ES2242441T3 - Proteina akt-3. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Akt-3 humana o un equivalente funcional de ésta, que comprende la secuencia de aminoácidos determinada en la SEQ Nº de ID 3, donde un equivalente funcional es una proteína Akt-3 capaz de fosforilar la histona H2B cuando se expresa y purifica como una proteína de fusión GST recombinante.

Description

Proteína Akt-3.

La presente invención se refiere a la clonación y expresión de una nueva serina/treonina quinasa humana denominada "Akt-3" y, en particular, a moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína Akt-3, la proteína misma y compuestos que se pueden usar para inhibir la supervivencia celular.

Un rasgo característico de muchas células cancerosas es su capacidad de multiplicarse independientemente de la adhesión. En contraste, cuando se impide que las células endoteliales sin transformar se adhieran a la matriz extracelular (ECM), éstas sufren apoptosis (Frisch y Francis, 1994; Meredith et al, 1993). El proceso por el cual se provoca que células normalmente adherentes sufran apoptosis cuando no pueden adherirse a la ECM se ha denominado "anoikis" (Frisch y Ruoslahti, 1997) y es un ejemplo del efecto que tiene sobre una célula la eliminación de un factor de supervivencia. Cambios en la señalación provocados por moléculas de adhesión pueden producir resistencia a la anoikis (Frisch y Ruoslahti, 1997) y esto puede contribuir al mecanismo mediante el cual las células cancerosas que se multiplican independientemente de la adhesión pueden evitar la anoikis.

Akt (también conocida como proteína quinasa B (PKB) o "proteína quinasa relacionada con A y C" (RAC-PK)) es una serina/treonina quinasa que ha sido implicada en la regulación de la supervivencia celular (Khwaja et al., 1997; Dudek et al., 1997; Kauffmann-Zeh et al., 1997; Kennedy et al., 1997; Datta et al., 1997; Marte y Downward, 1997). La Akt puede inhibir la apoptosis inducida por el desprendimiento de la ECM (anoikis; Khwaja et al., 1997), así como por la eliminación de factores de supervivencia (Kennedy et al., 1997; Ahmed et al., 1997; Dudek et al., 1997; Kauffman-Zeh et al., 1997; Philpott et al., 1997; Crowder y Freeman, 1998; Eves et al., 1998) o la irradiación (Kulik et al., 1997).

Akt comprende un dominio de homología a plecstrina (PH, pleckstrin homology) en la región NH_{2}-terminal involucrado en la unión a lípidos, un dominio quinasa y una "cola" COOH-terminal. Se cree que Akt se activa por reclutamiento hacia la membrana plasmática y posterior fosforilación por dos quinasas secuencia arriba, PDK-1 y PDK-2 (estudiado en Coffer et al, 1998; Alessi y Cohen, 1998). Se cree que la unión de 3-fosfoinositidos, generada por la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI 3-quinasa), al dominio PH de la Akt promueve la translocación a la membrana plasmática y facilita la fosforilación de Akt-1 por PDK-1 en Tre^{308} (Thr^{308} en inglés) (Alessi et al., 1996; Alessi et al., 1997; Stephens et al., 1998) o de Akt-2 en Tre^{309} (Meier et al., 1997). Además de la fosforilación de Tre^{308}, la activación total requiere la fosforilación de la cola COOH en Ser^{473} en Akt-1 (Alessi et al, 1996) o en Ser^{474} en Akt-2 (Meier et al., 1997). La enzima responsable de la fosforilación de Ser^{473}/Ser^{474} se denominó originalmente PDK-2 pero recientemente la quinasa vinculada a integrina, ILK (Delcommenne et al., 1998) surgió como una candidata para esta función.

Hasta la fecha se describieron dos isoformas humanas de Akt, Akt-1 y Akt-2 (Coffer y Woodgett, 1991; Jones et al., 1991; Cheng et al., 1992). Se describió una tercera isoforma, a la que aquí se hace referencia como Akt-3, en la rata (Konishi et al., 1995). Dado que esta Akt-3 de rata posee una cola aparentemente truncada y de ese modo carece de Ser^{473}, su regulación puede diferir de la de Akt-1 y Akt-2. Tanto Akt-1 como Akt-2 se expresan ampliamente, aunque la expresión de Akt-2 es muy importante en los tejidos que responden a la insulina, como el hígado y el músculo esquelético (Konishi et al., 1994; Altomare et al., 1995). Akt-1 y Akt-2 son activadas por la insulina en los adipocitos, los hepatocitos y el músculo esquelético de rata. En contraste, la Akt-3 no parece ser activada en gran medida por la insulina en estos tejidos (Walker et al., 1998). La función de las diversas isoformas de Akt en la señalización de la insulina puede limitar la utilidad de los compuestos que inhiben la actividad de Akt-1 o Akt-2 puesto que dichos agentes pueden inducir los síntomas observados en los pacientes con diabetes. Formulamos la hipótesis de que este problema se podía evitar utilizando inhibidores selectivos de Akt-3 y esto nos indujo a identificar el análogo humano de la Akt-3 de rata.

Los presentes inventores identificaron y caracterizaron una molécula de ácido nucleico que codifica la isoforma humana de la Akt-3. Significativamente, la Akt-3 humana posee una cola COOH-terminal que contiene un residuo de aminoácido análogo a Ser^{473}/Ser^{474} previamente implicado en la activación de Akt-1/Akt-2, pero ausente en la proteína Akt-3 de rata.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención provee de una molécula de ácido nucleico que codifica la Akt-3 humana o un equivalente funcional, derivado o bioprecursor de ésta, que contiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 2. Preferentemente, la molécula es una molécula de ADN y aún más preferentemente una molécula ADNc, e incluso aún más preferentemente contiene la secuencia de los nucleótidos ilustrados en la figura 1. Este aspecto de la invención también provee de una molécula de ácido nucleico capaz de hibridarse a la molécula de acuerdo con la invención en condiciones de restricción alta.

Restricción de la hibridación como se usa aquí se refiere a las condiciones bajo las cuales los ácidos polinucleicos son estables. La estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (Tm) de los mismos. Se puede calcular aproximadamente la Tm mediante la fórmula:

81,5^{o}C + 16,6(log_{10} [Na^{+}]+0,41

\hskip1cm

(%G \ y \ C)-600/1

donde 1 es la longitud de los híbridos en los nucleótidos. Tm disminuye aproximadamente en 1-1,5ºC con cada 1% de reducción en la homología de la secuencia.

El término "restricción" se refiere a las condiciones de hibridación en las que un ácido nucleico monocatenario se une con una hebra complementaria cuando las bases purina o pirimidina de él se aparean con su base correspondiente por puentes de hidrógeno. Las condiciones de restricción alta favorecen el apareamiento de bases homólogas mientras que las condiciones de restricción baja favorecen el apareamiento de bases no homólogas.

La condiciones de "restricción baja" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 37ºC o inferior, una concentración de formamida menor que aproximadamente 50%, y una concentración de sal entre moderada y baja (SSC); o, alternativamente, una temperatura de aproximadamente 50ºC o inferior, y una concentración de sal entre moderada y alta (SSPE), por ejemplo NaCl 1 M.

Las condiciones de "restricción alta" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 42ºC o inferior, una concentración de formamida menor que aproximadamente 20% y una concentración de sal baja (SSC); o, alternativamente, una temperatura de aproximadamente 65ºC o inferior, y una concentración de sal baja (SSPE). Por ejemplo, las condiciones de restricción alta comprenden la hibridación en NaH_{2}PO4 0,5 M, dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS) y EDTA 1 mM a 65ºC (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Vol. I, 1989; Green Inc. New York, en 2.10.3).

"SSC" comprende una hibridación y solución de lavado. Una solución de reserva de 20X SSC contiene cloruro de sodio 3M, citrato de sodio 0,3 M y pH 7,0.

"SSPE" comprende una hibridación y solución de lavado. Una solución 1X SSPE contiene NaCl 180 mM, NaH_{2}PO_{4} l0 mM, EDTA 1 mM y pH 7,4.

El ácido nucleico capaz de hibridarse a las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en general tendrá una homología de al menos 85%, preferentemente de al menos 90% y aún más preferentemente de al menos 95% con las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.

Las moléculas de ADN de acuerdo con la invención pueden, de manera ventajosa, ser incluidas en un vector de expresión apropiado para expresar polipéptidos que codifican de allí en un huésped apropiado.

La presente invención también comprende dentro de su alcance proteínas o polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un equivalente funcional, derivado o bioprecursor de éste.

Un vector de expresión de acuerdo con la invención incluye un vector que tiene un ácido nucleico de acuerdo con la invención unido operablemente a las secuencias reguladoras, como las regiones del promotor, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. La expresión "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera en que fueron concebidos. Tales vectores se pueden transformar en una célula huésped apropiada para asegurar la expresión de un polipéptido de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención provee de un proceso para preparar polipéptidos de acuerdo con la invención que comprende el cultivo de una célula huésped, transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente en condiciones para asegurar la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifique los polipéptidos y la recuperación de los polipéptidos expresados.

