ES2242980T3 - Dermatan disulfato, un inhibidor de la generacion de trombina y de la activacion del complemento. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende dermatán sulfato que tiene más del 75% de unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D- galactosamina 4, 6-di-O-sulfatada.

Description

Dermatán disulfato, un inhibidor de la generación de trombina y de la activación del complemento.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la inhibición de la generación de trombina mediada por un cofactor II de heparina independiente de la antitrombina III (en lo sucesivo CHII), así como a la inhibición de las vías alternativa, clásica y terminal de la activación del complemento; de manera específica, esta invención se refiere a un dermatán sulfato sulfatado químicamente constituido por cadenas disacarídicas de dermatán principalmente disulfatadas que inhiben la generación de trombina y la activación del complemento.

Antecedentes

Las afecciones y enfermedades caracterizadas por una generación excesiva de trombina, como la trombosis venosa profunda (en lo sucesivo TVP) y la proliferación destructiva de las células musculares lisas vasculares (en lo sucesivo CMLV), pueden ser potencialmente mortales y precisan un tratamiento eficaz. El traumatismo produce tanto lesión vascular como proliferación de las CMLV, lo que produce estenosis, restenosis e hiperplasia vascular, así como activación de la coagulación sanguínea. La restenosis vascular, la hiperplasia y la activación de la coagulación sanguínea pueden ser potencialmente mortales cuando aparecen después de cirugía de injerto vascular, trasplante de corazón, angioplastia con balón o con láser, lesión arterial traumática, reparación postquirúrgica de arterias musculares, implantación a largo plazo de catéteres arteriales, intervenciones arteriales diagnósticas invasoras, trasplantes de riñón, pulmón o hígado, e intervenciones de cirugía de derivación.

Por ejemplo, la TVP aparece con frecuencia antes de una complicación potencialmente mortal, la embolia pulmonar (en lo sucesivo EP). La mayoría de las EP, y particularmente la mayoría de las EP mortales, aparece después de una TVP asintomática. Datos epidemiológicos indican que la tasa anual de TVP es de aproximadamente 160 por 100.000 en la población general, y la incidencia de EP mortal es de aproximadamente 60 por 100.000. Así, la profesión médica lucha por tratar la TVP y prevenir sus complicaciones. De manera ideal, un tratamiento satisfactorio de la TVP prevendrá la EP, la extensión del trombo, la gangrena venosa y las pérdidas de miembros, la recurrencia sintomática de la trombosis, el síndrome postraumático grave y el hinchamiento progresivo de la pierna que da lugar a aumento de la presión compartimental, que produce la consiguiente flegmasía cerúlea dolorosa.

Como ejemplo de la gravedad del problema, los pacientes a los que se realizan determinados tipos de cirugía programada tienen un riesgo elevado de presentar una tromboembolia venosa postoperatoria. Se sabe que sin profilaxis perioperatoria, la sustitución total de cadera se asocia a una elevada incidencia, tal vez tan alta como del 50%, de TVP, y de manera secundaria a una elevada tasa de EP. Sin embargo, los anticoagulantes son eficaces para la prevención de la morbilidad y de la mortalidad en el tratamiento de la TVP (European Consensus Report; 1992), ya que se sabe que los anticoagulantes en general y la heparina en particular pueden reducir la TVP y la EP mortal en pacientes quirúrgicos generales. La heparina, un glucosaminoglucano (en lo sucesivo GAG) que tiene potentes propiedades anticoagulantes, es una mezcla heterogénea de cadenas de polisacárido sulfatadas de manera variable que tienen un peso molecular de entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 30.000 Dalton y que están constituidas por unidades repetitivas de D-glucosamina y residuos de ácido L-idurónico o D-glucurónico. Por lo tanto, el sentido común indica que antes de la intervención quirúrgica el paciente debe recibir profilaxis con anticoagulantes, habitualmente heparina, que típicamente se mantiene durante 7 a 10 días después de la operación.

Otras complicaciones potencialmente mortales se producen después de las intervenciones quirúrgicas para reparar la lesión vascular. Una forma grave de lesión vascular, la aterosclerosis, produce cerca del 50% de toda la mortalidad de Norteamérica por un conjunto variado de enfermedades que incluyen infarto de miocardio, accidente cerebrovascular agudo y gangrena de las extremidades. Habitualmente una respuesta inflamatoria-fibroproliferativa excesiva a diversas formas de agresión al endotelio y a la pared arterial produce las lesiones ateroscleróticas. Con frecuencia el tratamiento de elección para combatir la aterosclerosis es una intervención quirúrgica, lo que da lugar a más de 1,5 millones de intervenciones de injerto de derivación, endarterectomías y angioplastias transluminales percutáneas (en lo sucesivo ATPC) realizadas cada año en Norteamérica. Lamentablemente en muchos casos, aunque los efectos inmediatos de la intervención son beneficiosos para el paciente quirúrgico, la aceleración tardía del proceso aterosclerótico después de la intervención reduce mucho la eficacia a largo plazo de la intervención quirúrgica. De manera específica, la proliferación de las CMLV de la íntima produce con frecuencia estenosis y oclusión de la luz del vaso. Por ejemplo, la tasa de restenosis después de ATPC es tan alta como del 40% en los primeros tres a seis meses después de la intervención. El caso de los más de 200.000 injertos de derivación realizados cada año, entre el 40% a 60% fracasan en un plazo de cinco años debido a cambios proliferativos y oclusivos que implican proliferación de CMLV. Además, la proliferación de CMLV es responsable de más del 50% de los fracasos del trasplante de corazón en un plazo de cinco años. Por lo tanto, son necesarias composiciones y procedimientos para reducir la aceleración de los procesos ateroscleróticos que aparecen después de las intervenciones cardiovasculares.

Fármacos u otros tratamientos que interfieren con la actividad promotora del crecimiento que produce proliferación de las CMLV podrían desacelerar la progresión del proceso aterosclerótico. Como se sabe que la trombina ejerce una potente actividad promotora del crecimiento de las CMLV, y que en determinadas condiciones puede estar presente en el interior de la pared vascular, los inhibidores de la trombina son candidatos fundamentales para desacelerar el proceso aterosclerótico. Entre las composiciones que interfieren con el efecto de la trombina están las heparinas comerciales (Castellot, J.J. J. Cell Biol. 102:1979-84 (1986)), que inhiben la trombina tanto in vitro como in vivo. También se piensa que la heparina es un potente antiproliferativo que inhibe la trombina mejor que cualquiera de los otros GAG conocidos in vitro (Castellot, J.J. J. Cell Biol. 90:3722(1981)). Sin embargo, existen pocas evidencias que apoyen esta última posibilidad en el contexto clínico.

Además, la heparina tiene muchas limitaciones producidas principalmente por su potente actividad anticoagulante. Por ejemplo, las elevadas dosis de heparina (> 200 unidades/kg (en lo sucesivo U/kg), que generan > 3 unidades de antitrombina/ml de plasma) necesarias para realizar con éxito la cirugía con derivación cardiopulmonar (en lo sucesivo DCP) y para mantener la permeabilidad de la bomba de DCP producen una hemorragia local o profusa que contribuye a la morbilidad del paciente. La hemorragia postoperatoria excesiva y la consiguiente necesidad de transfusión sanguínea son efectos adversos bien documentados que experimentan los pacientes a los que se hace cirugía con DCP (Woodman, R.D., Harker, L.A., Bleeding Complications Associated with Cardiopulmonary Bypass, Blood 76(9):1680 (1990); Dietrich, W., y cols., The Influence of Preoperative Anticoagulation on Heparin Response During Cardiopulmonary Bypass, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 102:505 (1991)). Se ha descrito hemorragia potencialmente mortal en el 5% a 25% de los casos y se estima que los cirujanos deben reoperar por hemorragia quirúrgica a aproximadamente el 3% de los pacientes sometidos a DCP. Las complicaciones hemorrágicas se deben no sólo a las hemorragias quirúrgicas sino también al desplazamiento de la heparina desde varias proteínas plasmáticas, lo que da lugar a una anticoagulación sistémica prolongada y a un efecto inhibidor de la heparina sobre la función plaquetaria. La administración de una cantidad precisa de un antagonista de la heparina en forma de protamina revierte el efecto anticoagulante de la heparina, lo que previene la hemorragia excesiva en el momento de la descanulación. Sin embargo, la administración de protamina depende de manera crítica de la dosificación, e incluso la administración de un ligero exceso de protamina produce numerosos efectos adversos alarmantes y potencialmente mortales que incluyen inhibición plaquetaria, prolongación del tiempo de tromboplastina parcial activada (en lo sucesivo TTPA) y prolongación de la hipotensión sistémica y de la hipertensión pulmonar (Ireland, H., Rylance, P.B., Kesteven, P., Heparin as an Anticoagulant During Extracorporeal Circulation, Heparin, David A. Lane y Ulf Lindahl (editores); 549-74 (1989)). Una encuesta de 1985 a perfusionistas citó la "reacción a protamina" como el accidente de perfusión más frecuente en las intervenciones con DCP, que se observó de manera completa en dos tercios de los casos (Kuruz, 6th Annual Meeting of Pathophysiology and Extracorporeal Technology, San Diego, CA (1986)). Por lo tanto, la DCP proporciona un excelente modelo in vivo para evaluar la contribución que tienen los compuestos o procedimientos candidatos al agravamiento o a la mejoría de la actividad antitrombótica y las complicaciones hemorrágicas.

