cultivadas con la(s) célula(s) epitelial(es) es realizada durante un tiempo suficiente para producir la célula progenitora dental. Preferiblemente, este tiempo es de aproximadamente

\hbox{72 h.}

Preferiblemente, los marcadores de las células progenitoras dentales son como se describe aquí. Preferiblemente, dichos marcadores son determinados por hibridación in situ.

Ventajas

La presente invención tiene una serie de ventajas. Estas ventajas resultarán evidentes en la siguiente descripción.

A modo de ejemplo, la presente invención es ventajosa, ya que requiere un sacrificio de animales mínimo.

Además, la presente invención es ventajosa, ya que ahorra trabajo.

Además, la presente invención es ventajosa, ya que no implica una recombinación quirúrgica múltiple de tejidos.

Desarrollo dental

El desarrollo del diente de los mamíferos ha sido reconocido como un sistema modelo para el estudio de las interacciones epiteliales/mesenquimatosas durante la organogénesis. Los dientes comienzan a desarrollarse pronto en la embriogénesis de mamíferos (11 días en ratones, 6 semanas en humanos) gracias a una serie de interacciones recíprocas entre dos tipos celulares, las células del epitelio oral y las del mesénquima derivado de la cresta neural.

Las señales inductoras para el desarrollo de los dientes proceden del epitelio, sobre el que se programan las células mesenquimatosas que responden para volverse odontogénicas (2). Las células mesenquimatosas odontogénicas proporcionan entonces señales instructivas para un mayor desarrollo de los dientes (3). Las células epiteliales dan lugar eventualmente a ameloblastos, que son responsables de la formación del esmalte, y a células mesenquimatosas, que forman odontoblastos, que producen dentina.

La identidad de estas diferentes señales instructivas ha sido revelada por estudios de expresión génica y experimentos de implantación. FGF8, BMP4 y SHH se establecen como señales instructivas tempranas del epitelio oral (3). Los BMP, los FGF y la activina están entre las señales tempranas del mesénquima (3,4).

Las moléculas clave implicadas en la señalización de la organogénesis dental incluyen la Activina \betaA, que se expresa en el presunto mesénquima germinal dental y es una molécula señalizadora en el desarrollo de los dientes. Las proteínas activinas se producen a partir de dos productos génicos, la Activina \betaA y la Activina \betaB, que se dimerizan para formar activina A (\betaA:\betaA), activina B (\betaB:\betaB) y activina AB (\betaA:\betaB). Las inhibinas estrechamente relacionadas, inhibina A e inhibina B, son dímeros consistentes en una subunidad de activina \betaA o \betaB unida a una subunidad \alpha específica de inhibina (Vale y col., 1990; Roberts y col., 1991; Roberts y Barth, 1994).

El análisis del desarrollo de los dientes en embriones mutantes en cuanto a la Activina \betaA muestra que los dientes incisivos y molares mandibulares no consiguen desarrollarse más allá del estadío de brote. La Activina \betaA es, por lo tanto, un componente esencial del desarrollo dental y es un gen marcador de las células mesenquimatosas.

Marcadores de expresión génica dental

Se puede examinar la expresión de genes marcadores mesenquimatosos y epiteliales bien caracterizados por cualquier método adecuado. Por ejemplo, se lleva a cabo la hibridación radiactiva in situ en embriones, tal como hasta el estadío de brote. Los genes adecuados para examinar los patrones de expresión pueden incluir Barx-1, Msx-1, Dlx-2, Pax-9, Gli-3, Lef-1, syndecan-1, Tgf\beta-1, Tgf\beta-3, Bmp-4, Bmp-7, Shh, CD44, Otlx-2, Lhx6, Lhx7, FGF8, Pitx2 o cualquier otro gen marcador adecuado. Se discute esto con mayor detalle a continuación.

Marcadores mesenquimatosos

Como ejemplos de dichos marcadores, se incluyen Barx1, Dlx2, Dlx5, Msx1, Pax9, Activina \betaA, Lhx6, Lhx7 y otros. Estos marcadores pueden ser detectados por cualquier medio adecuado, tal como Western blotting, inmunofluorescencia, hibridación radiactiva in situ u otros medios adecuados.

En dientes de tipo salvaje en estadío de brote, la expresión del gen Barx-1 se encuentra principalmente en la región molar de la mandíbula y de la maxila y está presente en un amplio campo de células mesenquimatosas derivadas de las crestas neurales, más que restringirse al mesénquima dental (Ferguson y col., 1998; Tissier-Seta y col., 1995).

Msx-1, Lef-1 y Bmp-4 se expresan en el mesénquima dental (es decir, en las células mesenquimatosas condensantes asociadas a brotes epiteliales incisivos y molares invaginantes) en respuesta a la señalización epitelial (Ferguson y col., 1998; Mackenzie y col., 1991; Kratochwil y col., 1996; Vainio y col., 1993).

La expresión de Dlx-2 se encuentra principalmente en las células mesenquimatosas inmediatamente alrededor del brote epitelial, pero también está presente en el epitelio dental en el lado bucal de los brotes (Ferguson y col., 1998; Thomas y col., 1995; Qui y col., 1997).

