ES2241009T3 - Un metodo para la regulacion de la composicion de lignina de las plantas. - Google Patents
Un metodo para la regulacion de la composicion de lignina de las plantas.Info
- Publication number
- ES2241009T3 ES2241009T3 ES96944430T ES96944430T ES2241009T3 ES 2241009 T3 ES2241009 T3 ES 2241009T3 ES 96944430 T ES96944430 T ES 96944430T ES 96944430 T ES96944430 T ES 96944430T ES 2241009 T3 ES2241009 T3 ES 2241009T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- plant
- lignin
- gene
- fah1
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA LA REGULACION DE LA COMPOSICION DE LA LIGNINA DE UN TEJIDO VEGETAL. LAS PLANTAS SE TRANSFORMAN CON UN GEN QUE CODIFICA UN GEN F5H ACTIVO. LA EXPRESION DEL GEN F5H CAUSA UN INCREMENTO EN LOS NIVELES DE MONOMERO DE SIRINGILO PROPORCIONANDO UNA COMPOSICION DE LA LIGNINA MAS FACILMENTE DEGRADABLE CON AGENTES QUIMICOS Y ENZIMAS.
Description
Un método para la regulación de la composición de
lignina de las plantas.
Esta invención ha sido realizada con el soporte
del gobierno bajo el No. de contrato
DE-FG02-94ER20138 concedido por el
Departamento de Energía. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta
invención
El presente método hace referencia al campo de la
biología molecular y a la regulación de la síntesis de proteínas
mediante la introducción de genes extraños en los genomas de las
plantas. De forma más específica, el método se refiere a la
modificación de la composición de la lignina de las plantas en una
célula de la planta mediante la introducción de un gen de una planta
extraña que codifica una enzima de la
ferulato-5-hidroxilasa (F5H) activa.
Los transformantes de plantas que albergan el gen de la F5H
demuestran unos niveles incrementados de los residuos del monómero
de siringilo en su lignina, una característica que se piensa que
conduce al polímero más susceptible de delignificación.
La lignina es uno de los principales productos
del proceso fenilpropanoide general, y es una de las moléculas
orgánicas más abundantes en la biosfera (Crawford, (1981) Lignin
Biodegradation and Transformation, New York: John Wiley and
Sons). En la naturaleza, la lignificación proporciona rigidez a la
madera y es en gran parte responsable de la integridad estructural
de los elementos traquearios de las plantas. La lignina está bien
adecuada a estas capacidades debido a sus características físicas y
a su resistencia a la degradación bioquímica. Desafortunadamente,
esta misma resistencia a la degradación tiene un impacto
significativo en la utilización del material de las plantas
lignocelulósicas (Whetten y col., Forest Ecol. Mangement 43,
301, (1991)).
La composición monomérica de la lignina tiene
efectos significativos en su degradación química durante la
reducción a pasta de papel industrial (Chiang y col., Tappi,
71, 173 (1988). Las ligninas de guaiacilo (derivadas del ácido
ferúlico) características de maderas blandas tales como el pino,
requieren sustancialmente más cantidad de alcali e incubaciones más
largas durante la reducción a pasta de papel en comparación con las
ligninas de guaiacilo-sitingilo (derivadas del ácido
ferúlico y del ácido sinápico) que se encuentran en las maderas
duras como el roble. Los motivos para las diferencias entre estos
dos tipos de lignina han sido exploradas por medición de la
degradación de compuestos modelo tales como el éter de
guaiacilglicerol-\beta-guaiacilo,
el éter de
siringilglicerol-\beta-guaiacilo,
y el éter de
siringilglicerol-\beta-(4-metilsiringilo)
(Kondo y col., Holzforschung, 41, 83, (1987)) bajo
condiciones que mimetizan las utilizadas en el procedimiento de
reducción a pasta de papel. En estos experimentos, los compuestos
mono- y especialmente los di-siringilo se rompieron
de tres a cinco veces más rápido que sus correspondientes homólogos
de diguaiacilo. Estos estudios modelo están de acuerdo con los
estudios de comparación de la reducción a pasta de papel de madera
de pino Douglas y de madera de liquidambar en los que las
principales diferencias están en el porcentaje de reducción a pasta
de papel que se produce por encima de 150ºC cuando se rompen las
uniones éter del
arilglicerol-\beta-arilo (Chiang y
col., Holzforschung, 44, 309 (1990)).
Otro factor que afecta la degradación química de
las dos formas de lignina puede ser la condensación de residuos de
guaiacilo y siringilo derivados de lignina para formar unidades de
difenilmetano. La presencia de residuos de siringilo en ligninas de
madera dura conduce a la formación de derivados de difenilmetano
conteniendo siringilo que permanecen solubles durante la reducción a
pasta de papel, mientras que las unidades de difenilmetano
producidas durante la reducción a pasta de papel de la madera blanda
son insolubles en álcalis y de este modo permanecen asociados con
los productos celulósicos (Chiang y col., Holzforschung, 44,
147 (1990); Chiang y col., Holzforschung, 44, 309, (1990)).
Además, se piensa que la abundancia de reticulaciones
5-5'-diarilo que pueden presentarse
entre los residuos de guaiacilo contribuyen a la resistencia a la
degradación química. Esta unión es resistente a la rotura alcalina y
es mucho menos común en la lignina que es rica en residuos de
siringilo debido a la presencia del grupo 5-O-metilo en los
residuos de siringilo. La incorporación de los residuos de siringilo
da lugar a lo que se conoce como "lignina
no-condensada", un material que es
significativamente más fácil de ser reducido a pasta de papel que la
lignina condensada.
De forma similar, la composición de lignina y el
contenido en grasas es un factor principal en la determinación de la
digestabilidad de los materiales lignocelulósicos que son alimento
para la ganadería (H. G. Jung & D. A. Deetz, (1993) Cell wall
lignification and degradability in Forage Cell Wall Structure
and Digestibility (H. G. Jung, D. R. Buxton, R.D. Hatfield, y J.
Ralph eds.), ASA/CSSA/SSSA Press, Madison, WI.). La incorporación
del polímero de lignina en la pared de la célula de la planta
previene a los enzimas microbianos de tener acceso a los
polisacáridos de la pared celular que constituyen la pared. Como
resultado, estos polisacáridos no pueden ser degradados y la mayor
parte de los carbohidratos valiosos contenidos en las reservas de
alimentos de animales pasan a través de los animales sin ser
digeridos. De este modo, un incremento en la materia seca de las
grasas durante la estación de crecimiento es contrarestado por una
disminución en la digestibilidad causada principalmente por una
lignificación incrementada en la pared celular. A partir de estos
ejemplos, es claro que sería económicamente ventajosa la
modificación de la composición del monómeros de la lignina.
Por consiguiente, el problema a solucionar, es
desarrollar un método para la creación de plantas con niveles
incrementados de residuos de siringilo en su lignina para facilitar
su degradación química. La modificación del proceso enzimático
responsable de la producción de monómeros de la lignina proporciona
una posible ruta para solucionar este problema.
El mecanismo(s) por el que las plantas
controlan la composición de monómeros de la lignina ha sido el
sujeto de mucha especulación. Tal como se ha mencionado
anteriormente, los gimnoespermas no sintetizan cantidades
apreciables de siringil lignina. En los angioespermas, la deposición
de siringil lignina es regulada de forma desarrollada: el xilem
primario contiene guaiacil lignina, mientras que la lignina del
xilem secundario y la esclerenquima es
guaiacil-siringil lignina (Venverloo,
Holzforschung 25, 18 (1971); Chapple y col., Plant
Cell 4, 1413, (1992)). No se han encontrado plantas que
contengan puramente siringil lignina. Todavía no está claro cómo se
controla esta especificidad; sin embargo, existen al menos cinco
sitios de posible control enzimático, principalmente ácido
cafeico/O-metiltransferasa del ácido
5-hidroxiferúlico (OMT), F5H, ligasa de
(hidroxi)cinamoil-CoA (4CL), reductasa de la
(hidroxi)cinamoil-CoA (CCR), y dehidrogenasa
del (hidroxi) cinamoil alcohol (CAD). Por ejemplo, las
especificidades del sustrato de la OMT (Shimada y col.,
Phytochemistry, 22, 2657, (1972); Shimada y col.,
Phytochemistry, 12, 2873, (1973); Gowri y col., Plant
Physiol., 97, 7, (1991); Bugos y col., Plant Mol. Biol.
17, 1203, (1992)) y CAD (Sarna y col., Eur. J. Biochem.,
139, 259, (1984); Goffner y col., Planta., 188, 48,
(1992); O'Malley y col., Plant Physiol., 98, 1364, (1992))
están correlacionadas con las diferencias en la composición de
monómeros de la lignina observadas en los gimnoespermas y los
angioespermas, y se ha sugerido que la expresión de las isozimas 4CL
(Grand y col., Physiol. Veg. 17, 433, (1979); Grand y col.,
Planta., 158, 225, (1983)) está relacionada con la
especificidad del tejido de la composición de monómeros de la
lignina observada en los angioespermas.
Aunque hay al menos cinco posibles enzimas
objetivo que pueden ser explotadas, solo se han investigado la OMT y
la CAD en intentos recientes de manipular la composición de
monómeros de la lignina en plantas transgénicas (Dwivedi y col.,
Plant Mol. Biol. 26, 61, (1994); Halpin y col., Plant
J. 6, 339, (1994); Ni y col., Transgen. Res. 3, 120
(1994); Atanassova y col., Plant J. 8, 465, (1995);
Doorsselaere y col., Plant J. 8, 855, (1995)). La mayor parte
de estos estudios se han focalizado en la supresión con sentido y
antisentido de la expresión de la OMT. Esta aproximación se ha
encontrado con resultados variables, probablemente debido al grado
de supresión de la OMT alcanzado en los diferentes estudios. Los
efectos más dramáticos se observaron con la utilización de
construcciones de la OMT homológa para suprimir la expresión de la
OMT en el tabaco (Atanassova y col., supra) y álamos
(Doorsselaere y col. supra). Ambos estudios encontraron que
como resultado de la expresión del transgen, hubo una disminución en
el contenido de siringil lignina y una apariencia concomitante de
residuos de 5-hidroxiguaiacilo. Como resultado de
estos estudios, Doorsselaere y col., (WO 9305160) describen un
método para la regulación de la biosíntesis de la lignina a través
de la incorporación genómica de un gen de la OMT tanto en la
orientación con sentido como en la anti-sentido. En
contraste, Dixon y col. (WO 9423044) demuestran la reducción del
contenido de lignina en plantas transformadas con un gen de la OMT,
más que un cambio en la composición de monómeros de la lignina. Se
ha focalizado una investigación similar en la supresión de la
expresión de la CAD. La conversión del coniferaldehído y el
sinapaldehído en sus correspondientes alcoholes en plantas de tabaco
transgénicas ha sido modificado con la incorporación de un gen de la
CAD de A. cordata en la orientación
anti-sentido (Hibino y col., Biosci. Biotechnol.
