ES2241967T3 - Utilizacion de un agente supresor de la infeccion y de la proliferacion del vih. - Google Patents
Utilizacion de un agente supresor de la infeccion y de la proliferacion del vih.Info
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Abstract
Utilización de un derivado de macrólido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto mediante la supresión de la infección y/o de la proliferación del virus del síndrome de la inmunodeficiencia humana en un macrófago derivado de un monocito humano, donde el derivado de macrólido es seleccionado de entre oxaciclotetradecano-2-10-diona, 4[2, 6- didesoxi-3-O-metil-á-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil- 7, 12, 13-trihidroxi-3, 5, 7, 9, 11, 13-hexametil-6-[[3, 4, 6- tridesoxi-3-(dimetilamino)-â-D-xilo-hexopiranosil]oxi]; 11- (1''-hidroxipropil)-3-[2, 6-didesoxi-3-C-metil-á-L-ribo- hexopiranosil]oxi]-5-[(3, 4, 6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-â-D- xilo-hexopiranosil)oxi]-2, 4, 6, 8, 11, 14-hexametil-10, 13, 15-
Description
Utilización de un agente supresor de la infección
y de la proliferación del VIH.
La presente invención se refiere a un agente para
suprimir la infección y la proliferación del virus del síndrome de
la inmunodeficiencia humana (VIH-1), que infecta
células inmunocompetentes tales como macrófagos o células
dendríticas y produce la destrucción del sistema inmune. Más
particularmente, la presente invención se refiere a la utilización
de un agente para suprimir la infección y la proliferación del virus
del síndrome de la inmunodeficiencia humana, agente que suprime la
infección y la proliferación del virus del síndrome de la
inmunodeficiencia humana en macrófagos de tipo M derivados de
monocitos humanos.
Más de 40 millones de personas han sido
infectadas con el virus del síndrome de la inmunodeficiencia humana
(VIH-1), y entre ellas se estimó que alrededor de 5
millones de sujetos desarrollaron el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA). El SIDA es realmente una enfermedad infecciosa
mundial. Una terapia antirretroviral muy activa (HAART) para
pacientes con VIH-1 apareció al principio de los
años 90. Como resultado de la aplicación en el campo clínico, se
obtuvo un gran efecto terapéutico tal como la disminución del
recuento vírico en el plasma de pacientes con SIDA y el
reconocimiento de la recuperación del número de CD4.
Sin embargo, por otra parte, es preocupante que
el virus dirigido a macrófagos (M\Phi) permanece en los tejidos
reticuloendoteliales^{1),2)} y se observan cepas resistentes a la
HAART en pacientes que recibieron HAART, de medio año a varios años
después de la HAART aproximadamente. Además, como el coste del
tratamiento HAART es elevado, el tratamiento es aplicado
prioritariamente a las personas que viven en los países avanzados y
las personas de los países subdesarrollados no pueden recibir tal
tratamiento debido a las disparidades en poder económico entre los
países avanzados y los países subdesarrollados, en los que están más
del 80% de los pacientes con VIH del mundo, y tal tratamiento no
pudo contribuir a la interrupción de la distribución internacional
del virus; como resultado, se requiere una terapia de combinación
múltiple con el fin de suprimir la aparición de cepas resistentes, y
se ha informado de pacientes que son retirados del tratamiento
debido a síntomas abdominales y a daños hematopoyéticos, señalándose
por consiguiente los límites de la aplicación médica y social de la
HAART.
El VIH-1 es un virus que infecta
células inmunocompetentes tales como macrófagos y células
dendríticas para destruir el sistema inmune. Como resultado de
estudios recientes de investigación, está claro que la infección y
la proliferación del VIH-1 en el macrófago desempeña
funciones importantes en el mantenimiento de la infección y en el
desarrollo de la patogénesis del VIH-1^{3)}, por
consiguiente, se espera el desarrollo de nuevos fármacos que inhiban
la infección y la proliferación del VIH-1 en el
macrófago.
Aunque se realizó un gran número de experimentos
infecciosos con VIH-1 en macrófagos, muchos estudios
se llevaron a cabo utilizando cepas celulares de macrófagos y, como
resultado, los resultados experimentales de la utilización de tales
cepas celulares no reflejaban siempre la función de los macrófagos
tisulares in vivo. Akagawa y col. consiguieron con éxito la
inducción diferencial de dos tipos de macrófagos, macrófagos en los
que tenía lugar la proliferación del VIH-1 y
macrófagos que suprimían la proliferación del VIH-1
procedentes de los monocitos, demostrando además que los macrófagos
que suprimían la proliferación podían ser un modelo de macrófagos
alveolares humanos; como resultado, se hizo posible el análisis de
la infección, la proliferación y el mecanismo de supresión de la
proliferación del VIH-1 en un sistema similar al de
los macrófagos in vivo^{4)-9)}.
Además, se conocen macrólidos que son eficaces
para el tratamiento de la panbronquiolitis difusa (DPB) y de
enfermedades del campo ornitológico y se sabe que el mecanismo de
acción de los mismos, además de la acción antibiótica, es la
inducción de una acción antiinflamatoria^{10)}. Especialmente,
como resultado del examen de la acumulación de macrólidos en los
tejidos, hay un informe que indica que se observó una acumulación en
macrófagos de varios cientos a mil veces, en comparación con los
linfocitos periféricos y, por consiguiente, se cree que la acción de
los macrólidos sobre los macrófagos es importante.
EP-A-0.254.534 se
refiere a derivados y composiciones de eritromicina y su utilización
en enfermedades víricas. US 5.514.662 se refiere a la utilización de
derivados de anfotericina B como inhibidores de proteasas. US
5.541.193 se refiere a inmunomoduladores macrocíclicos que contienen
heterociclos. US 5.545.734 se refiere a macrólidos de arilo y
heteroarilo que tienen actividad inmunosupresora.
EP-A-1.064.942 se refiere a
preparaciones de liberación mantenida.
Sobre la base de los antecedentes anteriores,
nosotros hemos pensado que el desarrollo de fármacos que suplementen
las desventajas de la HAART, que supriman la infección y la
proliferación de VIH-1 en los macrófagos y que estén
dirigidos a excluir el VIH-1 dirigido a macrófagos
del sistema reticuloendotelial linfoide, especialmente el desarrollo
de agentes terapéuticos baratos desde el punto de vista de la
estrategia terapéutica contra el SIDA en vista del nivel mundial, es
útil para el tratamiento de pacientes con VIH-1.
Nosotros hemos estudiado si los derivados de
macrólidos conocidos tienen o no acciones inhibidoras de la
infección y proliferación del VIH-1 y, bastante
sorprendentemente, hemos encontrado que tienen acciones inhibidoras
frente a la infección y proliferación del VIH-1 en
los macrófagos y hemos demostrado que la acción inhibidora de la
proliferación es manifestada por la supresión de la expresión de la
proteína tirosina quinasa Hck en los macrófagos, la cual es esencial
para el crecimiento del virus, y por la supresión de la activación
de p38MAPK, y de esta forma hemos completado la presente
invención.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar la utilización de un agente para suprimir la infección
y la proliferación del virus del síndrome de la inmunodeficiencia
humana útil para el tratamiento de pacientes con infección por
VIH-1, mediante un agente quimioterapéutico barato
además de útil como agente suplementario en la HAART.
La presente invención se refiere a la utilización
de derivados de macrólidos para la supresión de la infección y
proliferación del virus del síndrome de la inmunodeficiencia humana
en macrófagos derivados de monocitos humanos. Los macrófagos
derivados de monocitos humanos son los macrófagos de tipo M. La
supresión de la proliferación del virus está basada en la acción
supresora de los macrólidos sobre la proteína tirosina quinasa Hck y
la supresión de la activación de p38MAPK del macrófago necesarias
para la proliferación del virus. Los derivados de macrólidos
conocidos que tienen tal acción supresora de la proliferación del
VIH-1 están todos incluidos en la presente
invención.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona la utilización de un derivado de macrólido en la
fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto mediante la
supresión de la infección y/o la proliferación del virus del
síndrome de la inmunodeficiencia humana en macrófagos derivados de
monocitos humanos, donde el derivado de macrólido es seleccionado de
entre
oxaciclotetradecano-2-10-diona,4[2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-7,12,13-trihidroxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-3-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi];
11-(1'-hidroxipropil)-3-[2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil]oxi]-5-[(3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi]-2,4,6,8,11,14-hexametil-10,13,15-tri-oxatriciclo
[9.2.1.1.^{9.6}]-pentadecano-1-ona;
6,15,16-Trioxatriciclo
[10.2.1.11,4]hexadecano, derivado de eritromicina;
4,13-Dioxabiciclo [8.2.1]
tridec-12-en-5-ona,7-[(2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-3-(1,2-dihidroxi-1-metilbutil)-2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi];
Oxaciclo-tetradecano-2,10-diona,4-[(2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-12,13-dihidroxi-7-metoxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi];
6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-sulfonil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-[3'-N-(3-hidroxi-1-propil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-acetoxietil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-cianometil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-fluoroetil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-etil-8,9-anhidro-pseudoeritromicinaA
o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dietil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-alil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dialil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-propil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dipropil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-hexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dihexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-bencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-bencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-propil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-(10-bromo-1-decanil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la
bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-acetil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-piperidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-pirrolidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-morfolino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-[hexahidro-1(1H)-azepinil]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(12-hidroxi)-de
[12-(1-hidroxipropil)]-12-hidroxi-oxima-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
[12-(1-hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(12-hidroxi)-de
[12-(1-hidroxipropil)]-12-amino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3'-N-metil)-de
[12-1-hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de
(3-O-cladinosil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo y 6,9-hemicetal de la de
(3-O-cladinosil)-de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo.
