ES2241004T3 - Procedimiento para la analizar la actividad inmunosupresora de bloqueadores de canales ionicos usando el cerdo enano. - Google Patents
Procedimiento para la analizar la actividad inmunosupresora de bloqueadores de canales ionicos usando el cerdo enano.Info
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Abstract
UN METODO PARA ANALIZAR LA ACTIVIDAD INMUNOSUPRESORA DE INHIBIDORES K V 1.3 UTILIZANDO MINICERDOS Y MICROCERDOS. SE HA OBSERVADO QUE ESTOS MODELOS DE CERDOS TIENEN CANALES K V 1.3 MUY SIMILARES A LOS DEL HOMBRE, TANTO EN LA FUNCION COMO EN LOS PARAMETROS DEL POTENCIAL DE MEMBRANA DE LOS LINFOCITOS T, Y RESPONDEN DE FORMA SIMILAR CON UNA REACCION LINFOCITARIA MIXTA (MLR) A LOS BLOQUEANTES DE LOS CANALES KV1.3. LOS MINICERDOS Y MICROCERDOS PROPORCIONAN MODELOS ANIMALES UTILES IN VIVO PARA ESTUDIAR LA ACTIVIDAD INMUNOSUPRESORA DE LOS BLOQUEANTES DE LOS CANALES KV1.3 CUYA FUNCION CABRIA ESPERAR EN EL HOMBRE.
Description
Procedimiento para analizar la actividad
inmunosupresora de bloqueadores de canales iónicos usando el cerdo
enano.
El canal de ion potasio está implicado en la
homeostasis celular normal y su posible asociación con trastornos
relacionados con una diversidad de estados patológicos y respuestas
inmunes.
Las enfermedades que tienen una asociación
particular con tales canales incluyen enfermedades autoinmunes y
rechazos en trasplantes. Las enfermedades autoinmunes incluyen
artritis reumatoide, diabetes mellitus de tipo 1
(insulinodependiente), esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus
eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del
tejido conectivo y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), por
nombrar unas pocas.
Se cree que las enfermedades autoinmunes se deben
en la mayoría de los casos a que células autoreactivas del sistema
inmune destruyen tejidos diana, bien por muerte directa o bien por
producción de autoanticuerpos. En las enfermedades autoinmunes
estudiadas hasta la fecha, parece emerger un patrón común de células
inmunes anormales que producen materiales que destruyen o inhiben
ciertos tejidos diana, causando síntomas manifiestos del estado
patológico.
Los aloinjertos o xenoinjertos pueden ser
rechazados a través de una reacción inmune, mediada por células o
humoral, del receptor contra componentes antigénicos presentes
durante el rechazo, que es la reacción inmune aguda mediada por
linfocitos (reacción de huésped contra injerto).
El tratamiento actual para esas respuestas y
enfermedades permanece en el nivel empírico y se basa en provocar
una respuesta inmunosupresora general. Tal aproximación terapéutica
también está palgada de otros problemas, incluyendo graves efectos
secundarios asociados. Además, sólo sirven para retardar la
progresión natural de esas enfermedades autoinmunes.
Varias clases de canales de potasio están
implicadas en el mantenimiento del potencial de membrana y
regulación del volumen celular en diversos tipos de células y
también en la modulación de la excitabilidad eléctrica en el sistema
nervioso [R.C. Lewis y M.D. Cahalan "Potassium and Calcium
Channels in Lymphocytes" Ann. Rev. Immunol. 13, (1995)
623-653 y G.J. Kaczorowski y G.C. Koo "Lymphocyte
Ion Channels as a Target for Immunosuppression" Perspectives in
Drug Discovery and Design 2, (1994) 233-248].
Se ha demostrado que los canales de potasio controlan la fase de
repolarización de los potenciales de acción y el patrón del disparo
de neuronas y otras células. Se ha demostrado que los flujos de
potasio son más diversos que los flujos de sodio o calcio y también
desempeñan un papel principal en la determinación del modo en que
una célula responde a un estímulo externo. Por ejemplo, la presencia
de diferentes clases de canales de potasio determina en gran medida
la velocidad de adaptación o retardo con el que una neurona responde
a una señal sináptica de entrada.