Pax-9, Lhx6 y Lhx7 se expresan en el mesénquima dental precoz antes de la formación de brotes y posteriormente en el mesénquima condensante en el estadío de brote (Ferguson y col., 1998; Neubüser y col., 1997).

Gli-3 se expresa en el mesénquima de E10.5. En el estadío de brote y de capuchón, la expresión de Gli-3 está ligeramente más localizada que la expresión de Pax-9 y se concentra en la papila dental y en el folículo dental (Ferguson y col., 1998; Hardcastle y Sharpe, 1998).

Syndecan-1, un proteoglicano de sulfato de heparina de la superficie celular, se expresa transitoriamente en el mesénquima dental y se cree que regula la condensación de células mesenquimatosas dentales por debajo del epitelio dental invaginante (Ferguson y col., 1998; Thesleff y col., 1996).

Tgf\beta-1 se encuentra en el mesénquima dental y débilmente en el epitelio de los incisivos y sólo aparece en los molares en el epitelio dental en el estadío de capuchón (Ferguson y col., 1998; Vaahtokari y col., 1991).

La expresión de Tgf\beta-3 está distribuida por todo el mesénquima de la cara, pero su expresión parece estar substancialmente ausente de las células mesenquimatosas condensantes inmediatamente adyacentes a los brotes epiteliales de incisivos y molares (Ferguson y col., 1998; Chai y col., 1994).

Marcadores epiteliales

Como ejemplos de dichos marcadores, se incluyen Pitx2, p21, Wnt7b y otros. Estos marcadores pueden ser detectados por cualquier medio adecuado, tal como Western blotting, inmunofluorescencia, hibridación selectiva in situ u otros medios adecuados.

Entre los genes que se sabe se expresan en el epitelio germinal dental, se incluyen los genes Bmp-7, Sonic hedgehog (Shh), CD44, FGF8, Pitx2 y Otlx-2.

En embriones de tipo salvaje, Bmp-7 se expresa inicialmente en el epitelio dental, pero la expresión cambia al mesénquima alrededor de los brotes dentales a partir de E13.5 (\ring{A}berg y col., 1997). En E13.5, la expresión mesenquimatosa de Bmp-7 se encuentra sólo en los incisivos inferiores, que son los más avanzados en el desarrollo en este estadío, mientras que la expresión persiste en el epitelio de los incisivos superiores y de los molares (Ferguson y col., 1998).

Shh se expresa en el engrosamiento epitelial de los gérmenes dentales precoces y se cree que es un importante componente de las señales que pasan del epitelio al mesénquima subyacente en esta etapa precoz, induciendo la expresión génica en el mesénquima y dándole instrucciones para comenzar la condensación (Bitgood y McMahon, 1995; Thesleff y Sharpe, 1997). En estadíos posteriores, Shh tiene una regulación decreciente, pero reaparecen transcriptos en las células epiteliales que constituyen el nudo del esmalte, un centro de señalización transitorio que surge en el epitelio dental en la fase de brote tardía del desarrollo de los dientes (Ferguson y col., 1998; Vaahtokari y col., 1996).

CD44 y Otlx-2 se expresan más ampliamente en el epitelio oral que Shh (Ferguson y col., 1998; Mucchielli y col., 1997). CD44 codifica para el receptor de hialuronano y Otlx-2 es el homólogo murino del gen humano que, cuando muta, causa la enfermedad conocida como síndrome de Rieger, en donde están ausentes los dientes (Semina y col., 1996).

La folistatina es una proteína de unión a activina que ha mostrado inhibir la actividad de la activina (Michel y col., 1993; De Winter y col., 1996). El patrón de expresión de la folistatina puede ser examinado por análisis de hibridación in situ (Ferguson y col., 1998). La expresión de la folistatina se encuentra en las células epiteliales germinales dentales inmediatamente adyacentes a las células que expresan activina \beta4 de E11.5. En estadíos posteriores, los transcriptos de folistatina se restringen a las células columnares que forman la capa más externa del brote epitelial, mientras que el núcleo central de células epiteliales son negativas a la folistatina (Ferguson y col., 1998). La folistatina se expresa, por lo tanto, en el epitelio dental adyacente y con un patrón complementario a la activina \beta4 en el mesénquima dental.

Primordios dentales

Se pueden cultivar los primordios dentales in vitro, permitiendo una gran variedad de estudios de manipulación, incluyendo la introducción de genes y/o proteínas y las recombinaciones de tejidos. Lo que es más significativo, los primordios manipulados pueden ser transferidos a cápsulas renales de animales adultos (tales como ratones) para producir condiciones para el desarrollo de dientes adultos. Ventajosamente, las células progenitoras de los dientes según la presente invención pueden ser usadas para la producción de primordios dentales o de dientes más completamente desarrollados.

Se contempla poder usar una aproximación de ingeniería de tejidos basada en las enseñanzas aquí descritas con respecto al desarrollo dental para generar dientes in vitro y en último lugar in vivo en la cavidad oral de un adulto.