La invención proporciona también la utilización
de tales derivados de macrólidos para la supresión in vitro
de la infección y/o proliferación del virus del síndrome de la
inmunodeficiencia humana en macrófagos derivados de monocitos
humanos.
Con el fin de comprender la presente invención,
se explica un mecanismo de la supresión de la proliferación de
VIH-1 dirigido a macrófagos en macrófagos derivados
de monocitos humanos.
Según ha sido informado previamente^{11)},
células mononucleares de sangre periférica humana (PMBC) fueron
aisladas de la capa de color blanco amarillento de voluntarios
humanos sanos utilizando microesferas con anticuerpos hacia el CD14
humano (Miltenyi Biotech, Alemania), un sistema de separación de
células magnéticas (MACS) (Miltenyi Biotech, Alemania) y Lymphoprep
(Nycome Inc., Noruega); posteriormente los monocitos fueron aislados
de las PMBC mediante selección positiva.
Los macrófagos derivados de monocitos se
prepararon mediante el cultivo de los monocitos recuperados en
presencia de M-CSF (factor estimulante de colonias
de macrófagos) (10^{4} U/ml, suministrado por Morinaga Milk Co.),
granulocitos y factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
(500 U/ml, suministrado por Japan Schering Plough Co., Osaka, o
adquirido a R & S Genzyme-TECHNE Inc.) con medio
RPMI1640 al que se había añadido un 10% de FCS (Nissui Seiyaku Co.,
Tokyo) durante 7 - 8 días.
Los macrófagos preparados mediante la inducción
diferencial con M-CSF a partir de monocitos humanos
son denominados macrófagos de tipo M (M\Phi de tipo M o
M-M\Phi) y los macrófagos preparados mediante la
inducción diferencial de monocitos humanos con
GM-CSF son denominados macrófagos de tipo GM
(M\Phi de tipo GM o GM-M\Phi). Además, se
prepararon macrófagos alveolares (M\Phi alveolares o
A-M\Phi) según sigue. Se recuperaron las células
del líquido de lavado alveolar obtenido del lavado alveolar de
voluntarios sanos, se suspendieron y se adhirieron a plástico,
posteriormente las células no adheridas fueron eliminadas mediante
lavado y las células adheridas restantes fueron denominadas M\Phi
alveolares.
La infección de macrófagos con
VIH-1 fue realizada según sigue. Cepas víricas
dirigidas a macrófagos,
VIH-1_{JR-FL} y
VIH-1_{BAL}, fueron puestas en contacto durante 2
horas con M-M\Phi, GM-M\Phi y
A-M\Phi para su infección (ajustadas a 2,5 x
10^{5}/pocillo, Falcon Nº 3043: Becton Dickinson Labware, Inc.,
EE.UU.) a baja concentración (título del antígeno p24 50 ng/ml,
DICT_{50} = 3000/ml de virus a una concentración final de 100
pg/ml), y los virus que no se habían adsorbido a los macrófagos
fueron eliminados mediante lavado, y se cultivaron sin añadir medio
fresco. En el caso del medio con M-M\Phi, se
añadió M-CSF (10^{4} U/ml) y en el caso del medio
con GM-M\Phi, se añadió GM-CSF
(500 U/ml).
La cantidad de virus utilizada en la infección
por contacto fue ajustada en los presentes experimentos al nivel de
virus en los pacientes en la etapa de portadores, ya que el nivel de
virus del tejido pulmonar en los pacientes en la etapa de portadores
del VIH-1 es desde varias decenas de pg/ml hasta
varios cientos de pg/ml, y el nivel de virus infecciosos en los
M\Phi alveolares es de varias copias en 10^{4}
células^{12)}.
La proliferación del virus fue examinada por las
partículas víricas liberadas en el sobrenadante del cultivo después
de la infección mediante un ELISA de sándwich utilizando dos tipos
de anticuerpos anti-p24 (Nu24 y 10B5^{13)}). Se
utilizaron los JAM62 y JAM65 siguientes como cebadores del gen LTR
(repetición terminal larga del VIH)-gag. Se
utilizaron los JAM63 y JAM64 siguientes como cebadores internos
para la PCR anidada.
JAM62:
- 5'-GCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTG-3'
JAM65:
- 5'-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGCCC-3'
JAM63:
- 5'-GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCC-3'
JAM64:
- 5'-CCGCTTAATACTGACGCTCTCGCAC-3'
La expresión de la proteína tirosina quinasa Hck
y de la proteína factor de transcripción C/EBP\beta en macrófagos
fue examinada después de solubilizar los macrófagos en tampón de
muestra para SDS-PAGE, realizar una electroforesis
en gel de SDS 10%-poliacrilamida, transferir la proteína desde el
gel a una membrana Immobilon P (Millipore Inc., EE.UU.) y comprobar
los anticuerpos contra estas proteínas mediante transferencia
Western. El anticuerpo hacia la proteína tirosina quinasa Hck
(N-30) y el anticuerpo hacia C/EBP\beta
(C-19) fueron adquiridos a Santacluse Inc. (EE.UU.).
La transferencia Western fue detectada mediante el Reactivo ELC de
Amersham (Amersham International plc, Buckinghamshire, R.U.). La
potencia de las bandas fue expresada mediante el valor de la PSL
(luminiscencia fotoestimulante) (A/mm^{2}).
Se utilizaron una sonda oligonucleotídica
antisentido de la proteína Hck y de la proteína C/EBP\beta (AS),
una sonda oligonucleotídica sentido correspondiente a las mismas (S)
y una sonda oligonucleotídica sin sentido que no tenía relación con
la transcripción y la traducción (NS), según sigue:
AS-Hck modificada con
fosforotioato:
- 5'-TTCATCGACCCCATCCTGGC-3'
S-Hck modificada con
fosforotioato:
- 5'-GCCAGGATGGGGTCGATGAA-3'
NS-Hck modificada con
fosforotioato:
- 5'-CCATATTTCCCGCTCGCGTG-3'
AS-C/EBP\beta modificada con
fosforotioato:
- 5'-CAGGCGTTGCATGAACGCGG-3'
S-C/EBP\beta modificada con
fosforotioato:
- 5'-CCGCGTTCATGCAACGCCTG-3'
NS-C/EBP\beta modificada con
fosforotioato:
- 5'-CCAGAGAGGGCCCGTGTGGA-3'
Estas sondas fueron disueltas en medio RPMI1640
sin suero en el que se había disuelto lipofectina (Life Technology
Inc., EE.UU.) a una concentración de 5 \muM, a temperatura
ambiente durante 30 minutos, se añadieron a los macrófagos con medio
RPMI1640 que contenía FCS 10% (concentración final 2 \muM) y se
incubaron a 37ºC durante 24 horas. Posteriormente, las células
fueron lavadas con el medio, se les añadió el medio RPMI1640 que
contenía FCS 10% sin oligonucleótidos, se cultivaron posteriormente
durante 24 horas y posteriormente fueron infectadas con
VIH-1.
La activación de p38MAPK y ERK1/2 fue determinada
utilizando un anticuerpo hacia p38MAPK, un anticuerpo
anti-ERK1/2, un anticuerpo
anti-fosforilación de tirosinas de p38MAPK y un
anticuerpo anti-fosforilación de tirosinas de
ERK1/2 (New England Biolabs Inc., EE.UU.) y se determinó la reacción
de fosforilación de estas moléculas mediante transferencia
Western.
M-M\Phi y
GM-M\Phi fueron infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL} e incubados durante 14 días. La
cantidad de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de los
macrófagos fue detectada a tiempos constantes. Con cualquiera de las
cepas de VIH-1, la proteína p24 fue detectada en el
sobrenadante del cultivo de M-M\Phi [véase la Fig.
1(A) y (B)].
Se observaron cambios morfológicos de
M-M\Phi y GM-M\Phi infectados
con la cepa VIH-1_{JR-FL} y con la
cepa VIH-1_{BAL} de manera dependiente del tiempo.
Se observó la formación de agregados celulares y de fusiones
celulares a partir del 2º día de incubación solamente en los
M-M\Phi que producían virus y se reconoció la
formación de células gigantes multinucleadas a partir de los días
4-7 de cultivo [véase la Fig. 2(A)]. Por otra
parte, en los GM-M\Phi que no generaban virus, no
se observaron cambios morfológicos [véase la Fig. 2(B)].
Estos resultados indicaban que el efecto citopático, tal como la
formación de agregados celulares, la fusión celular y la formación
de MGC en los macrófagos después de la infección por
VIH-1 dirigido a los macrófagos, podría ser
utilizado como un índice para determinar la proliferación del
virus.
M-M\Phi y
GM-M\Phi fueron infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL} y fueron inmunoteñidos con un
anticuerpo hacia p24 el día 8 de la infección. En
M-M\Phi, se observó la expresión de la proteína
p24 en MGC y en las células de su penumbra [véase la Fig.
