ES2242542B1 - Procedimiento para la produccion en levaduras de capsidas virales vacias compuestas por proteinas derivadas de pvp2 del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv). - Google Patents
Procedimiento para la produccion en levaduras de capsidas virales vacias compuestas por proteinas derivadas de pvp2 del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv).Info
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Abstract
Procedimiento para la producción en levaduras de
cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de pVP2
del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa
(IBDV).
Las cápsidas vacías del virus causante de la
enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) están constituidas por
ensamblaje de proteínas derivadas de la proteína pVP2 de IBDV, de
distinto tamaño y tienen aplicación en la producción de vacunas y en
la elaboración de vectores para terapia génica.
Description
Procedimiento para la producción en levaduras de
cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de pVP2
del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa
(IBDV).
La invención se relaciona con un procedimiento
para la producción de cápsidas virales vacías compuestas por
proteínas derivadas de la proteína pVP2 (pVP2*) del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV). Dichas cápsidas
pueden ser utilizadas en la producción de vacunas y en la
elaboración de vectores para terapia génica.
El virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV) es un miembro de la familia
Birnaviridae que infecta diferentes especies aviares y es el
responsable directo de una grave enfermedad inmunosupresora causante
de importantes pérdidas económicas en la industria avícola mundial
(Sharma JM et al. 2000. Infectious bursal disease virus of
chickens: pathogenesis and immunosuppression. Developmental and
Comparative Immunology 24:223-235; van den Berg
TP et al. 2000. Infectious bursal disease (Gumboro disease).
Revue scientifique et technique (International Office of
Epizootics) 19:509-543).
Las partículas de IBDV son icosaédricas con una
simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única
capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a
la obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han
fracasado. Por ello, la información estructural disponible está
basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes
obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de
partículas virales vacías. En base a estos estudios, se ha
comprobado que la superficie externa de la partícula está formada
por un entramado continuo de 260 trímeros de la proteína VP2 (37
kDa) ordenados en cinco conformaciones diferentes. La cara interna
de las partículas contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa),
los cuales, independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona
basal de los trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer
polipéptido, VP4 (28 kDa), también podría formar parte de las
partículas, estando situado en la base de los pentámeros que forman
los vértices de la estructura icosaédrica.
Las proteínas VP2, VP3, y VP4 se producen a
partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido (o
poliproteína) precursor de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se
procesa autocatalíticamente liberando los péptidos pVP2 (VPX), VP3 y
VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región central de la
poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas Ion y es el
responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos pVP2 y VP3 son
los responsables directos del ensamblaje de las cápsidas. El péptido
pVP2 sufre un último corte en su extremo C-terminal
antes de dar lugar a la forma madura de la proteína (VP2), que es
la que se encuentra en las partículas purificadas. Este
procesamiento de pVP2 es necesario para la correcta formación de
las cápsidas, y requiere la presencia de VP3, aunque la proteasa
responsable aún no ha sido identificada. Como es conocido, la
morfogénesis es un proceso vital para el ciclo vírico que requiere
de pasos sucesivos asociados a modificaciones en los polipéptidos
precursores. Por ello, los virus han desarrollado estrategias que
permiten la secuencial y correcta interacción entre cada uno de sus
componentes. Una de estas estrategias, utilizada con frecuencia por
virus icosaédricos, es la utilización de polipéptidos provenientes
de una única poliproteína como base de sus componentes
estructurales. En estos casos, el adecuado procesamiento
proteolítico de dicha poliproteína juega un papel crucial en el
proceso de ensamblaje.
Las vacunas convencionales empleadas para el
control de la bursitis infecciosa se basan en el empleo de cepas,
con diferentes grados de virulencia, del propio IBDV crecidas en
cultivo celular o en huevos embrionados. Los extractos que contienen
el material infeccioso son sometidos a procesos de inactivación
química para producir vacunas inactivadas o bien son empleados de
forma directa para producir vacunas vivas atenuadas. Este último
tipo de vacunas presenta los inconvenientes clásicos asociados con
el empleo de vacunas vivas atenuadas, concretamente, el riesgo de
mutaciones que reviertan la virulencia del virus o le hagan perder
su inmunogenicidad.
Se han descrito vacunas
sub-unidad recombinantes que comprenden la proteína
VP2 de IBDV expresada en diversos sistemas de expresión, por
ejemplo, bacterias, levaduras o baculovirus, normalmente en forma
de proteína de fusión. Los resultados obtenidos en ensayos de
inmunización de pollos con dichas vacunas no han sido completamente
satisfactorios.
Las partículas pseudovirales (VLPs, del inglés
"virus-like particles"), constituyen una
alternativa al empleo de vacunas vivas atenuadas y de vacunas
sub-unidad recombinantes. Las VLPs se obtienen por
autoensamblaje de la totalidad o parte de las
sub-unidades constituyentes de la cápsida viral y
mimetizan la estructura y propiedades antigénicas del virión nativo
aunque carecen de material genético por lo que son incapaces de
replicarse. Además de su aplicación con fines vacunales las VLPs
pueden ser utilizadas como vectores de moléculas de interés
biológico, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas,
etc.
