ES2240989T3 - Receptor de quimiocinas capaz de unirse a mcp-1, mip-1 alfa y/o rantes y sus usos. - Google Patents

Receptor de quimiocinas capaz de unirse a mcp-1, mip-1 alfa y/o rantes y sus usos.

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ES2240989T3 ES96900656T ES96900656T ES2240989T3 ES 2240989 T3 ES2240989 T3 ES 2240989T3 ES 96900656 T ES96900656 T ES 96900656T ES 96900656 T ES96900656 T ES 96900656T ES 2240989 T3 ES2240989 T3 ES 2240989T3
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Abstract

UN RECEPTOR DE QUEMOCINA QUE SE UNE A MCP L} Y/O RANTES. SE PUEDE UTILIZAR EN LA SELECCION DE AGENTES QUE ACTUAN COMO ANTAGONISTAS DE MCP DICHOS AGENTES PUEDEN SER UTILES EN EL TRATAMIENTO DE DIVERSOS TRASTORNOS, COMO ALERGIAS, ATEROMAS Y ENFERMEDADES MEDIADAS POR VIRUS. ASIMISMO PUEDEN SER UTILES EN LA PREVENCION DEL RECHAZO A INJERTOS Y EN LA PROTECCION DE CELULAS MADRE DE LOS EFECTOS PERJUDICIALES DE LA QUIMIOTERAPIA.

Description

Receptor de quimiocinas capaz de unirse a MCP-1, MIP-1 \alpha y/o RANTES y sus usos.
La presente invención se refiere a receptores de quimiocinas.
Las quimiocinas son una creciente familia de citocinas quimiotácticas que han estado implicados en desempeñar un papel en el reclutamiento y activación de células (Oppenheim, J.J. y col., Ann. Rev. Immunol., 9, 617-48, (1991), Schall, T. J., Cytokine, 3, 165-183, (1991)). Principalmente son responsables de la activación y el reclutamiento de leucocitos, pero no exclusivamente. Un análisis adicional de esta superfamilia de proteínas ha demostrado que puede dividirse en dos subfamilias adicionales de proteínas. Éstas se han denominado CXC o \alpha-quimiocinas, y CC o \beta-quimiocinas, según la separación de los residuos de cisteína conservados junto al amino terminal de las proteí-
nas.
Hasta la fecha se han identificado dos receptores para la familia de las quimiocinas CC. El primero, que es un receptor principalmente para MIP-1\alpha (polipéptido inflamatorio macrófago-1\alpha) y RANTES (leucocitos normales formados tras una activación, derivados y secretados), ha sido descrito previamente (Gao, J. L. Y col., J. Exp. Med., 177, 1421-7 (1993), Neote, K. y col., Cell 72, 415-25 (1993)). El segundo receptor de quimiocinas CC que se ha descrito recientemente es para la MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos-1) Charo I., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 91, 2752-2756 (1994). Más recientemente se ha demostrado que otro receptor, el US28, expresado por el citomegalovirus humano, es un receptor para RANTES, MIP-1\alpha y MCP-1 (Gao, J. L. y Murphy P. M., J. Biol. Chem. 269, 28539-28542 (1994)). Los tres receptores son del tipo de siete segmentos en hélice alfa transmembranales, y se expresan en las membranas de las células.
Sin embargo, hasta ahora permanece una necesidad de identificar receptores de quimiocinas no descritos y de caracterizarlos con el fin de desarrollar una imagen más completa de la estructura y la función de los receptores de quimiocinas.
Según la presente invención, se proporciona un receptor de quimiocinas con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 3.
Este receptor es capaz de unirse preferiblemente a MCP-1, MIP-1\alpha y RANTES. Puede ser importante en la función de basófilos y linfocitos T.
Puede usarse para detectar agentes farmacéuticamente activos. La presente invención incluye por tanto dentro de su alcance dichos agentes (que pueden ser o no proteínas). Pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Dicha composición está dentro del alcance de la presente invención. Puede prepararse mezclando el vehículo con el agente farmacéuticamente activo en condiciones estériles. La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de dosis unitaria. Puede estar presente como parte de un kit que incluya instrucciones para su uso.
La composición farmacéutica puede estar adaptada para su administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluyendo bucal o sublingual) rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica).
Un receptor de la presente invención puede usarse para detectar agentes útiles para el tratamiento de alergias, por ejemplo, asma, dermatitis atópica, rinitis, fiebre del heno, eccema o alergias alimentarias. También puede ser útil en la detección de agentes útiles para tratar la conjuntivitis. Los MCP-1, MIP-1\alpha y RANTES se unen todos al receptor de la presente invención y son capaces de provocar la liberación de histamina desde los basófilos. Un agente que bloquee esta unión puede evitar o reducir por tanto la liberación de histamina desde los basófilos (es decir, actuar como un antagonista de MCP-1, MIP-1\alpha o RANTES). Dichos agentes pueden ser variantes de MCP-1, MIP-1\alpha o RANTES (a los que se les ha eliminado, sustituido o insertado uno o más aminoácidos con respecto a los MCP-1, MIP-1\alpha y RANTES), aunque esto no es esencial.
También puede estar implicado en la activación de los linfocitos T, una característica común de estados inmunitarios y otros estados inflamatorios.
La unión de agentes al receptor de la presente invención puede ensayarse mediante técnicas adecuadas.
Por ejemplo, puede usarse técnicas electrofisiológicas. En una de dichas técnicas puede usarse un ovocito de Xenopus, por ejemplo, para expresar un receptor de la presente invención. El receptor puede expresarse en la membrana del ovocito tras una microinyección en el ovocito de ARN que codifica para dicho receptor.
Cuando un ligando se une al receptor, puede provocar la liberación de iones calcio tanto desde depósitos intracelulares como desde fuentes extracelulares. Estos flujos de calcio provocan entonces una corriente de cloruro a través de la membrana celular, que puede medirse electrofisiológicamente.
Dichas corrientes se plantean en Wahlestedt, C., Ann. N. Y. Acad. Sci. 632, 116-22 (1991), y Boton, R. y col., J. Physiol. (Londres), 408, 511-534 (1989), por ejemplo.