Biochem., 59, 929, (1995)). Un esfuerzo similar dirigido a la
inhibición anti-sentido de la expresión de la CAD
generó una lignina con un contenido de aldehído incrementado, pero
con sólo un cambio modesto en la composición de monómeros de la
lignina (Halpin y col., supra). Esta investigación ha dado
lugar a la descripción de métodos para la reducción de la actividad
de la CAD utilizando la expresión con sentido y
anti-sentido de un gen de la CAD clonado para
afectar la inhibición de la expresión de la CAD endógena en el
tabaco [Boudet y col., (US 5.451.514) y Walter y col., (WO 9324638);
Bridges y col., (CA 2005597)]. Ninguna de estas estrategias
incrementó el contenido de siringilo de la lignina, un hecho que
está correlacionado con la digestabilidad mejorada y la
degradabilidad química del material lignocelulósico (Chinang y col.,
supra; Chiang y Funaoka, Holzforschung 44, 309 (1990);
Jung y col., supra).
Aunque la F5H es también una enzima clave en la
biosíntesis de monómeros de la siringil lignina hasta la fecha no se
han dedicado esfuerzos en proyectar la calidad de la lignina. De
hecho, desde el momento de su descubrimiento hace más de 30 años
(Higuchi y col., Can. J. Biochem. Physiol., 41, 613, (1963))
ha habido sólo una demostración publicada de la actividad de la F5H
(C. Grand, FEBS Lett. 169, 7, (1984)). Grand demostró que la
F5H de álamos tenía una monooxigenasa dependiente del citocromo P450
(P450) tal como se analizó por los criterios clásicos de dependencia
en NADPH y de inhibición reversible con la luz por el monóxido de
carbono. Grand demostró además que la F5H está asociada con el
retículo endoplasmático de la célula. La falta de atención dada a la
F5H en los años recientes puede ser atribuida en general a las
dificultades asociadas con el hecho de tener que enfrentarse a
enzimas unidas a membranas, y, de forma más específica, a la
labilidad de la F5H cuando se trató con los detergentes necesarios
para la solubilización (Grand, supra). El descubrimiento más
reciente alrededor del gen de la F5H ha sido realizado por Chapple y
col., (supra) quienes describieron un mutante de L. Heynh de
la Arabidopsis thaliana llamado fahI que es deficiente
en la acumulación de metabolitos derivados de ácido sinápico,
incluyendo la guaiacil-siringil lignina típica de
los angioespermas. Este emplazamiento, llamado FAH1, codifica la
FH5. La clonación del gen que codifica la F5H proporcionaría la
oportunidad de ensayar la hipótesis de que la F5H es un objetivo
útil para el diseño de la composición de monómeros de la
lignina.
A pesar de la escasa información sobre la F5H en
la literatura publicada, el solicitante ha tenido éxito en el
aislamiento, la clonación y la secuenciación del gen de la F5H. El
solicitante también ha demostrado que la integración estable del gen
de la F5H en el genoma de la planta, en donde la expresión del gen
de la F5H está bajo el control de un promotor distinto del promotor
endógeno del gen, conduce a una regulación alterada de la
biosíntesis de la lignina.
La presente invención proporciona un fragmento de
ácido nucleico aislado que codifica una enzima F5H de planta activa
teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
que consiste en (1) la secuencia de amino-ácidos de la SEC de ID NO:
2, y (2) una secuencia de amino ácidos de SEC de ID NO: 2 que
engloba las sustituciones de amino ácidos, las adiciones y las
eliminaciones que no alteran la función de la enzima F5H de la
planta activa.
La invención proporciona además un fragmento de
ácido nucleico aislado que codifica un enzima F5H de planta activa,
estando seleccionado el fragmento entre el grupo que consiste en el
fragmento de ácido nucleico de la SEC de ID NO: 1, el fragmento de
ácido nucleico de la SEC de ID NO: 3 y un fragmento de ácido
nucleico de la SEC de ID NO: 1 o la SED de ID NO: 3 que abarca los
cambios de base que no alteran la función del enzima F5H de la
planta codificada.
La invención proporciona además un gen quimérico
que causa proporciones alteradas de los monómeros
guaiacil-siringil de la lignina en una planta
transformada, comprendiendo el gen un fragmento de ácido nucleico
que codifica una enzima F5H de la planta activa unida de forma
operable tanto en la orientación con sentido como en la
anti-sentido a secuencias reguladoras adecuadas. Los
fragmentos de ácido nucleico son los descritos anteriormente.
También se proporciona un método de alterar la
actividad de la F5H en una planta por medio de la transformación de
las células de la planta en una planta entera con un gen quimérico
que causa porcentajes de monómeros guaiacil:siringil de la lignina
en una célula de una planta transformada, en donde el gen está
expresado; creciendo dichas plantas bajo condiciones que permitan el
desarrollo de la semilla; y seleccionando las plantas derivadas de
estas semillas transformadas para aquellas que expresan un gen de la
F5H activo o un fragmento del mismo.
Se proporciona un método de alterar la actividad
de la enzima F5H en una planta por (i) la transformación de una
célula, un tejido o un órgano a partir de una planta anfitriona
adecuada con el gen quimérico descrito anteriormente en donde está
expresado el gen quimérico; (ii) la selección de las células
transformadas, el tejido leñoso cicatrizal de las células, los
embriones somáticos, o las semillas que contienen el gen quimérico;
(iii) la regeneración de las plantas enteras a partir de las células
transformadas, del tejido leñoso cicatrizal de las células, de los
embriones somáticos, o de las semillas seleccionadas en la etapa
(ii); (iv) la selección de las plantas enteras regeneradas en la
etapa (iii) que tengan un fenotipo caracterizado por (1) una
capacidad de la planta entera de acumular compuestos derivados de
ácido sinápico o (2) un contenido de monómero siringilo de la
lignina alterado en relación con el de una planta anfitriona no
transformada.
La invención proporciona de forma adicional un
método de alterar la composición de la lignina en una planta por
medio de la incorporación estable en el genoma de la planta
anfitriona mediante la transformación de un gen quimérico que causa
proporciones alteradas de monómeros guaiacil:siringil de la lignina
en una planta transformada; expresando el gen incorporado del modo
que se exprese la F5H y de modo que los porcentajes de monómeros
guaiacil:siringil de la lignina estén alterados respecto a los
porcentajes de la planta anfitriona no transformada.
La Figura 1 ilustra la biosíntesis de los
precursores monoméricos de la lignina a través del esquema del
fenilpropanoide general.
La Figura 2 es una ilustración del cósmido
pBIC20-F5H y de la construcción de la sobreexpresión
de la F5H (pGA482-35S-F5H) en la que
está expresado el gen de la F5H bajo el control del promotor 35S
constitutivo del virus del mosaico de la coliflor.
La Figura 3 muestra un análisis de los
metabolitos secundarios derivados del ácido sinápico en el tipo
salvaje, el mutante fah1-2, y plantas de
fah1-2 transgénicas derivadas de forma
independiente que llevan el T-DNA derivado del
cósmido pBIC20-F5H, o la construcción de la
sobreexpresión pGA482-35S-F5H.
La Figura 4 muestra el impacto de la
sobreexpresión de la F5H comparando los niveles de estado fijo del
mRNA de la F5H en el tipo salvaje, el mutante
fah1-2, las plantas de
fah1-2 transgénicas derivadas de forma
independiente que llevan el T-DNA derivado de la
construcción de la sobreexpresión de la 35S-F5H.
La Figura 5 muestra un análisis de GC
(cromatografía de gases) de los productos de oxidación del
nitrobenceno de la lignina para ilustrar el impacto de la
sobreexpresión de la F5H en la composición de monómeros de la
lignina en el tipo salvaje, el mutante
fah1-2, y un mutante
fah1-2 que tiene el T-DNA
derivado de la construcción de la sobreexpresión de la
35S-F5H.
La Figura 6 ilustra un análisis de manchas
Southern comparando la hibridación del cDNA de la F5H al DNA
genómico digerido de la EcoRI aislado de Arabidopsis
thaliana de tipo salvaje y un número de mutantes
fah1.
La Figura 7 es un análisis de manchas Northern
comparando la hibridación del cDNA de la F5H al RNA aislado de
Arabidopsis thaliana de tipo salvaje y un número de mutantes
fah1.
La Figura 8 muestra el nucleótido genómico (SEC
de ID NO.: 3) y las secuencias de amino ácidos (SEC de ID NO.: 2)
del gen de la F5H de Arabidopsis y la enzima F5H que
codifica.
Los solicitantes han proporcionado tres listados
de secuencias en conformidad con la 37 C.F.R.
1821-1825 y los Apéndices A y B ("Requeriments for
Application Disclosures Containing Nucleotides and/or Amino Acid
Sequences") y de conformidad con "Rules for the Standard
Representation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent
Applications" y los Anexos I y II a la Decisión del Presidente de
la EPO, publicada en el Suplemento No. 2, a OJ EPO, 12/1992.
La secuencia del cDNA de la F5H de la
Arabidopsis thaliana se da en la SEC de ID NO.: 1 y la
secuencia del clon genómico de la F5H de la Arabidopsis
thaliana se da en la SEC de ID NO.: 3. La secuencia de la
proteína de la F5H se da en la SEC de ID NO.: 2.
La presente invención proporciona un gen que
codifica la F5H, una enzima clave en la biosíntesis de la lignina.
La invención proporciona además un método para la alteración de la
composición de la lignina en plantas por transformación de las
plantas con el gen de la F5H en donde el gen es expresado y causa
una conversión incrementada de ácido ferúlico a ácido sinápico con
lo que se incrementa el contenido de siringilo del polímero de la
lignina.
El efecto en plantas de las composiciones de
lignina conteniendo un contenido de monómero siringilo superior es
que la lignina es más susceptible de delignificación química. Esto
es de uso particular en las industrias del papel y de pulpa en las
que las que se pierden cantidades de energía y tiempo en el
procedimiento de delignificación. Las plantas de madera
transformadas con un gen activo de la F5H ofrecerían una ventaja
significativa en el procedimiento de delignificación sobre otras
reservas de fuentes de papel convencionales. De forma similar, la
modificación de la composición de la lignina en plantas mediante la
inserción y la expresión de un gen de la F5H heterólogo ofrece un
método único de incrementar la digestibilidad de la alimentación de
la ganadería. Mediante la maximización de la digestibilidad de las
plantas se ofrece un beneficio económico de gran potencial para las
granjas y las industrias agrícolas.
La invención proporciona un gen y una
construcción de un gen quimérico útil para la transformación del
tejido de una planta mediante la alteración de la composición de
monómeros de la lignina. Las plantas adecuadas en la presente
invención comprenden plantas a las que, de forma natural, les falta
siringil lignina o aquellas que acumulan lignina con una elevada
relación guaiacilo:siringilo. Las plantas adecuadas en la presente
invención también comprenden plantas cuya lignina puede ser
modificada utilizando construcciones de transformación
anti-sentido que reducen el contenido de siringilo
de la lignina de las plantas transgénicas en el caso en que sea
deseable dicha alteración.
