ES2242299T3

ES2242299T3 - Peptidos de lunasina.

Info

Publication number: ES2242299T3
Application number: ES98949514T
Authority: ES
Inventors: Benito O. De Lumen; Alfredo F. Galvez
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1997-09-25
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2018-09-25
Also published as: DE69830066D1; EP1017798A1; DE69830066T2; US20030229038A1; JP2001517434A; CA2303061C; US6544956B1; JP3818850B2; EP1017798B1; ATE294856T1; AU9582198A; US6107287A; WO1999015642A1; US7375092B2; CA2303061A1; AU731631B2

Abstract

Un método para interrumpir selectivamente la función mitótica en una célula diana que muestra una función mitótica no deseable que no se ha practicado en el cuerpo humano o animal, dicho método comprende las etapas de: identificar una célula diana que muestra una función mitótica no deseable e introducir en la célula diana una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos que se seleccionan independientemente de Asp y Glu, en la que dicho ácido nucleico se expresa en la célula diana, por lo que la función mitótica no deseable de la célula se interrumpe selectivamente, en el que dichos 8 a 18 aminoácidos contiguos son esenciales para interrumpir selectivamente la función mitótica no deseable y en el que los aminoácidos contiguos se encuentran en de los 12 restos del extremo carboxilo del péptido.

Description

Péptidos de lunasina.

Campo de la invención

La invención se refiere a una clase de péptidos que interrumpe la función mitótica en las células.

Antecedentes de la invención

El desarrollo temprano de las semillas en las angiospermas se caracteriza por las rápidas división y diferenciación celulares seguidas por el cese de la división celular y el comienzo de la expansión celular durante la cual se producen la endorreduplicación del DNA y la síntesis masiva de las proteínas de almacenamiento, glúcidos y lípidos en el endospermo de los cereales y en los cotiledones de las legumbres (1). Los mecanismos moleculares que subyacen a estos fenómenos tempranos se conocen mal. Se ha demostrado que la expresión temporal de las albúminas 2S, un grupo heterogéneo de proteínas hidrosolubles encontradas en semillas en desarrollo coincide con el inicio de la expansión celular después de que las células hayan dejado de dividirse en los embriones de guisantes en desarrollo. La hibridación in situ realizada en Arabidopsis sobre las células que se están dividiendo activamente y las parenquimáticas que no se dividen también sugiere la posible existencia de un mecanismo regulador que es común a la expresión génica del gen de la albúmina 2S y a su actividad mitótica (3). No obstante, la función de las albúminas 2S en la regulación de la mitosis durante el desarrollo de la semilla sigue sin estar claro.

En la técnica se conocen varios inhibidores mitóticos diferentes. Por ejemplo, el poli(ácido L- glutámico) suprime la polimerización de proteínas de los microtúbulos porcinos y, por lo tanto, inhibe la mitosis. Además, WEE1Hu, la isoforma humana de la proteína de levadura wee1+, inhibe la mitosis antes de la fase M, al fosforilar la ciclina B1 (28 y 29).

Compendio de la invención

La invención proporciona un método para interrumpir selectivamente la función mitótica en una célula diana que muestra una función mitótica no deseable que no se ha practicado en organismo humano o animal, dicho método comprende las etapas de identificar una célula diana que muestra una función mitótica no deseable e introducir en la célula diana un cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica un péptido, que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos, que se seleccionan independientemente de Asp y Glu, en el que dicho ácido nucleico se expresa en la célula diana, por lo que la función mitótica no deseable de la célula se interrumpe selectivamente, en el que dichos 8 a 18 aminoácidos contiguos son esenciales para interrumpir selectivamente la función mitótica no deseable y en el que los aminoácidos contiguos se encuentran dentro de 12 restos del extremo carboxilo del péptido. La invención también proporciona el uso de un ácido nucleico expresado en una célula diana y que codifica un péptido que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos que se seleccionan independientemente de Asp y Glu para fabricar un medicamento para interrumpir selectivamente la función en la célula diana en el organismo humano o animal que muestra una función mitótica no deseable, en el que dichos 8 a 18 aminoácidos contiguos son esenciales para interrumpir selectivamente la función mitótica no deseable y en el que los aminoácidos contiguos se encuentran dentro de los 12 restos del extremo carboxilo del péptido.

Células diana adecuadas incluyen células de mamíferos, de plantas y de bacterias, cuyas células pueden estar in vitro o in situ en el método descrito anteriormente. En las realizaciones concretas, el péptido comprende los restos 33 a 43 de la SEQ ID n.º 2 y/o, al menos, 12 restos contiguos de la SEQ ID n.º 2, restos 1 a 35. El péptido se puede introducir transfectando la célula con un ácido nucleico que comprende un fragmento de, al menos, 24 nucleótidos de la SEQ ID n.º 1.

En la presente memoria se describen diversos tipos de composiciones. Éstas incluyen moduladores de la función mitótica, péptidos de Gm2S-1, ácidos nucleicos que codifican péptidos de Gm2S-1, fármacos de unión específicos de los péptidos Gm2S-1 tales como anticuerpos y sondas de hibridación de ácido nucleico y cebadores que comprenden una cadena de la SEQ ID n.º 1 o un fragmento de la misma suficiente para hibridarse específicamente y, por lo tanto, facilitar la identificación, clonación, amplificación y/o modulación de la expresión de un gen que codifica un péptido de Gm2S-1.

Descripción de realizaciones concretas de la invención

La invención proporciona métodos para interrumpir selectivamente la función mitótica en una célula diana que muestra una función mitótica no deseable. Por lo tanto, estos métodos se pueden usar para interferir con (p. ej., promover, prevenir o retrasar) la división de la célula diana. La invención es aplicable a una amplia variedad de indicaciones en las que la función mitótica no es deseable, por ejemplo, cuantitativa, cualitativa, espacial o temporalmente. En una realización concreta, los métodos se usan para controlar el crecimiento no deseado de las células en la neoplasia humana, tal como el cáncer o la restinosis. En otra realización, la invención se usa para prevenir la división normal de microorganismos perjudiciales, p. ej., bacterias patógenas tales como las descritas en Medical Microbiology 4^{a}Ed. (S. Baron, Ed., 1996, UT Med Branch en Galveston). En otra realización más, la invención se usa para regular el desarrollo de semillas de plantas controlando el tiempo de terminación de la división celular que permite que se produzca la endorreduplicación del DNA.

Los métodos generales implican la introducción en la célula diana de una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica un péptido desorganizador de la función mitótica que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos que se seleccionan independientemente de Asp o Glu dentro de 12 restos del extremo carboxilo del péptido, suficiente para modular selectivamente la función mitótica de una célula. Como se demostró en la presente memoria, la invención abarca una amplia variedad de métodos, cantidades y longitudes de péptidos apropiados que se optimizan empíricamente con facilidad.

En realizaciones concretas, el péptido comprende un péptido de Gm2S-1 que comprende, al menos, un dominio de 8, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20, restos de la SEQ ID n.º 2 suficiente para interrumpir selectivamente la función mitótica de la célula. Tales péptidos pueden derivar de la lunasina (restos 22 a 64 de la SEQ ID n.º 2). Los aminoácidos ácidos contiguos se encuentran dentro de 12 restos, preferiblemente dentro de 6 restos, más preferiblemente dentro de 3 restos del extremo carboxilo del péptido. El péptido puede comprender una amplia variedad de restos adicionales, sobre todo restos ubicados hacia el extremo amino respecto a los aminoácidos ácidos, que incluyen restos que proporcionan, por ejemplo, la detección, direccionamiento, estabilización o resistencia proteolítica.

Los péptidos de Gm2S-1 que se buscan proporcionan una actividad o función específica de péptido Gm2S-1, tal como la interrupción de la función mitótica específica de Gm2S-1, la unión ligando/anticuerpo o la unión inhibidora, o la inmunogenia. La actividad o la función específica del péptido de Gm2S-1 se puede determinar por medio de los análisis convenientes in vitro basados en células o in vivo: p. ej., análisis de unión in vitro, análisis de cultivos celulares, en animales (p. ej., genoterapia, transgénicos). Los análisis de unión abarcan cualquier análisis en el que se evalúa la interacción molecular de un péptido Gm2S-1 con una diana de unión. La diana de unión puede ser una diana de unión intracelular natural tal como una proteína reguladora del péptido Gm2S-1 (p. ej., mapmodulina, Ulitzur et al, 1997, PNAS 94, 5084-5089) u otro regulador que modula directamente la actividad o la localización del péptido de Gm2S-1; o una diana de unión no natural tal como una proteína inmunitaria específica como un anticuerpo, o un fármaco específico del péptido Gm2S-1 tal como los identificados en los análisis de detección bio/químicos. La especificidad de unión al péptido Gm2S-1 se puede analizar por medio de los análisis de desorganización mitótica descritos más abajo, de constantes de equilibrio de la unión (normalmente, al menos aproximadamente 10^{7}M^{-1}, preferiblemente al menos aproximadamente 10^{8}M^{-1}, más preferiblemente al menos aproximadamente 10^{9}M^{-1}), por medio de la capacidad de los péptidos objeto para funcionar como mutantes negativos en células que expresan el péptido Gm2S-1, para inducir un anticuerpo específico del péptido Gm2S-1 en un hospedador heterólogo (p. ej., un roedor o un conejo), etc. La especificidad de unión del péptido Gm2S-1 de los péptidos de Gm2S-1 preferidos necesariamente se diferencia de la de la tubulina, las MAP y la mapmodulina.

En unas realizaciones particulares, los moduladores que comprenden los péptidos de Gm2S-1 están aislados o son puros: un péptido "aislado no" está acompañado de al menos parte de las sustancias con las que se asocia en su estado natural que, preferiblemente, constituye aproximadamente el 0,5% y, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 5%, en peso del péptido total en una muestra dada, y un péptido puro constituye al menos aproximadamente el 90% y, preferiblemente, al menos aproximadamente el 99%, en peso del péptido total en una muestra dada. Los péptidos se pueden sintetizar, producirse por tecnología recombinante o purificarse de células. Una amplia variedad de métodos moleculares y bioquímicos están disponibles para la síntesis bioquímica, la expresión molecular y la purificación de las composiciones del asunto, véanse, p.ej., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al. Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols en Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al. Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) o que, por lo demás, se conocen en la técnica. Materiales y métodos para la expresión de péptidos recombinantes heterólogos en células bacterianas (p.ej. E. coli), levadura (p.ej., S. cerevisiae), células animales (p.ej., CHO, 3T3, BHK, células de insectos compatibles con el baculovirus, etc.). Los péptidos se pueden proporcionar sin complejarse con otro péptido, complejados en una amplia variedad de asociaciones no covalentes y en complejos de unión, complejados covalentemente con otras secuencias de péptido Gm2S-1 o diferentes de Gm2S-1 (péptidos homo o heteroquiméricos), etc.

