ES2242184T3 - Celulas resistentes o tolerantes a virus. - Google Patents
Celulas resistentes o tolerantes a virus.Info
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Abstract
SE PRESENTA UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA REGULADORA TRANSCRIPCIONAL Y UNA SECUENCIA CONTIGUA CON LA MISMA Y BAJO EL CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE LA MISMA, LA SECUENCIA CONTIGUA CODIFICA UN ARN QUE CONSTA DE UNA PLURALIDAD DE SUBSECUENCIAS, QUE SE CARACTERIZA EN QUE AL MENOS DOS DE LAS SUBSECUENCIAS TIENEN LAS SECUENCIAS DE ARN VIRALES Y EL ARN CONTIENE AL MENOS UN CODON DE TOPE TRANSLACCIONAL SITUADO POR ENCIMA DE LA SUBSECUENCIA DEL TERMINAL 3''. SE PREFIERE QUE AL MENOS UNA DE LAS SUBSECUENCIAS ESTE EN UNA CONFIGURACION ANTISENTIDO CON RESPECTO AL ARN DE LOS VIRUS, Y QUE LA SECUENCIA CONTIGUA CODIFIQUE MARN. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE, ENTRE OTROS, EL USO DE LA SECUENCIA EN LA GENERACION DE PLANTAS RESISTENTES O TOLERANTES A LOS VIRUS, ASI COMO LAS PLANTAS QUE COMPRENDEN LA SECUENCIA.
Description
Células resistentes o tolerantes a virus.
La presente invención se refiere a células que
tienen una susceptibilidad reducida a virus manipulada
genéticamente, a procedimientos para obtener tales células y a
material genético capaz de generar tal susceptibilidad reducida. En
una modalidad preferida, las células son células de planta.
Se han hecho muchos intentos de manipular la
resistencia viral en plantas insertando vectores que contienen DNA
en tejido de planta aceptor, DNA que es capaz de codificar proteínas
virales en la planta así transformada. La proteína viral puede
conferir resistencia a un virus invasor que comprende una proteína
viral substancialmente igual que la codificada por el DNA
introducido. Otros intentos de manipular la resistencia a virus en
plantas usan RNA antisentido que se basa en la introducción de DNA
que codifica una hebra de RNA que es complementaria al RNA de un
virus invasor y así interfiere con la replicación del mismo. Las
plantas que presentan un amplio grado de susceptibilidad reducida,
es decir, a más de un tipo viral, o un grado mayor de
susceptibilidad reducida a un tipo de virus particular, son
altamente deseables.
La resistencia en plantas a múltiples tipos de
virus puede obtenerse transformando tejido de planta con constructos
de DNA constituidos por bloques individuales de elementos genéticos,
consistiendo cada elemento esencialmente en tres componentes: (i)
promotor - (ii) elemento genético que confiere resistencia al virus
- (iii) terminador. Sin embargo, tales constructos requieren la
construcción de muchos promotores y terminadores y típicamente
padecen inestabilidad genética.
La presente invención proporciona entre otras
cosas nuevas secuencias nucleotídicas que pueden usarse en la
producción de células ecuarióticas -particularmente células de
planta- que exhiben una resistencia o tolerancia mejorada a virus.
Tales mejoras se correlacionan de forma sorprendente principalmente
con los niveles del RNA y las subsecuencias del mismo codificadas
por la secuencia nucleotídica de la invención, en vez de los niveles
de los productos de traducción de tal RNA. En efecto, puede
obtenerse resistencia o tolerancia mejorada mediante transcripción
de las secuencias nucleotídicas de la presente invención en células
eucarióticas, substancialmente en ausencia de la traducción de tales
productos de transcripción.
Se ha encontrado previamente que la expresión de
la proteína de la cápsida luteoviral puede conferir resistencia
contra virus a plantas de patata (Plan Mol. Biol. (1989) 13;
337-346), incluso cuando la expresión de tales
marcos de lectura abiertos contiene secuencias no traducidas, según
se describe en DE-40 05 684
(Max-Planck-Gesellschaft zur
Förderung der Wissenschaften E.V. 1991). Se ha observado además que
puede obtenerse para el maíz susceptibilidad reducida a virus a
través de la transformación de plantas de maíz con proteínas de la
cápsida del virus del mosaico enano del maíz (MDMV)
(WO-A-93 14210 Sandoz Erfindugen
Verwaltungsgesellschaft M.B.H. 1993). Un sistema similar se describe
en WO-A-93 17098 (The State of
Oregon, 1993), que usa un constructo antisentido para una proteína
de la cápsida viral para inhibir la función del RNA viral de
proteína de la cápsida de potivirus. De forma similar, se ha
encontrado que secuencias de RNA antisentido junto con una secuencia
que codifica una ribozima y secuencias espaciadoras, que permiten el
procesamiento, por ejemplo la reparación, de RNA, pueden conferir a
las plantas atributos mejorados en la defensa viral
(EP-A-0 421 376; Hoechst
Aktiengesellschaft; 1991).
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una secuencia nucleotídica (secuencia nucleotídica de
acuerdo con la invención) que comprende una secuencia reguladora
transcripcional y una secuencia contigua a la misma y bajo el
control transcripcional de la misma, secuencia contigua que codifica
un RNA que consiste en una pluralidad de subsecuencias, de modo que
dichas subsecuencias confieren una susceptibilidad reducida a un
virus en células de planta o una susceptibilidad reducida mejorada a
un solo tipo de virus en células de planta, en donde al menos dos de
las subsecuencias tienen las secuencias de RNAs virales y el RNA
contiene al menos un codón de parada de la traducción situado aguas
arriba de la subsecuencia terminal 3'. Adicionalmente, al menos una
de las subsecuencias no puede ser traducida y/o al menos una de las
subsecuencias codifica una proteína de la envuelta viral, una
proteína de la nucleocápsida viral u otras proteínas virales
incluyendo replicasa viral o proteínas de movimiento derivadas de
fuentes de virus seleccionadas del grupo que consiste en tospovirus,
potivirus, potexvirus, tobamovirus, cucumovirus, bromovirus,
closterovirus, tombusvirus y furovirus. Cada una de las secuencias
puede ser responsable de conferir una susceptibilidad reducida a un
virus en células de plantas o de conferir una susceptibilidad
reducida mejorada a un solo tipo de virus en células de planta.