La utilización de diferentes vectores para la
expresión de genes de IBDV ha permitido desarrollar sistemas de
producción de ensamblados virales diferentes. En este sentido, se
ha descrito la producción de distintas VLPs de IBDV mediante
expresión de la poliproteína viral empleando distintos sistemas de
expresión, por ejemplo, células de mamífero
(Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of
ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation
of virus-like particles. J. Gen. Virol.
79:1047-54) o vectores alternativos basados en el
empleo de baculovirus recombinantes (rBVs) (Vakharia VN. 1997.
Development of recombinant vaccines against infectious bursal
disease. Biotechnology Annual Review 3:151-68;
Kibenge FS et al. 1999. Formation of
virus-like particles when the polyprotein gene
(segment A) of infectious bursal disease virus is expressed in
insect cells. Can J Vet Res 63:49-55).
El empleo de dichos vectores virales ha
permitido la producción en células de insecto de diferentes tipos
de VLPs entre las que se incluyen partículas, formadas por
ensamblaje de una proteína VP2 recombinante, de
20-30 nm de diámetro (Min-Ying Wang
et al. 2000. Self-Assembly of the infectious
bursal disease virus capsid protein, rVP2, expressed in insect
cells and purification of inununogenic chimeric rVP2H particles by
immobilized metal-ion affmity chromatography.
Biotechnology and Bioengineering. Vol.
67(1):104-111); VLPs con simetría T=1
obtenidas mediante expresión de una forma quimérica de la proteína
VP2 (rVP2-456) (Martínez- Torrecuadrada JL et
al. 2000. Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278:322-331); VLPs que contienen todas las
proteínas presentes en la particula viral (Maraver A et al.
2003. The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of
infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid
formation. Journal of Virology 77:6438-49); y
VLPs producidas por la expresión de una forma quimérica de la
poliproteína viral formada por la fusión de ésta a una proteína
heteróloga con el fin de mejorar la eficiencia en la formación de
VLPs (Chevalier C et al. 2002. The maturation process of pVP2
requires assembly of infectious bursal disease virus capsids. J.
Virol. 76:2384-92).
Los diversos procedimientos de producción de
VLPs de IBDV descritos previamente adolecen de diferentes defectos
que reducen o impiden su aplicabibilidad para la generación de
vacunas frente a IBDV ya que:
- (i)
- los vectores desarrollados para producir VLPs de IBDV se basan en el empleo de virus recombinantes, derivados del virus vacunal o baculovirus, por lo que la producción de dichas VLPs se realiza a partir células de mamífero o de insecto; sin embargo, esos sistemas de producción son muy costosos para su aplicación en la producción a nivel industrial de vacunas veterinarias;
- (ii)
- la producción de VLPs de IBDV en células de mamífero se basa en el empleo de recombinantes del virus vacunal; sin embargo, además de que ese sistema de producción tiene un costo muy elevado, el empleo de un virus recombinante capaz de infectar tanto mamíferos como aves, no reúne las condiciones de bioseguridad necesarias para su empleo como vacuna;
- (iii)
- la producción de VLPs de IBDV en células de insecto empleando sistemas de expresión convencionales, por ejemplo, rBVs que expresan únicamente la poliproteína viral, además de costosa, es muy ineficiente y conduce a una producción de VLPs prácticamente nula; y
- (iv)
- la producción de VLPs de IBDV en células de insecto mediante la expresión de una poliproteína quimérica, formada por la fusión de la fase de lectura abierta (ORF) correspondiente a una proteína heteróloga al extremo 3' de la ORF correspondiente a la poliproteína de IBDV, tiene como resultado la producción de VLPs de IBDV que contienen una proteína de fusión (VP3-proteína heteróloga), lo que introduce un elemento proteico no presente en viriones de IBDV, de efecto desconocido y de dudosa aplicabilidad en la cadena de producción de carne de pollo para consumo humano.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar
un vector que permita la producción a nivel industrial de vacunas
frente a IBDV que subsane la totalidad o parte de los inconvenientes
mencionados previamente.
Las levaduras constituyen una alternativa a los
sistemas de expresión previamente mencionados por razones de
simplicidad y coste de producción. Sin embargo, hasta la fecha, no
se ha descrito la posibilidad de producir en las levaduras cápsidas
formadas por ensamblaje de la proteína VP2 de IBDV expresada en
levaduras. Por el contrario, los resultados obtenidos por distintos
grupos de investigadores señalan en la dirección opuesta, es decir,
en el sentido de que la expresión de la proteína VP2 de IBDV en
levaduras no conduce a la formación de partículas o cápsidas. En
relación con esto, Azad et al. (US 5.614.409) describen la
producción de una forma altamente inmunogénica de una proteína VP2
recombinante (rVP2) de IBDV, en la que los 5 últimos restos de
aminoácidos del extremo amino terminal de la VP2 nativa de IBDV han
sido reemplazados por un octapéptido, mediante la expresión de la
secuencia codificante de dicha rVP2 en levaduras. Sin embargo, como
reconocen los mismos autores, el análisis por microscopía
electrónica del material obtenido no reveló la formación de
estructuras de partículas definidas (US 5.614.409, columna 8,
líneas 64-67). Resultados similares parecen haber
sido obtenidos por Pitcovski et al. (Pitcovski J et
al. 2003. Development and large-scale use of
recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal
disease of chickens. Vaccine 21:4736-4743) quienes,
aunque describen la expresión del gen que codifica para la proteína
VP2 de IBDV en Pichia pastoris y el empleo de un material
parcialmente purificado que contiene dicha proteína rVP2 de IBDV
para inmunizar animales, no describen la formación de cápsidas
formadas por autoensamblaje de dicha rVP2 expresada en P.
pastoris.