Los vectores pueden ser, por ejemplo vectores plasmídicos, víricos o fágicos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho nucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables, como, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.

Los elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias promotoras para unirse a la ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para unirse al ribosoma. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriana puede incluir un promotor como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De manera semejante, un vector de expresión eucariótica puede incluir un promotor homólogo o heterólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación secuencia abajo, el codón de inicio AUG y un codón de terminación para el desprendimiento del ribosoma. Dichos vectores se pueden obtener comercialmente o reunir de las secuencias descritas por los métodos bien conocidos por los técnicos de la profesión.

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede insertar en los vectores descritos en una orientación antisentido para asegurar la producción de ARN antisentido. El ARN antisentido u otros ácidos nucleicos antisentido se pueden producir por métodos sintéticos.

De acuerdo con la presente invención, un ácido nucleico definido incluye no sólo el ácido nucleico idéntico sino también todas las variaciones menores de las bases incluidas en particular, las sustituciones en las bases que dan lugar a un codón sinónimo (un codón diferente que especifica el mismo residuo de aminoácido) debido al código degenerado en las sustituciones conservativas de los aminoácidos. La expresión "secuencia de ácidos nucleicos" también incluye la secuencia complementaria de cualquier secuencia monocatenaria dada considerando las variaciones de bases.

La presente invención también proporciona de manera ventajosa las secuencias de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 10 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y preferentemente de 10 a 120, y aún más preferentemente de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos. Estas secuencias pueden, ser utilizadas de manera ventajosa como sondas o cebadores para iniciar la replicación, o algo semejante. Dichas secuencias de ácidos nucleicos se pueden producir según las técnicas bien conocidas por los técnicos de la profesión, como por ejemplo por métodos recombinantes o sintéticos. También pueden usarse en los equipos de diagnóstico o similares para detectar la presencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Estas pruebas comprenden en general poner en contacto la sonda con la muestra en condiciones de hibridación y detectar la presencia de cualquier formación doble o triple entre la sonda y cualquier ácido nucleico de la muestra.

De acuerdo con la presente invención esas sondas se pueden sujetar a un soporte sólido. Preferentemente, están presentes en una matriz de modo que las múltiples sondas se puedan hibridar simultáneamente a una única muestra biológica. Las sondas se pueden colocar en la matriz o sintetizar in situ en ésta. (Ver Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14 de diciembre de 1996 "Expression monitoring by hybridisation to high density oligonucleotide arrays". Una única matriz puede contener por encima de 100, 500 o incluso 1.000 diferentes sondas en las ubicaciones discretas.

De manera ventajosa, las secuencias de ácidos nucleicos, de acuerdo con la invención se pueden producir usando dichos métodos recombinantes o sintéticos, como por ejemplo usando los mecanismos de clonación de RCP que implican en general preparar un par de cebadores, que pueden ser de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos para una región del gen que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el ARNm, el ADNc, o el ADN genómico de una célula humana, llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provocan la amplificación de la región deseada, aislando la región o el fragmento amplificado y recuperando el ADN amplificado. Generalmente, dichas técnicas como las definidas aquí son bien conocidas por los técnicos de la profesión, como se describe en Sambrook et al (Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 1989).

Los ácidos nucleicos o los oligonucleótidos de acuerdo con la invención pueden llevar un marcador que se puede revelar. Los marcadores apropiados incluyen radioisótopos como ^{32}P o ^{35}S, marcadores enzimáticos u otros marcadores proteicos como biotina o marcadores fluorescentes. Dichos marcadores se pueden agregar a los ácidos nucleicos o a los oligonucleótidos de la invención y se pueden detectar usando las técnicas conocidas per se.

Un aspecto adicional de la invención comprende la Akt-3 humana o un equivalente funcional, derivado o bioprecursor de ésta, que contiene una secuencia de aminoácidos como la que se ilustra en la figura 2.

El polipéptido designado Akt-3 humana de acuerdo con la invención incluye todas las variantes posibles de los aminoácidos codificados por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, incluido un polipéptido codificado por dicha molécula y que tiene cambios conservativos en los aminoácidos. Los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen además variantes de dichas secuencias, incluidas las variantes alélicas que se producen naturalmente que son prácticamente homólogas de dichos polipéptidos. En este contexto, la homología sustancial se considera como una secuencia que tiene al menos 90% de homología en los aminoácidos con los polipéptidos codificados por las moléculas del ácido nucleico de acuerdo con la invención y aún más preferentemente al menos 95% de homología en los aminoácidos.

La molécula del ácido nucleico o la Akt-3 humana de acuerdo con la invención pueden, de manera ventajosa, ser utilizados como un medicamento o en la preparación de un medicamento, para tratar la enfermedad asociada a la actividad de la Akt-3 como, el cáncer o similares.

De manera ventajosa, se puede suministrar la molécula del ácido nucleico o el polipéptido de acuerdo con la invención en una preparación farmacéutica junto con un vehículo, diluyente o excipiente de éstos aceptables desde el punto de vista farmacéutico.

La presente invención apunta además a la inhibición in vivo de la Akt-3 mediante el uso de la tecnología antisentido. La tecnología antisentido se puede utilizar para controlar la expresión de genes a través de la formación de triple hélice o de ADN o ARN antisentido; ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia proteica madura, que codifica la proteína de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para ser complementario de una región del gen involucrada en la transcripción (triple-helix, consultar Lee et al. Nucl. Acids Res., 6:3.073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1.360 (1991), evitando de este modo la transcripción y la producción de Akt-3. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de una molécula de ARNm en la Akt-3 (antisense - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1998)).

Alternativamente, el oligonucleótido descrito antes se puede suministrar a las células mediante procedimientos conocidos por los técnicos de la profesión de modo que el ARN o ADN antisentido se puedan expresar in vivo para inhibir la producción de Akt-3 de la manera descrita antes.

Las construcciones antisentido para Akt-3 pueden, por lo tanto, inhibir la supervivencia celular y evitar el crecimiento posterior del cáncer o tumor.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se provee también de una célula, tejido u organismo transgénicos que contienen un transgén capaz de expresar la proteína Akt-3 humana de acuerdo con la invención. El término "transgén capaz de expresar" como se usa aquí significa una secuencia de ácidos nucleicos apropiada que conduce a la expresión de la Akt-3 humana o de las proteínas humanas que tienen la misma función y/o actividad. El transgén, puede incluir, por ejemplo, el ácido nucleico genómico aislado de células humanas o el ácido nucleico sintético, incluido el ADN integrado en el genoma o en un estado extracromosómico. Preferentemente, el transgén contiene la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las proteínas de acuerdo con la invención según se describió aquí, o un fragmento funcional de dicho ácido nucleico. Un fragmento funcional de dicho ácido nucleico se debe interpretar como un fragmento del gen que contiene dicho ácido nucleico que codifica las proteínas de acuerdo con la invención o un equivalente funcional, derivado o derivado no funcional como un mutante dominante negativo, o bioprecursor de dichas proteínas. Por ejemplo, sería fácilmente evidente para los técnicos con experiencia que se pueden usar sustituciones o supresiones de nucleótidos utilizando técnicas corrientes, que no afecten a la secuencia de proteínas codificada por dicho ácido nucleico, o que codifiquen una proteína funcional de acuerdo con la invención.

La proteína Akt-3 humana expresada por dicha célula, tejido u organismo transgénicos o un equivalente funcional o bioprecursor de dicha proteína también forma parte de la presente invención.

Se pueden preparar, de manera ventajosa, anticuerpos antiAkt-3 humana mediante técnicas conocidas en la profesión. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos policlonales inoculando un animal huésped, como un ratón, con Akt-3 humana de acuerdo con la invención o un epítopo de ésta y recuperando el antisuero. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar según técnicas conocidas como las descritas por Kohler R. y Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención también se pueden utilizar en un método para detectar la presencia de Akt-3 humana de acuerdo con la invención, donde dicho método comprende hacer reaccionar el anticuerpo con una muestra e identificar cualquier proteína unida a dicho anticuerpo. Asimismo se provee de un equipo para llevar a cabo dicho método que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y medios para hacer reaccionar el anticuerpo con dicha muestra.

Las proteínas que interactúan con el polipéptido de la invención se pueden identificar, por ejemplo, investigando las interacciones proteína-proteína utilizando el sistema vector de dos-híbridos propuesto primero por Chien et al (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9.578-9.582.