Células ME no humanas

Tal como se muestra aquí, las células cultivadas, tales como las células ME no humanas, pueden substituir a las células mesenquimatosas derivadas de crestas neurales en la producción de células progenitoras dentales. De forma similar, como se describe aquí, se puede someter a ingeniería un epitelio artificial para emular el epitelio oral embrionario. Se contempla la utilización de las células epiteliales cultivadas aquí descritas en la producción de epitelio artificial y que este epitelio pueda ser sometido a ingeniería para que posea características de epitelio oral, permitiendo así el reemplazo del epitelio embrionario no humano con epitelio sometido a ingeniería en la producción de células progenitoras dentales.

Otras fuentes de células madre que pueden substituir a las células mesenquimatosas derivadas de crestas neurales pueden incluir células madre neurales primarias de adulto, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas. Éstas pueden ser obtenidas usando métodos establecidos, por ejemplo como describen Johansson y col. (Cell, Vol. 96, p25 (1999)) y/o Clarke y col. (Science, Vol. 288, p1660 (2000)). Dichas células son incluso capaces de formar células de crestas neurales cuando se trasplantan a blastocitos de ratón. La(s) línea(s) de células madre neurales cultivada(s) puede(n) ser también usada(s) para reemplazar las células mesenquimatosas derivadas de crestas neurales según los métodos de la presente invención, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas.

Se contempla que las células progenitoras dentales según la presente invención puedan ser empleadas eficazmente para generar dientes murinos por entero a partir de células madre cultivadas, combinando agregados de células ME no humanas con epitelio producido a partir de líneas celulares inmortalizadas y de células ME no humanas.

Se ha establecido la capacidad de las células ME no humanas para formar poblaciones primitivas de células de tipo ectodérmico (5,6). Se puede obtener la combinación de las señales segregadas necesarias para inducir odontogénesis en dichas células por manipulación experimental de las células, por ejemplo usando el sistema de administración de perlas aquí descrito. Más aún, se contempla que el ectodermo derivado de células ME no humanas pueda reemplazar ventajosamente al ectodermo odontogénico una vez se haya transferido la dirección de la señalización al mesénquima odontogénico.

Cultivo de células madre para la formación de dientes

Como se explica aquí, la presente invención se relaciona con método(s) para la generación de un tejido mesenquimatoso capaz de formar dientes a partir de células madre cultivadas, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas. Las células madre pueden ser preparadas para la inducción/interacción de una serie de formas. Por ejemplo, pueden ser nodulizadas para formar pequeños agregados. Se puede conseguir esto nodulizándolas sobre filtros. Dichos filtros pueden incluir cualquier substrato adecuado, tal como filtros Millipore pregelatinizados. Por razones de conveniencia, los filtros pueden estar soportados por rejillas metálicas, por ejemplo como describen Ferguson y col. (1998). Las células madre pueden ser nodulizadas en pequeños orificios hechos en un gel u otro soporte semisólido adecuado. El gel puede ser un gel de colágeno. El gel puede ser Matrigel, de Collaborative Biomedical Products, o un substrato similar. Se deposita el epitelio sobre las células madre para cubrir el orificio, que se cubre entonces con una fina capa de gel y se incuba. Los geles usados de esta forma pueden ser ellos mismos soportados por membrana(s) y/o rejillas metálicas como se ha señalado anteriormente y en la sección de Ejemplos.

Reemplazo de los dientes

La presente invención puede ser utilizada para el reemplazo dental, particularmente para el reemplazo de dientes humanos. Sería preferible hacer crecer los dientes sometidos a ingeniería de tejidos en la cavidad oral del adulto, permitiendo de este modo un reemplazo dental directo.

Es sabido que los primordios dentales embrionarios pueden desarrollarse y crecer normalmente en el ambiente del adulto, por ejemplo usando transferencias renales (1,4). Parece que sitios tales como el riñón del adulto y el ojo proporcionan un ambiente adecuado, en gran medida permitiendo un suministro adecuado de sangre. Por lo tanto, pensamos que los rudimentos dentales implantados quirúrgicamente en la cavidad oral se desarrollarían normalmente.

Además de poder desarrollar una serie de procedimientos para permitir el reemplazo dental, es deseable que el diente que se desarrolla in situ sea de la forma y tamaño correctos. Se conocen una serie de genes que determinan la forma del diente y, por manipulación de estos genes, es posible cambiar la forma del diente (1,4,7,8). De forma similar, se ve experimentalmente que la modulación de los fenómenos de señalización da lugar a alteración del tamaño del diente. Por ejemplo, la inhibición de la señalización de Wnt da lugar al desarrollo de dientes más pequeños (9). Estas observaciones podrían ser ventajosamente empleadas en los métodos de la presente invención.

Los métodos de la presente invención podrían ser aplicados eficazmente a una aproximación de ingeniería de tejidos para la generación de un órgano completo de mamífero, un diente, de novo a partir de células madre cultivadas, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas. La aproximación conlleva el reemplazo de tejidos embrionarios no humanos que forman dientes con tejidos generados a partir de las células madre cultivadas aquí descritas.