Tales subsecuencias no tienen necesariamente que ser capaces de
codificar proteína, y se prefiere que al menos una de ellas sea
incapaz de codificar proteína como consecuencia de que el RNA carece
de un codón de inicio de la traducción en el 5' del mismo y/o la
secuencia contigua que codifica una segunda subsecuencia aguas abajo
de una primera secuencia, definiendo la segunda secuencia un marco
de lectura de la traducción que está fuera de fase con el definido
por la primera subsecuencia. Dicha secuencia nucleotídica puede
codificar un RNA que tiene cualquier número de subsecuencias. Se
prefiere que el número de subsecuencias esté entre 2 y 7 (inclusive)
y se prefiere aún más que el número esté asimismo entre 2 y 4. Al
menos una de las subsecuencias puede estar en una configuración
antisentido con respecto al RNA del virus. La secuencia contigua
puede codificar mRNA.
Se prefiere que al menos una de las subsecuencias
sea un cistrón. Por "cistrón" se entiende un RNA que contiene
un marco de lectura abierto de traducción, es decir, uno que
comprende un codón de inicio de la traducción, una secuencia que
codifica proteína y un codón de parada de la traducción.
Se prefiere que el RNA codificado por la
secuencia contigua comprenda al menos una ribozima (u otro sitio de
segmentación) entre dos de las subsecuencias de modo que el RNA
pueda segmentarse en regiones que comprenden dichas subsecuencias, o
incluso en las subsecuencias de por sí. Excepto en el caso de la más
5' de las subsecuencias contenidas dentro del RNA codificado por la
secuencia contigua, las secuencias nucleotídicas resultantes de tal
segmentación no contendrán una protección 5' o un sitio de unión a
ribosomas y así no serán traducidas cuando estén presentes en una
célula eucariótica.
Se prefiere más que al menos una de las
subsecuenicas codifique una proteína de envuelta viral o una
proteína de la nucleocápsida viral, por ejemplo, la proteína de la
nucleocápsida (N) de un tospovirus tal como el virus de la peste
negra del tomate (TSWV), el virus de la mancha clorótica del tomate
(TCSV), el virus de la mancha anular del cacahuete (GRSV), el virus
de la necrosis de las yemas del cacahuete (GBNV) o el virus de la
mancha necrótica de Impatiens (INSV). Otras proteínas virales que
pueden ser codificadas por las subsecuencias presentes en el RNA
codificado por la secuencia contigua incluyen replicasas virales,
proteínas de movimiento, y similares, derivadas de fuentes de virus
tales como tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus,
cucumovirus, bromovirus, closterovirus, tombusvirus y furovirus.
La invención proporciona además adicionalmente
una secuencia nucleotídica que es similar a la secuencia descrita
previamente. Por "similar" se entiende una secuencia de prueba
que es capaz de hibridarse a una secuencia que es complementaria de
la secuencia nucleotídica de la invención. Cuando las secuencias de
prueba y de la invención tienen doble hebra, el ácido nucleico que
constituye la secuencia de prueba tiene preferiblemente una TM
dentro de 20ºC de la secuencia de la invención. En el caso de que
las secuencias de prueba y de la invención se mezclen entre sí y se
desnaturalicen simultáneamente, los valores de TM de las secuencias
están preferiblemente dentro de 10ºC entre sí. Más preferiblemente,
la hibridación se realiza bajo condiciones restrictivas, estando
soportado preferiblemente el DNA de prueba o de la invención. Así,
una secuencia de prueba de la invención desnaturalizada se une en
primer lugar preferiblemente a un soporte y la hibridación se
efectúa durante un período de tiempo especificado a una temperatura
de entre 50 y 70ºC en solución salina tamponada con citrato de doble
concentración que contiene 0,1% de SDS, seguido por enjuague del
soporte a la misma temperatura pero con un tampón que tiene una
concentración de SC reducida. Dependiendo del grado de restricción
requerido, y así del grado de similitud de las secuencias, tales
tampones de concentración reducida son típicamente SC de
concentración simple que contiene 0,1% de SDS, SC de concentración
media que contiene 0,1% de SDS y SC de un décimo de concentración
que contiene 0,1% de SDS. Las secuencias que tienen el mayor grado
de similitud son aquellas cuya hibridación está afectada al menos
por lavado en tampones de concentración reducida. Lo más preferido
es que las secuencias de prueba y de la invención sean tan similares
que la hibridación entre ellas esté substancialmente inalterada por
lavado o incubación en tampón de citrato sódico de un décimo de
concentración que contiene 0,1% de
SDS.
SDS.
La invención también proporciona un constructo de
DNA que comprende la secuencia nucleotídica de acuerdo con la
invención, así como un vector biológico que comprende dicha
secuencia o constructo. El vector biológico puede ser un virus o una
bacteria, tal como Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, y
el constructo ventajosamente codifica adicionalmente proteína que
tiene propiedades de resistencia a herbicidas, promotoras del
crecimiento de las plantas, antifúngicas, antibacterianas y/o
anti-nematodos.
La invención proporciona además adicionalmente
células eucarióticas, tales como células de planta (incluyendo
protoplastos, por ejemplo, que contienen la secuencia nucleotídica,
el constructo o el vector mencionados).
