ES2242192T3 - Scf humano, una variante suya de corte y empalme, su uso farmaceutico. - Google Patents
Scf humano, una variante suya de corte y empalme, su uso farmaceutico.Info
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Abstract
SCF QUE INCLUYE LA SIGUIENTE SECUENCIA C TERMINAL: GLU ILE CYS SER LEU LEU ILE GLY LEU THR ALA TYR LYS GLU LEU SER LEU PRO LYS ARG LYS GLU THR CYS ARG ALA ILE GLN HIS PRO ARG LYS ASO O UNA SECUENCIA C-TERMINAL QUE ES SUSTANCIALMENTE HOMOLOGA A LA MISMA Y A SU USO EN MEDICINA, EN CONCRETO, ASEGURANDO EL CORRECTO DESARROLLO DE EMBRIONES PRE-IMPLANTADOS.
Description
SCF humano, una variante suya de corte y empalme,
su uso farmacéutico.
El presente invento se refiere a una nueva
proteína factor de células madre (SCF) humana, a secuencias de ADN
que codifican este proteína, su uso en terapia, particularmente en
fertilización in vitro, así como a formulaciones
farmacéuticas que comprenden tal proteína.
Un implante con éxito de un embrión requiere un
correcto desarrollo del embrión previo al implante, dando como
resultado un blastocisto incubado, el cual es capaz de ser
implantado en un endometrio receptivo. Se ha recogido un cuerpo de
datos considerable que apoya la idea de que los factores solubles,
son secretados por el epitelio uterino, actúan directamente sobre el
embrión para controlar este proceso. (Pampfer, S. y otros,
Bioassays, 13: 535-540 (1991);
Tartakousky, B., y Ben Fair, E., Development Biology,
146: 345-352 (1991); Anderson, E. D., J.
Cellular Biochem., 53: 280-287 (1993); y
Schultz, G. A. Y Hevner, S., Mutat. Res., 296:
17-31 (1992)).
Además, los embriones en desarrollo se ha
demostrado que producen una variedad de citoquinas que pueden actuar
en una forma autocrina sobre el endometrio para influir en su
receptividad. Ejemplos de factores de crecimiento que se ha
demostrado que son producidos por embriones humanos incluyen
IL-1, IL-6, CSF-1 y
TNF-\alpha (Zolti y otros, Fertil. Steril.,
56 (1991) 265-272 y Witkin y otros, J.
Reprod. Immunol., 19 (1991) 85-93). El
TNF-\alpha se ha demostrado que está presente en
medio de cultivo de embriones humanos hasta el estadío de mórula,
pero no en el de blastocisto (Lachapelle y otros, Human
Reproduction, 8: 1032-1038 (1993). La
producción de citoquinas por el embrión puede por lo tanto estar
regulada en una manera específica de estadío.
Los datos sobre los posibles efectos directos de
las citoquinas en embriones han venido principalmente de
experimentos en ratones en los que se ha demostrado que muchas
citoquinas afectan el desarrollo de embriones previo al implante
in vitro. El INF-\gamma y
CSF-1, a concentraciones fisiológicas, inhiben el
número de embriones que desarrollan hasta el estadío de blastocisto
(Hill y otros, J. Immunol., 139 (1987)
2250-2254). TNF-\alpha se ha
demostrado también que tiene efectos más sutiles. Aunque el
TNF-\alpha no tiene un efecto evidente en las
velocidades de formación de blastocisto, parece que inhibe
específicamente la proliferación de células que contribuyen a la
masa de células internas (MCI), que dan como resultado blastocisto
con un ICM reducido (Pampfer y otros, Endocrinology,
134: 206-212 (1994)).
Otros factores de crecimiento también tiene
efectos específicos sobre las células MCI. Por ejemplo, los factores
de crecimiento 1 y 2 similares a la insulina estimulan la
proliferación de MCI, mientras que el factor inhibidor de la
leucemia (LIF) inhibe su diferenciación (Harvey y otros, Mol.
Reprod. Dev., 31 (1992) 195-199).