Las plantas adecuadas pueden incluir, pero no
están limitadas a, alfalfa (Medicago sp.), arroz (Oryza
sp.), maíz (Zea mays), planta de colza (Brassica
sp.), plantas forrajeras, y también árboles de cultivo tales
como eucaliptos (Eucalyptus sp.), pino (Pinus sp.),
abeto (Picea sp.) y álamo (Populus sp.), así como
Arabidopsis sp. y tabaco (Nicotiana sp.).
Tal como se utiliza en la presente invención
pueden utilizarse los siguientes términos para la interpretación de
las reivindicaciones y la especificación.
El término "FAH1" hace referencia al
emplazamiento o la localización cromosómica en el que se codifica el
gen de la F5H. El término "FAH1" hace referencia a
cualquier versión mutante de dicho gen que conduce a un nivel
alterado de la actividad de la enzima, del contenido de siringil
lignina o del éster sinapato que puede ser medido por cromatografía
de capa fina, cromatografía líquida de alta resolución, o por
fluorescencia in vivo.
"Gen" hace referencia a un fragmento de
ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las
secuencias reguladoras precedentes (5' no codificantes) y siguientes
(3' no codificantes) a la región de codificación. Gen "nativo"
hace referencia al gen que se encuentra de forma natural con sus
propias secuencias reguladoras.
Un "gen quimérico" hace referencia a un gen
que comprende secuencias reguladoras heterogéneas y secuencias de
codificación.
Un "gen endógeno" hace referencia al gen
nativo que normalmente se encuentra en su localización natural en el
genoma.
Un "gen extraño" o "transgen" hace
referencia a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo
anfitrión pero que es introducido por transferencia del gen.
El término "promotor" hace referencia a una
secuencia de DNA en un gen, normalmente corriente arriba (5') de su
secuencia de codificación, que controla la expresión de la secuencia
de codificación proporcionando el reconocimiento del sitio para la
polimerasa del RNA y otros factores requeridos para una
transcripción adecuada. Un promotor también puede contener
secuencias de DNA que están implicadas en la unión de factores de
proteínas que controlan la efectividad de la iniciación de la
transcripción como respuesta a las condiciones fisiológicas o de
desarrollo.
El término "unido de forma operable" hace
referencia a las secuencias de ácido nucleico en una única molécula
de ácido nucleico que están asociadas de modo que la función de una
esté afectada por la otra.
Tal como se usa en la presente invención,
"secuencias reguladoras" hacen referencia a secuencias de
nucleótidos localizados corriente arriba (5'), en, y/o corriente
abajo (3') de una secuencia de codificación, que controla la
transcripción y/o la expresión de las secuencias de codificación
conjuntamente con el aparato biosintético de la proteína de la
célula. Estas secuencias reguladoras incluyen promotores, secuencias
líderes de traducción, secuencias de terminación de la
transcripción, y secuencias de poliadenilación.
El término "T-DNA" hace
referencia al DNA que es transferido en el genoma de la planta a
partir de un plásmido de T-DNA transportado por una
cepa de Agrobacterium tumefaciens que es utilizada para
infectar las plantas con los objetivos de transformación de la
planta.
El término "plásmido de
T-DNA" hace referencia a un plásmido transportado
por el Agrobacterium tumefaciens que transporta un origen de
replicación, marcadores seleccionables tales como la resistencia a
los antibióticos, y las secuencias de DNA a las que se hace
referencia como extremos derecho e izquierdo que son requeridos para
la transformación de la planta. La secuencia de DNA que es
transferida durante este proceso es la que está localizada entre las
secuencias de los extremos del T-DNA derecho e
izquierdo presentes en un plásmido del T-DNA. El DNA
entre estos extremos puede ser manipulado de modo que cualquier
secuencia deseada pueda ser insertada en el genoma de la planta.
El término
"ferulato-5-hidroxilasa" o
"F5H" se referirá a una enzima en el proceso biosintético
fenilpropanoideo de la planta que cataliza la conversión del
ferulato a 5-hidroxiferulato y que permite la
producción de ácido sinápico y de sus subsecuentes metabolitos,
incluyendo el sinapolimalato y la siringil lignina.
Los términos "que codifica" y
"codificante" hacen referencia al procedimiento por el que un
gen, a través de los mecanismos de transcripción y traducción,
proporciona la información a una célula a partir de la que una serie
de amino ácidos pueden ser acoplados en una secuencia de amino
ácidos específica que incluye las secuencias de DNA que pueden
implicar cambios de base que no causan un cambio en el amino ácido
codificado, o que implican cambios de base que pueden alterar uno o
más amino ácidos, pero que no afectan las propiedades funcionales de
la proteína codificada por la secuencia de DNA. Por consiguiente se
entiende que la invención abarca más que las secuencias de los
ejemplos específicos. También se contemplan las modificaciones a la
secuencia, tales como eliminaciones, inserciones o sustituciones en
la secuencia que producen cambios silenciosos que no afectan de
forma sustancial las propiedades funcionales de la molécula de
proteína resultante. De este modo, un codón para el amino ácido
alanina, un amino ácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un
codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la
glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la
leucina, o la isoleucina. De forma similar, también puede esperarse
que los cambios que dan lugar a la sustitución de un residuo cargado
negativamente a partir de otro, tal como el ácido aspártico por el
ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal
como la lisina por la arginina, produzcan un producto biológicamente
equivalente. No sería de esperar que los cambios de nucleótidos que
dan lugar a la alteración de las partes N-terminal
y del C-terminal de la molécula proteica alteraran
también la actividad de la proteína. En algunos casos, de hecho,
puede ser deseable preparar mutantes de la secuencia con el fin de
estudiar el efecto de la alteración en la actividad biológica de la
proteína. Cada una de las modificaciones propuestas está dentro de
lo que se puede considerar la rutina del estado de la técnica, como
es el caso de la determinación de la retención de actividad
biológica en los productos codificados. Además, el experto en la
materia reconoce que las secuencias englobadas por esta invención
están también definidas por su habilidad para hibridar, bajo
condiciones rigurosas (2X SSC, 0,1% SDS, 65ºC), con las secuencias
ejemplificadas en la presente invención.
El término "expresión", tal como se utiliza
en la presente invención, hace referencia a la producción del
producto de la proteína codificado por un gen. "Sobreexpresión"
hace referencia a la producción de un producto del gen en organismos
transgénicos que excede los niveles de producción en organismos
normales o no-transformados.
"Transformación" hace referencia a la
transferencia de un gen extraño en el genoma de un organismo
anfitrión y su herencia genéticamente estable. Ejemplos de métodos
de transformación de plantas incluyen la transformación mediada por
Agrobacterium y de partículas aceleradas o la tecnología de
transformación de "caída de gen" tal como se ha descrito en la
patente U.S. 5.204.253.
El término "rescate del plásmido" se
referirá a una técnica para la restricción circulante del DNA
genómico de una planta de enzima digerida que transporta fragmentos
de T-DNA que tienen un origen bacteriano de
replicación y de resistencia a antibióticos (codificados por el gen
de \beta-lactamasa de E. coli) de modo que
este fragmento circularizado puede ser propagado como un plásmido en
una célula anfitriona bacteriana tal como la E. coli.
El término "composición de monómeros de la
lignina" hace referencia a las proporciones relativas del
monómero guaiacilo y del monómero siringilo encontrados en el tejido
lignificado de la planta.
El proceso biosintético de la lignina está bien
investigado y los pasos principales están ilustrados en la Figura 1.
La biosíntesis de la lignina es iniciada por la conversión de la
fenilalanina en cinamato a través de la acción de la liasa de amonio
fenilalanina (PAL). El segundo esquema del proceso es el
cinamato-4-hidroxilasa (C4H), una
monooxigenasa dependiente del citocromo P450 (P450) que es
responsable de la conversión del cinamato en p-cumarato. La
segunda hidroxilación del proceso es catalizada por una enzima
caracterizada como relativamente dañina, la
p-cumarato-3-hidroxilasa
(C3H), cuyo producto es el ácido cafeico. El ácido cafeico es
subsecuentemente O-metilado por la OMT para formar el ácido
ferúlico, un precursor directo de la lignina. La última reacción de
hidroxilación del proceso de fenilpripanoide general es catalizado
por la F5H. El 5-hidroxiferulato producido por la
F5H es O-metilado a continuación por la OMT, la misma enzima
que lleva a cabo la O-metilación del ácido cafeico. Esta
especificidad dual de la OMT ha sido confirmada por la clonación del
gen de la OMT, y la expresión de la proteína en la E. coli
(Bugos y col., (1991) supra; Gowri y col., (1991)
supra).
Las etapas implicadas de las biosíntesis de la
lignina están catalizadas por la 4CL, la reductasa de la
(hidroxi)cinamoil CoA (CCR) y la CAD, que finalmente genera
alcohol de coniferilo a partir de ácido ferúlico y alcohol de
sinapoilo a partir de ácido sinápico. El alcohol de coniferilo y el
alcohol de sinapoilo son polimerizados por oxidasas extracelulares
para dar lugar a la guaiacil lignina y a la siringil lignina
respectivamente, aunque la siringil lignina está descrita de forma
más precisa como un copolímero de ambos monómeros.
Aunque el ácido ferúlico, el ácido sinápico, y,
en algunos casos, el ácido p-cumárico están dirigidos a la
biosíntesis de la lignina, en algunas plantas estos compuestos son
precursores de otros metabolitos secundarios. En Arabidopsis,
el ácido sinápico sirve como un precursor para la biosíntesis de
lignina pero también está dirigido a la síntesis de ésteres de ácido
sinápico solubles. En este proceso, el ácido sinápico es convertido
en sinapolilglucosa que sirve como un intermedio en la biosíntesis
de sinapoilmalato (Figura 5). El ácido sinápico y sus ésteres son
fluorescentes y pueden ser utilizados como un marcador de plantas
deficientes en dichas enzimas que son necesarias para producir ácido
sinápico (Chapple y col., supra).
Se han identificado una serie de mutantes de
Arabidopsis que no acumulan sinapoilmalato y que han sido
nombrados colectivamente mutantes fah1. La naturaleza
fluorescente del sinapoilmalato permite la fácil identificación de
los ésteres de ácido sinápico por cromatografía de capa fina (TLC)
seguido por observación bajo luz ultravioleta (UV). La fluorescencia
del sinapoilmalato también puede ser visualizada in vivo
debido a que el sinapoilmalato es acumulado en la epidermis de la
hoja adaxial. El Arabidopsis de tipo salvaje exhibe una
fluorescencia azul pálida bajo el UV mientras que los mutantes
fah1 aparecen de color rojo oscuro debido a la falta de
fluorescencia azul del sinapoilmalato y la fluorescencia del
clorofilo en el mesofilo subtendido (Chapple y col.,
supra).
Una selección de mutantes basada en TLC de 4200
plantas de Arabidopsis mutagenizadas con metanosulfonato de
etilo identificaron un número de líneas mutantes independientes que
acumularon de forma significativa menores niveles de sinapoilmalato.