3(A)]. No se observó expresión de la proteína p24 en
GM-M\Phi [véase la Fig. 3(B)]. Estos
resultados estimaron que el mecanismo de supresión de la producción
de virus en GM-M\Phi podría ser un mecanismo
supresor anterior a las etapas de formación intracelular y gemación
de las partículas víricas.
M-M\Phi y
GM-M\Phi fueron infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL} y se detectó la formación de ADN
vírico el día 2 de la infección mediante PCR anidada utilizando el
cebador LTR-gag. Se detectó formación de ADN vírico
en los M-M\Phi, en los que se reconoció
proliferación del virus, y en los GM-M\Phi, en los
que no se reconoció formación de ADN vírico [véase la Fig.
4(A) y (B)]. Estos resultados indicaban que la infiltración
de virus en las células y la conversión de ARN en ADN ocurría
incluso en GM-M\Phi en los que no se reconoció la
proliferación de virus, mostrando que el mecanismo de supresión de
la formación de virus en GM-M\Phi existe en un
punto posterior a la formación de ADN del virus.
Como los M-M\Phi derivados de
monocitos humanos inducen potentemente la proliferación de
VIH-1 y los GM-M\Phi inhiben la
proliferación del virus, hemos examinado si las diferencias en la
sensibilidad a la infección por VIH-1 dependen o no
de las diferencias en la expresión de las proteínas del huésped.
Como resultado, se demuestra que la expresión de la proteína
tirosina quinasa Hck y de la proteína factor de transcripción
C/EBP\beta son diferentes en ambos macrófagos.
Cuando no había infección vírica, la proteína
tirosina quinasa Hck era altamente expresada en
M-M\Phi y menos expresada en
GM-M\Phi (véase la Fig. 5). Aunque la expresión de
la proteína tirosina quinasa Hck de M-M\Phi estaba
incrementada el día 2 de la infección por la cepa
VIH-1_{BAL}, la expresión de la proteína tirosina
quinasa Hck de GM-M\Phi estaba inversamente
disminuida (véase la Fig. 5). Por otra parte, en la expresión de la
proteína C/EBP\beta sin infección con el virus, se expresaba en
M-M\Phi solamente el tipo de alto peso molecular
(37 kDa), pero se reconoció la expresión de ambas proteínas, la de
tipo de alto peso molecular y la de tipo de bajo peso molecular (23
kDa), en GM-M\Phi (véase la Fig. 6). Aunque no se
reconocieron cambios en la expresión de la proteína C/EBP\beta de
M-M\Phi el día 2 después de la infección con la
cepa VIH-1_{BAL}, la expresión de la proteína
C/EBP\beta de bajo peso molecular estaba incrementada
significativamente en GM-M\Phi, y se habían
inducido cambios en la relación entre el tipo de alto peso molecular
y el tipo de bajo peso molecular (relación L/S) (véase la Fig.
6).
Se demostró que los GM-M\Phi
inducidos por el GM-CSF a partir de monocitos
humanos eran similares en morfología, expresión de marcadores de
superficie, producción de oxígeno activo y expresión de catalasa, a
los macrófagos alveolares humanos^{13),14)}. Nosotros hemos
examinado si lasensibilidad a la infección por
VIH-1 de los GM-M\Phi derivados de
monocitos humanos era similar o no a la de los M\Phi alveolares
humanos.
Después de la infección con la cepa
VIH-1_{BAL} de M\Phi alveolares
(A-M\Phi), se analizó el ADN vírico mediante PCR
anidada y se analizó la proliferación del virus en cuanto a cantidad
de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Se
reconoció ADN vírico en cualquier tiempo analizado después de la
infección [véase la Fig. 7(B)], pero no se reconoció la
detección de proteína p24 ni la producción de virus hacia los 14
días de incubación [véase la Fig. 7(A)].
Como resultado del examen de la expresión de la
proteína tirosina quinasa Hck y de la proteína C/EBP\beta en
M\Phi alveolares mediante transferencia Western, se reconoció una
disminución de la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck y
cambios en la expresión de la isoforma de la proteína C/EBP\beta,
concretamente la expresión de la proteína C/EBP\beta del tipo de
bajo peso molecular (23 kDa) estaba significativamente incrementada
y se reconoció una disminución de la relación L/S (véase la Fig. 8).
Estos resultados sugerían que los mecanismos de supresión de la
producción de virus en los M\Phi alveolares humanos y en los
GM-M\Phi derivados de monocitos humanos podrían
ser sumamente idénticos.
M-M\Phi fueron tratados con el
oligonucleótido antisentido (Hck-AS) contra la
proteína tirosina quinasa Hck durante 24 horas y los
M-M\Phi fueron incubados durante 24 horas más y se
examinó la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck. Como
resultado, la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck estaba
disminuida significativamente en comparación con el grupo control
(L) (véase la Fig. 9). Sin embargo, en los M-M\Phi
tratados con la sonda sentido (Hck-S) o con la sonda
no relacionada (Hck-NS), se reconoció la supresión
de la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck (véase la Fig.
9).
Estos M-M\Phi pretratados con
diferentes oligonucleótidos fueron infectados con la cepa
VIH-1_{BAL} y se comprobó la expresión de la
proteína tirosina quinasa Hck el día 2 después de la infección; se
reconoció una disminución de la expresión de la proteína tirosina
quinasa Hck solamente en el grupo al que se había añadido el
oligonucleótido antisentido (Hck-AS), y no se
reconoció supresión de la expresión de la proteína tirosina quinasa
Hck en los M-M\Phi tratados con la sonda sentido
(Hck-S) o con la sonda no relacionada
(Hck-NS) (véase la Fig. 10). Se detectó una cantidad
de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo los días 4, 7 y 10
después de la infección. En los M-M\Phi tratados
con el antisentido (Hck-AS) se observó a todos los
tiempos una cantidad significativa de proteína p24, pero en los
M-M\Phi tratados con la sonda sentido
(Hck-S) y con la sonda no relacionada
(Hck-NS), se observó un incremento dependiente del
tiempo de la proteína p24 similar al del grupo control tratado
únicamente con lipofectina (L) (véase la Fig. 10). Estos resultados
indicaban que la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck en
M-M\Phi es esencial para la proliferación del
VIH-1.
En GM-M\Phi tratados con el
antisentido frente a C/EBP\beta (C/EBP\beta-AS)
durante 24 horas y cultivados posteriormente durante 24 horas, y en
los GM-M después de dos días de infección con la
cepa VIH-1_{BAL} en dichos
GM-M\Phi, la expresión de la isoforma de alto peso
molecular (37 kDa) se mantenía relativamente, pero la expresión de
la isoforma de bajo peso molecular (23 kDa) estaba
significativamente disminuida, reconociéndose un incremento de la
relación L/S (véase la Fig. 11). Además, la infección por
VIH-1 de GM-M\Phi pretratados con
C/EBP\beta-AS inducía la proliferación del virus y
se observó proteína p24 en el sobrenadante del cultivo (véase la
Fig. 12). El efecto estimulante del crecimiento de
VIH-1 y los cambios en la expresión de C/EBP\beta
no se observaron en los grupos a los que se había añadido
C/EBP\beta-S y C/EBP\beta-NS
(véase la Fig. 11 y la Fig. 12).
De los resultados experimentales anteriores, se
deduce claramente que los M-M\Phi y los
GM-M\Phi derivados de monocitos humanos tienen una
sensibilidad diferente a la infección por el VIH-1
dirigido a macrófagos, y en los M-M\Phi la
proliferación vírica estaba inducida potentemente y, a la inversa,
en los GM-M\Phi la proliferación vírica estaba
suprimida. Además, la diferencia del patrón de proliferación entre
M-M\Phi y GM-M\Phi era idéntica
a la diferencia en la expresión de la isoforma de alto peso
molecular y de la isoforma de bajo peso molecular de la proteína
tirosina quinasa Hck y de la proteína factor de transcripción
C/EBP\beta en estas células. Como resultado de la expresión
específicamente regulada de la isoforma de la proteína tirosina
quinasa Hck y de la proteína C/EBP\beta utilizando el
oligonucleótido antisentido, la producción vírica en
M-M\Phi estaba completamente regulada y, a la
inversa, la producción vírica podía ser inducida en
GM-M\Phi.
A partir de estos resultados, se deduce
claramente que la tirosina quinasa era esencial para la
proliferación del VIH-1 en M-M\Phi
y que la isoforma de C/EBP\beta del tipo de bajo peso molecular
desempeñaba una función importante en la supresión de la
proliferación del VIH-1 en
GM-M\Phi. Además, como los resultados del análisis
de la sensibilidad a la infección por VIH-1 de los
M\Phi alveolares humanos y de la expresión de la proteína tirosina
quinasa Hck y de C/EBP\beta, y como los mecanismos de supresión
del crecimiento de VIH-1 en M\Phi alveolares
humanos y en GM-M\Phi derivados de monocitos
humanos son idénticos, el análisis en GM-M\Phi
podría estar altamente conectado con el análisis de los M\Phi
alveolares in vivo. Los resultados de estos experimentos
indicaban que el análisis del mecanismo de proliferación del
VIH-1 en M-M\Phi derivados de
monocitos humanos era útil como sistema experimental fundamental
para el desarrollo de fármacos con acción supresora del crecimiento
del VIH-1.