La invención proporciona también adicionalmente
plantas que comprenden tales células de planta, la progenie de tales
plantas y/o las semillas de tales plantas, en donde dichas progenie
o semillas contienen la secuencia establemente incorporada y
hereditaria de una manera mendeliana. Tales plantas incluyen
cultivos de campo, hortalizas y frutas incluyendo tomate, pimiento,
melón, lechuga, coliflor, brécol, berza, col de Bruselas, remolacha
azucarera, maíz, maíz dulce, cebolla, zanahoria, ajo puerro, pepino,
tabaco, alfalfa, berenjena, remolacha, haba mayor, apio, achicoria,
caupí, endibia, calabaza, maní, papaya, guisante, cacahuete, piña,
patata, cártamo, judía, soja, espinaca, calabacines, girasol, sorgo,
sandía y similares; y cultivos ornamentales incluyendo,
Impatiens, Begonia, Petunia, Pelargonium, Viola, Cyclamen,
Verbena, Vinca, Tagetes, Primula, Saint Paulia, Ageratum,
Amaranthus, Arithirrhinum, Aquilegia, Chrysanthemum, Cineraria,
Trébol, Cosmo, Caupí, Dahlia, Datura, Delphinium, Gerbera,
Gladiolus, Gloxinia, Hippeastrum, Mesembryanthemum, Salpiglossis,
Zinnia y similares.
La invención proporciona además adicionalmente el
uso de la secuencia de acuerdo con la invención -ya sea
"desnuda" o presente en un constructo de DNA o vector
biológico- en la producción de células de planta resistentes o
tolerantes a virus. Por "resistente" se entiende una célula que
substancialmente no exhibe cambios fenotípicos como consecuencia de
la infección con el virus. Por "tolerante" se entiende una
célula que, aunque pueda exhibir algún cambio fenotípico como
consecuencia de la infección con un virus, no tiene una capacidad
reproductiva substancialmente disminuida o un metabolismo
substancialmente alterado. Tal uso conduce a la producción de
plantas enteras morfológicamente normales resistentes o tolerantes a
virus.
La invención proporciona además adicionalmente un
método para inducir resistencia o tolerancia a virus en células
eucarióticas, que comprende introducir en tales células una
secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención o un constructo o
vector que la contiene. Se prefiere que las células sean células de
planta según se indica previamente.
La invención se hará evidente adicionalmente a
partir de la siguiente descripción tomada junto con los dibujos y
listados de secuencia asociados.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de constructos que comprenden posibles secuencias
nucleotídicas de acuerdo con la invención, en los que la secuencia
contigua codifica un RNA que comprende subsecuencias que codifican
las proteínas de la nucleocápsida de TCSV, TSWV y GRSV.
La Figura 2 muestra una representación
esquemática de constructos que comprenden posibles secuencias
nucleotídicas de acuerdo con la invención, en los que la secuencia
contigua codifica un RNA que comprende subsecuencias que codifican
las proteínas de la nucleocápsida de TCSC y TSWV y la proteína de
envuelta de PVY.
La ID SEC Nº 1 muestra una secuencia de DNA que
codifica las proteínas de la nucleocápsida de GRSV, TSWV y TCSV; la
ID SEC Nº 2 muestra una secuencia de DNA substancialmente similar a
la dada en la ID SEC Nº 1, excepto que cada una de las subsecuencias
que codifican las proteínas de la nucleocápsida está limitada por
una secuencia de ribozima que hace al RNA codificado por la
secuencia de DNA susceptible a la segmentación en sitios
predeterminados; la ID SEC Nº 3 muestra una secuencia de DNA que
codifica proteínas de la nucleocápsida de TCSV y TSWV y la proteína
de envuelta de virus de patata Y^{n} (PVY); la ID SEC Nº 4 muestra
una primera secuencia cebadora denominada ZUP422 (véase más
adelante) y la ID SEC Nº 5 muestra una segunda secuencia cebadora
denominada ZUP423 (véase más adelante).
Ejemplos de las secuencias nucleotídicas de la
invención se proporcionan más adelante. Estos ejemplos se refieren a
la producción de plantas de tomate resistentes o tolerantes a virus.
Las plantas de tomate pueden ser atacadas tanto por el virus del
mosaico del pepino (CMV) como por el virus de la peste negra del
tomate (TSWV). Puede producirse resistencia o tolerancia mejorada a
estos virus de un número de modos introduciendo diversas modalidades
de la secuencia nucleotídica de la invención en las plantas o el
material progenitor de las mismas.
1. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un mRNA que consiste
-en la dirección 5' a 3'- en (i) un codón de inicio de la
traducción, (ii) la región de codificación de la proteína de la
nucleocápsida de TSWV, (iii) un codón de parada de la traducción,
(iv) opcionalmente un codón de inicio adicional, (v) la región de
codificación de la replicasa de CMV y (vi) opcionalmente un codón de
parada adicional. Cuando tal secuencia se introduce en las células
de plantas de tomate, la secuencia que codifica el mRNA se
transcribe. La región del mRNA así transcrito que codifica la
proteína de la nucleocápsida de TSWV se traduce, mientras que la
región del mRNA que codifica la replicasa de CMV no se traduce como
resultado de que la traducción cesa en el codón de parada en el lado
3' de la región de codificación de la proteína de la nucleocápsida
de TSWV.
2. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un mRNA que consiste
-en la dirección 5' a 3'- en (i) un codón de inicio de la
traducción, (ii) la región de codificación de la proteína de
envuelta de CMV, (iii) un codón de parada de la traducción, (iv)
opcionalmente un codón de inicio adicional, (v) una región que
codifica la proteína de la nucleocápsida de TSWV y (vi)
opcionalmente un codón de parada adicional. Cuando tal secuencia se
introduce en las células de plantas de tomate, la secuencia que
codifica el mRNA se transcribe, la región del mRNA así transcrito
que codifica la proteína de envuelta de CMV se traduce, mientras que
la región del mRNA que codifica la proteína de la nucleocápsida de
TSWV no se traduce como resultado de que la traducción cesa en el
codón de parada en el lado 3' de la región que codifica la proteína
de envuelta de
CMV.