Las mutaciones en estas líneas se identificaron como la
fah1-1 hasta la
fah1-5. Se utilizó la selección visual de
fluorescencia UV in vivo para identificar más líneas mutantes
que transportan la mutación de fah1. Se seleccionaron dos de
estos mutantes (fah1-6 y
fah1-7) entre las poblaciones mutagenizadas
de EMS. Se seleccionó una línea mutante
(fah1-8) de entre una población mutante
generada por bombardeo rápido de neutrones (R.A. Nilan, Nucl.
Sci. Abstr., 28 (3), 5940 (1973); Kozer y col., Genet.
Pol., 26(3), 367, (1985)). Se identificó una línea
mutante final, (fah1-9) utilizando la misma
técnica a partir de una población de plantas de
T-DNA marcado. Antes del análisis adicional, cada
línea mutante se retrocruzó al menos dos veces al tipo salvaje y se
establecieron las líneas homozigóticas.
Para determinar si las líneas mutantes aisladas
de nuevo eran defectuosas en el mismo sitio, es decir, en el gen que
codifica la F5H, se llevaron a cabo experimentos de complementación
genética. En estos ensayos, cada línea mutante se cruzó al
fah1-2 el cual es conocido que es defectuoso en
F5H. En cada caso, se utilizó la línea mutante aislada de nuevo como
el modelo de hembra y se fertilizó con polen de un mutante
homozigótico fah1-2. También se llevó a cabo
un cruce recíproco utilizando el fah1-2 como
modelo de hembra, y la nueva línea mutante como el donador de polen.
Se recogieron las semillas de estos cruces varias semanas más tarde,
y se plantaron para el subsiguiente análisis. Se analizó la progenie
para determinar la producción de sinapoilmalato por TLC,
cromatografía líquida de alta presión y por observación bajo luz UV.
A partir de estos cruces, toda la progenie de F1 examinada fue
deficiente en sinapoilmalato, indicando que todas las mutaciones
identificadas eran alélicas.
Se seleccionó la línea del
fah1-9 para estudios adicionales debido la
presencia de la inserción de T-DNA en el gen de la
F5H. La inserción del T-DNA en el sitio del FAH1
facilitó la clonación del DNA de Arabibidopsis flanqueado que pudo
ser utilizado, a continuación, para recuperar el gen de la F5H de
tipo salvaje a partir del cDNA y de las bibliotecas genómicas (Meyer
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 6869 (1996)).
Se aisló un fragmento de DNA del sitio del FAH1 a
partir del mutante fah1-9 marcado del
T-DNA utilizando la técnica del rescate de plásmido
(Meyer y col., supra). La técnica del rescate del plásmido es
común y bien conocida en el estado de la técnica y puede ser
utilizada para aislar alelos específicos a partir de plantas
transformadas de T-DNA (Behringer y col., Plant
Mol. Biol. Rep., 10, 190, (1992)). Brevemente, el vector
utilizado para generar la población marcada de T-DNA
de Arabidopsis transporta las secuencias requeridas para la
replicación autónoma del DNA en bacterias y secuencias que confieren
resistencia antibiótica. Una vez este DNA está integrado en el
genoma de la planta, pueden ser utilizados los extractos de las
endonucleasas de restricción para generar fragmentos que pueden ser
circularizados, ligados, y transformados en la E. coli. El
DNA circularizado a partir del T-DNA generará
plásmidos funcionales que confieren resistencia antibiótica a sus
anfitriones bacterianos de modo que puedan ser identificados por
crecimiento en medios selectivos. Aquellos plásmidos que son
generados a partir de las secuencias, incluyendo los extremos
derecho e izquierdo, también transportarán con ellos las secuencias
genómicas de la planta flanqueando la inserción del
T-DNA. Los plásmidos generados de cualquiera de los
extremos del T-DNA que transportan las secuencias de
DNA flanqueante pueden ser identificados por análisis de los
productos que la enzima de restricción del diagnóstico digiere en
geles de azarosa. Los plásmidos con secuencias flanqueantes pueden
servir a continuación como un punto de partida para las secuencias
de plantas clonantes que comparten homología al DNA en el punto de
inserción del T-DNA (Behringer y col.,
supra).
Se llevó a cabo el rescate del plásmido
utilizando DNA digerido en EcoRI preparado a partir de
plantas de fah1-9 homozigóticas. Se ligó el
DNA genómico digerido en la EcoRI y a continuación se
electroporó en DH5\alphaE. Coli. competente. El DNA de los
plásmidos rescatados fue digerido además tanto con la EcoRI
como con SalI y los digeridos fueron analizados por
electroforesis de gel para identificar los plásmidos que contuvieron
DNA de Arabidopsis flanqueante. Se utilizó un fragmento de
SacII-EcoRI a partir de este plásmido rescatado para
identificar un clon de F5H a partir de una biblioteca de cDNA de
Arabidopsis (T. Newman y col., Plant. Physiol. 106, 1241,
(1994)).
Se llevó a cabo el análisis de la secuencia del
cDNA de la F5H y de clones genómicos en el DNA del plásmido de forma
manual utilizando un Kit de Sequenasa de United Status Biochemical
v. 2,0, en un secuenciador DuPont Genesis® 2000 o en un secuenciador
de DNA de Applied Biosystems 373A, utilizando oligonucleótidos
secuenciadores con base al vector estándar o oligonucleótidos
sintetizados por el cliente según fuera apropiado. La secuencia del
cDNA de la F5H del Arabidopsis thaliana se da en la SEC de ID
NO.: 1 y la secuencia del clon genómico de la F5H de Arabidopsis
thaliana se da en la SEC de ID NO.: 3.
El cDNA de la F5H contiene una configuración de
lectura abierta de 1560 bp que codifica una proteína con un peso
molecular de 58.728. El codón de iniciación del ATG putativo es
flanquedado por un A a -3 y un G a +4, manteniendo con los
nucleótidos que de forma común flanquean el iniciador metionina en
el mRNAs de plantas (Lutcke y col., EMBO J. 6, 43, (1987)).
Siguiendo de forma inmediata, el iniciador inferido metionina está
una secuencia de 17 aminoácidos conteniendo nueve hidroxi amino
ácidos (Figura 8). La secuencia de los subsiguientes quince amino
ácidos es rica en amino ácidos hidrofóbicos; once residuos
hidrofóbicos que comprenden residuos de fenilalanina, isoleucina,
leucina y valina. Este intervalo hidrofóbico es seguido
inmediatamente por una secuencia de transferencia de parada putativa
de Arg-Arg-Arg. La F5H también
comparte una identidad de secuencia significativa con otros P450s.
Más notable es el intervalo entre Pro-450 y
Gly-460. Esta región contiene ocho residuos que
comprenden el dominio de heme-unión y son altamente
conservados entre la mayoría de los P450s, siendo una excepción la
sintasa del óxido de aleno a partir del Linum usitatissimum
(Song y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8519,
(1993)). La región Pro-450 a Gly-460
contiene Cys-458 en F5H, que por analogía es más
posible el ligando de heme unión en esta enzima.
Se confirmó la identidad del gen de la F5H por
complementación del mutante fah1-2 con un
clon genómico y una construcción en donde la secuencia de
codificación genómica de F5H fue expresada bajo el control del
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. De forma breve,
se utilizó el cDNA de la F5H como una sonda para seleccionar una
biblioteca competente de transformación (Meyer y col., (1994)
Science, 264, 1452-1455) para clones
genómicos. Utilizando este método, se aisló un clon cósmido
(pBIC20-F5H) que transportaba un inserto genómico
de 17 kb conteniendo los codones de inicio y parada inferidos del
gen de la F5H (Figura 2). La parte de este cósmido que transporta la
configuración de lectura abierta de la F5H fue cortado del cósmido y
subclonado en un vector en el que estuvo unido de forma operable al
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(pGA482-35S-F5H) (Figura 2). Tanto
el cósmido original como su derivado de construcción del plásmido
fueron electroporados en Agrobacterium tumefaciens y fueron
utilizados para transformar los mutantes
fah1-2. Se evidenció el éxito de las
transformaciones por ensayos de TLC demostrando la acumulación de
sinapoilmalato en tejidos de hojas de los transformantes de
fah1-2 transportando el T-DNA
a partir del cósmido pBIC20-F5H o el plásmido
pGA483-35S-F5H (Figura 3). Estos
datos indican claramente que se ha identificado el gen que codifica
la F5H.
Se transformaron las plantas homozigóticas de
Arabidopsis para el alelo del fah1-2
con Agrobacterium transportando el plásmido
pGA482-35S-F5H que contiene el gen
F5H quimérico bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico
de la coliflor (Odell, y col., Nature 313,
810-812, (1985)). Se identificaron los transformante
homozigóticos independientes que transportan el transgen de la F5H a
un sitio genético único por selección en un medio de crecimiento
conteniendo kanamicina, crecido en el suelo y se analizó el tejido
de la planta para determinar la composición de monómeros de la
lignina. El análisis de la oxidación del nitrobenceno de la lignina
de tipo salvaje, del fah1-2, y de los
transformantes transportadores del T-DNA de la
construcción pGA482-35S-F5H
revelaron que la sobreexpresión de la F5H, tal como fue medida por
el análisis de manchas Northern (Figura 4), condujo a un incremento
significativo en el contenido de siringilo de la lignina transgénica
(Figura 5). La lignina de las plantas que sobreexpresan la F5H
demostró un contenido de siringilo tan alto como del 29% en moles en
oposición al contenido de siringilo de la lignina de tipo salvaje
que fue del 18% en moles (Tabla 1) (Ejemplo 5). Estos datos
demuestran de forma clara que la sobreexpresión del gen de la F5H es
útil para la alteración de la composición de la lignina en plantas
transgénicas.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Línea \+ \hskip5cm \+ % en moles de S \cr
tipo salvaje \+ \+ 18,4 +/- 0,91\cr 88 \+ \+ 5,06 +/- 0,17\cr 172
\+ \+ 13,7 +/- 0,55\cr 122 \+ \+ 19,2 +/- 0,56\cr 108 \+ \+ 22,7
+/- 0,82\cr 107 \+ \+ 25,3 +/- 1,23\cr 180 \+ \+ 25,8 +/- 0,78\cr
117 \+ \+ 28,8 +/- 0,92\cr 128 \+ \+ 27,5 +/-
1,80\cr}
De una forma similar, se generaron los
transformantes F5H del tabaco T1 (Nicotiana tabacum), se
hicieron crecer y se analizaron para determinar la composición del
monómero de la lignina. El análisis de oxidación del nitrobenceno
demostró que el contenido de monómero siringilo de los rebordes
centrales de las hojas fue incrementado en un 14% en moles en el
tipo salvaje hasta un 40% en moles en la línea transgénica que más
expresó el transgen de la F5H (Tabla 2).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Línea \+ \hskip5cm \+ % en moles de S \cr
tipo salvaje \+ \+ 14,3 +/- 1,09\cr 40 \+ \+ 22,4 +/- 1,53\cr 27
\+ \+ 31,3 +/- 0,50\cr 48 \+ \+ 35,7 +/- 0,50\cr 33 \+ \+ 40,0 +/-
1,86\cr}
La expresión de genes extraños en plantas está
bien establecida (De Blaere y col., (1987) Meth. Ensymol.