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que
es posible obtener cápsidas vacías de IBDV mediante la expresión y
ensamblaje de una proteína pVP2* de IBDV, en donde dicha proteína
pVP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida
por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el
resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un
número entero comprendido entre 441 y 501, en levaduras. Dichas
cápsidas vacías de IBDV, formadas por autoensamblaje de dicha
proteína pVP2* de IBDV, se denominan VLPs-pVP2* en
esta descripción. Dichas VLPs-pVP2* de IBDV
contienen uno de los elementos proteicos antigénicamente más
relevante presente en los viriones infectivos de IBDV por lo que
son capaces de inducir una respuesta inmune o antigénica en un
animal y, por tanto, pueden ser utilizadas con fines terapéuticos o
de diagnóstico.
En concreto, se ha observado que la expresión de
una proteína pVP2* de IBDV en Saccharomyces cerevisiae
permite obtener VLPs-pVP2* de IBDV. Dichas
VLPs-pVP2* tienen isometría T=1 y son
inmunogénicas.
Estos resultados han permitido diseñar una nueva
estrategia para la producción de las VLPs de IBDV proporcionadas
por esta invención (VLPs-pVP2*) que, a diferencia de
los métodos descritos previamente para la producción de VLPs de IBDV
(generalmente basados en el empleo de virus recombinantes derivados
del virus vacunal o de un baculovirus y en la producción de dichas
VLPs a partir células de mamífero o de insecto, sistemas de
producción inaceptables para la producción industrial de vacunas
veterinarias por razones de bioseguridad, eficiencia y coste),
permite la expresión y producción de VLPs de IBDV en levaduras con
lo que se subsanan los problemas de bioseguridad y eficiencia y se
consigue un significativo abaratamiento de los costes de producción,
lo que permite su empleo en la producción industrial de vacunas
frente a IBDV. Dicha estrategia se basa en la utilización de un
sistema o vector de expresión génica que permite la expresión de
una pVP2* de IBDV en levaduras y la formación de
VLPs-pVP2* de IBDV, con un rendimiento muy elevado
y con un coste económico muy bajo.
Las vacunas obtenidas utilizando dichas
VLPs-pVP2* presentan numerosas ventajas ya que, por
una parte, se evita la manipulación de material altamente
infeccioso, se previene el riesgo potencial de aparición de nuevos
mutantes de IBDV y se elimina el uso de virus vivo en las
explotaciones avícolas, previniéndose de este modo el riesgo de
diseminación de cepas vacunales de IBDV al Medio Ambiente, y, por
otra parte, permite el desarrollo de sistemas de diagnóstico
diferencial para discriminar entre animales vacunados e infectados.
Estos sistemas de diagnóstico diferencial se basan en la detección
de anticuerpos frente a las proteínas VP2, VP3 y VP4 de IBDV. Los
animales con IBDV desarrollan una fuerte respuesta humoral frente a
ambas proteínas mientras que los animales inmunizados con
VLPs-pVP2* solo presentan anticuerpos frente a la
proteína VP2 de IBDV.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención
se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas
VLPs-pVP2* de IBDV basado en la expresión génica de
una proteína pVP2* de IBDV en levaduras.
Los sistemas de expresión y las levaduras
desarrolladas para la puesta en práctica de dicho procedimiento de
producción de dichas VLPs-pVP2* de IBDV, así como su
empleo para la producción de dichas VLPs-pVP2* de
IBDV, constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
Dichas VLPs-pVP2* de IBDV, que
presentan actividad antigénica o inmunogénica frente a la infección
causada por IBDV, constituyen un aspecto adicional de esta
invención. Asimismo, el empleo de dichas VLPs-pVP2*
de IBDV en la elaboración de medicamentos, tales como vacunas y
vectores para terapia génica, y/o con fines de diagnóstico
constituye un aspecto adicional de esta invención. Dichas vacunas y
vectores constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del plásmido pESCURAinv/pVP2-456. El
plásmido contiene un fragmento de ADN que contiene la región
correspondiente a la poliproteína de IBDV que codifica desde el
resto 1 al resto 456 de la proteína VP2 de IBDV, bajo el control
transcripcional del promotor inducible por galactosa denominado
GAL1. Este plásmido fue utilizado para transformar un cultivo de la
levadura Saccharomyces cerevisiae haploide cepa 499.
La Figura 2 muestra la purificación de
estructuras derivadas de IBDV en células de S. cerevisiae
transformadas con pESCURAinv/pVP2-456 y crecidas en
presencia de galactosa (inductor) durante 18 h a 30ºC. Los cultivos
fueron recogidos y utilizados para la obtención de extractos que
fueron posteriomente analizados mediante ultracentrifugación en
gradientes lineales de sacarosa. Los carriles incluyen muestras
correspondientes al extracto total sin fraccionar (I) y a las
diferentes fracciones desde la zona inferior a la superior del
gradiente (1-37) mediante SDS-PAGE
y tinción con azul de coomassie (Figura 2A), y mediante Western
blot empleando suero anti-VP2 de IBDV (Figura 2B). M
indica los carriles cargados con marcadores de peso molecular (Dual
Color, BIO-RAD).