Esta técnica se basa en la reconstitución funcional in vivo de un factor de transcripción que activa un gen indicador. Más en particular la técnica comprende proporcionar una célula huésped apropiada con una construcción de ADN que contiene un gen indicador bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de unión a ADN y un dominio de activación, que expresa en la célula huésped una primera secuencia de ADN híbrido que codifica una primera fusión de un fragmento o de toda una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y o dicho dominio de unión de ADN o dicho dominio de activación del factor de transcripción, que expresa en la célula huésped al menos una segunda secuencia de ADN híbrido, como una genoteca o similar, que codifica supuestas proteínas de unión para ser investigadas junto con el dominio de unión a ADN o de activación del factor de transcripción que no está incorporado en la primera fusión; detectar cualquier unión de las proteínas para ser investigada con una proteína de acuerdo con la invención detectando la presencia de cualquier producto del gen indicador en la célula huésped; y opcionalmente aislar las segundas secuencias de ADN híbrido que codifican la proteína de unión.

Un ejemplo de dicha técnica utiliza la proteína GAL4 en la levadura. GAL4 es un activador de la transcripción del metabolismo de la galactosa en la levadura y tiene un dominio separado para la unión a los activadores que están secuencia arriba de los genes que metabolizan la galactosa así como un dominio de unión a proteínas. Se pueden construir vectores de nucleótidos, uno de los cuales comprenda los residuos de nucleótidos que codifican el dominio de unión al ADN de GAL4. Estos residuos del dominio de unión se pueden fusionar a una secuencia de codificación conocida, como por ejemplo los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. El otro vector contiene los residuos que codifican el dominio de unión a proteínas de GAL4. Estos residuos se fusionan a los residuos que codifican una proteína de prueba. Cualquier interacción entre los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de acuerdo con la invención y la proteína que se va a probar conduce a la activación de la transcripción de una molécula indicadora en una célula de levadura que tiene una transcripción GAL-4 deficiente en la cual se han transformado los vectores. Preferentemente, una molécula indicadora como la \beta-galactosidasa se activa con la restauración de la transcripción de los genes del metabolismo de la galactosa de la levadura.

Un aspecto adicional de la invención provee de un método de identificación de los compuestos que inhiben selectivamente la promoción de la supervivencia celular mediada por la Akt-3 humana, donde dicho método comprende i) proporcionar una célula transformada con un vector de expresión que activa la vía de la Akt-3, donde dicha célula sobrevive en presencia o ausencia de un factor de supervivencia en comparación con una célula de control que no ha sido transformada con dicho vector y que morirá en ausencia de dicho factor de supervivencia ii) poner en contacto dichas células con un compuesto de prueba después de eliminar de dichas células dichos factores de supervivencia, donde la muerte de dicha célula transformada es indicativa de la inhibición selectiva de dicho compuesto sobre la vía de la Akt-3 humana que promueve la supervivencia.

Alternativamente, se podría evaluar la actividad promotora de la supervivencia de la Akt-3 i) proporcionando una célula transformada con un vector de expresión que activa la vía de la Akt-3 además de una célula de control que no ha sido transformada con dicho vector, ii) poniendo en contacto cada una de dichas células con un agente que induzca la muerte, mediante lo cual la muerte de dicha célula de control y la supervivencia de dicha célula transformada son indicativas de la actividad promotora de la supervivencia de la vía de la Akt-3 activada, iii) poniendo en contacto a continuación dicha célula transformada sin la eliminación de dicho agente inductor de dicha muerte, con un compuesto de prueba, donde la muerte de dicha célula es indicativa de la inhibición selectiva de dicho compuesto sobre la vía de la Akt-3 humana que promueve la supervivencia.

En otro aspecto la presente invención provee de métodos para identificar a los agentes que afectan a la actividad de la proteína Akt-3 humana, que comprenden poner en contacto dicha proteína con un sustrato, una molécula reguladora o un sustituto de ésta y vigilar la interacción con la sustancia de prueba utilizando ensayos de fosforilación o unión estándar bien conocidos por los técnicos de la profesión.

Los compuestos que se identifican de acuerdo con este aspecto de la invención además de los anticuerpos anti Akt-3 humana se pueden utilizar, de manera ventajosa, como un medicamento o alternativamente en la preparación de un medicamento para tratar las enfermedades asociadas a la expresión de la proteína Akt-3 humana de acuerdo con la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende o un compuesto o una molécula antisentido o un anticuerpo de acuerdo con la invención junto con un vehículo, diluyente o excipiente de éstos aceptables desde el punto de vista farmacéutico.

Las moléculas antisentido o con más razón los compuestos identificados como agonistas o antagonistas de los ácidos nucleicos o de los polipéptidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en forma de una preparación farmacéutica, la que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos bien conocidos por los técnicos de la profesión. Las preparaciones preferidas incluyen un vehículo, diluyente o excipiente aceptables desde el punto de vista farmacéutico, como por ejemplo, una solución salina fisiológica. También se pueden usar otros vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluso otras sales no tóxicas, agua estéril o similares. También puede estar presente una solución amortiguadora apropiada que permita la liofilización y el almacenamiento en condiciones estériles de las preparaciones antes de su reconstitución mediante el agregado de agua estéril para su posterior administración. Se puede llevar a cabo la incorporación de los polipéptidos de la invención en una matriz sólida o semisólida biológicamente compatible la cual se puede implantar en los tejidos que requieren tratamiento.

El vehículo también puede contener otros excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico para modificar otras condiciones como pH, osmolaridad, viscosidad, esterilidad, lipofilicidad, solubilidad o similares.

También se pueden incluir excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico que permitan la liberación sostenida o retardada posterior a la administración.

Los polipéptidos, las moléculas o compuestos del ácido nucleico de acuerdo con la invención se pueden administrar por vía oral. En esta materialización se pueden encapsular y combinar con vehículos apropiados en formas farmacéuticas sólidas bien conocidas por los técnicos con experiencia.

Como es bien sabido por los técnicos de la profesión, la pauta posológica específica se puede calcular en función del área de superficie corporal del paciente o el volumen de espacio corporal a ser ocupado, dependiendo de la vía particular de administración que se va a utilizar. La cantidad de la preparación que se administre en realidad, no obstante, será determinada por un médico, sobre la base de las circunstancias correspondientes al trastorno que se va a tratar, como la gravedad de los síntomas, la preparación que se va a administrar, la edad, el peso y la respuesta de cada paciente y la vía de administración elegida.

La presente invención se puede comprender más claramente con referencia al ejemplo siguiente que es meramente ejemplar y los dibujos que lo acompañan donde:

La figura 1 es una ilustración de la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de la Akt-3 humana. En la columna de la izquierda se muestran y se numeran la secuencia de codificación de la Akt-3 y partes de las regiones 5' y 3' no traducidas. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Akt-3 se muestra encima de la correspondiente secuencia de ADN y se numera en la columna de la derecha. Los dos residuos de aminoácido que se presumen que se fosforilan con la activación de Akt-3 (Tre^{305} y Ser^{472}) están en negrita y marcados con un asterisco. La parte COOH-terminal de la proteína Akt-3 humana que difiere del homólogo de rata está subrayada.

La figura 2 es una alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas para las Akt-1, Akt-2 y Akt-3 humanas. Las secuencias se alinearon usando el programa de alineación de ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemania). Los residuos de aminoácido conservados entre las tres proteínas se incluyen en las áreas negras. Los residuos conservados entre sólo dos de las secuencias están sombreados en gris. Los residuos de aminoácido están numerados en la columna de la derecha. Los residuos Tre y Ser conservados que se presume que se fosforilan con la activación están marcados con un asterisco encima de la secuencia.

La figura 3 es una ilustración de la fosforilación de la histona H2B por las variantes de Akt-3. (A) Akt-3 se expresó como una proteína de fusión GST en E. coli. Para evaluar la actividad de la hAkt-3, se incubó la histona H2B con GST-Akt-3 y variantes de GST-Akt-3 durante el tiempo indicado y el grado de fosforilación se evaluó después de la SDS-PAGE. Las variantes de Akt-3 se designan: W.T., el tipo salvaje; T305D, Tre^{305} mutada a Asp; S472D, Ser^{472}mutada a Asp; T305D, S472D, ambas Tre^{305} y Ser^{472}mutadas a Asp. No se observó ninguna fosforilación significativa cuando se usó GST en lugar de GST-Akt. Los resultados son la media (\pm s.e.m.(error estándar de la media por sus siglas en inglés); n = 3 a 6) y se expresan con relación al grado de fosforilación de H2B catalizada por T305D y S472D hAkt-3 después de 45 minutos. Inserto, La pureza de la GST purificada (carril 1), Akt-3 tipo salvaje (carril 2), T305D Akt-3 (carril 3), S472D Akt-3 (carril 4) o T305D/S472D Akt-3 (carril 5) se evaluó por SDS-PAGE y por tinción con azul de Coomassie. (B) se transfectaron células HEK-293 o bien con vector (carriles 1 y 2) o Akt-3 (carriles 3 y 4) Akt-3T305A (carriles 5 y 6) o Akt-3 S472A (carriles 7 y 8) y o bien se trataron con solución amortiguadora (carriles 1, 3, 5 y 7) o IGF-1 (50 ng/ml; carriles 2, 4, 6 y 8). Se inmunoprecipitó Akt-3 con anticuerpo 3F10 (etiqueta anti-HA o anti HA-tag). Las muestras se analizaron por transferencia con respecto a HA-tag (panel superior) o con un anticuerpo fosfoespecífico que reconoce a la Ser^{472} fosforilada (panel inferior). (C) se evaluó la actividad de Akt en inmunoprecipitados de HA de las muestras preparadas como se describió anteriormente midiendo la fosforilación de un sustrato peptídico (Crosstide). Los resultados se expresan como el aumento de la actividad en comparación con células no estimuladas transfectadas con vector vacío (media \pm s.e.m., n=7).