Sobre la base de los resultados anteriores,
pueden mencionarse las siguientes sustancias como ejemplos
preferibles de derivados de macrólidos que tienen actividad
supresora de la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck en
M-M\Phi derivados de monocitos humanos y acción
supresora de la activación de p38MAPK, que son necesarias para la
proliferación del virus, y estas sustancias pueden estar fácilmente
disponibles comercialmente o pueden ser fácilmente obtenibles de
acuerdo con el método descrito en las referencias.
Oxaciclotetradecano-2,10-diona,4-[(2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-7,12,13-trihidroxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi]
(Sigma Inc., EE.UU.); de aquí en adelante denominado EM.
11-(1'-hidroxipropil)-3-[2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil]oxi]-5-[(3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilami-
no)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi]-2,4,6,8,11,14-hexametil-10,13,15-tri-oxatriciclo [9.2.1.1.^{9.6}]-pentadecano-1-ona
(véase P. Kurath y col., Experientia, 27, 362, 1971); de aquí en adelante denominado EM201.
no)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi]-2,4,6,8,11,14-hexametil-10,13,15-tri-oxatriciclo [9.2.1.1.^{9.6}]-pentadecano-1-ona
(véase P. Kurath y col., Experientia, 27, 362, 1971); de aquí en adelante denominado EM201.
6,15,16-Trioxatriciclo[10.2.1.11,4]hexadecano,
derivado de eritromicina o
6,9,12-Anhidroeritromicina A (véase P. Kurath y
col., Experientia, 27, 362, 1971); de aquí en adelante denominado
EM202.
4,13-Dioxabiciclo [8.2.1]
tridec-12-en-5-ona,7-[(2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-3-(1,2-dihidroxi-1-metilbutil)-2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi]
(véase
JP-A-7-247299); de aquí en adelante denominado EM703.
JP-A-7-247299); de aquí en adelante denominado EM703.
Oxaciclotetradecano-2,10-diona,4-[(2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-12,13-dihidroxi-7-metoxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi]
(véase S. Morimoto y col., J. Antibiotics, 43, 286, 1990 o el
producto of Apin Chemicals Ltd., R.U. y el producto de Wako Pure
Chemicals, Inc., Japón); de aquí en adelante denominado CAM.
Ejemplos de derivados de eritromicina son:
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM703.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-sulfonil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM727.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-[3'-N-(3-hidroxi-1-propil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM744.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-acetoxietil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM745.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-cianometil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM742.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-fluoroetil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM740.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM721.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-etil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM722.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dietil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM723.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-alil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM724.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dialil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM725.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM728.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM729.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-propil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM730.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3',3'-N,N-dipropil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM731.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-hexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM738.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dihexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM739.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-bencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM732.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dibencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM733.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-(2-propil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM736.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-(10-bromo-1-decanil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM749.
6,9-Hemicetal de la bis-de
(3'-N-metil)-3'-N-acetil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM726.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-piperidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM734.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-pirrolidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM735.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-morfolino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM747.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-dimetilamino)-3'-[hexahidro-1(1H)-azepinil]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM748.
6,9-Hemicetal de la de
(12-hidroxi)-de
[12-(1-hidroxipropil)]-12-hidroxioxima-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM743.
6,9-Hemicetal de la de
[12-(hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM746.
6,9-Hemicetal de la de
(12-hidroxi)-de
[12-(1-hidroxipropil)]-12-amino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM750.
6,9-Hemicetal de la de
(3'-N-metil)-de
[12-(1-hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM751.
6,9-Hemicetal de la de
(3-O-cladinosil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM737 y
6,9-hemicetal de la de
(3-O-cladinosil)-de
(3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina
A o una sal del mismo; de aquí en adelante denominado EM754.
Los diferentes derivados de eritromicina
descritos en la presente anteriormente fueron encontrados por los
presentes inventores, Satoshi Omura y col., y fueron solicitados
como una solicitud de patente internacional, la Publicación
Internacional WO 02/14338A1, incluyendo pseudoeritromicina, que se
espera que sea el nuevo agente antiinflamatorio. En la
especificación de WO 02/14338A1, se describen con detalle los
métodos sintéticos y las estructuras químicas de los derivados de
eritromicina, y en la presente, a continuación, se explican a
grandes rasgos los métodos sintéticos de cada derivado de
eritromicina.
Una solución de eritromicina (12,4 g) en ácido
acético glacial fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas,
se le añadió lentamente hidrógeno carbonato de sodio acuoso y se
neutralizó. La mezcla de reacción fue extraída con cloroformo, se
deshidrató la capa orgánica con mirabilita, se eliminó la mirabilita
por filtración y se retiró el solvente por destilación para obtener
una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow 10:1:0,05) para obtener EM201
(7,7 g). Posteriormente, se añadió carbonato de potasio (1,4 g) a
la solución en metanol de EM201 (7,6 g) y se sometió a reflujo
durante 2 horas. Después de eliminar el solvente por destilación, el
residuo fue disuelto en hidrógeno carbonato de sodio acuoso y
extraído con cloroformo. La mezcla fue deshidratada con mirabilita,
se filtró y se eliminó la mirabilita, posteriormente la sustancia
bruta obtenida fue purificada mediante cromatografía en columna de
gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01
\rightarrow 10:1:0,05) para obtener EM701 (5,9 g, polvo
blanco).
Acetato de sodio (3,9 g) y yodo (2,5 g) fueron
añadidos, en este orden, a una solución de EM701 (6,9 g) en metanol
(52,0 ml)-agua (13,0 ml) a temperatura ambiente y se
agitó a 50ºC durante 3 horas. Durante la agitación se añadió una
solución acuosa 1 N de hidróxido de sodio con el fin de mantener
continuamente el pH a 8-9. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con amonio acuoso (7,5 ml)-agua (200 ml) y
extraída con diclorometano. Después de deshidratar la capa orgánica
con mirabilita, la mirabilita fue retirada por filtración y el
solvente fue eliminado por destilación para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
10:0,5:0,01 \rightarrow 10:1:0,05) para obtener EM703 (4,8 g,
polvo blanco).
Se añadió sodio (4,5 g) a metanol (15 ml) con el
fin de preparar una solución de metóxido de sodio en metanol, y se
añadieron EM703 (195,4 mg) y yodo (353,6 mg), en este orden, a 0ºC y
se agitaron durante 3 horas. Después de confirmar la finalización de
la reacción mediante TLC, se añadieron tiosulfato de sodio (0,8 g),
amonio acuoso (0,5 ml) y agua (80 ml) y se sometió a extracción con
diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la adición
de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el
solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue
purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM721 (166,3 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (26,6 \mul) y yoduro de
etilo (12,2 \mul) a una solución de EM721 (21,0 mg) en
dimetilformamida (1,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante
4 horas. Después de confirmar la finalización de la reacción
mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída
con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la
adición de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se
eliminó el solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia
bruta fue purificada mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM722 (7,0 mg, polvo blanco).
A una solución de EM721 (21,0 mg) en
dimetilformamida (1,0 ml) se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (26,6 \mul) y yoduro de
etilo (12,2 \mul) y se agitó a temperatura ambiente durante 4
horas. Después de confirmar la finalización de la reacción mediante
TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída con
diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la adición
de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el
solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue
purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM723 (10,3 mg, polvo blanco).
Se añadió bromuro de alilo (148,3 \mul) a una
solución en diclorometano (5,7 ml) de EM721 (117,8 mg) y
N,N-diisopropiletilamina (298,6 \mul) a 0ºC y se
agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de confirmar
la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción
fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica
fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM724 (21,9 mg, polvo blanco).
Se añadió bromuro de alilo (148,3 \mul) a una
solución en diclorometano (5,7 ml) de EM721 (117,8 mg) y
N,N-diisopropiletilamina (298,6 \mul) a 0ºC y se
agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de confirmar
la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción
fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica
fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM725 (64,3 mg, polvo blanco).
\newpage
Se añadió anhídrido acético (8,4 \mul) a una
solución de EM721 (34,8 mg) en diclorometano (1,6 ml) a 0ºC, se
agitó durante 10 minutos y posteriormente se agitó a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Después de confirmar la finalización de
la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua
y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol = 100:1 \rightarrow
20:1) para obtener EM726 (33,4 mg, polvo blanco).
A una solución de EM703 (87,6 mg) en
diclorometano (4,2 ml) se añadió cloruro de metanosulfonilo (9,3
\mul) a 0ºC y se agitó durante 3 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol =
100:1 \rightarrow 20:1) para obtener EM727 (37,2 mg, polvo
blanco).
Se añadió 3-bromopropino (137,8
\mul) a una solución de EM721 (106,3 mg) y
N,N-diisopropiletilamina (269,3 \mul) en
diclorometano (5,2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas. Después de confirmar la finalización de la reacción mediante
TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída con
diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la adición
de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el
solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue
purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM728 (41,3 mg, polvo blanco).