143: 277-291) y esta invención proporciona un método
para aplicar esta tecnología a la introducción de un gen quimérico
para la sobreexpresión del gen de la F5H en plantas para la
manipulación de la composición del monómero de la lignina. La
expresión de los mRNAs de la F5H a un nivel apropiado puede requerir
el uso de diferentes genes quiméricos utilizando diferentes
promotores. Una clase preferida de anfitriones heterólogos para la
expresión de la secuencia de codificación del gen de la F5H son los
anfitriones eucarióticos, particularmente las células de plantas
superiores. Son particularmente preferidas entre las plantas
superiores y las semillas derivadas de estas, la alfalfa
(Medicago sp.), arroz (Oryza sp.), maíz (Zea
mays), planta de colza (Brassica sp.), plantas
forrajeras, y también cultivos de árboles tales como el eucaliptos
(Eucalyptus sp.), pino (Pinus sp.), abeto
(Picea sp.) y álamo (Populus sp.), así como
Arabidopsis sp. y tabaco (Nicotiana sp.). La expresión
en plantas utilizará secuencias reguladores funcionales en dichas
plantas.
El origen del promotor seleccionado para dirigir
la expresión de la secuencia de codificación no es crítico en tanto
en cuanto tenga suficiente actividad transcripcional para conseguir
que la invención exprese el mRNA traducible para el gen de la F5H en
el tejido anfitrión deseado. Los promotores preferidos dirigirán de
forma efectiva la expresión de la F5H a aquellos tejidos que sufren
lignificación. Estos promotores pueden incluir, pero no están
limitados a, los promotores de los genes que codifican las enzimas
del proceso fenilpropanoide tal como el promotor PAL (Ohl y col.,
Plant Cell, 2, 837, (1990) y el promotor 4CL (hauffed y col.,
Plant Cell, 3, 435 (1991).
Dependiendo de la aplicación, puede ser deseable
seleccionar promotores que sean específicos para la expresión de uno
o más órganos de la planta. Ejemplos de los mismos incluyen
promotores inducibles por la luz de la pequeña subunidad del
1,5-bisfosfato carboxilasa de la ribulosa, si se
desea expresión en órganos fotosintéticos o promotores
específicamente activos en raíces.
Se encuentran disponibles para los expertos en la
materia varios métodos de introducción de un secuencia de DNA (es
decir, de transformación) en células eucarióticas de plantas
superiores (ver las publicaciones de la EPO (Oficina de patentes
europea) 0 295 959 A2 y 0 138 341 A1). Dichos métodos incluyen
aquellos basados en la transformación de vectores basados en los
plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium spp. Es particularmente
preferido utilizar el tipo binario de estos vectores. Los vectores
derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas
superiores, incluyendo plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas,
tales como soja, algodón, tabaco, Arabidopsis y colza (Pacciotti y
col., Bio/Technology 3, 241, (1985); Byrne y col., Plant
Cell, Tissue and Organ Cultura 8, 3, (1987); Sukhapinda y col.,
Plant Mol. Biol. 8, 209, (1987); Lorz y col., Mol. Gen.
Genet. 199, 178, (1985); Potrykus Mol. Gen. Genet. 199,
183, (1985)).
Para la introducción en las plantas, los genes
quiméricos de la invención pueden ser insertados en vectores
binarios tal como se ha descrito en el Ejemplo 5.
Otros métodos de transformación son asequibles
para los expertos en la materia, tales como la captación directa de
construcciones de DNA extraño [ver publicación de la EPO 0 295 959
A2], técnicas de electroporación [ver Fromm y col. (1986)
Nature (Londres) 319: 791] o bombardeo balístico de alta
velocidad con partículas metálicas recubiertas con las
construcciones de ácido nucleico (ver Kline y col., Nature
(Londres) 327: 70 (1987), y ver la patente U.S. No. 4.945.050). Una
vez transformadas, las células pueden ser regeneradas por los
expertos en la materia.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar las
realizaciones clave de la invención pero, de ningún modo, deben ser
tomadas como limitantes de la misma.
Las digestiones, fosforilaciones, uniones y
transformaciones de las enzimas de restricción se llevaron a cabo
tal como se ha descrito en Sambrook y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Todos los reactivos y materiales utilizados para
el crecimiento y el mantenimiento de las células bacterianas fueron
obtenidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO laboratorios
(Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), o Sigma Chemical
Company (St. Louis, MO) a no ser que se especifique de otro
modo.
Los significados de las abreviaturas son los
siguientes: "h" significa hora(s), "min" significa
minuto(s), "sec" significa segundo(s), "d"
significa día(s), "\muL" significa
microlitro(s), "mL" significa mililitros, "L"
significa litros, "g" significa gramos, "mg" significa
miligramos, "\mug" significa microgramo(s), "nm"
significa nanómetro(s), "m" significa metro(s),
"E" significa Einstein(s).
La Arabidopsis thaliana se hizo crecer
bajo un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad a 100 mE
m^{-2} s^{-1} a 24ºC cultivada en una mezcla para macetas
Metromix 2000 (Scotts, Marysville OH). Se identificaron las líneas
mutantes fah1-1 hasta la
fah1-5 por TLC tal como se describe a
continuación. Utilizando su fluorescencia roja bajo la luz UV como
un marcador, se seleccionaron las líneas mutantes
fah1-6, fah1-7, y
fah1-8 a partir de las poblaciones mutagenizadas con
sulfonato de etilmetano (fah1-6,
fah1-7) o de neutrones rápidos
(fah1-8) de semillas de Landsberg erecta
M2. La línea marcada 3590 de T-DNA
(fah1-9) fue identificada de forma similar en
la población marcada de T-DNA Du Pont (K. A.
Feldmann, R.L. Malmberg, & C. Dean, (1994) Mutagenesis in
Arabidopsis en Arabidopsis, (E.M. Meyerowitz y C. R.
Somerville, eds.) Cold Spring harbor Press). Todas las líneas fueron
retrocruzadas al tipo salvaje al menos dos veces antes del uso
experimental para eliminar las mutaciones antecedentes no
unidas.
unidas.
Se prepararon extractos de hojas a partir de
muestras de 100 mg de tejido de hojas frescas suspendido en 1 mL de
metanol del 50%. Las muestras se agitaron brevemente, y a
continuación se congelaron a -70ºC. Las muestras se descongelaron,
se agitaron, y se centrifugaron a 12.000 xg durante 5 min. Se
determinó de forma cuantitativa el contenido de sinapoilmalato
siguiendo por TLC sobre gel de sílice, en una fase móvil de
n-butanol/etanol/agua (4:1:1). Se visualizó el ácido
sinápico y sus ésteres bajo luz UV de larga longitud de onda (365
nm) por su fluorescencia característica.
Para el análisis Southern se extrajo el DNA del
material de hojas (Rogers, y col., (1985) Plat. Mol. Biol. 5,
69), se digirió con endonucleasas de restricción y se transfirió a
una membrana Hybond N+ (Amersham, Cleveland Ohio) mediante
protocolos estándar. Se radiomarcaron las sondas de cDNA con
P^{32} y se hibridaron a una membrana objetivo en un tampón de
hibridación de Denhardt (900 mM de cloruro sódico, 6 mM de EDTA
disódico, 60 mM de fosfato sódico de pH 7,4, 0,5% de SDS y 0,01% de
DNA de esperma de arenque desnaturalizado y un 0,1% tanto de
polivinilpirrolidona, como de albúmina de suero de bovino, como de
Ficoll 400) conteniendo un 50% de formamida a 42ºC. Para eliminar la
sonda no unida, se lavaron las membranas dos veces a temperatura
ambiente y dos veces a 65ºC en 2x SSPE (300 mM de cloruro sódico,
2mM de EDTA disódico, 20 mM de fosfato sódico, pH 7,4) conteniendo
un 0,1% de SDS, y se expuso a una película.
Se extrajo en primer lugar el RNA del material de
hojas de acuerdo con el protocolo siguiente.
Para la extracción del RNA, se preparó un tampón
de extracción de Covey por disolución del TIPS (sal sódica del
sulfonato de triisopropil-naftaleno) al 1% (peso/v),
PAS (sal sódica del p-aminosalicilato) al 6% (peso/v) en 50
mM de Tris de pH 8,4 conteniendo un 5% v/v de fenol de Kirby. El
fenol de Kirby se preparó por neutralización de fenol licuado
conteniendo un 0,1% (peso/v) de 8-hidroxiquinolina
con Tris-HCl 0,1 M de pH 8,8. Para cada preparación
de RNA, se hicieron crecer muestras de 1 g de tejido de plantas en
nitrógeno líquido y se extrajeron en 5 mL de tampón de extracción de
Covey conteniendo 10 \muL de
\beta-mercaptoetanol. La muestra se extrajo con 5
mL de una mezcla 1.1 de fenol de Kirby y cloroformo, se agitó, y se
centrifugó durante 20 min a 7000 xg. Se separó el sobrenadante y se
precipitaron los ácidos nucleicos con 500 \muL de acetato sódico 3
M y 5 mL de isopropanol y se separó por centrifugación a 10.000 xg
durante 10 min. El pellet (gránulo) se disolvió de nuevo en 500
\muL de agua, y se precipitó el RNA en hielo con 250 \muL de
Lic. 8 M, y se separó por centrifugación a 10.000 xg durante 10 min.
El pellet se suspendió de nuevo en 200 \muL de agua y se extrajo
con un volumen igual de cloroformo:alcohol isoamílico 1:1 con
agitación. Después de la centrifugación durante 2 min a 10.000 xg,
se separó la capa superior acuosa, y se precipitaron los ácidos
nucleicos a -20ºC mediante la adición de 20 \muL de acetato sódico
3 M y de 200 \muL de isopropanol. Se lavó el pellet con 1 mL de
etanol del 70% frío, se secó y se suspendió de nuevo en 100 \muL
de agua. Se valoró el contenido de RNA de forma espectofotométrica a
260 nm. Las muestras conteniendo entre 1 y 10 \mug de RNA se
sometieron a electroforesis sobre gel desnaturalizante tal como se
ha descrito en otros trabajos (Sambrook y col., supra).
Se transfirió el RNA extraído a una membrana
Hybond N^{+} (Amersham Cleveland Ohio), y se sondó con sondas
radiomarcadas preparadas a partir de clones de cDNA. Las manchas se
hibridaron toda la noche, se lavaron dos veces a temperatura
ambiente y una vez a 65ºC en 3x SSC (450 mM de cloruro sódico, 45 mM
de citrato sódico, pH 7,0) conteniendo un 0,1% de SDS, y se
expusieron a la película.