La figura 4 es una ilustración de la inhibición de Akt-3 por estaurosporina y RO 31-8220. Se trató histona H2B con Akt-3 (variante T305D,S472D) en presencia de las concentraciones indicadas o bien de estaurosporina o bien de RO 31-8220. Después de 30 minutos, la reacción se terminó y el grado de fosforilación de H2B se cuantificó en un phosphorimager después de la SDS-PAGE. Los resultados (media \pm s.e.m., n=3) se expresan con relación al (%) de fosforilación observada en presencia de solvente (control, "C").

La figura 5 es una ilustración de la localización cromosómica de Akt-3 humana. (A)Diagrama de los resultados del mapeo de FISH de Akt-3. Cada mancha representa las señales de FISH dobles detectadas en el cromosoma humano 1, región q43 - q44. (B) Ejemplo de mapeo de FISH de Akt-3. El panel de la izquierda muestra las señales de FISH en el cromosoma 1. El panel de la derecha muestra la misma figura mitótica teñida con 4',6-diamidino-2-fenilindol para identificar el cromosoma 1.

La figura 6 es una ilustración de la expresión de Akt-3 en diferentes tejidos humanos. (A) Análisis de transferencia Northern de la expresión tisular de Akt-3. La expresión del ARNm de Akt-3 en diferentes tejidos humanos se evaluó usando una sonda correspondiente a la región 3' no traducida de hAkt-3 para analizar una transferencia de ARN poliA^{+} humano ("Multiple Tissue Northern"). Se usó \beta-actina humana como un control para confirmar la misma carga en los carriles (no se muestran los datos). (B) y (C) análisis de TI-RCP de la expresión tisular de Akt-3. Los análisis de TI-RCP se llevaron a cabo en ADNc de diferentes tejidos humanos (B) y de diferentes líneas celulares tumorales (C) usando cebadores específicos para Akt-3 humana o G3PDH (control) para el número indicado de ciclos de RCP. Las bandas del tamaño esperado (425 bp para Akt-3 y 1 kb para G3PDH) son visibles en los geles. Las imágenes de los geles de agarosa al 1,2% teñidos con bromuro de etidio se invirtieron para lograr mayor claridad usando el software EagleSight (Stratagene). Los resultados de reacciones RCP similares realizados para 25, 30 ó 35 ciclos no se muestran pero indicaron que los resultados de esta figura están dentro del rango lineal de amplificación. Caco-2 = adenocarcinoma colorrectal; T-84 = carcinoma colorrectal; MCF-7 = adenocarcinoma de mama; T-47D = carcinoma de la glándula ductal de la mama; HT1080 = fibrosarcoma óseo; SaOS-2 = osteosarcoma; SK-N-MC = neuroblastoma; HepG2 = hepatoblastoma; JURKAT = leucemia de células T.

La figura 7 es una ilustración de los resultados obtenidos por recuento por centelleo obtenidos en un ensayo de centelleo por proximidad para identificar los agentes que modulan la actividad de Akt-3.

La figura 8 es una ilustración de los resultados obtenidos de un ensayo de filtración de Akt-3 para identificar los agentes que modulan la actividad de la Akt-3.

Materiales y métodos Síntesis de oligonucleótidos y determinación de la secuencia de ADN

Todos los cebadores se obtuvieron de Eurogentec, Seraing, Bélgica. Se diseñaron cebadores de secuenciación específicos del inserto (15- y 16-mers) por inspección visual de las secuencias de ADN. El ADN se preparó en columnas Qiagen-tip-20 o en columnas spin Qiaquick (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Alemania) y se recuperó de las columnas spin en 30 \mul de solución amortiguadora Tris/EDTA (TrisHCl l0 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM (sal sódica)). Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando equipos Big Dye™ Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, EUA) y se corrieron en un secuenciador de ADN Applied Biosystems 377 (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, EUA).

Clonación molecular de Akt-3 humana

Usando la secuencia RAC-PK\gamma de rata (Konishi et al, 1995; GenBank acc. No. D49836) como una secuencia de interrogación, se llevó a cabo una búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool); Atschul et al., 1990) en la base de datos de marcador de secuencia expresada (EST) WashU Merck (Lennon et al., 1996) y en la base de datos EST humana patentada LifeSeq™ (Incyte Pharmaceuticals Inc, Palo Alto, CA, EUA). Se identificaron varios clones EST humanos con gran semejanza al RAC-PK\gamma de rata. Una secuencia EST (número de acceso Incyte 2573448) derivada de una genoteca de ADNc hipocámpico, contenía parte de la secuencia de codificación que incluye el supuesto codón de inicio metionina (ATG) y parte de la región 5' no traducida. El codón de inicio se rodeó de una secuencia consenso Kozak para comenzar la traducción y había presente un codón de parada del marco de lectura en las posiciones -6 a -3. Sobre la base de esta secuencia de 239 bp, se sintetizaron cebadores sentido de oligonucleótidos para experimentos de técnica de amplificación rápida de los extremos 3' de ADNc (3' RACE): Akt-3spl = 5'-ACC ATT TCT CCA AGT TGG GGG CTC AG-3' y Akt-3sp2 = 5'GGG AGT CAT CAT GAG CGA' TGT TAC C-3'. Se realizaron experimentos 3' RACE en Marathon-Ready™ ADNc de cerebro fetal humano o cerebelo humano (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EUA) según las instrucciones del fabricante usando Akt-3sp1/race-ap1 como cebadores en la RCP primaria y Akt-3sp2/race-ap2 en la RCP anidada. Los fragmentos de RCP resultantes se clonaron y secuenciaron. Esto extendió la secuencia de codificación de la Akt-3 en 916 bp, pero la nueva secuencia no incluía un codón de parada del marco de lectura. Se realizó una segunda ronda de amplificación 3' RACE en Marathon Ready™ ADNc de cerebro humano utilizando cebadores sentido sobre la base de la secuencia obtenida en la primera ronda (Akt-3sp3 = 5'CAC TCC AGA ATA TCT GGC ACC AGA GG-3' y Akt-3sp4 = 5'CTA TGG CCG AGC AGT AGA CTG GTG G-3') en combinación con race-ap1 y race-ap2, respectivamente. La secuencia obtenida incluía un codón de parada del marco de lectura y la secuencia 3' no traducida hasta la cola poli(A). Se diseñaron cebadores antisentido basados en la región 3' no traducida (Akt-3ap4 = 5'-TGC CCC TGC TAT GTG TAA GAG CTA GG-3' y Akt-3ap5 = 5' AAG AGC TAG GAC TGG TGA TGT CCA GG-3') y la secuencia de codificación completa de Akt-3 se amplificó del ADNc hipocámpico humano utilizando Akt-3sp1/Akt-3ap4 (RCP primaria) y Akt-3sp2/Akt-3ap5 (RCP anidada) como cebadores. El fragmento de RCP resultante de 1.200 bp se clonó después en el vector pCR2.1 en el TA-cloning (equipo original para clonación TA, Invitrogen BV, Leek, Países Bajos) y se secuenciaron completamente los insertos de varios clones. Un clon que contenía un inserto con la secuencia confirmada (hAkt-3/pCR2.1) se usó para subclonación posterior en el vector de expresión en mamíferos pcDNA-3 (Invitrogen), produciendo la construcción hAkt-3/pcDNA-3. A fin de preparar una construcción que codificara una proteína Akt-3 etiquetada con un COOH-terminal, se amplificó un fragmento de 553 bp a partir del plásmido Akt-3/pcDNA-3 utilizando un cebador antisentido que incorpora un sitio de restricción XhoI y la secuencia que codifica una hemaglutinina (HA) tag (YPYDVPDYA) después del aminoácido 479 de la secuencia de Akt-3. Este fragmento se volvió a clonar en el plásmido hAkt-3/pcDNA-3 utilizando los sitios de restricción BstEII y XhoI produciendo la construcción HA-hAkt-3/pcDNA-3.

Construcciones y mutantes para la expresión de Akt-3 en E. coli

A fin de expresar la proteína Akt-3 humana en E. coli, la secuencia de codificación completa de Akt-3 se amplificó a partir del plásmido hAkt-3/pCR2.1 usando cebadores que introducen un sitio de restricción EcoRI y un sitio de restricción XhoI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento de RCP se clonó como un fragmento EcoRI/XhoI en el vector pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) produciendo la construcción hAKT-3(WT)/pGEX-4T-3 y la secuencia del inserto se confirmó por análisis secuencial.