La Figura 3 muestra la caracterización
estructural de ensamblados derivados de IBDV producidos en células
de S. cerevisiae transfomadas con
pESCURAinv/pVP2-456. La Figura 3A muestra la
caracterización microscópica de VLPs-pVP2*
purificadas; las fracciones 21 a 26 del gradiente mostrado en la
Figura 2 fueron mezcladas y analizadas mediante microscopía
electrónica de transmisión (TEM); en la imagen mostrada se observa
la presencia de numerosas partículas isométricas de un tamaño de 23
nm aproximadamente. La muestra fue teñida con acetato de uranilo.
La Figura 3B muestra el resultado de un análisis bioquímico,
concretamente, la muestra (VLP) fue analizada mediante
SDS-PAGE seguido de tinción con azul de coomassie.
El marcador de peso molecular (M) empleado fue Dual Color
(BIO-RAD). La Figura 3C muestra el resultado de un
análisis antigénico, concretamente, la muestra (VLP) fue analizada
mediante Western blot empleando suero anti-VP2 de
IBDV. En las Figuras 3B y 3C "M" indica el carril
correspondiente a los marcadores de peso molecular (Dual Color,
BIO-RAD).
La Figura 4 es un diagrama de barras que ilustra
la caracterización de la respuesta humoral frente a
VLPs-pVP2-456. Dichas
VLPs-pVP2-456 fueron utilizadas para
inmunizar pollos SPF de 1 día (Ejemplo 2). La inmunización se
realizó empleando un grupo de 7 pollos, con una única dosis de
antígeno por vía intramuscular. Como control se utilizó un grupo de
pollos que fueron inyectados por vía intramuscular con un volumen
idéntico del diluyente del antígeno (PBS). Se tomaron muestras a
intervalos de 7 días hasta el dia 35. Las muestras de suero fueron
analizadas mediante ELISA empleando una dilución de la muestra de
suero de 1/500.
El término VLP-pVP2* (singular)
o VLPs-pVP2* (plural) de IBDV, tal como se utiliza
en esta descripción, se refiere a cápsidas vacías del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), en ocasiones
denominadas genéricamente VLP-pVP2* o
VLPs-pVP2* de la invención, con isometría T=1,
constituidas por ensamblaje de una proteína pVP2*, en donde dicha
proteína pVP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está
constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
resto 1 y el resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde
"n" es un número entero comprendido entre 441 y 501.
El término "IBDV", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a las diferentes cepas de IBDV
pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a
título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP,
Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000
19: 509-43].
El término "proteína pVP2*" se refiere, en
general, a una proteína cuya secuencia de aminoácidos está
constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
resto 1 y el resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde
"n" es un número entero comprendido entre 441 y 501 e incluye
a cualquiera de las diferentes formas de las proteínas pVP2
representativas de cualquiera de las mencionadas cepas de IBDV [NCBI
protein databank], de acuerdo con la definición realizada por
Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez AB, Rodríguez JF. Proteolytic
processing in infectious bursal disease virus: identification of the
polyprotein cleavage sites by site-directed
mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15;
262(1):190-199) así como a proteínas
sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 de IBDV, es decir,
proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 de IBDV, de, al menos,
un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más preferentemente
de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un
95%.
Las proteínas pVP2* particulares se denominan
siguiendo el formato "pVP2-n", donde "n"
es el definido previamente. En una realización particular, dicha
proteína pVP2* es una proteína seleccionada del grupo formado
por:
- (i)
- la proteína pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (ii)
- la proteína pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iii)
- la proteína pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iv)
- la proteína pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la . secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (v)
- la proteína pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vi)
- la proteína pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vii)
- la proteína pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y
- (viii)
- la proteína pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.
La proteína pVP2* de IBDV presente en las
VLPs-pVP2* proporcionadas por esta invención tiene
una secuencia de aminoácidos que comprende entre 441 y 501 restos de
aminoácidos, comenzando a partir del resto número 1, de cualquier
proteína pVP2 representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo,
de la proteína pVP2 de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136]. En una realización particular, dicha proteína pVP2* de
IBDV presente en las VLPs-pVP2* proporcionadas por
esta invención es la proteína pVP2-456 cuya
secuencia de aminoácidos está comprendida entre el resto 1 y el
resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de
acceso AAD30136]. La secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína pVP2-456 de IBDV se extiende desde el
nucleótido 350 hasta al nucleótido 1719 de la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
pVP2* de IBDV" incluye, además de las secuencias de nucleótidos
de dichas fases de lectura abierta, otras fases de lectura abiertas
análogas a las mismas codificantes de proteínas pVP2* de IBDV.
El término "análoga", tal como aquí se
utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que
puede ser aislada o construida sobre la base de la secuencia de
nucleótidos codificantes de pVP2* de IBDV, por ejemplo, mediante
la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la
molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia
de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es
sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de
nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de
nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un
80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más
preferentemente de, al menos, un 95%.