Los fármacos de unión específicos para los moduladores, que incluyen sustratos, agonistas, antagonistas y dianas de unión intracelulares naturales, los métodos para identificar y fabricar tales fármacos y su uso en el diagnóstico, el tratamiento y el desarrollo de fármacos también se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los nuevos fármacos de unión específicos de péptidos incluyen receptores específicos del péptido Gm2S-1, tales como los receptores polipeptídicos recombinantes somáticos como anticuerpos específicos o receptores de antígenos de los linfocitos T (véase, p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) y otros fármacos de unión intracelulares naturales identificados con análisis, tal como detecciones con simple, doble o triple híbrido, fármacos de unión intracelulares no naturales identificados en detecciones sistemáticas de quimiotecas, etc. Los fármacos de interés particular modulan la función del péptido Gm2S-1, p. ej., la desorganización mitótica dependiente del péptido Gm2S-1.

Los métodos eficaces para identificar fármacos activos en el nivel de una función celular modulable por Gm2S-1 generalmente implican analizar en busca de compuestos que modulan una interacción de los péptidos de Gm2S-1 con una diana de unión natural del péptido Gm2S-1. Se proporciona una gran variedad de análisis para los fármacos de unión, entre ellos, análisis de unión de proteína-proteína marcada in vitro, inmunoanálisis y análisis basados en células. Los métodos se pueden rastrear sistemáticamente de forma automática con una gran producción y rentabilidad de quimiotecas en busca de compuestos indicativos. Los fármacos que modulan las interacciones de un péptido Gm2S-1 con sus ligandos/dianas de unión naturales se pueden usar para modular los procedimientos biológicos asociados a una función del péptido Gm2S-1, p. ej., poniendo en contacto una célula que comprende un péptido de Gm2S-1 (p. ej., administrando a un sujeto que comprende tal célula) con tal fármaco. Los procedimientos biológicos afectados por los péptidos de Gm2S-1 incluyen una amplia variedad de procesos celulares que están afectados cuando un péptido de Gm2S-1 se une a un ligando, p. ej., la regulación de crecimiento de una semilla vegetal.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos objeto se usan para retrotraducir los ácidos nucleicos que codifican el péptido optimizados para determinados sistemas de expresión (Holler et al. (1993) Gene 136, 323-328; Martin et al. (1995) Gene 154, 150-166) o usados para generar cebadores de oligonucleótidos degenerados y sondas para usar en el aislamiento de las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido Gm2S-1 natural (paquete de programas ``GCG, Genetics Computer Group, Inc, Madison, WI). Los ácidos nucleicos que codifican péptidos moduladores se usan en vectores de expresión de péptidos y se incorporan en células huésped recombinantes, p. ej., para la expresión y la detección, p. ej., para estudios funcionales tales como la eficacia de fármacos candidatos a manipular la función celular modulada por el péptido, etc.

Los ácidos nucleicos de Gm2S-1 que incluyen sondas de hibridación y cebadores de replicación/amplificación que tienen una secuencia específica del ADNc de Gm2S1 que comprenden un fragmento de una cadena de la SEQ ID n.º 1 suficiente para efectuar una hibridación específica con la cadena complementaria de la SEQ ID n.º 1 (a saber, que hibrida específicamente con un ácido nucleico que comprende la cadena opuesta correspondiente de la SEQ ID n.º 1 en presencia de una genoteca de ADNc de semillas de soja a media maduración) también se describen en la presente memoria. Tales cebadores o sondas tienen una longitud de al menos 12, preferiblemente al menos 24, más preferiblemente al menos 36 y lo más preferiblemente al menos 96 bases. Demostrar la hibridación específica generalmente requiere unas condiciones rigurosas, a saber, las que 1) emplean una baja fuerza iónica y una elevada temperatura para lavar, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS 0,1% a 50ºC, o 2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl a 750 mM y citrato de sodio a 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es usar formamida al 50%, SSC 5 X (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1%, la disolución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2X y SDS 0,1%. Los ácidos nucleicos de Gm2S-1 también se pueden distinguir usando unos algoritmos de alineación, tales como BLASTX (Altschul et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J Mol Biol 215, 403-410). En una realización, los ácidos nucleicos de Gm2S-1 objeto comprenden las regiones codificantes del péptido Gm2S-1 de la SEQ ID n.º 1, p. ej., las bases 17 a 79 codifican un péptido de señal para Gm2S-1, las bases 80 a 208 codifican un péptido de lunasina, las bases 209 a 259 codifican un péptido conector de la alisina con la lunasina, y las bases 260 a 490 codifican un péptido de alisina.

Los ácidos nucleicos son de secuencias sintéticas/no naturales y/o están aislados, a saber, no están acompañados de al menos parte de las sustancias con las que se asocian en su estado natural, que preferiblemente constituye al menos aproximadamente el 0,5%, preferiblemente al menos aproximadamente el 5%, en peso del ácido nucleico total presente en una fracción dada, y usualmente recombinante, lo que significa que comprenden una secuencia no natural o una secuencia natural unida a un(os) nucleótido(s) diferente(s) al(los) que se une en un cromosoma natural. Los ácidos nucleicos recombinantes que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID n.º 1, o los fragmentos objeto de la misma, contienen tal secuencia o fragmento en un extremo, inmediatamente flanqueados por (es decir, contiguos a) una secuencia diferente a la que se une en un cromosoma natural, o flanqueados por una región flanqueante natural de menos de 10 kb, preferiblemente de menos de 2 kb, que está en un extremo o que está inmediatamente flanqueada por una secuencia diferente a la que se une en un cromosoma natural. Mientras que los ácidos nucleicos son normalmente RNA o DNA, a menudo es ventajoso usar ácidos nucleicos que comprenden otros análogos de bases o nucleótidos para proporcionar, p. ej., una estabilidad modificada.

Los ácidos nucleicos encuentran una gran variedad de aplicaciones que incluyen el uso como transcritos traducibles, vectores para delecionar o inactivar genes, sondas de hibridación, cebadores de la PCR, ácidos nucleicos de diagnóstico, etc.; el uso para detectar la presencia de genes y transcritos de Gm2S-1, y para detectar o amplificar ácidos nucleicos que codifican homólogos de Gm2S-1 adicionales y análogos estructurales. En el diagnóstico, las sondas de hibridación de Gm2S-1 se usan para identificar los alelos de Gm2S-1 de tipo mutante y salvaje. Los ácidos nucleicos de Gm2S-1 se usan para afectar y/o modular la expresión celular o la concentración intracelular o la disponibilidad del Gm2S-1 activo. Los métodos para afectar la expresión dirigida de los genes que codifican los moduladores se conocen en la técnica; véase, p.ej. Altenschmidt et al., 1997, J Mol Med 75:259-266; Perales et al. 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:6450-6455; Schmidt et al., 1997, Gene 190:211-216; Oldfield et al., 1993, Human Gene Therapy 4: 39-46; Asgari et al., 1997, Int J. Cancer 71:377-382; He D, et al. 1997, Cancer Res 57:1868-1872. Las composiciones terapéuticas a base de ácidos nucleicos se pueden combinar y/o usar ventajosamente en combinación con otros fármacos terapéuticos o profilácticos, diferentes de los compuestos objeto. En muchos casos, la administración junto con las composiciones objeto potencian la eficacia de tales fármacos, véase p.ej., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^{a} Ed., 1996, McGraw-Hill.

Sección experimental

Experimento 1

Clonación de Gm2S-1

En nuestra búsqueda de proteínas ricas en azufre endógenas en semillas de soja para mejorar su calidad nutritiva, clonamos un cDNA específico de cotiledones (Gm2S-1, SEQ ID n.º 1) que codifica una albúmina 2S de soja (Glicine max, Hodgson 78) de una genoteca de cDNA en lambda gt11 usando RNA poli-A de semilla de soja a media maduración. Brevemente, se obtuvo un producto de PCR de 500 pb mediante un protocolo de RACE con cebadores basados en 7 aminoácidos internos (EEGHMQK) del extremo amino de la proteína purificada de 8 kDa (Revilleza, et al. 1996). La plantilla es la segunda cadena del cDNA derivado del mRNA aislado de semillas de soja en la etapa de maduración media. El sitio de inicio de la transcripción se estableció mediante el protocolo de cRACE (Maruyama et al, 1995). El clon Gm2S-1 tiene un marco de lectura abierto de 770 bp que se encuentra en un fragmento de 1,5 kb EcoRI-BamHI cerca del extremo 3' del clon de cDNA de 2,5 kb que se hibridó con la sonda. El sitio del inicio de la transcripción se encuentra a 17 bp del ATG iniciador. La señal de poli-A se encuentra a 90 detrás del codón de terminación y la cola de poli-A se encuentra 138 bp cadena abajo de la señal de poli-A.

El cDNA completo codifica un marco de lectura (SEQ ID n.º 2) que incluye un péptido de señal de 21 restos y una pro-proteína que se procesa postraduccionalmente para producir una subunidad pequeña de 43 aminoácidos (lunasina) con un único extremo carboxilo que contiene el motivo de adhesión celular RGD seguido de 8 restos de ácido aspártico (5), un péptido conector de 17 aminoácidos y una subunidad grande de 77 aminoácidos (8 kDa) (alisina) rica en azufre (un 7,8% de metioninas), en lisina (13,0%) y en cisteína (7,8%). La pro-proteína es muy hidrófila con un pI predicho de 5,6. El análisis por Northern que usa el RNA total de embriones de soja en desarrollo (6) mostró que el transcrito de Gm2S-1 aparecía 3 semanas después de la floración, persistiendo hasta 7 semanas después de la floración (maduración tardía) pero que desaparece completamente en la semilla madura. Sólo se encontró en el cotiledón y en ningún otro tejido. La proteína se detecta mediante el método I-^{14}C-yodoacetato (de Lumen y Kho, 1987) 4 semanas después de la floración y sigue en el cotiledón durante la madurez. Esta expresión coincide con la fase de expansión celular del desarrollo de la semilla (7).

