ES2240970T3

ES2240970T3 - Polimorfismos de nucleotido simple y su uso en analisis geneticos.

Info

Publication number: ES2240970T3
Application number: ES95900520T
Authority: ES
Inventors: Philip Goelet; Michael R. Knapp
Original assignee: Orchid Biosciences Inc
Current assignee: Orchid Cellmark Inc
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-11-02
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: ATE291583T1; US20020094525A1; DE69434314D1; CA2175695A1; EP0726905B1; WO1995012607A1; EP0726905A4; AU8132194A; US20030170624A1; EP0726905A1; DE69434314T2

Abstract

SE PRESENTAN MOLECULAS Y METODOS ADECUADOS PARA IDENTIFICAR ZONAS POLIMORFICAS EN EL GENOMA DE UNA PLANTA O UN ANIMAL. LA IDENTIFICACION DE TALES ZONAS ES UTIL EN LA DETERMINACION DE LA IDENTIDAD, ANCESTROS, PREDISPOSICION A ENFERMEDADES GENETICAS, LA PRESENCIA O AUSENCIA DE RASGOS DESEADOS, ETC.

Description

Polimorfismos de nucleótido simple y su uso en análisis genéticos.

Campo de la invención

La presente invención se desarrolla en el ámbito de la tecnología de recombinación del ADN. Más concretamente, la invención se relaciona directamente con métodos adecuados para la identificación de polimorfismos de nucleótido simple en el genoma de un animal, en particular de un caballo o de un ser humano, y utilizar estas posiciones para analizar rasgos de identidad, de ascendencia y genéticos.

Antecedentes de la invención

La capacidad de hallar el genotipo de un animal, una planta o un microbio es de importancia fundamental en las ciencias forense, medicina y epidemiología, salud pública, y en el ámbito de la crianza y exhibición de animales. Esta capacidad es necesaria, por ejemplo, para establecer la identidad de un agente causante de alguna enfermedad infecciosa, determinar si dos indivisos están emparentados, o para averiguar si un animal concreto, como un caballo, es de pura sangre.

Los análisis de identidad y de parentesco, junto con la capacidad de diagnosticar enfermedades son también de interés central para el estudio genético de los seres humanos, los animales y las plantas, en particular para las evaluaciones forenses o de parentesco y para la valoración del riesgo de un individuo a padecer enfermedades genéticas. Estas metas se han venido acometiendo mediante el análisis de las variaciones en las secuencias del ADN que distinguen el ADN de un individuo con respecto a otro.

Si una de estas variaciones altera las longitudes de los fragmentos que se generan a partir de una segmentación por restricción de la endonucleasa, estas variaciones se denominan polimorfismos de longitud fragmentada por restricción (PLFR). Los PLFR han sido ampliamente empleados en análisis genéticos de animales y seres humanos (Glassberg, J., solicitud de patente UK 2135774; Skolnick, M.H. y otros, Cytogen. Cell Genet. 32:58-67 (1982); Botstein, D. y otros, Ann. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980); Fischer, S.G. y otros (solicitud PCT WO90/11368; Uhlen, M., solicitud PCT Wo90/11369)). Cuando es posible vincular un rasgo hereditario con un PLFR particular, la presencia del PLFR en un animal individual permite hallar la probabilidad de que cualquier individuo de esa especie animal también exhiba dicho carácter. Se han desarrollado algunos métodos estadísticos que permiten efectuar un análisis multilocus de PLFR y trazar un mapa de los rasgos complejos que dependen de alelos múltiples (Lander, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83:7353-7357 (1986); Lander, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:2363-2367 (1987); Donis-Keller, H. y otros, Cell 51:319-337 (1987); Lander, S. y otros, Genetics 121:185-199 (1989)). Dichos métodos pueden utilizarse para desarrollar un mapa genético, así como para desarrollar plantas o animales que presenten un carácter deseable (Donis-Keller, H. y otros, Cell 51:319-337 (1987); Lander, S. y otros, Genetics 121:185-199 (1989)).

En algunos casos, las variaciones en la secuencia del ADN se hallan en unas regiones del genoma caracterizadas por cortas repeticiones a pares (CRP) que incluyen patrones de di- o trinucleótidos que se repiten a pares. Estas repeticiones a pares también reciben el nombre de polimorfismos de "repetición por pares de número variable" (RPNV). Las RPNV han utilizado el análisis de identidad y de parentesco (Weber, J.L., patente U.S. 5.075.217); Armour, J.A.L. y otros, FEBS Lett. 307:113-115 (1992); Jones, L. y otros, Eur. J. Haematol, 39:144-147 (1987); Horn, G.T. y otros, solicitud PCT WO91/14003; Jeffreys, A.J., solicitud de patente europea 370.719; Jeffreys, A.J., patente U.S. 5.175.082); Jeffreys, A.J. y otros, Amer, J. Hum. Genet. 39:11-24 (1986); Jeffreys, A.J. y otros, Nature 316:76-79 (1985); Gray, I.C. y otros, Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243:241-253 (1991); Moore, S.S. y otros, Genomics 10:654-660 (1991); Jeffreys, A.J. y otros, Anim. Genet. 18:1-15 (1987); Hillel, J. y otros, Anim. Genet. 20:145-155 (1989); Hillel, J. y otros, Genet. 124:783-789 (1990)) y actualmente se emplean en un gran número de estudios de trazado del mapa genético.

Li y Sadler (Genetics 129:513-523 (1991)) han estudiado la diversidad de los nucleótidos en seres humanos utilizando secuencias publicadas de cADN y de genomas. Definieron como medida de variabilidad genética el número nucleótidos diferentes para cada posición de dos secuencias elegidas al azar de una población de individuos. Sobre esta base, se halló que la diversidad nucleotida en los seres humanos es baja.

Una tercera clase de variación en las secuencias de ADN se debe a polimorfismos de nucleótido simple (PNS) entre individuos de una misma especie. Estos polimorfismos son mucho más frecuentes que los PLFR, los CRP y los RPNV. En muchos casos, estos polimorfismos contienen mutaciones que son la característica determinante de una enfermedad genética. Una simple mutación en un único nucleótido de un gen codificante de una proteína puede efectivamente bastar para causar la enfermedad (por ejemplo, hemofilia, anemia falciforme). En muchos casos, estos PNS se hallan en regiones no codificantes de un genoma. A pesar de la importancia central de estos polimorfismos en la genética moderna, no se ha desarrollado ningún método práctico de análisis genéticos que permitan un análisis masivo en paralelo de muchos PNS alelos correspondientes a dos o más individuos.

La presente invención proporciona dicho método mejorado. En efecto, la presente invención proporciona métodos y secuencias de genes que permiten un análisis genético de identidad y de parentesco y el diagnóstico de enfermedades por determinación de las variaciones de polimorfismos de nucleótido simple.

Resumen de la invención

La presente invención se orienta a moléculas que contienen polimorfismos de nucleótido simple (PNS) presentes en el ADN de los mamíferos y, en particular, polimorfismos en el ADN genómico de los équidos y los seres humanos. La invención se orienta a métodos de: (i) identificación de polimorfismos de nucleótido simple nuevos, (ii) análisis y comprobaciones repetidas de estos PNS en diferentes muestras y (iii) explotación de dichas posiciones en el análisis genético de animales individuales y poblaciones de animales.

El análisis (genotipificación) de dichas posiciones resulta de utilidad para la determinación de características de identidad, de ascendencia, predisposición a enfermedades genéticas, presencia o ausencia de algún rasgo determinado, etc. En detalle, la invención proporciona:

un método para el análisis genético de un conjunto de individuos de la misma especie, el cual:

proporciona una serie polimórfica que constituye un conjunto de polimorfismos de nucleótido simple (PNS); y

determina la presencia o ausencia de polimorfismos en el conjunto de PNS para cada conjunto de individuos; y

determina si la presencia o ausencia de un alelo particular de un polimorfismo en el conjunto de PNS se halla asociado a algún rasgo particular.

La invención también proporciona:

un método para la determinación de la probabilidad de que una muestra de ácido nucleico proviene de un individuo particular, el cual:

proporciona una serie polimórfica que constituye un conjunto de polimorfismos de nucleótido simple (PNS) correspondientes a dicho individuo y una serie polimórfica correspondiente a dicha muestra;

determina la presencia o ausencia de polimorfismos PNS múltiples marcadores en las dos series y compara los resultados para cada polimorfismos PNS marcador;

determina a partir de ello una probabilidad de identidad / no identidad para cada comparación; y

determina a partir de ello una probabilidad acumulada de identidad / no- identidad como el producto de probabilidades obtenidas en cada comparación.

La invención también proporciona:

un método de determinación de la probabilidad de que un individuo sea o no progenie de un antecesor o unos antecesores putativos, el cual:

proporciona una serie polimórfica que constituye un conjunto de polimorfismos de nucleótido simple (PNS) correspondiente a dicho individuo y una serie polimórfica correspondiente a dicho antecesor o antecesores putativos;

determina la presencia o ausencia de polimorfismos PNS múltiples marcadores en la serie individual y la del antecesor o los antecesores y compara los resultados para cada polimorfismo PNS marcador; y

determina a partir de ello la probabilidad de que el individuo sea o no progenie del antecesor o los antecesores putativos.

La invención también proporciona:

un método de generación de un mapa genético de un individuo, el cual:

(a) proporciona una serie polimórfica compuesta por tres o más polimorfismos de nucleótido simple (PNS);

(b) identifica las variantes de PNS presentes en un antecesor del individuo por determinación de los rasgos de identidad básicos para cada posición del PNS en el cromosoma del individuo;

(c) determina el número de coincidencias entre el individuo y el antecesor;

(d) calcula el alcance de vinculación genética entre cada alelo a partir del número de coincidencias obtenido en el punto (c) y de la probabilidad de que cualquier par de alelos hallado en el individuo haya sido heredada del mismo antecesor sobre la base de las frecuencias alélicas de las variantes de polimorfismos PNS de la serie polimórfica, con lo cual construye el mapa genético del individuo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra el método preferente para la clonación de fragmentos de genoma arbitrarios. El ADN del genoma se fracciona según su tamaño y a continuación se introduce en un vector plásmido con el fin de obtener clones arbitrarios. Se diseñan los PCR primers (reacción en cadena de polimerasa, cebadores) y se emplean para secuenciar las secuencias de genoma insertadas

La Figura 2 ilustra los datos resultantes generados por el método preferente para la identificación de nuevas secuencias polimórficas, es decir, una secuenciación cíclica de un fragmento de genoma arbitrario.

La Figura 3 ilustra el método PLFR para aislar clones arbitrarios en secuencias polimórficas. Tras la optimización inicial de las condiciones PCR (arriba), el material amplificado es fragmentado con diversos enzimas de restricción, y se analizan los patrones resultantes (centro). A continuación se lleva a cabo un estudio de la población para determinar las frecuencias alélicas.

La Figura 4 muestra un gráfico con la probabilidad de que dos individuos con un panel determinado de marcadores genéticos tengan genotipos idénticos. El eje de abscisas representa el número de pruebas efectuadas y el eje de ordenadas, la probabilidad acumulada de no-identidad. Leyenda: o indica el prototipo extrapolado; x indica 3 alelos (51%, 34%, 15%); el triángulo indica 2 alelos (79%, 21%).

La Figura 5 muestra un gráfico con la probabilidad de que unos paneles determinados de 20 marcadores genéticos excluyan a un padre arbitrario en una prueba de paternidad en que la madre no está en cuestión. El número de pruebas se representa en el eje de abscisas y la probabilidad en el eje de ordenadas. La línea horizontal indica el 0,95% de probabilidad de exclusión. La leyenda es la misma que para la Figura 4.

La Figura 6 ilustra en la Tabla 1 la organización de las secuencias a partir del PNS identificado en el clon 177-2.

La Figura 7 ilustra el método preferente PNS para la determinación del genotipo. Las siete etapas ilustran cómo efectuar un GBA a partir de una muestra biológica.

Las Figuras 8A y 8B ilustran cómo aparecen los datos de parentesco equino en el nivel de un macho de microtitulación.

Descripción de las formas de realización preferidas I. Los polimorfismos de nucleótido simple de la presente invención y las ventajas de su uso en análisis genéticos A. Los atributos de los polimorfismos

Las secuencias de genes particulares de interés para la presente invención incluyen "polimorfismos de nucleótido simple". Un "polimorfismo" es una variación en la secuencia de ADN de algunos miembros de una especie. Los genomas de los animales y las plantas sufren de manera natural mutaciones espontáneas en el curso de su continua evolución (Gusella, J.F., Ann. Rev. Biochem. 55:831-854 (1986)). La mayoría de tales mutaciones crean polimorfismos. La secuencia mutada y la secuencia inicial coexisten en la población de la especie. En algunos casos, esta coexistencia está en equilibrio estable o cuasiestable. En otras ocasiones, la mutación otorga una ventaja para la supervivencia o evolutiva a la especie y, consecuentemente, puede eventualmente (esto es, en términos de tiempos evolutivos) llegar a quedar incorporada al ADN de todos los individuos de aquella especie.

Un polimorfismo se denomina "alélico" porque, debido a la existencia de un polimorfismo, algunos individuos de una especie pueden tener la secuencia no mutada (es decir, el "alelo" original), a la vez que otros pueden tener la secuencia mutada (esto es, el alelo variante o mutado). En el caso más simple, sólo existe una secuencia mutada, y se dice que el polimorfismo es dialélico. los polimorfismos dialélicos son los más comunes y los preferentes para la presente invención. La ocurrencia de mutaciones alternativas puede dar lugar a polimorfismos trialélicos, etc. Un alelo puede ser definido por el nucleótido o los nucleótidos que involucra la mutación. Así, por ejemplo, en la Tabla 1, el clon 177-2 (Id. sec. Nº: 1 y id. sec. Nº: 2) ilustra la secuencia de una hebra de un polimorfismo dialélico en el cual un alelo tiene una "C" y el otro alelo una "T" en la posición polimórfica.

La presente invención se dirige a una clase particular de polimorfismos alélicos y a su empleo para el genotipado de una planta o un animal. Estos polimorfismos alélicos se van a denominar a partir de ahora "polimorfismos de nucleótido simple", o PNS. Los polimorfismos de nucleótido simple vienen definidos por los atributos siguientes. Un atributo central de un polimorfismo de este tipo es que contiene un lugar polimórfico, X, preferentemente ocupado por un único nucleótido, que es el lugar de la variación entre las secuencias del alelo. Una segunda característica de un PNS es que, preferentemente, el lugar polimórfico X va precedido y seguido por secuencias del alelo invariantes. El lugar polimórfico del PNS se dice que yace así "inmediatamente" 3' hacia una secuencia "5'-proximal" invariante, o "inmediatamente" 5' hacia una secuencia "3'-distal" invariante. Estas secuencias flanquean el lugar polimórfico.