También se ha usado la heparina para tratar alteraciones de sistema del complemento. El sistema del complemento tiene una función importante en la defensa del huésped tanto mediante destrucción de organismos invasores como por su función de mediador de la inflamación. Las alteraciones del complemento son enfermedades poco frecuentes que se caracterizan por déficit o disfunción de cualquiera de las más de 19 proteínas de comportamiento normal que suponen aproximadamente el 10% de las globulinas en el suero humano normal. Los pacientes con deficiencias o disfunciones del complemento también pueden ser susceptibles a lesión tisular como consecuencia de respuestas inflamatorias excesivas. Además, la activación del complemento en el transcurso de la recuperación de la oclusión temporal de un vaso sanguíneo o en respuesta a la derivación cardiopulmonar durante la cirugía cardíaca inicia una lesión tisular que está más allá de la que produce la lesión inicial. Se ha mostrado que la heparina inhibe la actividad de las rutas alternativa, clásica y terminal del complemento mediante la regulación de C1, inhibidor de C1, proteína de unión a C4, C3b, factor H y proteína S en un modelo que predice las propiedades de inhibición del complemento in vivo (Edens, R.E., Linhardt, R.J., Bell, C.S., Weitler, J.M., Heparin and Derivatized Heparin Inhibit Zymosan and Cobra Venom Factor Acitivation of Complement in Serum, Immunopharmacol. 27:145-153 (1994)). Sin embargo, la actividad anticoagulante de la heparina contribuye al aumento del riesgo de hemorragia, cambios electrolíticos y trombocitopenia.

En un intento de contrarrestar la formación de trombos y la hemorragia que produce la administración sistémica de heparina durante la cirugía con DCP se han desarrollado procedimientos para la administración local de heparina, que incluyen recubrir biomateriales que interaccionan con la sangre con compuestos antitrombóticos. El compuesto antitrombótico puede estar unido iónicamente o covalentemente a la superficie del polímero de un biomaterial. Una desventaja importante de los polímeros recubiertos con las formulaciones de heparina disponibles en la actualidad es la eficacia limitada de la heparina. Por lo tanto, es importante desarrollar nuevas composiciones de recubrimiento que optimicen la actividad antitrombótica, a la vez que se aplican de manera satisfactoria y constante a diversos materiales tales como polímeros naturales y plásticos sintéticos. De manera ideal, tales nuevas composiciones permitirán el recubrimiento completo de las superficies de un artículo médico que interaccionan con la sangre.

La heparina es un producto natural y, como es el caso de muchos productos obtenidos a partir de diferentes fuentes biológicas, la heparina puede variar en su estructura, particularmente en el grado de sulfatación. La O-sulfatación selectiva mejora la actividad de algunas heparinas y GAG similares a heparina. Por ejemplo, la heparina de ballena, que tiene un bajo grado de O-sulfatación, puede ser 6-O-sulfatada selectivamente en forma de sal de tributilamonio en dimetilformamida (Uchiyama, H., Metori, A., Ogamo, A., Nagasawa, K.J., Biochem. 107:377 (1990); Ogamo, A., Metori, A., Uchiyama, H., Hagasawa, K., Carboh. Res. 193:165-172 (1989)) para aumentar su actividad anticoagulante. También se han sulfatado las sales de piridio de heparán sulfato, otro GAG con un bajo nivel de N- y O-sulfatación (Ofosu, F.A., Modi G.J., Blachman, M.A., Buchanan, M.R., Johnson, E.A., Biochem. J. 248:889 (1987)) para aumentar su actividad biológica. De manera alternativa, también se han sulfatado GAG que son solubles en agua o en formamida (Kiss., J. Helv. Chimica Acta 50:1423 (1967); Griffin, C.C., Stevenson, J.R., Foley, K.M., XIVth Int. Carbohydr. Symp., Estocolmo (1988)) mediante tratamiento con complejos de trióxido de azufre con piridina o trialquilaminas, de los que se prefieren estos últimos por su estabilidad (Levy, L., Petacek, F.J., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 109:901 (1962)). El aumento del grado de sulfatación mejora los efectos del dermatán sulfato (en lo sucesivo DS) sobre la inhibición de la trombina por el CHII en el plasma (Ofosu, F.A., Modi, G.J., Smith, L.M., Cerskus, A.L., Hirsch, J., Blajchman, M.A., Blood 64:742-47 (1984)). Otros estudios han sugerido un potencial como fármacos antitrombóticos para derivados ligeramente sobresulfatados de dermatán sulfato (Maaroufi, R.M., Tapon Bretaddiere, J., Mardiguian, J., Sternberg, C., Dautzenberg, M.D., Fischer, A.M. Influence of the Oversulfation Method and the Degree of Sulfation on the Anticoagulant Properties of Dermatan Sulfate Derivatives. Thromb. Res. 59:749-758 (1990)). Sin embargo, no se ha mostrado que ninguno de estos GAG sobresulfatados supere las dificultades que se han señalado anteriormente para la heparina en el contexto clínico.

Estudios recientes proporcionan otras bases científicas para reemplazar a la heparina como inhibidor de la trombina. Por ejemplo, la trombina se puede unir a fibrina in vitro. Esta unión reduce significativamente la capacidad de la heparina de catalizar la inhibición de la trombina (Hogg, D.J., Jackson, C.M. Fibrin Monomer Protects Thrombin from Inactivation by Heparin antithrombin-III: Implications for Heparin Therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3619-238 (1989)) porque la heparina se debe unir tanto al punto de elevada afinidad de la ATIII como al exopunto aniónico de la trombina, - el mismo punto al que la trombina se une a la fibrina-, para catalizar la inhibición de la trombina. Por lo tanto, la trombina unida a la fibrina reduce el acceso del exopunto a heparina/ATIII, reduciendo en gran medida el efecto de la heparina como inhibidor de la trombina.

El uso de la heparina permite la realización de intervenciones quirúrgicas vasculares complejas. Sin embargo, como se puede observar a partir de la explicación anterior, la heparina, particularmente si se administra por vía sistémica, no es el fármaco candidato ideal para la inhibición de la trombosis, la prevención de la aterosclerosis acelerada que implica crecimiento de CMLV o la inhibición de la activación del complemento que acompaña a las operaciones vasculares y los trasplantes de órganos.

Un candidato prometedor para reemplazar la heparina es el dermatán sulfato, un GAG similar a heparina, también conocido como heparín o condroitín sulfato B. El dermatán sulfato es un polisacárido constituido por la repetición de disacáridos ácido urónico > N-acetil-D-galactosamina unidos por enlaces alternantes 1,3 y 1,4. Dependiendo de su origen y procedimiento de preparación puede tener un peso molecular tan alto como 50.000 Dalton. Inicialmente se forma como un polímero constituido por unidades repetitivas del disacárido uronosilo > N-acetil-D-galactosamina, unidas a la proteína central por medio de una región de enlace glucuronosilo > galactosilo > galactosilo > xilosilo. Como los componentes monoméricos de dermatán sulfato son sacáridos, son susceptibles a epimerización. En particular, en la biosíntesis de dermatán sulfato algunos de los residuos de ácido D-crónico están epimerizados en C5, convirtiéndose en residuos de ácido L-idurónico, seguido de O-sulfatación de N-acetil-D-galactosamina principalmente en C4, aunque también en C6. El dermatán sulfato típicamente tiene contenidos de azufre y nitrógeno entre aproximadamente 6,2% y 6,9% y entre aproximadamente 2,4% y 2,9%, respectivamente (Seikagaku America, Inc, 3 (1989)), lo que refleja estructuralmente un disacárido monosulfatado de dermatán, denominado en el presente documento dermatán sulfato (DS).

Se ha mostrado que los componentes del dermatán sulfato y del condroitín sulfato del cartílago son responsables únicamente de la capacidad de unión al catión, que las reacciones de unión al cationes son del tipo de intercambio iónico y que diferentes cationes muestran grados variables de afinidad por el cartílago (Dunstone JR. Ion-Exchange Reactions Between Acid Mucopolysaccarides and Various Cations. Biochem J. 85:336- 351 (1962)).

En modelos animales se ha demostrado que el DS es un potente fármaco antitrombótico con un bajo riesgo de hemorragia (Fernández, F., Van Rijn., J., Ofosu, F.A., Buchanan, M.R. The Hemorrhagic and Antitrhombotic Effects of Dermatan Sulfate. Brit. J. Haematol. 64:3 (1986)). Una dosis de 500 \mug/kg de DS inhibe la formación de trombos así como una dosis de 70 \mug/kg de heparina. A dosis más elevadas, la magnitud de la hemorragia procedente de una incisión estandarizada en la oreja de conejo fue mucho mayor con heparina que con DS, lo que indica que el DS es más eficaz y más seguro como anticoagulante que la heparina, lo que sugiere que el DS sería útil clínicamente para inhibir la formación de trombos sin desencadenar hemorragias masivas. Además, el DS tiene poco efecto in vitro sobre las plaquetas, y se puede inyectar hasta 40 veces la dosis antitrombótica de DS en conejos sin aumentar la hemorragia (Fernández, F., Van Rijn., J., Ofosu, F.A., Buchanan, M.R. The Hemorrhagic and Antitrhombotic Effects of Dermatan Sulfate. Br. J. Haematol. 64:309- 1 (1986)). Además, se ha mostrado que el DS cataliza de manera eficaz la inhibición de la trombina in vitro, independientemente de si está unido a fibrina o está libre (Okwusidi, J.I., Anvari, N., Kulczycky M., Blajchman M.A., Buchanan M.R., Ofosu, F.A. In vivo Catalysis of Thrombin Inhibition by Antithrombin III or Heparin Co-factor II and Antithrombotic Effect: Differential Effects of Unfractioned Heparin and Dermatan Sulfate. Thromb. Haemorrh. Disorders 1:77-8013 (1990)), y que inhibe la aposición tanto de trombina como de fibrina a trombos preformados de conejo con más eficacia que la heparina in vivo. También se ha mostrado que el DS (30 U/kg) inhibe la hiperplasia de arterias carótidas lesionadas por primera y por segunda vez en un modelo de conejo en el que la heparina (15 U/kg) no había tenido efecto (Buchanan M.R., Brister S.J. Inhibition of Injured Vessel Wall Restenosis with Acute Thrombin Inhibition. Relative Effects of Heparin and Dermatan Sulfate. Bk. Of Abst. Joint Conf. Arteriosclerosis, Thrombosis, Vascular Biol., Salt Lake City, UT, pág. 18 (18-20 de febrero de 1987)).