Un aspecto de la presente invención se relaciona con epitelio oral embrionario no humano, el cual, cuando se recombina con mesénquima derivado de células madre embrionarias (células ME) no humanas cultivadas, induce la expresión de genes específicos de los dientes y el desarrollo precoz de dientes en el tejido de células ME no humanas.

Como es sabido en la técnica, el segundo arco branquial de los embriones de mamíferos no desarrolla dientes. En una realización de la invención, utilizando una técnica de doble recombinación con tejidos derivados de cepas de ratones marcadas genéticamente, se induce la odontogénesis en el mesénquima del segundo arco branquial. Se demuestra además que este tejido es entonces capaz de inducir odontogénesis en el epitelio del segundo arco branquial. Se forman entonces gérmenes dentales de estadío precoz a partir de estos tejidos recombinados según la presente invención. Se confirma la formación de dichos gérmenes dentales por monitorización de la expresión de los marcadores moleculares apropiados como se ha descrito antes. Así, es una característica ventajosa de la presente invención que se puede hacer que los tejidos no odontogénicos formen dientes, según se describe aquí.

En otra realización, la invención se relaciona con la inducción de mesénquima basado en células ME no humanas para que sufra odontogénesis. Se recombina epitelio oral con mesénquima de células madre embrionarias no humanas. Se forman invaginaciones epiteliales (brotes dentales). Usando marcadores moleculares para brotes dentales, se demuestra que se induce la expresión de estos marcadores en el mesénquima de células ME no humanas alrededor de las invaginaciones epiteliales, lo cual es indicativo de que tiene lugar una odontogénesis precoz y confirma la formación de brotes dentales. Por lo tanto, es una característica ventajosa de la presente invención que se puede inducir al mesénquima basado en células ME no humanas para que experimente odontogénesis.

Ventajosamente, los métodos de la presente invención pueden ser empleados para formar dientes enteramente a partir de tejidos embrionarios no humanos que no formarían dientes normalmente.

Se prevé que la presente invención puede permitir a las células ME no humanas reemplazar las células embrionarias no humanas derivadas de las crestas neurales y permitir el desarrollo de dientes.

Ventajosamente, se pueden producir células epiteliales a partir de líneas celulares y usarlas como reemplazo para el epitelio oral in vitro.

Los métodos de la presente invención pueden ser ventajosamente aplicados al reemplazo del ambiente embrionario no humano normalmente requerido para el desarrollo dental por un ambiente de adulto, tal como mediante implantación de células progenitoras de los dientes o de estructuras resultantes de ellas en una mandíbula de adulto para su desarrollo. Los dientes producidos/transplantados según la presente invención continúan creciendo y desarrollándose cuando se implantan en el hueso mandibular y se unen al mismo.

Se contempla que la presente invención permitirá dirigir las células madre para que sigan una ruta odontogénica en cultivo y posteriormente se desarrollen en dientes maduros cuando se implanten en riñón y/o mandíbula humanos, siempre que las células madre no sean células madre embrionarias humanas.

Es una ventaja de la presente invención poder producir el desarrollo eficaz de dientes a partir de células madre cultivadas.

Se demuestra aquí que se pueden pasar señales odontogénicas a células mesenquimatosas y epiteliales que normalmente no forman dientes programándolas en cultivo para posterior desarrollo dental según la presente invención.

Es una ventaja de la presente invención poder programar las células mesenquimatosas por exposición a señales odontogénicas (por ejemplo, del epitelio oral) en cultivo para formar posteriormente dientes al implantarlas (por ejemplo, implante renal o implante en la mandíbula).

Es una ventaja de la presente invención que los primordios dentales se unan y se desarrollen eficazmente después de su implantación en la mandíbula.

Se contempla que la presente invención facilitará el reemplazo del epitelio oral con línea(s) de células madre cultivada(s) y/o facilitará el reemplazo del epitelio con señales proteicas que pueden ser ventajosamente aplicadas como proteína y/o como gen(es) codificante(s) de la misma y/o facilitará el uso de células madre, tales como células madre neurales y/o células madre embrionarias no humanas, para la producción de dientes por ingeniería de tejidos.

Ejemplos

La presente invención será ahora descrita a modo de ejemplos, en donde se hace referencia a:

la Figura 1, que muestra una sección teñida, y

la Figura 2, que muestra una sección teñida.

Con ligeramente más detalle:

la Figura 1 muestra un brote en desarrollo y

la Figura 2 muestra la expresión visualizada de los genes marcadores progenitores de los dientes.