Las VLPs-pVP2* proporcionadas
por esta invención pueden obtenerse mediante la expresión de dicha
proteína pVP2* de IBDV, en células hospedadoras apropiadas, en
particular, levaduras, que contienen la secuencia de nucleótidos que
codifica para dicha proteína pVP2* de IBDV en una construcción
génica. En una realización particular, dichas células hospedadoras
apropiadas son levaduras transformadas con un sistema de expresión
adecuado que incluye una construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2* de
IBDV.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
procedimiento para la producción de VLPs-pVP2* de
IBDV, en adelante procedimiento de la invención, que comprende
cultivar una levadura que contiene la secuencia de nucleótidos que
codifica para una proteína pVP2* de IBDV y que expresa dicha
proteína pVP2* de IBDV, y, si se desea, recuperar dichas
VLPs-pVP2* de la invención.
En una realización particular, el procedimiento
de la invención comprende las etapas de:
- a)
- cultivar células de levadura transformadas con un sistema de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pVP2* de IBDV, en donde dicha proteína pVP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteínas pVP2* y su ensamblaje para formar VLPs-pVP2* de IBDV; y
- b)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas VLPs-pVP2* de IBDV.
Como puede apreciarse, el procedimiento de la
invención comprende la expresión génica de una proteína pVP2* de
IBDV mediante el empleo de un vector que permite la expresión de
dicha proteína en levaduras. Para ello, el procedimiento de la
invención comprende, como paso previo, la obtención de un sistema
de expresión génica, tal como un sistema constituido por un
plásmido que contiene una construcción génica que codifica para
dicha proteína pVP2* de IBDV, seguido de la transformación de
levaduras con dicho sistema de expresión, la expresión de las
proteínas recombinantes, y, si se desea, el aislamiento de las
VLPs-pVP2* de IBDV formadas por ensamblaje de dichas
proteínas pVP2* de IBDV, y, opcionalmente, la purificación de
dichas VLPs-pVP2*.
La obtención de levaduras transformadas con un
sistema o vector de expresión que permite la expresión de la
proteína pVP2* de IBDV puede ser realizada por un experto en la
materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre
esta tecnología (pESC epitope tagging vectors Instructions manual.
Stratagene www.stratagene.com; Sambrook J.1989. Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y.). Las levaduras transformadas se cultivan
bajo condiciones, conocidas por los expertos en la materia, que
permiten la expresión de las proteínas recombinantes (pVP2*) y su
ensamblaje para formar VLPs-pVP2* de IBDV. Tras la
expresión de dicha proteína pVP2* de IBDV en levaduras, las
proteínas pVP2* expresadas se ensamblan y forman las
VLPs-pVP2* de IBDV, las cuales pueden ser aisladas o
retiradas del medio, y, si se desea, purificadas. El aislamiento y
purificación de dichas VLPs-pVP2* de IBDV de la
invención puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo,
mediante fraccionamiento en gradientes de sacarosa.
El sistema o vector de expresión utilizado para
transformar levaduras comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para una proteína pVP2* de IBDV operativamente unida a
unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción, y constituye un aspecto adicional de esta
invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un sistema o vector de expresión útil para transformar
levaduras, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
para una proteína pVP2* de IBDV, en donde dicha proteína pVP2* es
una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la
secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto
"n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número
entero comprendido entre 441 y 501, estando dicha secuencia de
nucleótidos codificante para dicha proteína pVP2* de IBDV
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción
y, opcionalmente, de traducción.
En una realización particular, dicho sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende la secuencia
de nucléótidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a una proteína pVP2* seleccionada entre
las proteínas pVP2-441, pVP2-452,
pVP2-456, pVP2-466,
pVP2-476, pVP2-487,
pVP2-494 y pVP2-501.
Los elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, presentes en dicho sistema de
expresión incluyen promotores, que dirigen la transcripción de la
secuencia de la proteína pVP2* (a la que está operativamente unido),
y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y
su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de
inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación,
origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), etc., todas ellas
útiles en levaduras.
Prácticamente cualquier sistema o vector de
expresión apropiado puede ser utilizado en la generación de dicho
sistema de expresión. A modo ilustrativo, dichos vectores incluyen
plásmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), etc. que
pueden contener, además, un origen de replicación heterólogo, por
ejemplo, bacteriano, para que pueda ser amplificado en bacterias,
así como un marcador utilizable para seleccionar las células
transfectadas diferente al gen o genes de interés. Estos vectores
de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales
conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook J et al.
1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory] y forman parte de la presente invención. En una
realización particular, dicho sistema o vector de expresión es un
plásmido, tal como un plásmido adecuado para transformar levaduras
basado en un sistema de expresión pESC Yeast (Stratagene), por
ejemplo, el plásmido pESCURA/pVP2-456 (Ejemplo 1.1)
que contiene una construcción génica que codifica para la proteína
pVP2-456 de IBDV y permite la producción de
VLPs-pVP2* de IBDV en levaduras.
