ES2241182T3

ES2241182T3 - Procedimiento de inhibicion de la produccion de citocinas.

Info

Publication number: ES2241182T3
Application number: ES98956724T
Authority: ES
Inventors: Michel Goldman; Helene Margery; Patrick Adelin Oscar Robberecht; Jean Pierre Robert Ghislain Tassignon; Michel Vandevelde
Original assignee: PHAR H; H-PHAR
Current assignee: PHAR H; H-PHAR
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: EP1032401B1; DE69829406D1; DE69829406T2; EP1032401A2; BE1011571A3; ATE290870T1; US6407081B1; CA2312023A1; AU1327699A; AU757489B2; WO1999027937A3; WO1999027937A2; JP2001524526A

Abstract

Procedimiento de inhibición in vitro de producción de citocinas, mediante células, especialmente, animales o humanas, y de su secreción, el cual comprende la aplicación, sobre las células, de por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la **fórmula** en la cual, A, representa un grupo carboxílico o un grupo R1-N, B representa un grupo carboxílico de R3 R2, fórmula -N , R1, R2, R3 y R4, son idénticas R4 ó diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo hidroxi, R1 y R2, pueden estar unidas, conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, y R3 y R4, pueden estar unidas conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, X1 y X2, son idénticas o diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de oxígeno o un grupo NR5, en elcual, R5 es un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo nitro, y en el cual, cuando dos de los grupos NR5 se encuentran simultáneamente presentes, cada R5, puede ser idéntico o diferente del otro, así como de sus sales, ésteres e isómeros.

Description

Procedimiento de inhibición de la producción celular de citocinas.

La presente invención, se refiere a un procedimiento de inhibición in vitro de producción de citocinas, mediante células, especialmente, animales o humanas, y de su secreción.

La presente invención, tiene como finalidad el poner a punto un procedimiento de inhibición in vitro de producción de citocinas, mediante células, el cual no pone en peligro a las células. De una forma ventajosa, este procedimiento, permitirá inhibir, en estas células, la producción y la secreción de substancias que favorecen la aparición de fenómenos inmunoalérgicos.

Este problema, se resuelve, según la invención, mediante un procedimiento tal como el que se describe al principio, el cual comprende una aplicación sobre las citadas células, de por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la fórmula

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en la cual, A, representa un grupo carboxílico o un grupo 2, B representa un grupo carboxílico de la fórmula 3, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, son idénticas ó diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo hidroxi, R^{1} y R^{2}, pueden estar unidas, conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, y R^{3} y R^{4}, pueden estar unidas conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, X^{1} y X^{2}, son idénticas o diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de oxígeno o un grupo NR^{5}, en el cual, R^{5} es un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo nitro, y en el cual, cuando dos de los grupos NR^{5} se encuentran simultáneamente presentes, cada R^{5}, puede ser idéntico o diferente del otro, así como de sus sales, ésteres e isómeros.

Muchos de estos derivados azoicos, son compuestos conocidos, de una forma particular, por su actividad antivírica, especialmente, contra el virus del grupo retrovirus, de una forma particular, el virus del SIDA (véanse los documentos de las solicitudes internacionales de patentes WO-A-9 116 054 y WO-A-9 107 876, así como el documento de la solicitud de patente estadounidense US-A-5 585 367).

En cuanto a lo concerniente, de una forma más particular, a la 1,1'-azobisdimetilformamida, también denominada diamida, un gran número de investigadores, han investigado el fenómeno de activación del factor de transcripción intracelular NF kappa B, y han mostrado el hecho de que, la diamida, bloquea el rol interpretativo de ciertas enzimas, en la cascada de la activación de este factor (S. Singh et al., Protein-tyrosine..., The Journal of Biologycal Chemistry, 270 (18), 1995; Brennan et al., Inhibition of NF kappa B..., Biochemcial Society Transactions, 24(1), 1996; Brennan et al, The effects of thiol..., Biochemicals Society Transactions 21(4), 1993).

Otros autores, han mostrado el hecho de que, a ciertas concentraciones, la diamina, induce una apoptosis, en ciertas líneas celulares.

Otros autores, también, han mostrado un efecto de la diamina sobre ciertos receptores membranarios.

Ninguno de estos estudios muestra, mientras tanto, una acción de inhibición de la diamida, sobre la producción de citocinas, mediante las células observadas. Se puede incluso notar que, Mendez et al., en "Oxidants augment endotoxin -induced-activation of alveolar mocrophages", SHOGK, vol. 6, nº 3, páginas 157-163, 1996, observan un aumento no significativo de la producción del factor de necrosis tumoral, a la dosis de 1 milimol, es decir, un efecto inverso al observado, de una forma repetitiva, sobre diversas citocionas según la presente invención.

Se conoce, por otra parte, el hecho de que, los derivados azoicos según la presente invención, ofrecen una toxicidad propia, extremadamente débil, en sí misma, con respecto al cuerpo humano, o de las células sanas tratadas.