Se ha fijado la atención en el propio canal de
ión K^{+}. Se han identificado dos tipos de tipos de canales
iónicos, tipificados farmacológicamente y electrofisiológicamente,
los canales de potasio activados por voltaje (K_{V}) y los canales
de K^{+} activados por calcio (K_{Ca}). En lo que nos ocupa, los
linfocitos T de tejido linfático periférico se clasifican en tipos
relevantes: CD_{4}^{+}CD_{8}^{-},
CD_{4}^{-}CD_{8}^{+}, CD_{4}^{-}CD_{8}^{-}. Estas
células expresan todos o alguno de esos canales del ión potasio. En
la respuesta inmune normal que refleja inducción de actividad, tal
como con mitógenos, se incrementa más de diez veces un sólo tipo de
canal iónico en las células que están activadas. Así, los linfocitos
T, cuando se estimulan con mitógenos, muestran un aumento de la
respuesta inmune normal en el número de esos canales iónicos.
Uno de esos tipos de canales de ión K^{+},
K_{V}1.3, determina el potencial de membrana en linfocitos T
humanos sin activar. Se ha determinado que el bloqueo de este canal
del ión K^{+} es suficiente para provocar la despolarización y
prevenir la activación de mitógenos [G.J. Kaczorowski y G.C. Koo
"Lymphocyte Ion Channels as a Target for Immunosuppression"
Perspectives in Drug Discovery and Design 2, (1994)
233-248].
Antes del descubrimiento del cerdo enano como un
modelo animal para probar bloqueadores de K_{V}1.3 en la reacción
linfocítica mixta, se estudiaron otros modelos animales diversos,
incluyendo el ratón, la rata, el conejo y la cobaya. Sin embargo, la
margatoxina (MgTX), un inhibidor peptídico específico de los canales
K_{V}1.3, no inhibe la reacción linfocítica mixta en estos modelos
animales [Leonard y col. "Selective blockers of voltage gated
K^{+} channels depolarized human T lymphocytes: mechanism of the
antiproliferative effect of Charybdotoxin" Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 89: 10094-10098].
Recientemente, se ha seleccionado el cerdo enano
para validar el concepto de que el bloqueo de los canales de K^{+}
activados por voltaje (K_{V}1.3) es un objetivo para la
inmunomodulación. En análisis electrofisiológicos (comunicación sin
publicar de Reid Leonard), se ha mostrado que la toxina del
escorpión, margatoxina (MgTX), bloquea los canales K_{V}1.3 de las
células T del cerdo. También se ha descubierto que la margatoxina
inhibe la reacción linfocítica mixta en el cerdo, de forma similar a
su efecto en células mononucleares humanas (CMN). Igualmente, se
inhibió la proliferación inducida por PMA/ionomicina (ION) en
células mononucleares de cerdo. Por tanto, ensayos in vitro
indican que los canales K_{V}1.3 de cerdo son comparables a los
canales K_{V}1.3 humanos en cuanto a sus respuestas a
margatoxina.
Se eligió la respuesta de hipersensibilidad
retardada mediada por células T (DTH) en el cerdo para probar el
efecto de bloqueadores de canales iónicos in vivo. Se usaría
margatoxina en la DTH a falta de compuestos específicos que inhiban
los canales K_{V}1.3. Por tanto, se realizó el estudio
farmacocinético (PK) de la margatoxina en el cerdo enano. Además de
determinar la concentración de margatoxina en el plasma,
desarrollamos un ensayo ex vivo para evaluar la respuesta de
las células mononucleares a la inducción por PMA y ionomicina (ION).
Este ensayo se usa actualmente para controlar el efecto biológico
in vivo de la margatoxina.
Esta invención se refiere a procedimientos para
analizar la actividad inmunosupresora de bloqueadores del canal
iónico K_{V}1.3 usando el cerdo como modelo animal. Esta invención
se refiere a un procedimiento para analizar un efecto ex vivo
de un bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 administrado in
vivo a un cerdo de prueba en el que el análisis comprende las
etapas de:
(a) inmunización del cerdo de prueba y un cerdo
de control con un antígeno;
(b) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(c) administración del bloqueador del canal
iónico K_{V}1.3 al cerdo de prueba;
(d) administración del vehículo al cerdo de
control;
(e) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(f) exposición de los cerdos de prueba y de
control al antígeno;
(g) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba en relación a la respuesta inmune del cerdo de control; y
(h) medición de la respuesta antigénica de los
cerdos de prueba y de control en relación a la respuesta antigénica
del cerdo de control.
Figura 1. Farmacocinética de la margatoxina:
Inhibición ex vivo de la proliferación inducida por
PMA/ionomicina mediante la infusión de 2 \mug/kg del
inmunosupresor margatoxina.