Como alternativa al uso de técnicas electrofisiológicas o de otras técnicas que se basan en una respuesta biológica a la unión del receptor, pueden usarse ensayos de unión más directos. Por tanto, podrían marcarse los ligandos con un marcaje detectable, dejar que se unieran a un receptor, y el marcaje podría entonces ser detectado. Algunos marcajes adecuados que podrían usarse incluyen marcajes radiactivos, marcajes fluorescentes, enzimas que puedan provocar un cambio detectable, etc..
El receptor de la presente invención también puede usarse para detectar agentes adecuados para el tratamiento de ateromas. A este respecto debería mencionarse que MCP-1 es un reclutador clave de monocitos hacia las placas ateroscleróticas. El receptor puede usarse para detectar agentes que eviten o reduzcan dicho reclutamiento (que actúen como antagonistas de MCP-1\alpha). Dichos agentes pueden ser variantes de la propia MCP-1 (en la que se han eliminado, sustituido o insertado uno o más aminoácidos con respecto a la MCP-1), aunque esto no es esencial.
Un uso adicional del receptor de la presente invención es para detectar agentes que provocan una inhibición de la proliferación de células madre, en otras palabras, para detectar agonistas de MIP-1\alpha. Se ha demostrado que MIP-1\alpha (Graham, G. J. y col., Nature 344, 442- (1990)) inhibe la proliferación de células madre hematopoyéticas. Como tales, los agonistas del receptor podrían usarse para evitar la proliferación de células madre durante la quimioterapia, lo que protegería por tanto a las células madre de efectos potencialmente dañinos de dicha quimioterapia.
Se sabe que MIP-1\alpha es un inhibidor de la proliferación de células madre, y pueden detectarse agentes que también son inhibidores de la proliferación de células madre usando el receptor de la presente invención. Dichos agentes pueden ser variantes de la propia MIP-1\alpha (en el que se han eliminado, sustituido o insertado uno o más aminoácidos respecto a MIP-1\alpha), aunque esto no es esencial.
Otro uso del receptor de la presente invención es la detección de agentes útiles para reducir la probabilidad de rechazo de un trasplante o para aumentar la duración del tiempo antes de que se produzca el rechazo. A veces se encuentran altos niveles de RANTES en los trasplantes renales, y pueden relacionarse con el rechazo de dichos trasplantes. Los agentes que evitan o reducen la unión de los RANTES al receptor de la presente invención pueden por tanto ser útiles en el trasplante actuando como antagonistas de los RANTES. Dichos agentes pueden ser variantes de los propios RANTES (en los que se han eliminado, sustituido o insertado uno o más aminoácidos con respecto a los RANTES), aunque esto no es esencial.
Un uso adicional de la presente invención es en la detección de sustancias útiles para el tratamiento de enfermedades mediadas por virus. Por tanto, puede usarse como un detector de agentes antivíricos.
Un ejemplo de esto es la detección de agentes útiles para el tratamiento del SIDA. Se ha sugerido que los niveles de MIP-1\alpha y de RANTES pueden ser al menos parcialmente responsables de que ciertos pacientes con SIDA sobrevivan más que otros. Dado que un receptor de la presente invención puede unirse a MIP-1\alpha y/o a RANTES, puede usarse para detectar otros agentes que podrían ser útiles en el tratamiento del SIDA.
También es notable que los virus del citomegalovirus y herpes humanos tienen receptores de quimiocinas. La presente invención podría usarse para detectar agentes útiles en el tratamiento de las enfermedades mediadas por dichos virus.
Debería mencionarse que la presente invención no se limita al receptor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 3, sino que cubre variantes (variantes alélicas y no alélicas) con una o más eliminaciones, inserciones o sustituciones de los aminoácidos con respecto a dicha secuencia, siempre que dichas variantes tengan al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 y sean capaces de unirse a al menos una de las quimiocinas: RANTES, MIP-1\alpha y MCP-1. (Deseablemente, sin embargo, los receptores son capaces de unirse a todas estas quimiocinas). La unión puede determinarse mediante el control de la respuesta de las células en un ensayo electrofisiológico con ovocitos, según se ha descrito ya.
Por ejemplo, el experto en la materia apreciará que a menudo pueden sustituirse varios aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares sin alterar o afectar negativamente sustancialmente ciertas propiedades de una proteína. Por tanto, los aminoácidos glicina, valina, leucina o isoleucina a menudo pueden sustituirse por otro (aminoácidos con cadenas laterales hidroxílicas alifáticas). Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse por otro incluyen: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos con cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos con cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos con cadenas laterales ácidas); asparragina y glutamina (aminoácidos con cadenas laterales amida) y cisteína y metionina (aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre). Por tanto, la presente invención incluye dentro de su alcance variantes del receptor mostrado en la Fig. 3, que incluyen una o más de dichas sustituciones.
Sin embargo, es preferible que las variantes del receptor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 3 tengan una identidad aminoacídica sustancial con dicha secuencia de aminoácidos. El grado de identidad aminoacídica puede calcularse usando un programa tal como "bestfit" (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de similitud entre las dos secuencias. La alineación se basa en maximizar la puntuación conseguida usando una matriz de similitud de aminoácidos, tal como la descrita por Schwartz y Dayhof (1979), Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed., págs. 353-358.
Preferiblemente, sin embargo, el grado de identidad de la secuencia es de al menos un 90% o de al menos un 95%.
El receptor, o la variante del mismo, puede incluir una metionina N terminal. Dichas metioninas se incorporan a veces durante la traducción, y no son posteriormente eliminadas.
El receptor o su variante puede estar unido covalentemente a otra fracción (por ejemplo, una proteína). Por tanto, pueden formarse proteínas de fusión. Éstas son bien conocidas en la técnica, y pueden usarse para ayudar en la identificación o en la purificación, o de otro modo alterar las propiedades del receptor o de una variante del mismo (por ejemplo, para alterar su estabilidad y/o sus propiedades de unión).
También pueden proporcionarse variantes truncadas del receptor con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, dado que pueden eliminarse uno o más aminoácidos de dicha secuencia, conservando al mismo tiempo la unión a MIP-1\alpha, RANTES y/o MCP-1. Éstas pueden ser eliminaciones N terminales, eliminaciones C terminales o pueden producirse dentro de dicha secuencia.
