ES2241665T3 - Sistema de produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende: (a) transformar la línea germinal de un insecto con un sistema de expresión basado en un transposón, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto; (b) criar el insecto para que produzca larvas; (c) criar masivamente las larvas; y (d) aislar la proteína de interés a partir de las larvas criadas masivamente.

Description

Sistema de producción de proteínas.

La presente invención se refiere a un sistema para la producción de proteínas en larvas de insectos. Particularmente, la invención abarca la producción de proteínas de interés en larvas de Drosophila y de Moscamed.

Los sistemas de producción de proteínas, en los que se producen los polipéptidos o proteínas de interés en organismos o células recombinantes, constituyen la columna vertebral de la biotecnología comercial. A los primeros sistemas, basados en la expresión bacteriana en huéspedes tales como E. coli, se han unido sistemas basados en huéspedes eucarióticos, en particular cultivos de células de mamífero, células de insectos, tanto cultivos como en forma de insectos enteros, y mamíferos transgénicos, tales como ovejas y cabras.

Los sistemas de cultivo de células procarióticas son fáciles de mantener y fáciles de operar. Sin embargo, las células procarióticas no son capaces de llevar a cabo la modificación post-traduccional de las proteínas eucarióticas. Además, muchas proteínas se encuentran incorrectamente plegadas, requiriendo procedimientos específicos para plegarlas nuevamente, lo que incrementa el coste de producción.

Se han descrito sistemas de cultivo de células eucarióticas en varias aplicaciones. Por ejemplo, las células de mamífero son capaces de llevar a cabo modificaciones post-traduccionales y generalmente producen proteínas que se encuentran correctamente plegadas y son solubles. Entre las desventajas principales de los sistemas de células de mamífero se encuentran la necesidad de disponer de equipos especializados y caros para el cultivo, y el riesgo de infección, que puede llevar a la pérdida de todo el cultivo.

Los sistemas de producción vegetales pueden utilizarse para la expresión de proteínas, y pueden conseguir una producción de alto rendimiento. Sin embargo, los cultivos de plantas transgénicas son difíciles de contener, planteando el riesgo de la contaminación del medio ambiente con material que ha sido manipulado genéticamente.

Las células de insecto también se utilizan para la expresión de polipéptidos. El sistema de expresión más extendido que se ha utilizado en células de insecto se basa en los vectores baculovirus. Un vector de expresión baculovirus se construye sustituyendo el gen de la polihedrina del baculovirus, el cual codifica una proteína estructural importante del baculovirus, por un gen heterólogo, bajo el control del promotor nativo fuerte de la polihedrina. Las células huésped de insecto en cultivo se infectan con el virus recombinante, y la proteína producida de esta manera puede recuperarse de las células mismas, o del medio de cultivo si se utilizan señales de secreción adecuadas. Estos sistemas, sin embargo, también adolecen de problemas asociados con la infección del cultivo y la necesidad de disponer de equipos de cultivo especializados.

Los sistemas de expresión basados en organismos evitan muchas de las desventajas de la infección y son más fáciles de cultivar que los cultivos celulares. Por ejemplo, la utilización de vectores virus, tales como el baculovirus, permiten la infección de insectos enteros, que presentan menos requisitos de condiciones especiales de cría. Los insectos grandes, tales como las mariposas de la seda, proporcionan un rendimiento elevado de proteínas heterólogas. Las proteínas pueden extraerse de los insectos de acuerdo con técnicas de extracción convencionales.

También son conocidas las técnicas basadas en la expresión de proteínas de interés en mamíferos, tales como cabras y ovejas, bajo el control de secuencias de control de la expresión de las proteínas de la leche que permiten la expresión de las mismas en la leche. Dichas técnicas presentan grandes ventajas potenciales, pero son caras debido a la necesidad de aislar los virus, priones y proteínas endógenos del mamífero respecto al producto final. Además, el coste de generar y mantener animales transgénicos grandes es elevado.

Se ha propuesto la utilización de larvas de insecto, aquéllas de Trichoplusa ni, en sistemas de producción de proteínas (Pham et al., 1999, Biotech. Bioeng. 62:175-182). Sin embargo, tales sistemas tan solo se han propuesto en combinación con tecnología de vectores virales basada en los baculovirus.

En el caso de que las proteínas estén destinadas a la utilización dietética o farmacéutica, no resulta deseable la utilización de sistemas bacterianos y/o vectores virales. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un sistema de producción de proteínas que sea robusto y escalable, tal como los sistemas basados en organismos enteros, y libre de vectores basados en virus, así como de funcionamiento económico en un ambiente controlado.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende:

(a) transformar un insecto con un sistema de expresión basado en transposones, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto;

(b) criar el insecto para que produzca larvas;

(c) criar masivamente las larvas; y

(d) aislar la proteína de interés de las larvas criadas masivamente.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención permite la rápida producción de cantidades de miligramos de polipéptidos con fines de investigación, la producción de cantidades de kilogramos de proteínas para aplicaciones clínicas y diagnósticas y potencialmente miles de kilogramos de enzimas industriales a bajo coste, debido a la facilidad con la que pueden cultivarse las larvas de insectos utilizando técnicas de cultivo establecidas.