Los mutantes de esta construcción se prepararon utilizando el equipo de mutagénesis sitio-dirigida Quickchange (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) según las instrucciones del fabricante. El mutante T305D (construcción hAKT-3(T305D)/pGEX-4T-3) se creó mutando ACA en la posición 923-925 a GAG, lo que dio por resultado una mutación de Tre^{305} a Asp en la proteína resultante. El mutante S472D (construcción hAKT-3(S472D)/pGEX-4T-3) se creó cambiando TC en la posición 1404-1405 a GA utilizando RCP con un cebador antisentido largo que incorpora el cambio, lo que dio por resultado una mutación de una Ser^{472} a Asp en la proteína resultante. También se construyó un mutante doble por mutagénesis sitio-dirigida en hAKT-3(S472D)/pGEX-4T-3 y contuvo ambas mutaciones (construcción hAKT-3(T305D/S472D)/pGEX-4T-3). Los insertos de todas las construcciones resultantes se confirmaron por análisis secuencial completo. Las proteínas de fusión que resultaron de la expresión de estas construcciones en E. coli contienen una porción GST acoplada al NH_{2}-terminal de la secuencia Akt-3 humana.

Expresión en células Cos-7 y células HEK-293

Akt-3 se expresó transitoriamente en Cos-7 por transfección en fosfato de calcio de las células con la construcción HA-hAkt-3/pcDNA-3. Las células se estimularon con 10 ng/ml de IGF-1 durante 30 minutos, se lisaron y la Akt-3 se inmunoprecipitó con mAb 12CA5. La actividad de Akt-3 se evaluó según se describe más adelante.

Para la expresión en las células HEK-293, las células se transfectaron con construcciones pCDNA-3 Akt-3 según se describió previamente (Alessi et al 1996). Después de la estimulación con IGF, las células se lisaron (Alessi et al 1996) y HA-Akt se inmunoprecipitó con anticuerpo 3F10 (Roche Molecular Biochemicals). Se evaluó la actividad de Akt en los complejos inmunitarios midiendo la fosforilación de un sustrato peptídico (Crosstide) en presencia de PKI 1\muM (inhibidor de PKA) y GF 109302X 1\muM (inhibidor de PKC) según se describe.

Expresión y ensayo de Akt-3 tipo salvaje y mutante en E. coli

Las construcciones de expresión pGEX se transformaron en la cepa BL21 DE3 de E. coli y las proteínas de fusión GST de Akt-3 tipo salvaje y mutada se purificaron en glutatión-sefarosa según las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La proteína eluida de las perlas se almacenó en glicerol al 50% a -20ºC. La actividad de Akt se evaluó incubando 0,8 \mug de la enzima purificada durante 30 minutos a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario) en una solución amortiguadora que contenía HEPES 10 mM, MgCl 10 mM, DTT 1 mM y 0,1 mg/ml de histona H2B a pH 7,0, en un volumen total de 25 \mul y que contenía 10 \muCi [\gamma-^{32}P]-ATP(6.000 Ci/mmol). Los experimentos iniciales indicaron que la reacción fue lineal con el tiempo durante al menos 45 minutos. La reacción se detuvo agregando 25 \mul de solución amortiguadora de la muestra para SDS-PAGE. Los resultados se cuantificaron en un phosphorimager después de un SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 15% (p/v).

Estudios de mapeo cromosómico

SeeDNA Biotech Inc, Toronto, Canadá llevó a cabo estudios de mapeo cromosómico usando análisis por hibridación fluorescente in situ (FISH) esencialmente según se describe (Heng et al., 1992; Heng y Tsui, 1993), Brevemente, se cultivaron linfocitos humanos a 37ºC durante 68-72 h antes del tratamiento con 0,18 mg/ml de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) para sincronizar el ciclo celular en la población de células. Las células sincronizadas se lavaron y se volvieron a cultivar a 37ºC durante 6 h. Se cosecharon las células se prepararon extendidos en portaobjetos usando los procedimientos corrientes incluidos tratamiento hipotónico, fijación y secado al aire. Se biotiniló una sonda de ADNc para Akt-3 (fragmento EcoRI de 1,44 kb del clon hAkt-3/pcDNA-3) y se usó para la detección de FISH. Los extendidos se llevaron a estufa a 55ºC durante 1 h, se trataron con Rnasa y se desnaturalizaron en formamida al 70% (v/v) en 2x NaCl/Cit. (NaCl 0,3 M, citrato disódico 0,03 M, pH 7,0) durante 2 min a 70ºC seguido de deshidratación en etanol. Las sondas se desnaturalizaron antes de cargarlas en los extendidos cromosómicos desnaturalizados. Después de una hibridación durante toda la noche, los extendidos se lavaron y se registraron las señales de FISH y el patrón de bandas del 4',6-diamidino-2-fenilindol por separado en película fotográfica, y la asignación de los datos de mapeo de FISH a las bandas cromosómicas se logró por superposición de las señales de FISH con las bandas de cromosomas teñidos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (Heng & Tsui, 1993).

Análisis de transferencia Northern

Se hibridaron transferencias Northern que contenían 2 \mug de ARN enriquecido en poli(A) derivado de diferentes tejidos humanos (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EUA) según las instrucciones del fabricante con un fragmento marcado NotI- XbaI de Akt-3 (nucleótidos 1404 a 1857) de 454 bp cebado al azar con \alpha-^{32}P-dCTP (equipo HighPrime, Boehringer Mannheim) correspondiente a parte de la secuencia 3' no traducida.

Análisis de transcripción inversa (TI) RCP

Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos para la amplificación RCP específica de un fragmento de Akt-3. Estos cebadores fueron Akt-3sp2 = 5'-GGG AGT CAT CAT GAG CGA TGT TAC C-3' (cebador sentido) y Akt-3ap1 = 5'- GGG TTG TAG AGG CAT CCA TCT CTT CC -3' (cebador antisentido), originando un producto de 425 bp. Las amplificaciones RCP de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) se realizaron en las mismas muestras de ADNc utilizando como controles positivos cebadores de G3PDH 5'-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3' (cebador sentido) y 5'-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-3' (cebador antisentido), produciendo un fragmento de 1.000 bp. Estos cebadores se utilizaron para amplificaciones RCP en paneles de ADNc de múltiples tejidos (Clontech Laboratories) y en ADNc preparado de líneas celulares tumorales. Para la preparación de ADNc de células tumorales, las células se homogeneizaron y se preparó el ARN total usando el equipo RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Se hizo una transcripción inversa de 1 \mug del ARN total usando oligo(dT)_{15} como un cebador y 50 U de transcriptasa inversa Expand™ (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron reacciones de RCP con cebadores específicos para Akt-3 o específicos para G3PDH en 1 \mul de ADNc. Se obtuvieron imágenes de geles teñidos con bromuro de etidio usando el sistema de vídeo Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) y las bandas de RCP se analizaron usando el software EagleSight.

Ensayos para identificar los agentes que modulan la actividad de Akt-3

Para identificar los agentes que modulan la actividad de Akt-3, se pusieron a punto ensayos de SPA (ensayo de centelleo por proximidad) y ensayos de filtración para la actividad de la Akt-3.

Los ensayos de SPA se realizaron a 25ºC durante 3 h en presencia de Hepes 25 mM, pH 7.0, que contenía MgCl_{2} 15 mM y DTT 1 mM. Cada ensayo se realizó en un volumen de reacción de 100 \mul que contenía GST-AKT-3 111 nM (diluido en Hepes 25 mM, pH 7,0, que contenía MgCl_{2} 15 mM, DTT 1 mM), histona biotinilada H2B 0,75 \muM, [\gamma-^{33}P] - ATP 2nM y todos los agentes en análisis. La reacción se terminó agregando 100 \mul de mezcla de detención (ATP 50 \muM, EDTA 5 mM, BSA al 0,1%, Triton X-100 al 0,1% y 7,5 mg/ml de perlas para SPA de PVT (poliviniltolueno) recubiertas con estreptavidina). Después de permitir que las perlas se asentaran durante 30 minutos, se hizo el recuento de la mezcla de ensayo en un contador de centelleo de placa microtiter. Los resultados se ilustran en la figura 7.

Los ensayos de filtración de AKT3 se realizaron a 25ºC durante 3 h en presencia de Hepes 25mM, pH 7,0, que contenía MgCl_{2} 15 mM y DTT 1 mM. Cada ensayo se realizó en un volumen de reacción de 100 \mul que contenía GST-AKT-3 111 nM (diluido en Hepes 25mM, pH 7,0, que contenía MgCl_{2} 15 mM y DTT 1 mM), histona H2B 25 \muM, [\gamma^{-33}P]-ATP 2nM y todos los agentes en análisis. La reacción se terminó por agregado de 100 \mul de H_{3}PO_{4} 75 mM. Se filtraron 90 \mul de la mezcla de ensayo a través de papel de intercambio catiónico de fosfocelulosa. Después de lavar cinco veces con H_{3}PO_{4}75\muM, se hizo un recuento del papel de filtro en un contador de centelleo de placa de microtitulación. Los resultados se ilustran en la figura 8.