Figura 2. Inhibición de la respuesta de
hipersensibilidad retardada (DTH) a la tuberculina (PPD) en el cerdo
enano.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
analizar un efecto ex vivo de un bloqueador del canal iónico
K_{V}1.3 administrado in vivo a un cerdo de prueba en el
que el análisis comprende las etapas de:
(a) inmunización del cerdo de prueba y un cerdo
de control con un antígeno;
(b) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(c) administración del bloqueador del canal
iónico K_{V}1.3 al cerdo de prueba;
(d) administrar el vehículo al cerdo de
control;
(e) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(f) exposición de los cerdos de prueba y de
control al antígeno;
(g) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba en relación a la respuesta inmune del cerdo de control; y
(h) medición de la respuesta antigénica de los
cerdos de prueba y de control en relación a la respuesta antigénica
del cerdo de control.
Una forma de realización de la invención es el
procedimiento tal como se ha enumerado anteriormente en el que la
medida de la respuesta inmune comprende las etapas de:
(a) recolección de sangre total heparinizada del
cerdo;
(b) dilución de la sangre total heparinizada del
cerdo con un volumen igual de RPMI;
(c) centrifugación de la disolución de sangre
diluida con RPMI sobre Ficoll-Hypaque;
(d) aislamiento de la fracción de células
mononucleares a partir de la disolución de sangre diluida con
RPMI;
(e) ajuste de la concentración de la fracción de
células mononucleares a 2 millones de células por ml
aproximadamente;
(f) reacción de 100 \mul de una disolución de
PMA de 0,1 a 0,5 ng/ml y ionomicina a 200 ng/ml con 100 \mul de
las células mononucleares en los pocillos;
(g) incubación de la reacción de
PMA-ionomicina durante 24 horas aproximadamente;
(h) incubación de la reacción incubada de
PMA-ionomicina durante otras 24 horas con
^{3}H-timidina;
(i) recolección de las células mononucleares
después de la incubación con ^{3}H-timidina;
(j) recuento de la incorporación de
^{3}H-timidina a las células mononucleares.
El procedimiento anterior se usa para medir la
actividad inmunosupresora del bloqueador de canal iónico en células
mononucleares aisladas a partir de sangre a diversos intervalos de
tiempo durante el experimento, respecto al control. Se prepararon
las muestras sin la etapa de lavado empleada típicamente cuando se
aíslan las células mononucleares a partir de sangre total
heparinizada, lo que permitió una detección rápida de la respuesta
inmune después de la administración in vivo de un bloqueador
de canal iónico.
Esta invención también se refiere a un
procedimiento para analizar un efecto ex vivo de un
bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 administrado in vivo a
un cerdo de prueba, en el que el análisis comprende las etapas
de:
(a) inmunización del cerdo de prueba y un cerdo
de control con un antígeno;
(b) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control, comprendiendo las etapas de:
- (i)
- recolección de una muestra de sangre total heparinizada de los cerdos de prueba y de control;
- (ii)
- dilución de las muestras de prueba y de control de sangre total heparinizada con un volumen igual de RPMI;
- (iii)
- centrifugación de las muestras de prueba y de control de la disolución de sangre diluida con RPMI sobre Ficoll-Hypaque;
- (iv)
- aislamiento de las muestras de prueba y de control de la fracción de células mononucleares a partir de la disolución de sangre diluida con RPMI;
- (v)
- ajuste de la concentración de las muestras de prueba y de control de la fracción de células mononucleares a 2 millones de células por ml aproximadamente;
- (vi)
- reacción de 100 \mul de una disolución de PMA de 0,1 a 0,5 ng/ml y ionomicina a 200 ng/ml con 100 \mul de las muestras de prueba y de control de las células mononucleares en los pocillos;
- (vii)
- incubación de las muestras de prueba y de control de la reacción de PMA-ionomicina durante 24 horas aproximadamente;
- (viii)
- incubación de las muestras de prueba y de control de la reacción incubada de PMA-ionomicina durante otras 24 horas con ^{3}H-timidina;
- (ix)
- recolección de las muestras de prueba y de control de las células mononucleares después de la incubación con ^{3}H-timidina;
- (x)
- recuento de la incorporación de ^{3}H-timidina a las muestras de prueba y de control de las células mononucleares para establecer una línea base;
(c) administración en vena al cerdo de prueba una
disolución del bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 a una dosis
diaria de entre 2 \mug/kg y 100 mg/kg usando una bomba infusora
dosificando a una velocidad de 2,0 a 12 ml/h;
(d) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba medicado tal como se ha enumerado anteriormente en la etapa
(b);
(e) exposición de los cerdos de prueba y de
control al antígeno;
(f) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba expuesto al antígeno y del cerdo de control tal como se ha
enumerado anteriormente en la etapa (b);
(g) medición de la respuesta antigénica del cerdo
de prueba y del cerdo de control.