Las ventajas de los procedimientos de acuerdo con la invención son múltiples. La cría masiva de larvas de insectos resulta posible utilizando la tecnología existente y permite la producción de productos polipéptidos a un coste extremadamente bajo, en un ambiente de producción controlado. Lo anterior facilita la obtención de autorización legal en comparación con organismos enteros, tales como mamíferos, con los que debe demostrarse primero la ausencia de virus y priones, previamente a la obtención de la autorización. Además, el procedimiento de la invención evita las desventajas asociadas con el cultivo de células animales (incluyendo las de insecto), que conlleva el riesgo más elevado de infección, y el riesgo de contaminación viral o con priones en el caso del cultivo de células de mamífero o de los sistemas transgénicos de producción.

El término "proteína" incluye moléculas de polipéptido de una sola cadena, así como complejos de múltiples polipéptidos, en los que los constituyentes polipéptido individuales se encuentran unidos covalente o no covalentemente. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos de longitud, presentando típicamente más de 5, 10 ó 20 aminoácidos.

El sistema de expresión preferido para su utilización en larvas de insectos se basa en transposones. A continuación, se describen transposones adecuados con mayor detalle.

El sistema de expresión utilizado en el procedimiento de la invención comprende unos elementos de control que se encuentran activos en las células de insecto, y particularmente en las larvas de insecto. Muchas secuencias de control de los insectos, incluyendo diversos promotores, se encuentran activos en varias especies diversas. Por lo tanto, no resulta esencial utilizar secuencias derivadas del insecto en cuestión. Pueden utilizarse secuencias activas inducible o constitutivamente.

Preferentemente, las secuencias de control son secuencias inducibles. Un promotor inducible preferido es el promotor de la proteína de choque térmico HSP70, que resulta inducido al incrementar la temperatura a la que se cultivan las larvas, y los sistemas de expresión inducibles con tetraciclina (Heinrich y Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000).

Con el fin de incrementar la producción de proteínas pueden utilizarse múltiples sistemas de expresión. Estos sistemas pueden construirse con dos o más secuencias codificantes presentes en cada sistema, o como múltiples sistemas únicos. En cualquiera de los dos casos, puede utilizarse un cromosoma equilibrador con el fin de favorecer la retención y transmisión a la progenie del sistema de expresión durante el cruzamiento de los insectos.

Una ventaja de la cría de larvas de insecto es que los cultivos pueden sincronizarse, de manera que todas las larvas alcancen el mismo nivel de madurez simultáneamente. Esto puede conseguirse variando la temperatura del cultivo, debido a que las larvas se desarrollan más lentamente a temperaturas más bajas. Por ejemplo, a 18ºC las larvas se desarrollan a la mitad de la velocidad a la que crecen a 25ºC.

Entre las ventajas adicionales de la invención se encuentra el hecho de que la acumulación de proteínas puede dirigirse al cuerpo graso, o las proteínas secretarse en la hemolinfa bajo el control de regiones de control adecuadas y de péptidos de señalización, tales como las secuencias de proteína sérica de las larvas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la estructura del transposón pMiHspGFP/HspCcW, que expresa GFP y el gen white bajo el control del promotor Hsp70.

La figura 2 muestra la estructura del plásmido pMiAct5CGFP, que expresa GFP bajo el control del gen Actin 5C de Drosophila.

La figura 3 muestra la expresión de GFP en moscamed transgénicas y en larvas de moscamed tras el choque térmico.

La figura 4 muestra la expresión constitutiva de GFP en moscas Drosophila.

La figura 5 muestra la expresión constitutiva de GFP en adultos de Drosophila. La fluorescencia observada es dependiente de la dosis génica.

La figura 6 muestra la expresión de GFP en larvas de Drosophila (arriba: transgénicas; abajo: tipo salvaje).

La figura 7 muestra la estructura de un vector de expresión de una proteína en la hemolinfa de las larvas. LspP/L es el promotor del gen de la proteína sérica de larvas (Lsp) de Drosophila o de Moscamed, seguido del líder Lsp 5' no traducido (segmento rayado) y del péptido de señalización Lsp (segmento de color negro). El gen de interés se encuentra fusionado conservando el marco de lectura del péptido líder. HspP y HspT son el promotor y terminador, respectivamente, del gen 70 de choque térmico. CcW es el gen white de moscamed, utilizado como marcador visible dominante para la detección de transformantes. MiL y MiR son los extremos del elemento Minos.

La figura 8 es una secuencia preliminar de un clon de anticuerpo anti-PERV p30 aislado a partir de una biblioteca de anticuerpos de camélido y expresada en larvas de moscamed.

Descripción detallada de la invención

Aunque en general las técnicas indicadas en la presente memoria son bien conocidas en la técnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y a Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4ª edición, John Wiley & Sons, Inc.