Tal y como se ha venido haciendo hasta aquí, se dice que una secuencia de un alelo es "invariante" si la secuencia no presenta variaciones en la población de la especie, y si se trazara el mapa genético, la secuencia "correspondiente" remitiría al mismo alelo en el genoma de todos los miembros de la población de la especie. Se dice que dos secuencias son secuencias "correspondientes" si son análogas la una respecto a la otra y se han obtenido a partir de orígenes distintos. Las secuencias de genes codificantes de la hemoglobina en dos seres humanos sirven como ejemplo de secuencias alélicas correspondientes. Hasta aquí se ha pretendido aclarar, la definición que se ha venido utilizando de "alelos correspondientes", aunque no alterar el significado de este término tal como es entendido comúnmente por cualquier especialista en este ámbito. Cada fila de la Tabla 1 muestra la identidad de un nucleoide de la posición polimórfica de alelos "correspondientes" equinos, además de las secuencias 5'-proximal y 3'-distal invariantes, que también son atributos de aquel PNS. La Tabla 5 muestra "alelos correspondientes" relativos a seres humanos. Cada fila de la Tabla 5 muestra la identidad del nucleótido de la posición polimórfica de alelos correspondientes humanos, además de las secuencias 5'-proximal y 3'-distal invariantes, que también son atributos de aquel PNS.

Puesto que el ADN genómico es una cadena de doble hebra, cada PNS puede definirse en términos de cada una de las hebras. Así, para cada PNS, una hebra contendrá una secuencia inmediatamente 5'-proximal invariante y la otra contendrá una secuencia inmediatamente 3'-distal invariante. En la forma de realización preferente , en que la posición polimórfica del PNS, X, es un único nucleótido, cada hebra de la cadena doble del ADN del PNS contendrá tanto una secuencia inmediatamente 5'-proximal invariante como una secuencia 3'-distal invariante.

Aunque los PNS preferentes para la presente invención involucran una sustitución de un nucleótido por otro en la posición polimórfica del PNS, los PNS también pueden presentar formas más complejas e involucrar la delección de un nucleótido de, o la inserción de un nucleótido en una de las dos secuencias correspondientes. Por ejemplo, una secuencia de genes concreta puede contener una A en una posición polimórfica particular en algunos animales, mientras que en otros animales puede haber en aquella posición una delección de base simple o múltiple. Aunque los PNS preferentes para esta invención tienen tanto una secuencia proximal invariante como una secuencia distal invariante, los PNS pueden tener sólo una secuencia proximal invariante o una secuencia distal invariante.

Las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia complementaria a la de una secuencia inmediatamente 3'-distal invariante de un PNS pueden, si se replican "siguiendo un molde", formar un producto replicado que contendría la posición polimórfica del PNS. Un ejemplo preferente de molécula tal de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico cuya secuencia sea la misma que la de una secuencia 5'-proximal invariante del PNS. Replicar "siguiendo un molde" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mediar la réplica de un primer de modo tal que la secuencia replicada sea complementaria de la secuencia de un molde de ácido nucleico. Un primer es un oligonucleótido de hebra única o un polinucleótido de hebra única capaz de ser replicado por adición covalente de un nucleótido en una reacción de replicación "según un molde". Para poseer dicha capacidad, el primer ha de tener un radical 3'-hidroxil y pasar por un proceso de hibridación hacia una segunda molécula de ácido nucleico (esto es, el "molde"). Un primer consta típicamente de 11 bases o más; preferentemente, un primer tendrá 20 bases, aunque también servirán primers de longitudes menores o mayores. Una "polimerasa" es una enzima capaz de incorporar trifosfatonucleósidos para replicar un grupo 3'-hidroxil de una molécula de ácido nucleico. Se puede hallar una discusión acerca de las enzimas de polimerasa en Watson, J.D., en: Molecular Biology of the gene, 3ª ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977) y en textos similares. Otras polimerasas como el gran fragmento proteolítico de la ADN-polimerasa I de la bacteria E. coli, conocido comúnmente como polimerasa "Klenow", ADN-polimerasa I de E. coli y ADN-polimerasa T7 bacteriófaga, también pueden emplearse para llevar a la práctica el método descrito aquí. Es posible conseguir la ligación, siguiendo un molde, de ácidos nucleicos que presentan la misma secuencia que los de la secuencia inmediatamente 3'-distal invariante de un PNS a un primer cuya secuencia sea la misma que la secuencia inmediatamente 5'-proximal que ha sido replicada por un nucleótido siguiendo un molde.

B. Las ventajas de utilizar PNS en análisis genéticos

Las posiciones polimórficas de nucleótido simple de la presente invención pueden ser utilizadas para analizar el ADN de cualquier planta o animal. Estas posiciones resultan especialmente aptas para analizar el genoma de los mamíferos, entre los cuales se pueden incluir seres humanos, primates no humanos, animales domésticos (perros, gatos, etc.), animales de granja (vacuno, ovino y otras reses) y otros animales cuya relevancia económica es significativa, en particular, caballos. Sin embargo, también pueden ser utilizadas en relación con otros tipos de animales en particular, aves (pollos, pavos, etc.). Los polimorfismos de tipo PNS presentan diversas ventajas notables respecto a los de tipo PLFR, CRP y RPNV.

En primer lugar, los PNS se dan con mayor frecuencia (aproximadamente entre 10 y 100 veces más) y mayor grado de uniformidad que los PLFR y los RPNV. Una mayor frecuencia de los PNS significa que pueden ser identificados con mayor presteza que los otros tipos de polimorfismos. La mayor uniformidad de su distribución permite la identificación de PNS "más próximos" a un cierto rasgo de interés particular. El efecto combinado de estos atributos convierten a los PNS en polimorfismos altamente valiosos. Por ejemplo, si una característica particular (por ejemplo, predisposición a padecer cáncer) refleja una mutación en un locus particular, cualquier polimorfismo asociado a aquel locus particular puede servir para estimar la probabilidad de que un individuo exhiba dicha característica.

El valor de tal estimación viene determinado en parte por la distancia entre el polimorfismo y el locus. Así, si el locus se halla lejos de cualquier patrón de secuencia de nucleótidos repetidos a pares, los análisis RPNV serán de valor muy limitado. De modo parecido, si el locus está lejos de cualquier PLFR detectable, un análisis PLFR no sería de precisión. Sin embargo, dado que la presencia de PNS es de aproximadamente uno por cada 300 bases del genoma de los mamíferos y presenta una distribución uniforme, estadísticamente puede hallarse un PNS por cada 150 bases, independientemente de cualquier lesión o mutación genética particular. Ciertamente, la mutación particular puede ser en sí misma un PNS. En ese caso, la variación del nucleótido en ese locus de la secuencia es determinante de la característica en cuestión.

En segundo lugar, los PNS son más estables que otras clases de polimorfismos. Su ritmo de mutación espontánea es de en torno a 10^{-9}, aproximadamente 1.000 veces menos frecuente que el de los RPNV. Notablemente, los polimorfismos de tipo RPNV se caracterizan por ritmos de mutación altos.

Tercero, los PNS presentan la ventaja añadida de que su frecuencia alélica puede ser inferida a partir del estudio de relativamente pocas muestras representativas. Estas características de los PNS permiten alcanzar niveles de resolución genética de identidad, prueba de paternidad y análisis de predisposición a determinados rasgos genéticos en animales que no son posibles con los polimorfismos PLFR ni con los RPNV.

Cuarto, los PNS presentan la definición de información genética más alta posible: la posición del nucleótido y la identidad de la base. A pesar de proporcionar un nivel de definición tan alto, los PNS pueden ser detectados con mayor presteza que los PLFR o los RPNV, y con una mayor flexibilidad. Al ser, en efecto, el ADN una cadena de doble hebra, es posible analizar la hebra complementaria del alelo para confirmar la presencia y la identidad de cualquier PNS.

La flexibilidad con que puede caracterizarse un PNS identificado es un aspecto notable de los PNS. Los polimorfismos del tipo RPNV, por ejemplo, son más fáciles de detectar por métodos de fraccionamiento según tamaño que pueden discernir una variación en el número de las repeticiones. Los PLFR se detectan más fácilmente por métodos de fraccionamiento según tamaño tras su digestión por restricción.

En contraste, los PNS pueden ser caracterizados por una amplia variedad de métodos. Entre estos métodos se incluyen la secuenciación directa o indirecta de la posición, el uso de enzimas de restricción donde los respectivos alelos del lugar crean o destruyen una posición de restricción, el empleo de sondas de hibridación específicas de alelo, la utilización de anticuerpos específicos para las proteínas codificadas por los diferentes alelos del polimorfismo, o por medio de interpretación biomédica.

El método "Análisis de bit genético" (ABG) desarrollado por Goelet, P. y otros (WO 92/15712) y discutido a continuación es un método preferente de la presente invención para la detección de los polimorfismos de nucleótido simple. ABG es un método de averiguación de posiciones polimórficas en que la información de la secuencia de nucleótidos alrededor de la posición de la variación en una secuencia del ADN original se emplea para diseñar un primer oligonucleótido que sea complementario a la región inmediatamente adyacente, pero que no incluya, al nucleótido variable del ADN original. El molde de ADN original se selecciona a partir de la muestra biológica y se hibrida para transformarlo al primer de averiguación. Este primer se amplía con un solo didesoxinucleótido etiquetado usando la ADN-polimerasa en presencia de dos, y preferentemente los cuatro precursores de las cadenas de los radicales de trifosfatonucleósidos. Cohen, D. y otros (solicitud PCT WO91/02087) describe un método de genotipificación relacionado.

Recientemente se han descrito algunos procesos de incorporación guiada de nucleótidos al primer para hallar posiciones polimórficas en el ADN (Kohmer, J.S. y otros, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Solokov, B.P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvänen, A.-C. y otros, Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M.N. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T.R. y otros, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. y otros, GATA 9:107-112 (1992); Nyrén, P. y otros, Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos métodos se diferencian del método ABG en que se basan en incorporar desoxinucleótidos etiquetados para distinguir las bases en posiciones polimórficas. De esta forma, dado que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos del mismo nucleótido que ocurren en un segmento dan lugar a señales proporcionales a la longitud del segmento (Syvänen, A.-C. y otros, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)). El espectro de señales de este tipo, específicos del locus, podría ser más complejo de interpretar, sobre todo para heterozigotos, en comparación con la sencilla clase ternaria (2:0, 1:1 o 0:2) de señales producidas por el método ABG. Además, la incorporación de un desoxinucleótido incorrecto puede ocurrir en algunos loci incluso en la presencia del didesoxinucleótido correcto (Kohmer, J.S. y otros, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)). Estos casos de incorporación errónea de desoxinucleótidos pueden deberse a que el factor K_{m} de la ADN-polimerasa para el sustrato desoxi- desparejado sea comparable, en algunos contextos de la secuencia, al relativamente pobre K_{m} de, incluso, un sustrato de base didesoxi- correctamente emparejado (Kornberg, A. y otros, en: DNA Replication, 2ª ed. W.H. Freeman and. Co. (1992), Nueva York; Tabor, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86 :4076-4080 (1989)). Este efecto contribuiría al ruido de fondo del análisis de averiguación de posiciones polimórficas.

II. Métodos para el descubrimiento de posiciones polimórficas nuevas

Un método preferente para descubrir posiciones polimórficas implica una secuenciación comparativa de fragmentos genómicos del ADN a partir de unos cuantos genomas haploides. En la forma de realización preferente, ilustrada en la Figura 1, la secuenciación se lleva a cabo a partir de una biblioteca genómica de fragmentos de ADN aleatorios que contiene 0,5-3 kb fragmentos de ADN obtenidos de un individuo de una especie. Las secuencias obtenidas por recombinación aleatoria de estos fragmentos se emplean entonces para obtener secuenciaciones PCR, correspondientes a los mismos loci genómicos, de algunos individuos de aquella especie seleccionados arbitrariamente.

A partir de estas bibliotecas genómicas (típicamente, de alrededor de unos 50.000 clones), varios centenares de clones individuales son purificados, y determinadas las secuencias de sus radicales de inserción. Sólo es necesario conseguir una pequeña cantidad de datos de la secuencia radical (100-200 bases) para obtener una amplificación PCR de la región clonada. El propósito de la secuenciación es obtener suficiente información para permitir la síntesis de primers adecuada para mediar la amplificación de los fragmentos equivalentes a partir de muestras del ADN genómico de otros miembros de la especie. Preferentemente, estas determinaciones de secuencias se llevan a cabo mediante algun tipo de metodología de ciclo secuenciador.

Los primers se usan para amplificar el ADN a partir de un panel de individuos de la especie considerada seleccionados arbitrariamente. El número de individuos que constituyen el panel determina la frecuencia más baja de los polimorfismos que se van a aislar. Así, si se evalúan seis individuos, un polimorfismo cuya frecuencia sea de, por ejemplo, 0,01 podría no ser identificado. En un ilustrativo aunque muy simplificado tratamiento matemático, a partir de una muestra de seis individuos se esperaría identificar sólo aquellos polimorfismos que se dan con una frecuencia mayor de un valor de en torno a 0,08 (esto es, la frecuencia total 1,0 dividida por 6 individuos y dividido por 2 alelos por genoma). Luego, si uno pretendo identificar polimorfismos menos frecuentes, es necesario evaluar un panel de mayor número de individuos.

Algunos instrumentos de secuenciación automatizada de ADN y algunas aplicaciones de software (Applied Biosystems, Inc.) facilitan el análisis cíclico de secuencias (Mullis, K. y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich H. y otros, solicitud de patente europea 50.424; solicitud de patente europea 84.796, solicitud de patente europea 258.017, solicitud de patente europea 237.362; Mullis, K., solicitud de patente europea 201.184; Mullis, K. y otros, patente E.E.U.U. nº. 4.683.202; Erlich, H., patente E.E.U.U. nº 4.582.788; y Saiki, R. y otros, patente E.E.U.U. nº 4.683.194). Estas herramientas permiten identificar las diferencias entre secuencias de animales distintos y confirmarlas por simple inspección de la porción relevante de cromatogramas en la pantalla del ordenador. Estas diferencias se interpretan para reflejar un polimorfismo en el ADN sólo si se dispone de los datos correspondientes a las dos hebras, y si se hallan presentes en más de un ejemplo de haploide entre la población de animales examinados. La Figura 2 ilustra el método preferente de identificación de secuencias polimórficas nuevas, que consiste en una secuenciación cíclica de un fragmento genómico arbitrario. Los fragmentos PCR de cinco caballos sin relación entre sí fueron electroeludidos con geles acrilamida y secuenciados por medio de ciclos repetitivos de ADN-polimerasa T_{aq} termoestable en presencia de una mezcla de dNTP y ddNTP fluorescentes. A continuación se separaron los productos y se analizaron con un instrumento de secuenciación de ADN automatizado de Applied Biosystems, Inc. Los datos fueron analizados con un software ABI. Las diferencias entre las secuencias de animales diferentes fueron identificadas por el software y confirmadas por inspección de la porción relevante de cromatogramas en la pantalla del ordenador. Las diferencias se presentan como "polimorfismos del ADN" sólo si se dispone de los datos para las dos hebras y se hallan presentes en más de un ejemplo de haploide entre los cinco caballos examinados. El panel de arriba muestra un homozigoto "A", el panel del centro, un heterozigoto "AT" y el panel de abajo un homozigoto "T".