El receptor o su variante (de cualquier naturaleza) puede proporcionarse en una forma sustancialmente pura. Puede aislarse a partir de otras proteínas y puede aislarse a partir de una membrana celular. Puede estar en forma glucosilada o no glucosilada (dependiendo del sistema de expresión usado). Un receptor o una variante del mismo de la presente invención pueden proporcionarse mediante cualquier técnica adecuada.
Preferiblemente se usan técnicas de clonación de genes. Dichas técnicas se describen en, por ejemplo, J. Sambrook y col., Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Alternativamente puede usarse la síntesis química (aunque esto es menos preferible). Por ejemplo, pueden prepararse péptidos sintéticos cortos y después unirse entre sí para proporcionar una sustancia de la presente invención. Dichos péptidos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por tanto, puede inmovilizarse un extremo de una molécula, y los residuos de aminoácidos deseados pueden añadirse secuencialmente. Pueden usarse grupos protectores para evitar reacciones secundarias no deseadas, y después eliminarse.
Como sustancias de la presente invención se mencionan a continuación variantes del receptor de la presente invención junto con el propio receptor.
Dichas sustancias pueden usarse para crear o seleccionar anticuerpos. Estos incluyen anticuerpos que se unen a una sustancia de la presente invención. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a sustancias de la presente invención, de forma que pueden ser usados para purificar dichas sustancias. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.
Pueden crearse anticuerpos policlonales estimulando su producción en un animal hospedador adecuado (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, una oveja, una cabra o un mono) cuando se inyecta la sustancia de la presente invención en el animal. Si es necesario, puede administrarse un coadyuvante junto con la sustancia de la presente invención. Los anticuerpos pueden entonces purificarse en virtud de su unión a la sustancia de la presente invención.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse a partir de hibridomas. Estos pueden formarse fusionando células de mieloma y células de bazo que producen el anticuerpo deseado, con el fin de formar una línea celular inmortal. Esta es la conocida técnica de Kohler & Milstein (Nature 256, 52-55 (1975)).
Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a una proteína particular están ahora muy desarrolladas en la materia. Se discuten en libros habituales de inmunología, por ejemplo, en Roitt y col., Immunology, 2ª edición (1989), Churchill Livingstone, Londres.
Además de los anticuerpos completos, se incluyen derivados de los mismos que son capaces de unirse a sustancias de la presente invención.
Por tanto, también se describen fragmentos de anticuerpos y construcciones sintéticas. Dougall y col., en Tibtech 12, 372-379 (septiembre de 1994) dan algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos y construcciones sintéticas.
Algunos fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv (véase Roitt y col., (véase lo anterior).
Los fragmentos Fv pueden modificarse para producir una construcción sintética sintético conocido como una molécula con una única cadena Fv (scFv). Este incluye un péptido conector que une covalentemente las regiones V_{h} y V_{l}, lo que contribuye a la estabilidad de la molécula.
Otras construcciones sintéticas incluyen péptidos CDR. Estos son péptidos sintéticos que comprenden determinantes de unión a un antígeno. También pueden usarse péptidos miméticos. Estas moléculas son generalmente anillos orgánicos conformacionalmente confinados que mimetizan la estructura de un bucle CDR y que incluyen cadenas laterales que interaccionan con antígenos.
Algunas construcciones sintéticas incluyen moléculas quiméricas. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos o los derivados de los mismos humanizados (o primatizados) también están dentro del alcance de la presente invención. Un ejemplo de un anticuerpo humanizado es un anticuerpo con regiones de marco de lectura humanas, pero con regiones hipervariables de roedores.
Las construcciones sintéticas también incluyen moléculas que comprenden una fracción unida covalentemente que provee a la molécula con alguna propiedad deseable, además de la unión a un antígeno. Por ejemplo, la fracción puede ser un marcaje (por ejemplo, un marcaje fluorescente o radiactivo) o un agente farmacéuticamente activo.
Los anticuerpos o los derivados de los mismos tienen una amplia variedad de usos. Pueden usarse en la purificación y/o la identificación de sustancias de la presente invención. Por tanto, pueden usarse en diagnóstico.
Pueden proporcionarse en forma de un kit para la detección de las sustancias de la presente invención.
La presente invención también incluye dentro de su alcance moléculas de ácido nucleico que codifican para sustancias de la presente invención (es decir, para el receptor o las variantes del mismo mencionados anteriormente). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser ARN o ADN, y pueden proporcionarse en forma aislada o recombinan-
te.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden proporcionarse mediante cualquier técnica adecuada.
Se prefieren las técnicas de clonación de genes (véase Sambrook y col., véase antes). Las variantes de una secuencia de un ácido nucleico dado pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida).
Alternativamente pueden usarse técnicas de síntesis química, pero son menos preferibles.
Pueden usarse vectores para incorporar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Los vectores pueden ser vectores eucariotas o procariotas, y pueden incorporarse en células hospedadoras adecuadas o en sistemas de expresión no celulares.
Las moléculas de ácido nucleico que son complementarias de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente también están dentro del alcance de la presente invención. Éstas se denominan algunas veces "moléculas antisentido". Pueden hibridar para complementar las moléculas de ácido nucleico, y pueden por lo tanto evitar o reducir la expresión del producto de un gen. Por tanto, pueden usarse para alterar la expresión génica.
El uso de dichas moléculas es útil para estudiar la función y la regulación de los genes. Las técnicas de marcaje e hibridación apropiadas pueden ser útiles para identificar la localización de las regiones codificantes.
En este documento también se describen ácidos nucleicos que pueden usarse como sondas para receptores de quimiocinas. Las sondas preferidas pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico que codifica para la proteína con las secuencias de aminoácidos dadas en la Fig. 3, o para variantes de la misma, según se describió anteriormente. Dichas sondas pueden tener cualquier longitud adecuada, pero típicamente tendrán más de 15 nucleótidos de longitud, y pueden tener al menos 100 nucleótidos de longitud.