Se ha observado, en sistemas de ratón, que los
embriones cultivados in vitro se demoran en el desarrollo
comparado con los testigos in vitro, y exhiben velocidades de
embarazo más bajas tras la transferencia del embrión (Bowman, P. Y
McLaren, A., J. Embryol. Exp. Morphol., 24:
203-207 (1970)). Así, un mejor entendimiento del
papel de los factores de crecimiento en el desarrollo podría llevar
a mejorar las condiciones de cultivos in vitro y potenciar el
resultado en programas IVF humanos.
El factor de crecimiento de células madre (SCF)
es un factor de crecimiento relacionado en estructura al
CSF-1, y actúa a través del receptor tirosina
quinasa c-kit. En médula ósea, SCF y
CSF-1 actúan sinergísticamente para promover la
proliferación y la diferenciación de células madre en colonias de
macrófagos.
El documento de patente europea
EP-A-0423980 describe la secuencia
de ácidos nucleicos del SCF humano, y trata los usos potenciales de
SCF en condiciones que requieren la estimulación de proliferación
celular, particularmente células de la sangre.
En ratones, se ha demostrado que
c-kit se expresa a lo largo de todo el proceso
previo al implante (Arceci y otros (1992)). Los autores han
demostrado ahora que lo mismo es cierto en embriones humanos. A
ciertos estadíos los embriones humanos también expresan mARN de SCF,
sugiriendo que este factor de crecimiento puede actuar en una forma
autocrina. Esto está en contraste con el ratón, en el que no se ha
detectado expresión de SCF en embriones previo al implante (Arcceci
y otros (1992)).
Los transcritos de SCF de tamaño completo
consisten en ocho exones (Martin, F.H y otros, Cell,
63: 203-211 (1990)), cuyo papel también
describe una forma variante de SCF. También se ha descrito una
variante de corte y empalme de SCF que surge en virtud de la pérdida
del exón 6 (Flanagan y otros, Cell, 63:
1025-1035 (1991)).
Se ha encontrado ahora una nueva variante de
corte y empalme adicional que parece que surge debido a la inclusión
de un nuevo exón que consiste en 155 pares de bases entre los exones
3 y 4. Esto también da como resultado un desplazamiento en el marco
de lectura, y codifica una especie de SCF que comprende 33 nuevos
aminoácidos seguido del exón 3, antes de terminar en y en el mismo
marco del codon de terminación que ahora aparece en el exón 4 debido
al desplazamiento del marco.
Así, el presente invento proporciona SCF como se
caracteriza en las reivindicaciones. El presente invento proporciona
SCF que incluye la siguiente secuencia en el extremo
C-terminal:
o una secuencia que sea
sustancialmente homóloga a la
misma.
Preferiblemente, el nuevo SCF del invento
comprende los primeros 39 aminoácidos del SCF de tamaño completo
(sin incluir ninguna secuencia señal) seguido por los anteriormente
mencionados 57 aminoácidos. En una realización el nuevo SCF del
invento tiene una secuencia en las posiciones 1-39
sustancialmente homóloga a la mostrada en la figura 2.
Al nivel de aminoácidos, una secuencia proteica
puede verse como sustancialmente homóloga a otra secuencia proteica
si un número significativo de los aminoácidos constituyentes exhiben
homología. Al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99%,
en orden creciente de preferencia, de los aminoácidos pueden ser
homólogos.
Así, el mecanismo de corte y empalme alternativo
puede dar como resultado la producción de un nuevo SCF en embriones
humanos. Por lo tanto, el nuevo SCF del invento puede ser usado en
el tratamiento de embriones previo al implante para asegurar una
correcta diferenciación y desarrollo previamente a la implantación
en un sujeto.
Además, el invento también proporciona una
secuencia de ADN que codifica una proteína del invento cuya
secuencia incluye una secuencia:
e incluye todas las demás
secuencias de ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del
código genético, también codifican la secuencia aminoacídica dada o
que son sustancialmente homólogas a tal
secuencia.
Las secuencias que tienen una homología
sustancial pueden ser consideradas como las que hibridarán con la
secuencia de ácidos nucleicos mostradas en la figura 2 en
condiciones rigurosas (por ejemplo, a 35ºC hasta 65ºC en una
disolución salina de alrededor de 0,9 M).