Se añadió 3-bromopropino (137,8
\mul) a una solución de EM721 (106,3 mg) y
N,N-diisopropiletilamina (269,3 \mul) en
diclorometano (5,2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas. Después de confirmar la finalización de la reacción mediante
TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída con
diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la adición
de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el
solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue
purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM729 (27,9 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (59,6 \mul) y
1-yodopropino (33,3 \mul), en este orden, a una
solución de EM721 (23,5 mg) en acetonitrilo (2,3 ml) y se sometió a
reflujo a 80ºC durante 20 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM730 (5,7 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (59,6 \mul) y
1-yodopropino (33,3 \mul), en este orden, a una
solución de EM721 (23,5 mg) en acetonitrilo (2,3 ml) y se sometió a
reflujo a 80ºC durante 20 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM731 (12,0 mg, polvo blanco).
Se añadió cloruro de bencilo (297,3 \mul) a una
solución en diclorometano (4,3 ml) de EM721 (88,8 mg) y
N,N-diisopropiletilamina (450,1 \mul) a
temperatura ambiente y se agitó durante 96 horas. Después de
confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de
reacción fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa
orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM732
(49,9 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (135,9 \mul) y cloruro de
bencilo (89,7 \mul), en este orden, a una solución de EM721 (26,8
mg) en acetonitrilo (1,3 ml) y se sometió a reflujo a 80ºC durante
60 horas. Después de confirmar la finalización de la reacción
mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída
con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la
adición de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se
eliminó el solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia
bruta fue purificada mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 20:1:0,1) para obtener
EM733 (19,6 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (42,5 \mul) y
1,5-dibromopentano (33,2 \mul), en este orden, a
una solución de EM721 (16,8 mg) en acetonitrilo (4,9 ml) y se
sometió a reflujo a 80ºC durante 24 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM734 (13,3 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (40,2 \mul) y
1,4-dibromobutano (27,6 \mul), en este orden, a
una solución de EM721 (15,9 mg) en acetonitrilo (4,6 ml) y se
sometió a reflujo a 80ºC durante 24 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 10:1:0,1) para obtener EM735 (11,9 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (459,2 \mul) y
2-bromopropano (247,5 \mul), en este orden, a una
solución de EM721 (90,6 mg) en acetonitrilo (4,4 ml) y se sometió
areflujo a 80ºC durante 72 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 10:1:0,1) para obtener EM736 (25,3 mg, polvo blanco). La
materia prima EM721 fue recuperada, 47,1 mg.
Se añadió ácido p-toluensulfónico
monohidrato (80,3 mg) a una solución de EM701 (201,6 mg) en
dimetilformamida (5,6 ml) y se agitó a 50ºC durante 8 horas. Después
de confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla
de reacción fue diluida con agua, se ajustó a pH 8,0 mediante la
adición de hidrógeno carbonato de sodio acuoso saturado y se extrajo
con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la
adición de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se
eliminó el solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia
bruta fue purificada mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 20:1:0,1) para obtener
EM737 (84,7 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (408,5 \mul) y
1-bromohexano (328,7 \mul), en este orden, a una
solución de EM721 (80,6 mg) en acetonitrilo (3,9 ml) y se agitó a
60ºC durante 24 horas. Después de confirmar la finalización de la
reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y
extraída con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
15:1:0,1) para obtener EM738 (33,7 mg, polvo blanco). La materia
prima EM721 fue recuperada, 24,6 mg.
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (116,0 \mul) y
1-bromohexano (93,6 \mul), en este orden, a una
solución de EM721 (22,9 mg) en acetonitrilo (1,1 ml) y se agitó a
60ºC durante 72 horas. Después de confirmar la finalización de la
reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y
extraída con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
20:1:0,1) para obtener EM739 (20,1 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (347,7 \mul) y
1-bromo-2-flúor-etano
(148,6 \mul) a una solución de EM703 (70,0 mg) en dimetilformamida
(3,3 ml) a temperatura ambiente y se agitó durante 48 horas. Después
de confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla
de reacción fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La
capa orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 20:1:0,1) para obtener EM740
(36,0 mg, polvo blanco). La materia prima EM703 fue recuperada, 25,5
mg.
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (320,9 \mul) y
bromoacetonitrilo (128,3 \mul) a una solución de EM703 (64,6 mg)
en dimetilformamida (3,1 ml) a temperatura ambiente y se agitó
durante 4 horas. Después de confirmar la finalización de la reacción
mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída
con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la
adición de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se
eliminó el solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia
bruta fue purificada mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 20:1:0,1) para obtener
EM742 (53,1 mg, polvo blanco).
Se añadió tetraacetato de plomo (508,0 mg) a una
solución de EM701 (508,0 mg) en diclorometano (24,0 ml) y se agitó a
temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con solución salina saturada-hidrógeno
carbonato de sodio acuoso saturado (1:1, v/v) y se sometió a
extracción con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
10:0,5:0,01) para obtener EM705 (282,7 mg, polvo blanco).
Se añadió lentamente piridina (0,9 ml) a 0ºC a
una solución de EM705 (116,5 mg) y clorhidrato de hidroxilamina
(32,0 mg) en etanol (0,9 ml) y se agitó durante 3 horas. Después de
confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de
reacción fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa
orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:0,5:0,01 \rightarrow
10:1:0,05) para obtener EM743 (114,5 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (338,3 \mul) y
3-bromo-1-propanol
(175,6 \mul) a una solución de EM703 (68,1 mg) en dimetilformamida
(3,3 ml) a temperatura ambiente y se agitó durante 48 horas. Después
de confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla
de reacción fue diluida con agua y extraída con diclorometano. La
capa orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM744
(27,7 mg, polvo blanco). La materia prima EM703 fue recuperada, 22,5
mg.
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (106,8 \mul) y acetato de
2-bromoetilo (67,6 \mul) a una solución de EM703
(21,5 mg) en dimetilformamida (1,0 ml) a temperatura ambiente y se
agitó durante 48 horas. Después de confirmar la finalización de la
reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y
extraída con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
20:1:0,1) para obtener EM745 (6,0 mg, polvo blanco).
Se añadió borohidruro de sodio (21,8 mg) a una
solución de EM705 (37,7 mg) en metanol (2,9 ml) a -78ºC y se agitó
durante 30 minutos. La temperatura de la mezcla de reacción fue
incrementada hasta 0ºC y se agitó adicionalmente durante 30 minutos.
Después de confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la
reacción fue terminada mediante la adición de acetona (0,5 ml). La
mezcla de reacción fue diluida con agua y extraída con
diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la adición
de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el
solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue
purificada mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM746
(35,8 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (45,8 \mul) y
bis(2-bromoetil)éter (33,1 \mul), en este
orden, a una solución de EM721 (18,1 mg) en acetonitrilo (2,6 ml) y
se agitó a 80ºC durante 24 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 20:1:0,1) para obtener EM747 (12,0 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (49,5 \mul) y
1,6-dibromohexano (43,6 \mul), en este orden, a
una solución de EM721 (19,5 mg) en acetonitrilo (2,8 ml) y se agitó
a 80ºC durante 24 horas. Después de confirmar la finalización de la
reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue diluida con agua y
extraída con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
20:1:0,1) para obtener EM748 (11,7 mg, polvo blanco).
Se añadieron
N,N-diisopropiletilamina (45,6 \mul) y
1,10-dibromodecano (58,9 \mul), en este orden, a
una solución de EM721 (18,0 mg) en acetonitrilo (2,6 ml) y se
sometió a reflujo a 80ºC durante 36 horas. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con agua y extraída con diclorometano. La capa orgánica fue
deshidratada mediante la adición de mirabilita, se filtró para
eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una
sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio
acuoso = 20:1:0,1) para obtener EM749 (14,9 mg, polvo blanco).
Se añadieron óxido de molibdeno (IV) (10,0 mg) y
borohidruro de sodio (10,5 mg) a una solución de EM743 (15,5 mg) en
etanol (2,3 ml) a 0ºC y se agitó durante 4 horas. Después de
confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la reacción
fue terminada mediante la adición de acetona (0,5 ml), y la mezcla
de reacción fue diluida con solución salina
saturada-hidrógeno carbonato de sodio acuoso
saturado (1:1, v/v) y se sometió a extracción con diclorometano. La
capa orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol:amonio acuoso = 10:1:0,1) para obtener EM750
(13,4 mg, polvo blanco).
Se añadió tetraacetato de plomo (508,0 mg) a una
solución de EM701 (508,0 mg) en diclorometano (24,0 ml) y se agitó a
temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de confirmar la
finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla de reacción fue
diluida con solución salina saturada-hidrógeno
carbonato de sodio acuoso saturado (1:1, v/v) y se sometió a
extracción con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada
mediante la adición de mirabilita, se filtró para eliminar la
mirabilita y se eliminó el solvente para obtener una sustancia
bruta. La sustancia bruta fue purificada mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso =
10:0,5:0,01) para obtener EM706 (71,6 mg, polvo blanco).
Se añadió borohidruro de sodio (22,9 mg) a una
solución de EM706 (38,8 mg) en metanol (3,0 ml) a 0ºC y agitó
durante 1 hora. Después de confirmar la finalización de la reacción
mediante TLC, la reacción fue terminada mediante la adición de
acetona (0,5 ml) y la mezcla de reacción fue diluida con solución
salina saturada-hidrógeno carbonato de sodio acuoso
saturado (1:1, v/v) y se sometió a extracción con diclorometano. La
capa orgánica fue deshidratada mediante la adición de mirabilita, se
filtró para eliminar la mirabilita y se eliminó el solvente para
obtener una sustancia bruta. La sustancia bruta fue purificada
mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(cloroformo:metanol: amonio acuoso = 15:1:0,1) para obtener EM751
(31,4 mg, polvo blanco).