Las sondas hibridarán deseablemente con una secuencia diana en unas condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo de unas condiciones de hibridación rigurosas es una temperatura de 35-65ºC, y una concentración salina de aproximadamente 0,9 molar. Pueden usarse otras condiciones de hibridación rigurosas, y la concentración salina no necesita ser tan alta como 0,9 molar.
Pueden usarse las secuencias de ácido nucleico dadas en las Figs. 1 y 3 de este documento, o fragmentos de las mismas, como sondas o cebadores, o para preparar sondas o cebadores.
Los cebadores pueden usarse para amplificar secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, usando PCR u otras técnicas de amplificación. Las sondas pueden usarse en diagnóstico o en purificación.
La presente invención se explicará ahora, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la Fig. 1 muestra una secuencia de ADNc y una secuencia de aminoácidos deducida de un clon denominado "TM(2-7)5.5", que se usó para sondear una genoteca de ADNc \lambdaGT11 de bazo humano.
La Fig. 2 muestra varios cebadores que se usaron para secuenciar un clon aislado a partir de la genoteca mencionada en la Fig. 1 anterior, usando el ADN del TM(2-7)5.5 como sonda.
La Fig. 3 muestra una secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida con respecto al clon mencionado en la Fig. 2 anterior, denominándose el clon "K5.5".
Las Figs. 4 a 6 muestran análisis por transferencia Northern preparados usando ADN del TM(2-7)5.5 en varios estudios de hibridación. En estas figuras se usa el siguiente sistema de puntuación:
+++
señal positiva muy fuerte visible después de cuatro horas de exposición de la autorradiografía.
++
señal positiva clara visible después de cuatro horas de exposición de la autorradiografía.
+
señal no visible después de cuatro horas de exposición de la autorradiografía, pero clara después de 24 horas.
+/-
señal positiva débil visible únicamente después de 24 horas de exposición.
-
sin señal.
Las sondas se usaron a una actividad específica de 10^{6} cpm/ml en disolución de hibridación.
La Fig. 7 muestra el análisis en geles de agarosa de los productos de expresión del ARNm del receptor K5.5 de leucocitos y algunas líneas celulares humanas, habiéndose amplificado el ARN mediante el uso de PCR con transcriptasa inversa.
La Fig. 8A muestra un análisis de la corriente inducida en ovocitos de Xenopus con voltaje restringido en los que se había microinyectado ARNc de K5.5 tras su estimulación con varios ligandos de quimiocinas.
La Fig. 8B muestra un análisis similar al realizado en la Fig. 8A pero usando diferentes quimiocinas (aparte del MIP-1\alpha, que se muestra en ambas figuras para comparar). Los presentes inventores fueron incapaces de obtener ningún dato que demuestre que la IL-8 se una a moléculas CC-CKR3. Los receptores preferibles dentro del alcance de la presente invención no se unen a la IL-8.
La Fig. 9 muestra los resultados de un ensayo de unión usando [^{125}I]-MIP-1\alpha y [^{125}I]-RANTES de la unión a moléculas CC-CKR-3 humanas y murinas.
Ejemplos
Una alineación de las secuencias de aminoácidos del receptor A y B de la IL-8 y del C-C del CKR-1 (receptor de MIP-1\alpha/RANTES) indicó que una región entre los dominios transmembranales 3 y 4 propuestos contiene la secuencia conservada de aminoácidos R Y L A I V H A.
Una segunda secuencia de aminoácidos conservada aparece en el 7º dominio transmembranal propuesto en estos tres receptores, así como en dos receptores de péptidos quimiotácticos no quimiocínicos para fMLP (formil-metionina-leucina-fenilalanina) y C5a, como sigue:
C L (o V, I) N P I (o L, M, V) I (o L) Y A (o V) F (o V)
Se prepararon oligonucleótidos degenerados que contenían la mayoría de los codones posibles que podían ser traducidos para dar las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.
Estos oligonucleótidos tenían las secuencias:
a) sentido 5' GIT AYY TIG CIA THG TIC AYG C
o
b) antisentido 5' AMI RCR TAI ADI AII GGR TTI AIR C
usando los códigos IUB/GCG, en los que:
I = inosina, que puede sustituir a A, T, G o C
Y = C o T
H = A, C o T
M = A o C
R = A o G
D = A, G o T
Los oligonucleótidos se usaron entonces para clonar un receptor de quimiocinas CC humano usando el procedimiento establecido a continuación.
(a) Clonación de una secuencia denominada K5.5 humano (CC-CKR-3) *
(* La denominación CC-CKR-3 se usa aquí por coherencia con la denominación usada en el documento precedente. Sin embargo, se menciona que otros grupos de investigación están usando ahora la denominación CC-CKR-3 para una molécula diferente, y que la molécula denominada en este documento CC-CKR-3 puede ahora denominarse en la bibliografía CC-CKR-4).
Se aisló el ARN total a partir de 1 x 10^{8} células KU812 mediante el procedimiento de Chomczynski y Sacchi, (1987) (procedimiento de aislamiento del ARN en una etapa mediante extracción ácida con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, Anal. Biochem. 162, 156-159). Estas células eran de una línea celular de basófilos humanos KU812, que fue una donación del Dr. K. Kishi, Niigata, Japón.
Posteriormente se aisló el ARNm PoliA+ mediante cromatografía en celulosa con oligodT usando un kit de purificación de ARNm poliA quik (Stratagene). Se preparó ADNc monocatenario a partir de 1 \mug de ARNm poliA+ en una reacción de 50 \mul que contenía 1 \mug de oligodT_{12-18}, hidróxido metilmercúrico 4 mM, dNTP 1 mM, tampón tris-HCl 50 mM a pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 8 mM, 10 unidades de ARNsin y 100 unidades de transcriptasa inversa XL de AMV (Life Sciences Inc.) durante 60 min a 42ºC. Entonces se sometieron alícuotas de 5 \mul de la mezcla de reacción a 40 ciclos de PCR (95ºC, 2 min; 37ºC, 2 min y 72ºC, 2 min) en tampón Tris-HCI 10 mM a pH 8,3, KCI 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTPS 0,2 mM y 2,5 unidades de AmplitaqTM (Perkin Elmer Cetus) usando 3 \muM de cada cebador oligonucleótido degenerado (sentido 5' GIT AYY TIG CIA THG TIC AYG C y antisentido 5' AMI RCR TAI ADI AII GGR TTI AIR C) en un termociclador Techne PHC-2.