Experimento 2

Interrupción de la función mitótica en las bacterias

Pretendíamos producir péptidos purificados derivados de Gm2S-1, entre ellos, los péptidos lunasina y alisina, para pruebas de alergenidad usando vectores de expresión en bacterias. Inicialmente, los fragmentos amplificados por PCR que codifican la lunasina y un mutante de deleción de la lunasina (lunasina-del) (con 9 ácidos aspárticos eliminados del extremo carboxilo) se clonaron primero en el vector de clonación de PCR pGEM-T (Promega), luego se cortaron con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento del gen lunasina y lunasina-del que, luego, se subclonaron en el vector de expresión en bacterias pFLAG-1 (Kodak/IBI). Las construcciones de pFLAG con lunasina y lunasina-del se usaron para transformar células competentes de E. coli DH5 usando un protocolo estándar de choque térmico. En el transcurso de estos experimentos de expresión observamos que la expresión basal de la lunasina en las células de E. coli DH5 daba lugar a la formación de filamentos bacterianos alargados y sin tabicar. Este fenotipo no se detectó cuando los genes que codifican el péptido de la subunidad grande y la lunasina con un extremo sin el poli-aspartilo (lunasina-del) se expresaban en las células DH5, lo que indica que el extremo carboxilo de la lunasina es necesario para interrumpir la función mitótica en la división celular bacteriana.

Una desorganización mitótica similar se observa usando un gran conjunto de péptidos mutantes de deleción de la lunasina y la alisina (lunasina-del-n y alisina-del-n) y péptidos sintéticos similares a la lunasina/alisina (Gm2S-1-sin-n). Los péptidos de lunasina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios bacterianos incluyen (usando la convención de nomenclatura N\rightarrowC):

lunasina-del-1: la proteína de fusión MRG - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-2: la proteína de fusión OmpA - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-3: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - restos 48 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-4: la proteína de fusión FtsZ - restos 26 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-5: la proteína de fusión lacI - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-6: la proteína de fusión fragmento lacZ \alpha - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-7: la proteína de fusión OmpA - restos 44 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-8: la proteína de fusión FLAGG - restos 30 a 64 de lam SEQ ID n.º 2

lunasina-del-9: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-10: la proteína de fusión FtsZ - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-11: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.3) - restos 40 a 63 de la SEQ ID n.º2

lunasina-del-12: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.3) - restos 34 a 64 de la SEQ ID n.º2

Los péptidos de alisina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios bacterianos incluyen:

alisina-del-1: la proteína de fusión MRG - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-2: la proteína de fusión OmpA - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-3: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-4: la proteína de fusión FtsZ - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-5: la proteína de fusión lacI - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-6: la proteína de fusión fragmento lacZ \alpha - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-7: la proteína de fusión OmpA - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-8: la proteína de fusión FLAGG - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-9: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-10: la proteína de fusión FtsZ - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-11: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.3) - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º2

alisina-del-12: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.3) - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º2

Los péptidos de Gm2S-1-sin activos que sirven de ejemplo en estos estudios bacterianos incluyen:

Gm2S-1-sin-1: la proteína de fusión MRG - octa-aspartato

Gm2S-1-sin-2: la proteína de fusión OmpA - tetra-aspartato - tetra-glutamato

Gm2S-1-sin-3: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - nona-aspartato

Gm2S-1-sin-4: la proteína de fusión FtsZ - deca-aspartato

Gm2S-1-sin-5: la proteína de fusión lacI - octa-glutamato

Gm2S-1-sin-6: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - nona-glutamato

Gm2S-1-sin-7: la proteína de fusión OmpA - deca-glutamato

Gm2S-1-sin-8: la proteína de fusión FLAGG - tetra(aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-9: la proteína de fusión fragmento \alpha de lacZ - tri(aspartato-glutamato-aspartato)

Gm2S-1-sin-10: la proteína de fusión FtsZ - deca-(glutamato-aspartato)

Gm2S-1-sin-11: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.º 3) - tetra-glutamato - tetra-aspartato

Gm2S-1-sin-12: la proteína de fusión MEKIQGRG (SEQ ID n.º 3) - tetra (glutamato-aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-13: la proteína de fusión MRG - tri-glutamato - penta-aspartato

Los péptidos provocan una interrupción mitótica con varios métodos alternativos de introducción, que incluyen la absorción media directa, la absorción facilitada por medio de agentes caotrópicos, entre ellos los detergentes (p.ej. TWEEN20, etc.), sales de guanadina, etc, campo eléctrico pulsante, fusión con liposomas, etc. Alternativamente, los péptidos se introducen indirectamente por expresión dentro del microorganismo diana. Tal expresión se puede efectuar transitoriamente o por inducción de un gen introducido de forma estable que codifique el péptido. En la técnica, se conoce una gran variedad de métodos bien establecidos para facilitar la introducción, expresión y/o integración estable de genes exógenos en hospedadores microbianos.

Se observa actividad en una gran variedad de bacterias diferentes probadas, particularmente bacterias patógenas. La bacterias que sirven de ejemplo muestran una desorganización mitótica con los péptidos que incluyen los anteriores péptidos de lunasina-del, alisina-del y Gm2S-1-sin. Tales bacterias incluyen:

1: N.º de la ATCC 6357: Chromobacterium violaceum

2: N.º de la ATCC 25419: Serratia marcescens Bizi

3: N.º de la ATCC 19107: Vibrio sp. depositors/D

4: N.º de la ATCC 55191: Streptococcus agalactiae

5: N.º de la ATCC 55192: Streptococcus agalactiae

6: N.º de la ATCC 55193: Streptococcus agalactiae

7: N.º de la ATCC 19106: Vibrio tubiashii Hada

8: N.º de la ATCC 19105: Vibrio tubiashii Hada

9: N.º de la ATCC 19108: Vibrio alginoliticus

10: N.º de la ATCC 55194: Streptococcus agalactiae

11: N.º de la ATCC 700024: Vibrio ichthyoenteri

12: N.º de la ATCC 32751: Fusarium sp. depositors

13: N.º de la ATCC 700023: Vibrio ichthyoenteri

14: N.º de la ATCC 19109: Vibrio tubiashii Hada et

15: N.º de la ATCC 19310: Pseudomonas syringae sub

16: N.º de la ATCC 15302: Mycoplasma gallisepticum

17: N.º de la ATCC 15310: Burkholderia mallei

18: N.º de la ATCC 43115: Spiroplasma phoeniceum S

19: N.º de la ATCC 24458: Metarhizium anisopliae

20: N.º de la ATCC 62337: Cladosporium tenuissimum

Experimento 3

Interrupción de la función mitótica en las semillas vegetales

En este experimento, observamos que los genes que codifican los péptidos de Gm2S-1 pueden volver a poner en marcha la división celular cuando se sobreexpresan o inducen en células del parénquima de almacenamiento del cotiledón. En experimentos concretos, los péptidos de la lunasina muestran una desorganización mitótica en las células parenquimatosas del cotiledón y del endospermo mediante otros vectores binarios para transformar mediante Agrobacterium (familia pPZP de vectores binarios y pBIN19) y otros vectores de clonación para el método biolístico de transformación vegetal (a saber, la serie de vectores de clonación pBluescript y la familia de vectores de clonación pUC).

El endospermo de los cereales y el cotiledón de las legumbres constituyen al menos el 85% de la masa de la semilla y este tamaño de la semilla se correlaciona genéticamente con el rendimiento de cosecha al menos un 80%. Por lo tanto, la manipulación in vivo de la expresión del gen de la lunasina nos proporcionó unos métodos eficaces de aumentar la producción de las principales plantas de cultivo a partir de semillas. Específicamente, al alterar las estructuras temporal y espacial de la expresión de la lunasina en células parenquimatosas de las semillas en desarrollo, pudimos aumentar significativamente la longitud y la magnitud de la fase de expansión celular y el número de células que se someten a endorreduplicación del DNA, lo que dio lugar a semillas mayores que las normales. Para llevar a cabo esto, las regiones reguladoras en 5' del gen de la conglicinina de la soja (un elemento de secuencia de DNA de 170 pb que se encuentra 200 nucleótidos cadena arriba del sitio de comienzo de la transcripción) que confiere la expresión específica de cotiledón (Chen et al., 1988, EMBO J 7:297) y el gen de la glutenina (un elemento de secuencia de DNA de 121 pb que está 437/317 nucleótidos cadena arriba del sitio del inicio de la transcripción) que confiere expresión específica de endospermo (Yoshihara and Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107) se introducen en la posición -90 del promotor 35S del CaMV que, luego, se fusiona a los fragmentos de DNA que codifican la traducción en fase de los péptidos de la lunasina y de la lunasina-del. Las construcciones de DNA se ligan al vector binario, pKYLX71 (Lloyd et al., 1992, Science 258:1773) para transformar con Agrobacterium, y al vector pGEM-3Zf(+) (Promega) para la transformación biolística (Cho et al., 1995, Plant Mol Biol Rept 13:255). La transformación mediada por Agrobacterium que usa construcciones de DNA específicas de los cotiledones se utiliza con la mayoría de las dicotiledóneas, a saber, legumbres (soja, guisantes, cacahuetes y judías), Arabidopsis thaliana y tabaco. Para las monocotiledóneas como los cultivos de granos de cereales, trigo, arroz, cebada, centeno y com, el método biolístico de transformación se realiza mediante construcciones de DNA específicas del endospermo. La expresión del péptido de la lunasina en las semillas en desarrollo de todas estas especies vegetales se controla por medio de la inmunolocalización con anticuerpos derivados específicamente del epítopo del extremo carboxilo del péptido de la lunasina. La sobreexpresión de la lunasina en una mayor proporción de células parenquimatosas conduce a la detención del ciclo celular y permite que las células realicen ciclos adicionales de endorreduplicación del DNA que conduce a células más grandes y, consecuentemente, a mayores tamaños de semillas.