Las construcciones de ADN que comprenden las
secuencias de ADN del invento forman otro aspecto del presente
invento.
Como se trata aquí, la proteína del invento es
útil en el tratamiento de embriones para asegurar el correcto
desarrollo previo al implante. El SCF se ha mostrado que actúa
uniéndose al receptor transmembrana c-kit. Además,
los autores muestran que los embriones expresan
c-kit a lo largo de la mayoría de los estadíos del
desarrollo embrionario previo al implante.
Además, el invento también proporciona el uso de
SCF en la fabricación de un medicamento para usar en asegurarse el
correcto desarrollo en embriones previo al implante. De nuevo,
cualquier forma de SCF puede ser usada para producir un medicamento
adecuado.
El medicamento se presenta preferiblemente en la
forma de una formulación farmacéutica que comprende la proteína del
invento junto con uno o más vehículos y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables. Tales formulaciones farmacéuticas
forman un aspecto adicional más del presente invento. Tales
formulaciones farmacéuticas representan una vía en la que el SCF
puede ser usado en los métodos descritos anteriormente.
El invento será ahora descrito por medio de los
siguientes ejemplos, ejemplos que no deberían ser interpretados de
ningún modo como limitantes del presente invento. Los ejemplos se
refieren a las siguientes figuras que muestran:
Figura 1: la secuencia del nuevo exón y la
secuencia aminoacídica predicha;
Figura 2: la secuencia del SCF humano;
Figura 3: gel de agarosa que muestra los
productos de amplificación por RT-PCR anidada o ARN
de embriones humanos. Cada panel muestra los productos de
amplificación con los cebadores específicos para diferentes cADN
diana. cADN amplificados de diferentes embriones fueron cargados en
cada carril. Los carriles están etiquetados según las etiquetas del
cADN en la Tabla 1 (a continuación). Las muestras adicionales
fueron: carril p, trofoblasto de primer trimestre; carril q, cADN de
200 células BeWO; carril r, 10 ng de ADN genómico humano; y carril
s, no tiene incorporación de cADN, como un testigo negativo. Los
marcadores de peso molecular de ADN fueron un escalera de 123 pares
de bases cargada en el carril i. Los tamaños de los productos de PCR
esperados se muestran en pb.
| Nombres de testigos | \hskip2cm | cADN de embriones humanos y estadío de desarrollo |
| a | \hskip1cm 2 células | |
| b | \hskip1cm 3 células | |
| c | \hskip1cm 4 células | |
| d | \hskip1cm 6 células | |
| e | \hskip1cm 8 células | |
| f | \hskip1cm mórula | |
| g | \hskip1cm blastocisto | |
| h | \hskip1cm sobrenadante de cultivo de a a g | |
| j | \hskip1cm tres blastocistos reunidos | |
| k | \hskip1cm sobrenadante de cultivo para j | |
| l | \hskip1cm 2 x 6 células y 1 x 8 células | |
| m | \hskip1cm sobrenadante de cultivo para l | |
| n | \hskip1cm 1 x 4 células y 1 x 6 células | |
| o | \hskip1cm sobrenadante de cultivo para n | |
| las muestras de a a h son del mismo donante. |
Figura 4: cebadores usados para
RT-PCR, pares externos A y B, pares internos C y
D.
Los embriones humanos criopreservados que habían
sido fertilizados como parte de un programa IVF fueron usados en
este estudio. Estos embriones habían sido donados por los padres
para propósitos de investigación y este estudio cumplía con los
requerimientos de la Autoridad de Embriología y Fertilización
Humana, y el comité ético local. Los embriones congelados fueron
descongelados y cultivados en medio de sales Earles equilibradas
suplementadas con albúmina de suero bovina al 0,4% (armour
Pharmaceuticals UK), hasta el estadío del desarrollo requerido,
después congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido en 5 \mul
de fluido de cultivo (y así lisadas mediante cristales de hielo). Un
volumen idéntico de sobrenadante de cultivo fue congelado como
testigo. Cualquier cúmulo de células restantes fue eliminado durante
la manipulación de rutina.