Métodos generales

Los presentes métodos son llevados a cabo sobre explantes de embriones murinos cultivados usando un sistema establecido (véanse, por ejemplo, Ferguson y col., 1998, y siguientes). Se realizan las recombinaciones usando métodos establecidos que conllevan la separación de epitelio y mesénquima con Dispasa (4). La histología incluye el corte y la tinción de secciones de cera y la hibridación in situ con marcadores génicos utiliza sondas de ARN 35S, usando diferentes sondas en secciones adyacentes. Se llevan a cabo las transferencias renales en ratones CD1 machos de seis semanas de edad usando un procedimiento aprobado por el Ministerio del Interior del Reino Unido, se recogen los extractos renales a lo largo de 10 a 16 días, se descalcifican en EDTA, se hacen secciones seriadas y se tiñen. El cultivo de órganos/tejidos es según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo en "Organ culture in the analysis of tissue interactions". I. Thesleff y C. Sahlberg, en Molecular Embryology Methods and Protocols, Vol. 97, Cap. 3, Eds. PT Sharpe e I. Mason, Humana Press, 1999. Se propagan las células ME, se mantienen y se preparan según protocolos estándar, que pueden encontrarse, por ejemplo, en "CRE recombinase mediated alterations of the mouse genome using embryonic stem cells", Hadjantonakis y col., en Molecular Embryology Methods and Protocols, Vol. 97, Cap. 8, Eds. PT Sharpe e I. Mason, Humana Press, 1999. Cuando sea apropiado, se pueden nodulizar las células ME sobre filtros, o preferiblemente se cultivan sobre filtros pregelatinizados usando condiciones de cultivo estándar como se ha explicado anteriormente.

Ejemplo 1 Desarrollo de los dientes a partir de tejidos embrionarios no humanos no odontogénicos

Se determina el grado al que se pueden desarrollar los dientes a partir de recombinaciones de tejidos embrionarios que normalmente no forman dientes.

Se recombina el epitelio oral (primer arco branquial) de embriones E10 con mesénquima del segundo arco branquial. Se cultivan estos explantes durante tres días para iniciar la odontogénesis en el mesénquima, que se confirma por hibridación in situ con marcadores moleculares.

Recombinaciones de tejidos epiteliales-mesenquimatosos

Se llevan a cabo recombinaciones a E11.5 y E13.5. Se diseca el anlágeno molar de las mandíbulas en DMEM con glutamax-1. Se aíslan el epitelio y el mesénquima después de incubación en una solución de Dispasa (Gibco BRL) preparada en PBS libre de calcio y de magnesio a 2 unidades por ml durante 10-15 minutos a 37ºC. Después de incubar, se lavan las mandíbulas en D-MEM con un 10% de suero de ternera fetal ("FCS") y se separan mecánicamente los tejidos usando agujas finas de tungsteno. Para la recombinación, se alinean el epitelio y el mesénquima en la orientación correcta (como se muestra en Ferguson y col., 1998) encima de filtros de membrana Nucleopore transparentes (0,1 micras de diámetro de poro, Costar). Se cultivan las recombinaciones durante 24 a 48 h en D-MEM con un 10% de suero de ternera fetal, después de lo cual se fijan y se procesan para la hibridación radiactiva in situ o se trasplantan bajo la cápsula renal de ratones machos adultos y se cultivan durante otros 10 días para permitir el desarrollo completo de los dientes.

Hibridación in situ

Se llevan a cabo los procedimientos de hibridación radiactiva in situ en embriones a E10.5-E14.5 según describe Wilkinson (1995). Se generan sondas radiactivas antisentido a partir de clones de ADNc de ratón, tales como activina \betaA, folistatina, Barx-1, Bmp-4, Bmp-7, CD44, Dlx-2, Fgf8, Gli-3, Otlx-2, Pax-9, Shh, Syndecan-1, Tgf\beta-1, Tgf\beta-3 u otros según se discute aquí.

Después de tres días, el epitelio oral es retirado y substituido con epitelio del segundo arco branquial. En este momento, el potencial odontogénico reside en el mesénquima del segundo arco branquial (que ha sido inducido por el epitelio oral), que proporciona entonces las señales inductivas de nuevo al epitelio del segundo arco branquial. Se cultivan los explantes durante otros tres días y se estudian en cuanto a la formación de brotes dentales por histología y por marcadores moleculares.

La Figura 1 muestra la formación de brotes dentales en este sistema (con flechas).

Se transfieren explantes idénticos a cápsulas renales para demostrar que se pueden formar dientes normales a partir de una combinación de tejidos del segundo arco branquial que no pueden formar normalmente dientes. Es importante en estos experimentos asegurarse de que no existe contaminación de los tejidos del segundo arco branquial con células del primer arco. Se monitoriza esto usando embriones independientes de ratones ROSA 26 y GFP, cuyas células pueden distinguirse fácilmente usando los marcadores de ingeniería que hay en ellas. Recogiendo los tejidos del primer arco de ratones GFP y los tejidos del segundo arco de ratones ROSA 26, se pueden estudiar los orígenes de todas las células de los dientes formados por tinción con Lac Z y detección de GFP.

Inducción de primordios dentales a partir de tejido mesenquimatoso

Se demuestra la inducción in vitro de primordios dentales a partir de tejido mesenquimatoso. Se proporcionan las señales necesarias artificialmente usando perlas empapadas en proteína. Se deja entonces que estos progenitores dentales se desarrollen en dientes totalmente crecidos in vivo en animales adultos.