A pesar de la naturaleza arbitraria de estas búsquedas de polimorfismos, estas secuenciaciones y comparaciones de clones de ADN aleatorios es efectivamente capaz de identificar polimorfismos apropiados. En efecto, en referencia al ejemplo de los caballos, aproximadamente 1/400 nucleótidos secuenciados por estos métodos serían identificados como posiciones polimórficas de tipo PNS.

Alternativamente, el descubrimiento de posiciones polimórficas puede llevarse a cabo por la estrategia que se esquematiza en la Figura 3. En esta forma de realización, los polimorfismos de la secuencia de ADN son identificados por comparación de los perfiles de segmentación de endonucleasa por restricción generados por un panel de diversos enzimas de restricción sobre productos de la reacción PCR a partir de moldes genómicos de individuos no relacionados. Preferentemente, cada nucleasa de restricción empleada tendrá cuatro secuencias para el reconocimiento de bases, y de este modo proporcionará un número deseable de cortes en los productos amplificados.

Los patrones de digestión por restricción obtenidos a partir de los ADN genómicos se comparan, preferentemente, directamente con los patrones obtenidos de los productos PCR generados a partir de los correspondientes moldes plásmidos. Tal comparación proporciona un control interno que indica que las secuencias amplificadas a partir de los ADN genómico y plásmido derivan de loci equivalentes. Este control también permite la identificación de primers que amplifican fortuitamente secuencias repetidas o copias múltiples de loci, ya que generan muchos más fragmentos a partir de los moldes genómicos que a partir de los moldes plásmidos.

III. Métodos de la presente invención para la determinación de genotipo de los polimorfismos de nucleótido simple

Para la presente invención se puede emplear cualquiera de los diversos métodos de identificación de la posición polimórfica, X, de un polimorfismo de nucleótido simple. El método preferente para dicha identificación consiste en discernir directamente la secuencia de la posición polimórfica para cada polimorfismo que se analiza. Esta aproximación difiere, sin embargo, notablemente del método PLFR, la cual analiza patrones de bandas en lugar de propiamente la secuencia específica de un polimorfismo.

A. Métodos de muestreo

Las muestras de especímenes de ácido nucleico de un individuo de la especie objeto de análisis pueden obtenerse por medios "invasivos" o "no invasivos". Un medio de obtención de una muestra recibe el nombre de "invasivo" si obtiene las muestras de ácido nucleico del interior de la piel o los órganos de un animal (incluidos, especialmente, un múrido, ovinos, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y seres humanos). Entre los ejemplos de métodos invasivos se incluyen la extracción de sangre, de semen, la biopsia hipodérmica, la aspiración pleural, etc. Algunos ejemplos de estos métodos se desarrollan en Kim, C.H. y otros (J. Virol. 66:3879-3882 (1992)); Biswas, B. y otros (Annals NY Acad. Sci. 590:582-583 (1990)); Biswas, B. y otros (J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233 (1991)).

Por el contrario, un método de obtención de muestras "no invasivo" obtiene las moléculas de ácido nucleico de alguna superficie interna o externa del animal. Como ejemplos de obtención de muestras por métodos no invasivos se incluyen el uso de torundas y la obtención de lágrimas, saliva, orina, defecaciones, sudor o exudados, etc. Tal y como se emplea en este texto, la expresión "uso de torundas" denota poner en contacto un elemento de aplicación/obtención (la torunda), que consta de algún material adsorbente, con una superficie de modo tal que permita recoger trazas de la superficie y/o células muertas o viejas o restos celulares. Esta obtención puede ser por introducción de la torunda en los orificios nasales, oral, rectal, vaginal o aurales, o bien por contacto directo con la piel o los lacrimales, por recolección de folículos capilares, etc.

Se han empleado torundas nasales para obtener especímenes clínicos para amplificación por PCR (Olive, D.M. y otros, J. Gen. Virol. 71:2141-2147 (1990); Wheeler, J.G. y otros, Amer. J. Vet. Res. 52:1799-1803 (1991)). El uso de folículos capilares para identificar polimorfismos RPNV para las pruebas de paternidad en caballos ha sido descrito en Ellegren, H. y otros (Anim. Genetics 23:133-142 (1992). Los estados de referencia que un sistema de comprobación normalizado basado en polimorfismos microsatélites analizados por PCR pueden acabar siendo una alternativa razonable a la determinación de genoma a partir de una muestra de sangre en las pruebas de paternidad.

Para la obtención del ADN se requerirá preferentemente un tipo de torunda que disponga de algún apoyo sólido, una parte del cual por lo menos estará diseñada para adsorber ADN. La parte diseñada para adsorber ADN puede presentar una textura compresible, como de gomaespuma o similar. Alternativamente, puede presentar una composición fibrosa adsorbente, como algodón, poliéster, nylon o semejante. Aún en otra forma de realización, la parte diseñada para adsorber ADN puede ser alguna materia abrasiva, como un cepillo o pincel, o presentar una superficie rugosa. La parte de la torunda diseñada para adsorber ADN puede ser una combinación de las texturas y composiciones mencionadas arriba (por ejemplo, un cepillo compresible, etc.). La torunda tendrá preferentemente forma de varilla, flecha o champiñón, y dispondrá de un segmento por donde el individuo que recoje la muestra pueda sujetar la torunda, y una punta o extremo que pueda entrar en contacto con la superficie que contiene la muestra de ADN que se pretende obtener. En una forma de realización, la torunda puede disponer de algún tipo de cámara para el almacenamiento de la muestra, por ejemplo un tubo o cilindro de vidrio o plástico, uno de cuyos extremos puede estar abierto, como en un tubo de ensayo. O bien, el tubo puede tener los dos extremos abiertos, de modo que la torunda se puede sujetar por un extremo e introducirse en el tubo por el otro extremo. Y aún, en otra forma de realización, el tubo puede tener los dos extremos abiertos, de tal modo que, tras usar la torunda, el tubo pueda servir de capilar en el tratamiento posterior del ADN obtenido. En una forma de realización, el extremo o los extremos de la cámara de almacenamiento se sellan automáticamente tras haber recogido la muestra.

La torunda o la cámara de almacenamiento pueden contener agentes antimicrobianos en concentraciones suficientes para evitar la proliferación de microbios (bacterias, levaduras, mohos, etc.) durante su subsiguiente almacenamiento y tratamiento.

En una forma de realización, la torunda o la cámara de almacenamiento puede contener un agente cromogénico que reaccione a la presencia de ADN y produzca una señal detectable que pueda ser identificada en el mismo momento de la obtención de la muestra. Preferentemente, este agente deberá tener la concentración mínima para un ensayo de análisis de ADN de "análisis de punto final indeterminado". Este ensayo es capaz de detectar concentraciones de ácidos nucleicos entre un nivel mínimo hasta un nivel máximo de saturación. El nivel de saturación es ajustable, y puede incrementarse por reducción del tiempo de reacción. Entre los agentes reactores cromogénicos se cuentan los anticuerpos anti-ADN conjugados de enzimas, ácido diaminopimélico, etc.

B. Análisis basado en amplificación

El empleo de métodos de amplificación del ADN puede facilitar la detección de posiciones polimórficas en una muestra de ADN. Estos métodos incrementan específicamente la concentración de secuencias que abarcan la posición polimórfica o incluyen aquella posición y secuencias dispuestas tanto distal como proximalmente a ésta. Estas moléculas replicadas pueden detectarse con rapidez por gel para electroforesis u otros medios.

El método preferido para conseguir esta amplificación es el PCR, que parte de unos pares primer que son capaces de hibridar las secuencias proximales que definen un polimorfismo en su forma de doble hebra.

En lugar de PCR pueden emplearse métodos alternativos como la "Ligase Chain Reaction" (LCR) (Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189-193 (1991)). La LCR utiliza dos pares de muestras de oligonucleótidos sonda para conseguir una amplificación exponencial de la sustancia original específica. Las secuencias de cada par de oligonucleótidos se seleccionan de modo tal que el par hibrida las secuencias colindantes de la misma hebra de sustancia analizada. Esta hibridación forma un sustrato para un enlace según molde. Igual que en el PCR, los productos resultantes sirven como molde en los ciclos subsiguientes y se obtiene una amplificación exponencial de la secuencia deseada.

De acuerdo con la presente invención, la LRC puede llevarse a cabo con oligonucleótidos que tengan secuencias proximal y distal de una posición polimórfica en una misma hebra. En una forma de realización, se elegirá cualquier oligonucleótido que incluya la posición polimórfica del polimorfismo. En esta forma de realización, las condiciones de la reacción se eligen de tal modo que los oligonucleótidos sólo pueden enlazarse si la molécula que se replica contiene o carece del nucleótido específico complementario en la posición polimórfica del oligonucleótido.

En una forma de realización alternativa, los oligonucleótidos no incluirán la posición polimórfica, de modo que cuando hibridan la molécula de origen, se crea un "hueco" (gap) (véase Segev, D., aplicación PCT WO 90/01069). Este hueco se "llena" entonces con dNTP complementarios (por medio de ADN-polimerasa) o con pares de oligonucleótidos adicionales. Así, al final de cada ciclo, cada hebra tiene un complemento que puede servir como raíz durante el ciclo siguiente y se obtiene una amplificación exponencial de la secuencia.

Nickerson, D.A. y otros han descrito un ensayo de detección de ácido nucleico que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson, D.A. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8923-8927 (1990)). Este método emplea un PCR para conseguir una amplificación exponencial del ADN, que a continuación se detecta con OLA. Sin embargo, estas combinaciones heredan todos los problemas asociados con PCR y OLA.

También son conocidos (Wu, D.Y. y otros, Genomics 4:560) los esquemas basados en enlaces de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que proporcionan una secuencia resultante de "di-oligonucleótido", los cuales pueden ser fácilmente adaptados a los propósitos de la presente invención.

Otros procedimientos conocidos de replicación de ácido nucleico, como los sistemas de amplificación por transcripción (Malek, L.T. y otros, patente U.S. 5.130.238; Davey, C y otros, solicitud de patente europea 329.822; Schuster y otros, patente U.S. 5.169.766; Miller, H.I. y otros, aplicación OCT WO 89/06700; Kwoh, D. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 86:1173 (1989); Gingeras, T.R. y otros, aplicación PCT WO 88/10315)), o métodos de amplificación isoterma (Walker, G.T. y otros, Proc. Natl. Acad. (U.S.A.) 89:392-396 (1992)).

C. Preparación de ADN de hebra simple

El análisis directo de la secuencia de un PNS de la presente invención puede acometerse ya sea por el "método de terminación de cadena mediante dideoxido", conocido también como el "método Sanger" (Sanger, F. y otros, J. Molec. Biol. 94:441 (1975)) o por el "método por degradación química", también conocido como el "método Maxam-Gilbert" (Maxam, A.M. y otros, Proc. Natul. Acad. Sci. (U.S.A) 74:560 (1977)), ambos a partir de aquí incorporados por referencia. Los métodos de secuenciación de ADN que se basan tanto en el "método de terminación de cadena mediante dideoxido" como en el "método Maxam-Gilbert" son ampliamente conocidos entre aquellas personas expertas en la materia. Dichos métodos se desarrollan, por ejemplo, en Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), y en Zyskind, J.W. y otros, Recombinant DNA Laboratory Manual, Academic Press, Inc. Nueva York (1988).

Donde una molécula de ácido nucleico contiene una doble hebra de ADN (o ARN), o donde se ha empleado un protocolo de amplificación de una doble hebra de ácido nucleico (como PCR), en general es deseable tratar las moléculas de doble hebra antes de efectuar dicho análisis de la secuencia para obtener un preparado que en el que preferentemente se enriquece predominantemente una sola de las dos hebras.

El método más sencillo para generar moléculas de ADN bicatenarias es su desnaturalización por tratamiento con calor o sustancias alcalinas.

Las moléculas de ADN monocatenarias también pueden producirse utilizando la molécula de ADN monocatenaria bacteriófaga M13 (Messing, J. y otros, Meth. Enzymol 101:20 (1983); véase también Sambrook, J. y otros (En: Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

Diversos otros métodos pueden emplearse para generar hebras simples de moléculas de ADN. Gyllensten, U. y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:7652-7656 (1988) y Mihovilovic, M. y otros, (BioTechniques) 7(1) :14 (1989)) describen un método, denominado "PCR asimétrico", en que el método estándar PCR se lleva a cabo a partir de diversas concentraciones molares de primers. Higuchi, R.G. y otros (Nucleic Acids Res. 17:5865 (1985)) ejemplifica un método adicional para amplificar hebras simples de productos. El método involucra la fosforilación del radical 5' de una de las hebras de la doble cadena del producto que se desea amplificar, para a continuación permitir que una
5' \rightarrow 3' exonucleasa (por ejemplo, la exonucleasa) degrade la hebra fosforilada.

Otros métodos han explotado las propiedades de resistencia de las nucleasas de compuestos tiofosfatados para generar hebras simples de moléculas de ADN (Benkovic y otros, patente U.S. nº 4.521.509; 4 de junio, 1985); Sayers, J.R. y otros (Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Eckstein, F. y otros, Biochemistry 15:1685-1691 (1976); Ott, J. y otros, Biochemistry 26:8237-8241 (1987)).

En Nikiforov, T. (solicitud de patente U.S. número de serie 08/005.061, correspondiente a WO94/16090, publicada el 21 de julio de 1994) se discuten las ventajas y los inconvenientes relativos de estos métodos de producción de moléculas de hebra simple.

Estas moléculas de hebra simple se producirán preferentemente por los métodos descritos por Nikiforov, T. (supra). En pocas palabras, estos métodos utilizan compuestos de nucleótidos resistentes a nucleasas e incorporan estos compuestos, por síntesis química o enzimas, a las moléculas primer, o a su producto ampliado, en el lugar de los nucleótidos que se dan de manera natural.

Los compuestos de nucleótidos adecuados incluyen compuestos en que uno o dos de los oxígenos no enlazantes del fosfato central de un nucleótido han sido sustituidos por algún grupo sulfuro- (especialmente un tiofosfato), por un grupo alquil (especialmente un metil o un etil), un grupo nitrógeno- (especialmente un amina) y/o un grupo selenio-, etc.

Los compuestos desoxirribonucleicos o ribonucleicos fosforotiados (por ejemplo, un nucleósido 5'-O-1-tiotrifosfato) son los compuestos de nucleótidos preferidos. Para producir estos compuestos tiofosfatados se puede emplear cualquiera de los diversos métodos químicos que existen (véase, por ejemplo, Zon, G. y otros, Anti-Canc. Drug Des. 6:539-568 (1991); Kim, S.G. y otros, Biochem. Biophys. Res Commun. 179:1614-1619 (1991); Vu, H. y otros Tetrahedron Lett. 32:3005-3008 (1991); Taylor, J.W. y otros, Nucl. Acids Res. 13:8749-8764 (1985); Eckstein, F. y otros, Biochemistry 15:1685-1691 (1976); Ott, J. y otros Biochemistry 26:8237-8241 (1987); Ludwig, J. y otros, J. Org. Chem. 54:631-635 (1989)). Los compuestos de nucleótidos tiofosfatados también pueden obtenerse comercialmente en Amersham o Pharmacia.