El DS activa específicamente al CHII, un inhibidor de las proteasas plasmáticas que inhibe la trombina pero no otras proteasas que participan en la hemostasia (Tollefsen, D.W., Majerus, D.W., Blank, M.K. Heparin Cofactor II. Purification and Properties of a Heparin-Dependent Inhibitor of Thtombin in Human Plasma. J. Biol. Chem. 257:2162-9 (1982)). El CHII es activado por fracciones del DS de 12 o más residuos de longitud que contienen una secuencia de octasacárido necesaria para la unión al inhibidor. Se ha identificado un componente hexasacárido en el DS con elevada afinidad por el CHII (Tollefsen, D.M., en: Lane, D.A., Bjurk, I., Lindahl, U (editores), Heparin and Related Polyssaccharydes. Plenum Press, Nueva York, pág. 167-7 (1992).

El DS inhibe la trombina mediante una vía independiente de la ATIII, acelerando la inhibición de la trombina dependiente del CHII (Ofosu, F.A., Modi G.J., Blachman, M.A., Buchanan, M.R., Johnson, E.A., Biochem. J. 248:889 (1987)). El DS contiene cierta cantidad de secuencias sobresulfatadas (IdoA2S-GalNAc4S e IdoA-GalNAc4S6S) además de la secuencia principal de disacárido monosulfatado (IdoA-GalNAc4S). La concentración de las secuencias sobresulfatadas en el DS que aparece de manera natural se correlaciona con la inhibición de la trombina mediada por el CHII (Mascellani, G., Liverani, L., Prete, A., Guppola, P.A., Bergonzini, G., Bianchini, P. Relative Influence of Different Disulphate Disaccharide Clusters on the HCII-mediated Inhibition of Thrombin by Dermatan Sulfates of Different Origins. Thromb. Res. 74:605-1517 (1994)). Se ha sugerido que el contenido de ácido L-idurónico en el DS se correlaciona con el aumento de la inhibición de la trombina (Whinna, H.C., Choi, H.U., Rosenberg, L.C., Church, F.C. Interaction of Heparin Cofactor II with Biglycan and Decorin. J. Biol. Chem. 268:3920-3924 (1993)). El DS tiene una actividad anticoagulante menos específica que heparina, como se demuestra cuando se comparan sus actividades. En comparación con 150 U/mg de heparina, el DS tiene una actividad menor de 5 U/mg, según se mide con el TTPA (Thomas, D.P., Merton, R.E., Barrowcliffe, T.W. Relative Efficacy of Heparin and Related GAGs as Antithrombotic Drugs. Ann N.Y. Acad. Sci. 556:313- 322 (1981)). Se ha demostrado que el DS es un anticoagulante eficaz para la profilaxis de la TVP en pacientes a los que se realiza cirugía ortopédica programada, para prevenir la formación de trombos en pacientes a los que se realiza hemodiálisis y para realizar experimentalmente una derivación cardiopulmonar con éxito en cerdos adultos (Van Rijn, J., McKenna, J. Dermatan Sulfate: A New Concept in Antithrombotic Therapy, Diss. Abstr. Int. B 53:5662 (1993); Ryan, K.E., Lane, D.A., Flynn, A., Ireland, H., Boisclair, M., Sheppard, J., Curtis, J.R. Antithrombotic Properties of Dermatan Sulfate (MF701) n Haemodialysis for Chronic Renal Failure. Thom Haemostas. 68:563 (1992); Brister, S.J., Ofosu, F.A., Heigenhauser, G.L.F., Gianese, F., Buchanan, M.R. Is Heparin the Ideal Anticoagulant for Cardiopulmonary Bypass? Dermatan Sulphate May be an Alternate Choice. Throm Haemostas. 71:468-473 (1994)).

Lamentablemente, a pesar de la eficacia del DS en el laboratorio, produce problemas clínicos prácticos debido a su baja actividad biológica específica, combinada con su elevada viscosidad y baja solubilidad. Por lo tanto, la administración de DS es difícil y no es práctica.

Ahora se ha descubierto que la actividad biológica del DS que tiene típicamente un grupo sulfato por cada disacárido se puede aumentar significativamente mediante la adición de otro grupo sulfato. También se ha encontrado que la composición resultante, dermatán disulfato (en lo sucesivo DDS), formado principalmente por residuos repetitivos de disacárido disulfatado, no sólo es un inhibidor eficaz de la trombina in vivo, sino que también inhibe de manera eficaz la activación del complemento y atenúa la hiperplasia de la pared vascular. Esto es especialmente cierto para el DDS constituido principalmente por unidades de ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-di-O-sulfatada (IdoA-GalNAc4S6S). Además, se encontró que el DDS inhibe la generación de trombina con más eficacia que la heparina durante la DCP.

Como se ha señalado, el DS está constituido principalmente por monómeros monosulfatados, aunque algunos monómeros del DS que aparecen de manera natural están sobresulfatados. Aquellos polímeros de DS que tienen un elevado contenido de ácido L-idurónico se han correlacionado con una mayor inhibición de la trombina (Whinna, H.C., Choi, H.U., Rosenberg, L.C., Church, F.C. Interaction of Heparin Cofactor II with Biglycan and Decorin. J. Biol. Chem. 268:3920-3924 (1993)). Además, también se ha sugerido que el aumento del grado de sulfatación del DS mejoró los efectos catalíticos de la inhibición de la trombina por el CHII en el plasma (Ofosu, F.A., Modi, G.J., Smith, L.M., Cerskus, A.L., Hirsch, J., Blajchman, M.A., Blood 64:742-47 (1984)). Otros estudios de derivados ligeramente sobresulfatados de DDS han sugerido su posibilidad como fármacos antitrombóticos (Maaroufi, R.M., Tapon Bretaddiere, J., Mardiguian, J., Sternberg, C., Dautzenberg, M.D., Fischer, A.M. Influence of the Oversulfation Method and the Degree of Sulfation on the Anticoagulant Properties of Dermatan Sulfate Derivatives. Thromb. Res. 59:749-758 (1990)).

Se ha encontrado una correlación lineal entre el contenido de residuos de disacárido disulfatado y la actividad mediada por CHII de las fracciones de dermatán sulfato que contienen hasta el 20% de disacáridos 2,4-O-disulfatados (IdoA2S-GalNAc4S). Sin embargo, cuando el contenido de disacáridos 2,4-O-disulfatados era bajo, incluso concentraciones considerables de residuos de disacáridos 4,6-O-disulfatados (IdoA-GalNAc4S6S) no contribuían a la actividad antitrombina (Mascellani. G., Liverani, L. Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M., y Casu, B. Quantitation of Dermatan Sulfate Active Site for Heparin Cofactor II by H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Anal. Biochem. 223:135-141 (1994)). Otros estudios atribuyen una elevada inhibición mediada por el CHII de la generación de trombina principalmente a las fracciones del dermatán sulfato que contienen aproximadamente el 3% de secuencias de disacáridos 4,6-O-disulfatados (Linhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin, A., Hoppensteadt, D., Fareed, J. Low Molecular Weight Dermatan Sulfate as an Antithrombin Agent. Biochem. Pharmacol. 47:1241- 1252 (1994)). Más recientemente se ha sugerido que la 4-O-sulfatación de los residuos de N-acetil-D-galactosamina es esencial para la actividad anticoagulante del DS y que la estructura que se une al CHII son secuencias repetitivas de ácido 4-O-sulfatado-L-idurónico > D-galactosamina 4-O-sulfatada (Pavao, M.S.G., Mourao, P.A.S., Mulloy, B., Tollefsen, D.M., J. Biol. Chem. 270:31027-36 (1995)).

La mucosa bovina y la piel porcina son una fuente principal de preparaciones comerciales de dermatán sulfato que contienen residuos de disacárido 2,4-O-disulfatado (Mascellani. G., Liverani, L. Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M., y Casu, B. Quantitation of Dermatan Sulfate Active Site for Heparin Cofactor II by H- Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Anal. Biochem. 223:135-141 (1994)). Los dermatán sulfatos derivados de la mucosa porcina típicamente tienen también residuos de disacárido 4,6-O-disulfatado (Mascellani. G., Liverani, L. Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M., y Casu, B. Quantitation of Dermatan Sulfate Active Site for Heparin Cofactor II by H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Anal. Biochem. 223:135-141 (1994); Linhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin, A., Hoppensteadt, D., Fareed, J. Low Molecular Weight Dermatan Sulfate as an Antithrombin Agent. Biochem. Pharmacol. 47:1241-1252 (1994)). Un GAG del cartílago de calamar, también conocido como condroitín sulfato E, está formado principalmente por disacáridos 4,6-O-disulfatados. Sin embargo, está formado principalmente por unidades de ácido D-glucurónico > N-acetil-D- galactosamina 4,6-O-disulfatada (Kawai, y., Seno, N., Anno, K. J. Biochem. 60:317 (1966)) más que por ácido L-idurónico > N-acetil-D- galactosamina 4,6 O-disulfatada (IdoA-GalNAc4S6S).

El grado de sulfatación es una propiedad funcional importante que contribuye de manera significativa a los efectos anticoagulantes del DS y de otros GAG similares a la heparina. En el DS la unidad de galactosamina esta típicamente O-sulfatada, y los grupos O-sulfato están presentes con frecuencia en la posición 4 y de manera ocasional en la posición 6. Además, también están sulfatadas de manera ocasional las posiciones 2 y/o 3 del ácido idurónico.

El documento FR-A-2.584.728 describe la preparación de fragmentos de la sal sódica del dermatán sulfato. Además, también se describe la preparación de la sal sódica del dermatán sulfato sursulfatado.