ARN total a partir de trofoblasto de primer
trimestre fue aislado mediante el método de Chomsczynski y Sacchi,
Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987) en
el que el tejido congelado es homogeneizado en 5 ml de tampón que
contenía tiocianato de guanidinio 4 M (Gibco BRL Livingston,
Escocia), citrato sódico 25 mM pH 7,0, sarcosil 0,5% y
2-mercaptoetanol 0,1 M. El lisado fue acidificado
mediante la adición de 0,5 ml de acetato sódico 2 M pH 4, y la
extracción con fenol-cloroformo fue hecha usando 5
ml de fenol saturado en tampón y 1 ml de
cloroformo-isoamilacohol (49:1 v/v). La suspensión
fue colocada en hielo durante 15 minutos y centrifugada a 10.000 g
durante 20 minutos a 4ºC. La fase acuosa que contenía ARN fue
precipitada, lavada dos veces en etanol 70%, secada y resuspendida
en TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,4 y EDTA 1 mM). La
concentración de ARN fue determinada espectrofotométricamente a 260
nm.
El ARN fue preparado a partir de embriones
humanos únicos usando un protocolo a baja escala basado en el
procedimiento anterior. Para ayudar a la precipitación del ARN se
añadieron 100 \mug de tARN vehículo de levadura (Gibco BRL,
Livingston, Escocia) en la etapa de homogeneización. Los detalles
restantes son como se describen anteriormente, excepto en que todos
los volúmenes fueron 50 veces menores y el procedimiento entero fue
llevado a cabo en tubos Eppendorf de 400 \mul.
El cADN fue sintetizado a partir de la mitad del
ARN total de cada embrión usando la transcriptasa inversa AMV (Super
RT, HT Biotech, Cambridge, UK). 3-5 microgramos de
ARNfueron cebados con oligo dT (Pharmacia), según las instrucciones
de los fabricantes durante 60 minutos a 42ºC. La amplificación por
PCR de las preparaciones de cADN fueron realizadas como estaba
descrito previamente (Sharkey, A. y otros, Molecular
Endocrinol., 6: 1235-1241 (1992)) con un
termociclador de ADN Hybaid Omnigene en un volumen final de 30
\mul usando 1 U de ADN polimerasa Taq (CETUR, Emeryville, CA) y 10
\mul de cada uno de los pares de cebadores externos (véase la
Figura 4) en el tampón recomendado por los fabricantes. Se usó el
siguiente perfil de ciclos: - 30s a 95ºC, 30 s a XºC, 30 s a 72ºC
durante 30 ciclos, en el que X es la temperatura de hibridación
para cada par de cebadores de citoquinas, como se muestra a
continuación.
| Cebadores externos (^{o}C) | Cebadores interno (^{o}C) | |
| SCF | 54 | 54 |
| ARN hist | 52 | 59 |
| c-kit | 56 | 56 |
Los cebadores oligonucleotídicos para SCF,
c-kit e Histidil-t ARN sintetasa
fueron sintetizados en un sintetizador de ADN Cruachem PS250. Las
secuencias de cebadores fueron diseñadas a partir de secuencias
nucleotídicas publicadas (véase la Figura 4), una amplificación tal
de cualquier ADN genómico contaminante daría como resultado un
producto de diferente tamaño a partir de las especies de cADN.
Debido a la pequeña cantidad de material, dos
pares de cebadores fueron usados para cada cADN diana, en un
protocolo de PCR anidado. Un tercio de los productos de cADN fueron
amplificados usando Amplitaq (CETUR), en el tampón recomendado por
los fabricantes. Tras 30 ciclos de PCR usando el par de cebadores
externos, un quinto de la primera ronda de reacción fue transferida
a un tubo fresco que contenía el par de cebadores internos, y
sometido a 30 rondas de amplificación adicionales. Como testigo
negativo, un volumen igual del fluido de cultivo en el que se hizo
crecer el embrión fue extraído y sometido a RT-PCR
de la misma manera. También se hizo un extracto de 200 células de la
línea celular BeWo (ECACC Nº 86082803) como testigo positivo.
Los cebadores usados en este estudio se muestran
en la Figura 4, junto con el tamaño del producto esperado. La
identidad de cada producto fue confirmada clonando y secuenciando
como se describe previamente (Sharkey y otros. Mol.