Según un modo de realización de la presente invención, el procedimiento, comprende una inhibición in vitro de la producción y de la secreción de interleucinas, mediante las células. De entre el grupo de interleucinas, pueden citarse, de una forma especial, las interleucinas IL-2, IL-4, IL5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 y IL-15, y se considera, de una forma muy particular, la inhibición de la IL-2 y de la IL-5.

Según otra forma de realización de la presente invención, el procedimiento, comprende una inhibición de producción y de secreción del interferón-\gamma (IFN-\gamma), mediante las células. Según todavía otra forma de realización de la presente invención, el procedimiento, comprende una inhibición de producción y de secreción de un factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha).

Según una forma de realización ventajosa de la presente invención, R^{1} a R^{5}, representan cada una, en la fórmula general proporcionada anteriormente, arriba, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, el cual comporta de 1 a 6 átomos de carbono. Los heterociclos eventualmente formados en la fórmula general, pueden contener, además del átomo de nitrógeno, por lo menos otro heteroátomo, por ejemplo, oxígeno. El heterociclo, es por ejemplo pentagonal a octagonal, de una forma preferente, éste es hexagonal. Los derivados azoicos según la presente invención, pueden elegirse entre el grupo que comprende a derivados de azobisformamidina, tales como la 1,1'-azobisformamidina, 1,1-azobisnitroformamidina, la 2,2'azobismetilformamidina, la 1,1'-aozibisfluoroformamidina, la 1-monocloroazobis-formamidina, y la azobis-(cloroformamidina), los derivados de azobisformamidina, tales como 1,1'-azobisformamida y dimetil-azobisformamida, la 1,1'-(azodicarbonil)-dipiperidina, la 1,1'-azodicarbonil)-dimorfolina, el ácido azodihidroxámico y sus sales, y el ácido azodicarboxílico y sus sales.

De una forma ventajosa, el procedimiento, comprende una aplicación del derivado azoico sobre las células, a una dosis que no induzca a la apoptosis de éstas. Se puede considerar, de una forma preferente, una concentración micromolar de unos valores de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 200, de una forma preferente, de 2 a 20 y, de una forma ventajosa, de 2 a 10.

Bajo este aspecto, la 1,1'-azobisdimetilformamida, denominada también diamina, puede presentar, en ciertas circunstancias, el inconveniente de provocar, a ciertas concentraciones demasiado elevadas, una apoptosis celular, al mismo tiempo que ofrecer un tiempo de vida media, relativamente corto, de únicamente algunos minutos.

Según una forma de realización de la presente invención, la aplicación de por lo menos uno de los derivados azoicos indicados, se efectúa sobre células aisladas de macroorganismos o sobre células de microorganismos, las cuales proceden, por ejemplo, de los cultivos celulares. Los cultivos tratados, pueden también ser células de un órgano o de tejidos multicelulares, extraídos de un cuerpo humano o de un animal, como por ejemplo, las células de una muestra de sangre o de linfa.

Según una forma de realización de la invención, la aplicación de por lo menos uno de estos derivados azoicos indicados, se efectúa, por ejemplo, sobre células aisladas de sangre humana, productoras de citocinas. Estas células, pueden extraerse de una forma global y, desde entonces, se observarán efectos globales sobre los diferentes tipos linfocitarios, de las células que presentan antígenos, así como sobre los macrófagos, en co-cultivos. Una etapa más madura de la investigación, podrá consistir, en la medida de la producción de las citocinas mediante células celulares altamente purificadas, por ejemplo, en los linfocitos CD4.

El tratamiento de las líneas celulares concernidas, puede también efectuarse mediante la administración de los derivados azoicos a organismos vivos, entre los que se encuentra el ser humano, y la ponderación de los diferentes grupos de citocinas en los líquidos biológicos extraídos del cuerpo humano o animal, antes, durante y/o después del tratamiento, así como mediante la ponderación de la posibilidad de producción de las linfocinas concernidas, después de la extracción de las células contenidas en estos líquidos.

Puede también considerarse un tratamiento mediante un derivado azoico según la presente invención, de los injertos o de los tejidos celulares, antes de su transplante en un cuerpo humano o animal.

Puede también preverse la utilización de medicamentos a base de derivados azoicos según la presente invención, para tratar pacientes, contra el rechazo de injertos.

Las citocinas, se producen en el organismo, mediante diferentes depósitos celulares.

Se conoce, por ejemplo, el hecho de que, los linfocitos, se especializan para la producción específica de citocinas y que, según el tipo de citocinas producidas, se diferencian los linfocitos CD4 Th1 y Th2.

Las citocinas, se producen, también, mediante los linfocitos DC8(IL-4 y IL-5), pero también, mediante los mastocitos y los eosinófilos y, en el estado de implantación, en el útero, mediante células ectodérmicas del trofoblasto.