Descripción de la invención

Ahora se ha encontrado que el dermatán sulfato (DS) que típicamente tiene un grupo sulfato por cada disacárido es un anticoagulante al menos tan eficaz como la heparina, impide la generación de trombina con más eficacia que la heparina y atenúa la hiperplasia de la íntima con más eficacia que la heparina. Hemos encontrado que estas actividades biológicas se pueden mejorar de manera significativa con la adición de un grupo sulfato adicional. También se ha encontrado que el dermatán disulfato (DDS) resultante que está formado principalmente por residuos repetitivos de ácido L-idurónico > disacárido 4,6-O-disulfatado no sólo es un inhibidor eficaz de la trombina, sino que también inhibe de manera eficaz la activación del complemento.

Un aspecto de esta invención es un procedimiento para inhibir la generación de trombina mediante la administración de una composición que contiene una cantidad eficaz de dermatán disulfato (DDS) constituido por un disacárido repetitivo de ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina que tiene más de dos grupos sulfato por cada disacárido.

Otro aspecto de esta invención es una composición que contiene una cantidad eficaz de dermatán disulfato (DDS) constituida por más de aproximadamente el 75% de unidades de disacárido de ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-O-disulfatada, y un peso molecular entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 30.000 Dalton.

Otro aspecto de esta invención es una formulación que contiene una cantidad eficaz de dermatán disulfato (DDS) constituido por unidades repetitivas del disacárido constituido por ácido L-idurónico > N-acetil-D- galactosamina que tienen más de dos grupos sulfato por cada disacárido.

Breve descripción de los dibujos

Los detalles de nuestra invención se describirán en relación a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un diagrama de la composición química de un disacárido típico en la composición de DDS de la invención;

La Figura 2 muestra los espectros de RMN-^{1}H a 500 MHz en D_{2}O de la composición de DS;

La Figura 3 muestra los espectros de RMN-^{1}H a 500 MHz en D_{2}O de la composición de DDS de la invención;

La Figura 4 muestra la representación gráfica de la inhibición porcentual del complemento frente a la concentración de DS, DDS y heparina;

La Figura 5 muestra una representación gráfica de los tiempos de coagulación activada (TCA) en cerdos durante la DCP y después de la misma que recibieron 400 U/KG de heparina, 25 U/KG de heparina y DDS;

La Figura 6 muestra una representación gráfica de los cambios en la concentración de TAT y T/CHII frente al tiempo en un cerdo al que se hizo DCP con anticoagulación con DDS;

La Figura 7 muestra una representación gráfica de la actividad antitrombina (anti-IIa) frente al tiempo en un cerdo durante la DCP y después de la misma que recibió 400 U/kg de heparina, 25 U/kg de heparina y DDS; y

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La Figura 8 muestra una representación gráfica de la actividad de la generación de trombina (anti-IIa) frente al tiempo durante la DCP en cerdos que recibieron heparina o DDS.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Dermatán sulfato (DS) se refiere a una preparación que se obtiene a partir de tejidos de una manera convencional para la preparación DDS, que se sintetiza de otra manera o que se obtiene comercialmente. El DS se caracteriza porque tiene poca o ninguna actividad relacionada con ATIII y tiene actividad anticoagulante relacionada con CHII in vitro. La biosíntesis epimeriza algunos de los residuos de ácido D-glucurónico en C5, convirtiéndolos en residuos de ácido L-idurónico. Después se O-sulfata la N- acetil-D-galactosamina principalmente en C4 y de manera secundaria en C6. Los expertos en la técnica comprenderán bien la secuencia de etapas necesarias para la epimerización y sulfatación biosintéticas. Los tejidos de mamíferos, por ejemplo la piel de mamífero, incluyendo, si se desea, el tejido humano, actúan como fuentes de DS. Generalmente se prefiere el tejido vascularizado y la piel de fuentes porcinas o bovinas como fuentes de DS, y la mucosa intestinal proporciona la fuente comercial preferida de DS. En general, el material de partida del DS se prepara a partir de la fuente tisular seleccionada, permitiendo que el tejido experimente hidrólisis y recogiendo los polianiones mediante cromatografía de intercambio aniónico, seguida de precipitación selectiva del DS con sulfato de cobre.

En relación ahora con la Figura 1, se muestra un dermatán disulfato (DDS) de la presente invención que comprende una mezcla de cadenas poliméricas de dermatán que contienen principalmente dímeros de disacárido disulfatado conectados entre sí que se obtienen mediante la sulfatación química del DS nativo. Preferentemente los polímeros de esta invención comprenden unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina que tienen más de dos grupos sulfato en cada disacárido. También se prefiere que los polímeros de esta invención comprendan unidades repetitivas del disacárido constituido por ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-O-disulfatada. Preferentemente los polímeros de esta invención tienen un peso molecular medio que varía entre aproximadamente 5500 y aproximadamente 37.500 Dalton, preferentemente entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 30.000 Dalton, que corresponde a entre aproximadamente 16 y aproximadamente 100 unidades de monosacárido en las cadenas poliméricas.

El DDS que tiene un peso molecular medio menor de aproximadamente 30.000 Dalton se obtiene preferentemente mediante la escisión de cadenas de polisacáridos más largas mediante (1) sulfatación de un fragmento del dermatán sulfato (DDS) nativo, o (2) mediante despolimerización del DDS.

Las cadenas de dermatán se despolimerizan por diversos procedimientos enzimáticos y químicos conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen aquéllos en los que (1) la condroitinasa escinde los enlaces del dermatán sulfato nativo entre la N-acetil galactosamina y el ácido urónico con la formación de oligosacáridos que tienen residuos 4,5- insaturados de ácido urónico en el extremo no reductor (Linhardt, R.J., en: Current Protocols in Molecular Biology- A Varki, ed. 2:17.13.17-17.13.32 (1995)); (2) se somete a \beta-eliminación a ésteres de los grupos carboxilo del ácido idurónico del dermatán (Kiss, J., Adv. Varbohydr. Chem. Biochem., 29:229-303 (1974)) a pH alcalino (Mardiguian, J.S., Patente de EE.UU. 4.440.926 (1984)) con la formación de ácido urónico 4,5-insaturado en el extremo no reductor; (3) residuos no sulfatados de ácido urónico de los dermatanes son escindidos mediante oxidación con peryodato, seguida de reducción de los dialdehídos resultantes con borohidruro e hidrólisis en condiciones ligeramente ácidas (Wolfrom, M.L., Wang, P.Y., Honda, S. Carbohydr. Res. 11:179 (1969)), produciendo de esta manera grupos terminales con el residuo de ácido urónico no sulfatado; (4) se escinden los enlaces glucosídicos de los dermatanes mediante un mecanismo radical que usa peróxido de hidrógeno, conocido como despolimerización oxidativa-reductora (Gilbert, D.L., Gershman, R., Ruhm, K.B., Price, W.E. J. Gen. Physiol. 41:989 (1958); Pigman, W., Hawkins, W., Grauling, E., Rizi, S., Holley, H. Arch. Biochem. Biophys. 89:184 (1960); Pigman, W., Rizvi, S. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1:39 (1959)), dando lugar a fragmentos que tienen grupos terminales reductores; y (5) las cadenas de dermatán se escinden simultáneamente a la sulfatación mediante la acción de una mezcla de ácidos sulfúrico y clorosulfónico (Naggi, A., Torri, G., Patente de EE.UU. 4.727.063 (1988)). Los polímeros de esta invención tienen una actividad antitrombina significativa independiente de ATIII mediada por la acción de CHII.

Generalmente el DDS se sintetiza preferentemente sulfatando dermatán sulfato (DS) nativo. El DS obtenido comercialmente y disuelto en un disolvente polar, preferentemente un disolvente polar como agua o un disolvente polar aprótico como dimetilformamida, se trata con un agente sulfatante, preferentemente un agente sulfatante suave como un complejo trialquilamina inferior-trióxido de azufre, en el que en lo sucesivo el alquilo inferior se define para que incluya radicales alquilo de cinco o menos átomos de carbono, a una temperatura entre aproximadamente -20ºC y 100ºC durante aproximadamente una hora a 48 horas. Por lo tanto, son susceptibles a la sulfatación todos los residuos de ácido idurónico que no contienen uno o los dos de 2-sulfato y 3-sulfato y los residuos de galactosamina que no contienen un 4-sulfato o un 6-sulfato; sin embargo, los residuos de galactosamina susceptibles son sulfatados mucho más rápidamente que los residuos de ácido idurónico, lo que da a la reacción un elevado grado de selectividad. Este grado de selectividad permite la preparación de formulaciones anticoagulantes especialmente activas de DDS. Los DDS preparados pueden formar una sal. Los cationes preferidos para la formación de sales se seleccionan del grupo que comprende bario, calcio, cobre, litio, sodio, potasio, cinc, y los iones amonio seleccionados del grupo constituido por NR_{1}R_{2}R_{3}R_{4}^{+}, en los que los grupos R pueden ser grupos alquilo inferiores iguales o diferentes, o hidrógeno. Se prefiere que la mezcla de reacción se purifique mediante fraccionamiento por densidad de carga. También se pueden producir derivados de DDS para introducir grupos reactivos para permitir su unión a dispositivos que interaccionan con la sangre mediante aminación reductora. En una forma de realización se prefiere que el DDS forme complejos con una amina, preferentemente con una amina que permita el injerto por radiación sobre biomateriales que interaccionan con la sangre.