Se disecan mandíbulas de embriones a E11.5, E12.5 y E13.5 en D-MEM con glutamax-1 (Gibco BRL). Se usa el resto del embrión para la genotipificación. Para los cultivos a E11.5 y E13.5, se aísla el anlágeno de los dientes molares individuales del tejido oral y aboral circundante, mientras que, para los cultivos a E12.5, se usan mandíbulas completas. Se ponen con las superficies orales hacia arriba sobre filtros de membrana soportados por rejillas metálicas siguiendo la técnica de Trowell modificada por Saxen (Trowell, 1959; Saxen, 1966). Se lavan perlas de Affi-gel de agarosa (BioRad) varias veces en PBS y se secan luego antes de añadirlas a proteína activina A recombinante a 1 mg/ml, una concentración que se sabe puede inducir formación de mesodermo en ensayos animales de capuchón en Xenopus (Ferguson y col., 1998), o BSA a la misma concentración, durante una hora a 37ºC. Las perlas son empujadas al mesénquima de tal forma que permanezcan en estrecha proximidad a los gérmenes dentales en desarrollo. Se cultivan los explantes mandibulares a E11.5 y E13.5 con perlas durante 24 a 72 h en D-MEM con un 10% de suero de ternera fetal. Se cultivan los explantes mandibulares E12.5 con perlas durante 6 días, se fijan después en paraformaldehído al 4% (SIGMA) y se procesan para examen histológico usando tinción de hematoxilina/eosina. Se usa una incubadora estándar a 37º con una atmósfera de un 5% de CO_{2} en aire y un 100% de humedad. Todas las soluciones contienen penicilina y estreptomicina a 20 UI/ml. Después del período de cultivo, se retiran los explantes E11.5 y E13.5 de sus filtros de membrana y se trasplantan bajo las cápsulas renales de ratones adultos machos. Durante este procedimiento, la mayor parte de las perlas se disocian de los explantes. Se cultivan los explantes en riñones hospedadores durante 10 días para permitir el desarrollo completo de dientes. Se fijan entonces los tejidos resultantes en solución de Bouin (SIGMA), se deshidratan y se embeben. Se cortan diluciones seriadas de 7 micras y se tiñen usando azul alciano/rojo rápido de clorontina.

Inducción de células progenitoras dentales usando señales Fgf-8/Bmp-4 artificiales

Se disecan mandíbulas en E11.5. Cuando está indicado, se retira el epitelio después de incubar en Dispasa (2 unidades por ml) durante 10 minutos a 37ºC. Para la aplicación de proteína Fgf8, se lavan perlas acrílicas de heparina (Sigma) y se incuban después durante la noche en 1 mg/ml de proteína Fgf-8 (FGF-8b de ratón recombinante, R&D Systems, Europa) a 4ºC. Para la aplicación de proteína Bmp-4, se lavan perlas de Affi-gel de agarosa y se empapan en la proteína (BMP-4 humana recombinante) durante 1 h a 37ºC. Se usa una concentración de 100 \mug/\mul de Bmp-4, ya que esta concentración ha mostrado inhibir la expresión de Pax-9 en un ensayo similar (Neubüser y col., 1997). Después de 24-48 h en cultivo, se fijan los explantes y se procesan para la hibridación in situ. Se lleva a cabo el montaje total de digoxigenina en la hibridación in situ como describen Pownall y col. (1996).

Ejemplo 2 Uso de células madre cultivadas en la producción de células progenitoras de dientes

Se demuestra la substitución de células mesenquimatosas derivadas de las crestas neurales con células ME no humanas y la posterior determinación de éstas como células progenitoras de los dientes.

Se describe aquí una forma de reproductibilidad que produce tejido mesenquimatoso sólido a partir de células madre cultivadas, tales como células ME no humanas, siendo dicho tejido capaz de interaccionar con el epitelio oral y de formar dientes.

Para establecer que las células ME no humanas pueden ser usadas para reemplazar las células mesenquimatosas derivadas de las crestas neurales, se nodulizan células ME de ratón sobre filtros para formar pequeños agregados. Se recubren estos agregados con epitelio oral de embriones de ratón E10 y se deja que se desarrollen durante tres días en cultivo. La histología de los cultivos revela evidencia de invaginaciones epiteliales con expresión circundante de los genes marcadores mesenquimatosos dentales Barx1 y Dlx5, como se muestra en la Figura 2.

Se cultivan células ME 129 de tipo de salvaje y se mantienen en un estado pluripotente usando las mismas condiciones que las rutinariamente usadas para abordar genes. Se nodulizan las células sobre filtros Millipore pregelatinizados y se dejan crecer durante 1 a 3 días para formar agregados. Se recubren los agregados de células ME con epitelio oral E10 de embriones ROSA 26 y se cultivan durante tres a cinco días. Se llevan a cabo los análisis histológicos, de marcadores moleculares y de transferencia renal como se describe aquí. Como control., se usarán células ME homozigóticas para un alelo de interés de Msx1. Se producen células ME Msx1 +/- y -/- por electroporación de células
ME +/- con la construcción de interés original, seguido de selección con una mayor concentración de G418. Como los embriones Msx1 -/- no desarrollan dientes, las células ME -/- no permiten el desarrollo dental más allá del estadío de brote cuando se recombinan con epitelio oral (10).