Estas producciones de citocinas a partir de estos diferentes depósitos celulares, intervienen en la aparición de diversos procesos inflamatorios y alérgicos, en sentido amplio, así como en los fenómenos de los rechazos de injertos. Pueden citarse, entre otros, de una forma no exhaustiva, las patologías siguientes: el asma, la dermatitis atópica, la rinitis alérgica estacional, la psoriasis, el pénfigo, la tiroiditis, la miastenia, la poliartritis reumatoide, la nefropatía de Ig A, la esclerodermia, el lupus eritematoso, la diabetes insulino-dependiente, la esclerosis en placa, las enfermedades inflamatorias del tubo digestivo, la enfermedad de Crohn, la hipereosinophilia, el síndrome esosinófilo, así como toda infección debida a la apóptosis celular mediatizada por IL-5.

La substancia activa según la presente invención, puede aplicarse sobre las células, sola, o en mezcla con otras substancias según la presente invención, o incluso en mezcla con oras substancias que tengan otro efecto sobre las células. Se puede prever la aplicación de la substancia o substancias activas, tal cuales, o en forma de una composición que comporte por lo menos uno de los derivados azoicos que respondan a la fórmula anteriormente proporcionada y un soporte o vehículo apropiado.

Ciertos compuestos según la presente invención, presentan por lo menos un átomo de C, asimétrico y, por consiguiente, todos los isómeros, incluso los diastómeros y los isómeros rotativos o enantiómeros, se engloban como haciendo parte de la invención. La invención, incluye a los isómeros D e L, en forma pura o en mezcla, incluyendo a las mezclas racémicas.

Ciertos compuestos del tipo ácido, por ejemplo, los ácidos carboxílicos, pueden formar sales, por ejemplo, con metales, o con aminas aceptables, o ésteres, con alcoholes compatibles.

La presente invención, se refiere, también, a la utilización de por lo menos uno de los derivados que responden a la fórmula anteriormente proporcionada, arriba, así como sus sales o isómeros, para la fabricación de medicamentos a aplicar en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, resultantes de una producción celular patológica de las citadas citocinas. Se puede especialmente prever la fabricación de medicamentos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades auto-inmunes, y/o inflamatorias que hacen intervenir a los linfocitos T, enfermedades inflamatorias alérgicas, o incluso del rechazo de aloinjertos y/o de xenoinjertos de órganos, y la enfermedad del injerto contra el huésped, después de aloinjerto celular. De una forma ventajosa, se preverá, por lo tanto, la utilización, para fabricar medicamentos destinados a la aplicación en el tratamiento o la profilaxis de afecciones tales como las indicadas anteriormente, arriba.

El medicamento de esta forma preparado, según la presente invención, puede administrarse mediante toda vía apropiada, entre otras, por vía oral, sublingual, rectal o vaginal, por inyección o perfusión, por vía local, transcutánea o transmucosa. El medicamento, contiene una cantidad terapéuticamente eficaz, del derivado o derivados azóicos indicados anteriormente, arriba. La dosificación, será variable, de individuo a individuo, en función de sus propias características inmunológicas, las cuales, en parte, se determinan genéticamente. El medicamento, puede presentarse en cualquier tipo de forma galénica apropiado, por ejemplo, en forma de cápsulas, de píldoras, de comprimidos, de grageas, de materias en polvo, de formas a inyectar, de cremas, de ungüentos, de sistemas conocidos de distribución transdérmica, de productos a inhalar.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas, pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables usuales, así como, eventualmente, aditivos corrientes en farmacia. Estos excipientes y aditivos, comprenden, principalmente, a las cargas inertes compatibles, ligantes, agentes de desintegración, tampones, agentes conservantes, anti-oxidantes, lubrificantes, agentes sápidos, antiespesantes, colorantes, emulsionantes, etc.

Dada su primera aplicación en el sector terapéutico, un objeto de la presente invención, se refiere igualmente a derivados azoicos que responden a la fórmula general dada anteriormente, en la cual, por lo menos uno de los grupos A y B, representa un grupo carboxilo, así como sus sales, ésteres e isómeros farmacéuticamente aceptables, para su fabricación en calidad de substancias terapéuticamente activas. Se pretende, de una forma particular, como derivados de este tipo, ácidos azodiarboxílicos de la fórmula general que sigue a continuación

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y sus sales, ésteres e isómeros.

Así mismo, otro objeto de la presente invención, se refiere a los derivados azoicos que responden a la fórmula general proporcionada precedentemente, en la cual, el grupo A, representa el grupo 5, uno de los radicales R^{1} y R^{2}, representa un grupo hidroxi y, el otro, un átomo de hidrógeno, y en la cual, el grupo B, puede representar, simultáneamente, el grupo 6, uno de los radicales R^{3} y R^{4}, pueden representar un grupo hidroxi y, el otro, un átomo de hidrógeno, así como sus sales, ésteres, e isómeros farmacéuticamente aceptables, para su aplicación en calidad de substancias terapéuticamente activas. Se considerarán, de una forma particular, el ácido azodihidroxámico de la fórmula que sigue a continuación

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y sus sales e isómeros.