Es importante que el compuesto del nucleótido seleccionado permita su replicación in vitro por primer y confiera resistencia a exonucleasas hasta la zona de la molécula de ácido nucleico donde se incorpore. En la forma de realización preferente, este compuesto ha de conferir resistencia a las exonucleasas que atacan la cadena doble de ADN desde el extremo 5' (5' \rightarrow 3' exonucleasas). Ejemplos de estas exonucleasas incluyen la exonucleasa 6 gen T7 bacteriófaga ("T7 exonucleasa") y la exonucleasa lambda bacteriófaga ("\lambda exonucleasa"). Tanto la T7 exonucleasa como la \lambda exonucleasa están significativamente inhibidas por la presencia de enlaces tiofosfatados para permitir la degradación selectiva de las hebras. Sin embargo, es posible utilizar cualquier 5' \rightarrow 3' exonucleasa específica de cadena doble para este proceso, puesto que su actividad se ve afectada por la presencia de los enlaces de los compuestos de nucleótidos resistentes a nucleasas. El enzima preferido al utilizar compuestos tiofosfatados es la T7 exonucleasa 6 gen bacteriófaga, que presenta una actividad enzimática máxima en la misma solución tampón utilizada para muchas soluciones tampón de ADN-polimerasa, incluida la polimerasa T_{aq}. Las propiedades de resistencia de la 5' \rightarrow 3' exonucleasa de las moléculas de ADN que contienen compuestos tiofosfatados se discuten, por ejemplo, en Kunkel, T.A. (En: Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 2, 124-135 (Eckstein, F y otros, ed.), Springer-Verlag, Berlín, (1988)). Las propiedades de resistencia de la 3' \rightarrow 5' exonucleasa de los nucleótidos tiofosfatados que contienen moléculas de ácido nucleico se discuten en Putney, S.D. y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:7350-7354 (1981) y Gupta, A.P. y otros (Nucl. Acids. Res. 12:5897-5911 (1984)).

Además de ser resistentes a estas exonucleasas, las moléculas de ácido nucleico que contienen compuestos tiofosfatados en posiciones de reconocimiento de segmentaciones de endonucleasa por restricción son resistentes a estas segmentaciones. Taylor, J.W. y otros (Nucl. Acids Res., 13:8749-8764 (1985)) discuten las propiedades de resistencia a la endonucleasa de los nucleótidos tiofosfatados que contienen moléculas de ácido nucleico.

La resistencia a la nucleasa de los enlaces tiofosfatos se ha utilizado en el protocolo de amplificación de ADN (Walker, T.G. y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:392-396 (1992)). En el método de Walker y otros, los compuestos de nucleótidos tiofosfatados se insertan en una posición de reconocimiento de endonucleasa por restricción en una hebra de una molécula de ADN bicatenaria. La presencia de los compuestos de nucleótidos tiofosfatados protege aquella hebra de segmentaciones, y el resultado es que la endonucleasa segmenta la hebra desprotegida. La amplificación se consigue repitiendo la segmentación y la polimerización de las hebras.

De un modo parecido, la resistencia a los ataques de la nucleasa se ha empleado como base para un método de secuenciación Sanger modificado (Labeit, S y otros (DNA 5:173-177 (1986)). En el método Labeit y otros se empleaban compuestos de nucleótidos tiofosfatados de etiquetados con ^{35}S en lugar de los dideoxinucleótidos del método Sanger.

En la forma de realización preferente, el compuesto tiofosfatado se incluye en el primer. El compuesto del nucleótido puede ser incorporado al radical 5' en cualquier posición del primer, preferentemente adyacente a otro. Preferentemente, las moléculas primer tendrán una longitud aproximada de unos 25 nucleótidos y contendrán en torno a entre un 4% y un 40%, y más preferentemente un 16%, de residuos de tiofosfatos (comparados con los residuos totales). Los nucleótidos pueden ser incorporados a cualquier posición del primer y estar adyacentes a otro, o esparcidos por todo o por una parte del primer.

En una forma de realización, la presente invención puede emplearse conjuntamente con un protocolo de amplificación, por ejemplo, PCR. En esta forma de realización es preferente limitar el número de enlaces tiofosfatados de los primers a unos 10 (o aproximadamente la mitad de la longitud de los primers), de modo que los primers puedan ser usados en una reacción PCR sin ningún tipo de cambios en el protocolo PCR que se haya establecido para los primers no modificados. Cuando los primers contienen más enlaces tiofosfatados, es posible que las condiciones PCR requieran ajustes, especialmente por lo que respecta a las temperaturas templadas, para optimizar la
reacción.

La incorporación de estos compuestos de nucleótidos al ADN o ARN puede conseguirse por la acción enzimática¡ de una ADN-polimerasa (Vosberg, H.P. y otros, Biochemistry, 16:3633-3640 (1977); Burgers, P.M.J. y otros, J. Biol. Chem. 254:6889-6893 (1979); Kunkel, T.A., en: Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 2, 124-135 (Eckstein, F. y otros, ed.), Springer-Verlag, Berlín (1988); Olsen, D.B. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:1451-1455 (1990); Griep, M.A. y otros, Biochemistry 29:9006-9014 (1990); Sayers, J.R. y otros, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)). Alternativamente, es posible incorporar sintéticamente compuestos de nucleótidos tiofosfatados en un oligonucleótido (Zon, G. y otros, Anti-Canc. Drug Des. 6:539-568 (1991)).

Las moléculas primer se hibridizan a una molécula complementaria del ácido nucleico original, y a continuación se replican, preferentemente por medio de una polimerasa, hasta formar el producto amplificado. La presencia de los nucleótidos tiofosfatados en los primer proporciona al producto amplificado resistencia a los ataques de las nucleasas. Como se ha indicado, los productos amplificados que contienen tiofosfatos u otros compuestos de nucleótidos adecuados son sustancialmente resistentes a su "eliminación" (es decir, su degradación) por 5' \rightarrow 3' exonucleasas tales como la T7 exonucleasa o la exonucleasa; así, una 5' \rightarrow 3' exonucleasa será sustancialmente incapaz de seguir degradando una molécula de ácido nucleico tras encontrarse con un residuo de tiofosfato.

Puesto que la molécula objetivo carece de residuos resistentes a nucleasas, al incubar el producto objetivo y su "molde" -la muestra original- en presencia de una 5' \rightarrow 3' exonucleasa, la hebra que actúa de "molde" se destruye y se obtiene la producción preferente de la hebra simple deseada.

D. Unión del ADN en fase sólida

El método preferente para determinar la identidad de la posición polimórfica de un polimorfismo consiste en la hibridación del ácido nucleico. Aunque dicha hibridación puede llevarse a cabo en una disolución (Berk, A.J. y otros, Cell 12:721-732 (1977); Hood, L.E. y otros, en: Molecular Biology of Eukariotic Cells: A Problems Approach, Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings (1975); Wetmer, J.G., Hybridization and Renaturation Kinetics of Nucleic Acids, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 5:337-361 (1976); Itakura, K. y otros, Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)), es preferible emplear un ensayo de hibridación en fase sólida (véase Saiki, R.K. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6230-6234(1989); Gilham y otros, J. Amer. Chem. Soc. 86:4982 (1964) y Kremsky y otros, Nucl. Acids Res. 15:3131-3139 (1987)).

Para inmovilizar los oligonucleótidos al soporte sólido puede emplearse cualquiera de los diversos métodos que existen. Uno de los más ampliamente usados para conseguir esta inmovilización de oligonucleótidos primer para su uso posterior en ensayos de hibridización consiste en el recubrimiento no covalente de estas fases sólidas con estreptavidina o avidina e inmovilizar a continuación los oligonucleótidos biotinilados (Holmstrom, K. y otros, Anal. Biochem. 209:278-283 (1993)). Otro conocido método (Running J.A. y otros, BioTechniques 8: 276-277 (1990); Newton, C.R. y otros, Nucl. Acids Res. 21:1155-1162 (1993)) requiere el prerecubrimiento de las fases sólidas de poliestireno o vidrio con poli-L-Lis o poli L-Lis, Phe, seguido de la unión covalente de los oligonucleótidos modificados con amino- o sulfidril- por medio de agentes bifuncionales de enlace cruzado. Ambos métodos presentan los inconvenientes de que requieren el uso de oligonucleótidos modificados y además un pretratamiento de la fase sólida.

En otro método publicado (Kawai, S y otros, Anal. Biochem, 209:63-69), algunos oligonucleótidos sonda cortos se unían para formar polímeros que se unían en un vector fago. Tras una amplificación in vitro y el aislamiento de la forma monocatenaria de estos fagémidos, se inmovilizaban en placas de poliestireno y se fijaban con radiación ultravioleta a 254 nm. Las sondas inmovilizadas de este modo se empleaban para capturar y detectar un producto PCR con biotina.

También ha sido publicado un método para la unión covalente directa de primers cortos 5'-fosforilados a placas de poliestireno modificadas químicamente (placas "Covalink", Nunc) (Rasmussen, S.R. y otros, Anal. Biochem. 198:138-142 (1991)). La unión covalente de los oligonucleótidos modificados y la superficie de la fase sólida se induce por condensación en una disolución acuosa de un carbodiamida. Este método reivindica que garantiza una unión predominantemente 5' de los oligonucleótidos a través de sus 5'-fosfatos; sin embargo, requiere el uso de placas especialmente preparadas de alto coste económico.

Esta inmovilización de oligonucleótidos (preferentemente entre 15 y 30 bases) se consigue preferentemente por un método que permite su uso directo, sin necesidad de ningún tipo de pretatamiento, gracias a unas placas con pocillos de poliestireno disponibles comercialmente (placas ELISA), o láminas de vidrio microscópicas. Puesto que se emplean hasta 96 placas de poliestireno en los análisis ELISA, se ha despertado un significativo interés por el desarrollo de métodos de inmovilización de oligonucleótidos primer cortos a los pocillos de estas placas para los posteriores ensayos de hibridación. También resulta de interés un método de inmovilización en láminas de vidrio microscópicas, puesto que estas últimas se emplean en el así denominado Ensayo de lámina inmunoenzimática [Slide Inmunoenzymatic Assay] (SIA) (de Macario, E.C. y otros, BioThecniques 3:138-145) (1985)).

El soporte sólido puede ser vidrio, plástico, papel, etc. El soporte puede presentar cualquier forma, globular, de varilla, tubo de ensayo, etc. En una forma de realización preferente, el soporte será un microdisco de titulación que poseerá varios pocillos. Los microdiscos de titulación de 96 pocillos convencionales empleados en laboratorios de diagnóstico y en el cultivo de tejidos son un soporte preferente. El uso de este tipo de soporte permite determinar simultáneamente un gran número de muestras y controles, y facilitar así el análisis. Para analizar las posiciones polimórficas pueden utilizarse sistemas automáticos de distribución, y los análisis pueden llevarse a cabo por espectrómetros automatizados.

Un aspecto de la presente invención concierne a un método de inmovilización de los oligonucleótidos para su análisis. De acuerdo con el método, cualquiera de los diversos tipos de placas de poliestireno disponibles comercialmente puede emplearse directamente para la inmovilización, dado que poseen una superficie hidrofílica. Algunos ejemplos de placas adecuadas incluyen las cuatro placas Immulon™ (Dynatech) y las placas Maxisorp™ (Nunc). Los oligonucleótidos quedan inmovilizados en las placas simplemente por incubación en presencia de una sal adecuada. En ausencia de una sal, es decir, cuando el oligonucleótido se halla presente en solución acuosa, no se produce inmovilización alguna. Algunos ejemplos de sales adecuadas son: 50-250 mM NaCl; 30-100 mM hidrocloruro de 1 etil-3-(3'-dimetilaminopropil) carbodiamina (EDC), 6,8 pH; 50-150 mM hidrocloruro de octilmetilamina, 7,0 pH; 50-250 mM cloruro de tetrametilamonio. La incubación para la inmovilización dura preferentemente entre 3 y 24 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, las placas se lavan, preferentemente con una disolución de 10 mM Tris HCl, 7,5 pH, que contenga 150 mM NaCl y 0,005% vol. Tween-20 (TNTw). El último ingrediente cumple el importante papel de bloquear todas las posiciones de unión de los nucleótidos libres aún presentes en la superficie del poliestireno, de modo que no se produzca ninguna unión de oligoestirenos no específica durante las etapas de hibridación subsiguientes. El uso de oligonucleótidos marcados radioactivamente ha permitido determinar que la cantidad de oligonucleótidos inmovilizados por pocillo es de por lo menos 500 fmol. La inmovilización de los oligonucleótidos en la superficie de la placa es bastante estable y sólo es posible eliminar los oligonucleótidos de la superficie por incubación en disoluciones 0,5 M NaoH a altas temperaturas durante períodos prolongados. No es posible eliminar los oligonocleótidos de la placa con un simple lavado con agua, TNTw (Tween 20), PBS, 1,5 molar o disoluciones parecidas.

Los oligonucleótidos inmovilizados pueden capturar secuencias específicas de ADN por hibridación. La hibridación se suele llevar a cabo en una disolución de NaCl 1,5 M y EDTA 10 mM, durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. También es posible preparar otras condiciones de hibridación. Se ha determinado que los oligonucleótidos inmovilizados de un solo pocillo hibridan más de 400 fmol de una secuencia específica de ADN. Este ADN se une a los oligonucleótidos inicialmente inmovilizados por enlaces de hidrógeno Watson-Crick, que pueden retirarse fácilmente de los pocillos con un simple lavado con una disolución de NaCl 0,1 M, sin que se eliminen de la placa los oligonucleótidos inicialmente unidos. Si el fragmento de ADN capturado no está marcado radioactivamente, es decir, con un residuo de biotina, su detección también puede efectuarse con un ensayo de unión enzimática adecuado.

Aunque el método no requiere introducir modificaciones en los oligonucleótidos sintéticos, si se desea, permite la inmovilización de oligonucleótidos etiquetados (por ejemplo, con biotina). La cantidad de oligonucleótidos que pueden inmovilizarse en un único pocillo de una placa ELISA por este método es de como mínimo 500 fmol. Los oligonucleótidos así inmovilizados en fase sólida pueden hibridar "moldes" adecuados y también participar en reacciones enzimáticas como amplificaciones dirigidas según "molde" y ligamientos.