CMV.
3. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un RNA que consiste -en
la dirección 5' a 3'- en (i) la región de codificación de la
proteína de envuelta de CMV, (ii) un codón de parada de la
traducción, (iii) opcionalmente un codón de inicio adicional, (iv)
una región que codifica la proteína de la nucleocápsida de TSWV y
(v) opcionalmente un codón de parada adicional. Cuando tal secuencia
se introduce en las células de plantas de tomate, la secuencia que
codifica el RNA se transcribe, pero el RNA no se traduce entre otras
cosas debido a que el primer cistrón no contiene un codón de inicio
de la traducción aguas arriba del codón de parada de la traducción,
incluso suponiendo que el RNA contenga una protección 5' a la que
podrían unirse los ribosomas. El experto sabe que las células
eucarióticas no traducen cistrones segundos y subsiguientes en mRNA
policistrónico si el primer cistrón posee un codón de parada.
4. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un mRNA que consiste
-en la dirección 5' a 3'- en (i) un codón de inicio de la
traducción, (ii) la región de codificación de la proteína de
envuelta de CMV, (iii) un codón de parada de la traducción, (iv)
opcionalmente un codón de inicio adicional, (v) una región que
codifica la proteína de la nucleocápsida de TSWV en una
configuración antisentido con respecto a mRNA que codifica la
proteína de la nucleocápsida de TSWV, (vi) opcionalmente un codón de
parada adicional. Cuando tal secuencia se introduce en las células
de plantas de tomate, la secuencia que codifica el mRNA se
transcribe. La región del mRNA así transcrito que codifica la
proteína de envuelta de CMV se traduce, mientras que la región del
mRNA que codifica la proteína de la nucleocápsida de TSVW no se
traduce como resultado de que la traducción cesa en el codón de
parada en el lado 3' de la región que codifica la proteína de
envuelta de CMV. La región del mRNA no traducido que contiene dicho
RNA antisentido es capaz de apareamiento de bases con el mRNA que
codifica la proteína de la nucleocápsida de TSWV.
\newpage
Se apreciará que la secuencia contigua puede
codificar un RNA que comprende subsecuencias, dos o más de las
cuales tienen secuencias derivadas de un tipo de virus común, de
modo que puede generarse una resistencia aún mayor a la infección
por virus. Por ejemplo:
6. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un mRNA que consiste
-en la dirección 5' a 3'- en (i) un codón de inicio de la
traducción, (ii) la región de codificación de la replicadas de TSWV,
(iii) un codón de parada de la traducción, (iv) opcionalmente un
codón de inicio adicional, (v) una región que codifica la proteína
de la nucleocápsida de TSWV, (vi) opcionalmente un codón de parada
adicional. Cuando tal secuencia se introduce en las células de
plantas de tomate, la secuencia que codifica el mRNA se traduce. La
región del mRNA así transcrito que codifica la replicasa se traduce,
mientras que la región del mRNA que codifica la proteína de la
nucleocápsida de TSVW no se traduce como resultado de que la
traducción cesa en el codón de parada en el lado 3' de la región que
codifica la replicasa de TSWV.
7. La secuencia contigua en la secuencia
nucleotídica de la invención puede codificar un mRNA que consiste
-en la dirección 5' a 3'- en (i) un codón de inicio de la
traducción, (ii) una región que codifica una primera proteína de la
nucleocápsida de TSWV, (iii) un codón de parada de la traducción,
(iv) opcionalmente un codón de inicio adicional, (v) una región que
codifica una segunda proteína de la nucleocápsida de TSWV, (vi)
opcionalmente un codón de parada adicional. Cuando tal secuencia se
introduce en las células de plantas de tomate, la secuencia que
codifica el mRNA se traduce. La región del mRNA así transcrito que
codifica la primera proteína de la nucleocápsida se traduce,
mientras que la región del mRNA que codifica la segunda proteína de
la nucleocápsida no se traduce como resultado de que la traducción
cesa en el codón de parada en el lado 3' de la región que codifica
la primera proteína. Si es deseable, el codón de inicio de la
traducción en el lado 5' de la región que codifica la primera
proteína de la nucleocápsida puede suprimirse.
El siguiente análisis detalla la producción de
secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención, su inserción
en vectores apropiados, la transformación de material de planta con
tales vectores y la regeneración de tal material transformado en
plantas enteras morfológicamente normales resistentes o tolerantes a
virus.
Variedades de cultivo de Nicotiana tabacum
y Lycopersicon esculentum, usadas en estudios de
transformación de plantas, se hacen crecer bajo condiciones de
invernadero estándar. Material de explante axénico se hace crecer
sobre medio MS estándar [Murashige y Skoog (1962). Physiol. Plant
15:473] que contiene fitohormonas y sacarosa en concentraciones
apropiadas.
E. coli se hace crecer en agitadores
giratorios a 37ºC en medio LB estándar. Las cepas de
Agrobacterium tumefaciens se hacen crecer a 28ºC en medio
Min. A complementado con 0,1% de glucosa [Ausubel y otros, (1987).
Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates
and Wiley Intersciences].
En todos los procedimientos de clonación, se usa
la cepa de E. coli JM83, (F, \Delta
(lac-pro), ara, rpsL, \diameter80, dlacZM15) como
el receptor para plásmidos recombinantes.
Vectores binarios se conjugan a la cepa de
Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, una cepa que contiene la
región vir del plásmido Ti [Hoekema y otros (1983) Nature 303:179]
en cruces triparentales estándar usando E. coli HB101 que
contiene el plásmido pRK2013 como una cepa cooperadora [Figurski y
Helsinki, (1979) PNAS 76:1648]. Receptores de A. tumefaciens
apropiados se seleccionan en medios que contienen rifampicina (50
\mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml).