Al mismo tiempo, finalmente, otro objeto de la presente invención, se refiere a la 1,1'-(azodicarbonil)-dimorfolina de la fórmula

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así como a sus sales, ésteres e isómeros, para su aplicación en calidad de substancias terapéuticamente activas.

Todas estas substancias, las cuales presentan, por primera vez, una aplicación en el sector terapéutico, se destinan, de una forma particular, a su aplicación en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, que resultan de una producción celular patológica de citocinas.

La invención, se refiere también a productos que contienen por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la fórmula indicada precedentemente, arriba, y sus isómeros, y por lo menos una citocina, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo, en la terapia o la profilaxis de afecciones humanas o animales que resultan de una producción celular patológica de por lo menos una citocina, diferente de la citada por lo menos una citocina contenida en el producto de combinación, o en la terapia o la profilaxis de afecciones humanas que tiene, como efecto secundario, una producción celular patológica de por lo menos una citocina, diferente de la citada por lo menos una citocina contenida en el producto de combinación.

Otras formas y modos de realización de la invención, se indican en las reivindicaciones anexadas.

La invención, se explicará, a continuación, de una forma más detallada, con la ayuda de los ejemplos que se facilitan abajo, a continuación, proporcionados a título ilustrativo y no limitativo.

Las experiencias que se describen en estos ejemplos, se han efectuado en el Laboratoire d'Immunologie Experimental de la Université Libre de Bruxelles, con la excepción de la experiencia del ejemplo 7, la cual se ha realizado en los laboratorios de la firma UCB S.A.

Ejemplo 1 Efecto del ADA en la producción de IL-5

Se procede a aislar células mononucleares de sangre periférica (PMBC) de 5 donantes humanos sanos, de una forma corriente, a partir de 50 ml de su sangre y, a continuación, se purifican por centrifugación sobre gradiente de densidad (Lymphoprep). Las células (5 \cdot 10^{6} células/ml), se activan para 0,3 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA) y se ponen en cultivo, durante un transcurso de tiempo de 72 horas, a una temperatura de 37ºC, en presencia de diversas concentraciones en ADA (20, 10, 5, 1, 0,2 y 0,04 \mug/ml). El medio de cultivo, consiste en RPMI 1640, completado con un 10% de suero de ternero fetal, y de glutamina, y éste contiene mercaptoetanol). Las soluciones de ADA, se preparan en dimetilsulfóxido (DMSO), siendo, la concentración de trabajo en DMSO, durante las experiencias, de un 0,1%. Éstas últimas, se realizan sobre placas de 96 hoyos (200 \mul/hoyo) y, después de centrifugación de las placas, a 1500 revoluciones por minuto, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, los sobrenadantes, se recogen, y se analizan, en cuanto a lo referente a su contenido en IL-5, mediante una dosificación inmuno-enzimática de ELISA.

Los resultados de esta experiencia, se encuentran recopilados en la tabla 1 que se facilita a continuación.

TABLA 1 Contenido en IL-5, en porcentaje, del ensayo testigo

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Estos resultados, muestran que, comparativamente a las células no tratadas, las PBMC de cinco donantes sometidos a test de ensayo, producen menos IL-5, en presencia de ADA. Como media, la producción de IL-5, se inhibe a un porcentaje del 90%, para 20 \mug/ml de ADA, a un porcentaje del 80%, para 10 \mug/l, y a un porcentaje del 45%, para 0,2 \mug/ml.

Deberá tomarse debida nota del hecho de que, es la primera vez que se evidencia un efecto de ADA, de una forma del todo sorprendente, a concentraciones tan reducidas.

Se han efectuado efectos comparables, en ausencia de mercaptoetanol, con resultados relativamente semejantes.

Ejemplo 2 Efecto del ADA sobre la producción de interferón-\gamma

A partir de los mismos cultivos celulares que los que se han utilizado en el ejemplo 1, se procedió a examinar la presencia de interferón \gamma, después del tratamiento mediante las concentraciones indicadas de ADA. Aquí, también, para 4 donantes sobre 5, se observa una inhibición, tal y como se recopila en la tabla 2 que se facilita a continuación.

TABLA 2 Contenido en interferón \gamma, en porcentaje, del ensayo testigo

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En estos dos ejemplos, la disminución de la producción de citocinas, depende de la cantidad de ADA aplicada (efecto dependiente de la dosis) y ésta se observa mediante las concentraciones de ADA que no inducen a efectos citotóxicos.