Endocrinol. (1992)). Para asegurarse que el producto detectado
era resultado de la amplificación de cADN más que de ADN genómico
contaminante, los cebadores fueron elegidos de modo que cruzaran los
límites intrón/exón. Diez nanogramos de ADN genómico fueron también
sometidos a PCR al mismo tiempo que el cADN para verificar que
ninguno de los productos del tamaño esperado era resultado de ADN
genómico.
La técnica de RT-PCR fue aplicada
al ARN total extraído de embriones humanos producidos mediante
fertilización in vitro. Los embriones fueron cultivados hasta
el estadío apropiado, después fueron rápidamente congelados en
nitrógeno líquido. Los embriones almacenados fueron descongelados y
el ARN total extraído. Para producir un producto de
RT-PCR detectable a partir de ARN total de un único
embrión, un protocolo de PCR anidado fue empleado en el cual el cADN
fue sometido a dos series de amplificación por PCR con un par de
cebadores externos, seguido de un par interno. Los cebadores se
basaron en secuencias de cADN publicadas y diseñadas para que se
extendieran en los límites intrón-exón de modo que
la amplificación de ADN genómico contaminante pudiera ser fácilmente
distinguible de los cADN producto.
Inicialmente, el cADN de cada embrión fue
ensayado con cebadores para la histidil tARN sintetasa (HistRS) para
confirmar el aislamiento con éxito de ARN y la transcripción
inversa. Los cebadores usados dieron lugar a productos débiles
mayores de 400 pb a partir de ADN y 110 pb a partir de cADN derivado
de HistRS mARN. Los transcritos para Hist RS fueron detectados en
mARN de embriones en todos los estadíos del desarrollo, así como en
la decidua y en la línea celular de coriocarcinoma BeWo, usadas como
testigos positivos (Figura 3, carriles p y q respectivamente). No se
detectó ningún producto en un volumen igual de sobrenadante de
cultivo embrionario extraído y sometido a RT-PCR de
la misma manera, indicando que no había contaminación del cultivo
con cADN o ARN
extraño.
extraño.
Ejemplos de análisis de RT-PCR
similares con cebadores para SCF y c-kit como se
muestra en la Fig 3. Los patrones de cADN fueron retrotranscritos a
partir de cada muestra de ARN en dos ocasiones separadas y los
análisis de PCR fueron repetidas dos veces sobre cada patrón de
cADN. Los resultados se muestran en la Figura 3, que muestra el
patrón de expresión de c-kit y SCF durante el
desarrollo previo al implante. La identidad de los fragmentos de PCR
del tamaño correcto fue confirmada secuenciando los productos de PCR
clonados. En casos en los que productos de tamaños nuevos fueron
observados, también fueron clonados y secuenciados.
Para SCF, el fragmento predicho es de 966 pb. Sin
embargo, los transcritos de SCF parecieron mostrar diferencias en
tamaño específicas de estadío. Tras el clonaje y la secuencia, los
nuevos productos parecieron surgir debido a un evento de corte y
empalme alternativo que inserta un nuevo exón entre los exones 3 y
4. La secuencia predicha del nuevo transcrito se muestra en la
Figura 1. El nuevo patrón de corte y empalme también implica un
desplazamiento en el marco, dando un total de 33 nuevos aminoácidos,
antes de un codon de terminación en el mismo marco de lectura en el
exón 4.
En un análisis similar usando cebadores
específicos para c-kit, el receptor para SCF mostró
que el c-kit se expresaba en la mayoría de los
estadíos del desarrollo embrionario previo al implante. Esto sugiere
que el embrión tiene la capacidad para responder a SCF a lo largo de
este período.
Muchos factores de crecimiento se ha demostrado
que influyen en el desarrollo de embriones de mamíferos cultivados
previo al implante (para una revisión véase Anderson, E. D., J.
Cellular Biochem., 53: 280-287 (1993) y
Schultz, G. A. Y Hevner, S., Mutat. Res., 296:
17-31 (1992)).