Transposones

Los transposones son elementos genéticos que son capaces de "saltar" o transponerse de una posición a otra dentro del genoma de una especie. Se encuentran ampliamente distribuidos entre los animales, incluyendo los insectos.

Los transposones son activos dentro de su especie huésped debido a la actividad de una proteína transposasa codificada por los elementos mismos, o proporcionada por otros medios, tales como mediante inyección de ARNm que codifica la transposasa, mediante la utilización de una segunda secuencia codificante que codifica la transposasa, o mediante la adición de la proteína transposasa misma. Los avances en la comprensión de los mecanismos de transposición han resultado en el desarrollo de herramientas genéticas basadas en los transposones y que pueden utilizarse para la transferencia de genes.

Puede utilizarse cualquier elemento transponible que sea activo en el insecto deseado. Preferentemente, sin embargo, el elemento transponible se selecciona de entre el grupo constituido por Minos, mariner, Hermes, Sleeping Beauty y piggyBac.

Minos es un elemento transponible que se encuentra activo en la moscamed. Ha sido descrito en la patente US nº 5.840.865, que se incorpora a la presente memoria como referencia. La utilización de Minos para transformar insectos se describe en la patente US anteriormente indicada.

Mariner es un transposón originalmente aislado a partir de Drosophila, pero que posteriormente ha sido descubierto en varias especies de invertebrados y de vertebrados. La utilización de mariner para transformar organismos se describe en la solicitud de patente internacional nº WO99/09817.

Hermes se deriva de la mosca doméstica común. Su utilización para crear insectos transgénicos se describe en la patente US nº 5.614.398, incorporada en el presente documento como referencia en su integridad.

PiggyBac es un transposón derivado del huésped baculovirus Trichoplusia ni. Su utilización para la transformación de la línea germinal de Moscamed ha sido descrita por Handler et al., PNAS (USA) 95:7520-5 (1998).

La transferencia génica se lleva a cabo mediante transformación demostrada de la línea germinal mediada por transposón. El transposón seleccionado es Minos, el cual se ha demostrado que funciona como un vector de transgénesis en la moscamed (Loukeris et al., 1995) y en Drosophila. Pueden utilizarse como alternativas otros transposones funcionales en la moscamed, tales como piggyBac (McCombs et al., 1998). La metodología de transformación de la moscamed está bien descrita en la literatura (Loukeris et al., 1995). Brevemente, se coinyecta en embriones preblástula de moscamed un plásmido circular de ADN que contiene un transposón consistente en un gen de interés (tal como eritropoyetina, junto con secuencias de ADN reguladoras apropiadas), flanqueado por los dos extremos del transposón, junto con una fuente de transposasa (un plásmido que expresa transposasa, ARNm sintetizado in vitro que codifica transposasa, o la proteína transposasa misma). En los embriones tempranos, la transposasa interactúa con los extremos del transposón y cataliza la extracción del mismo y su reintegración en los cromosomas en posiciones aleatorias. Habitualmente, con el fin de facilitar la detección de las moscas transgénicas, también se incluye en el transposón un "gen marcador", tal como un gen que confiera un fenotipo dominante, visible o, de otro modo, seleccionable. Las moscas transgénicas se detectan en la progenie de las moscas inyectadas utilizando el fenotipo del gen marcador y posteriormente se crían hasta la homocigosidad. Pueden producirse varias de dichas cepas, conteniendo, cada una, una inserción en una posición diferente del genoma, en cada experimento de transformación, implicando la inyección en varios cientos de huevos.

Inserciones múltiples

Con el fin de incrementar los niveles de expresión, pueden construirse cepas que contengan inserciones múltiples mediante la reproducción cruzada de diferentes cepas transgénicas. Este procedimiento puede verse facilitado por la utilizaciónón de cromosomas equilibradores. Los cromosomas equilibradores contienen varias inversiones solapadas, una o más mutaciones recesivas letales y por lo menos una mutación dominante visible. Estos cromosomas suprimen la recombinación y pueden utilizarse para mantener y manipular los cromosomas que portan varios genes mutantes. Se ha descrito un cromosoma equilibrador de moscamed llamado FiM I. Mediante la supresión de la recombinación en una región de grandes dimensiones del cromosoma 5, puede ser utilizado para construir un cromosoma 5 que porte varias inserciones de transposones.

Selección de insecto y de promotor

Serían adecuadas en la presente invención varias larvas de insecto, incluyendo cualquiera de entre Bactrocera oleace (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental de la fruta), Heliothis armigera (oruga del algodón), Trichoplusa ni (polilla de la col), Manduca sexta (gusano del tabaco), Lobesia botrana (polilla del racimo de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (mosca negra), Phlebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca doméstica) y Ceratitis capitata (Moscamed). Sin embargo, se prefiere la moscamed.

Preferentemente, el promotor utilizado es un promotor fuerte. Se encuentran disponibles para su utilización dos categorías alternativas de promotor: promotores inducibles y promotores constitutivos.

Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, los promotores de choque térmico. Preferentemente, el promotor de choque térmico es un promotor de choque térmico de insecto, por ejemplo, el promotor Hsp70 de Drosophila melanogaster, que es capaz de regular la expresión de genes en organismos heterólogos, incluyendo en la moscamed. La invención también abarca la utilización del promotor Hsp70 de moscamed (Papadimitriou et al., Insect Mol. Biol. 7:279-90, (1998)). Los sistemas alternativos pueden basarse en la inducción con el antibiótico tetraciclina (Heinrich y Scott, PNAS 97:8229-8232, 2000).

Los promotores de choque térmico son inducibles mediante la elevación de la temperatura de las condiciones bajo las que se cultiva la moscamed. Por ejemplo, a una temperatura comprendida entre 23ºC y 25ºC, el promotor Hsp70 se encuentra activo a niveles bajos o no se encuentra activo en absoluto. Esto permite que las larvas de insecto se desarrollen sin estrés inducido por la producción de una proteína heteróloga. Sin embargo, a temperaturas más elevadas, tales como una temperatura comprendida entre 37ºC y 42ºC, el promotor Hsp70 resulta inducido y expresa la proteína heteróloga a un nivel elevado.

Los promotores inducibles pueden construirse basados en elementos inducibles de control génico conocidos. Por ejemplo, pueden construirse promotores inducibles mediante la combinación de un elemento que responda a un fármaco u hormona que puede administrarse en la dieta. En una forma de realización preferida, puede utilizarse un elemento que responda al estrógeno humano (ERE) para regular la expresión de la proteína de interés, con la condición de que el insecto sea transformado con una segunda secuencia codificante que exprese el receptor del estrógeno humano.

También pueden utilizarse promotores constitutivos para expresar la proteína de interés y/o otras proteínas necesarias en la larva de insecto. Por ejemplo, el promotor constitutivo puede ser un promotor de actina citoplasmática. El promotor de actina citoplasmática de D. melanogaster ha sido clonado (Act5C) y es altamente activo en los mosquitos (Huynh y Zieler, J. Mol. Biol. 288:13-20, (1999)). Los genes de la actina citoplasmática y sus promotores también pueden aislarse a partir de otros insectos, incluyendo la moscamed.

Entre otros ejemplos se encuentra el promotor de la tubulina citoplasmática, por ejemplo el promotor de la tubulina citoplasmática de moscamed.

Pueden utilizarse promotores que controlan los polipéptidos secretados, opcionalmente junto con secuencias de señalización apropiadas, con el fin de dirigir la secreción de la proteína hacia la hemolinfa. Por ejemplo, puede utilizarse el promotor de la proteína sérica de las larvas (Benes et al., Mol. Gen. Genet. 249(5):545-56, (1995)).

Cría de las larvas

La tecnología de cría masiva de la moscamed se encuentra altamente desarrollada. Existen instalaciones de cría masiva que producen más de 1.000 millones de moscas por semana. Estas moscas se utilizan para el control de las plagas de moscamed mediante la técnica del insecto estéril: las moscas se esterilizan mediante exposición a radiación en el estadio de pupa, y después se liberan en el campo.

El ciclo vital de la moscamed es de aproximadamente 25 días a 25ºC y una hembra normalmente pone 100 a 200 huevos. Al igual que todos los insectos holometábolos, la moscamed presenta cuatro estadios de desarrollo diferenciados: embrión (de duración aproximada 2 días), larva (aproximadamente 8 días), pupa (aproximadamente 10 días) y adulto. La madurez sexual se alcanza dentro de los 4 a 6 días de vida adulta. Junto antes de la pupación, cada larva presenta una masa de aproximadamente 10 mg y contiene aproximadamente 200 microgramos de proteína.

Para la producción de proteínas, los cultivos de larvas que se han iniciado en diferentes tiempos pueden sincronizarse mediante cambios apropiados de los regímenes de temperatura. Esto resulta posible debido a que las tasas de crecimiento dependen de la temperatura ambiental; a 18ºC, las tasas de crecimiento de las larvas se reducen en aproximadamente el 50%.

Para la producción a escala de laboratorio, se prefiere la utilización de insectos más pequeños, tales como Drosophila. Aunque se produce menos proteína por larva, el ciclo vital es más corto y la producción puede establecerse con mayor rapidez. Por ejemplo, el ciclo vital de Drosophila es de 12 días, siendo capaz cada 1 mg de larva de producir 20 \mug de proteína.