Ejemplo 3

Efecto del ADA, sobre la producción de IL-2, IL-5 e interferón \gamma, mediante linfocitos T purificados.

Se procede a purificar las PMBC de 3 donantes, mediante centrifugación, sobre un gradiente de densidad (LymphPrep). Los linfocitos T, se obtienen a partir de 15 \cdot 10^{6} PMBC, incubadas durante un transcurso de tiempo de 20 a 30 minutos, en un baño maría, a una temperatura de 37ºC, con 0,8 ml de una mezcla de LymphoKwik® (One Lambda, Inc., CA, Usa). Ésta, es una mezcla de complemento y de anticuerpo específico para las formaciones antígenas de la membrana de las células que lisan las células no deseadas (linfocitos B, monocitos,...). Las células, se centrifugan y, a continuación, se lavan en dos veces. Se constata, mediante análisis FACS, el hecho de que, los cultivos de linfocitos T de esta forma producidos, contienen un porcentaje de más de un 85% de CD3 + células.

Estos cultivos, se someten a un tratamiento mediante diversas concentraciones de ADA. Los resultados, se muestran en la tabla 3 que se facilita abajo, a continuación.

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TABLA 3

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Ejemplo 4 Efecto del ADA, sobre la producción de IL-2, IL-5 y de interferón-\gamma, mediante linfocitos T CD4, purificados

Se procede a someter linfocitos T CD4 purificados (90% de pureza) y estimulados mediante PMA (forbol miristato acetato) + anticuerpos anti-CD28, de donantes sanos, a un tratamiento, mediante diversas concentraciones de ADA. Los resultados obtenidos, se proporcionan en la tabla 4 que se facilita a continuación.

TABLA 4

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En los ejemplos 3 y 4, los resultados, se expresan en %, considerando el medio sin ADA, como un 100%. Las concentraciones correspondientes a un 100% son, respectivamente, de 90.000 pg/ml de IL-2, 1100 pg/ml de IL-5, 1900 pg/ml de IFN\gamma y 2870 pg/ml de TNF-\alpha. Los resultados, son la media de las mediciones ELISA independientes.

Se constata, para estos donantes, el hecho de que, la producción de IL-5, de interferón-\gamma, y de TNF-\alpha, se inhibe a la concentración de 20 \mug/ml de ADA. Las concentraciones inferiores, inhiben ya la secreción de IL-2 mediante los linfocitos.

Resulta, de estas experiencias, el hecho de que, el ADA, actúa sobre la producción y la secreción de citocinas, a unas concentraciones, las cuales, de una forma sorprendente, son muy inferiores a las necesarias para que esta substancias tenga una acción contra la proliferación de los retrovirus VIH, en las células, y contra la proliferación de las células de tipo canceroso, lo cual permite el prever su empleo, sin problemas de toxicidad, en el sector terapéutico, en el cual, hasta el momentos presente, no podía esperarse su aplicación.

Ejemplo 5 Efecto del ADA, sobre la producción de citocinas in vivo

Se procede a efectuar una inyección i.p. única de azodicarbonamida (ADA), en una dosis de 100 mg/kg de peso corporal, o del soporte correspondiente, sobre ratones BALB/C (Harla, Zeist, Países Bajos), un día antes de la inoculación i.p. de 25 \mug de 145-2C11 mAb de hamster, un anti-ratón CD_{3} mAb, el cual induce una activación masiva de las células T policlonales in vivo, conduciendo a una liberación sistémica de citocinas. Se procede a recoger sueros, 2, 4, 8 y 24 horas después del tratamiento anti-CD_{3} y, los niveles de citocinas (IL-2, IL-4), se determinan mediante un test de ensayo ELISA (Genzyme).

Se ha procedido a representar, sobre las figuras 1 y 2, unos gráficos, en los cuales, en la ordenada, se indican las cantidades de IL-2 y de IL-5, en el suero, en forma de una media de 5 animales sometidos a test de ensayo. En la abcisa, se indican los momentos de las extracciones de sangre. Las barras vacías, corresponden a los resultados obtenidos con el soporte y, las barras llenas, a los resultados obtenidos con un tratamiento previa del ADA.

Se desprende claramente, de este ensayo, y de las figuras 1 y 2 que lo ilustran, el hecho de que, el tratamiento con el ADA, provoca una disminución significativa de la liberación de las interleucinas IL-2 e IL-4, después de la inyección de 145-2C11 mAb, en los ratones.

Ejemplo 6 Efecto del ADA, en el rechazo de los injertos alogénicos

Se procede a preparar injertos de piel bien conocidos por su dependencia con respecto a las células T, a partir de algunos ratones hembra C57BL/6.CH-2^{bm12} (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Estos, se injertan sobre los costados de los ratones C57BL/6 (Harlan, Zeist, Países Bajos). Se procede a aplicar un vendaje alrededor del orificio. Este vendaje, se retira después de un transcurso de tiempo de 10 días y, los injertos, se controlan cada día. Los ratones del test de ensayo, reciben, diariamente, una inyección i.p. de 50 mg/kg de peso corporal, de ADA y, los testigos, reciben una cantidad equivalente del soporte correspondiente, hasta que se observa un rechazo agudo.