Sin embargo, hay buenas evidencias de diferencias
de especie a especie en la expresión de los receptores de factores
de crecimiento en el desarrollo previo al implante. Por ejemplo, el
mARN de EGF está expresado en el embrión de cerdo pero no ha sido
encontrado en ningún estadío en embriones de ratón previo al
implante (Vaughan y otros Development, 116:
663-669 (1992); Rapolee y otros, Science,
241: 1823-1825 (1988); y Watson, A.J. y
otros, Biol. Reprod., 50: 725-733
(1994)). Por lo tanto la utilidad de estos estudios para los
investigadores interesados en los factores que controla el
desarrollo humano previo al implante es limitado. Además, los
factores de crecimiento específico y los receptores investigados en
tales estudios han sido elegidos frecuentemente en base ad
hoc. Tanto por razones éticas como prácticas, tal aproximación
no es adecuada para usar con embriones humanos. Los autores han
usado por lo tanto un método de RT-PCR anidado que
les ha permitido cribar para la expresión de factores de crecimiento
y mARNs de receptores en embriones únicos humanos previo al
implante. Este método ha sido usado ampliamente a lo largo de los
últimos años en otras especies puesto que es fiable, sensible y
económico en su uso como material embrionario.
La RT-PCR con cebadores para la
Histidy-tARN sintetasa fue usada en muestras de cADN
para confirmar que el cADN había sido preparado con éxito a partir
de cada muestra de ARN embrionaria. El cADN específico para este gen
constitutivo fue detectado con éxito en muestras de cADN hecho
posible a través de un único embrión de 2-células,
indicando que el método fue lo suficientemente sensible para este
estudio.
El SCF se expresó en el estadío de 2 células, y
después reapareció en el estadío de 6 células. Esto es consistente
con la expresión materna seguido por la reexpresión a partir del
genoma de los embriones en el estadío de 6 células (Braude, P. y
otros, Nature, 332: 459-461 1988)).
Los transcritos de SCF parecieron mostrar diferencias específicas de
estadío en el tamaño del transcrito. Al clonar y secuenciar, se
encontró que estas diferencias eran debidas a corte y empalme
alternativo del transcrito primario. Dos de estas variante fueron
similares a las publicadas previamente (Martin y otro, supra
y Sharkey, A. y otros, Mol. Endocrinol., 6:
1235-1241 (1992)), y una fue una forma nueva que
predice una especie de SCF con 33 nuevos aminoácidos en el extremo
carboxilo terminal. Se conocen varias variantes de SCF, algunas de
las cuales están unidas a la membrana y son bioactivas. Estas
especies expresadas por el embrión previo al implante incluyen las
que se conoce que son bioactivas, e indican que varias formas de SCF
pueden actuar a través de c-kit expresado por el
embrión, y pueden afectar el desarrollo embrionario en este
tiempo.
Claims (10)
1. ADN que codifica para el factor de células
madre que comprende
a) la siguiente secuencia:
b) un ADN que es homólogo a la
misma debido a la degeneración del código
genético.
2. ADN que codifica para el factor de células
madre tiene la siguiente secuencia aminoacídica en el extremo
C-terminal:
\vskip1.000000\baselineskip
3. ADN como se reivindica en la reivindicación 2,
en el que la secuencia aminoacídica en las posiciones 1 a 39 es la
mostrada para los aminoácidos en las posiciones 1 a 39 en la
siguiente secuencia:
4. Un ADN que comprende un ADN como se define en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un polipéptido codificado por un ADN como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un polipéptido factor de células madre que es
al menos 70% idéntico a un factor de células madre, en el que la
secuencia aminoacídica en las posiciones 1 a 39 es la mostrada por
los aminoácidos en las posiciones 1 a 39 en la siguiente
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y en la que dicha secuencia va
seguida de la secuencia
aminoacídica
7. Un ADN que comprende un ADN que codifica el
polipéptido de la reivindicación 6.
8. Un polipéptido como se define en la
reivindicación 5 ó 6 para usar como un medicamento.
9. El uso de un polipéptido como se define en las
reivindicaciones 5 ó 6 en la fabricación de un medicamento para
usar en asegurarse el correcto desarrollo de embriones previo al
implante.
10. Una formulación farmacéutica que comprende un
polipéptido como se define en las reivindicaciones 5 ó 6 junto con
uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente
aceptables.
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