La clonación de fragmentos en los vectores pUC19
[Yanish-Perron y otros (1985) Gene 33:103],
pBluescript (Stratagene), pBIN19 [Bevan y otros (1984) Nucl. Acids
Res. 12:8711] o derivados de los mismos, el análisis de DNA con
enzimas de restricción, la transformación de cepas receptoras de
E. coli, el aislamiento de DNA plasmídico a pequeña así como
a gran escala, el traslado de la mella, la transcripción in
vitro, la secuenciación de DNA, la transferencia Southern y la
electroforesis en gel de DNA se realizan de acuerdo con
procedimientos estándar [Maniatis y otros (1982) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York;
Ausubel y otros, anteriormente, (1987)].
Un plásmido derivado de pUC19 recombinante que
contiene el gen N de TSWV es descrito por De Haan y otros (1990) J.
Gen. Virology 71:001. Plásmidos derivados de pBluescript
recombinantes que contienen el gen N de TCSV y genes N de GRSV son
descritos por De Avila y otros (1993) J. Gen. Virology 74:153. Un
plásmido derivado de pUC19 recombinante que contiene el gen CP de
PVY es descrito por Van der Vlugt (1992). PhD thesis, Agricultural
University Wageningen, Países Bajos, Ch4; páginas
45-47.
\newpage
Los vectores de expresión pZU-C y
pZU-D son derivados de pZU-B
descritos en la publicación de patente europea Nº
EP-A 426 195. El sitio de clonación Sma1 único entre
la secuencia \Omega de TMV y el terminador NOS se reemplaza usando
técnicas de laboratorio estándar [Maniatis y otros, anteriormente
(1982); Ausubel y otros (1987) anteriormente] por un sitio de
clonación Nco1, dando pZU-C. pZU-C
se linealiza con Pst1 y se trata con DNA polimerasa de T4 para
obtener extremos romos. Los conectores BamH1 se ligan y el plásmido
se digiere con BamH1 y subsiguientemente se recirculariza usando DNA
ligasa de T4 dando como resultado el plásmido recombinante
pZU-D.T. Los plásmidos recombinantes
pZU-C y pZU-D contienen sitios de
fusión de HincII de 35S-\Omega de TMV
(35S-\Omega), NcoI, Pst1 (pZU-C) o
NcoI únicos, BamH1 (pZU-D) y el terminador NOS.
El plásmido derivado de pUC19 recombinante que
contiene el gen N de GRSV se linealiza con BamH1 y se trata con DNA
polimerasa de T4 para obtener extremos romos. Los conectores Sst1 se
ligan y el plásmido se digiere con Sst1 y subsiguientemente se
recirculariza usando DNA ligasa de T4. El plásmido resultante se
linealiza a continuación con Kpn1 y se trata con DNA polimerasa de
T4 para obtener extremos romos. Los conectores BamH1 se ligan y el
plásmido se digiere con BamH1 y subsiguientemente se recirculariza
usando DNA ligasa de T4 dando como resultado el plásmido
recombinante N de GRSV (Fig. 1), que contiene el gen N de GRSV
(nucleótidos 1986 a 2953 de la ID SEC Nº 1). El plásmido N de GRSV
se somete a digestión con Sst1 y el fragmento que contiene el gen N
de GRSV se separa electroforéticamente y se purifica del gel usando
una membrana de DEAE NA-45 (Schleicher y Schull) y
se clona en N de TCSV linealizado con Sst1 (un plásmido recombinante
derivado de pBluescript) que contiene el gen N de TCSV (nucleótidos
7 a 981 de la ID SEC Nº 1) dando como resultado N de
TCSV-N de GRSV. El plásmido N de TSWV se somete a
digestión con Kpn1 y el fragmento que contiene el gen N de TSWV
(nucleótidos 988 a 1939 de la ID SEC Nº 1) se separa
electroforéticamente y se purifica del gel usando una membrana de
DEAE NA-45 y se clona en N de TCSV-N
de GRSV linealizado con Kpn1, dando como resultado el plásmido
recombinante N de TCSV-N de TSWV-N
de GRSV (Fig. 1). El plásmido N de TCSV-N de
TSWV-N de GRSV (ID SEC Nº 1) se somete a digestión
con BamH1 y el fragmento que contiene los genes N tospovirales se
separa electroforéticamente y se purifica del gel usando una
membrana de DEAE NA-45 y se clona en
pZU-D linealizado con BamH1, dando como resultado
pTOSPON 1 (Fig. 1). La secuencia nucleotídica que contiene el
promotor \Omega de 35S, los genes N tospovirales y el terminador
NOS se corta del plásmido pTOSPON 1 con una digestión parcial con
Sst1. El casete génico aislado se inserta a continuación en el
pBIN19 linealizado con Sst1 para crear el vector de transformación
binario pBIN-TOSPON 1.
La secuencia nucleotídica de DNA que codifica el
RNA que codifica las tres secuencias de la nucleocápsida tospoviral
contiene secuencias de ribozima y se representa en la ID SEC Nº
2.
Se construyen dos cebadores, ZUP422 (representado
en la ID SEC Nº 4) y ZUP423 (representado en la ID SEC Nº 5) que
contienen sitios de clonación Kpn1, secuencia de ribozima activa del
RNA satélite del virus de la mancha anular del tabaco y 17
nucleótidos superpuestos con la región de codificación del gen de
TSWV. Los cebadores se usan para amplificar por PCR el gen N de TSWV
usando pTOSPON como una plantilla. El fragmento de PCR se hace de
extremos romos mediante tratamiento con DNA polimerasa de T4 y
subsiguientemente se clona en el sitio EcoR V del plásmido pSK+. Se
obtienen clones que contienen una inserción Kpn1 del tamaño
esperado. El análisis de la secuencia revela que el sitio Kpn1 que
se origina a partir del cebador ZUP422 se destruye. Por lo tanto, el
sitio Kpn1 situado en el multienlazador de pSK+, junto con el sitio
Kpn 1 que se origina del cebador ZUP423, se usa para remplazar el
gen N de TSWV (como un fragmento Kpn 1) situado en el plásmido
recombinante N de TCSV-N de TSWV-N
de GRSV (véase previamente) dando los plásmidos N de
TCSV-ribozima-N de
TSVW-ribozima-N de GRSV y N de
TCSV-ribozima-N de TSWV
antisentido-ribozima-N de GRSV.