Para aplicaciones que requieren grandes volúmenes de ensayos, son deseables métodos de detección no radioactivos. En estos casos es preferible el uso de dideoxinucleótidos haptenados; los dideoxinucleótidos con biotina son preferentemente aptos porque dicha modificación proporciona una base detectable por medio de enzimas conjugados de avidina (o estreptavidina) estándares utilizados en los ensayos ELISA. Los ddNTPs con biotina se preparan preferentemente por reacción de los cuatro respectivos (3-aminopropin-1-il) trifosfatonucleósidos con sulfosuccinimidil 6-(biotinamido) exanoatos. Así, los (3-aminopropin-1-il) 5'-trifosfatonucleósidos se preparan tal como se describe en Hobbs, F.W. y otros (J. Org. Chem. 54: 3420-3422 (1989)) y en Hobbs, F.W. y otros (patente U.S. número 5.047.519). El (3-aminopropin-1-il) 5'-trifosfatonucleósido (50 mol) se disuelve en una disolución acuosa 1 M de 1 ml, de 7,6 pH, de bicarbonato trietilamonio (BTEA). Se añade sal de sulfosuccinimidil 6-(biotinamido) exanoato de sodio (Pierce, 55,7 mg, 100 mol) y la disolución se calienta a 50º en un tubo tapado durante 2 horas. La mezcla reactiva se diluye a 10 ml con agua y se aplica a un capilar DEAE-Sephadex A-25-120 (1,6 x 19 cm). La columna se eluye con una disolución acuosa de BTEA (0,1 M a 1,0 M) de pH 7,6 con gradiente lineal manteniendo el eluyente a 270 nm . El pico más alto del levigante final se recoge, se aparta y se evapora conjuntamente con etanol. El producto bruto, que contiene trifosfatonucleósido biotinilado y, en algunos casos, material inicial contaminante, se purifica por cromatografía capilar de fase inversa (empaquetado Baker C-18, lecho de 2 x 12 cm ). El material se carga en una disolución de BTEA 0,1 M de 7,6 pH y se leviga con un gradiente escalonado de acetonitrilo en una BTEA 0,1 M de 7,6 pH (0% a 36%, en incrementos de 2%, 8 ml/etapa). En cualquier caso, el producto biotinilado queda fijado con mayor firmeza y se detecta con mayor nitidez a partir del material de partida. Las fracciones que contienen el producto se retienen, se apartan y se evaporan conjuntamente con etanol. El producto se mete en agua y el resultado se calcula por el coeficiente de absorción para los nucleótidos de partida. Los espectros NMR del ^{3}H y del ^{31}P son consistentes con la estructura esperada y confirman la ausencia de contenido en fósforo o de impurezas de otros compuestos de nucleótidos. Se ha observado que por HPLC los materiales alcanzan niveles de pureza superiores al 99% (Waters Bondapak C-18, 4,6 x 250 mm, 1 ml/min, 1 a 35% CH_{3}CN/pH 7/0,01 M acetato
trietilamonio).

La síntesis de 5(-3(-6-biotinamida(hexanoamida))propin-1-il)-2', 3'-dideoxiuridina-5'-trifosfato presenta un resultado aproximado del 25% (asumiendo = 12.400 a 291,5 nm); HPLC t_{x} = 16,1 min.

La síntesis de 5(-3(-6-biotinamida(hexanoamida))propin-1-il)-2', 3'-dideoxicitidina-5'-trifosfato presenta un resultado aproximado del 63% (asumiendo = 9.230 a 294,5 nm); HPLC t_{x} = 19,4 min.

La síntesis de 7(-3(-6-biotinamida(hexanoamida))propin-1-il)-7-deasa-2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato presenta un resultado aproximado del 39% (asumiendo = 13.600 a 278,5 nm); HPLC t_{x} = 23,1 min.

La síntesis de 7(-3(-6-biotinamida(hexanoamida))propin-1-il)-7-deasa-2', 3'-dideoxiguanosina-5'-trifosfato presenta un resultado aproximado del 44% (asumiendo = 9.300 a 291 nm); HPLC t_{x} = 21,2 min.

E. Análisis de posiciones polimórficas en fase sólida 1. Análisis por polimerasas

Aunque la identidad de los nucleótidos de las posiciones polimórficas de la presente invención puede determinarse de diversos modos, un método especialmente preferente aprovecha las pruebas de diagnóstico basadas en las variaciones de los oligonucleótidos en la secuencia del ácido nucleico desarrollado en Goelet, P. y otros (aplicación PCT WO92/15712). En esta prueba, un oligonucleótido purificado, con una secuencia definida (complementaria a una secuencia inmediata proximal o distal de un polimorfismo) está ligado a un soporte sólido y cualesquiera moléculas de la muestra original por analizar presentes pueden hibridar el oligonucleótido enlazado.

En una forma de realización preferente, un oligonucleótido cuya secuencia sea complementaria a una secuencia distal inmediata de un polimorfismo se prepara con alguno de los métodos arriba descritos (preferentemente el de Nikiforov, T. (solicitud de patente U.S. número de serie 08/005.061, correspondiente a WO94/16090, publicada el 21 de julio de 1994)). El radical del oligonucleótido se halla unido al soporte sólido, como se ha descrito, por ejemplo, en Goelet, P. y otros (aplicación PCT WO92/15712), de modo que el 3'-extremo del oligonucleótido puede servir de sustrato para la amplificación del primer.

El primer inmovilizado se incuba entonces en presencia de una molécula ADN (preferentemente una molécula de ADN genómico), que posea un polimorfismo de nucleótido simple cuya secuencia distal inmediata sea complementaria a la del primer inmovilizado. Preferentemente, dicha incubación tiene lugar en completa ausencia de cualquier tipo de dNTP (es decir, dATP, dCTP, dGTP o dTTP), pero sólo en presencia de uno o más compuestos de nucleotidotrifosfatos de terminación de cadena (como por ejemplo, compuestos de dideóxidos), y en condiciones adecuadas para que estos compuestos se puedan incorporar al 3'-radical del primer. Como se observará, donde sólo existen dos o tres alelos en la posición polimórfica es tal que (tal que sólo podrían incorporarse, respectivamente, dos o tres especies de dNTP al producto de amplificación del primer). La identidad del nucleótido añadido viene determinada por el nucleótido en la posición polimórfica y es complementaria a éste.

En esta forma de realización, el nucleótido de la posición polimórfica se determina, por tanto, por averiguación de qué conjunto de nucleótidos etiquetados ha sido incorporado al 3'-radical del oligonucleótido enlazado por una polimerasa dependiente del primer. Preferentemente, cuando se empleen simultáneamente varios compuestos de dideoxinucleótidos, se utilizarán etiquetas distintas que permitirán diferenciar la identidad del compuesto de dideoxinucleótido incorporado.

2. Análisis por polimerasas/ligasas

En una forma de realización preferente, la identidad del nucleótido de la posición polimórfica se determina por un proceso mediado por polimerasas/ligasas. Igual que en la forma de realización anterior, se emplea un oligonucleótido primer, el cual es complementario de la secuencia invariante 3'-distal inmediata del PNS. Un segundo oligonucleótido se fija a la fase sólida por su 3'-extremo. La secuencia de este oligonucleótido es complementaria de la secuencia 5'-proximal del polimorfismo que se analiza, pero es incapaz de hibridar el oligonucleótido primer.

Estos oligonucleótidos son incubados en presencia del ADN que contiene el polimorfismo de nucleótido simple que se desea analizar, y por lo menos un 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato. La reacción de incubación incluye además una ADN-polimerasa y una ADN-ligasa. Así, por ejemplo, si al evaluar el polimorfismo del clon 177-2 (Tabla 1), el oligonucleótido fijado contuviera la secuencia 3'-distal de Id. sec. Nº:2, el segundo oligonucleótido tendría la secuencia 5'-proximal de Id. sec. Nº:1.

Los oligonucleótidos fijados y los solubles son de este modo capaces de hibridar la misma hebra del polimorfismo de nucleótido simple analizado. Las condiciones secuenciales obligan a los dos nucleótidos a hibridar las secuencias proximal y distal del PNS que flanquean la posición polimórfica X del polimorfismo; de este modo, los oligonucleótidos hibridados quedan separados por un "hueco" de un nucleótido simple en el lugar exacto de la posición polimórfica.

La presencia de polimerasa y de un 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato complementario a X permite la ligación del primer amplificado con el 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato complementario al oligo complementario a la secuencia distal; un 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato que es complementario al nucleótido de la posición polimórfica permite la creación de un sustrato ligable. La reacción de la ligación inmoviliza el nucleótido 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato y el anteriormente soluble oligonucleótido primer, al soporte sólido.

La identidad de la posición polimórfica que era opuesta al "hueco" se puede determinar entonces por diversos métodos. En una forma de realización preferente, el 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfato de la reacción está etiquetado y su detección revela así la identidad del nucleoide complementario de la posición polimórfica. Puede haber distintos 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfatos, cada uno etiquetado de una manera diferente. Alternativamente, pueden producirse reacciones independientes para cada uno de los 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfatos. En una forma de realización alternativa secundaria, los 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfatos no están etiquetados, pero lo está el segundo oligonucleótido soluble, y cada uno de los 2', 5'-desoxinucleotidotrifosfatos sin etiquetar provoca una reacción diferente. La reacción que contiene el oligonucleótido complementario permite la formación del sustrato para el ligamiento, y se detecta por detección de la inmovilización del oligonucleótido previamente soluble.

F. Amplificación de señal

Podemos incrementar la sensibilidad de los pruebas de detección de hibridación del ácido nucleico si alteramos la forma en que la detección se transmite al observador. Por ejemplo, es posible aumentar la sensibilidad de una prueba si se usan reactivos con etiquetas detectables. Con este fin se han diseñado una amplia variedad de estos métodos de amplificación de señal. Kourilsky y otros (patente U.S. 4.581.333) describe el empleo de etiquetas enzimáticas para incrementar la sensibilidad en una prueba de detección. También se han utilizado etiquetas fluorescentes (Albarella y otros, EP 144914), etiquetas químicas (Sheldon III y otros, patente U.S. 4.582.789; Albarella y otros, patente U.S. 4.563.417), bases modificadas (Miyoshi y otros, EP 119448), etc., en un esfuerzo por mejorar la eficiencia con que se pueda observar la hibridación.

Es preferible emplear utilizar etiquetas fluorescentes y aún más etiquetas cromogénicas (enzimas especiales), que permiten determinar la identidad del nucleótido incorporado de manera automática o semiautomática con un espectrofotómetro.

IV. Determinación de genotipo de PNS para uso en métodos de análisis genéticos A. Consideraciones generales sobre el empleo de polimorfismos de núcleo simple en análisis genéticos

La utilidad de la determinación de las posiciones polimórficas de la presente invención proviene del hecho de que dichas posiciones pueden utilizarse para estimar la probabilidad estadística de que dos individuos posean los mismos alelos para un polimorfismo dado.

Los análisis estadísticos de los PNS pueden emplearse para una gran diversidad de propósitos. El análisis genético practicado a un animal puede servir como una "huella dactilar" con la cual determinar si un cierto animal es, o no, aquel animal particular.

Los métodos de la presente invención también se pueden practicar al padre o los padres putativos de un individuo para determinar la probabilidad de que un determinado individuo sea o no progenie de dicho o dichos padres. Así, la detección y el análisis de VNS puede servir para descartar la posibilidad de que un macho o varón sea el padre de un individuo particular (como por ejemplo, que un semental sea el padre de un potro), o establecer la probabilidad de que un individuo particular sea progenie de una determinada hembra (por ejemplo, que un potro sea hijo de una yegua en particular).

Como se indica más adelante, la presente invención permite construir un mapa genético de una especie determinada. De este modo, la serie particular de polimorfismos identificados mediante los métodos que propone la presente invención pueden correlacionarse con una característica concreta que ayude a prever la predisposición de un animal (o planta) concreto a contraer una enfermedad genética o a presentar unas condiciones o unas particularidades determinados. Debemos entender que el término "característica", tal como se va a emplear de aquí en adelante, incluye los conceptos "enfermedad genética", "condición" y "particularidad". El término "enfermedad genética" involucra un estado patológico causado por una mutación, independientemente de que dicho estado pueda ser detectado o sea asintomático. Una "condición" denota una predisposición a presentar unas determinadas peculiaridades (por ejemplo, asma, huesos débiles, ceguera, úlcera, cáncer, enfermedades coronarias o cardiovasculares, defectos esqueletomusculares, etc.). Una carcaterística es un atributo que imparte valor económico a una planta o un animal. Como ejemplos de características podemos mencionar la longevidad, la velocidad, la resistencia, el ritmo de envejecimiento, la fertilidad, etc.

B. Identificación y verificación de parentesco

Las mediciones más útiles para determinar la potencia de un sistema de identificación y verificación de paternidad son: (i) la "probabilidad de identidad" (p(ID)) y (ii) la "probabilidad de exclusión" (p(exc)). La p(ID) calcula la probabilidad de que dos individuos arbitrarios tengan el mismo genotipo con respecto a un marcador polimórfico dado. La probabilidad de que un macho o varón arbitrario tenga un genotipo incompatible consigo mismo siendo el padre en un caso de paternidad en que la identidad de la madre no se halla en cuestión. Puesto que los loci genéticos simples, incluidos los loci con múltiples alelos como la región de mayor histocompatibilidad, raramente proporcionan pruebas con niveles adecuados de fiabilidad estadística para las pruebas de paternidad, es deseable una prueba que mida preferentemente loci múltiples desenlazados en paralelo. Las probabilidades acumuladas de identidad o no identidad y las probabilidades acumuladas de exclusión de paternidad para estas pruebas multi-locus se calculan como el producto de las probabilidades correspondientes a cada locus.

Las mediciones estadísticas de mayor interés son: (i) la probabilidad acumulada de no identidad (p_{ac}(no-ID)) y (ii) la probabilidad acumulada de exclusión de paternidad (p_{ac}(exc)).