Resultados Clonación molecular de Akt-3 humana

La búsqueda de similitud en las bases de datos LifeSeq™ y EMBL usando la secuencia de Akt-3 de rata como una secuencia de interrogación produjo varias secuencias EST humanas que codificaban parte del homólogo humano de la Akt-3 de rata. Usando la información de la secuencia de ADN de las bases de datos, fuimos capaces de deducir la secuencia completa de ADNc para la Akt-3 humana en experimentos 3' RACE posteriores (figura 1). La secuencia de ADNc obtenida codificó una proteína de 479 residuos de aminoácido con una masa molecular calculada de 55.770 Da. Los primeros 451 aminoácidos de la proteína Akt-3 humana contienen sólo dos diferencias con la secuencia correspondiente de rata (Konishi et al, 1995)- Asp (rata) a Gli (humana) (Gly en inglés) en la posición 10 y Pro (rata) a Ala (humana) en la posición 396 y codifican un dominio de homología a plecstrina, un dominio quinasa y una "cola" COOH-terminal. La proteína Akt-3 predicha (figura 2) muestra una significativa semejanza con Akt-1 (Jones et al, 1991; 83,6% de identidad; 87,8% de similitud) y con Akt-2 (Cheng et al., 1992; 78% de identidad; 84,3% de similitud). Se observó la "cola" COOH-terminal en las proteínas Akt-1 y Akt-2 tanto del ser humano como de la rata, pero está aparentemente truncada en el única otra secuencia informada de Akt-3 (Akt-3 de rata, Konishi et al., 1995; número de acceso D49836). Los experimento 3' RACE realizados en ADNc humanos derivados de diferentes tejidos no aportaron pruebas de la existencia de una forma más corta de Akt-3 que sería análoga a la Akt-3 de rata (no se muestran los datos). La cola en la Akt-3 humana contiene 28 residuos de aminoácido (YDEDGMDCMDNERRPHFPQFSYSASGRE) que reemplazan 3 residuos de aminoácido en la secuencia de rata (CPL). La cola de la Akt-3 humana contiene un residuo de serina en la posición 472 (se muestra en negrita) que corresponde a Ser^{473} en Akt-1 o Ser^{474} en Akt-2. La fosforilación de Ser^{473} y Ser^{474} ha sido implicada previamente en la activación de Akt-1 y Akt-2, respectivamente (Alessi et al., 1996; Meier et al.,1997). La Tre^{308} (en el dominio quinasa) también ha sido implicada en la activación de Akt-1 y este residuo también se conserva en la Akt-3 humana (Tre^{305}).

Caracterización de la actividad de Akt-3

Para caracterizar la actividad enzimática de Akt-3, expresamos y purificamos la enzima recombinante como una proteína de fusión GST. El análisis del producto purificado por SDS-PAGE indicó que la proteína era aparentemente >90% pura. La enzima purificada pudo fosforilar la histona H2B (figura 3) y no se observó ninguna fosforilación utilizando GST recombinante sola. Previamente, se había demostrado que la actividad enzimática de Akt-1 aumentaba por fosforilación de Tre^{308} y Ser^{473}, y la mutación de ambos residuos a Asp (para simular la fosforilación) activa sinérgicamente a la Akt-1 (Alessi et al., 1996). Para investigar si Akt-3 se regula de la misma manera, las proteínas de fusión GST en las cuales o Tre^{305} o Ser^{472}(correspondientes a Tre^{308} y Ser^{473} en Akt-1) o tanto Tre^{305} como Ser^{472} se mutaron a Asp se expresaron y ensayaron en comparación con la enzima de tipo salvaje. La mutación de Tre^{305} a Asp ("T305D") aumentó en 2 veces la tasa inicial de fosforilación de la histona H2B, mientras que la mutación de Ser^{472} a Asp(S472D'') aumentó la tasa inicial sólo 1,4 veces (figura 3A). Cuanto se mutaron tanto Tre^{305} como Ser^{472} (``T305D,S472D) a Asp, se observó un aumento en 3,2 veces de la tasa inicial de fosforilación.

Para confirmar que los estímulos extracelulares pueden activar la Akt-3 en las células de mamíferos, se transfectaron células Cos-7 con un ADNc que codifica Akt-3 fusionada a una HA tag. La actividad de Akt-3 en immunoprecipitados de HA aumentó en 1,5 y 1,9 veces (n=2) después de la estimulación con IGF-1 (10 ng/ml).

Para confirmar aún más que los estímulos extracelulares pueden activar a la Akt-3 en las células de mamíferos, se transfectaron células HEK-293 con un ADNc que codifica Akt-3 fusionada a un HA epítopo tag. Con el tratamiento con IGF, la actividad de la Akt-3 en los inmunoprecipitados de anti-HA (figura 3B) aumentó casi 60-veces por encima de la de las células no transfectadas (figura 3C). Las variantes de Akt en las cuales Tre^{305} y Ser^{472} se mutaron a alanina fueron resistentes a la activación por IGF. Compatible con esto, la transferencia Western con un anticuerpo fosfoespecífico Ser^{472} de inmunoprecipitados de HA de las células estimuladas con IGF demostró que la Ser^{472} se fosforilaba después de la estimulación con IGF (figura 3B). Además, se inhibió la activación de Akt-3 mediante el tratamiento previo con CY29 4002 (100 \muM, 94% de inhibición), no se muestran los datos.

Para caracterizar aún más la Akt-3 humana, investigamos la capacidad de una variedad de inhibidores de Ser/Tre de la quinasa para inhibir a la Akt-3. Estos incluyeron Go 6976, GF-109203X (ambos inhibidores de la proteína quinasa C (PKC)); H-85, H-88, H-89 y KT5720 (inhibidores de la proteína quinasa A (PKA)), KN-62 (inhibidor de la quinasa dependiente de Ca^{+2}/Calmodulina) y PD 98059 (inhibidor de MEK). Cuando se probaron a una concentración 10 \muM estos compuestos no tuvieron un efecto significativo en la actividad de la variante T305D,S472D de Akt-3. Sin embargo, el inhibidor de quinasa de amplio espectro estaurosporina (IC_{50}= 2,0 \pm 0,3 \muM) y el inhibidor de la PKC Ro 31-8220 (IC_{50}= 3,2 \pm 1,0 \muM) inhibieron la variante T305D,S472D de Akt-3 (figura 4).

Localización cromosómica de Akt-3

La secuencia de codificación completa de Akt-3 se usó como una sonda para el análisis de FISH. En las condiciones utilizadas, la eficiencia de hibridación fue de aproximadamente 75% para esta sonda (entre 100 figuras mitóticas comprobadas, 75 de ellas mostró señales en un par de los cromosomas). Puesto que el bandeo DAPI se usó para identificar el cromosoma específico, se obtuvo la asignación entre la señal de la sonda y el brazo largo del cromosoma 1. La posición detallada se determinó posteriormente en el diagrama basado en el resumen de 10 fotografías (figura 5A). No hubo ningún otro locus recogido por la detección de FISH en las condiciones usadas, por consiguiente, se concluyó que Akt-3 está ubicado en el cromosoma humano 1, en la región q43-q44. En la figura 5B se presenta un ejemplo de los resultados del mapeo.

Distribución tisular del ARNm de Akt-3

Se realizó un análisis de transferencia Northern en ARNm derivado de diferentes tejidos humanos. El ARNm de Akt-3 se detectó como dos transcripciones de aproximadamente 4,5 kb y 7,5 kb, que mostraron patrones de expresión similares (fig. 6A). El ARNm de Akt-3 se expresó en una variedad de tejidos, fundamentalmente en el cerebro. De manera semejante, se detectó la Akt-3 de rata como transcripciones múltiples que se expresan sobre todo en el cerebro (Konishi et al., 1995). La expresión más débil de Akt-3 se observó en dos tejidos que responden a la insulina, músculo esquelético e hígado. Akt-3 también se expresó en una cantidad de líneas celulares cancerosas incluidas SW480 de adenocarcinoma colorrectal, A549 de carcinoma de pulmón y G361 de melanoma (no se muestran los datos).