Estos plásmidos se linealizan con BamH1 y se usan como plantillas
para producir transcritos desenrollados con RNA polimerasa de T7. La
electroforesis en gel de poliacrilamida revela que los transcritos
primarios son segmentados inmediatamente y completamente para dar
las moléculas del gen N de sentido y/o tospoviral separadas. Los
plásmidos N de TCSV-ribozima-N de
TSWV-ribozima-N de GRSV y N de
TCSV-ribozima-N de TSWV
antisentido-ribozima-N de GRSV (ID
SEC Nº 2) se someten a digestión con BamH1 y los fragmentos que
contienen los genes N tospovirales se separan electroforéticamente y
se purifican del gel usando una membrana de DEAE
NA-45 y se clonan en pZU-D
linealizado con BamH1, dando como resultado
pTOSPON-ribo1 y pTOSPON-ribo2 (Fig.
1), respectivamente. Las secuencias nucleotídicas que contienen el
promotor \Omega de 35S, los genes N tospovirales limitados por
ribozimas y el terminador NOS se cortan de los plásmidos a través de
una digestión parcial con Sst1. Los casetes génicos aislados se
insertan a continuación en el pBIN19 linealizado con Sst1 para crear
los vectores de transformación binarios
pBIN-TOSPON-ribo1 y
pBIN-TOSPON-ribo2,
respectivamente.
Ambos constructos se transfieren a plantas dando
23 transformantes pBIN-TOSPON y 17
pBIN-TOSPON-ribo2. La progenie de
los transformantes se estimula con los diversos tospovirus y se
encuentra que exhibe una resistencia o tolerancia mejorada a los
mismos, en comparación con controles no transformados.
El plásmido N de TCSV se somete a digestión con
Pst1 y el fragmento grande que contiene el gen N de TCSV y pUC19 se
separa electroforéticamente y se purifica a partir del gel usando
una membrana de DEAE (NA-45, Schleicher y Schull) y
se recirculariza usando DNA ligasa de T4, dando como resultado N de
TCSV (Fig. 2). El plásmido derivado de pUC19 recombinante que
contiene el gen CP de pVY (nucleótidos 1984 a 2899 de la ID SEC Nº
3) se linealiza con Sph1 y se trata con DNA polimerasa de T4 para
obtener extremos romos. Los conectores Sst1 se ligan y el plásmido
se digiere con Sst1 y subsiguientemente se recirculariza usando DNA
ligasa de T4, dando como resultado el plásmido recombinante CP de
PVY (Fig. 2). El plásmido CP de PVY se somete a digestión con Sst1 y
el fragmento que contiene el gen CP de PVY se separa
electroforéticamente y se purifica a partir del gel usando una
membrana de DEAE NA-45 y se clona en N de TCSV
linealizado con Sst1, dando como resultado N de
TCSV-CP de PVY. El plásmido N de TSWV se somete a
digestión con Kpn1 y el fragmento que contiene el gen de TSWV (Fig.
2) se separa electroforéticamente y se purifica a partir del gel
usando una membrana de DEAE NA-45 y se clona en N de
TCSV-CP de PVY linealizado con Kpn1, dando como
resultado el plásmido recombinante N de TCSV-N de
TSWV-CP de PVY. El plásmido N de
TCSV-N de TSWV-CP de PVY se somete a
digestión con Pst1 y el fragmento que contiene los genes N
tospovirales y el gen CP de PCY se separa electroforéticamente y se
purifica a partir del gel usando una membrana de DEAE
NA-45 y se clona en pZU-C
linealizado con Pst1, dando como resultado pTOSPOVY 1 (Fig. 2). El
casete génico que contiene el promotor \Omega de 35S, los genes N
de TCSV y TSWV, el gen CP de PVY y el terminador NOS se corta del
plásmido pTOSPOVY 1 a través de una digestión parcial con Sst1. El
casete génico aislado se inserta a continuación en el pBIN19
linealizado con Sst1 para crear el vector de transformación binario
pBIN-TOSPOVY 1.
Métodos para transferir vectores binarios a
material de plantas son conocidos por un experto en la técnica.
Existen variaciones en los procedimientos debido a diferencias en
las cepas de Agrobacterium usadas, diferentes fuentes de
material de explante, diferencias en los sistemas de regeneración y
en la variedad de cultivo de la especie de planta empleada.
Vectores de transformación de plantas binarios
como los descritos previamente se emplean en experimentos de
transformación de plantas de acuerdo con los siguientes
procedimientos. Constructos de vectores binarios se transfieren
mediante cruce triparental a una cepa de Agrobacterium
tumefaciens aceptora, seguido por análisis Southern de
exconjugantes para la verificación de la transferencia apropiada del
constructo a la cepa aceptora, y la inoculación y el cocultivo de
material de explante axénico con la cepa de Agrobacterium
tumefaciens de elección, la destrucción selectiva de la
Agrobacterium tumefaciens usada con antibióticos apropiados,
la selección de células transformadas haciendo crecer sobre medio
selectivo que contiene kanamicina, la transferencia de tejido a
medios inductores de vástagos, la transferencia de vástagos
seleccionados a medios inductores de raíces, la transferencia de
plántulas al suelo, el ensayo de la integridad del constructo
mediante análisis Southern de DNA total aislado de la planta
transgénica, el ensayo de la función apropiada del gen insertado
mediante análisis Northern y/o ensayos enzimáticos y análisis por
transferencia Southern de proteínas siguiendo métodos como los
descritos por Ausubel y oros, previamente.