El empleo del sistema de expresión génica
proporcionado por esta invención para la producción y obtención de
VLPs-pVP2* de IBDV constituye un aspecto adicional
de esta invención.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula hospedadora, tal como una levadura, que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2* de
IBDV. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una
levadura transformada con un sistema de expresión proporcionado por
esta invención que comprende una construcción génica que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2*
de IBDV. Prácticamente cualquier levadura puede ser utilizada para
la puesta en práctica del procedimiento de la invención; no
obstante, en una realización particular, dicha levadura es una
levadura del género Saccharomyces, por ejemplo, S.
cerevisae, S. pombe, etc., una levadura del género
Pichia, por ejemplo, P. pastoris, etc.
Las VLPs-pVP2* de IBDV pueden
ser utilizadas como vectores o vehiculizadores de productos de
interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo,
fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc., por lo
que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos, de diagnóstico o
de investigación. En una realización particular, dichas moléculas
de interés biológico incluyen polipéptidos de interés, tales como
antígenos o inductores de respuestas inmunes en animales o humanos
a los que se suministre, o bien incluyen secuencias de ácido
nucleico, útiles en terapia génica, destinadas a ser introducidas
en el interior de las células apropiadas.
Dichas VLPs-pVP2* de IBDV pueden
ser utilizadas para inmunizar animales, en particular, aves, per
se o como vectores o vehiculizadores de moléculas con actividad
biológica, por ejemplo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
fármacos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines
terapéuticos o de diagnóstico. En una realización particular,
dichas moléculas con actividad biológica incluyen antígenos o
inductores de respuestas inmune en animales o humanos a los que se
suministre, o bien fármacos que se liberan en su sitio de acción
específico, o bien secuencias de ácido nucleico, todas ellas útiles
en terapia génica y destinadas a ser introducidas en el interior de
las células apropiadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de dichas VLPs-pVP2* de IBDV
en la elaboración de medicamentos tales como, vacunas, vectores para
terapia génica (delivery systems), etc. En una realización
particular, dicho medicamento es una vacuna destinada a conferir
protección a animales, en particular, aves, frente a IBDV. En otra
realización particular, dicho medicamento es un vector para terapia
génica.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
VLPs-pVP2* de IBDV, junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha
vacuna es útil para proteger animales, en particular, aves, frente
a IBDV. En una realización particular, dichas aves se seleccionan
del grupo formado por pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes,
codornices y avestruces. En una realización preferida, la vacuna
proporcionada por esta invención es una vacuna útil para proteger
pollos de la infección causada por IBDV.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de VLPs-pVP2* de la invención calculada
para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada,
entre otras causas, por las características propias de las
VLPs-pVP2* de la invención y el efecto de
inmunización a conseguir.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.
En una realización particular, dicha vacuna se
prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un
diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro
diluyente aceptable farmacéuticamente.
La vacuna proporcionada por esta invención puede
ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que
dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la
secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna
se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de
administración elegida. En una realización particular, la
administración de la vacuna proporcionada por esta invención se
efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. El
Ejemplo 1 ilustra la obtención de
VLPs-pVP2-456 de IBDV, mientras que
el Ejemplo 2 pone de manifiesto la capacidad antigénica de dichas
VLPs-pVP2-456 de IBDV en pollos.
Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener
VLPs de IBDV formadas por autoensamblaje de la proteína
pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está
constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV, denominadas
VLPs-pVP2-456, en cultivos de
levadura (Saccharomyces cerevisiae) se generó el vector
pESCURAinv/pVP2-456. El primer paso en la
construcción del vector se realizó mediante el clonaje de la región
codificante de la proteína pVP2-456 (restos
1-456 de la pVP2 de IBDV) en el vector pESCURAinv.
El plásmido pESCURAinv se generó mediante digestión del vector
pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y religación de la mezcla
de digestión. El vector resultante, pESCURAinv, contiene la región
de clonaje múltiple en posición invertida con respecto a la del
vector parental pRS426. El fragmento de DNA correspondiente a la
proteína pVP2-456 se obtuvo mediante PCR con los
oligonucleótidos identificados como Oligo I (SEQ ID NO: 2) y Oligo
II (SEQ ID NO: 3) empleando como molde el plásmido pVOTE.2/Poly
(Fernández-Arias A et al. 1998. Expression
of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal
discase virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79:1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas Bg1II y HindIII y
clonado en el vector pESCURAinv previamente digerido con los
enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pESCURAinv/pVP2-456 (Figura 1).
El plásmido pESCURAinv/pVP2-456
se empleó para transformar un cultivo de la levadura S.
cerevisiae haploide cepa 499 según un protocolo previamente
descrito (Gietz & Woods. 2002. Transformation of yeast by the
Liac/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology
350:87-96). Las levaduras transformadas con el
plásmido fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de
medio SC (CSM + YNB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los
aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo
(-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30ºC, se seleccionó una
colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes
análisis de expresión de proteínas y formación de VLPs. El análisis
de la expresión de la proteína pVP2-456 y la
formación de VLPs se realizó siguiendo un protocolo descrito
previamente para la caracterización de VLPs de IBDV en otros
sistemas de expresión (Fernández-Arias A et
al. 1998. Expression of ORF A1 of infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology 79,
1047-1054; Lombardo E et al. 1999. VP1, the
putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious
bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3,
leading to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology
73:6973-698).
