ES2241653T3 - Utilizacion de un vector adenoviral de replicacion deficiente para la fabricacion de un medicamento destinado a estimular la respuesta inmune de celulas t cd8+ antigeno. - Google Patents

Abstract

Uso de un vector adenovírico deficiente en su replicación que codifica un antígeno o un epítopo de células T CD8+ de dicho antígeno, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un individuo en el que una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno tiene un beneficio terapéutico o profiláctico, en donde el medicamento es para administrarlo a un individuo tal para estimular la respuesta inmune de células T CD8+ del individuo contra el antígeno a continuación de la administración previa de una composición cebadora no adenovírica que comprende dicho antígeno o epítopo o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno o epítopo.

Description

Utilización de un vector adenoviral de replicación deficiente para la fabricación de un medicamento destinado a estimular la respuesta inmune de células T CD8+ antígeno.

La presente invención se refiere a medicamentos para su uso en la generación de una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno. Más particularmente, la presente invención se refiere a regímenes de inmunización de "cebado y estímulo", en los cuales la respuesta inmune inducida por la administración de una composición cebadora es impulsada por la administración de una composición de impulso. La presente invención se basa en la demostración experimental de los inventores de que puede conseguirse una estimulación efectiva usando vectores de adenovirus defectuosos en su replicación, a continuación del cebado con una composición cebadora no adenovírica.

Un componente protector principal de la respuesta inmune frente a un cierto número de patógenos está mediado por los linfocitos T del tipo CD8+, también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CTL). Una función importante de las células CD8+ es la secreción de interferón gamma (IFN-\gamma), y esto proporciona una medida de la respuesta inmune de células T CD8+.

La respuesta de la células T CD8+ es importante en la protección frente a un cierto número de parásitos, incluyendo los parásitos protozoarios tales como Toxoplasma y Trypanosoma, Plasmodium falcifarum (y en los ratones P. berghei), los virus tales como el VIH, el herpes simplex, el herpes zoster, el VHB, el VHC, el de la gripe, el VEB, el del sarampión, el del dengue, y el HTLV-1, bacterias tales como Mycobacterium tuberculosis y Listeria sp., y varios cánceres, tales como el melanoma y el carcinoma renal.

La infección de ratones con P. berghei proporciona un buen modelo para la malaria de P. falcifarum en humanos, escogido por los inventores para ejemplificar la capacidad de la presente invención para proporcionar potentes respuestas inmunes de células T CD8+ contra el antígeno. La malaria es un problema de salud principal en el mundo, y se han dirigido importantes esfuerzos para hallar composiciones inmunes efectivas para la vacunación.

Con objeto de proteger frente a la etapa pre-eritrocítica de la malaria de P. falcifarum, una composición inmunogénica debe inducir una potente respuesta de células T CD8+. En general, la vacunas vivas atenuadas, capaces de producir una infección de vida corta que es inofensiva en un individuo sano, son efectivas para inducir respuestas de células T. Se ha observado que los esporozoitos de P. falcifarum irradiados, los cuales pueden infectar hepatocitos, pero no progresan a una etapa de infección en sangre, protegen tanto a los ratones como a los hombres frente a la malaria mediante la inducción de respuestas de células T contra antígenos pre-eritrocíticos (Nardin y Nussenzweig, Annu. Rev. Immunol. 11:687-727 (1993)). No obstante, en el hombre, esto requiere múltiples inmunizaciones a lo largo de un prolongado período de tiempo, y mientras que estas inmunizaciones experimentales has proporcionado valiosa información, esta estrategia no es útil para el desarrollo de una vacuna.

Las vacunas de subunidades de proteína recombinante elicitan respuestas tumorales, pero respuestas pobres de células T CD8+ (Shirmbeck et al., Vaccine 13(9):857-865 (1995)). Las vacunas de ADN se ha mostrado que elicitan ambas respuestas, humorales y celulares con la proteína CD de P. yoelii (Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(21):9866-9870 (1994)). Sin embargo, los ratones inmunizados con una vacuna de ADN que expresaba el gen de CS de P. berghei tan sólo mostraron una respuesta débil de células T CD8+ contra el epítopo pb9 de células T CD8+ (Romero et al., Nature 341(6290):323-326 (1989)) y no resultaron protegidos frente a un desafío con esporozoitos infecciosos, incluso después de repetidas inmunizaciones (Schneider et al., Nat. Med. 4(4):397-402 (1998)) Las partículas parecidas al virus Ty, que consisten en una proteína recombinante ensamblada en una partícula de 30 nm, inducen respuestas de células T CD8+ más intensas, pero no protegen frente a la infección (Gilbert et al., Nat. Biotechnol. 15(12):1280-1284 (1997)).