Una desorganización mitótica similar se observa usando un conjunto numeroso de péptidos mutantes de deleción de la lunasina y la alisina (lunasina-del-n y alisina-del-n) y péptidos sintéticos similares a la lunasina/alisina (Gm2S-1-sin-n). Los péptidos de la lunasina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios de transformación de plantas incluyen:

lunasina-del-2: la proteína de fusión \alpha-tubulina - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-3: la proteína de fusión \beta-tubulina - restos 48 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-4: la proteína de fusión MAP2 - restos 26 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-5: la proteína de fusión Mapmodulina - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-6: la proteína de fusión GFP - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-7: la proteína de fusión MAP4 - restos 44 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-8: la proteína de fusión FLAGG - restos 30 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-9: la proteína de fusión \alpha-tubulina - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-10: la proteína de fusión \beta-tubulina - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-11: la proteína de fusión SEQ ID n.º2, restos. 48 a 55 - restos 40 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-12: la proteína de fusión SEQ ID n.º2, restos. 48 a 55 - restos. 34 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-13: la proteína de fusión MRG - octa-aspartato

lunasina-del-14: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - octa-aspartato

lunasina-del-15: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - MRG - octa-aspartato

lunasina-del-16: la proteína de fusión SEQ ID n.º2, restos 48 a 55 - SEQ ID n.2, restos 48 a 55 - octa-aspartato.

lunasina-del-17: la proteína de fusión MRG - tetra-aspartato - tetra-glutamato

lunasina-del-18: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - octa-glutamato

lunasina-del-19: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 1 a 21 - MRG - deca-glutamato

lunasina-del-20: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - SEQ ID n.2, restos 48 a 55 - tetra-aspartato - tetra-glutamato

Los péptidos alisina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios con plantas incluyen:

alisina-del-1: la proteína de fusión MRG - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-2: la proteína de fusión \alpha-tubulina - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-3: la proteína de fusión \beta-tubulina - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-4: la proteína de fusión FLAGG - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-5: la proteína de fusión GFP - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-6: la proteína de fusión mapmpodulina - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-7: la proteína de fusión MAP2 - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-8: la proteína de fusión MAP4 - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-9: la proteína de fusión \alpha-tubulina - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-10: la proteína de fusión \beta-tubulina - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-11: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-12: la proteína de fusión SEQ ID n.º 2, restos 48 a 55 - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

Los péptidos de Gm2S-1-sin activos que sirven de ejemplo en estos estudios con plantas incluyen:

Gm2S-1-sin-1: la proteína de fusión MRG - octa-aspartato

Gm2S-1-sin-2: la proteína de fusión \alpha-tubulina - tetra-aspartato - tetra-glutamato

Gm2S-1-sin-3: la proteína de fusión \beta-tubulina - nona-aspartato

Gm2S-1-sin-4: la proteína de fusión FLAGG - deca-aspartato

Gm2S-1-sin-5: la proteína de fusión GFP - octa-glutamato

Gm2S-1-sin-6: la proteína de fusión MAP2 - nona-glutamato

Gm2S-1-sin-7: la proteína de fusión mapmodulina - deca-glutamato

Gm2S-1-sin-8: la proteína de fusión FLAGG - tetra(aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-9: la proteína de fusión GFP - tri(aspartato-glutamato-aspartato)

Gm2S-1-sin-10: la proteína de fusión MAP2 - deca-(glutamato-aspartato)

Gm2S-1-sin-11: la proteína de fusión \alpha-tubulina - tetra-glutamato - tetra-aspartato

Gm2S-1-sin-12: la proteína de fusión \beta-tubulina - tetra(glutamato-aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-13: la proteína de fusión MAP4 - tri-glutamato - penta-aspartato

Los péptidos proporcionan interrupción mitótica cuando se inducen en plantas transgénicas que se transformaron fusionando las regiones codificantes con las regiones 5' del promotor del cotiledón y los genes específicos de endospermo, que incluyen genes específicos de cotiledones tales como At2S1, At2S2 y Gm2S-1; y genes específicos de endospermo tales como Hth-1, prolamina, glutenina1D1, \beta-glucosidasa, globulina-1, zeína (pML1), etc.

Experimento 4

Desorganización de la función mitótica en células de mamíferos

El fenotipo de formación de filamentos sin tabicación en los procariotas está causado por las mutaciones que interrumpen la polimerización de Fts-Z (protofilamento) en la placa de división celular bacteriana (9). Se ha postulado la hipótesis de que el Fts-Z es el precursor evolutivo de las tubulinas eucarióticas ya que son estructuralmente similares y ambas desempeñan funciones similares en la división celular (9). La interrupción de la división celular bacteriana mediada por el Fts-Z causado por los péptidos de Gm2S-1 y su actividad en las células vegetales nos llevó a formular la hipótesis de que este péptido de soja podría tener, generalmente, un efecto similar en la división celular eucariótica, incluidas las células humanas y de mamíferos, particularmente las transformadas o las células neoplásicas.

Inicialmente, para probar esta hipótesis, las células del hepatoma murino en cultivo (Hepa lclc7) se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión de mamíferos, el pEGFP-C1 (10), que contiene el gen de la lunasina y el mutante lunasina-del (menos los 9 restos de ácido aspártico) marcados con el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) en el extremo amino. Al etiquetar con la GFP pudimos controlar las células transfectadas y observar los cambios celulares mediante microscopia de fluorescencia y llevar a cabo un análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo. Estos datos muestran el efecto de la expresión de los genes lunasina y lunasina-del en las células del hepatoma murino que se dividen activamente. La división celular normal se produjo en las células transfectadas con lunasina-del a las 24 h, 48 h y las 72 h después de la transfección. No se observaron cambios morfológicos en las células transfectadas y las no transfectadas como se demuestra por medio del contraste de fases y la fluorescencia de la GFP. A las 72 h, al menos 3 ciclos de división celular dieron lugar a la dilución de la fluorescencia de la GFP en estas células como resultado de la expresión transitoria de lunasina-del.

A diferencia de la división celular normal observada en el control del mutante de deleción, la expresión de lunasina en las células del hepatoma murino dio lugar a unos cambios morfológicos macroscópicos, que se observaron con contraste de fases y en imágenes fluorescentes tras 48 h, 72 h y 80 h. A las 48 h, las células eran más grandes y, generalmente, se observó una fluorescencia de la GFP más brillante en comparación con las células transfectadas con lunasina-del. Mediante tinción con una baja concentración de yoduro de propidio (10), se visualizaron los cromosomas metafásicos condensados mediante microscopia de contraste de fases y mostraron una orientación dispersa en lugar de la alineación normal a lo largo de la placa metafásica. A las 72 h, las células transfectadas con lunasina se habían lisado, y mostraron una degradación de la membrana celular y la expulsión de los cromosomas condensados de la célula rota. La fluorescencia de la GFP estaba asociada a los fragmentos cromosómicos, lo que indicó una anexión de la lunasina a los cromosomas incluso después de la desintegración de la membrana celular. A las 80 h de la transfección se observó más fragmentación de los cromosomas y la consecuente dilución de la fluorescencia de la GFP.

La orientación anormal de los cromosomas metafásicos, la forma alargada de las células y la no dilución de la GFP en las células transfectadas con lunasina tras 48 h sugieren que se ha producido la detención mitótica. Para determinar si hay un aumento en la proporción de las células del hepatoma murino en la etapa mitótica en las células transfectadas con lunasina, se realizaron una citometría de flujo y un análisis del ciclo celular en 12 transfecciones independientes usando construcciones del pEGFP-C1 con lunasina y lunasina-del, y el vector pEGFP-C1 sólo (11). Al variar los parámetros de la electroporación y al usar diferentes densidades de células en cada experimento de transfección, se obtuvieron eficacias en un margen del 0,3 al 15% (11). La proporción de las células que se encuentran en la fase G2/M se midió tras 48 h. Para cada experimento de transfección, las células transfectadas con lunasina tuvieron una proporción coherente y mayor de células en la G2/M en comparación con los dos controles, células transfectadas con lunasina-del y células transfectadas con el pEGFP-C1, como reflejaban los valores positivos para la detención en G2/M. La detención en G2/M se calculó como la diferencia entre la proporción de las células en G2/M en las células transfectadas con la lunasina y el promedio de los dos controles, cuyos valores percentiles de la G2/M no fueron estadísticamente diferentes uno de otro (11). Para determinar si hay alguna relación entre la detención en G2/M y la eficacia de la transfección con lunasina, se generó una gráfica de regresión lineal y se calculó la correlación del momento-producto de Pearson usando las dos variables. Hubo una correlación significativa positiva entre la detención mitótica y la eficacia de transfección del gen lunasina, lo que indicó que la expresión de la lunasina dio lugar a la detención mitótica de las células del hepatoma murino en división. De este modo, es posible aumentar la proporción de células que se consiguen detener en la mitosis al mejorar la eficacia de transfección del gen lunasina en las células que se dividen activamente.

A diferencia de la mayoría de los fármacos antimitóticos que atenúan la división celular (12), la expresión transitoria de lunasina no sólo condujo a la detención mitótica sino también a la lisis celular y a la rotura de los cromosomas condensados dentro de un breve periodo. La fragmentación del DNA, un distintivo de la respuesta apoptótica tardía, se midió consecuentemente usando el análisis de TUNEL (13) en las células transfectadas con lunasina y lunasina-del a las 24 h, las 48 h y las 72 h después de la transfección. Las células transfectadas con lunasina-del no mostraron la respuesta apoptótica a las 24 h y las 48 h de la transfección. Por otra parte, algunas de las células transfectadas con lunasina fueron apoptóticas (fluorescencia amarilla) ya a las 24 h de la transfección. Las células apoptóticas mostraron un contorno celular deformado y ninguna adherencia a la superficie de cristal a las 48 h. A las 72 h, los cromosomas condensados visualizados mediante contraste de fases comenzaron a desagruparse y a fragmentarse, lo que se observó por medio de la prueba de TUNEL. En la lisis celular, los cromosomas además se rompieron en fragmentos de DNA más pequeños, según se reveló por medio del contraste de fases y del análisis de TUNEL.

La detención mitótica causada por la expresión de lunasina parece que se produjo en la transición metafase a anafase y debió implicar cambios en el ensamblaje de las fibras del huso como resultado de la interrupción de la dinámica de los microtúbulos, que es el mecanismo común entre los fármacos antimitóticos (12). Para determinar si el mismo mecanismo está implicado en el efecto antimitótico de la lunasina, se visualizó la formación de los microtúbulos mediante marcación inmunofluorescente indirecta de la tubulina en las células del hepatoma murino transfectadas con lunasina y lunasina-del (14). Hubo un ensamblaje normal de las fibras del huso en la anafase en las células transfectadas con lunasina-del que se dividen activamente. En cambio, las células transfectadas con lunasina mostraron a las 48 h un alargamiento anormal de las fibras del huso que emanaban de dos polos opuestos del huso mitótico. En las células con la mitosis detenida no se encontró la forma fusiforme normal del ensamblaje de las fibras del huso durante la metafase y la anafase temprana; en cambio, las fibras fusiformes se proyectaron desde los centriolos de los polos opuestos en una orientación mal alineada. A las 72 h de la transfección, las fibras del huso alargadas todavía estaban intactas y parecieron extenderse a lo largo de las células anormalmente grandes, aunque la sección medial de la célula ya había comenzado a lisarse. Para visualizar el DNA cromosómico en estas células en lisis, se añadió yoduro de propidio a la reacción de marcación con inmunofluorescencia (14). Una célula transfectada con lunasina que se había detenido en la etapa de metafase reveló que la masa cromosómica estaba localizada asimétricamente cerca de un centriolo pero con algunos cromosomas que parecían migrar al polo opuesto y difundir desde la célula en lisis.