Los productos de la reacción de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1% que contenían 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Los productos de la reacción que migraron en los tamaños predichos (500-550 pb) se purificaron en gel mediante procedimientos estándar (Sambrook J. y col., 1989 en Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). El ADN purificado en gel se cortó entonces en extremos romos mediante el tratamiento secuencial con polinucleótido T4 quinasa (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante, en un volumen total de 50 \mul durante 1 h a 37ºC. Después de este tiempo, se añadieron 2,5 \mul de dNTP 2,5 mM y 1 \mul de fragmento Klenow de ADN de polimerasa I de E. coli (New England Biolabs), y la incubación continuó durante 30 min adicionales a 37ºC. La mezcla de reacción se inactivó entonces por calor a 70ºC durante 30 min y después se extrajo una vez con fenol/cloroformo saturado con Tris-HCI a pH 8,0 (1:1 v/v). El ADN se precipitó mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 3 M a pH 5,5, 1 \mul de glucógeno (20 mg/ml) (Boehringer) y 250 \mul de etanol a -20ºC. El ADN se recuperó mediante centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a 4ºC y se lavó con etanol al 70%. El sedimento final se resuspendió en agua estéril a una concentración de 10 ng/\mul.
Se preparó un vector de clonación pBluescript II SK (Stratagene) como sigue: 20 \mug de plásmido purificado en gradiente de CsCI se digirieron en un volumen de reacción de 100 \mul durante 2 h a 37ºC con 200 unidades de Eco RV o Eco RI (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante. Después de 2 h, el vector digerido se trató con 10 \mul de fosfatasa alcalina intestinal de becerro (24 unidades/ml) (Boehringer) durante 30 min adicionales a 37ºC.
La mezcla de reacción se inactivó por calor a 68ºC durante 15 min y después se extrajo una vez con fenol/cloroformo saturado con Tris-HCI a pH 8,0 (1:1 v/v). El ADN del plásmido se precipitó mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 3 M a pH 5,5, y 250 \mul de etanol a -20ºC. El ADN se recuperó mediante centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a 4ºC y se lavó con etanol al 70%. El sedimento final se resuspendió en agua estéril a una concentración de
50 ng/\mul.
El producto con extremos romos de la PCR (10 ng) se ligó a 50 ng de vector de clonación de plásmido pBluescript II SK digerido con Eco RV y tratado con fosfatasa alcalina en 20 \mul de volumen usando 2 \mul de ligasa T4 de ADN (400.000 unidades/ml) (New England Biolabs) durante al menos 16 h a 15ºC. Los productos de la ligación se diluyeron hasta 100 \mul con 1 x TE (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0/EDTA 1 mM) y se extrajeron fenol/cloroformo según se describió previamente. Los productos de la ligación se precipitaron mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 3M a pH 5,5, 1 \mul de glucógeno (20 mg/ml) y 250 \mul de etanol durante 15 min a -70ºC. El ADN se recuperó mediante centrifugación según se describió anteriormente y se resuspendió en 10 \mul de agua estéril. Entonces se electroporaron cinco \mul de los productos de la ligación resuspendidos en la cepa electrocompetente de E. coli XL-1 blue (recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac, [F' proAB, lacIgZDM15, Tn10 (tet^{r})] (40 \mul) usando un generador de impulsos Bio Rad Gene, según las instrucciones del fabricante. Tras la electroporación, se añadió 1 ml de medio LB y las células se hicieron crecer a 37ºC durante 1 h. Después de este tiempo, se colocaron en placas alícuotas de 100 \mul del medio de cultivo en placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y se hicieron crecer durante 16 h a 37ºC. Entonces las colonias bacterianas individuales se recogieron en 5 ml de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se hicieron crecer hasta el día siguiente a 37ºC. Entonces se realizaron preparaciones de ADN de plásmido a pequeña escala (mini-preps) a partir de 3 ml de cada cultivo usando un sistema de purificación de ADN Wizard^{TM} mini-prep (Promega) según las instrucciones del fabricante. Entonces se digirieron alícuotas de tres \mul del ADN de la mini-prep con las enzimas de restricción Hind III y Eco RI (ambas de New England Biolabs), según las instrucciones del fabricante, en un volumen de reacción de 15 \mul. Los productos de reacción se analizaron en geles de agarosa al 1% que contenían 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Los ADN de las mini-prep, que rindieron un tamaño del inserto de aproximadamente 500-550 pb se sometieron entonces a un análisis de la secuencia del ADN usando los cebadores T3 y T7 y Sequenasa (USB) según las instrucciones del fabricante.
Una comparación de las secuencias obtenidas frente a las bases de datos del GenBank/EMBL/DDBJ reveló que 10/23 de las secuencias analizadas mostraban un 60% de identidad a nivel del ADN con respecto al C-C CKR-1 humano (receptor MIP-1\alpha/RANTES) (Neote y col., Molecular cloning, functional expression and signalling characteristics of a C-C chemokine receptor, Cell 72, 415-425 (1993)). En la figura 1 se muestra la secuencia de uno de los clones, denominado TM(2-7)5.5 (abreviado a K5.5).