Se añadió ácido p-toluensulfónico
monohidrato (53,9 mg) a una solución de EM703 (132,4 mg) en
dimetilformamida (3,8 ml) y se agitó a 50ºC durante 6 horas. Después
de confirmar la finalización de la reacción mediante TLC, la mezcla
de reacción fue diluida con agua, se ajustó a pH 8,0 mediante la
adición de hidrógeno carbonato de sodio acuoso saturado y se extrajo
con diclorometano. La capa orgánica fue deshidratada mediante la
adición de mirabilita, se filtró para eliminar la mirabilita y se
eliminó el solvente para obtener una sustancia bruta. La sustancia
bruta fue purificada mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (cloroformo:metanol:amonio acuoso = 15:1:0,1) para obtener
EM754 (50,2 mg, polvo blanco).
La Fig. 1(A) muestra la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de
M-M\Phi y GM-M\Phi infectados
con la cepa VIH-1_{JR-FL} y (B)
muestra la cantidad de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo
de M-M\Phi y GM-M\Phi infectados
con la cepa VIH-1_{BAL}.
La Fig. 2(A) muestra la citopatía de
M-M\Phi infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL}, y (B) muestra la citopatía de
GM-M\Phi infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 3(A) muestra la distribución
intracelular de la proteína p24 en M-M\Phi
infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL}, y (B) muestra la distribución
intracelular de la proteína p24 en GM-M\Phi
infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 4(A) muestra la detección de ADN
vírico en M-M\Phi y GM-M\Phi
infectados con la cepa
VIH-1_{JR-FL} y (B) muestra la
detección de ADN vírico en M-M\Phi y
GM-M\Phi infectados con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 5 muestra los cambios en la expresión de
la proteína tirosina quinasa Hck en M-M\Phi y
GM-M\Phi y la expresión por infección con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 6 muestra los cambios de la expresión de
la proteína C/EBP\beta en M-M\Phi y en
GM-M\Phi y la expresión por
M-M\Phi y GM-M\Phi infectados
con la cepa VIH-1_{BAL}.
La Fig. 7(A) muestra la respuesta de
crecimiento del VIH-1 mediante la detección de la
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo después de la infección
por la cepa VIH-1_{BAL} en M\Phi alveolares
humanos (A-M\Phi) y (B) muestra la detección de
ADN vírico.
La Fig. 8 muestra los cambios de la expresión de
la proteína tirosina quinasa Hck y de la proteína C/EBP\beta en
M\Phi alveolares y la expresión por la infección con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 9 muestra la expresión de la proteína Hck
en M-M\Phi tratados con un oligonucleótido
antisentido para la proteína tirosina quinasa Hck antes y después de
la infección con la cepa VIH-1_{BAL}.
La Fig. 10 muestra la supresión de la
proliferación de VIH-1 en M-M\Phi
tratados con el oligonucleótido antisentido para la proteína
tirosina quinasa Hck.
La Fig. 11 muestra la expresión de la proteína
C/EBP\beta en GM-M\Phi tratados con el
oligonucleótido antisentido para la proteína C/EBP\beta antes y
después de la infección con la cepa
VIH-1_{BAL}.
La Fig. 12 muestra la proliferación de
VIH-1 en GM-M\Phi tratados con el
oligonucleótido antisentido para la proteína C/EBP\beta.
La Fig. 13 muestra el efecto de derivados de
macrólidos sobre la proliferación del VIH-1 en
M-M\Phi a los que se había añadido un derivado de
macrólido tal como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, en comparación con
la adición de DMSO.
La Fig. 14 muestra el efecto de derivados de
macrólidos sobre la proliferación del VIH-1 en
GM-M\Phi a los que se había añadido un derivado de
macrólido tal como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, en comparación con
la adición de DMSO.
La Fig. 15 muestra el efecto de derivados de
macrólidos sobre la proliferación del VIH-1 en
M-M\Phi preparados a partir de diferentes humanos
(tres sujetos) a los que se había añadido un derivado de macrólido
tal como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, en comparación con la
adición de DMSO.
La Fig. 16 muestra el efecto de la concentración
de macrólidos tales como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM sobre la
proliferación del VIH-1 en
M-M\Phi, en comparación con la adición de
DMSO.
La Fig. 17 muestra el efecto de los derivados de
macrólidos sobre la citopatía de M-M\Phi
infectados con VIH-1 a los que se había añadido EM,
EM201, EM202, EM703 o CAM, en comparación con la adición de
DMSO.
La Fig. 18 muestra el efecto de derivados de
macrólidos tales como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, sobre la
expresión de la proteína tirosina quinasa Hck en
M-M\Phi infectados con VIH-1.
La Fig. 19(A) muestra el efecto de
derivados de macrólidos tales como EM, EM201, EM202, EM703 o CAM,
sobre la activación de p38MAPK de M-M\Phi
infectados con VIH-1, en comparación con DMSO, y (B)
muestra el efecto de derivados de macrólidos tales como EM, EM201,
EM202, EM703 o CAM, sobre la activación de ERK1/2 de
M-M\Phi infectados con VIH-1, en
comparación con DMSO.
La Fig. 20 muestra el efecto del inhibidor de
p38MAPK (SB203580) y del inhibidor de ERK1/2 (PD98059) sobre la
proliferación de virus en M-M\Phi infectados con
la cepa VIH-1_{BAL} en comparación con un grupo
control.
La Fig. 21 muestra el efecto de varias
concentraciones de macrólidos tales como EM722, EM730, EM732 o
EM736, sobre la proliferación de VIH-1 en
M-M\Phi en comparación con DMSO.
La Fig. 22 muestra el efecto de varias
concentraciones de macrólidos tales como EM734, EM735, EM747 o
EM748, sobre la proliferación de VIH-1 en
M-M\Phi en comparación con DMSO.
La Fig. 23 muestra el efecto de varias
concentraciones de un macrólido tal como EM743 sobre la
proliferación de VIH-1 en M-M\Phi
en comparación con DMSO.
La Fig. 24 muestra el efecto de varias
concentraciones de macrólidos tales como EM746, EM750 o EM751, sobre
la proliferación de VIH-1 en
M-M\Phi en comparación con DMSO.
La Fig. 25 muestra el efecto de varias
concentraciones de un macrólido tal como EM754 sobre la
proliferación de VIH-1 en M-M\Phi
en comparación con DMSO.
La presente invención será explicada de manera
concreta con los ejemplos siguientes, pero no está limitada por
estos ejemplos.
Con el fin de mostrar el efecto supresor del
crecimiento de la presente invención, entre los derivados de
macrólidos, EM, EM201, EM202, EM703, CAM, EM722, EM730, EM732,
EM736, EM734, EM735, EM747, EM748, EM743, EM746, EM750 o EM751,
fueron disueltos en DMSO a una concentración de 100 mM cada uno, y
utilizados posteriormente diluidos con el medio. El grupo control
eran M-M\Phi tratados solamente con el DMSO
utilizado para disolver los derivados de macrólidos.
M-M\Phi y
GM-M\Phi fueron sometidos a infección por contacto
con la cepa VIH-1_{BAL} durante 2 horas, se añadió
una concentración 30 \muM de EM, EM201, EM202, EM703, CAM, EM722,
EM730, EM732, EM736, EM734, EM735, EM747, EM748, EM743, EM746, EM750
o EM751, se incubó durante 14 días y se analizó la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de manera dependiente
del tiempo.
En comparación con el grupo control (DMSO), en
los M-M\Phi a los que se había añadido EM201 o
EM703, no se detectó casi p24 y la generación de virus estaba
potentemente suprimida a los 14 días del cultivo (véase la Fig. 13).
En M-M\Phi a los que se había añadido CAM, se
observó una supresión de 1/2 aproximadamente, pero en el grupo al
que se había añadido EM o EM202 se reconoció una supresión de la
generación de virus, aunque no tan potente en comparación con EM201
y EM703 (véase la Fig. 13). En GM-M\Phi, en el
grupo al que se había añadido EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, no se
reconoció prácticamente generación de virus en todos los puntos de
ensayo similares a los del grupo control (DMSO) (véase la Fig. 14).
En el experimento en el que se utilizaron M-M\Phi
derivados de monocitos humanos recogidos de tres voluntarios humanos
adultos, se obtuvieron los mismos resultados que los mostrados en la
Fig. 13 (véase la Fig. 15).
La acción supresora de EM201 y EM703 sobre
VIH-1_{BAL} en M-M\Phi es
dependiente de la concentración e inhibían completamente la
generación de virus a 3 \muM o más (véase la Fig. 16). Aunque se
observó proliferación del virus a 300 \muM no solamente con EM201
y EM703, sino también con EM, EM202 y CAM, como se observó en el
grupo control (DMSO), podría ser debido a la citotoxicidad del DMSO
utilizado para disolver los agentes, los experimentos siguientes se
llevaron a cabo a 30 \muM.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se les añadió una concentración de 30 \muM de EM,
EM201, EM202, EM703 o CAM, se incubaron y se observó la morfología
celular. En el grupo control (DMSO) y en el grupo al que se había
añadido EM, EM202 o CAM, se reconoció ligeramente la formación de
MGC de acuerdo con un incremento de la cantidad de proteína p24
según se mostró en el Ejemplo 1, pero en los grupos a los que se
había añadido EM201 y EM703, no se observó efecto citopático tal
como la formación de MGC (véase la Fig. 17).