Se puede hacer que el DDS se "adhiera" a biomateriales por medios electrostáticos. Las sales de amonio cuaternario se pueden unir a superficies de adsorción y, por lo tanto, se pueden usar para recubrir biomateriales que entran en contacto con la sangre. Los radicales amino positivos de las aminas primarias, secundarias y terciarias y de los compuestos de amonio cuaternario se unen electrostáticamente a los radicales sulfato negativos del DDS. Las sales de amonio cuaternario se seleccionan del grupo constituido por NR_{1}R_{2}R_{3}R_{4}^{+}, en el que entre uno y cuatro de los grupos R pueden ser los mismos o diferentes grupos arilo o grupos alquilo, siempre que al menos un grupo sea un alquilo que tenga más de 8 átomos de carbono, o hidrógeno. Para esta función se prefieren las sales de amonio cuaternario, como el cloruro de benzalconio, un cloruro de alquildimetilbencilamonio en que el grupo alquilo varía desde C8 a C18. Los radicales alquilo que tienen entre 16 y 18 átomos de carbono tienen propiedades de unión similares independientemente de qué otros radicales están unidos al grupo alquilo. La reducción del número de átomos de carbono de los grupos alquilo a 12 da lugar a una disminución significativa del grado de fijación a superficies tensioactivas-plásticas. Los DDS complejados con sales de amonio cuaternario se unen físicamente a superficies de absorción debido a sus potentes propiedades tensioactivas y, por lo tanto, se pueden usar para recubrir materiales artificiales que están en contacto con el torrente sanguíneo. Los copolímeros de aminas y de DDS también se pueden unir irreversiblemente a polímeros mediante irradiación gamma, un procedimiento de injerto por radiación conocido en la materia.

En una síntesis preferida, una mezcla de reacción se disuelve en formamida que contiene DS disponible comercialmente en una concentración de entre aproximadamente 2,5% y 25% (p/v), aunque preferentemente de aproximadamente 7,5% (p/v), y se incuba con el complejo trialquilamina-trióxido de azufre durante más de 4, preferentemente más de 6, horas. Aunque la reacción avanza bien a entre 10ºC y 30ºC, preferentemente aproximadamente a temperatura ambiente, se pueden preferir temperaturas más bajas para mejorar la selectividad de la reacción. El intervalo preferido de temperaturas puede estar en el intervalo de entre aproximadamente -10ºC y 60ºC. La composición resultante contiene disacáridos modificados disulfatados (y trisulfatados) de peso molecular en el intervalo de entre aproximadamente 5000 y 35.000 Dalton con una longitud media de la cadena de entre aproximadamente 16 y 100 unidades de monosacárido, en los que al menos el 75% de los residuos tiene más de dos grupos sulfato por cada disacárido, y una actividad antitrombina in vitro mediada por CHII, dependiendo del peso molecular medio, de aproximadamente 25 a 125 U/mg. En una preparación típica la actividad antitrombina mediada por CHII de la preparación comercialmente disponible de DDS que se usa para la síntesis (habitualmente aproximadamente <10 U/mg) aumenta más de 2 veces, preferentemente más de 8 veces hasta entre aproximadamente 25 a 125 U/mg, dependiendo del peso molecular. La inhibición de la generación de trombina y de la activación del complemento por la preparación es mayor que la del DS nativo original sobre una base gravimétrica.

La composición que se ha sintetizado de esta forma, el DDS, es útil como anticoagulante general para la sangre, y por lo tanto se puede usar en la recogida y análisis de sangre in vitro, como recubrimiento de biomateriales que están en contacto con la sangre, o en terapéutica cuando sea deseable la inhibición de la generación de trombina y/o la inhibición de la activación del complemento. El DDS posee preferentemente una actividad anti-IIa en el intervalo de entre aproximadamente 25 a 125 U/mg, y más preferentemente mayor de 75 U/mg.

Las composiciones antitrombóticas de DDS de la invención son útiles en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de trastornos o enfermedades que se caracterizan por una generación de trombina y una activación del complemento excesivas. Estos trastornos se producen con frecuencia cuando el paciente ha estado expuesto a un traumatismo, como en los pacientes quirúrgicos. El traumatismo que producen las heridas y la cirugía da lugar no sólo a lesión vascular y proliferación secundaria de las células musculares lisas vasculares (que da lugar a reestenosis e hiperplasia vascular), sino también a activación de la coagulación sanguínea. Estos resultados indeseables se pueden producir después de cirugía de injerto vascular, trasplante de corazón, angioplastia con balón o con láser, lesión arterial traumática, reparación postquirúrgica de arterias musculares, implantación a largo plazo de catéteres arteriales, intervenciones arteriales diagnósticas invasoras, trasplante de riñón, pulmón o hígado, e intervenciones de cirugía de derivación. La eficacia del DDS para tratar los trastornos que se enumeran más arriba se puede analizar usando modelos porcinos o en conejos.

Por ejemplo, se estudiaron los efectos del DS y de la heparina sobre la hiperplasia como se señala a continuación: se lesionaron arterias carótidas de conejo mediante dilatación con un líquido a presión. Se trató a la mitad de los animales durante 2 horas antes y después de la lesión con 30 U/kg de DS o con 150 U/kg de heparina. Cuatro semanas después se sacrificó a los animales y se determinó histológicamente el grado de hiperplasia en la pared del vaso lesionado usando un analizador de imagen computarizado. A la otra mitad de los animales no se le trató en el momento de la primera lesión, sino que se les permitió que se recuperaran. Dos semanas después se anestesió a estos animales y se aislaron las dos arterias carótidas lesionadas (que estaban ocluidas debido a hiperplasia). Se realizó una endarterectomía carotídea en todos los vasos ocluidos para restaurar el flujo sanguíneo. En el momento de la segunda lesión se trató a todos los animales con DS o con heparina, como se ha descrito más arriba, y se les permitió que se recuperaran otras cuatro semanas. Se sacrificó a los animales y se determinó la hiperplasia de la pared vascular. El DS atenuó la hiperplasia de la pared vascular en los dos modelos de lesión. La heparina no tuvo ningún efecto.

En todas estas enfermedades y trastornos es útil la administración de cantidades adecuadas de las composiciones de la invención. Los modos de administración preferidos incluyen administración in vivo mediante administración parenteral, administración adventicial, administración intraluminal para tratar la pared vascular, e implantación de la composición. También se puede usar ex vivo. La administración se realiza por las vías típicas y generalmente incluye la administración sistémica, como mediante inyección. Particularmente se prefiere la inyección intravenosa, porque se puede mantener fácilmente la inyección continua a lo largo de períodos de tiempo prolongados. También se prefiere su introducción en el sistema vascular mediante administración intraluminal o mediante administración adventicial usando bombas osmóticas. Los implantes típicos contienen materiales biodegradables como colágeno, polilactato y mezclas de polilactato/poliglucósido, preferentemente formuladas en forma de parches o de perlas.

El intervalo típico de dosificación es de aproximadamente 0,1-5 mg/kg/h de manera constante durante un período de aproximadamente 5 a 30 días, preferentemente entre aproximadamente 7 a 14 días. La dosificación particularmente preferida es de aproximadamente 0,3 mg/kg/hora o, en el caso de un adulto de 70 kg, también se pueden usar otras formas de administración más convencionales. También puede ser eficaz la inyección por vía subcutánea o intramuscular a una dosis menor o la administración por vía oral de una dosis ligeramente mayor que la inyección intravenosa, o la administración transmembrana o transdérmica o tópica de otro tipo para las lesiones localizadas. La administración localizada mediante un dispositivo de liberación continua, tal como una matriz de soporte, tal vez incluida en el material de un injerto vascular, es particularmente útil cuando la localización del traumatismo es accesible. Las formulaciones adecuadas para los modos anteriores de administración son conocidas en la materia, y se encuentra un compendio adecuado de otras formulaciones en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Las composiciones de DDS de la invención también se pueden marcar biológicamente usando procedimientos convencionales que incluyen marcaje radiactivo, marcaje fluorescente, cromóforos y enzimas. Las composiciones de DDS también se pueden usar en un ensayo competitivo para detectar la actividad antitrombótica en una muestra biológica. Se pueden elaborar anticuerpos que tienen inmunorreactividad específica frente a DDS mediante procedimientos convencionales bien conocidos, y se pueden usar de manera beneficiosa como marcadores para las pruebas anteriores.

Ejemplos

La invención se puede comprender mejor en referencia a los siguientes Ejemplos ilustrativos de la forma de realización preferida de la invención. Se pretende que los Ejemplos ilustren la invención y no limiten de ninguna manera el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo muestra la preparación de dermatán disulfato (DDS).

En agitación constante, se solubilizaron 67 g de dermatán sulfato nativo (Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, Nº Lote DI-10494) que tenía un peso molecular medio de 36.000 Dalton, una rotación óptica de -62º, un ensayo de heparina de 5 U/mg y una actividad HCI/anti-IIa de 7 U/mg, en 900 ml de formamida secada previamente sobre tamices moleculares de 4 \ring{A}. Después se añadieron 100 g (32 mmol) de trióxido de sulfuro de trialquilamina al reactivo que estaba protegido de la humedad con un tubo secante de cloruro cálcico. Se hizo reaccionar la mezcla durante 24 horas a 60ºC. El producto de la reacción se transfirió a 1 l de etanol al 95% y se mantuvo durante 30 minutos antes de la adición de entre 5 y 10 l de solución acuosa de cloruro sódico al 1%. Se ajustó el pH a la neutralidad y se limpió, decoloró y diafiltró la disolución frente a cinco volúmenes de disolución acuosa de cloruro sódico al 1% (hasta que se hubo retirado toda la trimetilamina libre de la mezcla de reacción), seguidos de dos volúmenes de agua purificada. El producto se concentró y se liofilizó, obteniéndose 58 g de DDS. La Tabla 1 muestra las propiedades del DDS aislado a partir de esta reacción.