Sobre el gráfico de la figura 3, se ha indicado, en la ordenada, en %, la supervivencia del injerto de piel y, en la abcisa, el número de días después del transplante.

Puede constatarse el hecho de que, el rechazo de aloinjerto de piel, se ha retardado significativamente, en los ratones tratados con ADA (triángulos negros), con relación al testigo (círculos negros), lo cual confirma el hecho de que, el ADA, ejerce también unos efectos supresores, sobre las células T in vivo.

Ejemplo 7

Se procede a extraer 200 ml de sangre, sobre la heparina, a partir de voluntarios sanos, machos y hembras. Se aíslan células mononucleadas, mediante centrifugación Ficoll-Hypaque, y se ponen en suspensión, en un medio constituido por RPMI 1640, completado con un 5% de suero autólogo, con 1 mN de glutamina, con 1001 IU/ml de penicilina, con 10 \mug/ml de estreptomicina, con 10/g/ml de fitohemaglutinina (pha), con 10 \mug/ml de acetato miristato de forbol (pma), y con compuestos de ensayo, tal y como viene indicado por la experiencia individual, a una densidad celular de 2.000.000 por ml. Las células, se siembran en placas de microtitración (microvaloración), de 96 hoyos, a 250 \mul por hoyo y, éstas, se ponen a incubar, durante un transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de 37ºC. A continuación, los sobrenadantes, se recogen y, las concentraciones en IL-2 y en IL-5, se cuantifican mediante un test de ensayo ELISA standard, utilizando la tecnología de biotina-estreptavidina. Como variante, la pha, se reemplazó por 0,1 \mug/ml de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD3 humanos, de tal forma que se obtuviera una activación más específica de las células T.

TABLA 5

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A =	diamina
B =	1,1'-(azodicarbonil)-dipiperidina
C =	1,1'-(azodicarbonil)-dimorfolina

Ejemplo 8 Efecto del ADA sobre la producción in vivo de interferón-\gamma

Se procede a sensibilizar ratas Brown-Norway, activamente, con ovoalbúmina. 21 días más tarde, las ratas, se tratan por vía de aerosol, con una solución de avoalbúmina, a un 5%, en NaCl 0,9%. 24 horas más tarde, se procede a medir la reactividad bronquial a la metacolina, sobre las ratas anestesiadas. Desde el final de la medición de la reactividad bronquial, se extraen esplenocitos de estas ratas, y se ponen en cultivo, para determinar la producción de IFN-\gamma, mediante estas células.

El ADA, se administra 24 horas antes del inicio de la fase de sensibilización de la ovoalbúmina y, diariamente, durante todo el tiempo de duración del ensayo, con la excepción del día de las mediciones. El ADA, se administra por vía oral, en suspensión, en metilcelulosa 1%, a una dosificación de 500 mg/kg y de 1000 mg/kg de peso corporal, dos veces al día.

En la figura 5, se reúnen los resultados obtenidos. En la ordenada, se indican las cantidades de IFN-\gamma, en pg/mg de proteína. En la abcisa, las barras vacías A a F, corresponden a las experimentaciones siguientes:

A - Ninguna estimulación con la ovoalbúmina, ninguna substancia activa

B - Ninguna estimulación con la ovoalbúmina, ADA a 500 mg/kg p.o.

C - Ninguna estimulación con la ovoalbúmina, ADA a 1000 mg/kg p.o.

D - estimulación con la ovoalbúmina, ninguna substancia activa

E - estimulación con la ovoalbúmina, ADA a 500 mg/kg p.o.

F - estimulación con la ovoalbúmina, ADA a 1000 mg/kg p.o.

Resulta claramente, de este ensayo, el hecho de que, el ADA, tiene un efecto de inhibición de la producción de INF-\gamma, por los esplenocitos de ratas tratadas, para mostrar una fuerte reactividad bronquial.

Ejemplo 9 Grageas a administrar por vía oral Composición de una gragea

500 mg de ADA

10 mg de monoestearato de glicerina

10 mg de dióxido de silicio precipitado

5 mg de estearato de magnesio

Se procede a introducir esta composición, de una forma corriente, en cápsulas de gelatina. Se puede por ejemplo prever una administración de grageas de dosis creciente (máximo, 100 mg/kg/día), a pacientes que reciben un injerto renal u otro tipo de aloinjerto (corazón, pulmón, hígado, etc...), en las 72 horas siguientes, lo más tardar, que preceden al transplante, con el fin de disminuir o de suprimir la fase de rechazo agudo. Se recomienda un control frecuente de la producción de IL-2, por parte de los pacientes. Las grageas, se administrarán solas o en asociación con ciclosporina y corticosteroides, o cualquier otro tratamiento inmunodepresor apropiado.