A continuación se dan las fórmulas empleadas para calcular el valor de estas probabilidades. A efectos de simplicidad, estas expresiones se dan primero para loci de 2 alelos, en que un alelo se denota de tipo A y el otro de tipo B. En este modelo son posibles cuatro genotipos: AA, AB, BA y BB (los tipos AB y BA son bioquímicamente indistinguibles). La frecuencia alélica viene dada por el número de veces que A (f(A), denotamos la frecuencia de A con una p) o B (f(B), denotamos la frecuencia de B con una q, siendo q = 1 - p) se halla en el genoma del haploide. La probabilidad de hallar un genotipo dado en un locus determinado es:

: Homocigoto: p(AA) = p^{2}

: Heterocigoto único: p(AB) = p(BA) = pq = p(1-p)

: Dos heterocigotos: p(AB+BA) = 2pq = 2p(1-p)

: Homocigoto: p(BB) = (1-p)^{2}

La probabilidad de identidad en un locus (es decir, la probabilidad de que dos individuos seleccionados aleatoriamente de una población, tengan genotipos idénticos en un locus dado) viene dada por la ecuación:

p(ID) = (p^{2})^{2} + (2pq)^{2} + q^{2}

Luego, la probabilidad de identidad acumulada para n loci viene dada por la ecuación:

p_{ac}(ID) = \subseteq p (ID_{1})p(ID_{2})p(ID_{3})...p(ID_{n})

La propiedad de no identidad acumulada para n loci (es decir, la probabilidad de que dos individuos sean diferentes en uno o más loci) viene dada por la ecuación:

p_{ac}(no-ID) = 1 - p_{ac}(ID)

La probabilidad de exclusión de paternidad (representada por la probabilidad de que un macho o varón arbitrario tenga un genotipo respecto a un locus dado que lo incompatibilice como padre respecto a una situación promedio de paternidad en que la identidad de la madre no está en discusión) viene dada por la ecuación:

p(exc) = pq(1-pq)

La probabilidad de no exclusión (representada por la probabilidad de que en un locus dado un macho o varón arbitrario tenga no sea excluido como padre respecto a una situación promedio de paternidad) viene dada por la ecuación:

p(no-exc) = 1 - p(exc)

Luego, la propiedad de no exclusión acumulada (representada por el valor obtenido cuando se consideran n loci) es:

p_{ac}(no-exc) = \subseteq p (no-exc_{1})p(no-exc_{2})p(no-exc_{3})...p(no- exc_{n})

La probabilidad de exclusión acumulada (representada por la probabilidad de que, considerando un panel de n loci, un macho o varón arbitrario esté bioquímicamente excluido como padre en una situación promedio de paternidad en que la madre no está en cuestión) viene dada por la ecuación:

p_{ac}(exc) = 1 - p_{ac}(no-exc)

Estos cálculos pueden ampliarse a cualquier número de alelos en un locus dado. Por ejemplo, la probabilidad de identidad de p(ID) para un sistema de 3 alelos cuyas frecuencias de aparición en la población son p, q y r, respectivamente, es igual a la suma de los cuadrados de las frecuencias de genotipo:

p(ID) = p^{4} + (2pq)^{2} + (2qr)^{2} + (2pr)^{2} + r^{4} + q^{4}

Análogamente, la probabilidad de exclusión para el sistema de tres alelos viene dada por:

p(exc) = pq(1-pq) + qr(1-qr) + pr(1-pr) + 3pqr(1-pqr)

En un locus de n alelos se utiliza el desarrollo binomial correspondiente para calcular p(ID) y p(exc).

Las Figuras 4 y 5 muestran cómo aumentan la probabilidad y la probabilidad acumulada en función del número y el tipo de loci genéticos considerados. Puede observarse que en un sistema de tres alelos se alcanza un poder de discriminación más elevado cuantos menos marcadores se consideran. En las figuras 4 y 5, los triángulos indican el aumento de los valores de la probabilidad para números crecientes de loci con dos alelos en que el alelo común presenta una frecuencia de aparición de p = 0,79. Las cruces de las Figuras 4 y 5 muestran el mismo análisis para números crecientes de loci de tres alelos en que p = 0,51, q = 0,34 y r = 0,15.

Sin embargo, la elección entre si emplear loci con 2, 3 o más alelos resulta enormemente influida por las consideraciones bioquímicas arriba descritas. Es posible diseñar una prueba de análisis polimórficos para obtener el número de alelos correspondientes a un locus determinado. En caso de querer determinar el número de alelos por gel electroforesis, cada alelo deberá ser fácilmente resoluble por gel electroforesis. Dado que las variaciones longitudinales en las familias multialélicas suelen ser pequeñas, las pruebas con ADN humano que emplean familias multialélicas incluyen correcciones estadísticas para compensar identificaciones de alelos erróneas. Es más, aunque la aparición de un alelo raro en un sistema alélico múltiple puede ser altamente informativa, la rareza de estos alelos dificulta extremadamente tomar medidas exactas de su frecuencia de aparición en la población. Para corregir errores en las estimaciones de frecuencias de estos alelos poco habituales, los análisis estadísticos de estos datos incluyen una medida de los efectos acumulados de incertidumbre en estas estimaciones de frecuencias. Al utilizar estos sistemas multialélicos se incrementa además la probabilidad de descubrir en la población alelos nuevos o raros en el curso de grandes cribados de la población. La integridad de los datos genéticos recogidos con anterioridad se revisarían empíricamente para reflejar el descubrimiento de un nuevo alelo.

En vista de estas consideraciones, aunque el uso de loci con muchos alelos podría potencialmente ofrecer algunas ventajas a corto plazo (ya que no haría falta seleccionar tantos loci), es preferible efectuar análisis polimórficos con loci de menos alelos, pero: (i) que sean más frecuentemente representativos, y (ii) que sean más fáciles de medir sin ambigüedades. Los ensayos de estas características pueden alcanzar el mismo poder de discriminación que los ensayos basados en un número más elevado de loci polimórficos, puesto que el mismo número total de alelos se obtiene de una serie de loci desenlazados.

C. Mapa genético y análisis de características genéticas con PNS

Los polimorfismos detectados en un conjunto de individuos de la misma especie (por ejemplo, en seres humanos, caballos, etc.) o de especies muy cercanas pueden ser analizados para determinar si la presencia o la ausencia de un polimorfismo particular está correlacionado con una característica particular.

Para este análisis polimórfico se determina la presencia o la ausencia de un conjunto de polimorfismos (es decir, de una "serie polimórfica") en un conjunto de individuos, algunos de los cuales exhiben unas mismas características particulares y otros exhiben características mutuamente excluyentes (por ejemplo, en caballos, huesos frágiles o huesos resistentes; principios de ceguera en la madurez o no ceguera; predisposición a padecer asma o enfermedades cardiovasculares, o no presentar dicha predisposición). A continuación se determina si la presencia o ausencia de cada alelo concreto del conjunto va asociada con la característica particular en estudio. Dichas correlaciones definen un mapa genético de la especie. Los alelos que no presentan un comportamiento aleatorio con respecto a una característica pueden servir para estimar la probabilidad de que un animal en particular presente dicha característica. Por ejemplo, si un determinado alelo polimórfico está presente en sólo el 20% de los miembros de la especie, los cuales exhiben alguna condición cardiovascular particular, un individuo de esta especie que contenga ese alelo tendrá una probabilidad del 20% de exhibir dicha condición cardiovascular. Como se ha indicado, el poder de predicción del análisis es mayor cuanto mayor es la relación entre un alelo polimórfico particular y una característica concreta. Análogamente, el poder de predicción del análisis se incrementa si se analizan simultáneamente los alelos de múltiples loci polimórficos en relación con una característica particular. Si en el ejemplo anterior se descubre que un segundo alelo polimórfico también se halla presente en el 20% de los individuos de la especie que presentan la condición cardiovascular, todos los miembros examinados que presentan dicha condición cardiovascular exhiben una combinación particular de alelos para estos primer y segundo polimorfismos; luego, un miembro particular de la especie que contenga ambos alelos tendrá una probabilidad muy alta de presentar dicha condición
cardiovascular.

La detección de posiciones polimórficas múltiples determina la frecuencia con que estas posiciones discriminan por sí mismas en una población. Si, por ejemplo, dos posiciones polimórficas presentan una frecuencia de aparición aleatoria, o bien están en cromosomas separados o bien se hallan en el mismo cromosoma muy lejos la una de la otra. Un análisis de frecuencias significativas de aparición permite así establecer un mapa de marcadores genéticos. De este modo, la presente invención proporciona un medio para trazar un mapa de los genomas de plantas y
animales.

La resolución del mapa genético es proporcional al número de marcadores que contiene. Dado que los métodos de la presente invención permiten aislar un gran número de posiciones polimórficas, es posible crear un mapa de cualquier nivel de resolución deseado.

La secuenciación de las posiciones polimórficas aumenta notablemente su utilidad al aplicarse a la determinación del mapa genético. Estas secuencias pueden servir para diseñar oligonucleótidos primer y sonda que "bajen" por el cromosoma y vayan identificando nuevas posiciones con marcadores (Bender, W. y otros, J. Supra. Molec. Struc. 10 (supl.):32 (1979); Chinault, A.C. y otros, Gene 5:111-126 (1979); Clarke, L. y otros, Nature 287:504-509
(1980)).

La resolución del mapa puede incrementarse si se combina el análisis polimórfico con datos sobre el fenotipo de otros atributos de la planta o el animal cuyo genoma se intenta descifrar. Así, si un polimorfismo particular determina el color marrón del pelo, la posición en el mapa del locus asociado a dicho polimorfismo ha de hallarse cerca de la posición del gen o los genes responsables del color del pelo. De modo parecido pueden utilizarse datos bioquímicos para incrementar la resolución del mapa genético. En esta forma de realización, por medio de un análisis bioquímico (por ejemplo, un serotipo, una isoforma, etc.) se intenta averiguar si una posición polimórfica es codeterminante. Estos mapas pueden servir, por ejemplo, para identificar mutaciones causantes de enfermedades.

Evidentemente, la identificación de los PNS de la presente invención permite utilizar oligonucleótidos complementarios como primers para PRC u otras reacciones de aislamiento y secuenciación de nuevas secuencias de genes localizadas a ambos lados del PNS. La invención permite determinar tales nuevas secuencias de genes. Las secuencias genómicas que pueden aislarse por clonación con la ayuda de estos primers pueden ser tanscritas a ADN y expresadas como proteína. La presente invención también incluye estas proteínas, además de anticuerpos y otras moléculas capaces de enlazar con las proteínas.

La invención se ilustra a continuación en relación con dos formas de realización - para caballos y seres humanos. No obstante, puesto que los principios fundamentales de la genética se aplican por igual para cualquier especie, este ejemplo ilustrativo es igualmente válido para cualquier otra especie. De modo que cualquiera versado en la materia requerirá sólo utilizar directamnente los métodos que se han explicado en la invención para aislar PNS en cualquier otra especie, y así llevar a cabo el análisis genético de la presente invención.

Como ya se ha indicado, el desarrollo de la metodología LOD de marcaje de segmentos permite utilizar PLFR tanto para seguir la herencia de las características genéticas como construir un mapa genético de una especie (Lander, S y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 7353-7357 (1986); Lander, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:2363-2367 (1987); Donis-Keller, H. y otros, Cell 51: 319-337 (1987); Lander, S. y otros, Genetics 121:185-199 (1989)). Estos métodos puede adaptarse fácilmente para ser utilizados con los polimorfismos considerados en la presente invención. Evidentemente, a este respecto, estos polimorfismos son superiores a los PLFR y los CRP. Dada la frecuencia de aparición de los PNS, es posible generar con prontitud un denso mapa genético. Es más, como ya se ha indicado, los polimorfismos de la presente invención son más estables que los polimorfismos PLFR típicos (de tipo RPNV).

Los polimorfismos considerados en la presente invención comprenden información directa de secuencias genómicas, que puede tipificarse por diversos métodos. En un mapa según CRP o PLFR, el análisis ha de estar basado en gel, y conlleva tener que obtener un perfil elecroforético del ADN del animal considerado. Por el contrario, un análisis de los polimorfismos (PNS) considerados en la presente invención permite el uso de métodos espectrométricos y una automatización inmediata para facilitar el análisis de animales en gran número.

Después de describir la invención en términos generales, el mismo planteamiento se va a entender con mayor claridad por referencia a los ejemplos siguientes de aislamiento y análisis de polimorfismos en equinos, los cuales hay que entender como ejemplos ilustrativos, y no como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento de polimorfismos en equinos

Como etapa inicial en la identificación de polimorfismos en equinos, se prepararon colecciones de pequeñas dianas a partir del ADN genómico obtenido de leucocitos sanguíneos periféricos purificados en un gradiente de densidades Ficoll-hypaque a partir de la sangre de un caballo purasangre castrado de 15 años de edad (John Henry). Este ADN se fragmentó completamente con Bam HI y Pst I y se introdujo, bien directamente o bien después de fraccionarlo según tamaño, en geles agarosa.

El vector pLT14 (una variante del plásmido Stratagen pKSM13(-)) se fragmentó con Bam HI y Pst I y el ADN linealizado se purificó con un gel agarosa. El ADN genómico tanto del vector como el fraccionado según tamaño y la agarosa se disolvieron en yoduro sódico saturado y a continuación el ADN precipitó en cristales. Tras lavarlo, el ADN se elugó con agua y etanol y precipitó con un portador de glicogen.

Se prepararon ligaciones con distintas proporciones de vector/inserción de ADN- ligasa T4 de longitud variable a 4ºC. El E.coli XLI se transformó con mezclas de ligación y se depositó sobre un LB de agar con una concentración de 100 g/ml de ampicilina. Se generaron aproximadamente 50.000 clones en diversos experimentos diferentes que utilizaban inserciones de ADN sin fraccionar o fraccionado según tamaño. Las células transformadas sin depositar se almacenaron a -70ºC en 7% DMSO. Se prepararon franjas de colonias por aislamiento y plásmido a pequeña escala para determinar el tamaño del ADN de equino introducido. Se efectuaron preparaciones a gran escala escala por cromatografía Qiagen.

La secuencia de los primeros 200-300 nucleótidos del genoma introducido se determinó por el método de terminación de cadena mediante dideoxidonucleósidos con ADN-polimerasa T7 a partir de primers complementarios de las secuencias de plásmido. Esta información fue utilizada para diseñar primers de oligonucleótidos sintéticos complementarios de la secuencia de ADN de equino que se emplearía en reacciones PCR.

En la mayoría de los casos se sintetizaron dos conjuntos de primers PCR (en general, 25-meros). El primer conjunto se utilizó para amplificar ADN genómico bajo un conjunto de condiciones estándar. Los productos de estas reacciones se diluyeron y se utilizaron como "molde" de ADN en un segundo PCR con primers anidados ligeramente más internos que el conjunto original. Los productos de estas dos reacciones se compararon con aquellos obtenidos a partir del ADN plásmido original de molde. En la mayoría de casos, con este procedimiento se obtuvo una alta calidad, productos de una sola especie, sin intentar optimizar las condiciones de la reacción para ningún par particular de
primers.

Se utilizaron dos métodos diferentes para cribar secuencias polimórficas en el ADN amplificado de caballo. Inicialmente, los fragmentos PCR procedentes de un panel de seis caballos se mezclaron con un panel de endonucleasas de restricción que disponía de cuatro posiciones de reconocimiento de bases. Los productos de estas reacciones se analizaron por gel acrilamida electroforesis con geles no desnaturalizados entre 5% y 7,5%. Los productos de la mezcla que mostraban variabilidad al hibridarse a diferentes miembros del panel, quedaban sujetos al analisis secuencial de ADN. A continuación, la secuenciación del ADN se utilizaba directamente para cribar las posiciones polimórficas. Los fragmentos PCR de cinco caballos no relacionados entre sí eran electroelugados con gel acrilamida y se secuenciaban por ciclos repetitivos de reacción de polimerasa T_{aq} termoestable en presencia de una mezcla de dNTPS y de ddNTPS fluorescentes. Los productos se separaban y se analizaban con un instrumento de secuenciación de ADN automatizado de Applied Biosystems, Inc. Los datos se analizaron con software ABI. El software identificaba y confirmaba las diferencias entre secuencias correspondientes a animales diferentes por inspección de la parte relevante de los cromatogramas en la pantalla del ordenador. Se concluía que dichas diferencias constituían un polimorfismo del ADN sólo si los datos estaban disponibles para ambas hebras, y/o se hallaban presentes en más de un ejemplo haploide entre los cinco caballos analizados.