Se identificó el cDNA y los clones genómicos para
la F5H por técnicas estándar utilizando un fragmento de 2,3 kb de
SacII/EcoRI a partir del plásmido rescatado (pCCI)
(Ejemplo 2) como una sonda. Se identificó el clon pCC30 del cDNA en
la biblioteca \lambdaPRL2 (Newman y col., (1994) supra)
gentilmente proporcionado por el Dr. Thomas Newman (Laboratorio de
Investigación de Plantas DOE, Universidad del estado de Michigan,
East Lansing, MI). Se valoró una biblioteca de cósmidos genómicos de
Arabidopsis thaliana (ecotipo Landsberg erecta)
generada en el vector de cósmido binario pBIC20 (ejemplo 3) (Meyer y
col., Science 264, 1452, (1994)) con el inserto de cDNA
radiomarcado derivado del pCC30. Los insertos genómicos en el
T-DNA de pBIC20 se flanquearon por el gen de
neomicin fosfotransferasa para la adyacente selección de kanamicina
a la secuencia del extremo derecho del T-DNA, y el
gen de \beta-glucuronidasa para la adyacente
selección histoquímica al extremo izquierdo. Se caracterizaron los
clones positivos por digestión de restricción y análisis Southern en
comparación con el DNA genómico de Arabidopsis.
Se llevó a cabo la transformación de la
Arabidopsis thaliana por infiltración a vacío (Bent y col.,
Science 265, 1856, (1994)) con modificaciones menores. De
forma breve, se hicieron crecer 500 mL de cultivos de
Agrobacterium transformados albergando el cósmido
pBIC20-F5H o la construcción
pGA482-35S-F5H hasta la fase
estacionaria en un caldo Luria conteniendo 10 mg L^{-1} de
rifampicina y 50 mg L^{-1} de kanamicina. Las células se
cosecharon por centrifugación y se suspendieron de nuevo en un 1 L
de medios de infiltración conteniendo 2,2 g de sales de MS
(Murashige y Skoog, Physiol. Plant. 15, 473, (1962)),
vitaminas B5 de Gamborg (Gamborg y col., Exp. Cell Res. 50,
151, (1968)), 0,5 g de MES, 50 g de sacarosa, 44 nM de
bencilaminopurina, y 200 \muL de Silwet L-77 (OSI
Specialties) a pH 5,7. Se invirtieron plantas de Arabidopsis
cribadas (generación T_{0}) que tenían entre 5 y 10 cm de altura
en la suspensión bacteriana y se expusieron a un vacío (> 500 nm
de Hg) durante entre tres y cinco min. Se retornaron las plantas
infiltradas a las condiciones de crecimiento estándar para la
producción de semillas. Las semillas transformadas (T_{1}) se
identificaron por selección en un medio de MS conteniendo 50 mg
L^{-1} de kanamicina y 200 mg L^{-1} de timentina (SmithKline
Beecham) y se transfirieron al suelo.
La transformación del tabaco se consiguió
utilizando el método del disco de hojas de Horsch y col.
(Science 227, 1229, (1985)).
Para la determinación de la composición del
monómero de la lignina, se trituró tejido del tallo hasta un polvo
en nitrógeno líquido y se extrajo con 20 mL de tampón de fosfato
sódico 0,1 M, pH 7,2 a 37ºC durante 30 min seguido por tres
extracciones con etanol del 80% a 80ºC. A continuación se extrajo el
tejido una vez con acetona y se secó completamente. Se saponificó el
tejido por tratamiento con NaOH 1,0 M a 37ºC durante 24 horas, se
lavó tres veces con agua, una vez con etanol del 80%, una vez con
acetona y se secó. La oxidación del nitrobenceno de muestras de
tejido de tallo se llevó a cabo con un protocolo modificado de
Iiyama y col. (J. Sci. Food Agric. 51,
481-491 (1990)). Se mezclaron las muestras de
material lignocelulósico (5 mg cada una) con 500 \muL de NaOH 2 M
y 25 \muL de nitrobenceno. Se incubó esta mezcla en un tubo de
vidrio cerrado a 160ºC durante 3 h. Se enfriaron los productos de
reacción a temperatura ambiente y se añadieron 5 \muL de una
solución de
3-etoxi-4-hidroxibenzaldehído
en piridina de 20 mg mL^{-1} como un estándar interno antes de
extraer la mezcla dos veces con 1 mL de diclorometano. Se acidificó
la fase acuosa con HCl 8pH 2) y se extrajo dos veces con 900 \muL
de éter. Se secaron las fases etéreas combinadas con sulfato sódico
anhidro y se evaporó el éter en una corriente de nitrógeno. El
residuo seco se suspendió de nuevo en 50 \muL de piridina, se
añadieron 10 \muL de BSA
(N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida)
y se analizaron alícuotas de 1 \muL de los productos sigilados
utilizando un cromatógrafo de gases Hewlet-Packard
5890 Series II equipado con una columna SPB I Supelco (30 m x 0,75
mm). Se calculó la composición de monómero de lignina a partir de
las áreas integradas de los picos que representan los derivados
trimetilsililados de vanillina, siringaldehído, ácido vaníllico y
ácido siríngico. Se calcularon las unidades de guaiacilo
susceptibles de oxidación del nitrobenceno (vanillina y ácido
vaníllico) y las unidades de siringilo (siringaldehído y ácido
siríngico) siguiendo la corrección para las eficiencias de
recuperación de cada uno de los productos durante el procedimiento
de extracción relativo al estándar interno.
Se identificó un mutante fah1 marcado de
T-DNA en una biblioteca de líneas marcadas de
T-DNA (Feldmann y col., Mol. Gen. Genet. 208,
1, (1987)) (Dr. Tim Caspar, Dupont, Wilmington, DE) por selección de
plantas adultas bajo luz de UV de onda larga. Se seleccionó una
línea fluorescente roja (línea 3590), y se ensayó su progenie para
determinar el contenido de sinapoilmalato por TLC. Los análisis
indicaron que la línea 3590 no acumuló sinapoilmalato. Los cruces
recíprocos de la línea 3590 a un homocigoto de
fah1-2, seguido por análisis de la generación
F1 para el contenido de sinapoilmalato, demostraron que la línea
3590 tenía un nuevo alelo de fah1, y se designó como
fah1-9.
fah1-9.
Los experimentos preliminares indicaron
co-segregación del fenotipo de kanamicina del
mutante marcado de T-DNA con el fenotipo
fah1. La semilla autofecundada a partir de plantas
[fah1-9 x FAH1] resistentes a 7
kanamicina segregaron 1:3 para la resistencia a la kanamicina
(kan^{sensible}kan^{resistente}) y 3:1 para la
deficiencia de sinapoilmalato (FAH1:fah1). A partir de estas
líneas, las plantas de fah1 dieron un aumento a sólo la
progenie fah1 kan^{resistente}. Para determinar la
distancia genética entre la inserción de T-DNA y el
sitio de FAH1, se llevaron a cabo múltiples cruces de ensayo entre
un [fah1-9 x FAH1] F1 y un homocigoto
de fafl-2. Se evaluó la distancia entre el
sitio de FAH1 y la inserción del T-DNA por
determinación de la frecuencia a la que se recuperó la progenie de
FAH1/kan^{sensible}en el ensayo de cruce F1. En la
ausencia de sucesos de reticulación, toda la progenie de F1
resistente a la kanamicina fue incapaz de acumular sinapoilmalato, y
dando, de este modo, fluorescencia roja bajo la luz UV. En la
progenie examinada de F1 682 kan^{resistente}, no se
identificaron plantas proficientes de sinapoilmalato, indicando una
unión muy estrecha entre el sitio de inserción del
T-DNA y el sitio del FAH1.
Se llevó a cabo el rescate del plásmido
utilizando el DNA digerido de la EcoRI preparado a partir de
plantas fah1-9 homozigóticas (Behringer y
col., (1992), supra). Se incubaron 5 \mug de DNA genómico
digerido de la EcoRI con 125 U de ligasa de DNA T4 toda la
noche a 14ºC en un volumen final de 1 mL. La mezcla de unión se
concentró aproximadamente cuatro veces por dos extracciones con
volúmenes iguales de 2-butanol, y a continuación se
precipitó de etanol y se electroporó en células
DH5-\alpha competentes tal como se ha descrito
(Newman y col., 81994), supra).
El DNA de plásmidos rescatados fue doble digerido
con la EcoRI y la SalI. Los plásmidos generados a
partir de las secuencias de T-DNA internas fueron
identificados por la presencia de bandas de triplete a 3,8, 2,4 y
1,2 kb y fueron descartados. Se identificó un plásmido (pCC1) que
dio un aumento a la banda de 3,8 kb esperada más una nueva banda de
5,6 kb como un plásmido de extremo derecho externo putativo.
Utilizando un fragmento SacII/EcoRI de pCC1 que
pareció que representaba el DNA de Arabidopsis, se
identificaron los clones de el cDNA putativo (pCC30) para F5H. El
clon F5H transportó un inserto de SalI-No1I, cuya
secuencia se determinó. El análisis de Blastx (Alschul y col., J.
Mol. Biol. 215, 403, (1990)) indicando que este cDNA codifica
una monooxigensa dependiente del citocromo P450, consistente con
trabajos anteriores en los que (i) el mutante de fah1 era
defectuoso en F5H (Chapple y col., supra) y (ii) la F5H es un
monooxigenasa dependiente del citocromo P450 (Grand,
supra).
Se utilizó el análisis Southern y Northern para
determinar si el cDNA de F5H putativo representa realmente el gen
que fue cortado en la línea marcad de T-DNA para
caracterizar los mutantes de fah1 disponibles utilizando el
cDNA de F5H putativo.
La Figura 6 muestra una mancha Southern
comparando la hibridación del cDNA de F5H al DNA genómico digerido
de la EcoRI aislada a partir del tipo salvaje (ecotipos
Columbia (Col), Landsberg erecta (LER), y Wassilewskija (WS))
y los nueve alelos de fah1 incluyendo el alelo de
fah1-9 marcado del T-DNA. WS
es el ecotipo a partir del que se generó la línea marcada de
T-DNA.
Estos datos indicaron la presencia de un
polimorfismo de longitud del fragmento de restricción entre la línea
marcada y el tipo salvaje. Estos datos también indican un
polimorfismo de longitud del fragmento de restricción en el alelo
fah1-8 que fue generado con neutrones
rápidos, una técnica que se ha descrito que causa mutaciones de
eliminación.
Tal como se muestra en la Figura 6 el DNA
genómico de los alelos fah1-8 y
fah1-9 (la línea marcada del
T-DNA) es cortado en la región correspondiente al
cDNA de F5H putativo. Estos datos también indican que la F5H es
codificada por un único gen en Arabidopsis tal como era
esperado considerando que la mutación en el mutante de fah1
segrega un único gen mendeliano. Estos datos proporcionan la primera
indicación de que el cDNA de la F5H putativa corresponde al gen que
es cortado en los mutantes de fah1.