En los ejemplos siguientes se describe la invención, únicamente a título ilustrativo.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de GFP en larvas de moscamed y de Drosophila

El gen que codifica la proteína fluorescente verde de la medusa Aequoria victoria ha sido expresado en la moscamed, Ceratitis capitata, y en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las larvas, pupas y adultos transgénicos de Drosophila y de moscamed que contienen inserciones únicas y múltiples de un transposón Minos/GFP en su genoma muestran fluorescencia característica de GFP. Se utilizaron dos constructos de GFP, uno con un promotor inducible (Hsp70 de Drosophila) y uno con un promotor constitutivo (el promotor actin 5C de Drosophila). Las larvas de Drosophila y de moscamed con el gen Hsp70/GFP mostraban niveles bajos de fluorescencia a la temperatura normal de cría (22ºC) y fluorescencia elevada tras la exposición durante 1 hora a una temperatura elevada (39ºC). Las larvas de Drosophila con el gen actin 5C/GFP mostraban niveles constitutivamente elevados de fluorescencia GFP. La GFP se expresa en la mayoría, si no en todos, los tejidos de Drosophila y de moscamed. La proteína GFP también se detecta en insectos transgénicos utilizando un ensayo de inmunotransferencia. La comparación de varias líneas transgénicas mostraba que los niveles de expresión de GFP dependían de la posición de integración del transgén y del número de copias del transgén presentes en el genoma.

Materiales y procedimientos

Moscas e inyección de ADN: en todos los experimentos se utilizaron la cepa yw de Drosophila y la cepa A71 de Ceratitis capitata, una cepa de ojos blancos homocigótica para el gen w1; las moscas se criaron a 22ºC bajo condiciones estándar. Las inyecciones de ADN de los plásmidos transposón, junto con un plásmido auxiliar que expresaba la transposasa, se llevaron a cabo utilizando embriones preblástula, tal como se ha descrito anteriormente (Loukeris et al. 1995, Science).

Construcciones de plásmido y análisis de ADN

Se construyó el plásmido pMiHsp70/GFP insertando un fragmento amplificado por PCR que contenía el gen GFP en el sitio de clonación múltiple del plásmido pHSS6Hsp70PT, en la orientación apropiada. El plásmido pHSS6Hsp70
PT contiene, en las orientaciones apropiadas, el promotor y la secuencia 3' de ARNm remolque-señal de poliadenilación (en lo sucesivo denominada "terminador") del gen Hsp70 de Drosophila melanogaster. El promotor y el terminador se separaron mediante un sitio de clonación múltiple. El promotor Hsp70 también contenía la secuencia líder 5' no traducida del ARNm de Hsp70 para incrementar la estabilidad del ARNm. El cassette promotor/GFP/terminador a continuación se clonó como fragmento NotI en un vector Minos que contenía el ADNc de tipo salvaje del gen white de Moscamed (Loukeris et al., Science, 1995). El gen white se utiliza como un marcador genético primario visible para la detección de transformantes (Loukeris et al., Science, 1995). La estructura del transposón pMiHspGFP/HspCcW se muestra en la figura 1.

El plásmido pMiAct5CGFP (figura 2) contiene el gen GFP corriente abajo del fragmento de 2 kb de Drosophila melanogaster que contiene el promotor del gen Actin 5C, el cual codifica la actina citoplasmática, de expresión ubicua. El plásmido pMiAct5CGFP no contiene el gen white como marcador primario, y los transformantes generados con este plásmido se identifican a partir únicamente de la expresión de GFP (ver después).

En un experimento de transgénesis típico, se coinyecta una mezcla de plásmido transposón de ADN y plásmido auxiliar de ADN en embriones preblástula (de 0 a 1 hora posteriores a la oviposición) de Drosophila o de moscamed que son homocigóticos para la mutación white del color de los ojos. Con el fin de detectar las moscamed transgénicas, las moscas derivadas de los embriones inyectados (generación G0) se crían mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora, y la progenie se somete individualmente a ensayo en el estadio de larva para la expresión del gen white (moscas inyectadas con pMiHspGFP/HspCcW) o de GFP (moscas inyectadas con pMiACt5CGFP). La expresión de white es detectable como un cambio en el color de los ojos de blanco a coloreado (variando desde amarillo pálido al rojo del tipo salvaje). La expresión de la GFP se sigue mediante la detección de fluorescencia específica de GFP en los tejidos de las larvas tras dos tratamientos térmicos sucesivos separados por un día de 1 hora a 39ºC, utilizando microscopía de epifluorescencia estándar.

Las larvas transgénicas individuales (generación G1) se crían mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora y la progenie individual que expresa white o GFP (G2) se cruza entre sí para producir progenie homocigótica (G3). La intensidad del color de los ojos o de la fluorescencia GFP es dependiente de la dosis génica. Los individuos homocigóticos se detectan, por lo tanto, de entre la progenie G3 mediante el seguimiento de estos fenotipos. Los individuos de G3 putativamente homocigóticos se cruzan entre sí y su progenie se analiza mediante transferencia southern para determinar si contiene inserciones únicas o múltiples. Las cepas homocigóticas para las inserciones únicas se establecen mediante este procedimiento.

Expresión inducible térmicamente de GFP en larvas de Drosophila y de moscamed

Las larvas transgénicas de Drosophila y de moscamed homocigóticas para las inserciones del transposón
MiHspGFP/HspCcW criados a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban niveles bajos pero detectables de fluorescencia GFP en comparación con las larvas no transgénicas. La fluorescencia se incrementa drásticamente tras el choque térmico (figura 3).