Ejemplo 10 Tabletas recubiertas

Se realizan, de una manera corriente, tabletas que contienen 250 mg de azobisformamidina, con la ayuda de los excipientes siguientes: hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxi-propilcelulosa, dióxido de titanio, polietilenglicol 400, óxido negro de hierro.

Estas tabletas, pueden administrarse para reducir, de una forma apropiada, la producción de IgE, gracias a la disminución de IL-5, en los fenómenos alérgicos (rinitis alérgica estacionaria, por ejemplo). Este tratamiento, se instaurará, con objeto de obtener una remisión y su mantenimiento.

Ejemplo 11 Forma para inyectar

Se realiza una forma inyectable a base de 1 g de dimetilazobisformamida y agua destilada apirógena, aditivada con NaCl.

Estas formas, son para administrar, por ejemplo, en las fases de crecimientos agudos de producción de autoanticuerpos (enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso, diebetes autoinmune, tiroiditis autoinmune, etc...), al mismo tiempo que se guarda el espíritu de que se observe habitualmente una mejora, después de un transcurso de tiempo de seis a ocho semanas.

Ejemplo 12 Crema o ungüento

Se realiza una crema o un ungüento, con la 1,1'-azobis-[cloroformamidina](cloroazodina) y, como excipiente, especialmente, glicerina, aceite de parafina y vaselina.

Esta crema, puede aplicarse localmente, a título de inmunodilatador, en la esclerodermia.

Ejemplo 13

Pueden también preverse sistemas de distribución transdérmica de dimetilazobisformamida.

Estos sistemas, pueden aplicarse de tal forma que se obtenga una disminución sostenida de linfocitos circulando, en pacientes que sufren de asma difícil de controlar.

Este tratamiento, puede combinarse con el uso de tratamientos convencionales.

Ejemplo 14 Comprimidos a administrar por vía oral Composición de un comprimido

100 mg de ADA

10 mg de monoestearato de glicerina

10 mg de dióxido de silicio precipitado

5 mg de estearato de magnesio.

Se procede a introducir esta composición, de una forma corriente, en una máquina de comprimir.

En el ámbito de un tratamiento de, por ejemplo, un cáncer, puede preverse una administración de IL-2 al paciente. El contenido sobreabundante de IL-2, en el cuerpo del paciente de esta forma tratado, tiene por efecto, el de estimular una sobreproducción, por las células de éste último, de otras citocinas y, especialmente la IL-5, lo cual conlleva efectos secundarios, tales como el pénfigo, la tiroiditis, la poliartritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la esclerodermia, la hipereosinofilia, etc...

Puede por consiguiente preverse, conjuntamente con la administración de IL-2, la toma regular de comprimidos de ADA, para contrarrestar estos efectos secundarios.

La administración de IL-2 y de ADA, puede hacerse simultáneamente, separadamente, o de una forma escalonada en el tiempo.

Claims

1. Procedimiento de inhibición in vitro de producción de citocinas, mediante células, especialmente, animales o humanas, y de su secreción, el cual comprende la aplicación, sobre las células, de por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la fórmula

14

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en la cual, A, representa un grupo carboxílico o un grupo 15, B representa un grupo carboxílico de la fórmula 16, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, son idénticas ó diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo hidroxi, R^{1} y R^{2}, pueden estar unidas, conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, y R^{3} y R^{4}, pueden estar unidas conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, X^{1} y X^{2}, son idénticas o diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de oxígeno o un grupo NR^{5}, en el cual, R^{5} es un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo nitro, y en el cual, cuando dos de los grupos NR^{5} se encuentran simultáneamente presentes, cada R^{5}, puede ser idéntico o diferente del otro, así como de sus sales, ésteres e isómeros.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una inhibición de producción y de secreción de interleucinas.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una inhibición de producción y de secreción de una citocina elegida de entre el grupo que comprende el interferón-\gamma y el factor de necrosis tumoral \alpha.

4. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que, R_{1} a R_{5}, representan, cada una de ellas, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, que comporta de 1 a 6 átomos de carbono.

5. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que, el derivado azoico, se elige de entre el grupo que comprende a derivados de azobisformamidina, tales como la 1,1'-azobisformamidina, 1,1-azobisnitroformamidina, la 2,2'-azobismetilformamidina, la 1,1'-azobisfluoroformamidina, la 1-monocloroazobisformamidina, y la azobis-(cloroformamidina), los derivados de azobisformamida, tales como 1,1'-azobisformamida y dimetil-azobisformamida, la 1,1'-(azobidicarbonil)-dipiperidina, la 1,1'-azodicarbonil)-dimorfolina, el ácido azodihidroxámico y sus sales, y el ácido azodicarboxílico y sus sales.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una aplicación del derivado azoico sobre las células, a una dosis que no induzca una apóptosis de éstas.