Fue examinado el material de plantas homozigótico
para nueve alelos fah1 derivados de forma independiente para
determinar la abundancia del transcrito correspondiente al cDNA de
F5H putativo utilizando el análisis de manchas Northern. Los datos
se muestran en la Figura 7.
Tal como se puede ver de los datos, el mRNA de
F5H putativo se representó a niveles similares en tejido de hojas de
Columbia, ecotipos de Landsberg erecta y Wassilewskija y en
los fah1-1, fah1-4, y
fah1-5, inducidos de EMS, así como el
fah1-7 inducido por neutrones rápidos. La
abundancia del transcrito fue reducida de forma sustancial en hojas
a partir de plantas homozigóticas para el fah1-2,
fah1-3 y fah1-6, todos
los cuales fueron inducidos por EMS, el
fah1-8 del mutante inducido por neutrones
rápidos y en el fah1-9 de la línea marcada.
El mRNA en el mutante de fah1-8 también
parece estar truncado. Estos datos proporcionaron una fuerte
evidencia de que el clon de cDNA que había sido identificado era
codificado por el sitio de FAH1.
Con el fin de demostrar la identidad del gen de
F5H al nivel funcional se valoró la biblioteca de cósmido pBIC20
competente en la transformación (Meyer y col., supra) para
los clones genómicos correspondientes utilizando el cDNA de F5H de
longitud total como una sonda. Se transformó un clon
(pBIC20-F5H) que transporta un inserto genómico de
17 kb que contiene 2,2 kb de secuencia contra corriente del codon de
inicio de la F5H putativo y 12,5 kb de la secuencia en el sentido de
la corriente del codon final del gen de F5H (Figura 2) en el mutante
de fah1-2 por infiltración a vacío. Se
llevaron a cabo treinta experimentos de infiltración independientes,
y se transfirieron 167 plantillas de semilla resistentes a
kanamicina, representando al menos 3 transformantes de cada
infiltración, al suelo y fueron analizadas con respecto al los
metabolitos secundarios derivados de ácido sinápico. De estas
plantas, 164 acumularon sinapoilmalato en el tejido de su hoja tal
como se determinó por TLC (Figura 3). Estos datos complementarios
indican que está presente el gen defectuoso en el mutante
fahl en el cósmido binario pBIC20-FSH.
Para delimitar la región de DNA en el cósmido
pBIC20-FSH responsable de la complementación del
fenotipo mutante, se fusionó un fragmento de 2,7 kB de la secuencia
genómica de la F5H en el sentido de la corriente del promotor del
virus mosaico de la coliflor 35S en el plásmido binario pGA482 y se
transformó esta construcción
(pGA482-35S-F5H) (Figura 2) en el
mutante de fah1-2. Se analizó la presencia de
sinapoilmalato en 109 de las 110 líneas transgénicas analizadas por
TLC o por fluorescencia in vivo bajo luz UV indicando que el
fenotipo mutante fah1 había sido complementado (Figura 3).
Estos datos proporcionan una evidencia conclusiva de que ha sido
identificado el cDNA de F5H.
Se secuenció completamente tanto del cDNA de la
F5H como un fragmento de 5156 bp de HindIII-XhoI del
clon genómico pBIC20-F5H en ambas hebras y la
secuencia de la proteína de F5H (SEC de ID NO.: 2) se infirió a
partir de la secuencia de cDNA (Figura 8). La secuencia del cDNA de
F5H de Arabidopsis thaliana se da en la SEQ de ID NO.: 1. La
secuencia del clon genómico de F5H de Arabidopsis thaliana se
da en la SEC de ID NO.: 3.
Utilizando una estrategia de clonación basada en
adaptador, se sustituyeron las secuencias reguladoras 5' del sitio
de iniciación de la traducción del gen F5H con el promotor del virus
35S mosaico de la coliflor de fuerte constitución (Odell y col.,
Nature 313, 810-812 (1985)), tal como se
muestra en la Figura 2. La construcción resultante transporta 2719
bp de la secuencia genómica de F5H dirigida por el promotor del
virus mosaico de la coliflor 35S fusionado 50 bp en sentido
contrario a la corriente del codón de inicio ATG inferido. Como
resultado, el promotor del virus mosaico de la coliflor 35S dirige
la expresión del gen de F5H mediante la utilización del sitio de
inicio de la transcripción del promotor viral y la señal de
terminación presente en la secuencia genómica de F5H. Se insertó
este registro de expresión para la expresión ectópica de la F5H en
el T-DNA del vector binario pGA482 (G. An, (1987),
Binary Ti vectors for plant transformation and promoter análisis
in: Methods in enzymology. R. Wu, ed. Academic Press, NY
153: 292-305) y se introdujo en Agrobacterium
tumefaciens por electroporación.
Se transformaron las plantas de
Arabidopsis transgénicas del ecotipo Columbia que fueron
homozigóticas para el alelo de fah1-2
(Chapple y col., supra) con cultivos de Agrobacterium
que albergaban la construcción
pGA482-35S-F5H de acuerdo con el
método de Bent y col. (supra). Se identificaron las plantas
transgénicas de la generación T2 y T3 por selección en medios
conteniendo kanamicina y subsecuentemente se transfirieron al
suelo.
Se cosechó tejido de tallo de plantas de 4
semanas de vida que habían sido crecidas en suelo a 22ºC bajo un
fotoperiodo de luz/oscuridad de 16 h/ 8 h. El análisis de oxidación
del nitrobenceno generó valores de siringilo de % de moles para 9
líneas transformantes diferentes (Tabla 1) oscilando entre 5,06 +/-
0,17 moles en % y 28,8 +/- 0,92 moles en % como oposición al control
de tipo salvaje que demostró un valor de 18,4 +/- 0,91 moles en %.
El antecedente mutante de fah1-2 en el que se
generaron las líneas transgénicas está completamente falto de
siringil lignina (Tabla 1). La baja expresión del transgen de la F5H
en un antecedente genético al que le falta el mensaje de la F5H
endógeno explica cómo la línea 88 puede tener niveles de siringil
lignina que son menores que el tipo salvaje.
Además de la Arabidopsis, las plantas de
tabaco se transformaron de un modo similar con el gen de la F5H bajo
control del promotor de virus mosaico de la coliflor 35S. Se
seleccionaron los transformantes positivos T2 y T3 y se analizaron
para la modificación de la lignina y los datos se dan en la tabla 2.
El análisis de oxidación del nitrobenceno de los rebordes centrales
de las hojas de tabaco generó valores de siringilo en % en moles
para 4 líneas transformante diferentes (Tabla 2) que oscilan entre
22,4 +/- 1,53 moles en % y 40,0 +/- 1,86 moles en % como oposición
al control de tipo salvaje que demostró un valor de 14,3 +/- 1,09
moles en %.
Los datos de las Tablas 1 y 2 demuestran
claramente que la sobre expresión del gen de la F5H en plantas
transgénicas produce la modificación de la composición del monómero
de la lignina. Es esperable que la planta transformada tenga un
contenido de monómero siringil lignina que oscile entre
aproximadamente el 0% en moles y aproximadamente el 95% en moles tal
como se ha medido en el tejido de la planta entera.
(1) GENERAL INFORMATION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- APPLICANT:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME: PURDUE RESEARCH FOUNDATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- STREET: 1650 ENGINEERING ADM BLDG, ROOM 328
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CITY: WEST LAFAYETTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- STATE: INDIANA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- COUNTRY: UNITED STATES OF AMERICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- POSTAL CODE (ZIP): 47907-1650
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEPHONE: 317-494-2610
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 317-496-1277
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITLE OF INVENTION: A METHOD FOR REGULATION OF PLANT LIGNIN COMPOSITION
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMBER OF SEQUENCES: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- COMPUTER READABLE FORM:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIUM TYPE: DISKETTE, 3.50 INCH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTER: IBM PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OPERATING SYSTEM: WINDOWS 3.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MICROSOFT WORD 2.0C
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- CURRENT APPLICATION DATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- APPLICATION NUMBER:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FILING DATE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASSIFICATION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PRIOR APPLICATION DATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- APPLICATION NUMBER: 60/009,119
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FILING DATE: DECEMBER 22, 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME: THOMAS Q. HENRY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- REGISTRATION NO.: 28,309
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCE/DOCKET NUMBER: CR-9870
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGHT: 1838 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: DNA (cDNA)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGHT: 520 amino acids
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: amino acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: unknown
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: unknown
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: protein
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGHT: 5156 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
Claims (10)
1. Un fragmento de ácido nucleico aislado que
codifica una enzima F5H de una planta activa teniendo una secuencia
de amino ácidos seleccionada entre el grupo que consiste en (1) la
secuencia de amino ácidos de SEC de ID NO.: 2, y (2) una secuencia
de amino ácidos de la SEC de ID NO.: 2 englobando las sustituciones,
las adiciones o las eliminaciones de amino ácidos que no alteran la
función de la enzima F5H de la planta activa.
2. Un fragmento de ácido nucleico aislado que
codifica una enzima F5H de una planta activa, estando el fragmento
seleccionado entre el grupo que consiste en el fragmento de ácido
nucleico de la SEC de ID NO.: 1, el fragmento de ácido nucleico de
la SEC de ID NO.: 3 y un fragmento de ácido nucleico de la SEC de ID
NO.: 1; ó SEC de ID NO.: 3 englobando los cambios de base que no
alteran la función de la enzima F5H de la planta codificada.
3. Un gen quimérico que causa relaciones
alteradas de los monómeros guaiacilo:siringilo de lignina en una
célula de una planta transformada con el gen quimérico,
comprendiendo el gen quimérico el fragmento de ácido nucleico de las
reivindicaciones 1 o 2 unido de forma operable tanto en una
orientación con sentido como en anti-sentido a al
menos una secuencia reguladora adecuada.
4. El gen quimérico de la reivindicación 3 en
donde el fragmento de ácido nucleico está unido de forma operable
en la orientación con sentido, a al menos una secuencia reguladora
adecuada.
5. El gen quimérico de la reivindicación 3 en
donde el al menos una secuencia reguladora comprende un promotor
seleccionado entre el grupo que consiste en el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor, el promotor del gen de la
fenilalanina amonio liasa, el promotor del gen de la
p-cumaroil CoA ligasa, y los promotores de las plantas
endógenos capaces de controlar la expresión de los genes F5H de
plantas.
6. Una planta transformada que tenga las
relaciones relativas de los monómeros guaiacilo:siringilo alteradas
con relación a las relaciones de una planta no transformada y que
comprenda una planta anfitriona adecuada y el gen quimérico de la
reivindicación 3.
7. La planta transformada de la Reivindicación 6
en la que el contenido en el monómero siringilo de la lignina está
comprendido entre aproximadamente un 0% en moles y aproximadamente
un 95% en moles, habiéndose medido en el tejido de la planta
entera.