Los virus recombinantes también pueden actuar como vacunas. El virus Vaccinia modificado Ankara (MVA) no se replica en células humanas y es un virus muy seguro para usar como una vacuna (Mayr et al., Zentralbl. Bakteriol. 167(5-6):375-390 (1978)); Sutter y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10847-10851 (1992); Sutter et al., Vaccine 12(11):1032-1040 (1994)). La expresión recombinante de MVA que expresan la CS de P. berghei se ha ensayado también en ratones, resultando en niveles similares de lisis específica del péptido en un ensayo de citotoxicidad que en ratones inmunizados con VLP Ty (Gilbert et al., Biol. Chem. 380(3):299-303 (1999)). De nuevo, estos ratones no se protegieron contra el desafío infeccioso. Sin embargo, a pesar del hecho de que ninguna de las vacunas de ADN, VLP Ty o MVA, usada sola puede proteger frente a la infección de malaria, usando ADN o VLP Ty para cebar una respuesta de células T y MVA para estimularla, resulta en un números enormemente incrementados de células T CD8+ que secretan IFN-\gamma, y en una protección completa frente a la infección cuando el MVA se administra de forma intravenosa (Schneider et al., Nat. Med. 4(4):397-402 (1998), WO-98/56.919).

En el Int. J. Cancer vol. 71., 300-307, 1997, se descubre una inmunización homóloga del tipo cebado-estímulo usando un vector adenovírico.

La presente invención emplea un adenovirus deficiente en su replicación que, como muestran los experimentos descritos más abajo, se ha hallado que es un medio efectivo para proporcionar un estimulo a la respuesta inmune de células T CD8+ cebadas con una composición cebadora no adenovírica.

Un adenovirus deficiente en su replicación y derivado del serotipo 5 humano ha sido desarrollado como vector viral vivo por Graham y colaboradores (Graham y Prevec, Mol. Biotechnol. 3(3):207-220 (1995); Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(19):8802-8806 (1994)). Los adenovirus son virus sin cubierta que contienen un genoma de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 3000 p.b. Los virus recombinantes pueden construirse mediante recombinación in vitro entre un plásmido de genoma de adenovirus y un vector lanzadera que contiene el gen de interés junto con un promotor eucariota fuerte, en una línea celular permisiva que permite la replicación viral. Pueden obtenerse títulos virales elevados a partir de la línea celular permisiva, pero los virus resultantes, aunque son capaces de infectar un amplio rango de tipos de células, no se replican en ninguna célula distinta de la línea permisiva, y, por tanto, son un sistema seguro de suministro de antígenos. Se ha observado que los adenovirus recombinantes elicitan respuestas inmunes protectoras frente a un cierto número de antígenos, incluyendo la proteína NS1 del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (Jacobs et al., J. Virol. 66(4):2086-2095 (1992)) y la nucleoproteína del virus del sarampión (Fooks et al., Virology 210(2):456-465 (1995)). Además, una única dosis de adenovirus recombinante resultó en una disminución del 93% en el nivel de ARNr del parásito hepático de P. yoeli en ratones, y una protección del 40%, que se mostró que estaba mediada por células T CD8+ (Rodrigues et al., J. Immunol. 158:1268-1274
(1997)).

De forma remarcable, el trabajo experimental descrito más abajo demuestra que el uso de realizaciones de la presente invención permite que los adenovirus defectuosos en su replicación expresen un antígeno (específicamente ejemplificado con el gen CS de Plasmodium berghei) para estimular una respuesta inmune de células T CD8+ cebada mediante una vacuna de ADN, VLP Ty, o el virus Vaccinia modificado Ankara recombinante (MVA). Se halló que los adenovirus defectuosos en su replicación inducían una respuesta de células T CD8+ después de la inmunización intradérmica o intramuscular.