Para confirmar el análisis de transferencia Northern, se realizaron reacciones de RCP con cebadores específicos de Akt-3 y específicos de G3PDH (control interno) en ADNc derivados de diferentes tejidos humanos (fig. 6B). El mensaje de Akt-3 estuvo presente en cada tejido que se ensayó, puesto que se amplificó un fragmento específico de 425 bp en cada ADNc después de 30 ciclos de RCP. La expresión del ARNm de Akt-3 fue alta en la placenta, el ovario y el bazo. La expresión vista en el cerebro, el corazón, el riñón, el colon, la próstata, el intestino delgado y los testículos fue moderada. La menor expresión se dio en el hígado, el pulmón, el páncreas, el músculo esquelético, la sangre periférica, los leucocitos y el timo. En las líneas celulares tumorales (figura 6C), la expresión del ARNm de Akt-3 fue relativamente elevada en las células de fibrosarcoma óseo HT-1080, en las de osteosarcoma SaOS-2 y en las células T de leucemia JURKAT (banda detectable de Akt-3 después de 30 ciclos de la RCP). Las células Caco-2 de adenocarcinoma colorrectal, T84 de carcinoma colorrectal, MCF-7 de adenocarcinoma de mama y SK-N-MC de neuroblastoma muestran expresión de ARNm de Akt-3 después de 35 ciclos de RCP. En las células T-47D de carcinoma de la glándula ductal de mama y HepG2 de hepatoblastoma, la expresión de ARNm de Akt-3 es muy baja o está ausente (no hay señal detectable después de 35 ciclos de RCP).

Se identificaron Akt-1 y Akt-2 en varias especies. Se ha informado de clones de Akt-1 humanos (Jones et al., 1991; Coffer et al 1991), de ratón (Bellacosa et al., 1993) y bovinos (Coffer y Woodgett, 1991), en tanto se han identificado clones de Akt-2 humanos (Cheng et al., 1992) de ratón (Altomare et al., 1995) y de rata (Konishi et al., 1994). Sin embargo, la Akt-3 sólo ha sido identificada previamente en rata (Konishi et al, 1995). Los presentes inventores han identificado la isoforma humana de Akt-3. Aunque la Akt-3 humana muestra una considerable similitud con la Akt-1 y Akt-2 humanas, el descubrimiento de la Akt-3 humana es particularmente significativo porque la secuencia de ADNc codifica una "cola" COOH-terminal que incluye un sitio de fosforilación implicado en la activación de Akt-1 y Akt-2 (Alessi et al., 1996; Meier et al., 1997). Esta cola está ausente en la secuencia de aminoácidos predicha para la rata. La Akt-3 humana parece ser activada por la fosforilación de manera similar a Akt-1 y Akt-2. Sin embargo, su perfil de expresión sugiere que la principal función de esta enzima no es la regulación de las respuestas a la insulina.

La secuencia que se identificó representa el homólogo humano de Akt-3. Esta asignación se basa en la identidad >99% entre las secuencias de proteínas de la Akt-3 de rata y la Akt-3 humana. Con excepción de la cola COOH terminal vista en la Akt-3 humana, hay sólo 2 diferencias en los aminoácidos (Gli^{10} y Ala^{396} en la Akt-3 humana) entre las proteínas Akt-3 de rata y humana. La alineación de todas las secuencias de Akt previamente descritas demuestra que Gli^{10} y Ala^{396} en la proteína humana corresponden a residuos de Gli y Ala respectivamente en las secuencias de Akt-1 y Akt-2 identificadas en otras especies. Otras pruebas de que identificamos la isoforma de Akt-3 provienen de la presencia de secuencias específicas de isotipos representadas por los residuos 47-49 (LPY), 118-122 (NCSPT) y 139-141 (HHK) de Akt-3 humana. Para cada isotipo, estas secuencias se conservan entre especies, pero difieren entre isotipos.

Se predijo que la secuencia de ADNc de Akt-3 humana codificaría un dominio de homología (PH) a plecstrina NH_{2}-terminal (Musacchio et al., 1993) y un dominio quinasa COOH-terminal. Una diferencia sorprendente entre la secuencia de proteínas de la Akt-3 humana y la de rata (Konishi, et al., 1995) es la presencia de una "cola" COOH-terminal que comprende 74 residuos después del dominio quinasa. Los últimos 28 residuos de aminoácido en la Akt-3 humana están ausentes en la secuencia de Akt-3 de rata. No pudimos identificar las secuencias de ADNc humanas que codifican un truncamiento similar, a pesar de conducir los experimentos RACE usando ADNc de varios tejidos humanos diferentes. La región de la Akt-3 humana que está ausente en la Akt-3 de rata abarca un tramo de 10 residuos (residuos 467-476 en la Akt-3 humana) que son idénticos a la correspondiente región de Akt-1 y Akt-2 humanas. Esto sugiere que la cola observada en la Akt-3 humana es auténtica. La importancia de la diferencia observada en la región de la cola de Akt-3 de rata queda por investigar. Sin embargo, la secuencia COOH-terminal de la Akt-3 humana incluye Ser^{472}, la cual corresponde a Ser^{473} en Akt-1. La fosforilación de Ser^{473} mostró conducir a un aumento en 5 veces de la actividad de la Akt-1, mientras que se observa un aumento en 20-25 veces de la actividad de la Akt-1 si se fosforilan tanto Ser^{473} como Tre^{308} (Alessi et al., 1996). Por lo tanto, nuestra observación de que Ser^{472} está presente en la Akt-3 humana es significativa, porque sugiere que la Akt-3 humana es potencialmente regulada de manera similar a Akt-1 y Akt-2. Si la Akt-3 de rata se regula de manera diferente queda por resolver.

Los dominios quinasa y PH de Akt-3 muestran homología con las secuencias de los dominios consenso PH y quinasa (Musacchio et al., 1993; Hanks y Hunter 1995). El dominio PH de la Akt-3 humana es 77% y 86% idéntico a los dominios PH de Akt-1 y Akt-2, respectivamente, mientras que el dominio quinasa de la Akt-3 es 88% y 87% idéntico al dominio quinasa de Akt-1 y Akt-2, respectivamente. La elevada conservación del dominio PH puede indicar una función específica de Akt, porque los dominios PH son a menudo muy divergentes (Musacchio et al, 1993). Aparte de unirse a fosfoinositidos, se ha demostrado que el dominio PH de Akt media interacciones entre Akt y PKC (Konishi, et al., 1995) y también dirige la formación de los complejos multiméricos de Akt (Datta et al, 1995). En contraste, la región entre el dominio PH y el dominio quinasa está poco conservada entre las secuencias de las Akt-1, Akt-2 y Akt-3 humanas, y esta región también es importante para mediar la formación de complejos multiméricos de Akt (Datta et al, 1995). Esto plantea un tema interesante, si la secuencia NH_{2}-terminal del dominio quinasa de Akt-3 media la interacción con otros compañeros de unión que son únicos para Akt-3 o que se unen a múltiples isoformas de Akt.

Para comprobar que el dominio quinasa predicho era catalíticamente activo, expresamos Akt-3 como una proteína de fusión GST en E. coli. La proteína purificada pudo fosforilar un sustrato exógeno, mientras que no se observó ninguna actividad catalítica usando GST en lugar de GST-Akt-3. Para confirmar que Akt-3 en verdad es regulada de manera muy afín a la de Akt-1 y Akt-2, mutamos Tre^{305} y Ser^{473}, o por separado o conjuntamente, a Asp. Se vio previamente que esta estrategia imitaba fielmente el efecto de la fosforilación de estos residuos en Akt-1 (Alessi et al., 1996). La mutación de cualquiera de estos residuos dio por resultado un aumento de la actividad, aunque el aumento fue menor que el observado con Akt-1 (Alessi et al., 1996). Además, no observamos una activación sinérgica de Akt-3 por mutación tanto de Tre^{305} como de Ser^{473}. En contraste, cuando ambos residuos correspondientes se mutaron simultáneamente a Asp en Akt-1, se observó activación sinérgica (Alessi et al, 1996). Las diferencias cuantitativas evidentes entre Akt-1 y Akt-3 pueden reflejar verdaderas diferencias en la regulación de estas dos isoformas, o pueden deberse a otros factores como el sistema de expresión diferente utilizado. En el presente estudio Akt-3 se expresó como una proteína de fusión GST en E. coli, mientras que la actividad de Akt-1 se estudió usando una proteína etiquetada con HA expresada en células COS. No obstante, nuestros resultados demuestran que Akt-3 es regulada cualitativamente de manera similar a Akt-1. El trabajo anterior también mostró que la activación de Akt depende de PI 3-quinasa para generar 3-fosfoinositidos que se unen al dominio PH de Akt, promueven la translocación de Akt a la membrana plasmática y facilitan la fosforilación de Akt por las quinasas secuencia arriba (estudiado en Alessi y Cohen, 1998; Coffer et al., 1998). Nuestra observación de que el mutante T305D/S472D de Akt-3 es más activo que la enzima del tipo salvaje (figura 3), cuando se mide en ausencia de 3-fosfoinositidos, sugiere que después de la fosforilación Akt-3 se vuelve (al menos parcialmente) independiente de la unión a fosfoinositido.