TABLA 1 Propiedades típicas del dermatán disulfato

	PM medio	28.000
	Rotación óptica	-41,3º
	Ensayo de heparina, U/mg	10
	Nitrógeno, %	1,80
	Azufre total, %	8,24
	Anti-IIa, U/mg	88

Actividad anti-IIa. Se determinó la actividad antitrombina de DDS mediada por CHII incubando 80 \mul de una disolución de muestra que contenía 0,3 ml de muestra (5,345 \mug/ml) y 0,1 UPE de cofactor II de heparina humana purificado (vendido por Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, nº de catálogo 44.405), con 20 \mul de trombina humana purificada (7,5 unidades NIH/ml) a 37ºC durante 180 segundos. Después se añadieron 50 \mul de sustrato cromogénico (2,5 \mumol/ml de etilmalonil-Pro- Arg-pNA, vendido por Celsus Laboratories, como cromógeno de THII, nº de catálogo 01505), y se midió la actividad amidolítica de la trombina a 450 nm. Las mediciones se realizaron en un dispositivo ACL 300 Plus (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) y se calcularon en comparación con el patrón de referencia de heparina K-3 de la USP (US Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD).

Peso molecular medio. Se determinó el peso molecular medio disolviendo muestras hasta el 0,8% p/v en cloruro sódico 0,5 M. Se midió el tiempo del flujo de salida en segundos con un viscómetro capilar Ostwald en un baño de agua equilibrado a 25ºC y se calculó el peso molecular, como se ha descrito previamente.

Nitrógeno y azufre. Se determinaron los contenidos de nitrógeno y de azufre mediante análisis elemental (normas ASTM 5291 y D4239, respectivamente) por los Laboratorios Galbraith (Knoxville, TN).

Análisis de RMN. Se intercambiaron muestras de DS y de DDS con D_{2}O (óxido de deuterio) antes de una dilución de aproximadamente 5% (p/v) para RMN-^{1}H. Se registraron los espectros de RMN-^{1}H con una resolución digital de 0,24 Hz y a 60ºC para impedir que la señal HOD se solapara con las señales anchas procedentes de \delta 4,64 a 4,74. Los espectros de DS y DDS se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Aunque en general son similares, los dos espectros difieren en 4,1, que representa un aumento del contenido de N-acetil-D-galactosamina 4,6-O-disulfatada para DDS. La Figura 2 muestra que el DS es un DS nativo típico que contiene sólo residuos de ácido idurónico y parece estar totalmente 4-O-sulfatado. La Figura 3 muestra que el DDS también está 4-O-sulfatado completamente (\delta 4,9), aunque también está casi totalmente 6-O-sulfatado (\delta 4,1), y contiene una pequeña cantidad de ácido idurónico 2-O-sulfatado (\delta 5,25) y trazas de ácido idurónico 2,3-di-O-sulfatado (\delta 5,48).

Ejemplo 2

Este ejemplo muestra la inhibición in vitro de la antitrombina III y la inhibición mediada por CHII de la generación de trombina en presencia de DDS o de heparina.

Se extrajo sangre de un voluntario humano sano y se repartió en tubos distintos que contenían cada uno de ellos 25 U anti-IIa/ml de DDS o de heparina. La generación in vitro de trombina a lo largo del tiempo fue aproximadamente la misma para los dos compuestos. Sin embargo, la mayor parte de la actividad anti-IIa de DDS estaba asociada a CHII, mientras que la mayor parte de la actividad anti-IIa de heparina estaba asociada a ATIII. Véase la Tabla 2.

TABLA 2 Trombina generada en pMol

Tiempo en minutos	15	30	60	120	240
Heparina, T/CHII	42	53	44	51	48
Heparina, TAT	24	25	26	28	41
Heparina, total	66	78	70	79	89
DDS, T/CHII	56	42	48	54	61
DDS, TAT	15	07	09	12	07
DDS, total	71	49	57	66	68

Ejemplo 3

Este ejemplo muestra la actividad inhibidora in vitro del complemento de DDS.

Se ensayaron heparina, DS y DDS en cuanto a su capacidad para regular la vía clásica del complemento como se ha descrito previamente, y se prepararon a diversas concentraciones desde 0,15 a 40 \mug en 100 \mul de suero salino tamponado con veronal semiisotónico, pH 7,5, que contenía gelatina al 0,1%, calcio 0,15 M, magnesio 0,5 mM y dextrosa al 2,5% (DGVB++) y se añadió a tubos colocados en hielo. Posteriormente, para producir un promedio de un episodio lítico por célula (un Z de lisis), se añadió C2 de cobaya (C2c), pretitulado a cada tubo en 100 \mul de DGVB++. Por último, se añadieron 1\cdot10^{7} eritrocitos de oveja que contenían C1 y C4 de superficie (EAC 1,4b) en 100 \mul del DGVB++ a cada tubo, y los tubos se incubaron inmediatamente en un baño de agua con agitación a 30ºC durante 10 minutos (la t_{max}). Posteriormente se añadieron a cada tubo 0,3 ml de concentrado de cobaya (CC) diluido en suero salino tamponado con gelatina y veronal y que contenían etilendiamina 40 mM como fuente de componentes de la vía terminal del complemento, y se mantuvo la incubación durante 60 minutos a 37ºC. Finalmente se añadió a cada tubo 1,5 ml de suero salino (excepto a los tubos del 100% de lisis, que recibieron agua), se agitaron y centrifugaron los tubos y se evaluó la lisis mediante la determinación de la liberación de hemoglobina a 414 nm. Los tubos que no contenían GAG ni derivados de GAG se denominaron control no inhibido y se constituyeron para que tuvieran aproximadamente un episodio lítico por célula (un Z de lisis). Los tubos sin reactivo y los tubos del 100% de lisis no recibieron GAG ni C2. Se calculó la inhibición según la lisis de intermediarios celulares (Z) en la muestra de prueba en comparación con los tubos controles no inhibidos.

En relación ahora con la Figura 4, se muestra una comparación de cuatro tipos diferentes de anticoagulantes. Se puede observar que el DDS tiene esencialmente la misma actividad inhibidora que la heparina, y considerablemente más actividad que el DS.

Ejemplo 4

Este ejemplo muestra el uso de DDS en comparación con heparina y DS en una intervención de DCP en un cerdo adulto.

Se anestesiaron cerdos Yorkshire adultos (60-70 kg) con ketamina y se les intubó y ventiló (volumen corriente 15 ml/kg, frecuencia 12-16 por minuto). Se controló continuamente la adecuación de la ventilación midiendo los niveles de pH, pCO_{3} y pO_{2} en muestras de sangre extraídas de manera seriada durante todo el experimento. Se mantuvo la anestesia con Ethrane (Anaquest, Mississauga, Ontario) y Somnotol intravenoso (MTC Pharmaceutical, Cambridge, Ontario). Cuando fue necesario, se mantuvo la parálisis con pancuronio intravenoso (Abbott STD. Abbott Laboratories, Saint Laurent, Quebec). Se insertaron catéteres arteriales y venosos femorales bilaterales para controlizar la tensión arterial, para extraer muestras de sangre adicionales y para administrar líquidos y el compuesto de prueba.

El circuito de DCP estaba constituido por tubos y cánulas de polietileno (Baxter Health Care, Bentley Division, Irvine, CA), un oxigenador de membrana con reservorio venoso (Cobe CML, Cobe Canada Ltd., Scarborough, Canadá) y un filtro arterial en línea (Pall Stat Prime Blood Filter, Pal Biomedical Inc., Figuerido, Puerto Rico). El circuito se cebó con lactato de Ringer. El flujo sanguíneo se reguló usando una bomba rotatoria Sarns (modelo nº 5000, Sarns Inc, Ann Arbor, Michigan) y la temperatura se reguló y se controló usando un intercambiador de calor Sarns 3M HeaterCooler (modelo nº 48103).

Se anestesió y se preparó a los cerdos como se ha descrito más arriba. Se les abrió el tórax a través de una esternotomía media. Después se administró a los cerdos una dosis en bolo (400 U/kg) de heparina o DDS en forma de bolo o en forma de bolo más infusión. El compuesto también se añadió al líquido de cebado de la bomba a una concentración igual a la concentración plasmática esperada para evitar cualquier efecto de dilución por el plasma asociado al inicio de la DCP. Después se insertaron las cánulas aórtica y auricular y se inició la DCP.

Las actividades anticoagulantes, la resistencia arterial, la oclusión de circuito y la hemorragia se evaluaron como sigue:

Actividades anticoagulantes. La actividad anticoagulante se midió en forma de i) prolongación del tiempo de coagulación activado (TCA) y ii) actividad anti-trombina y anti-factor Xa (U/ml) en muestras de sangre extraídas inmediatamente antes de inyectar el compuesto y en muestras de sangre extraídas de manera seriada durante la DCP y hasta 120 minutos después de la misma. El TCA se midió en un analizador Hemocron R-400 (International Technidyne Corp., New Jersey). Las actividades anti-trombina y anti-factor Xa se midieron usando ensayos cromógenos estándar.

Hemorragia. Se recogió toda la sangre perdida en el campo quirúrgico en la cavidad torácica antes y después de la descanulación, y se midió su volumen. Todas las esponjas que se usaron para obliterar la cavidad torácica después de la DCP se colocaron en 1 l de agua para lisar los eritrocitos. Después se determinó la cantidad de sangre midiendo la cantidad de hemoglobina presente en el agua mediante espectrofotometría. Se calculó la hemorragia total como la suma de estas dos mediciones.

Evaluación de la formación de trombos. Al final de la DCP y de la descanulación el circuito de DCP se drenó con sangre, y se inspeccionaron todos sus componentes para detectar trombos y hebras de fibrina visibles.

Complejos trombina/ATIII (TAT). La trombina es un enzima clave en la patogenia de la trombosis y se forma cuando la protrombina escinde la protrombina en trombina y fragmentos de protrombina. Una vez que se ha formado en el plasma, la trombina es inhibida por una antiproteasa que aparece de manera natural, ATIII, con la formación del complejo un complejo de trombina/ATIII (TAT) (Teitel, J.M., Bauer, K.A., Lau, H.K., Rosenberg, R.D.. Studies of the prothrombin activation pathway utilizing radioimmunoassay for the F2/F1+2 fragment and thrombin-antithrombin complex. Blood 59:1086-97 (1990)). Se ha demostrado que los niveles preoperatorios de TAT se correlacionan con el riesgo de presentar TVP después de cirugía mayor. Para realizar los ensayos se drenó sangre en un tubo de extracción en vacío Vacutainer (Becton Dickinson nº 6416) que contenía 0,105 de citrato tamponado. El plasma se separó inmediatamente de los elementos celulares mediante centrifugación a 1700 g durante 15 minutos a 22ºC, y se congeló en alícuotas a -70ºC hasta que se realizaron ensayos por lotes. Los niveles de TAT se midieron usando un kit de ELISA disponible comercialmente (Behringwerke, Marburg, Alemania).