Expresión constitutiva de GFP en Drosophila

Las moscas Drosophila transgénicas homocigóticas para las inserciones del transposón MiAct5CGFP criadas a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban niveles elevados de fluorescencia GFP en comparación con las moscas no transgénicas adultas (figura 4) y en estadio de larva (figura 6). Los niveles de fluorescencia son dependientes de la dosis génica (figura 5).

No se detectaron moscamed que expresasen GFP en la progenie de más de 1.000 individuos G0 inyectados con MiAct5CGFP. Se concluye que el promotor actin 5C de Drosophila es un promotor débil en la moscamed y que será necesario utilizar un promotor homólogo de la actina en la moscamed para alcanzar niveles elevados de expresión constitutiva de proteínas heterólogas.

Se comparó la expresión de GFP de varias líneas transgénicas de Drosophila que eran homocigóticas para
MiAct5CGFP. Aunque todas las líneas mostraron niveles elevados de fluorescencia, se detectaron diferencias de intensidad que eran específicas de determinadas líneas.

Ejemplo 2 Producción de hormona del crecimiento humana en larvas de moscamed

Se clonó una secuencia de ADNc que codificaba hGH corriente abajo del promotor de D. melanogaster para el gen de choque térmico Hsp70. El promotor Hsp70 también contiene la secuencia líder 5' no traducida del ARNm de Hsp70 para incrementar la estabilidad del ARNm. La secuencia remolque 3' no traducida de Hsp70 de D. melanogaster, que contiene una señal de poliadenilación, se clonó corriente abajo de la secuencia codificante de la hGH. El constructo se insertó en un vector Minos que además contenía un constructo marcador. El constructo marcador consistía en el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequoria victoria, regulado por el promotor Hsp70 de D. melanogaster y que también contenía la región 3' de Hsp70. Este marcador confiere un genotipo visible (fluorescencia GFP) a los organismos transgénicos y se utiliza para detectar las moscamed que son transgénicas en el estadio de embrión, de larva o de adulto. La estructura global del transposón completo es, por lo tanto:

Repetición invertida izquierda de Minos-constructo de expresión de hGH-constructo de expresión del marcador GFP-repetición invertida derecha de Minos

El transposón se construyó en E. coli en un vector BlueScript.

Como fuente de transposasa en los experimentos de transgénesis se utilizó el ARNm sintetizado in vitro que codificaba la transposasa de Minos. El ARNm se sintetizó in vitro utilizando como molde un vector de expresión plásmido que contenía el gen de transposasa clonado corriente abajo a partir de un promotor de fago T7 y ARN polimerasa de T7 comercialmente disponible. La secuencia de ADN completa e ininterrumpida que codificaba la transposasa de Minos se obtuvo mediante transcripción inversa a partir del ARNm de Minos procedente de D. melanogaster transgénico que expresaba la transposasa de Minos.

Se coinyectó el plásmido de ADN que contenía el transposón con el ARNm de transposasa de Minos en embriones preblástula (de 0 a 1 hora posteriores a la oviposición). Las condiciones para la manipulación de los embriones de moscamed y las inyecciones han sido descritas en la literatura (Loukeris et al., 1995). Bajo estas condiciones, entre el 10% y el 20% de las moscas fértiles derivadas de los embriones inyectados se esperaba que diesen lugar a progenie transgénica. Con el fin de detectar las moscamed transgénicas, las moscas derivadas de los embriones inyectados (generación G0) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora, y su progenie se sometió a ensayo individual en el estadio de larva para la expresión de GFP. Esto se llevó a cabo mediante la detección de fluorescencia específica de GFP en los tejidos de las larvas tras dos tratamientos sucesivos separados por un día de 1 hora a 39ºC, utilizando microscopía de epifluorescencia estándar.

Las larvas transgénicas individuales (generación G1) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora y la progenie que expresaba GFP (G2) se cruzó entre sí para producir progenie homocigótica (G3). Los individuos homocigóticos G3 son detectables midiendo la expresión de GFP mediante microscopía de epifluorescencia cuantitativa. Se establecieron las cepas homocigóticas para las inserciones únicas.

\newpage

En tales cepas transgénicas, los niveles de expresión del transgén no sólo dependen del promotor y de las condiciones de inducción, sino también del punto de inserción del transgén. Se sometieron a ensayo varias cepas obtenidas independientemente (es decir, cepas derivadas de diferentes moscas G0) para los niveles de expresión de hGH y aquéllas que mostraban los niveles más elevados se caracterizaron adicionalmente a niveles molecular y citogenético. La caracterización molecular consistió en la transferencia southern y, para las cepas que finalmente se utilizarían para la producción de proteínas, la clonación y secuenciación del transgén. La caracterización citogenética se llevó a cabo mediante hibridación in situ en cromosomas politénicos de glándula salival con el fin de determinar el punto cromosómico de inserción.

Con el fin de construir cepas con múltiples inserciones, se llevaron a cabo cruzamientos apropiados entre miembros de diferentes cepas. La progenie de estos cruzamientos se cruzó entre sí y se recuperaron múltiples individuos homocigóticos utilizando GFP como marcador. Dependiendo de la posición cromosómica de las inserciones, pueden utilizarse cepas que porten cromosomas equilibradores con el fin de facilitar estos constructos. Se requieren tres a cuatro generaciones para construir cepas estables con inserciones múltiples.