Ambos, los adenovirus recombinantes y deficientes en su replicación y los MVA recombinantes son vacunas que son seguras para su uso en humanos. De forma ventajosa, los inventores han hallado que puede emplearse un régimen de vacunación que use inmunización intradérmica tanto para el cebado como para el estímulo, es un régimen de inmunización general apropiado para inducir células T CD8+, por ejemplo, en humanos.

La presente invención en varios aspectos y realizaciones emplea el uso de un vector adenovirus deficiente en su replicación, que codifica un antígeno, en la fabricación de un medicamento para estimular la respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno, cebada mediante la administración previa del antígeno o ácido nucleico que codifica el antígeno.

Un aspecto general de la presente invención proporciona el uso de un vector adenovirus deficiente en su replicación en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno.

Un aspecto de la presente invención proporciona el uso de un vector adenovirus deficiente en su replicación en la fabricación de un medicamento para su uso en un procedimiento para estimular una respuesta inmune de células T CD8+ contra un antígeno en un individuo, incluyendo el vector adenovírico deficiente en su replicación un ácido nucleico que codifica el antígeno, unido operativamente a secuencias reguladoras para la producción de antígeno en el individuo mediante su expresión a partir del ácido nucleico, mediante lo cual se estimula una respuesta inmune, previamente cebada, de células T CD8+ contra el antígeno.

En la presente invención se ceba una respuesta inmune contra un antígeno mediante inmunización con una composición no adenovírica.

Un aspecto adicional proporciona el uso de un vector adenovirus deficiente en su replicación, tal como se descubre, en la fabricación de un medicamento para su administración a un mamífero a continuación de la administración previa de una composición cebadora que comprende el antígeno.

La composición cebadora podría comprender un vector viral, distinto del adenovirus, tal como un vector del virus Vaccinia, tal como una cepa deficiente en su replicación, tal como el virus Ankara modificado (MVA) (Mayr et al., Zentralb. Bakteriol. 167(5-6):375-390 (1978); Sutter y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10847-10851 (1992); Sutter et al., Vaccine 12(11):1032-1040 (1994)), o NYVAC (Tartaglia et al., Virology 118(1):217-232 (1992)), un vector de las viruelas de aves tal como de la viruela aviar o de la viruela del canario, por ejemplo, la cepa conocida como ALVAC (Kanapox, Paoletti et al., Dev. Biol. Stand. (82:65-69 (1994)), o un vector del virus herpes. La composición cebadora podría contener un vector bacteriano recombinante, tal como el BCG o la Salmonella. Una composición cebadora que comprende una virus recombinante de la viruela aviar está entre las realizaciones preferidas para su uso en la presente invención.

La composición de cebado podrían comprender un ADN que codificara el antígeno, tal ADN preferiblemente estaría en forma de un plásmido circular que no es capaz de replicarse en células de mamífero. Cualquier marcador seleccionable no debería ser de resistencia a un antibiótico usado clínicamente, así pues, por ejemplo, se prefiere la resistencia a la kanamicina a la ampicilina. La expresión del antígeno debería estar dirigida por un promotor que es activo en células de mamífero, por ejemplo, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV IE).

La composición cebadora podría ser una VLP Ty recombinante. Estas son partículas proteicas que consisten en una única especie de proteína procedente del retrotransposón Ty1 de S. cerevisiae, la cual se ensambla espontáneamente en partículas. Las VLP Ty podrían producirse fusionando la secuencia codificante del epítopo requerido o de un antígeno al extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína TyA, y transformando S. cerevisiae con un vector que incluya la secuencia codificante para la expresión de la proteína de fusión, la cual se ensambla a continuación en partículas en el citoplasma de la levadura, a partir de la que podría purificarse. La naturaleza en partículas de las VLP Ty les permite ser captadas por células que presenten el antígeno y cebar una respuesta de células T CD8+ contra los epítopos contenidos sobre sí.

Otras composiciones cebadoras apropiadas incluyen los péptido alargados con lípidos, las proteínas de fusión, las composiciones de adyuvante, y demás.