Ejemplo 2 Caracterización de polimorfismos equinos

El programa de identificación y caracterización de secuencias de ADN polimórficas en fragmentos arbitrarios continuó de tal modo que ya se han caracterizado aproximadamente 550 plásmidos a este nivel. Para 200 de estos plásmidos se determinaron las secuencias adyacentes a las posiciones de clonación. El tamaño de los injertos de estos plásmidos secuenciados oscilaban entre 0,25 y 3,5 kb. A partir de la información secuencial, se diseñaban oligonucleótidos primer que permitieran la amplificación por PCR de la misma región genómica de diferentes caballos. Para la identificación de los nucleótidos presentes en posiciones polimórficas, se purificaron con geles acrilamida por electroelugación fragmentos PCR de cinco caballos y se secuenciaron por completo por bioquímica de secuenciación con "ciclos" de T_{aq} polimerasa y equipos de secuenciación automatizados. Los resultados para los cinco caballos fueron analizados por ordenador y confirmados visualmente. Las variantes de ADN secuencial descubiertas por este método se contaban sólo si las secuencias se obtenían para ambas hebras y la variante se había encontrado en más de un ejemplo haploide. Los 18 clones en la Tabla 1 constituyen un subconjunto de PNS identificados. En la Tabla 1 se muestran la secuencia inmediata 5'-proximal, la identificación del nucleoide de la posición polimórfica y la secuencia inmediata 3'-distal de cada PNS. Estas secuencias se presentan en filas horizontales correspondientes a cada PNS. Las secuencias de ADN bicatenario de la Tabla 1 se presentan de acuerdo con los requisitos de listado de secuencias de la Oficina de Registros y Patentes de los E.E.U.U. Así, todas las secuencias se presentan en la misma orientación
(5' \rightarrow 3'). La organización de la tabla se ilustra en la Figura 6 con respecto a un PNS de ejemplo, el clon 177-2. Este PNS tiene una posición polimórfica que puede presentar una C o una T en una de las hebras, y una G o una A en la hebra opuesta. La secuencia de ADN 5'-proximal inmediata que precede a la posición polimórfica en la hebra C/T se designa como Id. sec. Nº:1. La secuencia 3'-distal que sigue inmediatamente a la posición polimórfica en la hebra C/T se designa como Id. sec. Nº:2. La secuencia de ADN 5'-proximal inmediata que precede a la posición polimórfica en la hebra G/A se designa como Id. sec. Nº:3. La secuencia 3'-distal que sigue inmediatamente a la posición polimórfica en la hebra G/A se designa como Id. sec. Nº:4. Si se tiene en mente que las secuencias se escriben en la misma orientación (5' \rightarrow 3'), se observa que las secuencias Id. sec. Nº:1 y Id. sec. Nº:4 son complementarias; análogamente, las secuencias Id. sec. Nº:2 y Id. sec. Nº:2 son complementarias. Las secuencias que flanquean una posición polimórfica particular se obtienen, pues, al combinar la secuencia proximal de una fila con la secuencia distal de la
misma fila.

\newpage

1

\newpage

La presente especificación se relaciona con las secuencias anteriores pos sus números de identificación ID de secuencia (es decir, Id. sec. Nº). Para facilitar las terminología, se emplea notación algebraica (del tipo "2n + 1"), según el álgebra convencional. Así, la notación "Id. sec. Nº:2n + 1" designa Id. sec. Nº:5 para n = 5, Id. sec. Nº:7 para n = 3, etc.

Ejemplo 3 Análisis de frecuencias alélicas de polimorfismos en equinos en estudios en poblaciones pequeñas

En poblaciones pequeñas (50-60 animales) se han efectuado estudios sobre algunas posiciones polimórficas de estos polimorfismos en secuencias de ADN por el método del Análisis de Bits Genéticos (ABG), el sistema preferente de determinación de nucleótidos simples en fase sólida (Goelet, P. y otros (WO 92/15712)). En la Figura 7 se ilustran las siete etapas de la forma de realización preferente de este estudio:

Etapa 1

Preparación del ADN

Etapa 2

Amplificación de la secuencia en estudio. Después de haber preparado el ADN de la muestra, una región específica del genoma (locus) de la muestra se amplifica por PCR. Uno de los primers del PCR se modifica con cuatro enlaces tiofosfatados en el extremo 5'.

Etapa 3

Fragmentación con exonucleasa y generación de "moldes" de hebra simple. La exonucleasa fragmenta el producto del PCR y deja intacta la hebra tiofosfatada.

Etapa 4

Hibridación para capturar el molde amplificado. La hebra amplificada se hibrida luego al primer del ABG apropiado que hay inmovilizado sobre la superficie del pocillo de titulación.

Etapa 5

Amplificación de base simple con polimerasa. Se utilizan ADN-polimerasa y ddNTP haptenados para amplificar según "molde" el primer del AGB por una base.

Etapa 6

Detección colorimétrica del producto amplificado. Después de lavar el "molde" con NaOH, la base heptanada se detecta por medio de un conjugado antihaptén y el sustrato colorimétrico adecuado.

Etapa 7

Interpretación del genotipo asistida por ordenador. Los datos colorimétricos de algunos loci se convierten en un genotipo de PNS para el individuo particular estudiado.

El método se lleva a cabo preferentemente del modo siguiente:

Preparación del molde del AGB

La amplificación de las secuencias genómicas se efectuó por el protocolo de reacción por cadena de polimerasa (PCR, por su sigla inglesa polymerase chain reaction). En una primera etapa, se emplearon cien nanogramos de ADN genómico en mezclas reactivas que contenían primer iniciales en concentraciones de 2 M y 10 mM de Tris 8,3 pH, 50 mM de MgCl_{2}, 0,01% de gelatina; y 0,05 unidades por I ADN-polimerasa T_{aq} (AmpliTaq (Marca Registrada), Perkin Elmer).

El "molde" de monocatenario para emplear con el primer inmovilizado en fase sólida se puede obtener por dos métodos. En el primero, 4 compuestos nucleótidotiofosfatados median la amplificación de los primers, tal como enseño Nikiforov, T. (solicitud de patente U.S. número de serie 08/005.061), correspondiente a WO94/16090, publicada el 21 de julio de 1994). Alternativamente, un segundo método de PCR requiere concentraciones "asimétricas" de primer. Los productos de la primera reacción se diluyen hasta 1/1.000 en una segunda reacción. Uno de los primers del segundo método se utiliza a la concentración estándar de 2 M, y el otro a 0,08 M. En estas condiciones se sintetizan moléculas monocatenarias durante la reacción.

Inmovilización de ácidos nucleicos en fase sólida

Las uniones a la fase sólida molde-primer por el procedimiento de AGB simplifica el enjuague, el intercambio en las disoluciones tampón, etc.; y, en principio, estas uniones puede producirse por el molde o por el primer. Sin embargo, en la práctica, especialmente cuando se emplean métodos de detección por gel, es preferible la unión por el primer. Este método permite utilizar enjuague estringentes (por ejemplo, 0,2 N NaOH) para retirar las impurezas y los productos colaterales mientras se retienen los dideoxidonucleótidos haptenados enlazados a los extremos 3' del primer.

Por ello, para reacciones AGB en placas de 96 pocillos (Nunc Nunclon (Marca Registrada), placas, Roskilde, Dinamarca), el primer AGB se acopló a la placa por enlace covalente. Esto se consiguió por incubación en una disolución 10 pmol de primer, con un grupo 5'-amina por pocillo, en 50 de una disolución tampón 3 mM de fosfato de sodio, 6 pH, 20 mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiamida (EDC) durante toda la noche a temperatura ambiente. Tras el acoplamiento, la placa se enjuagó tres veces con TNTw.

AGB en placas de pocillos

La hibridación covalente de ADN monocatenario a primers acoplados en placas de pocillos se consiguió añadiendo al producto monocatenario del PCR un volumen igual de NaCl 3 M, 20 mM EDTA e incubando cada pocillo con 20 l de esta mezcla a 20ºC durante por lo menos 30 minutos. Después, la placa se lavó tres veces con TNTw. Y a continuación se incubaron durante por lo menos 5 minutos a temperatura ambiente veinte litros de mezcla de amplificación por polimerasa que contenían ddNTP (3 M por mezcla, una de los cuales con biotina) 5 mM DTT, 7,5 mM de isocitrato de sodio, 5 mM MnCl_{2}, 0,04 unidades por l de ADN-polimerasa Klenow.

Después de la reacción de amplificación, la placa se lavó una vez con TNTw. Las hebras molde se retiraron incubando los pocillos en una disolución de 50 \mul de 0,2 N de NaOH durante por lo menos 5 minutosa temperatura ambiente. Luego la placa se lavó tres veces con TNTw. La incorporación de ddNTP con biotina se midió por ensayo de enlace enzimático. Cada pocillo se incubó en una disolución con 20 \mul de peroxidasa de estreptavidina conjugada de rábano picante (disolución 1/1.000 en TNTw de un producto comprado en BRL, Gaitherburg, MD) con agitación durante por lo menos 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarlo 5 veces con TNTw, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de o-fenilenediamina (OPD, 1 mg/ml en ácido cítrico 0,1 M, 4,5 pH) (BRL) con H_{2}O_{2} concentrado al 0,012%. La cantidad de enzima enlazado se determinó por métodos cinéticos con un espectrómetro "Vmax" de 96 pocillos para equipos moleculares. Las Figuras 8A y 8B ilustran cómo aparecen los datos de parentesco para un caballo en el nivel de la placa de titulación. En las pruebas estándar de parentesco en caballos, en la placa se disponen 85 muestras (columnas 1-11) más los controles (columna 12). Para cada locus del caballo, la presencia de los dos alelos conocidos se determina por interrogación específica de las bases en placas independientes. Las dos placas mostradas en las Figuras 8A y 8B son idénticas en moldes PCR y en primer AGB y difieren sólo en los ddNTP con biotina que se emplearon en la reacción de amplificación (biotina-ddCTP en la Figura 8A y biotina-ddTTP en la Figura 8B). Además de la adición del reactivo colorimétrico (OPD), la absorbencia del color resultante se midió en un lector de microplacas de titulación para equipos moleculares y los datos en bruto se obtuvieron en miliOD/min por pocillo. Los dos resultados en bruto en representaciones en escala de grises de los datos de absorción para estas placas se muestran en las figuras dispuestas en el mismo orden que en la microplaca de titulación. Las intensidades de la escala de grises se corresponde directamente con la producción en colores. En esta posición bialélica, las bases detectadas son C (Figura 8A) y T (Figura 8B). Aproximadamente el 40% de los caballos analizados hasta la fecha son heterozigóticos (por ejemplo, la muestra en el pocillo A1), y los restantes homozigotos para C (por ejemplo, A2) o T (por ejemplo, B3). Los controles de molde sintéticos incluyen un homozigoto C de control (pocillo E12), un homozigoto T de control (pocillo F12) y un heterozigoto de control (pocillo G12). La escala se expresa en miliOD/min a 450 nm. En este caso, las muestras más positivas daban señales por encima de 100. En este formato, para una prueba de parentesco en caballos con un panel de 28 marcadores bialélicos, se requerirían 56 de estas placas para hallar el genotipo completo de los 85
caballos.

Cincuenta y un caballos no relacionados aleatoriamente seleccionados y tres familias macho/yegua/potro fueron elegidos para el estudio con la intención de establecer que un subconjunto razonable del grupo de marcadores de ADN obtenido hallado hasta la fecha podía proporcionar la deseada p(exc) \geq 0,90, y establecer la potencia de los marcadores de ADN a la vez que una priorización entre éstos para mediciones definitivas de frecuencias alélicas.

El molde de ADN monocatenario generado por PCR se preparó a partir del ADN genómico de cada animal. Este material se codificó en relación con variaciones de los nucleótidos por el método AGB. Los datos del genotipo obtenidos para cada posición polimórfica se resumen en la tabla 2. A partir de estos datos del genotipo, se determinaron las frecuencias alélicas y se emplearon para calcular la p(exc) correspondiente a cada posición. Se da la p(exc) acumulada para las 18 posiciones listadas en las Tablas 1 y 2 y es de 0,955 para todo el grupo. En las Tablas 2-5, el genotipo está indicado como homozigoto (es decir, PP o QQ) o heterozigoto (PQ). Los números entre paréntesis denotan el número de alelos del genotipo observados.

2

Ejemplo 4 Prueba de parentesco

Se analizó el genotipo de una familia constituida por un semental, una yegua y su descendiente con respecto a las 18 posiciones variables discutidas arriba sin hallar exclusiones. Esta familia no había sido previamente analizada. A partir de los números para las frecuencias alélicas preliminares presentados en la Tabla 2, es posible construir una tabla de p(exc) correspondientes a este caso específico (Tabla 3). En general, al construir esta tabla se asumió que la identidad de la madre no está en cuestión (aunque, en la práctica es posible excluir a la madre si ninguno de sus alelos es heredado por el potro). La Tabla 3 muestra los datos de genotipo para el potro y su madre con las posiciones analizadas listadas, en este caso, por orden de significatividad. La propiedad acumulada total en este caso era de
0,942.

3

Ejemplo 5 Prueba de identidad

Resulta de interés utilizar los grupos de análisis de población para deducir información preliminar acerca de otros aspectos del panel de marcadores. Por ejemplo, a partir de los datos de las frecuencias alélicas, es posible calcular un valor de probabilidad de identidad [p(ID)] para las 18 posiciones, que resulta de 4,79 x 10^{-7} o, aproximadamente, 1 entre 2,1 millones. Luego, uno podría concluir que ninguno de los caballos del grupo de población examinado tendría un genotipo igual al de ningún otro, y el análisis por ordenador así lo confirma. Como se muestra en la tabla 4, la p(ID) alcanza números muy pequeños con el análisis de comparativamente pocos loci. Con las siete primeras posiciones, la probabilidad de que dos animales distintos arbitrarios tengan genotipos diferentes es ya del
99%.

4

Tasa de error

En el presente estudio podemos hallar dos tipos de resultados potencialmente falsos, debidos a (1) fallos en el proceso del PCR o (2) incompatibilidades entre el genotipo obtenido de hebras opuestas. Sólo los datos de aquellos animales que dieron resultados correctos en ambas hebras fueron incluidos en los cálculos de las frecuencias alélicas. Sesenta caballos genotipados con respecto a 18 posiciones proporcionan 1.080 genotipos. El 95% de todos los análisis de determinación del genotipo resultaron correctos. No se produjeron los tradicionales fallos debidos al PCR. El 3,8% de los resultados falsos se localizaron en la etapa del ABG, o bien debido a que la PCR falló en la réplica de la monocadena, o a errores de manipulación. El 1,1% de todos los genotipos proporcionó datos incompatibles entre las hebras por motivos desconocidos.