8. La planta transformada de la reivindicación 7
en donde la planta anfitriona adecuada está seleccionada entre el
grupo que consiste en alfalfa (Medicago sp.), arroz
(Oryza sp.), maíz (Zea mays), planta de colza
(Brassica sp.), plantas forrajeras, Arabidopsis sp.,
tabaco (Nicotiana sp.) y árboles de cultivo tales como
eucaliptos (Eucalyptus sp.), pino (Pinus sp.), abeto
(Picea sp.) y álamo (Populus sp.).
9. Un método de alterar la actividad de la enzima
F5H en una planta, que comprende:
(i) la transformación de una célula, un tejido o
un órgano de una planta anfitriona adecuada con el gen quimérico de
la Reivindicación 3 en donde el gen quimérico es expresado;
(ii) la selección de las células transformadas,
de tejido leñoso cicatrizal de células, de embriones somáticos, o de
semillas que contienen el gen quimérico;
(iii) la regeneración de plantas enteras a partir
de células transformadas, de tejido leñoso cicatrizal de células, de
embriones somáticos, o de semillas seleccionadas en la etapa
(ii);
(iv) la selección de plantas enteras regeneradas
en la etapa (iii) que tienen un fenotipo caracterizado por
(1) la habilidad de la planta entera para acumular compuestos
derivados del ácido sinápico o (2) un contenido relativo del
monómero siringilo de la lignina en relación a una planta anfitriona
no transformada.
10. Un método de alterar el contenido o la
composición de lignina en una planta, que comprende la incorporación
de forma estable del gen quimérico de la reivindicación 3 en el
genoma de la planta anfitriona por medios de transformación por los
que el gen quimérico incorporado expresa la enzima F5H y por lo que
las relaciones de monómeros de la lignina guaiacilo:siringilo están
alterados a partir de los de la planta anfitriona no
transformada.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US911995P | 1995-12-22 | 1995-12-22 | |
| US9119P | 1995-12-22 | ||
| US1338896P | 1996-03-14 | 1996-03-14 | |
| US13388P | 1996-03-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2241009T3 true ES2241009T3 (es) | 2005-10-16 |
Family
ID=26679075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96944430T Expired - Lifetime ES2241009T3 (es) | 1995-12-22 | 1996-12-19 | Un metodo para la regulacion de la composicion de lignina de las plantas. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5981837A (es) |
| EP (1) | EP0868432B1 (es) |
| AT (1) | ATE294815T1 (es) |
| AU (1) | AU716369B2 (es) |
| BR (1) | BR9612220A (es) |
| DE (1) | DE69634699T2 (es) |
| ES (1) | ES2241009T3 (es) |
| NZ (1) | NZ325676A (es) |
| PT (1) | PT868432E (es) |
| WO (1) | WO1997023599A2 (es) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE294815T1 (de) * | 1995-12-22 | 2005-05-15 | Purdue Research Foundation | Methode zur regulation der ligninzusammensetzung in pflanzen |
| AU716066B2 (en) * | 1996-07-19 | 2000-02-17 | Purdue Research Foundation | Manipulation of lignin composition in plants using a tissue-specific promoter |
| US5850020A (en) * | 1996-09-11 | 1998-12-15 | Genesis Research & Development Corporation, Ltd. | Materials and method for the modification of plant lignin content |
| US7087426B2 (en) | 1996-09-11 | 2006-08-08 | Agrigenesis Biosciences Ltd. | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| US6204434B1 (en) | 1996-09-11 | 2001-03-20 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| AU2003203517B2 (en) * | 1996-09-11 | 2006-12-14 | Arborgen, Llc | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| US6410718B1 (en) | 1996-09-11 | 2002-06-25 | Genesis Research & Development Corporation Ltd. | Materials and methods for the modification of plant lignin content |
| HUP0002477A3 (en) * | 1997-08-27 | 2002-09-30 | Pioneer Hi Bred Int | Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof |
| US7279619B2 (en) | 1998-01-22 | 2007-10-09 | National Research Council Of Canada | Methods and compositions for modifying levels of secondary metabolic compounds in plants |
| JP2002502587A (ja) | 1998-01-22 | 2002-01-29 | ナショナル、リサーチ、カウンシル、オブ、カナダ | 植物において二次代謝化合物のレベルを改変する方法および組成物 |
| ID30318A (id) | 1998-10-09 | 2001-11-22 | Genesis Res & Dev Corp Ltd | Bahan-bahan dan metoda untuk modifikasi kandungan lignin tanaman |
| US6982153B1 (en) * | 1998-12-03 | 2006-01-03 | Targanta Therapeutics, Inc. | DNA sequences from staphylococcus aureus bacteriophage 77 that encode anti-microbial polypeptides |
| US6540997B1 (en) * | 1999-01-26 | 2003-04-01 | Robert A. Sinnott | Shelf-stable, virulent preparation containing Agrobacterium cells, an acidulant and a phenolic compound |
| EP1153134A1 (en) * | 1999-02-01 | 2001-11-14 | Cellfor Inc. | Modification of lignin composition of gymnosperms |
| GB0002814D0 (en) * | 2000-02-09 | 2000-03-29 | Univ York | Nucleic acids and their uses |
| US20020026658A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-02-28 | Chapple Clinton C.S. | Genes encoding sinapoylglucose: malate sinapoyltransferase and methods of use |
| CA2419524A1 (en) | 2000-08-16 | 2002-02-21 | Purdue Research Foundation | Genes encoding mutant p-coumarate 3-hydroxylase (c3h) and methods of use |
| US20060260011A1 (en) * | 2005-03-28 | 2006-11-16 | Syngenta Participations Ag | Methods and genetic constructs for modification of lignin composition of corn cobs |
| WO2005102034A2 (en) | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Syngenta Participations Ag | Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue |
| US9238818B2 (en) * | 2004-04-20 | 2016-01-19 | Syngenta Participations Ag | Methods and genetic constructs for modification of lignin composition of corn cobs |
| US7456338B2 (en) | 2004-09-22 | 2008-11-25 | Arborgen Llc | Modification of plant lignin content |
| WO2008013774A2 (en) | 2006-07-25 | 2008-01-31 | Nitto Denko Corporation | Non-linear optical device with long grating persistency |
| EP2054765A2 (en) * | 2006-07-25 | 2009-05-06 | Nitto Denko Corporation | Non-linear optical device sensitive to green laser |
| US9309528B2 (en) * | 2006-11-21 | 2016-04-12 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Biofuel production methods and compositions |
| US20080213871A1 (en) * | 2006-12-01 | 2008-09-04 | Michigan State University | Altering regulation of maize lignin biosynthesis enzymes via RNAi technology |
| JP2011514914A (ja) * | 2008-02-05 | 2011-05-12 | 日東電工株式会社 | 青色レーザーに反応する光学素子および光を変調する方法 |
| US20100096603A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-22 | Nitto Denko Corporation | Optical devices responsive to near infrared laser and methods of modulating light |
| US20100099789A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-22 | Nitto Denko Corporation | Method for modulating light of photorefractive composition |
| EP2821491A1 (en) * | 2013-07-03 | 2015-01-07 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Method for producing a drought and salt tolerant plant |
| US20150034109A1 (en) | 2013-08-02 | 2015-02-05 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Process for Producing Lignin from Tobacco |
| US9950858B2 (en) | 2015-01-16 | 2018-04-24 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Tobacco-derived cellulose material and products formed thereof |
| US11154087B2 (en) | 2016-02-02 | 2021-10-26 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Method for preparing flavorful compounds isolated from black liquor and products incorporating the flavorful compounds |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9109063D0 (en) * | 1991-04-26 | 1991-06-12 | Ici Plc | Modification of lignin synthesis in plants |
| ATE294815T1 (de) * | 1995-12-22 | 2005-05-15 | Purdue Research Foundation | Methode zur regulation der ligninzusammensetzung in pflanzen |
-
1996
- 1996-12-19 AT AT96944430T patent/ATE294815T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 PT PT96944430T patent/PT868432E/pt unknown
- 1996-12-19 NZ NZ325676A patent/NZ325676A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 WO PCT/US1996/020094 patent/WO1997023599A2/en not_active Ceased
- 1996-12-19 ES ES96944430T patent/ES2241009T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 BR BR9612220-0A patent/BR9612220A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 AU AU14239/97A patent/AU716369B2/en not_active Ceased
- 1996-12-19 DE DE69634699T patent/DE69634699T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 EP EP96944430A patent/EP0868432B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 US US09/091,432 patent/US5981837A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-31 US US09/387,663 patent/US6489538B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69634699D1 (de) | 2005-06-09 |
| EP0868432A2 (en) | 1998-10-07 |
| WO1997023599A2 (en) | 1997-07-03 |
| US5981837A (en) | 1999-11-09 |
| AU1423997A (en) | 1997-07-17 |
| AU716369B2 (en) | 2000-02-24 |
| WO1997023599A3 (en) | 1997-10-09 |
| DE69634699T2 (de) | 2006-05-04 |
| PT868432E (pt) | 2005-06-30 |
| NZ325676A (en) | 1999-09-29 |
| ATE294815T1 (de) | 2005-05-15 |
| EP0868432B1 (en) | 2005-05-04 |
| US6489538B1 (en) | 2002-12-03 |
| BR9612220A (pt) | 2000-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0868432B1 (en) | A method for regulation of plant lignin composition | |
| US6610908B1 (en) | Manipulation of lignin composition in plants using a tissue-specific promoter | |
| JP4871487B2 (ja) | 植物におけるリグニン含量及び組成、及びセルロース含量の同時制御方法 | |
| US5850020A (en) | Materials and method for the modification of plant lignin content | |
| CN101568254B (zh) | 改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法 | |
| AU1658192A (en) | Modification of lignin synthesis in plants | |
| CA2404104C (en) | Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages | |
| AU2001247731A1 (en) | Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages | |
| US20040049802A1 (en) | Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages | |
| US20040052774A1 (en) | Reducing oxidative stress of plants by increasing glutathione content | |
| US7071376B2 (en) | Genes encoding p-coumarate 3-hydroxylase (C3H) and methods of use | |
| Grimmig et al. | Expression of BifunctionaI Caffeoyl‐CoA 3‐O‐Methyltransferase in Stress Compensation and Lignification | |
| AU746458B2 (en) | A method for regulation of plant lignin composition | |
| MXPA98005066A (es) | Metodo para regulacion de una composicion de lignina vegetal | |
| MXPA99000596A (es) | Manipulacion de la composicion de lignina en plantas que usan promotor especifico de tejido | |
| GRIMA-PETTENATI et al. | LIGNIFICATION GENES IN EUCALYPTUS: CHARACTERIZATION, EXPRESSION AND | |
| Hu | Isolation and characterization of p-coumarate: Coenzyme A ligase cDNAs and genes from quaking aspen (Populus tremuloides Michx) | |
| Grima-Pettenati et al. | Lignification Genes in Eucalyptus: Characterization, Expression and Subsequent Use for Lignin Manipulation | |
| Li | Characterization of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) genes in Arabidopsis | |
| CA2240832A1 (en) | A method for regulation of plant lignin composition |