La administración de una composición cebadora podría seguirse con la estimulación con composición de primera y segundo estímulo, siendo las composiciones primera y segunda diferentes entre ellas, por ejemplo, tal como se ilustra más abajo. Podrían emplearse composición que estimulen aún más sin apartarse de la presente invención. En una realización, un régimen de triple inmunización emplea ADN, a continuación adenovirus como una primera composición estimulante, y a continuación MVA como una segunda composición estimulante, seguida opcionalmente por un (tercera) composición estimulante adicional o por la administración estimulante subsiguiente de uno u otro, o ambos del mismo o diferentes vectores. Otra opción es el ADN, a continuación MVA, a continuación Ad, seguidos opcionalmente por la administración estimulante adicional de uno u otro o ambos de los mismos o diferentes
vectores.

El antígeno a incluir en las respectivas composiciones de cebado y estímulo (aunque se empleen muchas composiciones de estímulo) no tienen porque ser idénticos, pero deberían compartir al menos un epítopo de célula T CD8+. El antígeno podría corresponder a un antígeno completo en un patógeno o célula diana, o a un fragmento del mismo. Podrían emplearse epítopos de péptidos o cadenas artificiales de epítopos, de forma más eficiente eliminando mediante corte las secuencias proteicas innecesarias en el antígeno y codificando secuencias en el vector o vectores. Podrían incluirse uno o más epítopos adicionales, por ejemplo, epítopos que son reconocidos por las células auxiliares T, especialmente los epítopos reconocidos en individuos de diferentes tipos de HLA (tales como los epítopos del tétanos).

Dentro del vector adenovírico deficiente en su replicación, las secuencias reguladoras para la expresión del antígeno codificado incluirán un promotor. Por "promotor" se quiere indicar una secuencia de nucleótidos a partir de la cual podría iniciarse la transcripción de ADN operativamente unido cadena abajo (es decir, en la dirección 3' en la hebra con sentido del ADN de doble hebra). "Operativamente unido" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, convenientemente ubicado y orientado para que su transcripción se inicie a partir del promotor. El ADN operativamente unido a un promotor está "bajo regulación del inicio de transcripción" del promotor. Otras secuencias reguladoras incluyen los fragmentos terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias potenciadoras, los genes marcadores, y otras secuencias que podrían incluirse según sea apropiado, de acuerdo con el conocimiento y práctica de la persona ordinaria especialista en la técnica: ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, en la mutagénesis, en la secuenciación, en la introducción de ADN en células, y en la expresión de genes, y en el análisis de proteínas, se describen en detalle en "Current Protocols in Molecular Biology", editores Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1994.

Los promotores apropiados para su uso en aspectos y realizaciones de la presente invención incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV IE), con o sin el intrón A, y cualquier otro promotor que sea activo en células de mamífero.

Una o ambas de las composiciones cebadoras y estimulante podría incluir un adyuvante, tal como un factor estimulante de colonias de macrófago granulocito (GM-CSF) o el ácido nucleico que lo codifica.

La administración de la composición estimulante tiene lugar de forma general aproximadamente de 10 días a 4 semanas después de la administración de la composición cebadora, preferiblemente alrededor de 2-3 semanas.

Preferiblemente, la administración de la composición cebadora, de la composición de estímulo, o de ambas composiciones cebadora y estimulante, es la inmunización intradérmica o intramuscular.

La administración intradérmica de vacunas de adenovirus o MVA podría conseguirse mediante el uso de una aguja para inyectar una suspensión del virus. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar una suspensión de virus (por ejemplo, usando un Biojector™) o un polvo liofilizado que contenga la vacuna (por ejemplo, de acuerdo con las técnicas y productos del Powderject), proporcionando los medios para fabricar dosis preparadas individualmente que no necesitan almacenamiento en frío. Esto sería una gran ventaja para una vacuna que se necesita en áreas rurales de África.

Los adenovirus y los MVA son virus con un excelente registro de seguridad en inmunizaciones humanas. La generación de virus recombinantes puede conseguirse de forma simple, y pueden manufacturarse de forma reproducible en grandes cantidades. Por tanto, la administración intradérmica de adenovirus recombinantes deficientes en su replicación, seguida por el MVA recombinante, es muy conveniente para la vacunación profiláctica o terapéutica de humanos frente a enfermedades que pueden controlarse mediante una respuesta de células T CD8+.

El individuo podría tener una enfermedad o trastorno tal que el suministro del antígeno, y la generación de una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno, sea beneficioso o tenga un efecto terapéuticamente beneficioso.