Se extrae RNA de hojas de plantas regeneradas
usando el siguiente procedimiento. Se trituran 200 mg de material de
hojas hasta un polvo fino en nitrógeno líquido. Se añaden 800 \mul
de tampón de extracción de RNA (Tris-HCl 100 mM (pH
8,0), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, \beta-mercaptoetanol
200 nM, SDS al 0,4%) y el homogenado se extrae con fenol y los
ácidos nucleicos se recogen mediante precipitación con alcohol. Los
ácidos nucleicos se resuspenden en 0,5 ml de
Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y se añade LiCl
hasta una concentración final de 2M, y se deja sobre hielo durante
no más de 4 horas. El RNA se recoge mediante centrifugación y se
resuspende en 400 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0),
EDTA 1 mM y a continuación se precipita con alcohol. El RNA se
resuspende a continuación en 50 \mul de Tris-HCl
10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM. Los RNAs se separan sobre geles de
glioxal/agarosa y se transfieren a Genescreen según se describe por
Grinsven y otros [(1986) Theor. Appl. Gen.
73:94-101]. Las secuencias de RNA viral recombinante
se detectan usando sondas de DNA o RNA marcadas con [^{32}P],
[^{35}S] o usando técnicas de marcaje no radiactivas. Basándose en
el análisis Northern, se determina hasta qué extensión las plantas
regeneradas expresan geles virales recombinantes.
Plantas transformadas con moléculas de DNA viral
recombinante también se someten a análisis de transferencia Western
después de la inoculación de la planta con el virus respectivo. Las
proteínas se extraen de las hojas de plantas transformadas
triturando el tampón de muestra [Laemmli (1970) Nature 244:29] y una
porción de 50 \mug de proteína se somete a electroforesis en un
gel de poliacrilamida en presencia de SDS al 12,5%. Las proteínas
separadas se transfieren a nitrocelulosa electroforéticamente según
se describe por Towbin y otros [(1979) PNAS76:4350]. Las proteínas
transferidas se hacen reaccionar con antisuero producido contra
nucleocápsidas de TCSV purificadas. Basándose en los resultados del
análisis Western, se determina que las plantas transformadas
expresan proteína de TCSV.
Las plantas transformadas se hacen crecer en el
invernadero bajo condiciones de cuarentena estándar para evitar
cualquier infección por patógenos no deseables. Los transformantes
se autopolinizan y las semillas se recogen. Las plantas de progenie
se analizan con respecto a la segregación del gen insertado y
subsiguientemente se infectan con TCSC, TSWV y/o GRSV y PVY mediante
inoculación mecánica. Tejido de plantas infectadas sistémicamente
con estos virus se tritura en 5 volúmenes de tampón de inoculación
enfriado con hielo (tampón de fosfato 10 mM, que contiene sulfito
sódico 10 mM) y se restriegan en presencia de polvo de carburo de
silicio sobre las primeras dos hojas completamente extendidas de
plántulas de aproximadamente 5 semanas de edad. Las plantas
inoculadas se verifican con respecto al desarrollo de síntomas
durante 3 semanas después de la inoculación.
Plantas que contienen secuencias de TOSPON 1
(Fig. 1), pTOSPON-ribo1,
pTOSPON-ribo2 o TOSPOPVY 1 (Fig. 2) muestran
susceptibilidad reducida a la infección con TCSV, TSWV y/o GRSV y
PVY en comparación con plantas de control no transformadas que
muestran síntomas sistémicos intensos 7 días después de la
inoculación con estos virus. Las plantas que resistían la infección
se autopolinizan y se demuestra la resistencia similar de la
progenie S2 resultante.
Se apreciará que la presente invención no está
limitada solamente a los ejemplos previos, sino que incluye todas
las extensiones lógicas y obvias de las modalidades de la invención
descritas aquí así como las reivindicadas específicamente.
La invención también describe constructos como
los detallados en el siguiente párrafo en las cláusulas numeradas
1-12.
(1). Constructos de DNA multigénico que
comprenden al menos un gen no estructural en el que el DNA
multigénico está bajo el control de un solo grupo de elementos
reguladores genéticos. Por "gen no estructural" se entiende un
gen capaz de codificar para una molécula de RNA viral que es
substancialmente incapaz de codificar para un polipéptido o una
proteína viral pero que sin embargo es capaz de conferir una
susceptibilidad reducida mediada por RNA de un virus de planta en
células de planta. (2). Constructos de acuerdo con la cláusula 1, en
los que el al menos un gen no estructural es un gen viral. (3).
Constructos de DNA multigénico que comprenden al menos un gen no
estructural en el que los constructos de DNA multigénico son capaces
de dar lugar a elementos virales en células de planta que son
capaces de conferir una susceptibilidad reducida a virus de planta
en células de planta, y en donde el DNA multigénico está bajo el
control de un solo grupo de elementos reguladores genéticos. (4).
Constructos de acuerdo con las cláusulas 2 a 3, que comprenden al
menos un gen no estructural viral y un gen estructural viral. (5).
Constructos de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 2 a 4,
que comprenden al menos dos genes no estructurales y elementos
génicos estructurales no virales. (6). Constructos de acuerdo con la
cláusula 5, que comprenden de 2 a 5 genes no estructurales virales.
(7). Constructos de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a
3, que comprenden DNA capaz de codificar para moléculas de RNA
virales de tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus,
cucumovirus, bromovirus, closterovirus, tombusvirus y furovirus.