Según se describió previamente, los
M-M\Phi expresaban potentemente la proteína
tirosina quinasa Hck, y la regulación de la expresión de la proteína
tirosina quinasa Hck utilizando oligonucleótidos antisentido podía
suprimir la proliferación de VIH-1 en
M-M\Phi. Este resultado indicaba que la expresión
de la proteína tirosina quinasa Hck era esencial para la
proliferación de VIH-1 en M-M\Phi.
Como EM201 y EM703 suprimían la proliferación del
VIH-1 en M-M\Phi, se sugirió que
la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck estaba suprimida
en M-M\Phi tratados con estos agentes.
Por consiguiente, M-M\Phi
fueron sometidos a infección por contacto con la cepa
VIH-1_{BAL} durante 2 horas, se añadió una
concentración de 30 \muM de EM, EM201, EM202, EM703 o CAM, se
incubó y se observó la expresión de la proteína tirosina quinasa Hck
el día 2 después de la infección mediante transferencia Western. En
el grupo de EM, EM202 y CAM, que no presentaban una acción supresora
de la proliferación vírica tan potente, se observó la supresión de
la proteína tirosina quinasa Hck, aunque no tan potente, en
comparación con el grupo control (tratado solamente con DMSO) (véase
la Fig. 18). Con EM201 y EM703, que mostraban una potente acción
supresora de la proliferación vírica, la expresión de la proteína
tirosina quinasa Hck estaba fuertemente suprimida (véase la Fig.
18).
Las p38MAPK y ERK1/2 (p42/44MAPK) están
implicadas en varias respuestas en el mecanismo de transducción de
señales intracelulares. La fosforilación de tirosinas de p38MAPK y
ERK1/2 en M-M\Phi infectados con la cepa
VIH-1_{BAL} fue examinada mediante transferencia
Western. Como resultado, la fosforilación de tirosinas de p38MAPK
era potentemente inducida por la infección vírica, pero la
fosforilación de tirosinas de ERK1/2 era débil. Estos resultados
indicaban que la activación de p38MAPK era importante para la
proliferación vírica en M-M\Phi.
Por consiguiente, se examinó el efecto de EM,
EM201, EM202, EM703 y CAM, que tienen acción supresora de la
proliferación vírica en M-M\Phi, sobre la
activación de p38MAPK y ERK1/2.
Se añadió una concentración 30 \muM de EM,
EM201, EM202, EM703 o CAM a M-M\Phi infectados con
la cepa VIH-1_{BAL}, se detectó fosforilación de
tirosinas de p38MAPK el día 2 del cultivo mediante transferencia
Western. En el grupo al que se añadió EM, EM202 y CAM, en los que la
acción supresora de la proliferación vírica no era tan potente, se
observó que la fosforilación de tirosinas de p38MAPK disminuía,
aunque no tan potentemente en comparación con el grupo control
(DMSO). En el grupo al que se añadió EM201 y EM703, que suprimían
potentemente la proliferación vírica, la fosforilación de tirosinas
de p38MAPK estaba significativamente disminuida [véase la Fig.
19(A)]. En todos los grupos la cantidad total de p38MAPK
(suma total de p38MAPK fosforilada y no fosforilada) era la misma.
Estos resultados sugerían que la supresión de la proliferación
vírica en M-M\Phi por EM, EM201, EM202, EM703 y
CAM estaba implicada en la supresión de p38MAPK.
Por otra parte, en el grupo al que se añadió EM,
EM202 y CAM, que no tenían una acción supresora de la proliferación
vírica tan potente, la fosforilación de tirosinas de ERK1/2 se
observó débilmente igual que en el grupo control (DMSO), pero en el
grupo al que se añadió EM201 y EM703, que mostraban una potente
acción supresora de la proliferación vírica, se observó una
estimulación de la fosforilación de tirosinas de ERK1/2. En todos
los grupos la cantidad total de ERL1/2 (suma total de ERK1/2
fosforilada y no fosforilada) era la misma [véase la Fig.
19(B)].
19(B)].
A partir de los resultados del Ejemplo 4, se
sugirió que la activación de p38MAPK era importante para la
proliferación del VIH-1 en M-M\Phi
y que la acción supresora de la proliferación del
VIH-1 de EM, EM201, EM202, EM703 y CAM estaba
causada por la acción supresora de estas sustancias sobre la
activación de p38MAPK.
Por consiguiente, se añadió un inhibidor de
p38MAPK, SB203580,
(4-[4-fluorofenil]-2-[4-metilsulfinilfenil]-5-[4-piridil]-1H-imidazol)
y un inhibidor de ERK1/2, PD98059,
(2-[2-amino-3-metoxifenil]-4H-1-benzopiran-4-ona),
a una concentración de 10 \muM, a M-M\Phi
infectados con la cepa VIH-1_{BAL} y se examinó
su efecto sobre los virus.
Cuando se añadió SB203580, 10 \muM, a
M-M\Phi infectados con la cepa
VIH-1_{BAL} y se incubó, no se detectó casi
proteína p24 ni siquiera el día 14, y se inhibió la proliferación
del virus (véase la Fig. 20). Por otra parte, cuando se añadió el
inhibidor de ERK1/2, PD98059, 10 \muM, la cantidad de proteína p24
no era diferente de la del grupo control y se observó proliferación
vírica (véase la Fig. 20). A partir de estos resultados
experimentales, la proliferación de la cepa de VIH-1
dirigida a macrófagos en M-M\Phi requería
esencialmente la activación de p38MAPK, y se creyó que la
implicación de ERK1/2 era baja.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se añadieron varias concentraciones de EM722,
EM730, EM732 o EM736, se incubaron durante 10 días y se analizó la
cantidad de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de manera
dependiente del tiempo. Un grupo tratado solamente con el DMSO
utilizado para disolver los derivados de macrólidos es establecido
como grupo control.
Se observó un incremento de la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo del grupo control al que
se había añadido solamente DMSO, dependiente del transcurso de los
días de cultivo, y se observó proliferación de
VIH-1. Sin embargo, en comparación con el grupo
control, en los grupos a los que se había añadido EM722, EM730,
EM732 o EM736, la producción de la proteína p24 era suprimida
dependiendo de la concentración del agente, y se observó supresión
de la producción de virus. Especialmente, a la concentración de 30
\muM, se reconoció que cualquiera de los agentes EM722, EM730,
EM732 y EM736 inhibía casi completamente la producción de virus
(véase la Fig. 21). Con los agentes EM703, EM727, EM744, EM745,
EM742, EM740, EM721, EM723, EM724, EM725, EM728, EM729, EM731,
EM738, EM739, EM733, EM749 y EM726, se obtuvieron resultados
similares a los de la Fig. 21. Además, en el experimento que utilizó
M-M\Phi derivados de monocitos humanos recogidos
de tres voluntarios adultos sanos, se obtuvieron los mismos
resultados que en la Fig. 21.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se añadieron varias concentraciones de EM734,
EM735, EM747 y EM748, se incubaron durante 10 días y se analizó la
cantidad de proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de manera
dependiente del tiempo. Un grupo tratado solamente con el DMSO
utilizado para disolver los derivados de macrólidos es establecido
como grupo control.
Se observó un incremento de la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo del grupo control al que
se había añadido solamente DMSO, dependiente del transcurso de los
días de cultivo, y se observó proliferación de
VIH-1. Sin embargo, en comparación con el grupo
control, en los grupos a los que se había añadido EM734, EM735,
EM747 y EM748, la producción de la proteína p24 era suprimida
dependiendo de la concentración del agente, y se observó supresión
de la producción de virus. Especialmente, a la concentración de 30
\muM, se reconoció que cualquiera de los agentes EM734, EM735,
EM747 y EM748 inhibía casi completamente la producción de virus
(véase la Fig. 22). Además, en el experimento que utilizó
M-M\Phi derivados de monocitos humanos recogidos
de tres voluntarios adultos sanos, se obtuvieron los mismos
resultados que en la Fig. 22.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se añadieron varias concentraciones de EM743, se
incubaron durante 10 días y se analizó la cantidad de proteína p24
en el sobrenadante del cultivo de manera dependiente del tiempo. Un
grupo tratado solamente con el DMSO utilizado para disolver los
derivados de macrólidos es establecido como grupo control.
Se observó un incremento de la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo del grupo control al que
se había añadido solamente DMSO, dependiente del transcurso de los
días de cultivo, y se observó proliferación de
VIH-1. Sin embargo, en comparación con el grupo
control, en los grupos a los que se había añadido EM743, la
producción de la proteína p24 era suprimida dependiendo de la
concentración del agente, y se observó supresión de la producción de
virus. Especialmente, a la concentración de 30 \muM, se reconoció
que EM743 inhibía casi completamente la producción de virus (véase
la Fig. 23). Además, en el experimento que utilizó
M-M\Phi derivados de monocitos humanos recogidos
de tres voluntarios adultos sanos, se obtuvo el mismo resultado que
en la Fig. 23.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se añadieron varias concentraciones de EM746, EM750
y EM751, se incubaron durante 10 días y se analizó la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo de manera dependiente
del tiempo. Un grupo tratado solamente con el DMSO utilizado para
disolver los derivados de macrólidos es establecido como grupo
control.