Una forma de realización de la invención es un
procedimiento para analizar un efecto ex vivo de un
bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 administrado in vivo a
un cerdo en el que, para dicho análisis, el cerdo se inmuniza con
bacilo Calmette-Guérin y posteriormente se expone a
derivado proteico purificado de tuberculina (PPD).
El término cerdo usado en la presente invención
incluye el cerdo enano y el microcerdo, los cerdos con un peso entre
2 kg aproximadamente y 15 kg aproximadamente. El modelo animal
preferido es el cerdo enano Yucatan o el microcerdo Yucatan. Otras
líneas de cerdo enano son las variedades Hanford, NIH y Minnesota.
Los cerdos enanos Yucatan y microcerdo Yucatan se adquirieron de
Charles River, Windham, ME.
El bloqueador de canal iónico se administra al
cerdo por vía intravenosa, oral, intramuscular o subcutánea. La vía
de administración preferida se selecciona entre vía intravenosa u
oral.
La dosis diaria de bloqueador de canal iónico
está entre 2 \mug/kg aproximadamente y 100 mg/kg aproximadamente.
La dosis diaria preferida de un bloqueador de canal iónico está
entre 0,1 mg/kg aproximadamente y 100 mg/kg aproximadamente cuando
se administra por vía oral y entre 2 \mug/kg aproximadamente y 15
mg/kg aproximadamente cuando se administra por vía intravenosa. Se
ha descubierto que la margatoxina es eficaz en un intervalo de entre
4 \mug/kg aproximadamente y 8 \mug/kg aproximadamente.
Para administrar al cerdo el bloqueador de canal
iónico, por ejemplo margatoxina, se usó una bomba infusora
ambulatoria (Pharmacia-Delta) o una bomba infusora
portátil a una dosis preprogramada. Cuando el compuesto se
administró cada día, se llenó diariamente el depósito dentro de la
bomba con una disolución del bloqueador de canal iónico. La dosis
seleccionada del bloqueador de canal iónico se diluyó en 30 ml de
solución salina y PBS 1:1 que contenían el suero autólogo al 5%. A
los cerdos se les aplicaron catéteres en la vena y arteria yugular,
varios días antes de la prueba. En el momento del tratamiento, se
montó la bomba infusora ambulatoria en el bolsillo de un chaleco a
medida, hecho con un material de red de poliéster (Fabric
Expression, Seattle, WA) o durante la duración del estudio se
contuvo al cerdo con un cabestrillo y se conectó el catéter
intravenoso a una bomba infusora portátil. Se administró la
disolución de margatoxina mediante una bomba infusora a una
velocidad de 2 a 12 ml/h aproximadamente. La disolución de
margatoxina se infunde tres veces al día dosificando a lo largo de
un periodo de cuatro horas y se administró bien durante los ocho
días siguientes a la inmunización, o bien en el día de la
exposición. Después, los cerdos se inmunizaron con 1 mg de bacilo
Calmette-Guérin (Connaugh) por vía intradérmica y
subcutánea en aproximadamente 4 a 6 sitios diferentes de los cuartos
traseros. En el día de la exposición (7-10 días
después de la inmunización), se inyectaron intradérmicamente 0,1 ml
de tuberculina (PPD) (25 unidades, Connaugh) mientras el cerdo
estaba sedado con Telazol e/o isoflurano. Véase a continuación la
descripción cronológica. La induración se midió 48 h después. Se
recogió sangre en diferentes momentos durante y después de la
infusión para hacer determinaciones bioquímicas y ensayos
biológicos, tal como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Inicialmente, se administró la MgTX desde el día
de la inmunización con bacilo Calmette-Guérin (BCG)
hasta el día siguiente a la exposición a tuberculina y se observó
una respuesta del 50-80% de supresión. Sin embargo,
se observó el mismo efecto cuando se llevaron a cabo experimentos
para suprimir la respuesta administrando MgTx solamente el día de
exposición.