La morfología de las fibras anormales del huso y el movimiento aberrante de los cromosomas durante la mitosis que temporalmente condujo a la apoptosis sugieren dos modelos de detención mitótica en las células transfectadas con lunasina en base al efecto de la lunasina en la dinámica de los microtúbulos y su asociación al DNA cromosómico. La pérdida del efecto antimitótico y citotóxico en la deleción del extremo carboxilo de ácido poli-aspártico cargado negativamente indica que el efecto antimitótico de la lunasina implica interacciones electroestáticas con la maquinaria de la división celular.

El mecanismo de la detención mitótica por medio de fármacos antimitóticos como la vinblastina, la colchicina, el nocodazol y el taxol implica la unión de estos compuestos a los extremos positivos del microtúbulo, lo que conduce a la interrupción de la dinámica de los microtúbulos del huso mitótico (12). La vinblastina, la colchicina y el nocodazol despolimerizan los microtúbulos en concentraciones elevadas mientras que el taxol favorece la polimerización e inhibe el desensamblaje de los microtúbulos, por lo que bloquea la función del huso durante la mitosis (12). Sin embargo, a diferencia de estos compuestos, la lunasina, con su extremo carboxilo muy ácido, no parece unirse directamente a los microtúbulos (es decir, a través de la región del extremo carboxilo ácido de la tubulina) sino que podría afectar indirectamente la dinámica de los microtúbulos a través de su asociación con las proteínas asociadas a los microtúbulos (las MAP). Los experimentos in vitro con microtúbulos del cerebro de la rata mostraron que los polímeros de aminoácidos ácidos sintéticos de gran masa molecular se pueden unir a la región básica de unión a la tubulina de las MAP mediante una interacción electrostática (15). Las MAP de las células no neuronales de mamíferos incluyen los motores mitóticos, la dineína y la cinesina (16), así como también la MAP4 que promueve el ensamblaje de los microtúbulos y su estabilidad in vitro (17), aunque su eliminación de los microtúbulos in vivo no produjo ningún cambio celular durante la mitosis (18). Sin embargo, la posible inhibición de la unión de la dineína y la cinesina a los microtúbulos (16) por el acoplamiento competitivo de la lunasina cargada negativamente al sitio de unión de los microtúbulos cargado positivamente de estas proteínas motoras podría explicar el movimiento aberrante y la distribución asimétrica de los cromosomas durante la mitosis en las células transfectadas con la lunasina.

Es evidente, a partir de las imágenes fluorescentes de la GFP tras la lisis celular, que la lunasina todavía seguía unida a los cromosomas en fragmentación, más probablemente a través de la formación de complejos con las proteínas histónicas muy básicas que componen la cromatina. En este modelo de detención mitótica, la formación del complejo entre la cromatina de DNA y la lunasina en la prometafase previene la anexión del extremo positivo de los microtúbulos a los cromosomas, particularmente en la región heterocromatizada del cinetocoro, por lo que se inhibe la reunión simultánea de los cromosomas en la placa metafásica. La orientación desalineada del huso podría ser indicativa de la incapacidad de las fibras del huso para formar una anexión bipolar al cinetocoro, de tal modo que previene la formación del huso tenso (19) y, consecuentemente, la forma fusiforme normal del ensamblaje de las fibras del huso en la metafase (20). Las fibras alargadas del huso que se observan también podrían ser la consecuencia de la ausencia de anexión de los microtúbulos del huso al cinetocoro. Esto podría ser resultado de la polimerización continua de microtúbulos y de la inhibición del desensamblaje de los microtúbulos causadas por la desorganización de la dinámica normal de los microtúbulos del cinetocoro durante la mitosis (20, 21).

La naturaleza de la interrupción de la división celular por la expresión de lunasina en las células del hepatoma murino sugiere que su efecto no debe ser específico de un tipo de célula en particular. Para probar si el mismo efecto antimitótico se produce en otras células en división activa, se transfectaron unas construcciones del pEGFP-C1 con lunasina y lunasina-del en células del cáncer de mama humano (MCF7) (22) y se realizó el análisis de TUNEL para detectar la apoptosis (13). Las células MCF-7 transfectadas con lunasina-del no mostraron ninguna división celular aberrante ni apoptosis a las 48 h de la transfección. En cambio, la fragmentación del DNA y el movimiento anormal de los cromosomas en la mitosis se observaron en las células transfectadas con lunasina a las 48 h de la transfección. Al igual que en las células del heptatoma murino, la expresión de lunasina en las células del cáncer de mama humano también dio lugar a la lisis celular, la fragmentación cromosómica y la apoptosis. La respuesta apoptótica asociada con el efecto antimitótico de la lunasina en el hepatoma murino y en las células del cáncer de mama humano es similar a la respuesta inusualmente rápida de la T47D (estirpe celular del cáncer de mama humano) al taxol y al nocadazol y la sensibilidad de esta estirpe celular a los inhibidores del huso mitótico se ha atribuido a la reducción de la concentración de la proteína de control mitótico humano, la hsMAD2, en el cinetocoro (23).

Una desorganización mitótica similar se observa usando un conjunto numeroso de péptidos mutantes de deleción de la lunasina y la alisina (lunasina-del-n y alisina-del-n) y péptidos sintéticos similares a la lunasina/alisina (Gm2S-1-sin-n). Los péptidos de lunasina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios con mamíferos incluyen (usando de nuevo la convención de nomenclatura N\rightarrowC):

lunasina-del-9: la proteína de fusión CICLINA A - restos 57 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-10: la proteína de fusión CICLINA B1 - restos 54 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-11: la proteína de fusión CICLINA B2 - restos 40 a 63 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-12: la proteína de fusión CICLINA B3 - restos 34 a 64 de la SEQ ID n.º 2

lunasina-del-13: la proteína de fusión SH2 - octa-aspartato

lunasina-del-14: la proteína de fusión SH3 - octa-aspartato

lunasina-del-16: la proteína de fusión SEQ ID n.º2, restos 48 a 55 - SEQ ID n.2, restos 48 a 55 - octa-aspartato

lunasina-del-20: la proteína de fusión SEQ ID n.º2, restos 48 a 55 - SEQ ID n.2, restos 48 a 55 - tetra-aspartato - tetra-glutamato

Los péptidos alisina-del activos que sirven de ejemplo en estos estudios con mamíferos incluyen:

alisina-del-1: la proteína de fusión MRG - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-5: la proteína de fusión GFP - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-6: la proteína de fusión mapmodulina - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-9: la proteína de fusión CICLINA A - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-10: la proteína de fusión CICLINA B1 - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-11: la proteína de fusión CICLINA B2 - restos 123 a 130 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-12: la proteína de fusión CICLINA B3 - restos 120 a 132 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-13: la proteína de fusión SH2 - restos 84 a 91 de la SEQ ID n.º 2

alisina-del-14: la proteína de fusión SH3 - restos 82 a 92 de la SEQ ID n.º 2

Los péptidos Gm2S-1-sin activos que sirven de ejemplo en estos estudios con mamíferos incluyen:

Gm2S-1-sin-1: la proteína de fusión MRG - octa-aspartato

Gm2S-1-sin-3: la proteína de fusión \beta-tubulina - nona-aspartato

Gm2S-1-sin-4: la proteína de fusión FLAGG - deca-aspartato

Gm2S-1-sin-5: la proteína de fusión GFP- octa-glutamato

Gm2S-1-sin-6: la proteína de fusión MAP2 - nona-glutamato

Gm2S-1-sin-7: la proteína de fusión mapmodulina- deca-glutamato

Gm2S-1-sin-8: la proteína de fusión CICLINA A - tetra(aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-9: la proteína de fusión CICLINA B1 - tri(aspartato-glutamato-aspartato)

Gm2S-1-sin-10: la proteína de fusión CICLINA B2 - deca-(aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-11: la proteína de fusión CICLINA B3 - tetra-glutamato - tetra-aspartato

Gm2S-1-sin-12: la proteína de fusión SH2 - tetra(glutamato-aspartato-glutamato)

Gm2S-1-sin-13: la proteína de fusión SH3 - tri-glutamato - penta-aspartato

Los péptidos consiguen la desorganización mitótica mediante varios métodos alternativos de introducción, que incluyen la toma directa del medio, la toma facilitada mediante agentes caotrópicos que incluyen detergentes (p. ej., TWEEN20, etc.), sales de guanadina, etc., campo eléctrico pulsante, fusión de liposomas, etc. Alternativamente, los péptidos se introducen indirectamente por medio de la expresión dentro de la célula diana. Tal expresión se puede efectuar mediante la introducción del gen que codifica el péptido de forma transitoria o de forma estable.