Complejos trombina/cofactor II de heparina (T/CHII). El cofactor II de heparina (CHII) es un segundo inhibidor endógeno de la trombina en el plasma humano. La inhibición de la trombina por el DS dependiente de CHII suprime la formación de trombos, el crecimiento de los trombos y la hiperplasia en conejos con más eficacia que heparina/ATIII. Los estudios han sugerido que el CHII es un inhibidor más eficaz de la trombina que está confinado en el espacio extravascular o unido a la superficie de la pared de un vaso lesionado, de un trombo formado o de una superficie artificial (VanRyn-McKenna J., Ofosu F.A., Gary E., Hirsh J., Buchanan MR. Effects of dermatan sulfate and heparin on inhibition of thrombus growth in vivo. Ann NY Acad Sc. 556:304 (1989); Ofosu F.A., Fernández F., Gauthier D., Buchanan M.R. Heparin Cofactor II and other endogenous factors in the mediation of the antithrombotic and antocoagulant effects of heparin and dermatan sulfate. Semin Throm Haemost 11:133 (1985); Okwusidi J.I., Anvari N., Kulczycky M., Blajchman M.A., Buchanan M.R. Fibrin moderates the catalytic action of heparin but not that of dermatan sulfate on thrombin inhibition in human plasma. J Lab Clin Med 117:359 (1991)). Para los ensayos, se procesó la sangre en cuanto a los niveles de TAT.

De acuerdo con una actividad antitrombina especifica (mediada por ATIII y CHII) de 10 unidades, se administró un bolo de 0,8 mg/kg de DDS (número de lote OD-00195, Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio) a cerdos adultos (67-70 kg), seguido de una infusión de 2,4 mg/kg/hora de DDS durante la DCP durante 90 minutos, de modo que se administró un total de 4,4 mg/kg de DDS (en comparación con una dosis típica de 2,67 mg/kg de heparina con una actividad de 15 U/mg). La DCP se realizó con éxito a pesar de una ligera prolongación del tiempo de coagulación activado (TCA) hasta los 170 segundos cuando estaban conectados a DCP. Este TCA se asoció a niveles mínimos de antitrombina y a niveles indetectables anti-factor Xa. Lo que es más importante, el TCA volvió rápidamente a las mediciones basales cuando se interrumpió la infusión (véase la Figura 5). Toda la trombina generada durante la DCP fue inhibida por el CHII, como se demostró por los niveles aumentados de complejos trombina/CHII (T/CHII) en la Figura 6. Esto contrasta de manera marcada con lo que se observa clínica y experimentalmente con heparina, en los que el TCA se prolonga a más de 700 segundos, y los niveles de TAT permanecen elevados durante al menos 24 horas, mientras que los niveles de TAT como de T/CHII vuelven rápidamente a la línea basal después de la interrupción de DDS. Este descenso de los niveles de TAT y de T/CHII después de la DCP sugiere que DDS/CHII inhibe la trombina de manera más eficaz que heparina/ATIII.

Ejemplo comparativo

Se colocó a un total de 12 animales en DCP y se les administró uno de tres tratamientos antes del inicio de la DCP.

Serie 1

DDS 25

n=4

Dermatán disulfato, bolo de 25 U/kg (2,5 mg/kg)

\quad

(Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, lote nº OD-00195)

Serie 2

HEP 25

n=4

Heparina, bolo de 25 U/kg

\quad

(Organon Canada Ltd., Toronto, Canadá)

Serie 3

HEP 400

n=4

Heparina, bolo de 400 U/kg (2,7 mg/kg)

\quad

(Organon Canada Ltd., Toronto, Canadá) (Ésta es la dosis estándar usada en la DCP en seres humanos).

Se realizó la DCP con éxito tanto en los animales tratados con heparina a dosis altas como en los animales tratados con DDS, es decir, no se observaron coágulos macroscópicos en los circuitos durante la DCP, la sangre permaneció líquida después de la DCP y los animales no experimentaron efectos adversos. Esto contrasta de manera marcada con la DCP en el grupo en los animales tratados con heparina a dosis baja, en los que se observaron coágulos durante la DCP y la sangre del circuito se coaguló cuando se redujeron los flujos al desconectarlos de la DCP, haciendo imposible de esta manera volver a conectar la DCP si fuera necesario. Esta necesidad se produce aproximadamente el 30% de las veces en medicina clínica. Además, la sangre coagulada es sangre que pierde el paciente, lo que aumenta el riesgo de hemorragia postoperatoria y el uso de hemoderivados homólogos. La hemorragia fue menor en animales tratados con DDS25 o con HEP25 que en los cerdos tratados con HEP400. Véase la Tabla 3.

TABLA 3 Hemorragia de la pared torácica, ml/2 horas

Fármaco	Número de animales	Media (\pmETM)	valor de P
HEP400	6	161\pm36
HEP25	4	114\pm21	0,594
DDS25	4	81\pm13	0,07

En los animales tratados con DDS, el TCA no superó los 270 segundos durante la DCP y volvió a valores normales a lo largo del período de controlización de dos horas (Figura 5). Este TCA se asoció a una actividad antitrombina circulante mínima (Figura 7). Los niveles de TAT y de T/CHII no aumentaron durante el tiempo que estuvieron conectados a DCP (Figura 8). En los animales tratados con HEP25 los hallazgos fueron similares. El TCA no superó los 260 segundos durante la DCP (Figura 5) y de nuevo se asoció a una actividad antitrombina circulante mínima (Figura 7). En los animales tratados con HEP400 (dosis clínica estándar en seres humanos) el TCA estaba muy elevado respecto a la línea basal, como se observa en la situación clínica. Esto se asoció a una actividad antitrombina significativa (Figura 7). Los niveles de TAT y de T/CHII aumentaron durante la DCP, aunque fueron menores en los animales tratados con DDS25 o HEP25 (Figura 8).

Estos datos sugieren que 1) DDS/CHII inhibe la trombina de manera más eficaz que heparina/ATIII ya que se consiguió la DCP con éxito con DDS a una dosis anticoagulante sistémica menor, y la generación de trombina después de la DCP mejoró con DDS mientras que no lo hacía con heparina; y 2) este efecto se puede conseguir con una menor dosis anticoagulante, reduciéndose con ello el riesgo de hemorragia.

Ejemplo 5

Este ejemplo muestra cómo elaborar otras formas de sales de DDS.

Como es conocido para los expertos en la técnica, la forma salina determina la afinidad por determinados electrólitos ionizados en la sangre que pueden ser cruciales para determinar los constituyentes gaseosos de la sangre. La sal sódica de la composición de DDS del Ejemplo 1 se hace reaccionar con el cloruro de un catión diferente para producir otras formas de sales o mezclas de sales diferentes. Ese intercambio iónico de la composición de DDS se puede realizar haciéndolo pasar sobre una resina de intercambio catiónico cargada previamente, haciéndolo sedimentar con una disolución de cloruro seguida por precipitación en disolvente o diafiltración frente a una disolución acuosa que contiene un cloruro diferente.

De manera alternativa, la composición de DDS de la presente invención que generalmente está en forma sódica como consecuencia de la neutralización con sosa cáustica diluida durante la fabricación, se diluye con agua purificada hasta una concentración de entre aproximadamente 1% y 15%, preferentemente aproximadamente 7%, y se somete a diafiltración a través de una membrana que tiene un punto de corte de peso molecular de 1000 Dalton (PCAC de Millipore Corporation, Bedford, MA) en un aparato adecuado (Pellican, Millipore Corporation, Bedford, MA). La concentración de DDS se mantiene constante mediante la adición continua de cloruro cálcico aproximadamente 0,5-2,0 M (ajustado a pH 7,4 con hidróxido cálcico). Se retira cualquier exceso de cloruro cálcico mediante diafiltración por adición continua de agua purificada, y la sal cálcica de DDS se recupera se recupera mediante liofilización. Un rendimiento típico de la transformación es mayor de 90%, con un contenido porcentual de calcio de más de 9,5% y un contenido de sodio de menos de 1000 ppm, según se determina mediante fotometría a la llama.

Se usa el mismo enfoque en la producción de otras sales, que incluyen las sales de amonio, bario, cobre, litio, potasio y cinc.

Ejemplo 6

Este ejemplo muestra la preparación de un fragmento de dermatán sulfato (DS).

Despolimerización oxidativa-reductora de dermatán sulfato. Se diluyeron en agua purificada 50 g de DS nativo (Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, Nº Lote DI-10394) que tenía un peso molecular medio de 35.000 Dalton, contenido de azufre y nitrógeno de 2,0% y 6,59%, respectivamente, y un ensayo de heparina de 4 U/mg, hasta una concentración de 10% (v/v). Se añadió en agitación Duolite C-20 (Rohm & Hass, Filadelfia, PA), regenerado previamente con ácido clorhídrico, para reducir el pH hasta 2,5, y en este momento se retiró la resina mediante filtración a través de un embudo de Buchner. Después se recalentó con agitación la disolución de DS a 75ºC y se añadieron 10 ml de peróxido de hidrógeno al 35%, seguido de esterilización a una presión de 159 kPa (23 psi) durante 15 minutos. Después de completar el ciclo, la disolución se retiró del esterilizador, se enfrió a menos de 40ºC y se ajustó el pH a 6,5-7,0 con sosa cáustica. Se añadió un volumen de etanol para precipitar el DS. El precipitado se retiró mediante secado en vacío. El DS despolimerizado tenía las siguientes propiedades:

TABLA 4 Propiedades típicas de un fragmento de DS

	Recuperación, g	40
	Peso molecular medio	5600
	Ensayo, U/mg	< 2
	Nitrógeno, %	2,42
	Azufre total, %	6,49

Ejemplo 7

Este ejemplo muestra un procedimiento para la preparación de un fragmento de dermatán disulfato (DDS).