Se preparó ADN de plásmido purificado en gradiente de CsCI para el clon K5.5 mediante procedimientos estándar. Se digirieron 20 \mug de ADN del plásmido a 37ºC con las enzimas de restricción Hind III y Eco RI según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Los productos de la digestión se analizaron en geles de agarosa al 1% que contenían 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. El inserto de ADN de 514 pb correspondiente al producto secuenciado de la PCR se purificó en gel según se describió previamente. Cien ng del inserto de 514 pb se marcaron con ^{32}P-dCTP (Amersham International) usando un kit de marcaje de ADN con cebado aleatorio (Boehringer) según las instrucciones del fabricante, y se usaron para detectar 5 x 10^{5} clones de una genoteca de ADNc \lambdaGT11 de bazo humano (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Tras la hibridación, los positivos duplicados se volvieron a detectar con la misma sonda hasta que se obtuvo una placa de fago positivo puro. El ADN del fago se recuperó a partir de las placas positivas usando procedimientos estándar (Sambrook J. y col. (1989)). El ADN del fago purificado (100 \mug)
se digirió con 200 unidades de Eco RI (New England Biolabs) en tampón 2 (New England Biolabs) durante 16 h a 37ºC. Los productos de la digestión se fraccionaron en geles de agarosa al 1% que contenían bromuro de etidio (0,5 \mug/ml),
y los insertos de ADNc se purificaron en gel y se ligaron en el sitio Eco RI del vector pBluescript II SK, según se describió anteriormente. Los productos de la ligación fueron transformados en la cepa de E. coli XL-1 blue (recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdRl7, supE44, relA1, lac, [F' proAB, lacIqZDM15, Tn10 (tet^{r})] mediante electroporación, como anteriormente. Se inocularon colonias bacterianas Individuales resistentes a ampicilina en caldo L que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se hicieron crecer durante 16 h a 37ºC. Se preparó ADN de la mini-prep a partir de 3 ml de medio de cultivo de toda una noche, según se describió anteriormente. Después se digirieron alícuotas de tres \mul del ADN de la mini-prep con la enzima de restricción Eco RI según las instrucciones del fabricante, en un volumen de reacción de 15 \mul. Los productos de reacción se analizaron en geles de agarosa al 1% que contenían 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Las mini-preps que contenían los insertos de ADNc se secuenciaron posteriormente usando Sequenasa^{TM} y los cebadores T3 y T7, en un secuenciador de ADN de Applied Biosystems.
Mediante la secuenciación con el cebador T7 se demostró que un clon denominado E1-C19 contenía el supuesto extremo 5' de K5.5. El ADN purificado en gradiente de CsCI del clon E1-C19 se resecuenció posteriormente con los cebadores T3 y T7 y varios cebadores de secuenciación internos basados en los resultados de la secuenciación previa (las secuencias de los cebadores se muestran en la figura 2). La secuencia del ADNc del inserto E1-C19 se muestra en la figura 3.
(b) Análisis por transferencia Northern
Se adquirieron transferencias Northern de tejidos múltiples en Clontech y se hibridaron con el fragmento de 514 pb Hind III/Eco RI de pTM(2-7)5.5 según las instrucciones del fabricante. Para otras transferencias Northern se preparó ARN total a partir de líneas celulares y poblaciones de leucocitos de sangre periférica mediante el procedimiento de Chomczynski y Sacchi (1987). Todas las líneas celulares usadas en este estudio se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS inactivado por calor y 50 \mug/ml de gentamicina (todos adquiridos en Gibco-BRL). Las células mononucleares totales en sangre periférica y las células polimorfonucleares se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll (Pharmacia). Los leucocitos se clasificaron mediante FACS usando el anticuerpo marcado adecuadamente en un FACS star (Becton Dickinson) para obtener poblaciones puras (>90%) de linfocitos B (CD20), de linfocitos T (CD4, CD8, CD45RO, CD45RA) y monocitos (CD14). Se prepararon macrófagos pulmonares y leucocitos pulmonares mezclados a partir de muestras de tejido pulmonar humano seco usando el procedimiento de Nicod y col. (1989) (Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J. Leukocyte. Biol. 45, 458).
Se electroforetizaron 5 \mug de cada ARN en geles de agarosa al 1% que contenían un 2,2% de formaldehído (v/v), se transfirieron a nitrocelulosa y se sondearon con el inserto de 514 pb marcado con ^{32}P-dCTP de TM(2-7)5.5 usando un procedimiento de transferencia Northern estándar (Sambrook y col. (1989)). Los resultados se muestran en las Figs. 4 a 6.
(c) Análisis de la expresión del ARNm del receptor K5.5 en leucocitos y algunas líneas celulares humanas mediante PCR con transcriptasa inversa
Se calentaron 10 \mug de ARN total (en un volumen de 10 \mul) y 0,5 \mul de una disolución de oligodT_{15} de 0,5 mg/ml a 70ºC durante 10 min y después se enfriaron en hielo durante 2 min, seguido de la adición de 4 \mul de tampón 5X de la primera hebra, 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de dNTP 10 mM y 1 \mul de Superscript^{TM} durante 1 h a 37ºC. Todos los reactivos para la reacción de transcripción inversa (RT) eran de Gibco-ERL excepto oligodT_{15} (Stratagene). Entonces se sometieron alícuotas de dos \mul de cada reacción de RT a 40 ciclos de PCR (2 min 95ºC; 2 min, 55ºC y 2 min, 72ºC) en 100 \mul de una mezcla de reacción que contenía 100 pmol de cada uno de los cebadores K5-5FLA y K5-5FLB. Los productos de la reacción de PCR (10 \mul) se analizaron en geles de agarosa al 1% según se describió anteriormente, para analizar la presencia de un producto de reacción de 1.085 pb correspondiente a la secuencia codificante completa de K5.5. Los resultados se muestran en la Fig. 7, en la que las muestras de los carriles indicadas en la Fig. 7 son como sigue:
Carril Muestra
1 Marcadores de pesos moleculares
(desplazamiento de 1 kb)
2 Linfocitos T de sangre periférica (estimulados por IL-2)
3 Linfocitos T de sangre periférica
4 Jurkat
5 MOLT-4
6 Linfocitos B de sangre periférica
7 Linfocitos B de sangre periférica
8 Macrófagos pulmonares
9 Monocitos de sangre periférica
10 KU812
11 EOL-3
12 SW900 (línea celular epitelial pulmonar)
13 CCLu32 (línea celular de fibroblasto pulmonar)
14 LL24 (línea celular de fibroblasto pulmonar)
15 AALT.16 (línea celular de músculo liso aórtico)
(d) Expresión del ARNc de K5.5 en ovocitos de Xenopus
El ADN del plásmido pE1-C19 purificado en gradiente de CsCl (5 \mug) se linealizó usando la enzima de restricción Bam HI (New England Biolabs) en un volumen de reacción de 100 \mul hasta el día siguiente a 37ºC. Los plásmidos linealizados se trataron con 2 \mul de proteinasa K (16,7 mg/ml, Boehringer) durante 30 min a 37ºC. El ADN se extrajo dos veces con fenol (0,1 M, saturado con Tris, pH 8,0) y una vez con cloroformo. Se añadió glucógeno (1 \mul de la disolución de reserva de 20 mg/ml) a la fase acuosa, y el ADN linealizado precipitó tras la adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,5, y 2,5 volúmenes de etanol durante 1 h a -80ºC. El ADN se recuperó mediante centrifugación (14.000 rpm, 4ºC en una micrófuga), se lavó con etanol al 70% y se disolvió en agua sin ribonucleasa a
250 ng/ml.