Lo más probable, es que la administración tenga el objetivo profiláctico de generar una respuesta inmune contra un patógeno o enfermedad antes de la infección o del desarrollo de síntomas.

Las enfermedades y trastornos que podrían tratarse o prevenirse de acuerdo con la presente invención incluye cualquiera de las ya mencionadas más arriba y otras en las cuales la respuesta inmune de células T CD8+ podría jugar un papel protector o terapéutico.

Los componentes a administrarse de acuerdo con la presente invención podrían formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones podrían comprender un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticas aceptables, bien conocidos por los especialistas en la técnica. Tales materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material podría depender de la ruta de administración, por ejemplo, las rutas intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

Tal como se ha destacado, la administración es preferiblemente intradérmica, subcutánea o intramuscular.

Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como el agua, el petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral, o aceite sintético. Podrían incluirse la solución salina fisiológica, la dextrosa y otras soluciones de sacáridos, o glicoles tales como el etilenglicol, el propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o la inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, la cual esta libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad apropiados. Aquéllos con formación relevante en la técnica están perfectamente capacitados para preparar soluciones apropiadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro Sódico, la Inyección de Ringer, la Inyección de Ringer con Lactato. Según se requiera, podrían añadirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Podría emplearse una formulación de liberación lenta.

A continuación de la producción de partículas de adenovirus deficientes en su replicación, y de la formulación opcional de tales partículas en composiciones, las partículas podrían administrarse a un individuo, particularmente humano u otro primate.

La administración lo es preferiblemente en una "cantidad profilácticamente efectiva" o en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (como pudiera ser el caso, aunque la profilaxis podría considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar un beneficio al individuo. La cantidad realmente administrada, y la velocidad y la secuencia temporal de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., se hallan dentro de la responsabilidad de los facultativos generalistas y otros doctores médicos, o en un contexto veterinario, un veterinario, y típicamente tiene en consideración el trastorno a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de administración, el procedimiento de administración, y otros factores conocidos por los facultativos. Pueden hallarse ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados más arriba en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16ª edición, Editor Osol, A., 1980.

En un régimen preferido, el ADN se administra (preferiblemente de forma intramuscular) en una dosis de 0,5 mg/inyección, seguido por adenovirus (preferiblemente de forma intramuscular o intradérmica) en una dosis de 5\times10^{7} - - 5\times10^{8} partículas víricas/inyección.

Una composición podría administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultáneamente o de forma secuencial, dependiendo de la condición que deba tratarse.

El suministro a un mamífero no humano no tiene porque tener un propósito terapéutico, pero podría ser para uso en un contexto experimental, por ejemplo, en investigaciones de mecanismos de respuesta inmune contra un antígeno de interés, por ejemplo, la protección frente los cánceres, la malaria, y otros patógenos, y demás.

Otros aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes a aquéllos con una formación ordinaria en la técnica, a la vista de los descubrimientos anteriores y de las siguientes ejemplificaciones experimentales, incluidas a modo de ilustración y no de limitación, y con referencia a las figuras adjuntas.

La presente invención se restringe en su ámbito a el sujeto que es asunto de la Reivindicación 1. Los temas que se hallan fuera del ámbito de esta reivindicación tienen el propósito de comparación.

La Figura 1 muestra los resultados de experimentos que muestran la secreción de IFN-\gamma específica para péptido por parte de células T cebadas con una única inmunización de Ad-PbCS. Se inmunizaron grupos de tres ratones, a través de las rutas mostradas, usando 10^{7} pfu. Transcurridas dos semanas, se realizaron por duplicado ensayos ELISPOT con esplenocitos para detectar células T específicas del pb9 que secretaran IFN-\gamma. La gráfica muestra las células formadoras de manchas (SFC) por millón de esplenocitos para cada ruta de administración.

La Figura 2 muestra los resultados de inmunizaciones de cebado/estímulo. Se inmunizaron grupos de 3 ratones en el día 0 con la primera vacuna mostrada (D = pSG2.PbCS, A = AD-PbCS, M = MVA-PbCS), y el día 14 con la segunda vacuna. El ADN se inyectó i.m., el adenovirus y el MVA i.d. Se realizaron ELISPOT con esplenocitos aislados el día 28. La gráfica muestra las SFC por millón de esplenocitos para cada régimen de inmunización cebado/estímulo.