La estructura del dominio catalítico de Akt está estrechamente relacionada con la proteína quinasa A y la proteína quinasa C. En realidad, una búsqueda BLAST de la base de datos SwissProt reveló que las quinasas más estrechamente relacionadas (distintas de las diferentes isoformas de Akt) incluyen varias isoenzimas de la proteína quinasa C. Esto nos impulsó a investigar si los inhibidores existentes de PKA o PKC, así como otros inhibidores de serina/treonina quinasa, se podrían utilizar como inhibidores de Akt-3. De los compuestos ensayados, sólo la estaurosporina y el compuesto estructuralmente relacionado Ro 31-8220 inhibieron potencialmente a Akt-3. La estaurosporina es un inhibidor no selectivo de la quinasa, mientras que Ro 31-8220 es un inhibidor más selectivo de PKC (Davis, et al., 1992). Aunque Ro 31-8220 es un inhibidor aproximadamente 100 veces más potente (IC_{50}= 10 nM; Davis, et al., 1992) de PKC que de Akt-3, esta observación advierte que los experimentos que usan altasconcentraciones de Ro 31-8820 pueden afectar a Akt-3. En contraposición con la estaurosporina y Ro 31-8220, otros dos inhibidores de PKC y otros tres inhibidores de PKA no inhibieron a Akt-3. Esto sugiere que aunque Akt-3 está estrechamente relacionado en la secuencia con PKC, puede ser posible encontrar inhibidores selectivos de Akt.

La observación de que la Akt-3 es activada por IGF-1 sugiere que la Akt-3 puede desempeñar una función en la regulación de la supervivencia celular. Akt-3 puede potencialmente suprimir la apoptosis en las células tumorales. Una inquietud al usar Akt como un objetivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer es que Akt desempeña una función en la señalización de la insulina (estudiado en Sheperd et al, 1998). Por lo tanto, los inhibidores de Akt pueden inducir los síntomas observados en los pacientes con diabetes. Una solución que se ha propuesto es desarrollar inhibidores selectivos de Akt-2 (Walker et al, 1998). Esto se basa en parte en la observación de que la Akt-1 es activada en gran medida por la insulina en los hepatocitos y músculo esquelético de rata, mientras que la Akt-2 sólo es débilmente activada por la insulina en estos tejidos. Sin embargo, la Akt-3 de rata parece ser aún más débilmente activada por la insulina en estos tejidos (Walker et al, 1998), y en este estudio hemos demostrado que el ARNm de Akt-3 se expresa sólo a bajos niveles en hígado y músculo esquelético humanos, que son tejidos que responden a la insulina. Esto sugiere que los inhibidores selectivos de Akt-3 podrían tener menor potencial para causar síntomas similares a aquellos vistos en pacientes con diabetes que los que causan los inhibidores de Akt-2. La ubicación de Akt-3 humana en el cromosoma humano 1q43-44 también es interesante, puesto que se ha informado de pacientes con cánceres hematológicos que tienen anomalías cromosómicas en esta región (Mitelman et al, 1997). Aunque la importancia de la última observación es debatible, puesto que se han observado anomalías en varios locus en los pacientes con cánceres hematológicos, los resultados presentados aquí indican que la Akt-3 puede probar ser un objetivo importante para el desarrollo de nuevos tratamientos para el tratamiento del cáncer.

Listado de secuencias

1. La secuencia Nº de ID 1 corresponde a la secuencia de nucleótidos de Akt-3 ilustrada en la figura 1

2. La secuencia Nº de ID 2 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de Akt-3 desde la posición del nucleótido 11 a la 1.447 ilustrada en la figura 1.

3. La secuencia Nº de ID 3 corresponde a la secuencia de aminoácidos de Akt-3 ilustrada en las figuras 1 y 2.

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<110> Janssen Pharmaceutica N.V.

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<120> AKT-3 humana

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<130> 51869/001

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<140> PCT/GB99/04311

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<141> 1999-12-17

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<150> GB 9828375.7

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<151> 1998-12-22

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1547

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 1435

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 479

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

3

4

5

Claims (28)

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Akt-3 humana o un equivalente funcional de ésta, que comprende la secuencia de aminoácidos determinada en la SEQ Nº de ID 3, donde un equivalente funcional es una proteína Akt-3 capaz de fosforilar la histona H2B cuando se expresa y purifica como una proteína de fusión GST recombinante.

2. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 que es una molécula de ADN y preferentemente de ADNc.

3. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que contiene la secuencia de nucleótidos ilustrada en la SEQ Nº de ID 1.

4. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ Nº de ID 2.

5. Una molécula antisentido de 10 a 40 pares de bases de longitud, capaz de hibridarse a la molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones de restricción alta.

6. Una proteína Akt-3 humana o un equivalente funcional, derivado o bioprecursor de ésta, que comprende una secuencia de aminoácidos como la determinada en la SEQ Nº de ID 3, donde un equivalente funcional es una proteína Akt-3 capaz de fosforilar la histona H2B cuando se expresa y purifica como una proteína de fusión GST recombinante.

7. Una proteína Akt-3 humana codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Una proteína Akt-3 humana de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende la secuencia de aminoácidos determinada en la SEQ Nº de ID 3.

9. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.

10. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9 que contiene un promotor inducible.

11. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 que contiene una secuencia que codifica una molécula indicadora.

12. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para utilizar como un medicamento.

13. El uso de molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer.

14. Una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para usar como un medicamento.

15. El uso de una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer.

16. Una preparación farmacéutica que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 junto con un vehículo, diluyente o excipiente de ésta aceptables desde el punto de vista farmacéutico.

17. Una célula huésped u organismo no humano, transformado o transfectado con un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

18. Una célula, tejido u organismo no humano transgénicos que contienen un transgén capaz de expresar una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

19. Una proteína Akt-3 humana expresada a partir de la célula o el organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.

20. Un método de identificación de compuestos que inhiben selectivamente la promoción de la supervivencia celular mediada por la proteína Akt-3 humana, donde dicho método comprende:

i)

proveer de una célula transformada con un vector de expresión que activa la vía de la Akt-3 que sobrevive en presencia o ausencia de un factor de supervivencia en comparación con una célula de control que no fue transformada con dicho vector y que morirá en ausencia de dicho factor de supervivencia,

ii)

poner en contacto cada una de dichas células con un compuesto de prueba después de eliminar de dichas células dicho factor de supervivencia, donde la muerte de dicha célula transformada es indicativa de la inhibición selectiva de dicho compuesto sobre la vía de la Akt-3 humana que promueve la supervivencia.

21. Un método de identificación de compuestos que inhiben selectivamente la promoción de la supervivencia celular mediada por la proteína Akt-3 humana, donde dicho método comprende:

i)

proveer de una célula transformada con un vector de expresión que activa la vía de la Akt-3 además de una célula de control que no ha sido transformada con dicho vector,

ii)

poner en contacto cada una de dichas células con un agente que induce la muerte, mediante el cual la muerte de dicha célula de control y la supervivencia de dicha célula transformada son indicativas de la actividad de promoción de la supervivencia de la vía de la Akt-3 activada,

iii)

poner en contacto dicha célula transformada con un compuesto de prueba, donde la muerte de dicha célula es indicativa de la inhibición selectiva de dicho compuesto sobre la vía de la Akt-3 humana que promueve la supervivencia.

22. Un método de identificación de los agentes que influyen la actividad de una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho método comprende poner en contacto dicha proteína Akt-3 humana con un sustrato de ésta en presencia de un compuesto de prueba y una fuente de fosfato y controlar cualquier fosforilación de dicho sustrato.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22 donde se provee de dicha proteína Akt-3 como una proteína de fusión o etiquetada por epítopo que tiene un dominio capaz de fosforilar un sustrato conocido.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 22 donde dicha proteína Akt-3 se proporciona como una molécula de fusión de GST y Akt-3 humana.

25. Un método de identificación de los agentes que influyen en la actividad de una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho método comprende poner en contacto un fosfolípido o un sustituto o equivalente funcional de éste, con un dominio PH de una proteína Akt-3 humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en presencia de un agente que se debe probar y controlar cualquier unión de dicho fosfolípido, substituto o equivalente funcional de éste con dicho dominio PH de dicha proteína Akt-3.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25 donde dicho fosfolípido contiene 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol.

27. Un método de identificación de un compuesto que modula la actividad de la de Akt-3 quinasa, que comprende:

a)

poner en contacto dicha Akt-3 con un sustrato de ésta en presencia de una fuente de fosfato radiomarcada y el compuesto que se va a probar,

b)

detener la reacción mediante el agregado del inhibidor de quinasa en presencia de perlas de SPA,

c)

controlar la señal de dichas perlas en comparación con un control que no se haya puesto en contacto con dicho compuesto.

28. Un método de identificación de un compuesto que modula la actividad de Akt-3, que comprende:

a)

poner en contacto dicha Akt-3 con un sustrato de ésta en presencia de una fuente de fosfato radiomarcada y el compuesto que se va a ensayar,

b)

detener la reacción,

c)

filtrar la mezcla de reacción a través de papel de intercambio de cationes de fosfocelulosa, y

d)

controlar la señal de dicho papel de filtro en comparación con un control que no se haya puesto en contacto con dicho compuesto