La sangre total heparinizada se recogió, se
diluyó con un volumen igual de RPMI (GIBCO) y se centrifugó sobre
Ficoll-Hypaque (LSM, Organo Technika Co., Durham,
NC). La fracción de células mononucleares se aisló y su
concentración se ajustó a 2x10^{6}/ml aproximadamente. Después, se
añadieron 100 \mul de la fracción de células mononucleares a cada
pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron 100
\mul que contenían PMA (0,1-0,5 ng/ml de
concentración final) y ionomicina (200 ng/ml de concentración
final). En algunos ensayos, en los que se estudió el efecto supresor
de la margatoxina in vitro, se añadieron 50 \mul de medio o
margatoxina (concentración final 50-200 nM).
Después, se cultivaron las células durante 2 días a 37ºC y CO_{2}
al 7%. Durante las últimas 24 horas se añadió
^{3}H-timidina. Se recogieron las células
mononucleares y se contó la incorporación de timidina mediante el
sistema de placas beta LKB.
Antes de realizar los estudios farmacocinéticos,
mezclamos sangre total con margatoxina y observamos una supresión
significativa de la respuesta proliferativa a PMA/ION, probada en
las condiciones descritas en el presente documento. En los estudios
farmacocinéticos, se tomaron muestras de sangre en los tiempos
señalados y se agitó 1 ml de sangre heparinizada y se determinaron
los niveles de margatoxina en plasma. Se separaron 2 ml de sangre
sobre Ficoll-Hypaque y se estudiaron las CMN en
cuanto a la inducción por PMA/ION tal como se ha descrito
anteriormente.
En la figura 1 se muestra un experimento
representativo. Un cerdo enano Yucatan recibió 25 \mug de
margatoxina en 30 ml de vehículo (suero autólogo al 5% en solución
salina con PBS 1:1) durante 2,5 h. No hubo un incremento
significativo de la presión sanguínea ni de la frecuencia cardiaca
durante la infusión. En este estudio, el nivel en plasma alcanzó un
máximo de 600 pM al final de la infusión y cayó hasta 100 pM a las
4,5 h tras la infusión, con una semivida de 2 h aproximadamente. A
las 24 h la margatoxina fue indetectable en plasma. El nivel
plasmático de MgTX se determinó en un ensayo de unión competitiva,
mediante la inhibición de la unión de MgTX marcada con ^{125}I a
canales K_{V}1.3 presentes en membranas plasmáticas aisladas. La
falta de respuesta a PMA/ION también fue máxima al final de la
infusión y se mantuvo durante 4,5 h tras la infusión. Se llevó a
cabo un estudio farmacocinético similar seis veces, con buenas
correlaciones entre niveles plasmáticos altos de margatoxina y una
respuesta más baja a PMA/ION. Los cerdos enanos Yucatan que
recibieron vehículo no tuvieron una fluctuación significativa en la
respuesta a PMA/ION. Por lo tanto, esta prueba ex vivo
proporciona una evaluación del efecto biológico de la MgTX in
vivo y también puede usarse para estudiar los efectos
inmunosupresores de otros bloqueadores de canales iónicos.
En la figura 2 se muestra una gráfica
representativa de la inhibición de la respuesta de hipersensibilidad
retardada a tuberculina PPD mediante margatoxina. El cerdo enano
Yucatan se inmunizó con BCG 8 días antes (-8 d) de la exposición a
tuberculina PPD (PPD). La MgTX se proporcionó durante los 8 días
anteriores a la exposición o en el día de la exposición (0 d). La
tuberculina PPD se inyectó por vía intradérmica en
4-6 puntos del costado del cerdo. Como control se
inyectó PBS, el diluyente de la PPD, en 4-6 sitios.
Se registró la respuesta antigénica, específicamente la rojez y la
induración en los sitios de inyección de prueba y de control
aproximadamente entre 44 y 48 horas después de la exposición.