La colonia seleccionada fue cultivada en medio
liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%. El
cultivo se incubó a 30ºC durante 24 h. Este cultivo fue empleado
para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de 200
ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor galactosa
al 2%. El cultivo fue mantenido a 30ºC durante 18 horas (hasta una
D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas a 3.000
rpm, durante 5 minutos a 4ºC, se lavaron con agua destilada 1 vez, y
el pellet fue resuspendido en tampón de lisis (TEN: Tris 10 mM, pH
8,0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X (Compl
Roche). Para la lisis se añadió 1 volumen de "glass beads"
(cuentas o perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de
425-600 micrones (Sigma). Esta mezcla fue sometida
al vortex vigoroso durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de
30 segundos, y todo ello a 4ºC. Tras ello se recuperó la fracción
soluble por centrifugación de la mezcla de lisis a 13.000 rpm
durante 15 minutos a 4ºC. Esta muestra fue sometida a
fraccionamiento en un gradiente de sacarosa según un protocolo
previamente descrito (Lombardo E et al. 1999. VP1, the
putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious
bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3,
leading to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology
73:6973-6983). Las muestras obtenidas tras el
fraccionamiento, así como una muestra del material de partida
fueron analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current
Protocols in Molecular Biology, Edited by: Fred M. Ausubel, Roger
Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A.
Smith, Kevin Struhl, John Wiley & Sons,
http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm] y tinción con azul
de coomassie (coomassie blue) e inmunodetección por Western blot
empleando suero anti-VP2 [Current Protocols in
Molecular Biology, Edited by: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert
E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin
Struhl, John Wiley & Sons,
http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm]. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 2. Como puede observarse en la
Figura 2A, la tinción con azul de coomassie reveló la presencia de
una proteína con el tamaño (42 kDa) esperado para
pVP2-456, junto con proteínas de mayor masa
molecular, en diferentes fracciones correspondientes a la zona
central del gradiente. La Figura 2B, correspondiente al análisis
mediante Western blot, muestra que la bandas detectadas mediante
tinción con azul de coomassie corresponden a la proteína
pVP2-456 tanto en su forma monomérica como en forma
de oligómeros de alto peso molecular. Estos resultados demostraron
de forma fehaciente la correcta expresión del polipéptido
pVP2-456 en el cultivo de S. cerevisiae
transformado con el plásmido
pESCURAinv/pVP2-456.
A continuación, las distintas fracciones del
gradiente fueron analizadas mediante microscopía electrónica de
transmisión tal como se ha descrito previamente (Lombardo E et
al. 1999. VP1, the putative RNA-dependent RNA
polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with
the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology
73:6973-6983). Este análisis se realizó con el
producto resultante de mezclar las fracciones 21 a 26 del gradiente
indicado en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 3A, el
análisis mediante TEM de dichas fracciones del gradiente reveló la
existencia de VLPs de IBDV en esa región del gradiente. Las VLPs
obtenidas (VLPs-pVP2-456) son
isométricas (T = 1) y presentan un diámetro de 23 nm y aspecto
circular. El subsiguiente análisis mediante SDS-PAGE
(Figura 3B) e irmunoblot con suero anti-VP2 (Figura
3C), mostró que la fracción contenía la proteína
pVP2-456 con un grado de pureza estimado de, al
menos, 95%.
Siguiendo el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1.1 se generaron los vectores que se describen en la Tabla
1 que expresaban en levaduras las VP2* que se relacionan en dicha
Tabla 1, en la que se recoge, además, la isometría que presentan las
VLPs-pVP2* obtenidas y los iniciadores
utilizados.
| Notas: |
| * El número indica el número de restos de aminoácidos de pVP2 de IBDV de cada proteína. |
| (a) VLPs T = 1 |
| (b) VLPs T =7 |
| (c) Túbulos 20 nm |
| (d) Capsómeros |
| (e) VLPs T = 13 |
| (f) Túbulos 50 nm |
Con el fin de determinar la inmunogenicidad de
las VLPs-pVP2-456 (Ejemplo 1.1) se
realizó un ensayo de inmunización en pollos de 1 dia. Un grupo de 7
animales SPF (libre de patógenos específicos) fue inmunizado por
vía intramuscular con una única dosis de 200 \mul conteniendo 10
\mug de VLPs-pVP2-456/animal
diluidas en PBS. Un grupo similar fue inyectado con PBS. Se
realizaron extracciones semanales de suero de cada uno de los
animales de ambos grupos. Los sueros de cada grupo y fecha fueron
mezclados para obtener un suero homogéneo (pool) representado por
volumenes equivalentes de cada individuo del grupo. Los sueros
fueron analizados mediante ELISA. Para ello, los pocillos fueron
tapizados con 10 ng de
VLPs-pVP2-456. Los ensayos fueron
realizados según un protocolo previamente descrito (Current
Protocols in Immunology. Edited by: Barbara Bierer, John E.
Coligan, David H. Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober, John
Wiley & Sons
\underline{http://www.interscience.wiley.com/c\_{}p/index.htm}).