(8). Constructos de acuerdo con la cláusula 7, en los que el DNA
codifica para moléculas de RNA viral no estructural de proteínas de
la nucleocápsida, proteínas de la envuelta viral y proteínas virales
no estructurales. (9). Plantas que comprenden constructos de DNA
multigénicos de una cualquiera de las cláusulas 1 a 3. (10). Plantas
de acuerdo con la cláusula 9 seleccionadas del grupo que comprende
tomates, pimientos, melones, lechugas, coliflores, brécoles, berzas,
coles de Bruselas, remolacha azucarera, maíz, maíz dulce, cebollas,
zanahorias, ajos puerros, pepinos, tabacos, alfalfas, berenjenas,
remolachas, habas mayores, apios, achicorias, caupíes, endibias,
calabazas, maníes, papayas, guisantes, cacahuetes, piñas, patatas,
cártamos, judías, habas de soja, espinacas, calabacines, girasoles,
sandías y sorgos. (11). Plántulas de acuerdo con la cláusula 9
seleccionadas del grupo de plantas ornamentales que consiste
esencialmente en Impatiens, Begonias, Petunias, Pelargoniums
(geranios), Violas, Cyclamens, Verbenas, Vincas, Tagetes, Primulas,
Saint Paulias, Ageratums, Amaranthuses, Arithirrhinums, Aquilegias,
Chrysanthemums, Cineraria, Tréboles, Cosmos, Caupíes, Dahlias,
Daturas, Delphiniums, Gerberas, Gladiolos, Gloxinias, Hippeastrums,
Mesembryanthemums, Salpiglossis y Zinnias. (12). Un
método para obtener plantas que presentan una susceptibilidad
reducida a virus, que comprende: (a) insertar en el genoma de una
célula de planta un constructo de DNA de acuerdo con una cualquiera
de las cláusulas 1 a 8; (b) obtener células transformadas; y (c)
regenerar de las células transformadas plantas genéticamente
transformadas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Ltd
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Lichtstrasse 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4002
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 061-324-1111
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 061-322-7532
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 965-05055
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Patent GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Humobltstrasse 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Loerach
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-7850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Erfingungen Verwaltungsgesellschaft MBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Brunner Strasse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Viena
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): A-1230
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Células resistentes o tolerantes a virus
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2959 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Secuencia quimérica
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2899 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Secuencia quimérica
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2917 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Secuencia quimérica
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGGTACCG TCACCGGATG TGCTTTCCGG TCTGATGAGT CCGTGAGGAC GAAACGGTAT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCTAAGGT TAAGC
\hfill75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAGGTACCG TTTCGTCCTC ACGGACTCAT CAGACCGGAA AGCACATCCG GTGACGGTCA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCAAGTTCT GCG
\hfill73
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Una secuencia nucleotídica que comprende una
secuencia reguladora transcripcional y una secuencia contigua a la
misma y bajo el control transcripcional de la misma, secuencia
contigua que codifica un RNA que consiste en una pluralidad de
subsecuencias tal que dichas subsecuencias confieren una
susceptibilidad reducida a un virus en células de planta o una
susceptibilidad reducida mejorada a un solo tipo de virus en células
de planta, en
donde
donde
- a)
- al menos dos de las subsecuencias tienen las secuencias de RNAs virales y el RNA contiene al menos un codón de parada de la traducción situado aguas arriba de la subsecuencia terminal 3';
- b)
- al menos una de las subsecuencias no puede traducirse;
- c)
- al menos una de las subsecuencias codifica una proteína de la envuelta viral, una proteína de la nucleocápsida viral u otras proteínas virales que incluyen replicasa viral o proteínas de movimiento derivadas de fuentes de virus seleccionadas del grupo que consiste en tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus, cucumovirus, bromovirus, closterovirus, tombusvirus y furovirus.
2. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que al menos una de las subsecuencias está
en una orientación antisentido con respecto al RNA del virus.
3. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la secuencia contigua codifica
mRNA.
4. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos
una de las subsecuencias es un cistrón.
5. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el RNA
codificado por la secuencia contigua comprende al menos una ribozima
entre dos de las subsecuencias.
6. Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la secuencia contigua codifica un RNA
que consiste en al menos dos subsecuencias y no más de siete
subsecuencias.
7. La secuencia de acuerdo con la reivindicación
1, en la que la proteína de la nucleocápsida es una proteína de
nucleocápsida de tospovirus de un virus seleccionado del grupo que
consiste en virus de la peste negra del tomate, virus de la mancha
clorótica del tomate, virus de la mancha anular del cacahuete, virus
de la necrosis de las yemas del cacahuete y virus de la mancha
necrótica de Impatiens.
8. La secuencia de acuerdo con la reivindicación
1, en la que la proteína de la envuelta se obtiene a partir de un
virus del mosaico del pepino o un virus de patata Y.
9. Un constructo de DNA que comprende la
secuencia nucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. El constructo de DNA de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que la secuencia nucleotídica es la ID SEC
Nº 1.
11. El constructo de DNA de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que la secuencia nucleotídica es la ID SEC
Nº 2.
12. El constructo de DNA de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que la secuencia nucleotídica es la ID SEC
Nº 3.
13. Un vector que comprende la secuencia
nucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8 o el constructo de acuerdo con la reivindicación 9.
14. Una célula de planta que contiene la
secuencia nucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, el constructo de acuerdo con la
reivindicación 9 o el vector de acuerdo con la reivindicación
13.
13.
15. Una planta que comprende las células de la
reivindicación precedente, la progenie de tales plantas y/o las
semillas de tales plantas o tal progenie, en donde dicha progenie o
semillas contienen la secuencia establemente incorporada y
hereditaria de una manera mendeliana.
16. Uso de la secuencia de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de acuerdo
con la reivindicación 9 o el vector de acuerdo con la reivindicación
13, en la producción de células de planta resistentes o tolerantes a
virus.
17. Un método para inducir resistencia o
tolerancia a virus en células de planta que comprende introducir en
tales células una secuencia nucleotídica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un constructo de acuerdo
con la reivindicación 9 o el vector de acuerdo con la reivindicación
13.
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