La cría masiva de larvas se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos establecidos. Las larvas se criaron con alimento semiseco consistente en una base de salvado suplementada con levadura. El crecimiento de las larvas se sincronizó mediante variaciones apropiadas de la temperatura y las larvas de tercer estadio se trataron a una temperatura comprendida entre 39ºC y 41ºC durante el tiempo necesario para la inducción máxima del transgén. Las larvas de tercer estadio tardías se alejan del alimento, en búsqueda de un lugar para pupar. Este comportamiento se utiliza para recolectar las larvas del alimento para la producción en masa de moscas en las instalaciones de cría masiva; también se aplica a la recolección de larvas limpias de alimento para la producción y purificación de las proteínas.

Las larvas de moscamed se lavaron con solución salina fría y después se homogeneizaron en presencia de inhibidores de proteasa. Se purificó la hGH a partir del homogenado de acuerdo con procedimientos estándar.

Ejemplo 3 Producción de un anticuerpo de camélido en larvas de moscamed

En la figura 7 se muestra un vector diseñado para la expresión de una proteína en hemolinfa de larva. LspP/L es el promotor del gen de proteína sérica de larva de Drosophila o de moscamed (Lsp) (Benes et al., Mol. Gen. Genet. 249(5):545-56, (199))), seguido de un líder 5' no traducido Lsp (segmento rayado) y del péptido de señalización Lsp (segmento de color negro). El gen de interés, en este caso el gen del anticuerpo de camélido, se fusionó conservando el marco de lectura del péptido líder. HspP y HspT son el promotor y el terminador, respectivamente, del gen 70 de choque térmico. CcW es el gen white de moscamed, utilizado como marcador dominante visible para la detección de transformantes. MiL y MiR son los extremos del elemento Minos.

Se aisló un anticuerpo de camélido a partir de una biblioteca de expresión fágica (Unilever). El anticuerpo era específico para el retrovirus porcino PERV (retrovirus endógeno porcino) y reconoce el componente p30 de las proteínas gag del PERV (las proteínas del núcleo viral). Se expresó un clon de p30 en el vector de expresión pHEN1 con el fin de obtener antígeno para la exploración de la biblioteca de anticuerpos, y de acuerdo con esto se seleccionaron los clones de anticuerpo. En la figura 8 se muestra una secuencia y traducción preliminares del anticuerpo utilizado en este experimento.

Las moscas transgénicas se identificaron mediante la expresión de white, tal como en el Ejemplo 1. La expresión de anticuerpos se detectó en la hemolinfa de las larvas de las moscas transgénicas.

Se purificó el anticuerpo mediante la homogenización del extracto de las larvas y la purificación mediante cromatografía de columna con proteína A. Las inmunoglobulinas se unen a la proteína A a pH 8,6 y son eluídas de la columna a pH 4,3. De esta manera, la elución se lleva a cabo reduciendo el pH de la columna de proteína A. Se hinchó la agarosa-proteína A (0,25 g; Sigma) en solución salina tamponada con Tris (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 8,6) y después se empaquetó en una columna (el volumen de lecho era de 1 ml). El sobrenadante del cultivo se ajustó a pH 8,6 mediante la adición de NaOH diluido y después se centrifugó a 600 g durante 30 minutos a 4ºC. Tras cargar la muestra, la columna de proteína A se lavó con solución salina tamponada con Tris, pH 8,6, hasta el final de la elución de las proteínas de la columna. A continuación, se llevaron a cabo eluciones por pasos con PBS (fosfato 0,05 M/NaCl 0,15 M, pH 7,0), solución salina tamponada con citrato (citrato 0,05 M/NaCl 0,15 M, pH 5,5) y solución salina tamponada con acetato (acetato 0,05 M/NaCl 0,15 M, pH 4,3) hasta la elución del anticuerpo. Las fracciones que contribuyeron al pico de A 280 se agruparon, se dializaron en 0,01xPBS, se liofilizaron, se redisolvieron en 500 \mul de PBS y se almacenaron a -70ºC. La pureza del pico de proteínas se analizó mediante SDS/PAGE. La columna se regeneró mediante lavado con solución salina tamponada con glicina (glicina 0,05 M/HCl/NaCl 0,15 M, pH 2,3) seguido de solución salina tamponada con Tris (pH 8,6, que contenía NaN_{3} al 0,02%).

Se llevó a cabo un ensayo ELISA utilizando antígeno p30 inmovilizado, producido tal como se ha indicado anteriormente, y un anticuerpo monoclonal murino anti-camélido marcado. De esta manera, se confirmó la especificidad para p30 de PERV del anticuerpo eluído procedente de las larvas de moscamed.

Ejemplo 4 Producción de \alpha-glucosidasa humana en larvas de moscamed

Se construyó un sistema de expresión transposón inducible por choque térmico de acuerdo con el Ejemplo 1, utilizando el gen de la \alpha-glucosidasa humana (GenBank GI:182907) en lugar del gen de GFP.