Más aún, se puede seguir el protocolo expuesto en el Ejemplo 1 anterior, donde, después de la inducción de potencial odontogénico en el tejido de células ME no humanas, se substituye el epitelio oral con epitelio del segundo arco branquial no odontogénico.

Ejemplo 3 Uso de células cultivadas en la formación de epitelio oral

Se demuestra la substitución del epitelio oral con líneas celulares epiteliales odontogénicas cultivadas.

Se muestra aquí cómo substituir epitelio oral con un epitelio derivado de líneas inmortalizadas de células epiteliales dentales. En primer lugar, se genera una serie de líneas clonadas de células inmortalizadas derivadas de epitelio odontogénico precoz.

Cultivos epiteliales

Se aísla el epitelio oral tras la incubación de mandíbulas E11.5 en Dispasa (2 unidades por ml) durante 10 minutos a 37ºC. Se cultiva el epitelio en Matrigel (Collaborative Biomedical Products) sobre filtros de membrana soportados por rejillas metálicas según describen Ferguson y col., 1998. Matrigel es una membrana basal solubilizada extraída de la línea celular de sarcoma murino Engelbreth-HolmSwarm y proporciona una matriz en la que se pueden desarrollar las células epiteliales. El gel solidifica rápida e irreversiblemente a temperaturas de entre 22ºC y 35ºC. Por lo tanto, se mantiene el producto sobre hielo y se usan pipetas pre-enfriadas. Se cubren los filtros con Matrigel, que se deja solidificar a 37ºC antes de pipetear los epitelios en la parte superior. Para visualizar los epitelios, se tiñen débilmente con rojo neutro antes de colocarlos sobre el Matrigel. Se preparan perlas de Affi-gel de agarosa (BioRad) empapadas en proteína activina A recombinante (1 mg/ml) o BSA como se describe aquí. Se ponen las perlas encima de los epitelios, que son entonces cubiertos con más Matrigel, de tal forma que se rodean los cultivos. Se cultivan los epitelios con perlas durante 48 h en D-MEM con un 10% de suero de ternera fetal. Después del período de cultivo, se lavan los cultivos en metanol helado durante 1 minuto y se fijan luego en paraformaldehído fresco al 4% durante 1 hora a TA. Se preparan entonces los cultivos para la hibridación in situ de secciones ^{35}S.

Se producen líneas inmortalizadas de células epiteliales odontogénicas. Se estudian las líneas celulares generadas en cuanto a sus capacidades inductivas odontogénicas. Se establecen líneas que expresan amelogeninas, proteínas únicas específicas de los dientes implicadas en la formación del esmalte. Se analizan los marcadores moleculares para determinar si están bien establecidas las propiedades de señalización del epitelio oral precoz.

Se identifican las células que tienen propiedades de ameloblastos por cribado de las líneas en cuanto a la expresión de amelogenina. Se usa RT-PCR para estudiar la expresión de FGF8, BMP4, SHH y Pitx2 (el marcador más precoz del epitelio oral), con objeto de determinar qué líneas es probable que puedan reemplazar el ectodermo oral.

Para estudiar la capacidad inductora odontogénica de las líneas celulares, se cultivan explantes mesenquimatosos (con eliminación del epitelio) de primordios mandibulares de embriones E12 en filtros en pequeños pocillos en geles de colágeno. Se depositan las células cultivadas de las líneas seleccionadas sobre los explantes mesenquimatosos y se cultivan los explantes durante 3 días. Se estudia el grado formación e invaginación del epitelio histológicamente y con marcadores moleculares dentales.

Como en E11.5 la capacidad de inducción odontogénica reside en el mesénquima, el epitelio natural responde a estas señales y permite el desarrollo dental. Si el medio de crecimiento usado en los cultivos no contiene los factores necesarios para que las líneas celulares produzcan un epitelio odontogénico, se usan medios condicionados de cultivos de explantes de primordios mandibulares intactos.

Se estudian las propiedades odontogénicas inductoras de las líneas celulares inmortalizadas siguiendo los métodos de los ejemplos anteriores, pero substituyendo el mesénquima de los primordios mandibulares con mesénquima del segundo arco branquial.

Si las células epiteliales no inducen apropiadamente la odontogénesis, se estudia la expresión de moléculas señalizadoras inductoras (FGF8, BMP4, SHH, etc.) en los cultivos de explantes de colágeno y se substituye cualquier señal ausente por proteínas purificadas sobre perlas o por electroporación de construcciones de expresión génica (véase lo que sigue).

Ejemplo 4 Ingeniería de epitelio artificial

Tal como se describe aquí, se pueden suministrar señales inductoras epiteliales usando proteínas purificadas. Se usan las siguientes aproximaciones experimentales para reproducir (substituir) las señales inductoras en el epitelio oral producido a partir de células ME no humanas cultivadas inmortalizadas.