La Figura 3 muestra los resultados de una combinación triple de inmunizaciones, y la comparación con la combinación doble de inmunizaciones. Se inmunizaron grupos de 3 ratones a intervalos de 10 días con las vacunas mostradas (D = pSG2.PbCS, A = AD-PbCS, M = MVA-PbCS), con la primera vacuna de las combinaciones dobles administrada el mismo día que la segunda vacuna de las combinaciones triples. Se realizaron ensayos ELISPOT por duplicado con esplenocitos 10 días después de la última inmunización. La gráfica muestra las SFC por millón de esplenocitos para cada régimen de inmunización.

Ejemplificación experimental

Los inventores construyeron un adenovirus recombinante deficiente para su replicación que expresara el gen CS de P. berghei (AD-PbCS), y ensayaron las capacidades de este virus para inducir respuestas de células T CD8+ en ratones, bien solo o en combinación con otro tipo de vacunas.

Cuando se usó como una única inmunización, se generaron niveles elevados de células T CD8+ específicas para el antígeno. El cebado con adenovirus seguidor por estimulación con MVA resultó en la protección completa.

De forma remarcable, el adenovirus fue capaz de estimular sustancialmente una respuesta cebada mediante ADN, VLP Ty, o MVA.

Materiales y procedimientos Vacuna de ADN

La vacuna de ADN pSG2.PbCS consiste en el promotor del CMV con un intrón A, dirigiendo la expresión de la proteína CS de P. berghei, con la secuencia poli A de la hormona del crecimiento bovina. El plásmido es resistente a la kanamicina, es incapaz de replicarse en células eucariotas. Los plásmidos se prepararon usando columnas Qiagen, y se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y libre de endotoxina.

Construcción de adenovirus recombinantes deficientes en su replicación

El promotor del CMV con el intrón A, el gen de la proteína CS de P. berghei, y la secuencia poli A de la hormona del crecimiento bovina procedente del pSG2.PbCSP se ligaron en el sitio de clonación múltiple del vector lanzadera de adenovirus p\DeltaE1sp1A (Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(19):8802-8806 (1994)). Este vector puede usarse para construir Adenovirus 5 recombinantes con supresiones en E1. El vector lanzadera recombinante se usó para transfectar la línea celular permisiva 293 junto con el plásmido pJM17 de genoma de adenovirus (Graham y Prevec, Mol. Biotechnol. 3(3):207-220 (1995)). Los virus procedentes de células transfectadas se purificaron clonalmente mediante tres diluciones limitantes sucesivas en células 293, y la expresión de la CS de P. berghei en las células infectadas con el virus aislado se confirmó mediante inmunofluorescencia. Se prepararon grandes cantidades de virus a partir de células 293 infectadas, y se purificaron mediante extracción con Arklone (Graham y Prevec, Mol. Biotechnol. 3(3):207-220 (1995)) antes de la inmunización.

VLP Ty

Se prepararon VLP Ty recombinantes, que expresaban el epítopo pb9 de la CS de P. berghei, SYIPSAEKI, tal como se ha descrito (Gilbert et al., Nat. Biotechnol. 15(12):1280-1284 (1997)) y se suspendieron en PBS.

MVA recombinante

Se preparó MVA que expresaba la CS de P. berghei mediante recombinación in vitro entre un vector lanzadera que contenía el gen de la CS dirigido por el promotor P7.5 de Vaccinia y el virus MVA en fibroblastos embrionarios primarios de pollo (Sutter et al., Vaccine 12(11):1032-1040 (1994)). El recombinante, que también expresa la \beta-galactosidasa de E. coli, se purificó repetidamente sobre placas, y la expresión del gen recombinante se confirmó mediante inmunofluorescencia. El virus para la inmunización se purificó mediante ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa y se suspendió en PBS libre de endotoxina.

Inmunizaciones

Se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 4-6 semanas de edad, bajo anestesia, tal como se describió para los experimentos individuales. Las inmunizaciones con ADN intramusculares usaron 50 \mug de ADN en cada músculo tibialis. Los MVA y adenovirus (10^{6} y 10^{7} pfu por dosis, respectivamente) se inyectaron intradérmicamente en el pabellón de la oreja. La VLP Ty (100 \mug por dosis) se inyectaron intradérmicamente en la planta del pie o intravenosamente en la vena caudal lateral.