Los transcritos de ARNc con caperuza se generaron a partir de 1 \mug de ADN linealizado con Bam HI (New England Biolabs) en un volumen de reacción de 100 \mul que contenía 20 \mul de tampón de transcripción (5X), 4 \mul de mezcla de NTP (ATP, UTP y CTP 10 mM, GTP 3 mM), 4 \mul de DTT 0,75 M, 2,5 \mul de RNAsin, 0,5 \mul de GTP (10 mM), 4 \mul de análogo de CAP (m7G(5')ppp(5')G 10 mM) y 2,5 \mul de polimerasa T7 o T3 de ARN, respectivamente. Todos los reactivos usados para la reacción de transcripción in vitro eran de Promega, excepto el análogo de CAP (Pharmacia). Después de 1,5 h a 37ºC, se añadieron 4 \mul de Desoxirribonucleasa RQ1 (Promega) y la mezcla de reacción se incubó durante 15 min adicionales a 37ºC. La mezcla de reacción se extrajo dos veces con fenol/cloroformo saturado con Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, (1:1 v/v) y una vez con cloroformo. Se añadió glucógeno (1 \mul, como anteriormente) a la fase acuosa y el ARNc precipitó hasta el día siguiente a -20ºC tras la adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,5, y 2,5 volúmenes de etanol. El ARNc se recuperó mediante centrifugación (14.000 rpm, 4ºC, 20 min en una micrófuga), el sedimento se lavó en etanol al 70% y se resuspendió en agua estéril a 1 \mug/\mul. Se obtuvo un estimado aproximado de la concentración del ARNc analizando una alícuota del material resuspendido en un gel de agarosa al 1% que contenía 2,2% (v/v) de formaldehído frente a marcadores de ARN de concentración conocida. Las muestras se almacenaron a -80ºC antes de su uso.
Se recogieron ovocitos de hembras adultas de Xenopus laevis, mediante procedimientos estándar (Bertrand y col., 1991). Los ovocitos se desfolicularon mediante incubación en colagenasa al 0,2% (p/v) (Sigma) en 50 ml de medio OR2 sin Ca^{2+} y sin Mg^{2+} en un frasco de agitación con una agitación lenta durante 2 h a temperatura ambiente (el medio OR2 es NaCl 82,5 mM, KCl 2,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 1 mM, HEPES 15 mM, CaCI_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 7,6). Los ovocitos se aclararon cuidadosamente con OR2 seguido por MBS (disolución salina de Barth modificada: NaCl 88 mM, KCI 1 mM, Ca(NO_{3})_{2} 0,33 mM, CaCl_{2} 0,41 mM, MgSO_{4} 0,82 mM, NaHCO_{3} 2,4 mM, HEPES 10 mM, pH 7,6) y se dejaron recuperar durante al menos 1-2 h en MBS antes de seleccionar los ovocitos de las etapas V-VI. Los ovocitos seleccionados se incubaron en MBS complementado con penicilina/estreptomicina (100 unidades/ml) (Gibco-BRL) hasta el día siguiente a 18ºC antes de la inyección.
Los ovocitos se microinyectaron usando una bomba Inject + Matic air (Gabay) usando agujas fabricadas por Drummond calibradas para capilares de 6 ml. El ARNc (25 ng in 50 nl) se inyectó en el citoplasma. Los ovocitos se transfirieron individualmente a los pocillos de una placa de cultivo de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron en MBS durante 24-72 h.
Los registros electrofisiológicos se realizaron 1-3 días después de la inyección en ovocitos inundados con medio OR2 a temperatura ambiente en condiciones de voltaje restringido usando dos microelectrodos (1-2 M\Omega, ambos rellenos con KCl 3 M), siendo el potencial de membrana restringido de forma rutinaria a -100 mV usando un instrumento Gene Clamp 500 (Axon).
Las quimiocinas del ensayo se adquirieron en PeptroTech o se produjeron internamente en Glaxo Institute for Molecular Biology, y se resuspendieron a una concentración de 1 \muM en PBS. Se aplicaron cincuenta \mul de cada quimiocina directamente sobre los ovocitos con voltaje restringido, y la corriente inducida se controló en un osciloscopio Tektronix 5113 de almacenamiento de doble haz unido a un PC IBM. Cuando se ensayaban múltiples quimiocinas sobre un mismo ovocito se dejó un tiempo de recuperación de 2 min entre cada aplicación. Los resultados se muestran en la Fig. 8A.
La Fig. 8B muestra los resultados de un análisis similar al ilustrado en la Fig. 8A, pero usando diferentes quimiocinas (aparte de MIP-1\alpha).
Puede observarse que no se observó una respuesta electrofisiológica significativa cuando se usó IL-8, en contraste con el resultado obtenido para el MIP-1\alpha.