Se observó un incremento de la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo del grupo control al que
se había añadido solamente DMSO, dependiente del transcurso de los
días de cultivo, y se observó proliferación de
VIH-1. Sin embargo, en comparación con el grupo
control, en los grupos a los que se había añadido EM746, EM750 y
EM751, la producción de la proteína p24 era suprimida dependiendo de
la concentración del agente, y se observó supresión de la producción
de virus. Especialmente, a la concentración de 30 \muM, se
reconoció que cualquiera de los agentes EM746, EM750 y EM751 inhibía
casi completamente la producción de virus (véase la Fig. 24).
Además, en el experimento que utilizó M-M\Phi
derivados de monocitos humanos recogidos de tres voluntarios adultos
sanos, se obtuvieron los mismos resultados que en la Fig. 24.
M-M\Phi fueron sometidos a
infección por contacto con la cepa VIH-1_{BAL}
durante 2 horas, se añadieron varias concentraciones de EM754, se
incubaron durante 10 días y se analizó la cantidad de proteína p24
en el sobrenadante del cultivo de manera dependiente del tiempo. Un
grupo tratado solamente con el DMSO utilizado para disolver los
derivados de macrólidos es establecido como grupo control.
Se observó un incremento de la cantidad de
proteína p24 en el sobrenadante del cultivo del grupo control al que
se había añadido solamente DMSO, dependiente del transcurso de los
días de cultivo, y se observó proliferación de
VIH-1. Sin embargo, en comparación con el grupo
control, en los grupos a los que se había añadido EM754, la
producción de la proteína p24 era suprimida dependiendo de la
concentración del agente, y se observó supresión de la producción de
virus. Especialmente, a la concentración de 30 \muM, se reconoció
que EM754 inhibía casi completamente la producción de virus (véase
la Fig. 25). Además, en el experimento que utilizó
M-M\Phi derivados de monocitos humanos recogidos
de tres voluntarios adultos sanos, se obtuvo el mismo resultado que
en la Fig. 25.
Según se describió en la presente anteriormente,
se reconoció que los derivados de macrólidos utilizados en la
presente invención tenían acción supresora sobre la proliferación de
VIH-1 dirigido a macrófagos en
M-M\Phi derivados de monocitos humanos.
Especialmente, EM201 y EM703, que se reconoció que tenían una
potente acción inhibidora de la proliferación de
VIH-1 dirigidos a macrófagos en
M-M\Phi, inhibían casi completamente la
proliferación del virus incluso a una concentración de 3 \muM. Se
reconoció que la acción supresora de EM201 y EM703 sobre la
proliferación del virus presentaba un efecto supresor suficiente,
del 95% o mayor, incluso el día 14 después de incubación, mediante
la adición solamente de EM201 o EM703 en el medio de cultivo
primario después de la infección por contacto con el virus.
Además, EM, EM202 y CAM mostraban también
supresión de la producción vírica dependiendo de la concentración
del fármaco, y la misma acción supresora fue reconocida para EM722,
EM730, EM732, EM736, EM734, EM735, EM747, EM748, EM743, EM746,
EM750, EM751 y EM754, a una concentración de 30 \muM para una
inhibición casi completa. A partir de este hecho, se reconoció que
la acción supresora estaba implicada en las propiedades
farmacológicas de los macrólidos que presentaban acumulación en los
macrófagos tisulares con una acción de larga duración.
Según se describió previamente, la expresión de
la proteína tirosina quinasa Hck era esencial para la proliferación
del VIH-1 en M-M\Phi, y como
varios derivados de macrólidos de la presente invención suprimían la
expresión de la proteína tirosina quinasa Hck en
M-M\Phi, se sugirió que esta acción supresora era
uno de los mecanismos de acción de la acción supresora de estas
sustancias sobre la proliferación del VIH-1. Además,
como varios derivados de macrólidos de la presente invención, que
muestran acción supresora de la proliferación del virus, inhibían la
fosforilación de tirosinas de p38MAPK, se sugirió que la supresión
de la proliferación del VIH-1 estaba basada en la
supresión de la activación de p38MAPK por estas sustancias.
Según se describió en la presente anteriormente,
la presente invención se refiere a la utilización de derivados de
macrólidos para suprimir la infección y la proliferación del virus
del síndrome de la inmunodeficiencia humana en macrófagos derivados
de monocitos humanos. La presente invención es no sólo útil como
agentes para suprimir la infección y la proliferación del virus del
síndrome de la inmunodeficiencia humana sino que también tiene
expectativas para uso clínico como agente suplementario en
HAART.
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Claims (7)
1. Utilización de un derivado de macrólido en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto
mediante la supresión de la infección y/o de la proliferación del
virus del síndrome de la inmunodeficiencia humana en un macrófago
derivado de un monocito humano, donde el derivado de macrólido es
seleccionado de entre
oxaciclotetradecano-2-10-diona,4[2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-7,12,13-trihidroxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi];
11-(1'-hidroxipropil)-3-[2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil]oxi]-5-[(3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi]-2,4,6,8,11,14-hexametil-10,13,15-tri-oxatriciclo[9.2.1.1.^{9.6}]-pentadecano-1-ona;
6,15,16-Trioxatriciclo [10.2.1.11,4]
hexadecano,
derivado de eritromicina; 4,13-Dioxabiciclo [8.2.1] tridec-12-en-5-ona,7-[(2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-3-(1,2-dihidroxi-1-metilbutil)-2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-he-
xopiranosil]oxi]; Oxaciclo-tetradecano-2,10-diona,4-[(2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-
12,13-dihidroxi-7-metoxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi]; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-sulfonil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-[3'-N-(3-hidroxi-1-propil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-(2-acetoxietil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-cianometil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-(2-fluoroetil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-etil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dietil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-alil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dialil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-propil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dipropil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-hexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dihexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-bencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dibencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-(2-propil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-(10-bromo-1-decanil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-acetil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-piperidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-pirrolidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-morfolino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-[hexahidro-1(1H)-azepinil]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (12-hidroxi)-de [12-(1-hidroxipropil)]-12-hidroxi-oxima-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de [12-(hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (12-hidroxi)-de [12-(1-hidroxipropil)]-12-amino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-de [12-(1-hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3-O-cladinosil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo y 6,9-hemicetal de la de (3-O-cladinosil)-de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo.
derivado de eritromicina; 4,13-Dioxabiciclo [8.2.1] tridec-12-en-5-ona,7-[(2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-3-(1,2-dihidroxi-1-metilbutil)-2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-he-
xopiranosil]oxi]; Oxaciclo-tetradecano-2,10-diona,4-[(2,6-didesoxi-3-O-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-14-etil-
12,13-dihidroxi-7-metoxi-3,5,7,9,11,13-hexametil-6-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi]; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-sulfonil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-[3'-N-(3-hidroxi-1-propil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-(2-acetoxietil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-cianometil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-3'-N-(2-fluoroetil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-etil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dietil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-alil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dialil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-propargil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-propil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3',3'-N,N-dipropil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-hexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dihexil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-bencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-dibencil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-(2-propil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-3'-N,N-di-(10-bromo-1-decanil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la bis-de (3'-N-metil)-3'-N-acetil-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-piperidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-pirrolidino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-morfolino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-dimetilamino)-3'-[hexahidro-1(1H)-azepinil]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (12-hidroxi)-de [12-(1-hidroxipropil)]-12-hidroxi-oxima-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de [12-(hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (12-hidroxi)-de [12-(1-hidroxipropil)]-12-amino-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3'-N-metil)-de [12-(1-hidroxipropil)]-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo; 6,9-hemicetal de la de (3-O-cladinosil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo y 6,9-hemicetal de la de (3-O-cladinosil)-de (3'-N-metil)-8,9-anhidro-pseudoeritromicina A o una sal del mismo.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en la que el macrófago derivado de monocitos humanos es un
macrófago M de tipo M.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en la que el derivado de macrólido suprime la proliferación del
virus mediante la supresión de la expresión de la proteína tirosina
quinasa Hck y la activación de p38MAPK en macrófagos M de tipo
M.
4. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el derivado de macrólido es
11-(1'-hidroxipropil)-3-[2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil]oxi]-5-[(3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil)oxi]-2,4,6,8,11,14-hexametil-10,13,15-tri-oxatriciclo[9.2.1.1.^{9.6}]-pentadecano-1-ona
o
4,13-Dioxabiciclo[8.2.1]tridec-12-en-5-ona,7-[(2,6-didesoxi-3-C-metil-\alpha-L-ribo-hexopiranosil)oxi]-3-(1,2-dihidroxi-1-metilbutil)-
2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi].
2,6,8,10,12-pentametil-9-[[3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-\beta-D-xilo-hexopiranosil]oxi].
5. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el medicamento es para un
sujeto que está siendo, o que ha sido, tratado con terapia
anti-retroviral altamente activa (HAART).
6. Utilización de un derivado de macrólido para
la supresión in vitro de la infección y/o proliferación del
virus del síndrome de la inmunodeficiencia humana en un macrófago
derivado de un monocito humano, en la que el derivado de macrólido
es según se definió en la reivindicación 1.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, en la cual el derivado es según se definió en la reivindicación 3
ó 4 y/o el macrófago es según se definió en la reivindicación 2.
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