7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una aplicación del derivado azoico sobre las células, a una concentración micromolar de 0,4 a 200.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende una aplicación del derivado azoico sobre las células, a una concentración micromolar de 2 a 20, de una forma preferente, de 2 a 10.

9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende la citada aplicación de una composición que comporta por lo menos uno de los citados derivados azoicos y un soporte apropiado.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende la citada aplicación, sobre una de las células aisladas de macroorganismos o de células de microorganismos.

11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende la citada aplicación sobre las células de un órgano o de tejido multicelular extraído de un cuerpo humanos o animal.

12. Utilización de por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la fórmula

17

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en la cual, A, representa un grupo carboxílico o un grupo 18, B representa un grupo carboxílico de la fórmula 19, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, son idénticas ó diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo hidroxi, R^{1} y R^{2}, pueden estar unidas, conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, y R^{3} y R^{4}, pueden estar unidas conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, X^{1} y X^{2}, son idénticas o diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de oxígeno o un grupo NR^{5}, en el cual, R^{5} es un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo nitro, y en el cual, cuando dos de los grupos NR^{5} se encuentran simultáneamente presentes, cada R^{5}, puede ser idéntico o diferente de los otros, así como de sus sales, ésteres e isómeros, para la fabricación de medicamentos a aplicar en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, resultante de una producción celular patológica de citocinas, con la excepción de enfermedades víricas.

13. Utilización, según la reivindicación 12, caracterizada por el hecho de que, el medicamento de esta forma fabricado, contiene una cantidad terapéuticamente eficaz, de por lo menos uno de los citados derivados azoicos o de sus sales, ésteres o isómeros, así como un soporte farmacéuticamente apropiado.

14. Derivados azoicos que responden a la fórmula de reivindicación 1, en el cual por lo menos uno de los grupos A y B, representan un grupo carboxilo, así como sus sales, ésteres e isómeros, farmacéuticamente aceptables, para su aplicación en calidad de substancias terapéuticamente activas, a aplicar en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, resultante de una producción celular patológica de citocinas.

15. Derivados azoicos que responden a la fórmula general de la reivindicación 1, en la cual, el grupo A, representa el grupo 20, uno de los radicales R^{1} y R^{2}, representa un grupo hidroxi y, el otro, un átomo de hidrógeno, y en la cual, el grupo B, puede representar, simultáneamente, el grupo 21, uno de los radicales R^{3} y R^{4}, pueden representar un grupo hidroxi y, el otro, un átomo de hidrógeno, así como sus sales, ésteres, e isómeros farmacéuticamente aceptables, para su aplicación en calidad de substancias terapéuticamente activas, a aplicar en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, resultante de una producción celular patológica de citocinas.

16. Derivados azoicos que responden a la fórmula de la reivindicación 1, en la cual, X^{1} y X^{2}, representan oxígeno y, NR^{1}R^{2}, así como NR^{3}R^{4}, representan, cada una, un heterociclo hexagonal, el cual contiene, como suplemento, un átomo de oxígeno en posición 4, así como sus sales, ésteres, e isómeros farmacéuticamente aceptables, para su aplicación en calidad de substancias terapéuticamente activas, a aplicar en el tratamiento o la profilaxis de afecciones humanas o animales, resultante de una producción celular patológica de citocinas.

17. Producto que contiene por lo menos uno de los derivados azoicos que responden a la fórmula

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22

en la cual, A, representa un grupo carboxílico o un grupo 23, B representa un grupo carboxílico de la fórmula 24, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, son idénticas ó diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo hidroxi, R^{1} y R^{2}, pueden estar unidas, conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, y R^{3} y R^{4}, pueden estar unidas conjuntamente, para formar un núcleo heterocíclico con su átomo de nitrógeno contiguo, X^{1} y X^{2}, son idénticas o diferentes, y representan, cada una de ellas, de una forma independiente, un átomo de oxígeno o un grupo NR^{5}, en el cual, R^{5} es un átomo de hidrógeno o de halógeno, un radical de hidrocarburo alifático o aromático, eventualmente sustituido, o un grupo nitro, y en el cual, cuando dos de los grupos NR^{5} se encuentran simultáneamente presentes, cada R^{5}, puede ser idéntico o diferente del otro, así como sus sales, ésteres e isómeros, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende, además, por lo menos una citocina, como producto de combinación, para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo, en la terapia y la profilaxis de afecciones humanas o animales resultantes de una producción celular patológica de por lo menos una citocina, diferente de la citada por lo menos una citocina contenida en el producto de combinación, o en la terapia o la profilaxis de afecciones humanas o animales, que tienen por efecto secundario, una producción celular patológica de por lo menos una citocina, diferente de la citada por lo menos una citocina contenida en el producto de combinación.