Se observa actividad en una gran variedad de células distintas probadas, particularmente tipos celulares de patógenos. Las células que sirven de ejemplo que muestran desorganización mitótica con péptidos que incluyen la lunasina-del y la lunasina-syn-1-12 incluyen: células transformadas de mamíferos que incluyen: los n.º de la ATCC: CRL-1435: PC-3; HTB-81: DU 145; HB-11430: 9H10-A4; HB-9119: P25.48; HB9120: P25.91; CRL-2220: CA-HPV-10; HB-9140: P25.15; CRL-1740: clon LNCaP; CRL-10995: LNCaP-FGC; HB8279: T16; CRL-7535: Hs 804.Sk; CRL-2221: PZ-HPV-7; CRL-5813: NCI-H660; CRL-2222: YPEN-1; HB-8428: S27; HB-10494: 7E11C5; HB-8051: F5-A-1/22.8.13; HB-8525: RLSD09; HB-8527: RLSD06 y CRL-7930: IK-15; células de mieloma, entre ellas los n.º de la ATCC: TIB-98: RDP 45/20; TIB-157: LS 136: HB-88: Bet-2; HB-43: 1410 KG7; HB-45: 141PF11; HB-100: Bet-1; HB-121: ESBB3IIA2; TIB-132: 80 V 5B4 CRL-1869: 6F4C5; TIB-17: XS63;HB-128: 2E.6; HB-9762: NUH-2; TIB-194: 2F.11.15; TIB-109: N-S.8.1; HB-8478: C-2; HB-8479: LA-5; HB-8480: LA-4; HB-8481: Re-2; HB-8482: Re-1; HB-8705: L21-6; carcinoma hepático que incluyen los n.º de la ATCC: CRL-7549: Hs 817.T; HB-8065: Hep G2; CRL-7930: IK-15; CRL-7929: IK-6; CRL-7454: Hs 715.K; CRL-6504: VX7; CRL-7721: MB 157;HB-8431: ME195; HB-8411: MF116; CRL-7369: Hs 607.T; CRL-7758: TE 206.T; CRL-7192: Hs 227.T; HB-8410: MF61; CRL-7335: Hs 566(A).T; CRL-7211: Hs 249.T; CRL-7214: Hs 257.T; CRL-7833: Hs 172.T; CRL-7870: Hs 740.T; CRL-7139: Hs 187.T; CRL-7159: Hs 200.T; células de carcinoma de colon, entre ellas los n.º de la ATCC: CRL-7214: Hs 257.T; CRL-7168: Hs 207.T; CRL-7892: Hs 844.T; CRL-7423: Hs 682.T; CRL7884: Hs 785.T; CRL-7351: Hs 586.T; CRL-7139: Hs 187.T;-7159: Hs 200.T; CRL-7202: Hs 237.T; CRL-7399: Hs 674.T/ cc; CRL-7184: Hs 219.T; CRL-7213: Hs 255.T; CRL-7207: Hs 241.T; CRL-7172: Hs 210.T; CRL-7352: Hs 587.Int; CRL7376: Hs 614.T; CRL-7179: Hs 217.T; CRL-7456: Hs 722.T; CRL-7435: Hs 698.T; CCL-220: COLO 320DM; células de carcinoma, entre ellas los n.º de la ATTC: CRL-7439: Hs 700.Sk; CCL-200: CCD-13Lu; CRL-1677: IA-XsSBR; HB-8779: AS 33; CRL1837: SU.86.86; HB-8059: 1116-NS-19-9; CRL-1687: BxPC-3; HB-11028: 100-310; CRL-2133: DSL-6B/C1; CRL2172: SW 1990; CRL-2132: DSL-6A/C1; HTB-134: Hs 766T; HTB-80: Capan-2; CRL-2141: TGP47; CRL-2136: TGP49; CRL-1997: HPAF-II; HTB-79: Capan-1; CRL-1674: ARIP; CRL-1918: CFPAC-1; CCL-91:BF-2; células de leucemia que incluye los n.º de la ATTC: CRL-8012: FL74-UCD-1; TIB-57: T27A; TIB-58: D2N; TIB-55: BB88; TIB-56: D1B; CRL-6070: R2LBLN; CRL-6047: 2LBLN; CRL-6048: 3LBLN; CRL-6049: 5LBLN; CRL-6050: 6LBLN; CRL-6045: 2FLB.Ln n; TIB-192: M1; CRL-6039: FB3.Thy ; CRL-6046: LBLN; CRL-6038: FB3.Ln; TIB-59: BC16A; TIB-60: BC3A; CRL-10423: JM1; CRL6359: JLS-V5; CRL-7739: TE 90.Sk; células de osteosarcoma, entre ellas los n.º de la ATTC: CRL-7134: Hs 184.T; CRL-6114: FC95.Thy; CRL-7780: TO 203.T; CRL-7943: T1-73; CRL-7783: HT 728.T; CRL-7722: Murphy; CRL-7765: TE 417.T; CRL-7135: Hs 185.T; CRL-7628: Hs 890.T; CRL-7764: TE 415.T; CRL-7766: TE 418.T; CRL-7626: Hs 889.T; CRL7606: Hs 870.T; CRL-7922: FI-73; CRL-7520: Hs 792(A); CRL-7010: Hs 13.T; CRL-7823: Hs 14.T; CRL-7521: Hs 792 (B); CRL-7140: Hs 188.T; CRL-7263: Hs 387.T; células de melanoma, entre ellas los n.º de la ATTC: CRL-1676: WM-266-4; CRL1585: C32; CRL-1424: G-361; HB-8672: WI-MN-1; CRL-7360: Hs 600.T; HB-9348: NR-ML-06; CRL-7357: Hs 597.T; CRL-7637: Hs 895.T; CRL-1675: WM-115; CRL-7299: Hs 432.T; CRL-9607: HMCB; CCL-53.1: Clon M-3; CRL-7568: Hs 834.T; CRL-7687: Hs 936.T; CRL-7572: Hs 839.T; CRL-1980: COLO 829BL; CRL-7597: Hs 862.T; CRL-7375: Hs 613.Sk; CRL-7686: Hs 936.T; HB-9349: NR-ML-03; células de retinoblastoma, entre ellas los n.º de la ATTC: HTB-18: Y79; TIB-198: PI 153/3; HTB-169: WERI-Rb-1; CCL-2: HeLa; HTB-31: C-33 A; CCL-2.3; CRL2207: PA317LXSN6E7; CRL2205: PA317LXSN16E7; CRL-5804: NCI-H187; HTB-32: HT-3; CRL-5811: NCI-H526; CRL-5809: NCI-N417; células de cáncer de mama humano, entre ellas los n.º de la ATTC: HB-10807: 741F8-2B9; HB-10811: 452F2-1B2; CRL-7034: Hs 54.T; HB-8630: Hybridoma 23; CRL-7789: HT 762.T; CRL-7369: Hs 607.T; CRL-7853: Hs 631.T; CRL-7940: SW527; CRL-7335: Hs 566 (A); CRL-7368: Hs 606; CRL-7145: Hs 190.T; CRL-7277: Hs 402.T; CRL-7365: Hs 605.T; CRL-7484: Hs 743.T; CRL7574: Hs 841.T; CRL-7584: Hs 851.T; CRL-7596: Hs 861.T; CRL-7208: Hs 243.T; CRL-7212: Hs 252.T; CRL-7236: Hs 319.T; células de cáncer de piel, entre ellas los n.º de la ATTC: CRL-7360: Hs 600.T; CRL-7779: TO 175.T; CRL-7357: Hs 597.T; CRL7043: Hs 63.T; CRL-7299: Hs 432.T; CRL-7233: Hs 295.T; CRL-7590: Hs 854.T; CRL-7572: Hs 839.T; CRL-7314: Hs 523.Sk; CRL-7597: Hs 862.T; CRL-7781: HT 295.T; CRL-7630: Hs 892.T; CRL-7686: Hs 936.T; CRL-7658: Hs 908.Sk; CRL-7898: A101D; CRL-7762: TE 354.T; CRL-7641: Hs 898.T; CRL-7102: Hs 156.T; CRL-7677: Hs 925.T; CRL-7806: Hs 456.T; células de carcinoma, entre ellas los n.º de la ATTC: CRL-7786: HT 756.Lu; CRL-7588: Hs 853.T; CRL-7380: Hs 618.T; CRL-7194: Hs 229.T; CRL-7209: Hs 246.T; CRL-7621: Hs 887.T; CRL-7455: Hs 717.T; CRL-7619: Hs 887.Lu; CRL7217: Hs 266.Pe; CRL-7220: Hs 272.Pe; CRL-7796: HT 824.Pe; CRL-7873: Hs 750.T; CCL-199: HLF-a; CRL-7228: Hs 284.Pe; CRL-7906: A427; CRL-1642: LL/2; CRL-1453: KLN 205; CCL-185: A549; CCL-200: CCD-13Lu; HB-8628: L18.

La lunasina es el primer péptido antimitótico cuyo gen se ha clonado. Esto permitió demostrar sus efectos antimitótico e inductor de la apoptosis cuando el gen se expresa en las células de cáncer de mamíferos, lo que da lugar a unas concentraciones locales temporales y elevadas del fármaco antimiótico dentro de las células neoplásicas. Además, también contiene el motivo de adhesión celular RGD, que permite la adhesión de las células tumorales a la matriz extracelular (24). Los análogos sintético y recombinante del péptido que contienen este motivo previenen la metástasis de las células tumorales mediante la adhesión competitiva a las matrices extracelulares (25). La lunasina se aisló a partir de la fracción hidrosoluble y de baja masa molecular de las proteínas de la semilla de soja que se ha encontrado que tienen unas propiedades antineoplásicas (26). Junto con los datos anteriores, esto indica que la aplicación extracelular apropiada de la lunasina, con su motivo RGD, puede inhibir la metástasis así como también el crecimiento tumoral.

Experimento 5

Interrupción de la función mitótica en las células del cáncer de próstata in situ: genoterapia

El vector de expresión de mamíferos, pEFGP-C1 (Clontech), que contiene una región codificante del péptido Gm2S-1 fusionada en el extremo carboxilo de la GFP se transfecta con lipofectamina en tres estirpes celulares de próstata: LNCap (dependiente de hormonas), PUC-3 (independiente de hormonas) y ARCap (reprimida por hormonas) que representan una forma avanzada de cáncer de próstata clínico (Zhau H. Y. E., Chang S. M., Chen B. Q. et. al, 1996, Androgen-repressed phenotype in human prostate cancer, Proc Natl Acad Sci USA 93:15152-15157). Las construcciones análogas que comprenden los ácidos nucleicos que codifican la lunasina-del, la lunasina-del-1-20, la alisina, la alisina-del-1-14 y la Gm2S-1-sin-1-13 como se describen en el ejemplo 4 se construyen de manera similar. La marcación de la proteína fluorescente verde (GFP) permite seleccionar las células transfectadas que están expresando el gen recombinante por fluorescencia y por microscopia de contraste de fases (NSF Center for Plant Development Biology, UC Berkeley). Además, la microscopia fluorescente invertida proporciona el control en directo de la progresión de los cambios de forma de las células que expresan las diferentes construcciones que codifican el péptido de Gm2S-1. Aunque la eficacia de transferencia génica es menor con el pEGFP-C1, un vector plasmídico, en comparación con vectores víricos, inicialmente elegimos usarlo porque se puede seleccionar con más facilidad y controlar las células transfectadas. Esto también nos permite realizar el análisis del ciclo celular usando la citometría de flujo (Cancer Research Lab, UC Berkeley). La fragmentación cromosómica, un distintivo de la apoptosis tardía, se controla con el análisis TUNEL (marcación del extremo con dUTP mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal (TDT)) usando el kit de ensayo de fragmentación del DNA ApoAlert de Clontech (Palo Alto,CA).