Los resultados obtenidos, reflejados en la Figura 4, demuestran que
una única inmunización en ausencia de adyuvante produce una potente
respuesta frente a la proteína pVP2-456.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<110> BIONOSTRA, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN EN
LEVADURAS DE CÁPSIDAS VIRALEE VACÍAS COMPUESTAS POR PROTEÍNAS
DERIVADAS DE pVP2 DEL VIRUS CAUSANTE DE LP ENFERMEDAD DE LA BURSITIS
INFECCIOSA (IBDV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7929
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica del plásmido
pESCURAinv/pVP2-456
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(342)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Gal1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (350)..(1719)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fase de Lectura Abierta de la
proteína pVP2-456 de IBDV
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo I, oligonucleótido iniciador
directo utilizado para la generación del fragmento de DNA
codificante de la proteína pVP2-456 en combinación
con la SEQ. ID. NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo II; Oligonucleótido iniciador
inverso utilizado para la generación del fragmento de DNA
codificante de la proteína pVP2-456 en combinación
con la SEQ. ID. NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt acacagctat cctccttatg gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-441 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt ttatgctcct gcaatcttca gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-452 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt accttatggc ccggattatg tctttgaagc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-466 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcaggtgg gaacaatgtg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-476 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aaccttcccc aattgcatgg ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-487 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcctgggc ctcatcgccc agc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-494 en combinación con la , SEQ. ID.
NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggctcgagc agttcccgaa gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-501 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aaggtcttgc ttttcctgac gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la generación del fragmento de DNA codificante de la
proteína pVP2-512 en combinación con la SEQ. ID. NO:
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
Claims (18)
1. Un procedimiento para la producción de
cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis
infecciosa (IBDV) [VLPs-pVP2*] que comprende
cultivar una levadura que contiene la secuencia de nucleótidos que
codifica para una proteína pVP2* de IBDV y que expresa dicha
proteína pVP2* de IBDV, y, recuperar dichas
VLPs-pVP2*, en donde dicha proteína pVP2* de IBDV es
una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la
secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto
"n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número
entero comprendido entre 441 y 501.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende las etapas de:
- a)
- cultivar células de levadura transformadas con un sistema de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pVP2* de IBDV, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteínas pVP2* y su ensamblaje para formar VLPs-pVP2* de IBDV; y
- b)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas VLPs-pVP2* de IBDV.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha proteína pVP2* de IBDV se
selecciona del grupo formado por:
- (i)
- la proteína pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (ii)
- la proteína pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iii)
- la proteína pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iv)
- la proteína pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (v)
- la proteína pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vi)
- la proteína pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vii)
- la proteína pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y
- (viii)
- la proteína pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha levadura es del género
Saccharomyces o del género Pichia.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicha levadura es S. cerevisiae, S. pombe o P.
pastoris.
6. Una levadura del género Saccharomyces
que comprende un sistema de expresión que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para una proteína pVP2* de IBDV
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, en donde dicha proteína pVP2* es una
proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la
secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto
"n" de la proteína pVP2 nativa de IBDV, en donde "n" es un
número entero comprendido entre 441 y 501.
7. Levadura según la reivindicación 6, en el que
dicha levadura es S. cerevisiae o S. pombe.
8. Empleo de un sistema de expresión de
levaduras que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
para una proteína pVP2* de IBDV operativamente unida a unos
elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción, en donde dicha proteína pVP2* es una proteína cuya
secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de
aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la
proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero
comprendido entre 441 y 501, o de una levadura según cualquiera de
las reivindicaciones 6 ó 7, para producir cápsidas vírales vacias
del virus de la bursitis infecciosa (IBDV)
[VLPs-pVP2*].
9. Una cápsida vacía del virus causante de la
enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
[VLP-pVP2*] obtenida según el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Una cápsida vacía del virus causante de la
enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
[VLP-pVP2*], caracterizada porque está
constituida por ensamblaje de proteínas pVP2* de IBDV expresadas en
levaduras, en donde dicha proteína pVP2* de IBDV es una proteína
cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de
aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la
proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero
comprendido entre 441 y 501, con la excepción de que "n" es
456.
11. Una cápsida según cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicha proteína pVP2* de IBDV se
selecciona del grupo formado por:
- (i)
- la proteína pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (ii)
- la proteína pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iii)
- la proteína pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iv)
- la proteína pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (v)
- la proteína pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vi)
- la proteína pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y
- (vii)
- la proteína pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.
12. Cápsida según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque tiene
isometría T=1.
13. Empleo de cápsidas vacías del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
[VLPs-pVP2*], según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en la elaboración de un medicamento.
14. Empleo según la reivindicación 13, en el que
dicho medicamento es una vacuna frente a la enfermedad aviar
denominada bursitis infecciosa o un vector para terapia génica.
15. Una vacuna que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías del virus causante de
la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) [VLPs- pVP2*], según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, junto con, opcionalmente,
uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
16. Vacuna según la reivindicación 15, para
proteger aves de la infección causada por el virus causante de la
bursitis infecciosa (IBDV).
17. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dichas aves se seleccionan del grupo formado por pollos, pavos,
ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces.
18. Una vacuna para proteger pollos de la
infección causada por el virus causante de la bursitis infecciosa
(IBDV) que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
cápsidas vacías de IBDV [VLPs-pVP2*], según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, junto con,
opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
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