En resumen, el método ABG (análisis de bit genético) es un método de determinación de genotipos simple, adecuado y fácil de automatizar. En este método, se asocian secuencias específica a un primer con enlace a fase sólida que seleccionan una única posición polimórfica en una muestra de ácido nucleico, y con una reacción altamente precisa de ADN-polimerasa con nuevos dideoxidonucleótidos no radioactivos se determina el genotipo correspondiente a aquella posición. Una de las características más atractivas de la aproximación ABG es que, dado que la discriminación alélica se debe efectivamente a la ADN-polimerasa, condiciones distintas de reacción permiten examinar muchas posiciones polimórficas diferentes. Esta característica reduce los costes de las complejas pruebas de ADN porque permite el desarrollo de varias pruebas en paralelo.

La tasa de error intrínseca del procedimiento ABG en el formato presentado se estima baja; la relación señal/ruido en términos de incorporación de nucleótidos correcta/incorrecta para los homozigotos parece ser de aproximadamente 20:1. ABG es, pues, un método suficientemente cuantitativo que permite una detección fiable de heterozigotos en estudios de genotipo. La presencia en la reacción de amplificación por medio de ADN-polimerasa de los cuatro dideoxinucleósidostiofosfato como único sustrato de nucleótidos aumenta la fidelidad de la determinación de los genotipos al evitar las incorporaciones erróneas. El método ABG puede utilizarse para cualquier tipo de aplicación -incluidos los estudios de enlaces genéticos y determinación del mapa genético, diagnósticos genéticos y pruebas de identidad/parentesco -siempre que se conozca la secuencia de ADN.

Ejemplo 6 Análisis de PNS en humanos

Los polimorfismos de nucleótido simple en seres humanos pueden utilizarse del mismo modo que los polimorfismos descritos para el caso de los equinos. En la tabla 5 se presentan algunos ejemplos de polimorfismos adecuados en seres humanos.

5

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Con el fin de intentar convertir PNS de humanos a un formato adecuado para un análisis ABG, una posición de PNS fenotípicamente neutra se convirtió y se analizó por ABG. La posición se seleccionó de entre las posiciones registradas en la base de datos de polimorfismos humanos OBM de la Universidad John Hopkins: La posición es met-H en el cromosoma 7 a q31, posición de mutación 127, A a G (Horn, G.T. y otros, Clin. Chem. 36, 1614-1619, 1990). Se sintetizaron los oligonucleótidos siguientes (p = tiofosfato):

PCR primer nº 1552 (ID. SEC. Nº:93)

: 5'-CpApTpCpCATGTAGGAGAGCCTTAGTC

PCR primer nº 1553 (ID. SEC. Nº:94)

: 5'-CCATTTTTGTGTCTTCTAGTCTAAGG

ABG primer nº 1554 (ID. SEC. Nº:95)

: 5'-TTGAAAGATCGTCAGAAAAATCC

Las muestras de ADN se seleccionaron al azar de los archivos de ADN de dos familias de entre la colección de familias del Centre d'Etude du Polimorphisme Humaine (CEPH). También se empleó un control negativo, que no contenía ADN. El ADN de muestra se amplificó por PCR con los primer mencionados arriba y el producto resultante se analizó por ABG para dos bases potenciales de la posición polimórfica, G y A. Los resultados del ABG se obtuvieron por interpretación del espectro de absorción a 450 nm en un lector de pocillos de microtitulación. Los datos se presentaron en la Tabla 6.

Las muestras 1, 2, 3, 4, 6 y 8 eran homozigotos de A, las muestras 7 y 9 eran homozigotos de G y las muestras 3 y 5 eran heterozigotos GA. Estos ADN no han sido analizados por ningún otro método hasta la fecha, por su bialelismo.

6

Tasa de error

En el presente estudio podemos hallar dos tipos de resultados potencialmente falsos, debidos a (1) fallos en el proceso del PCR o (2) incompatibilidades entre el genotipo obtenido de hebras opuestas. Sólo los datos de aquellos animales que dieron resultados correctos en ambas hebras fueron incluidos en los cálculos de las frecuencias alélicas. Sesenta caballos genotipados con respecto a 18 posiciones proporcionan 1.080 genotipos. El 95% de todos los análisis de determinación del genotipo resultaron correctos. No se produjeron los tradicionales fallos debidos al PCR. El 3,8% de los resultados falsos se localizaron en la etapa del ABG, bien debido a que la PCR falló en la réplica de la monocadena, o a errores de manipulación. El 1,1% de todos los genotipos proporcionó datos incompatibles entre las hebras por motivos desconocidos.

En resumen, el método ABG (análisis de bit genético) es un método de determinación de genotipos simple, adecuado y fácil e automatizar. En este método, se asocian secuencias específica a un primer con enlace a fase sólida que seleccionan una única posición polimórfica en una muestra de ácido nucleico, y con una reacción altamente precisa de ADN-polimerasa con nuevos dideoxidonucleótidos no radioactivos se determina el genotipo correspondiente a aquella posición. Una de las características más atractivas de la aproximación ABG es que, dado que la discriminación alélica se debe efectivamente a la ADN-polimerasa, condiciones distintas de reacción permiten examinar muchas posiciones polimórficas diferentes. Esta característica reduce los costes de las complejas pruebas de ADN porque permite el desarrollo de varias pruebas en paralelo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: ORCHID BIOSCIENCES, INC.

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ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SIMPLE Y SU USO EN ANÁLISIS GENÉTICOS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 95

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(iv): DISPOSITIVO LECTOR DEL COMPUTADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): COMPUTADOR: IBM compatible PC

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.25

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(v): DATOS ACTUALES DE LA APLICACIÓN:

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: NÚMERO DE LA APLICACIÓN: EP 95900520.8

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(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. 1 Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): FIBRADO: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Equus caballus

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(vii): FUENTE INMEDIATA

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(B): CLON: 177-2

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 1:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGCTCTAA GTGCTGTGGG

\hfill

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(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Equus caballus

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(vii): FUENTE INMEDIATA

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(B): CLON: 177-2

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCAGAAATT CTAAGGTGTT

\hfill

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(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Equus caballus

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(vii): FUENTE INMEDIATA

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(B): CLON: 177-2

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACACCTTAG AATTTCTGCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRADO: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCACAGCAC TTAGAGCTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCTGGGAN TGATCCACTA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGGGAAAA ATGATGATGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATCATCAT TTTTCCCTCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTGGATCA TCCCAGAGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 090-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAACTAATT TGATGGCCAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 090-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGTCAGAA CAATGATTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 090-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAATCATTG TTCTGACTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 090-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGCCATCA AATTAGTTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAAGGCCC AAGAACAGGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGTTCAGC GAGTGTCAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGACACTC GCTGAACTCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGTTCTT GGGCCTTGTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 129-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAAAGAC CACATTATTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 129-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCCCTTTT GTTTCAGACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 129-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCTGAAAC AAAAGGGAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 129-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAATAATGTG GTCTTTCCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGAGTAAG AAGCATCCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGGAGTC ATAGATAAGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTATCTAT GACTCCATGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGATGCTT CTTACTCATG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGAACA GGATTGAGTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGAGTGTC AGAGTTGTGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACAACTCT GACACTCGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 324-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTCAATCC TGTTCTTGGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAAGAAA TGGGGGGCCTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCTACAAT TGCCAGGAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCCTGGCA ATTGTAGGAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCCCCCC ATTTCTTGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATATCAAT ATATATATAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGTGTGTG TGTATTTGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAAATACA CACACACACA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATATAT ATTGATATTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCATAATTA AGCCTGTATT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTGTTTTA AATTTTGTGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAAAATT TAAAACAAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATACAGGCT TAATTATGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTAGAGTA GTTCAAGGAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTCTTATA CCTCCCTTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAGGGAGG TATAAGACAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCTTGAAC TACTCTACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 085-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAACGGAG AGCAGGCCTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 085-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCTGAAG CCTCAGACCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 085-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTCTGAGG CTTCAGCAGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 085-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCCTGCT CTCCGTTCAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTCTTTA GACTATGACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAACCTTGC ATCATGAGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCATGAT GCAAGGTTGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 007-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCATAGTC TAAAGAGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 474-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGAGCTGG GACCTCAGTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 474-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCCTGCCT TTAGACTCGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 474-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGTCTAA AGGCAGGAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 474-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTGAGGTC CCAGCTCAAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 178-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACCTCTGG GCCGTGGATA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 178-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTCAGAA GCACAGGTGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 178-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACCTGTGC TTVTGAACAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 178-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATCCACGGC CCAGAGGTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTTGCTA GCTCTGGGAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCACTAAT GAGGGAAAAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTCCCTC ATTAGTGGAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCCAGAGC TAGCAAATAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 595-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGTTGTGG GAVAGATGTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGATGCAG CTCTAAGTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACTTAGAG CTGCATCTCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 177-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACATCTGTC CCACAACTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGAGGAA GCCTCCACAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCCAATAG TCTGGGATTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATCCCAGA CTATTGGGAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: 459-2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTGGAGGC TTCCTCATGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGKC 2p12

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGCAGACT ACGAGAAACA CAAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGKC 2p12

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTACGCCTG CGAAGTCACC CATC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGKC 2p12

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGGTGAC TTCGCAGGCG TAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGKC 2p12

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTGTTTC TCGTAGTCTG CTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ILIB 2q3-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTGCAAT TGACAGAGAG CTCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ILIB 2q3-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCAGAGA ACAGCACCCA AGGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ILIB 2q3-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTTGGGTG CTGTTCTCTG CCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ILIB 2q3-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTCTCT GTCAATTGCA GGAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: LDLR 19p13.3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCATCTCA AGCATCGATG TCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ILIB 2q3-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTCTCT GTCAATTGCA GGAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: LDLR 19p13.3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCATCTCA AGCATCGATG TCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: LDLR 19p13.3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGCAACC GGAAGACCAT CTTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: LDLR 19p13.3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGATGGTC TTCCGGTTGC CCCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: LDLR 19p13.3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGACATCGA TGCTTGAGAT GGAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MET-H 7q31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTGGTCTA AGTTGCTGAT TACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MET-H 7q31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTTTTCT GACGATCTTT CAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MET-H 7q31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTGAAAGAT CGTCAGAAAA ATCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MET-H 7q31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTAATCAGC AACTTAGACC AAAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: PROC 2q13-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACAGCG GCCCACTGCA TGGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: PROC 2q13-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTCCAAGA AGCTCCTTGT CAGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: PROC 2q13-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGACAAGG AGCTTCTTGG ACTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: PROC 2q13-q21

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATGCAGT GGGCCGCTGT CAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Equus caballus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MET-H 7q31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCATGTA GGAGAGCCTT AGTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRADO: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Equus caballus

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(vii): FUENTE INMEDIATA

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(B): CLON: MET-H 7q31

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 94:

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CCATTTTTGT GTCTTCTAGT CTAAGG

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(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. SEC. Nº: 95:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRADO: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): SIN SENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Equus caballus

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(vii): FUENTE INMEDIATA

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(B): CLON: MET-H 7q31

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 95:

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TTGAAAGATC GTCAGAAAAA TCC

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Claims

1. Un método para análisis genéticos de un conjunto de individuos de la misma especie, el cual:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el PNS no causa la característica.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye además:

un análisis de las frecuencias de aparición determinantes entre los PNS del conjunto, que permiteestablecer un mapa genético en que los PNS actúan como marcadores.

4. Un método para determinar la probabilidad de que una muestra de ácido nucleico provenga de un individuo particular, el cual:

determina a partir de ello una probabilidad de identidad/no identidad para cada comparación; y

determina a partir de ello una probabilidad acumulada de identidad/no-identidad como el producto de probabilidades obtenidas en cada comparación.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la muestra de ácido nucleico es desconocida y el individuo particular es conocido.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la serie polimórfica comprende un conjunto de marcadores genéticos de referencia que incluyen tres o más PNS.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, que involucra determinar las frecuencias alélicas de aparición de los PNS por comparación de los resultados para cada PNS marcador.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la probabilidad acumulada de identidad o no-identidad es superior a 0,95.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual las moléculas de ácido nucleico son ADN.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual las moléculas de ácido nucleico son ARN.

11. Un método de determinación de la probabilidad de que un individuo sea o no progenie de un antecesor o unos antecesores putativos, el cual:

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual el antecesor putativo es un padre putativo, o los antecesores putativos son los padres putativos.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, el cual se utiliza para excluir la posibilidad de paternidad de que un macho o varón sea padre putativo de un individuo por cálculo de una probabilidad de exclusión de paternidad por comparación de ambos, y determinación de una probabilidad acumulada de exclusión de paternidad por multiplicación de dichas probabilidades de exclusión de paternidad.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, el cual se emplea para establecer la probabilidad de que un individuo sea progenie de una hembra o mujer putativa seleccionada.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la probabilidad acumulada de identidad o no-identidad es superior a 0,95.

16. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el cual la probabilidad acumulada de exclusión de paternidad es superior a 0,95.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual la probabilidad de exclusión es superior a 0,99.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, el cual determina que la probabilidad de que un individuo sea o no progenie de un antecesor o unos antecesores putativos se obtiene a partir de la identificación de relaciones obtenidas por comparación de los resultados para cada PNS marcador y detección de las frecuencias alélicas de los PNS en la serie o las series polimórficas.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los PNS marcadores se hallan en múltiples loci desenlazados.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los PNS marcadores son dialélicos o trialélicos.

21. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo propósito es la determinación del genotipo de una planta o un animal.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual el individuo es un múrido, ovino, equino, bovino, porcino, canino felino o un ser humano.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la característica es una predisposición a una enfermedad genética.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la presencia o la ausencia de los PNS viene determinada por análisis de bits genéticos (ABG).

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la serie polimórfica incluye 3 o más PNS.

26. Un método de elaboración de un mapa genético de un individuo, el cual:

(c) determina el número de coincidencias entre el individuo y el antecesor; y

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual las posiciones de los PNS utilizados para la construcción del mapa genético están distribuidos arbitrariamente por todo el genoma de la especie.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual un antecesor se selecciona entre un grupo constituido por padres y abuelos.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las los PNS variantes no causan ninguna característica genética.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la característica de interés es una predisposición a padecer una enfermedad genética.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la característica de interés es una enfermedad genética.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el individuo se selecciona de entre un animal o una planta.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el individuo es un mamífero.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual el mamífero se selecciona entre seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, vacas, ovejas, caballos, ratones, ratas y conejos.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 34, en el cual el mamífero es un ser humano.

36. Un método de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual el mamífero es un caballo.

37. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual cada PNS presenta una frecuencia de aparición de por lo menos 0,20.

38. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que incluirá posteriormente calcular una segmentación LOD y determinar una relación genética entre PNS variantes y la característica de interés.

39. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la serie polimórfica incluye tres o más PNS.

40. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual ninguno de los PNS variantes de la serie polimórfica causa la característica.