Se puede esterificar el DDS en los grupos carboxilo del ácido urónico y se escinde mediante \beta-eliminación controlada en condiciones alcalinas empleando procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. En este procedimiento el DDS se convierte en una forma soluble en disolventes orgánicos mediante el contacto con una sal hidrófoba de amonio cuaternario como Hyamine 1622. A una disolución de la sal de Hyamine de DDS en un disolvente como dimetilformamida se añade cloruro de bencilo (o un bencilo sustituido adecuadamente) y las sustancias se dejan en contacto durante tres días a temperatura ambiente. Después se añade un volumen igual de una disolución al 10% de acetato sódico en metanol y el precipitado que se forma se separa mediante filtración, se lava con metanol y se seca en vacío para obtener la sal sódica del éster de DDS. El producto se caracteriza por la absorción ultravioleta del grupo bencilo a aproximadamente 200 nm. Después se somete el éster bencílico a \beta-eliminación alcalina en condiciones bien conocidas para los expertos en la técnica.

De manera alternativa, el DDS se disuelve en acetato 0,15 M, NaCl 0,15 M y CaCl 0,005 M a pH 6,9. Después de la adición de polisacárido liasa, se incubó la mezcla a temperatura ambiente hasta que la masa molecular media del disulfato se había reducido a aproximadamente 5000 Dalton. La despolimerización se controló por el aumento de la absorción ultravioleta a 232 nm (debido a la protección de un doble enlace en el extremo no reductor del disacárido) y midiendo la masa molecular media de la mezcla de polímeros mediante viscometría.

Ejemplo 8

Este ejemplo muestra la preparación de fracciones de dermatán sulfato (DS) y de dermatán disulfato (DDS).

El dermatán sulfato (DS) nativo se puede fraccionar, seguido de sulfatación. Las técnicas de fraccionamiento conocidas por los expertos en la técnica que se pueden aplicar al DS y a otros glucosaminoglucanos estructuralmente relacionados (Linhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin, A., Hoppensteadt D., Fareed J. Low molecular weight dermatan sulfate as an antithrombotic agent. Biochem Pharmacol 49:241-1152 (1994)) incluyen fraccionamiento en disolvente, ultrafiltración y cromatografía por intercambio iónico, por afinidad y en gel.

Fraccionamiento de DS por densidad de carga. Se regeneró una columna de 19 cm x 127 cm que contenía resina de intercambio aniónico (Lewatit S-6238-A, Bayer, Pittsburg, PA) con ácido clorhídrico, se lavó meticulosamente con agua purificada USP y se equilibró con 29 l de NaCl 0,5 M. Después se cargaron en la columna 400 g de DS, nº de lote DI-10.094, disueltos en 19 l de NaCl 0,5 M, a una velocidad de flujo de 200 ml/minuto. Después se lavó con otros 12 l de NaCl 0,5 M. Posteriormente se obtuvieron 12 l de DF-104-1 a 200 ml/minuto, se sometieron a diafiltración frente a agua purificada USP hasta una conductividad de menos de 200 S, se identificaron para detectar hidratos de carbono mediante una prueba cualitativa de Molisch (Dische Z. General color reaction. Mtds. Carbohydr Chem 1963; 1:478-81), se concentraron mediante ultrafiltración y se liofilizaron. Otras subfracciones se eluyeron de manera similar cargando la columna con incrementos de 28 l de NaCl 1,2, 1,6 y 2,0 molal para la obtención de las fracciones DF-104-2 a DF-104-4. Véase la Tabla 5.

TABLA 5 Fracciones de dermatán sulfato nativo obtenidas mediante fraccionamiento por densidad de carga

	DS-10494	DF-104-1	DF-104-2	DF-104-3	DF-104-4
Recuperación, g		164	164	118	40
Peso molecular	36.000	51.366	26.801	26.653	23.116
Rotación óptica	-62				-31
Ensayo, U/mg	5	< 2	< 2	10	> 15
Nitrógeno, %	2,33	2,60	2,57	2,68	2,22
Azufre total, %	7,16	6,27	5,99	6,83	6,61
Anti-IIa, U/mg	7	6	2	6	10
Anti-Xa, U/mg	9	1	2	12	> 15

Fraccionamiento de DDS mediante densidad de carga. Se disolvieron 5 g de OD-00195 en 750 ml de NaCl 0,5 M y se aplicaron a una columna de 4,4 x 43 cm equilibrada con NaCl 0,5 M a una velocidad de flujo de 100 ml/hora. Se lavó la columna con un volumen de columna de NaCl 0,5 M. El producto así obtenido combinado con los eluatos de 1,4 y de 1,6 M se recogió en forma de 001951. Se recogió un eluato en NaCl 2 M en forma de 001952. Después de interrumpir la columna se recogió un segundo eluato 2 M en forma de 001953. El principal eluato con NaCl 2,5 M se recogió en forma de 001954. Después de interrumpir la columna durante la noche se obtuvo un segundo eluato con NaCl 2,5 M en forma de 001955. Después de interrumpir durante una noche se lavó la columna. La elución con NaCl 3 M no permitió obtener ningún material adicional. Los datos mostrados en la Tabla 5 sugieren que la densidad de carga es un procedimiento eficaz para optimizar la actividad anti-IIa del DDS.

TABLA 6 Fracciones de DDS obtenidas mediante fraccionamiento por densidad de carga

	001951	001952	001953	001954	01955
Recuperación, g	0,08	0,4	0,2	3,8	0,5
Peso mol. Medio	14.434	16.613	37.305	30.169	31.164
Anti-IIa, U/mg	< 18	30	71	74	64

Ejemplo 9

Este ejemplo muestra la preparación de un recubrimiento tromborresistente basado en dermatán disulfato.

Se mezcla una disolución de DDS en agua con un exceso estequiométrico de una disolución acuosa de una sal hidrófoba de amonio cuaternario tal como cloruro de benzalconio, cloruro de tridodecilmetilamonio u otra sal conocida para un experto en la técnica. La sal de amonio cuaternario de DDS resultante se recoge mediante filtración en vacío, se lava de manera intensiva con agua y se seca en vacío. Esta sal, insoluble en agua o en una disolución salina diluida, se disuelve en etanol, isopropanol u otro disolvente orgánico adecuado y se usa para recubrir superficies artificiales que pueden entrar en contacto con el torrente sanguíneo.

Ejemplo 10

Este ejemplo muestra el dermatán disulfato inmovilizado covalentemente.

Los copolímeros de aminas y de DDS se pueden unir de manera irreversible a polímeros mediante irradiación gamma, un procedimiento conocido en la materia como injerto por radiación.

De manera alternativa, se permite que el DDS reaccione en una disolución acuosa a pH 3 y a 4ºC con una cantidad estequiométricamente limitante de metaperyodato sódico durante 24 horas. Durante este tiempo se escinde una pequeña porción de los residuos no sulfatados de ácido urónico del DDS con peryodato y los grupos aldehído recién formados se detectan y cuantifican mediante el ensayo de MBTH (Sawicki, E., TR., Stanley, T.W. y Elbert W. Anal. Chem. 33:93-96, 1961). El derivado escindido de DDS se recupera mediante precipitación con tres volúmenes de etanol al 95%, decantación y disolución en cloruro sódico 1 M. Este derivado se purifica después mediante de precipitación con tres volúmenes de etanol al 95%, se extrae mediante decantación o filtración, se deshidrata secuencialmente con etanol al 95% y acetona mediante trituración con el disolvente, y se extrae el sólido mediante decantación o filtración. Los disolventes atrapados se retiran en vacío para obtener un sólido blanco. El derivado activado de DDS ahora se puede inmovilizar covalentemente sobre materiales que portan aminas mediante la formación de bases de Schiff y reducción con cianoborohidruro sódico usando condiciones bien conocidas para los expertos en la técnica.

Aunque esta invención se ha descrito principalmente en términos de ejemplos específicos y formas de realización de los mismos, es evidente que la descripción anterior sugerirá muchas alternativas, modificaciones y variaciones a aquellos de experiencia habitual en la técnica.

Claims (10)

1. Una composición que comprende dermatán sulfato que tiene más del 75% de unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D- galactosamina 4,6-di-O-sulfatada.

2. La composición de la reivindicación 1 en la que el dermatán sulfato tiene un contraión catiónico, y en la que dicho contraión catiónico es sodio.

3. La composición de la reivindicación 1 en la que el dermatán sulfato tiene un contraión catiónico seleccionado del grupo constituido por amonio, bario, calcio, cobre, hierro, litio, potasio y cinc.

4. Un procedimiento para la producción de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende la sulfatación química de dermatán sulfato nativo.

5. Un procedimiento para la producción de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende síntesis química completa.

6. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que el dermatán sulfato nativo se aísla a partir de fuentes naturales que después se purifican.

7. Un procedimiento para la producción de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende la purificación mediante fraccionamiento por densidad de carga de una preparación heterogénea de dermatán sulfato.

8. Uso de un dermatán sulfato que tenga más del 75% de unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-di- O-sulfatada en la fabricación de un medicamento para inhibir la generación de trombina.

9. Uso de un dermatán sulfato que tenga más del 75% de unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-di- O-sulfatada en la fabricación de un medicamento para inhibir la activación del complemento.

10. Uso de un dermatán sulfato con más del 75% de unidades repetitivas del disacárido ácido L-idurónico > N-acetil-D-galactosamina 4,6-di-O-sulfatada en la fabricación de un medicamento para inhibir la hiperplasia de la intima.