Se han identificado una serie de proteínas señalizantes que se segregan por el epitelio oral y que a las células mesenquimatosas para que se vuelvan odontogénicas y generen brotes dentales epiteliales. Estas señales incluyen FGF8, BMP4 y SHH (3,11). Estos factores pueden ser suficientes para inducir la iniciación del diente en células no odontogénicas.

Se estudia la viabilidad de producir por ingeniería un epitelio oral artificial. Se implantan perlas empapadas en una combinación de proteínas señalizantes implicadas en la iniciación en el epitelio de extractos de segundo arco branquial y se analiza el desarrollo de los dientes.

No se desarrollan dientes en el segundo arco branquial y, por lo tanto, cualquier evidencia de desarrollo dental tras la adición de señales exógenas implica iniciación. Se estudia un rango de concentraciones y combinaciones.

Se forman estructuras en los explantes tratados con factores que no se forman en los explantes control.

Alternativamente, se puede usar electroporación para transferir construcciones de expresión génica a sitios epiteliales localizados con objeto de reproducir las disposiciones espaciales del primer arco branquial de estas tres moléculas de señalización en el segundo arco branquial.

Ejemplo 5 Producción de epitelio derivado de células ME no humanas

En la producción de células progenitoras dentales según la presente invención, es deseable substituir el epitelio oral por un epitelio derivado de células ME no humanas (es decir, derivado de células madre cultivadas).

La generación de progenitores dentales animales, tales como progenitores dentales humanos, será preferiblemente llevada a cabo por entero a partir de células madre cultivadas.

Las células ME han mostrado ser capaces de formar células ectodérmicas/epiteliales y, siguiendo líneas similares a las antes descritas para líneas celulares epiteliales inmortalizadas, se investigan los requerimientos para que las células ME no humanas generen un epitelio odontogénico inductor.

Para las células ME control, se usan células ME Pitx2 -/-, ya que Pitx2 se expresa en el epitelio oral precoz y los embriones Pitx2 -/- no pueden formar brotes dentales en estadío de capuchón (12,13,14).

Preferiblemente, tanto el epitelio odontogénico como el mesénquima son substituidos con epitelio y mesénquima generados de células ME no humanas en un solo explante en los métodos de los ejemplos anteriores.

Ejemplo 6 Desarrollo de explantes dentales en la cavidad oral

Los explantes pueden desarrollarse normalmente en al menos dos sitios adultos, la cápsula renal y la cámara anterior del ojo. Se determina si los explantes pueden desarrollarse en la cavidad oral del adulto.

Se anestesian ratones machos adultos y se extrae un único diente primer molar. Se trasplantan los explantes de primordios dentales molares cultivados durante 3 días como en los ejemplos anteriores en el sitio de extracción. Se cierra la mucosa oral sobre el trasplante, se sutura y se deja durante 10-16 días para desarrollarse, durante cuyo tiempo se alimenta al animal con una dieta blanda.

Se estudia el grado de desarrollo del diente explantado por histología. Estos experimentos requieren el uso de microcirugía. Se adquiere experiencia quirúrgica con ratones sacrificados antes de llevarla a la práctica con animales vivos.

Diversas modificaciones y variaciones de los métodos descritos y del sistema de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin desviarse del alcance y espíritu de la presente invención. aunque la presente invención ha sido descrita en relación a realizaciones preferidas específicas, habría que entender que la invención reivindicada no debe limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. Ciertamente, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos de llevar a cabo la invención, que son obvias para los expertos en bioquímica y biotecnología o campos relacionados queden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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12. Lu M-F., Pressman, C., Dyer, R., Johnson, R. y Martin, J.F. (1999), Nature 401, 276-278.

13. Lin, C.R., Kioussi, C., O'Connell, S., Briata, P., Szeto, D., Liu, F., Izpisua-Belmonte, J.c. y Rosenfeld, M.G. (1999), Nature 401, 279-282.

14. Gage, P.J., Suh, H. y Camper, S.A. (1999), Development 126, 4643-4651.

Claims (6)

1. Uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental, siempre que la célula madre no sea una célula madre embrionaria humana.

2. Uso de una célula madre cultivada para producir una célula progenitora dental según la reivindicación 1, donde dicha célula madre cultivada es una célula madre embrionaria (célula ME).

3. Un método para la producción de una célula progenitora dental a partir de una célula madre cultivada, cuyo método consiste en:

i) disponer de una célula madre cultivada,

ii) poner en contacto la célula madre cultivada de (i) con una o más células epiteliales orales y

(iii) incubar durante un tiempo suficiente para producir dicha célula progenitora dental,

donde dicha célula madre cultivada es una célula madre embrionaria (célula ME).

4. Un método según la reivindicación 3, donde la célula madre cultivada es una célula ME.

5. Una célula progenitora dental que puede ser obtenida a partir de una célula madre cultivada, donde dicha célula madre cultivada es una célula madre embrionaria (célula ME).

6. Una célula progenitora dental que puede ser obtenida a partir de una célula madre cultivada según la reivindicación 5, donde dicha célula madre cultivada es una célula ME.