Ensayos ELISPOT

El número de células T específicas para el pb9, que secretaban IFN-\gamma en preparaciones recientes de esplenocitos se determinó, como se ha descrito previamente (Schneider et al., Nat. Med. 4(4):397-402 (1998)), recubriendo placas de nitrocelulosa de 96 pocillos con el anticuerpo anti-IFN-\gamma de ratón (clon R4 procedente de ETCC), lavando con PBS, y bloqueando subsiguientemente con medio completo que contenía un 10% de FCS. Los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados se resuspendieron a 1-2 \times10^{7} células/ml y se colocaron por duplicado en los pocillos recubiertos, y se diluyeron en serie. El péptido pb9 restringido con H2-K^{d} (SYIPSAEKI) (Romero) se añadió a los pocillos y un péptido irrelevante a los pocillos de control. Después de su incubación durante la noche, se lavaron los pocillos, y se añadió un segundo anticuerpo anti-IFN-\gamma biotinilado (clon Pharmingen) a los pocillos. Se lavaron de nuevo los pocillos y se añadió estreptoavidina-fosfatasa alcalina. Después de lavados adicionales, se revelaron los puntos mediante la adición de un sustrato de fosfatasa alcalina. La reacción se detuvo lavando los pocillos, y los puntos se contaron bajo un estereomicroscopio.

Desafío con P. berghei

Se obtuvieron esporozoitos de P. berghei (clon 1 de la cepa ANKA) a partir de mosquitos Anopheles stephensi hembras criados en laboratorio, mantenidos a 18ºC durante 20-25 días después de alimentarse de ratones infectados. Se recuperaron las glándulas salivares de estos mosquitos mediante disección y se colocaron en un homogeneizador de tejidos con RPMI 1640 (Sigma) para liberar los esporozoitos, los cuales se contaron a continuación usando un hemocitómetro. Se desafiaron los ratones mediante la inyección de 2000 esporozoitos en la vena caudal. La infección se determinó mediante la presencia de formas anilladas en manchas de sangre teñidas con Giemsa, tomadas 7 y 9 días después del desafío. Si se observaba parasitemia en la etapa de la sangre en los dos momentos, se sacrificaban los ratones. Los animales supervivientes se observaron durante al menos otras tres semanas adicionales para el desarrollo de síntomas de malaria.

Resultados Inmunogenicidad de las inmunizaciones únicas con adenovirus usando diferentes rutas de administración

Inicialmente, se ensayó el efecto de la ruta de administración sobre la capacidad de Ad-PbCS de inducir células T secretoras de IFN-\gamma específicas del pb9.

Rodrigues et al., J. Immunol. 158(3):1268-1274 (1997) había hallado que se inducían niveles elevados de células T CD8+ específicas de malaria después de inmunizaciones i.m. y s.c., pero no i.v., i.p. o i.n. Los inventores no ensayaron las i.v. o i.p., puesto que estas no son rutas apropiadas para una vacuna profiláctica a usar en humanos, pero incluyeron la i.d. y los grupos de "pintado de genes" - - -administración simple de adenovirus recombinantes sobre la piel (conocida como pintado de genes)- - - que previamente se había visto que eran capaces de inducir una respuesta inmune contra el antígeno expresado por el virus (Tang et al., Nature 388(6644):729-730 (1997)).

Los grupos de ratones recibieron una única inmunización de 10^{7} pfu de Ad-PbCS y se ensayaron los esplenocitos en busca de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido, después de 14 días.

Los números de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido (FIGURA 1) detectadas después de la inmunización i.m. o i.d. fueron algo superiores a los detectados después de una única inmunización con ADN i.m., y ligeramente inferiores a los detectados después de la MVA i.m. (Gilbert et al., Biol. Chem. 380(3):299-303 (1999)). La inmunización intranasal o s.c. produjo números muy bajos de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido, y no pudo detectarse ninguna en el grupo "pintado de genes". La inmunización intradérmica se usó para todos los experimentos subsiguientes.