Se coinyectó una mezcla de plásmido transposón de ADN y plásmido auxiliar de ADN, al igual que en el Ejemplo 1, en embriones preblástula (de 0 a 1 hora posteriores a la oviposición) de Drosophila o de moscamed, homocigóticos para la mutación white del color de los ojos. Con el fin de detectar las moscamed transgénicas, las moscas derivadas de embriones inyectados (generación G0) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora, y su progenie se sometió a ensayo individual en el estadio de larva para la expresión del gen white. La expresión de white es detectable como un cambio en el color de los ojos de blanco a coloreado (variando desde el amarillo pálido hasta el rojo del tipo salvaje).

Las larvas transgénicas individuales (generación G1) se criaron mediante cruzamiento de retorno a la cepa receptora y la progenie white individual (G2) se cruzó entre sí con el fin de producir progenie homocigótica (G3). La intensidad del color de los ojos es dependiente de la dosis génica. Los individuos homocigóticos se detectan, por lo tanto, de entre la progenie G3 mediante el seguimiento de estos fenotipos. Los individuos de G3 putativamente homocigóticos se cruzaron entre sí y su progenie se analizó mediante transferencia southern para determinar si contenían una única inserción o inserciones múltiples. Se establecieron cuáles eran las cepas que eran homocigóticas para las inserciones únicas mediante este procedimiento.

Expresión inducible por calor de la \alpha-glucosidasa en larvas de Drosophila y de moscamed

Las larvas transgénicas de Drosophila y de moscamed homocigóticas para las inserciones del transposón \alpha-glucosidasa MiHsp/HspCcW criadas a la temperatura estándar, comprendida entre 22ºC y 24ºC, mostraban niveles bajos pero detectables de \alpha-glucosidasa en los cuerpos grasos en comparación con las larvas no transgénicas, según la evaluación mediante inmunocuantificación de acuerdo con Umapathysivam et al., Clin. Chem. 46(9):1318-25 (2000). La cantidad de \alpha-glucosidasa se incrementa marcadamente tras el choque térmico.

Claims (17)

1. Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende:

(a) transformar la línea germinal de un insecto con un sistema de expresión basado en un transposón, capaz de expresar la proteína de interés en las larvas del insecto;

(b) criar el insecto para que produzca larvas;

(c) criar masivamente las larvas; y

(d) aislar la proteína de interés a partir de las larvas criadas masivamente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la transformación del insecto comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar un elemento transponible que codifica una proteína transposasa que es activa en el insecto;

b) modificar el elemento transponible mediante la inserción de una secuencia codificante que codifica la proteína de interés; y

c) transformar los insectos diana con el elemento transponible modificado.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el elemento transponible se selecciona de entre el grupo constituido por Minos, mariner, Hermes, sleeping beauty y piggyBac.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de expresión comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de interés, bajo el control de un elemento de control transcripcional inducible que se encuentra operativo en las larvas del insecto.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el sistema de control inducible es regulable con tetraciclina o con estrógenos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sistema de expresión comprende una secuencia codificante que codifica la proteína de interés, bajo el control de un elemento de control transcripcional constitutivo que se encuentra operativo en las larvas de insecto.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el elemento de control constitutivo se selecciona de entre el grupo constituido por el promotor de la actina citoplasmática, tal como el promotor Act5C de Drosophila y el promotor de la tubulina citoplasmática.

8. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la secuencia de control de expresión inducible es un promotor de choque térmico, tal como el promotor Hsp70 de Drosophila o de la moscamed.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto proteína se acumula principalmente en los cuerpos grasos o en la hemolinfa.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el promotor de proteína sérica de larvas dirige la secreción del producto proteína en la hemolinfa, y el promotor Hsp70 se utiliza para la expresión en los cuerpos grasos.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el insecto es transformado con dos o más sistemas de expresión, o con un sistema de expresión que comprende dos o más secuencias codificantes.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la retención del sistema de expresión se ve favorecida por la utilización de un cromosoma equilibrador.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de interés se selecciona de entre el grupo constituido por un enzima, una citoquina, una hormona o un fármaco proteico.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el insecto se selecciona de entre el grupo constituido por Bactrocera oleae (mosca del olivo), Bactrocera orientalis (mosca oriental de la fruta), Heliothis armigera (oruga del algodón), Trichoplusa ni(polilla de la col), Manduca sexta(gusano del tabaco), Lobesia botrana (polilla del racimo de la vid), Anopheles gambiae (mosquito), Aedes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla), Glossina morsitans (mosca tse-tse), Simulium sp. (mosca negra), Phlebotomus sp. (mosca de la arena), Musca domestica (mosca doméstica), Drosophila melanogaster y Ceratitis capitata (Moscamed).

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el insecto es Ceratitis capitata.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el insecto es Drosophila melanogaster.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los cultivos de larvas se sincronizan mediante la manipulación de las temperaturas de los cultivos.