(e) Transfección de células HL-60 y ensayo de unión de ligandos
Treinta \mug de CC-CKR-3-pcDNA1neo humano, CC-CKR-3-pcDNA1neo o pcDNA1neo murinos se electroporaron en 500 \mul de células HL-60 (2 x 10^{7} células/ml en NaCl 0,15 M, HEPES 20 mM, pH 7,3) usando un Bio Rad Geno Pulster (260 voltios, 960 \muF, cubeta de 0,4 cm de cavidad). Las células se sembraron en matraces T-175 que contenían 25 ml de medio AIM-V sin suero (GIBCO). En el día 2 ó 3 después de la transfección las células se diluyeron en un volumen total de 45 ml de medio AIM-V que contenía 600 \mug/ml de G418, y en el día 6 las células se diluyeron adicionalmente hasta 180 ml de medio AIM-V que contenía 600 \mug/ml de G418. En los días 7-15 tras la transfección las células se mantuvieron en medio AIM-V (+G418) a una densidad de 0,4-1,2 x 10^{6} células/ml, y se realizaron los ensayos de unión durante este tiempo. La unión de competición en equilibrio se llevó a cabo incubando 5 x 10^{5} células en 100 \mul de tampón de unión (CaCl_{2}1 mM, MgCl_{2} 5 mM, BSA al 0,5%, HEPES 50 mM, pH 7,2), [^{125}I]-radioligando 0,34 nM y 0,5-2.000 nM de ligando sin marcar en placas de filtro con pocillos Millipore®-DV96. Después de 1,5 h de incubación a temperatura ambiente las células se lavaron cuatro veces con filtración a vacío con tampón de unión que contenía NaCl 0,5 M. Se añadieron cincuenta \mul de líquido de centelleo Optiphase (Wallac) a cada pocillo y se midió la radiactividad con un lector de placas Wallac Microbeta. Todos los datos de unión se normalizaron como el porcentaje de unión total. La unión total para un ligando dado se definió como la radiactividad unida en ausencia de ligando competidor a 5 x 10^{5} células transfectadas con CC-CKR-3 humano (intervalo: 1.000-2.500 cpm).
Los resultados se muestran en la Figura 9, que ilustra una alta afinidad de unión de [^{125}I]-MIP-1\alpha y [^{125}I]-RANTES a CC-CKR-3 humano y murino. Las células HL-60 se transfectaron con CC-CKR-3 humano (\bullet), CC-CKR-3 murino (\sqbullet), o con un vector vacío (O) y se mantuvieron en medio AIM-V que contenía G418 durante 7-15 días. Los ensayos de competición en equilibrio se realizaron según se describió anteriormente con [^{125}I]-MIP-1\alpha (A) y [^{125}I]-RANTES (B). Cada punto representa la media \pm D.T. de los puntos por duplicado a partir de cuatro (A) o tres (B) experimentos por separado. Los datos se ajustaron a la curva con el programa informático GraFit 3.01 (Leatherbarrow, R. J., GraFit Versions 3.01, Erithicus Softward Ltd., Staines, Reino Unido (1992)) usando la ecuación B/Bmax^{app} = 1/ (1+ ([L]/CI_{50})), en la que B = cpm unidos, Bmax^{app} = cpm unidos en ausencia de ligando competidor, L = ligando competidor, y la CI_{50} = [radioligando]+ K_{d}(Cheng, Y. y Prusoff, W. H., Biochem Pharmacol 22: 3099-3108 (1973)).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: GLAXO GROUP LIMITED
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(B)
CALLE: GLAXO HOUSE, BERKELEY AVENUE
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(D)
CIUDAD: GREENFORD
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(E)
ESTADO: MIDDLESEX
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(E)
PAÍS: REINO UNIDO
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(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): UB6 ONN
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(A)
NOMBRE: WELLS, Timothy Nigel Carl
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(B)
CALLE: c/o GLAXO INSTITUTE FOR MOLECULAR BIOLOGY, 14. CHEMIN DES AULX.
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(C)
CIUDAD: PLAN-LES-OUATES
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(D)
ESTADO: GINEBRA
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(E)
PAÍS: SUIZA
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(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1228
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(A)
NOMBRE: POWER, Christine Anna
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(B)
CALLE: c/o GLAXO INSTITUTE FOR MOLECULAR BIOLOGY, 14. CHEMIN DES AULX.
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(C)
CIUDAD: PLAN-LES-OUATES
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(D)
ESTADO: GINEBRA
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(E)
PAÍS: SUIZA
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(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1228
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SUSTANCIAS Y SUS USOS
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
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(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco floppy
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(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
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(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
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(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/GB96/00143
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(VI)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: GB9501683.8
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 DE ENERO DE 1995
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Asn Pro Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GNTAYYTNGC NATHGTNCAY GC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AMNRCRTTAN ADNANNGGRT TNANRC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 514 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3..512
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGTACTTG GTTTTGCAGT AG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGCAGTGA ACAAAAGCCA G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATAGTGCTC TTCCTAGAGA C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTGAGCAG GTACACATCA G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.500000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAATACTGTG GGCTCCTCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTCAGGTCC ATGACTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCATGAGCA TTGATAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGAGCGCAA CCATACC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAGAAGTC CTTCAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCATGAT CTTCATG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATGAAACC CCACGGATAT AGCAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCTACAGAG CATCATGAAG ATC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1607 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
LOCALIZACIÓN: 183..1265
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 170 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 360 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
4

Claims (14)

1. Un polipéptido que:
a)
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (ID SEC Nº 20), o
b)
tiene una o más eliminaciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (ID SEC Nº 20), y que tiene al menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (ID SEC Nº 20).
2. Polipéptido según se reivindica en la reivindicación 1, que tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (ID SEC Nº 20).
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (ID SEC Nº 20).
4. Polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es capaz de unirse a RANTES, MIP-1\alpha y/o MCP-1.
5. Un procedimiento para detectar un agente farmacéuticamente activo usando el polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 5 para detectar un agente útil en el tratamiento de alergias.
7. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 5 para detectar un agente útil en el tratamiento de trastornos inmunitarios y/o inflamatorios relacionados con la activación de los linfocitos T.
8. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 5 para detectar un agente útil en el tratamiento de ateromas.
9. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10. Ácido nucleico según se reivindica en la reivindicación 9 que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 19 (Figura 3).
11. Ácido nucleico según la reivindicación 9 que comprende los nucleótidos 183-1262 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 19 (Figura 3).
12. Un vector que comprende un ácido nucleico según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Un hospedador que comprende un vector según se reivindica en la reivindicación 12.
14. Un procedimiento para obtener un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende incubar un hospedador según la reivindicación 12 en unas condiciones que provoquen la expresión de dicho polipéptido, y purificar después dicho polipéptido.
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