Claims (8)
1. Un procedimiento para analizar un efecto ex
vivo de un bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 administrado
in vivo a un cerdo de prueba en el que el análisis comprende
las etapas de:
(a) inmunización no terapéutica del cerdo de
prueba y un cerdo de control con un antígeno;
(b) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(c) administración no terapéutica del bloqueador
del canal iónico K_{V}1.3 al cerdo de prueba;
(d) administración del vehículo al cerdo de
control;
(e) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control;
(f) exposición de los cerdos de prueba y de
control al antígeno;
(g) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba en relación a la respuesta inmune del cerdo de control; y
(h) medición de la respuesta antigénica de los
cerdos de prueba y de control en relación a la respuesta antigénica
del cerdo de control.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el análisis comprende las etapas de:
(a) dilución de la sangre total heparinizada
recogida del cerdo con un volumen igual de RPMI;
(b) centrifugación de la disolución de sangre
diluida con RPMI sobre Ficoll-Hypaque;
(c) aislamiento de la fracción de células
mononucleares a partir de la disolución de sangre diluida con
RPMI;
(d) ajuste de la concentración de la fracción de
células mononucleares a 2 millones de células por ml
aproximadamente;
(e) reacción de 100 \mul de una disolución de
PMA de 0,1 a 0,5 ng/ml y ionomicina a 200 ng/ml con 100 \mul de
las células mononucleares en los pocillos;
(f) incubación de la reacción de
PMA-ionomicina durante 24 horas aproximadamente;
(g) incubación de la reacción incubada de
PMA-ionomicina durante otras 24 horas con
^{3}H-timidina;
(h) recolección de las células mononucleares
después de la incubación con ^{3}H-timidina;
(i) recuento de la incorporación de
^{3}H-timidina a las células mononucleares.
3. Un procedimiento para analizar un efecto ex
vivo de un bloqueador del canal iónico K_{V}1.3 administrado
in vivo a un cerdo de prueba en el que el análisis comprende
las etapas de:
(a) inmunización no terapéutica del cerdo de
prueba y un cerdo de control con un antígeno;
(b) medición de la respuesta inmune de los cerdos
de prueba y de control, comprendiendo las etapas de:
- (i)
- dilución de las muestras de prueba y de control de sangre total heparinizada recogidas de los cerdos de prueba y de control con un volumen igual de RPMI;
- (ii)
- centrifugación de las muestras de prueba y de control de la disolución de sangre diluida con RPMI sobre Ficoll-Hypaque;
- (iii)
- aislamiento de las muestras de prueba y de control de la fracción de células mononucleares a partir de la disolución centrifugada de sangre diluida con RPMI;
- (iv)
- ajuste de la concentración de las muestras de prueba y de control de la fracción de células mononucleares a 2 millones de células por ml aproximadamente;
- (v)
- reacción de 100 \mul de una disolución de PMA de 0,1 a 0,5 ng/ml y ionomicina a 200 ng/ml con 100 \mul de las muestras de prueba y de control de las células mononucleares en los pocillos;
- (vi)
- incubación de las muestras de prueba y de control de la reacción de PMA-ionomicina durante 24 horas aproximadamente;
- (vii)
- incubación de las muestras de prueba y de control de la reacción incubada de PMA-ionomicina durante otras 24 horas con timidina ^{3}H;
- (viii)
- recolección de las muestras de prueba y de control de las células mononucleares después de la incubación con timidina ^{3}H;
- (ix)
- recuento de la incorporación de timidina ^{3}H a las muestras de prueba y de control de las células mononucleares para determinar la respuesta inmune relativa;
(c) administración no terapéutica en vena al
cerdo de prueba una disolución del bloqueador del canal iónico
K_{V}1.3 a una dosis diaria de entre 2 \mug/kg y 100 mg/kg
usando una bomba infusora dosificando a una velocidad de 2,0 a 12
ml/h;
(d) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba medicado tal como se ha enumerado anteriormente en la etapa
(b);
(e) exposición de los cerdos de prueba y de
control al antígeno;
(f) medición de la respuesta inmune del cerdo de
prueba expuesto al antígeno y del cerdo de control tal como se ha
enumerado anteriormente en la etapa (b);
(g) medición de la respuesta antigénica del cerdo
de prueba y del cerdo de control.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que para el análisis, el modelo
porcino usado es un cerdo enano Yucatan o un microcerdo Yucatan.
5. El procedimiento según la reivindicación 4 en
el que para el análisis, el modelo porcino usado es un cerdo enano
Yucatan.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en la que, para el análisis, el antígeno
usado para inmunizar el cerdo es bacilo
Calmette-Guérin y el antígeno usado para exponer al
cerdo es tuberculina PPD.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que, para el análisis, el bloqueador
del canal iónico K_{V}1.3 se administra por vía oral y la dosis
diaria del bloqueador de canal iónico es de 0,1 mg/kg a 100
mg/kg.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que, para el análisis, el bloqueador
del canal iónico K_{V}1.3 se administra por vía intravenosa y la
dosis diaria del bloqueador de canal iónico es de 2 \mug/kg a 15
\mug/kg.
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