El procedimiento básico se describe en Zhau et. al, 1996 (véase más arriba). Todas las estirpes celulares de próstata derivadas de la ATCC que usamos (LNCap, PUC-3, ARCap) se conocen por ser oncogénicas. Los ratones lampiños (nu/nu) BALB/C atímicos (de 6 a 8 semanas), engendrados congénitamente (Charles River Breeding Lab) se usan como hospedadores. Se producen estirpes celulares estables para cada una de las tres estirpes celulares de próstata mediante un vector retrovírico inducible por tetracicilina de gran rendimiento (Retro-On Retroviral Tet System Vector, Clontech) que contiene las distintas inserciones de Gm2S-1. Las células transformadas resultantes se inyectan subcutáneamente (2 x 10^{6}en 100 ml de medio T por sitio) y los tumores se controlan semanalmente. Los volúmenes de los tumores se calculan como la longitud por la anchura por la altura. La expresión de las construcciones del gen recombinante se induce en los animales por medio de una inyección subcutánea de tetraciclina (procedimiento de Clontech) en una etapa temprana y en la última etapa de la formación tumoral. Después, el tamaño del tumor se controla en días alternos. Los resultados de estos experimentos muestran unas reducciones significativas en el volumen tumoral en las etapas temprana y última con las construcciones mencionadas, salvo con las construcciones con lunasina-del.

En un segundo conjunto de experimentos, se usa un vector adenovírico (Adeno-Quest de Quantum Biotechnologies Inc, (QBI, Canada)) para introducir los genes que codifican el péptido de Gm2S-1 en los tumores de próstata implantados. Este mecanismo mediado por el receptor proporciona un tropismo positivo significativo hacia las células de origen epitelial, que proporciona una transferencia génica eficaz en las células que no se dividen y en el tejido in situ por medio del contacto celular con el virus. Se generan tumores en los ratones atímicos con cada una de las tres estirpes celulares de próstata por medio de una inyección subcutánea y se controla el crecimiento tumoral como anteriormente. Se construyen vectores adenovíricos recombinantes que no se pueden replicar que contienen los distintos insertos del Gm2S-1 en el vector de Adenoquest pQBIpAdBM5 y se amplifican (Adenovirus Expression System, 1997, Quantum Biotechnologies Inc. Laval, Quebec, Canada). Los insertos se clonan en el vector de transferencia pQBI-pAdBM5 y, luego, se transfieren al DNA adenovírico de QBI por medio de recombinación homóloga in vivo en las células humanas 293A. Luego, las partículas víricas se purifican por medio de doble purificación en gradiente de cloruro de cesio. Luego, las partículas víricas purificadas se introducen transcutáneamente en los tumores de próstata (50 ml que contienen 10^{9}ufc en el medio T por sitio) en múltiples inyecciones. El tamaño del tumor se mide antes de la inyección y después en días alternos. Los resultados de estos experimentos también muestran reducciones significativas en el volumen tumoral en las etapas temprana y tardía con las construcciones mencionadas, salvo con las construcciones con lunasina-del.

Experimento 6

Gm2S-1 codifica péptidos antimutágenos

Las regiones codificantes de la lunasina, la alisina y los propéptidos de Gm2S-1 se ligaron al vector de expresión bacteriana, el pFLAF-1 (Kodak/IBI). Los transformantes bacterianos que contienen la lunasina transformada mostraron un crecimiento bacteriano anormal y produjeron de 2 a 3 veces menos DNA plasmídico (pDNA). Cuando los pDNA de lunasina se migraron en geles de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio (EtBr), no fueron visibles con luz UV, aunque las lecturas por DO confirmaron la presencia del pDNA. Además, cuando se trataron con la proteinasa K y se extrajeron con fenol-cloroformo, la forma relajada del pDNA se tiñe rápidamente con varios intercalalantes de DNA, incluido el EtBr. Finalmente, la retirada de los nueve restos del ácido aspártico terminales de la lunasina (lunasina-del) abolió este efecto de protección del péptido. Estos datos indican que los péptidos de la lunasina pueden proteger el DNA de mutágenos tales como los colorantes de intercalación. Se observa una eficacia similar con una amplia variedad de mutantes de deleción de Gm2S1 que incluyen la lunasina-del-1-20 del experimento 5 contra una amplia variedad de mutágenos que incluyen radionucleótidos, hidrocarburos policíclicos y bifenilos policlorurados en numerosos tipos de células que incluyen los tipos de células de mamíferos enumeradas en el experimento 5.

Experimento 7

Referencias y anotaciones que aparecieron entre paréntesis

1. L. Schweizer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7070 (1995); R. V. Kowles, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7010 (1985); D. Spencer, et al., in Commentaries in Plant Science, H. Smith, Ed. (Pergamon Press, New York, 1981), pp. 175-189.

2. A. J. Hauxwell et al., Development 110, 283 (1990).

3. A. da Silva Conceicao, E. Krebbers, Plant J 5, 493 (1994).

4. A. F. Galvez, M. J. R. Revilleza, B.O. de Lumen, Plant Gene Register, PGR97-103 en prensa (1997); número de acceso de Genbank del cDNA de Gm2S-1: AF005030.

5. S. Odani, T. Koide, T. Ono, J Biol Chem 262, 10502 (1987).

6. Los RNA totales se aislaron de 200 a 500 mg de cotiledones de semillas en desarrollo y de tejido foliar. Jepson et al., Plant Mol Biol Rept 9, 131 (1991). Se prepararon las transferencias Northern usando la membrana Hybond-N (Amersham). R. M. Fourney et al., Focus 10, 5 (1988) y se sondearon con un fragmento de PCR marcado con ^{32}P que contenía la región codificante completa de Gm2S-1 y un fragmento de PCR de 326 pb del cDNA del rRNA 18S que se usó como un control interno para mostrar que la carga del RNA total en cada calle era similar. Se realizó un lavado final con SSC 0,5X y SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 min y, luego, las transferencias se expusieron con Hyperfilm-MP (Amersham) con pantallas de intensificación a -80ºC durante 2 días antes de revelar la película.

7. R. Goldberg et al., Science 266, 605 (1994); J.A. Gatehouse et al., Phil Trans R Soc Lond 314, 367 (1986); D. H. Meinke et al., Planta 153, 130 (1981).

9. H. P. Erickson, Trends in Cell Biol 7, 362 (1997); H. P. Erickson et al, Proc. Natl. Acad .Sci. U.S.A. 93, 519 (1996); W. Margolin, R. Wang, M. Kumar, J of Bacteriology 178, 1320 (1996).

10. El vector de mamíferos usado fue el pEGFP-C1 (Clontech). Se generaron productos amplificados por PCR que contenían fragmentos del gen de lunasina y de lunasina-del con un sitio HindIII en 5' y un sitio EcoRI en 3' por PCR usando el cDNA de Gm2S-1 como plantilla. Los productos de la PCR se purificaron usando una extracción con fenol-cloroformo y se digirieron con HindIII y EcoRI antes de ligarlos por medio de la ligasa de T4 (Promega) al vector pEGFP-C1 digerido con HindIII y EcoRI. Se usaron las construcciones del pEGFP-C1 para transformar las células competentes XL1-Blue y la secuencia del DNA se verificó por medio de la secuenciación con didesoxinucleótidos (Sequenase) para comprobar que la ligación de las regiones codificantes de lunasina y lunasina-del en pEGFP-C1 se produjo en fase.

Las células de hepatoma murino (Hepa 1c1c7) se obtuvieron de la ATCC. Las células se cultivaron en medio completo (DMEM + suero bovino fetal al 10%) hasta la confluencia (10^{7}células) en placas de 10 cm. Las células se sembraron en placas para conseguir una confluencia del 80% durante una noche antes de transfectarlas mediante electroporación. Las células se lavaron con PBS (NaCl a 1,37 mM, KCl a 2,68 mM, KH_{2}PO_{4} a 1,47 mM, Na_{2}HPO_{4} a 8,1 mM), se recogieron por incubación a 37ºC durante 5 min con tripsina/EDTA 1X y, luego, se volvieron a suspender en un medio completo a una densidad de 4 x 10^{6}. Los DNA plasmídicos (pDNA) del pEGFP-C1 con lunasina y lunasina-del se aislaron por el método de la lisis alcalina y a 0,4 ml de la suspensión celular se le añadieron 30 g del pDNA resuspendidos en 20 l de PBS. Las células se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente antes de transferirlas a una cubeta de electroporación de 2 mm de ancho. La electroporación se realizó mediante un Electro Cell Manipulator (ECM 600, Genetronics, Inc.) usando los parámetros siguientes: capacidad de 950 F, resistencia de 72 \Omega y voltaje de descarga de 130 V. Para el análisis de citometría de flujo, los parámetros de electroporación variaron de una capacidad de 1000 a 950 F y un voltaje de descarga de 120 a 150 V. La mezcla electroporada se incubó durante 15 minutos antes de sembrar en placa 100 l de la mezcla en 4 ml del medio completo en placas de 60 mm. Para analizar con microscopia fluorescente la expresión transitoria de la GFP, se colocaron cubreobjetos estériles dentro de las placas. Al final del periodo de cultivo (48 a 80 h), las células del cubreobjetos se lavaron con PBS, se incubaron con 2 ml de PBS/paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente (TA) para fijar las células, se lavaron dos veces con PBS antes de montar el cubreobjetos en un portaobjetos de cristal con una gota de PBS. En algunas de las preparaciones en el portaobjetos, para teñir el DNA se añadió yoduro de propidio (PI) al PBS (10 ng/ml y 1 mg/ml) después de que las células se permeabilizaran por incubación con TritonX-100 al 0,2% en hielo durante 30 min. Los cubreobjetos se juntaron a los portaobjetos de cristal sellándolos con goma. El contraste de fases y la microscopia fluorescente se realizaron en un microscopio Axiophot (Zeiss) equipado con una lámpara de mercurio HBO100 y fluoresceína (FTTC) (excitación de 450 a 490 nm) y cubos de filtro de Texas Red (excitación de 530 a 580 nm). Las imágenes se procesaron usando los programas Adobe Photoshop y Canvas (Deneba).