Inmunogenicidad de las diferentes inmunización de cebado/impulso

La Figura 2 muestra los números de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido detectadas en los bazos de ratones inmunizados que recibieron una inmunización de cebado en el día 0 y una inmunización de estímulo el día 14.

Usando la misma vacuna para cebar y estimular resultó en un incremento en células T CD8+ específicas, pero se observó un incremento mucho mayor después de la estimulación heteróloga. El ADN no estimula una respuesta existente. Sin embargo, la combinación de cebado con adenovirus y estimulación con MVA resultó en números extremadamente elevados de células T CD8+ específicas para el péptido. Además de ser capaz de cebar una respuesta que pudiera estimularse hasta niveles tan elevados, el Ad-PbCS fue capaz de estimular una respuesta que se había cebado mediante ADN o MVA.

Inmunogenicidad de las inmunizaciones de combinación triple

El cebado y la estimulación heteróloga son claramente mucho más efectivos que usar la misma vacuna repetidamente. Se emplearon secuencialmente tres vacunas diferentes. La vacunas de ADN no estimulan, por tanto, fueron posibles dos combinaciones, y se emplearon: ADN/Ad/MVA y ADN/MVA/Ad. Se inmunizaron grupos de tres ratones a intervalos de 10 días, y se ensayaron los esplenocitos 10 días después de la inmunización final.

Como en el experimento previo, se detectaron números elevados de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido después de las inmunizaciones con ADN/MVA, Ad/MVA, MVA/Ad y ADN/Ad (Figura 3). Sin embargo, estos números no incrementaron hasta el mismo punto (de tres a diez veces) cuando se administró una tercera inmunización de estímulo heteróloga.

Protección frente al desafío infeccioso

Varias de las combinaciones de cebado/estímulo que empleaban adenovirus, bien como agente cebador o estimulante, habían resultado en números elevados de células T secretoras de IFN-\gamma específicas para el péptido, que podría esperarse protegieran los ratones frente un desafío con esporozoitos de P. berghei. Por tanto, se inmunizaron grupos de ocho a once ratones con un cierto número de diferentes combinaciones heterólogas de cebado/estímulo, y se desafiaron con 2000 esporozoitos infecciosos de P. berghei dos semanas después de la inmunización de estímulo. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

La administración intradérmica de adenovirus seguida por la i.d. de MVA protegió completamente los ratones inmunizados. En los experimentos previos de desafío con P. berghei se halló que el ADN i.m. seguido por MVA i.d. proporcionaba un nivel elevado de protección, pero que la protección completa sólo se conseguía cuando el MVA se administraba intravenosamente (Schneider et al., Nat. Med. 4(4):397-402 (1998)). Sin embargo, usando el cebado con adenovirus y la estimulación con MVA, ambas vacunas podían administrarse intradérmicamente sin pérdida de la protección. El cebado con MVA y la estimulación con adenovirus resultó también en un nivel elevado de protección, mientras que dos inmunizaciones subsiguientes con adenovirus no lo hacían. Los adenovirus también estimularon las respuestas cebadas con ADN o VLP Ty, resultando en niveles de protección comparables a los obtenidos mediante el cebado con ADN y la estimulación i.d. con MVA.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

Claims (8)

1. Uso de un vector adenovírico deficiente en su replicación que codifica un antígeno o un epítopo de células T CD8+ de dicho antígeno, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un individuo en el que una respuesta inmune de células T CD8+ contra el antígeno tiene un beneficio terapéutico o profiláctico, en donde el medicamento es para administrarlo a un individuo tal para estimular la respuesta inmune de células T CD8+ del individuo contra el antígeno a continuación de la administración previa de una composición cebadora no adenovírica que comprende dicho antígeno o epítopo o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno o epítopo.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde la composición de cebado comprende ADN que codifica dicho antígeno o epítopo.

3. Uso según la reivindicación 1, en donde la composición de cebado comprende VLP Ty recombinantes.

4. Uso según la reivindicación 1, en donde la composición de cebado comprende virus Ankara modificado (MVA).

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento es una composición de estímulo a administrar antes de la administración de otra, diferente, estimulante, que comprende dicho antígeno o epítopo.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento es una composición de estímulo a administrar a continuación de la administración de otra, diferente, estimulante, que comprende dicho antígeno o epítopo.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el medicamento es para administración intradérmica.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el medicamento es para administración intramuscular.