11. Las células del hepatoma murino transfectadas por electroporación (10) con lunasina y los dos controles, lunasina-del y el vector pEGFP-C1 se prepararon para análisis de citometría de flujo a las 48 h de la transfección como sigue: las células en confluencia del 50 al 100% se lavaron con PBS y se tripsinizaron. Las células se resuspendieron en 1,5 ml de medio completo y se centrifugaron a 3000 rpm durante 3 min. El medio se aspiró y el sedimento se lavó con 1 ml de PBS frío. El sedimento se centrifugó a 3000 rpm durante 3 min, tras lo cual el PBS se retiró por aspiración. El sedimento se almacenó a -80ºC si no se iba a usar inmediatamente. Para el análisis de citometría, 0,5 ml de una disolución de PI (2,5 mg de yoduro de propidio, 50 mg de citrato de sodio, 50 l de TritonX-100 y 50 ml de agua destilada) se añadieron al sedimento para resuspender las células. La mezcla se incubó en hielo durante 30 min y, luego, se filtró por un tapón tamizador de células de 35 m en un tubo de poliestireno de 6 ml (Falcon, Franklin Lakes, NJ). Las células se analizaron en un citómetro de flujo Epics XL-MCL (Coulter, Miami, FL) cuando se tiñeron con PI y GFP. Los datos de citometría de flujo para la tinción con PI se usaron para el contenido del DNA y el análisis del ciclo celular, usando un Multicycle AV (Phoenix Flow Systems) para determinar la proporción de células en la etapa G2/M de la división celular. La proporción de las células en G2/M de las células transfectadas con lunasina-del y el pEGFP-C1 para cada experimento de transfección se comparó estadísticamente usando la prueba de la t para datos emparejados (SigmaStat, Jandel) y se encontró que no había una diferencia significativa (P = 0,44). La detención en G2/M de las células transfectadas con lunasina para cada experimento de transfección se calculó como sigue: (G2/M de células transfectadas con GFP-lunasina) - [(G2/M de células transfectadas con la GFP-lunasina-del) + (G2/M de células transfectadas con el pEGFP-C1)] / 2. La eficacia de la transfección con la lunasina se basó en mediciones por citometría de flujo de la fluorescencia de la GFP y contando las células fluorescentes por la GFP en proporción a las células sin transfectar por microscopia fluorescente. El ajuste a una regresión lineal de la curva entre la eficacia de transfección de lunasina y la detención en G2/M se generó usando SigmaPlot (Jandel) y el coeficiente de correlación momento-producto de Pearson se calculó usando SigmaStat.

12. L. Wilson, M. A. Jordan, in Microtubules, J. Hyams, C. Lloyd, Eds. (Wiley-Liss Inc., New York, 1994) pp. 59-84; L. Wilson, M. A. Jordan, Curr Biol 2, 569 (1995).

13. El kit de análisis de fragmentación del DNA ApoAlert (Clontech) se basa en el método de marcación del extremo con dUTP mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL por las siglas en inglés). Y. Gavrieli et al., J Cell Biol 119, 493 (1992); A. Facchinetti et al., J Immunol Methods 136, 1251 (1991). TdT incorpora dUTP-fluoresceína en los extremos hidroxilo 3' libres del DNA fragmentado, que se puede visualizar por microscopia fluorescente. Las células del hepatoma murino transfectadas con lunasina y con lunasina-del se cultivaron durante 24 h a 72 h en placas con un cubreobjetos estériles dentro para permitir que las células crezcan sobre el cubreobjetos de cristal. Las células se lavaron dos veces con PBS, luego se fijaron en paraformaldehído/PBS al 4% a TA durante 30 min. Las células se lavaron dos veces con PBS y se permeabilizaron mediante incubación con TritonX-100 al 0,2% en hielo durante 5 min. Las células se lavaron con PBS dos veces y, luego, se cubrieron con 100 l del tampón equilibrador (del kit de Clontech) durante 10 min a TA. La mezcla de reacción de la TdT se preparó como se describe en el kit. Se añadieron 50 l de la mezcla de reacción de la TdT a las células y, luego, se las incubó en un incubador oscuro humidificado a 37ºC durante 1 h. La reacción se finalizó añadiendo SSC 2X (20X = NaCl a 3 M y citrato de sodio a 300 mM) y luego se lavaron con PBS. Las células se tiñeron incubándolas en una disolución de PI/RNasa/PBS (0,5 g/ml de yoduro de propidio, 0,5 g/l de RNasa) durante 5 min antes de montar los cubreobjetos sobre los portaobjetos al añadir una gota de antiextinción (p-fenilendiamina a 1 mg/ml, PBS 1X, glicerol al 90%) y sellando los extremos del cubreobjetos con goma cimentante. La microscopia de contraste de fases y la microscopia fluorescente se realizaron como se describe (10).

14. Las células del hepatoma murino transfectadas se dejaron crecer en un cubreobjetos de cristal como se describió (10). Las células se fijaron con paraformaldehído/PBS al 4% durante 30 min a TA, se lavaron dos veces con PBS, luego se permeabilizaron incubándolas en TritonX-100 al 0,2% en hielo durante 5 min. Las células se lavaron dos veces con PBS, se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA)/PBS al 3% durante 30 min y luego se secaron al vacío. Un anticuerpo monoclonal de rata contra un epítopo de tubulina tirosinado del extremo carboxilo (YL1/2, Sera-lab) se diluyó 1:200 y, luego, se añadió a las células para incubarlas durante 1 h a TA y con una humedad elevada. Las células se lavaron cuatro veces con BSA/PBS al 3% antes de que una IgG antirrata marcada con fluoresceína de asno con una reactividad cruzada mínima (Jackson Immunoresearch), que se diluyó a 1:100, se añadiera y se incubara durante 30 min. Las células se lavaron cuatro veces más antes de montarlas sobre los portaobjetos de cristal con antiextinción. Algunas preparaciones de células se tiñeron con una disolución de PI/RNasa/PBS (13) durante 5 min y, luego, se lavaron con agua destilada antes del montaje. La microscopia fluorescente se realizó como se describió (10).

15. A. Nakamura et al., J Biochem 106, 93 (1989).

16. G. Woehlke et al., Cell 90, 207 (1997); J. R. McIntosh, in Microtubules, J. Hyams, C. Lloyd, Eds. (Wiley-Liss Inc., New York, 1994) pp. 413-434.

17. N. Hirokawa, Curr Opin Cell Biol 6, 74 (1994).

18. X. M. Wang et al., J Cell Biol 132, 345 (1996).

19. R. B. Niklas, Science 275, 632 (1997).

20. A. A. Hyman, E. Karsenti, Cell 84, 401 (1996).

21. L. D. Belmont, T. J. Mitchison, Cell 84, 623 (1996).

22. Las células del cáncer de mama humano (MCF-7) se colocaron en placas en DMEM + suero bovino fetal (FBS) al 10% durante una noche hasta una confluencia del 60% en placas de 60 mm. Las células recogidas se lavaron dos veces con PBS, luego se tripsinizaron, se lavaron y se resuspendieron en 2 ml de medio sin suero (DMEM sin rojo fenol ni FBS). La transfección se realizó usando 8 l de lipofectamina (Gibco/BRL) y 1 g de pDNA (construcciones de pEGFP-C1 que llevaban lunasina y lunasina-del (10)) que se incubó con 98 l de medio sin suero durante 40 min antes de añadirlo a las células. Tras 5 h, a la disolución se le añadieron 2 ml de DMEM + FBS al 20%. Al día siguiente, las células se suplementaron con 4 ml de medio nuevo (DMEM + 10% FBS) y se las dejó crecer durante 48 h antes de realizar un ensayo de TUNEL como se describió (13). La microscopia confocal se realizó con un microscopio de barrido láser confocal de Molecular Dynamics (CLSM) equipado con un láser iónico de argón.

23. Y. Li, R. Benezra, Science 274, 246 (1996).

24. E. Ruoslahti, M. D. Pierschbacher, Cell 44, 517 (1986); K. R. Ely et al., Protein Engineering 8, 823 (1995).

25. I. Hardn et al., J Cancer 55, 1023 (1993); J. Murata, I. Saiki Jap J Clin Med 53, 1653 (1995); S. K. Akiyama et al., Cancer Metastasis Reviews 14, 173 (1995).

26. A. R. Kennedy, J Nutr 125: 733S (1995); J. Yavelow et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 5395 (1985).

27. Fujii et al., Biochem. Cell. Biol. 64(7), 615 (1986).

28. Watanabe et al., EMBO J. 14(9), 1878 (1995).

29. Igarashi et al., Nature. 353 (6339), 80 (1991).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: de Lumen, Benito O. Galvez, Alfredo F

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos de lunasina

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: SCIENCE & TECHNOLOGY LAW GROUP

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(B): CALLE: 75 DENISE DRIVE

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(C): CIUDAD: HILLSBOROUGH

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(D): ESTADO: CALIFORNIA

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(E): PAÍS: USA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 94010

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(v): FORMULARIO LEGIBLE POR EL ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con IBM PC

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: salida al mercado n.º 1.0, Versión 1.30 de PatentIn

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE CUMPLIMENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL AGENTE/PROCURADOR:

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(A): NOMBRE: OSMAN, RICHARD A

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36,627

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: B98-003

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(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (650) 343-4341

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(B): TELEFAX: (650) 343-4342

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 770 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CATENARIEDAD: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 158 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CATENARIEDAD: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácidos

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(C): CATENARIEDAD: no relevante

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(D): TOPOLOGÍA: no relevante

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly

\hfill

Claims

1. Un método para interrumpir selectivamente la función mitótica en una célula diana que muestra una función mitótica no deseable que no se ha practicado en el cuerpo humano o animal, dicho método comprende las etapas de:

identificar una célula diana que muestra una función mitótica no deseable e introducir en la célula diana una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos que se seleccionan independientemente de Asp y Glu, en la que dicho ácido nucleico se expresa en la célula diana, por lo que la función mitótica no deseable de la célula se interrumpe selectivamente, en el que dichos 8 a 18 aminoácidos contiguos son esenciales para interrumpir selectivamente la función mitótica no deseable y en el que los aminoácidos contiguos se encuentran en de los 12 restos del extremo carboxilo del péptido.

2. Uso de un ácido nucleico expresado en una célula diana y que codifica un péptido que comprende de 8 a 18 aminoácidos ácidos contiguos que se seleccionan independientemente de Asp y Glu para fabricar un medicamento para interrumpir selectivamente la función mitótica en la célula diana en el cuerpo humano o animal que muestra una función mitótica no deseable, en el que dichos 8 a 18 aminoácidos contiguos son esenciales para desorganizar selectivamente la función mitótica no deseable y en el que los aminoácidos contiguos se encuentran en de los 12 restos del extremo carboxilo del péptido.

3. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que los aminoácidos son Asp.

4. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en la que el péptido comprende un resto básico del lado amino terminal de los aminoácidos.

5. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que el péptido comprende los restos 33 a 43 de la SEQ ID n.º 2.

6. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que el péptido comprende, al menos, 12 restos contiguos de la SEQ ID n.º 2, restos 1 a 35.

7. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula de mamíferos.

8. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en la que la célula es una célula bacteriana.

9. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula vegetal.

10. El método de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico comprende un fragmento de, al menos, 24 nucleótidos de la SEQ ID n.º 1.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de introducción comprende introducir el ácido nucleico en la célula in situ.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de introducción comprende introducir el ácido nucleico en la célula in vitro.